用于预防并治疗口腔疾病的组合物和方法
阅读：1033发布：2020-10-31
专利汇可以提供用于预防并治疗口腔疾病的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 披露了以下组合物，这些组合物包含 铁 多价螯合糖蛋白、螯合剂、稳定剂、结合剂、 表面活性剂 、氟化物、抗 微 生物 剂以及pH调节剂或缓冲液，这些组合物用于通过抗感染特性来 预防 并 治疗 由牙斑/ 生物膜 引起的 口腔 疾病 ，如龋齿、齿龈炎以及 牙周炎 。一种组合物的抗感染特性包括减少或杀死出现在多微生物牙生物膜中的厌 氧 性/好氧性/兼性革兰氏阴性和革兰氏阳性口腔细菌。该组合物可以呈洗液、冲洗液、浸泡液、糊剂、凝胶、喷雾形式或其他合适的形式。此外，本发明提供了一种使用或者一种脂质体或者一种 纳米粒子 递送系统来递送所配制的组合物的有效方法，该组合物含有一种 聚乙二醇化 或氟化的铁多价螯合糖蛋白和一种或两种螯合剂或单独的螯合剂。，下面是用于预防并治疗口腔疾病的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种用于预防并治疗口腔疾病的组合物，包含：
(a)一种铁多价螯合糖蛋白，该铁多价螯合糖蛋白选自下组，该组由以下各项组成：卵铁传递蛋白、乳铁传递蛋白以及血清铁传递蛋白；
(b)一种螯合剂，该螯合剂选自下组，该组由以下各项中的一个或多个组成：EDTA、EGTA、DTPA、EDDHA、IDA、CDTA、HEDTA、HEIDA、NTA的二钠或四钠，柠檬酸钠，柠檬酸钾以及柠檬酸锌；
所述组合物用于预防并治疗口腔疾病。
2.如权利要求1所述的组合物，其中该铁多价螯合糖蛋白是介于该组合物的约25mg/L与约500mg/L之间并且该螯合剂是介于该组合物的约300mg/L与约3000mg/L之间。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中该组合物有效抵抗口腔疾病相关细菌。
4.如权利要求1到3所述的组合物，其中该细菌选自下组，该组由以下各项组成：变形链球菌、表兄链球菌、血液链球菌(血链球菌)、格氏链球菌、口腔链球菌、轻型链球菌、溶齿放线菌、粘性放线菌、伴放线菌聚集菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌、福塞斯拟杆菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌、直肠弯曲菌、啮蚀艾肯菌、韦荣氏球菌属、微小微单胞菌、犬齿龈液卟啉单胞菌、伴放线菌嗜血菌放线菌属、芽孢杆菌属、分枝杆菌属、梭菌属、链球菌属、金黄色酿脓葡萄球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、大肠杆菌、不动杆菌属、肠球菌属、普氏菌属、卟啉单胞菌属、梭菌属、嗜麦芽寡养单胞菌、犬齿龈液卟啉单胞菌、以及白色念珠菌。
5.如权利要求4所述的组合物，其中该细菌选自下组，该组由以下各项组成：变形链球菌、表兄链球菌、血液链球菌(血链球菌)、口腔链球菌、牙龈卟啉单胞菌、犬齿龈液卟啉单胞菌以及伴放线菌聚集菌。
6.如权利要求1到5所述的组合物，进一步包含一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：水、一种缓冲液、一种稳定剂、一种结合剂、一种胶凝剂、一种减感剂、一种牙齿增白剂、一种抗牙斑沉积助手、一种表面活性剂、一种氟化物、一种草药、一种维生素、一种矿物、一种抗微生物剂、一种抗生素、一种pH调节剂、一种调味剂以及一种颜料。
7.如权利要求1到6所述的组合物，其中该铁多价螯合糖蛋白是卵铁传递蛋白，并且该螯合剂是EDTA二钠。
8.如权利要求7所述的组合物，其中该卵铁传递蛋白是以约0.5mg/ml存在，并且该EDTA二钠是以约2mg/ml存在。
9.如权利要求7或8所述的组合物，其中该铁多价螯合糖蛋白是聚乙二醇化或氟化的卵铁传递蛋白，并且该螯合剂是EDTA二钠。
10.如权利要求7到9所述的组合物，其中该卵铁传递蛋白是脱辅基-卵铁传递蛋白。
11.如权利要求1到6所述的组合物，其中该铁多价螯合糖蛋白是乳铁传递蛋白，并且该螯合剂是EDTA二钠。
12.如权利要求1到6所述的组合物，其中该铁多价螯合糖蛋白是乳铁传递蛋白，并且该螯合剂是柠檬酸钠。
13.如权利要求12所述的组合物，其中该螯合剂进一步包含EDTA二钠。
14.如权利要求13所述的组合物，其中该乳铁传递蛋白是以约0.05mg/ml存在，并且该EDTA二钠和柠檬酸钠分别是以约2mg/ml和3mg/ml存在。
15.如权利要求1所述的组合物，其中该铁多价螯合糖蛋白是聚乙二醇化或氟化的乳铁传递蛋白，并且该螯合剂是EDTA二钠和柠檬酸钠。
16.如权利要求1所述的组合物，其中该两种螯合剂是EDTA二钠和柠檬酸钠。
17.一种用于预防并治疗口腔疾病的组合物，包含：柠檬酸钠和EDTA二钠。
18.如权利要求16或17所述的组合物，其中该EDTA二钠和柠檬酸钠分别是以约2mg/ml和3mg/ml存在。
19.如权利要求17或18所述的组合物，其中该EDTA二钠具有介于0.025mg/ml与2mg/ml之间的一个浓度，并且该柠檬酸钠具有介于0.5mg/ml与3.5mg/ml之间的一个浓度。
20.如权利要求16到19所述的组合物，进一步包含一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：水、一种缓冲液、一种稳定剂、一种结合剂、一种胶凝剂、一种减感剂、一种牙齿增白剂、一种抗牙斑沉积助手、一种表面活性剂、一种氟化物、一种草药、一种维生素、一种矿物、一种抗微生物剂、一种抗生素、一种pH调节剂、一种调味剂以及一种颜料。
21.如权利要求20所述的组合物，其中一种矿物选自下组，该组由以下各项中的一个或多个组成：锌盐、乳酸锌、柠檬酸锌、葡萄糖酸锌以及氯化锌。
22.如权利要求21所述的组合物，其中该乳酸锌具有介于0.025mg/ml与0.5mg/ml之间的一个浓度。
23.如权利要求1到22所述的组合物，该组合物被制备成以下各项中的一种或多种：
一种漱口水/含漱液、一种喷雾、溶液、一种凝胶、一种水添加剂、一种研磨性/非牙粉凝胶、一种糊剂、一种义齿洗液、一种义齿浸泡液、一种义齿粘合剂或接合剂、一种口香糖、一种糖果、一种糖锭、一种饼干以及一种软饮料。
24.如权利要求1到23所述的组合物，其中该组合物包含一个脂质体或纳米粒子递送系统。
25.如权利要求1到24所述的组合物，进一步包含一种口腔护理化合物，该化合物选自下组，该组由以下各项组成：过碳酸钠或过硼酸钠、硅酮聚合物、月桂基硫酸钠；氟化钠、氟化亚锡以及单氟磷酸钠。
26.如权利要求1到25所述的组合物，进一步包含一种抗感染化合物，该抗感染化合物选自下组，该组由以下各项组成：CSP、CSP类似物、分散蛋白B、乳酸链球菌肽、乳铁蛋白素、卵白蛋白、卵类粘蛋白、硫酸鱼精蛋白、氯己定、氯化十六烷基吡啶、三氯生、氯化苯甲烃铵、过氧化氢、表没食子儿茶素没食子酸酯、兰索拉唑、木糖醇、山梨糖醇、丁子香酚、三聚磷酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸锌、5-氟尿嘧啶、顺-2-癸烯酸、DNA酶I、蛋白酶K、银、镓以及抗微生物肽。
27.如权利要求1到6所述的组合物，其中该铁多价螯合糖蛋白是分离或重组脱辅基-卵铁传递蛋白或乳铁传递蛋白，并且这些螯合剂是EDTA二钠和柠檬酸钠。
28.一种预防或治疗口腔疾病的方法，该方法包括口服使用如权利要求1到27所述的组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中该口腔疾病与牙生物膜相关。
30.如权利要求29所述的方法，其中该口腔疾病选自以下各项中的一种或多种：龋齿、齿龈炎、牙周炎、口腔细菌感染以及疾病。
31.如权利要求28到30所述的方法，该方法进一步包括多次暴露于该组合物。
32.如权利要求28到31所述的方法，其中该口腔的这些病症是与以下各项中的一个或多个相关的病理形式：该口腔的出牙、植入以及手术的并发症。
33.如权利要求28到32所述的方法，其中该方法是用于治疗以下各项中的一个或多个：人类、家畜和农畜以及动物园动物、体育用动物或玩赏动物，如犬、马、猫、牛、猪以及羊。
34.如权利要求33所述的方法，其中该方法是用于治疗人类、犬、猫或马。
35.如权利要求34所述的方法，其中该方法是用于治疗人类。
36.如权利要求34所述的方法，其中该方法是用于治疗犬。
37.一种如权利要求1到27所述的组合物用于预防或治疗口腔疾病的用途。
38.如权利要求37所述的用途，其中该口腔疾病是以下各项中的一种或多种：龋齿、齿龈炎、牙周炎、口腔细菌感染以及疾病。
39.如权利要求37或38所述的用途，进一步包括多次暴露于该组合物。
40.如权利要求37到39所述的用途，其中该用途是用于以下各项中的一个或多个：人类、家畜和农畜以及动物园动物、体育用动物或玩赏动物，如犬、马、猫、牛、猪以及羊。
41.如权利要求40所述的用途，其中该用途是用于人类。
42.如权利要求40所述的用途，其中该用途是用于犬。
用于预防并治疗口腔疾病的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请分别要求了2011年10月31日提交的美国专利申请号61/553,506；2012年5
月2日提交的美国专利申请号61/641,503以及2012年6月1日提交的美国专利申请号
61/654,490的权益和优先权。
以上专利申请的内容特此通过引用明确地结合于此处的详细说明中。
发明领域
[0001] 本发明涉及使用组合物来预防并治疗口腔疾病的方法。本发明进一步涉及通过将组合物施加到口腔来配制这些组合物的方法，这些组合物包含铁多价螯合糖蛋白、螯合剂以及药学上可接受的赋形剂。更具体地说，本发明涉及一种使用或者脂质体或者纳米粒子递送系统来递送药学上可接受的配制品的有效方法，该配制品含有聚乙二醇化或氟化的铁多价螯合糖蛋白以及一种或两种螯合剂。
发明背景
[0002] 牙斑是发现于牙齿表面被包埋在宿主和微生物聚合物的细胞外基质中的多样性微生物群落。斑块的重要环境效应是发展低氧环境，该低氧环境促进了厌氧细菌的定植和生长。斑块中的微生物从口腔环境中所存在的丰富的多糖、糖蛋白以及饮食糖(例如蔗糖)合成了一种粘液基质或糖萼(生物膜)。最终，该斑块变成了具有高度结构化、基质包埋、严重地改变基因表达的多样性微生物群体的特征性牙生物膜。
[0003] 牙斑是牙垢的前体。牙垢(dental calculus)或牙结石(tartar)是指通过唾液、残渣以及矿物的存在所形成的硬化(矿化)斑块在牙齿上的累积。成熟的牙垢由无机部分组成，该无机部分主要是类似于骨质、牙釉质以及牙质的以羟磷灰石晶格结构排列的磷酸钙。有机部分也是存在的并且由以下各项组成：脱落的上皮细胞、白细胞、唾液沉积物、食物残渣以及不同类型的微生物。其粗糙表面为细菌生长提供了一种理想的介质，从而威胁牙龈健康并且远比天然牙齿更容易地吸收难看的污渍。
[0004] 牙斑可以出现在牙龈线上方(龈上)和下方(龈下)。龈上牙斑在清洁牙齿之后的数小时内形成于牙齿上。在富含蔗糖的饮食的存在下，龈上斑块转变得更像是一种产酸斑块，由此产生龋齿。形成于龈下牙齿表面上并且涂布龈缝的上皮细胞内衬的斑块导致了牙周感染(即齿龈炎和牙周炎)的发展。
[0005] 龋齿的特征是溶解牙齿的矿物部分，这会引起疼痛并丧失牙齿活力，从而迫使高成本的修复或拔除牙齿。在美国，龋齿影响了50％年龄为5-9岁的儿童、67％年龄为12-17岁的青少年以及94％年龄为18岁的成人(《发病率和死亡率周报》(Morbidity and Mortality Weekly Reports)51:144-147,2002)。干净的牙齿将不会龋蚀；然而，即使在强力清洁的情况下，仍然难以保持牙齿足够地干净。已经研发了不同的方法来预防或缓解龋齿，包括例如向饮用水中添加氟化钠、硅氟化钠或氟硅酸以及向局部用制剂(包括牙粉和含漱液)中添加氟化钠或氟化锡。已经使用通过用聚合材料或密封剂涂布牙齿来预防龋齿；然而，这些技术是高成本的，可能需要用磷酸腐蚀牙齿并且可能仅在尚未发展出龋齿的幼小儿童中有效。也已经提出了抗细菌剂(包括抗生素)作为龋齿的一种疗法。
[0006] 口腔链球菌属和放线菌属首先出现在牙齿表面上。链球菌占唾液细菌的约20％，这些唾液细菌包括链球菌属，如变形链球菌、表兄链球菌、血液链球菌、格氏链球菌、口腔链球菌以及轻型链球菌。虽然四种链球菌变形链球菌、表兄链球菌、血液链球菌以及口腔链球菌直接参与龋齿的引发，但是变形链球菌被认为是龋齿的一个主要的致病因子(德维拉帕(Devulapalle)等人，《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)339:1029-1034,2004)。随着变形链球菌已经演变成依赖于生物膜生活方式以便在口腔中存活和持续及其作为机会性致病菌的作用，变形链球菌已经成为形成生物膜、引起疾病的链球菌的研究最透彻的实例(伯恩(Burne)，R.A.，《牙科研究杂志》(J.Dent.Res.)77:445-452,1998)。
[0007] 牙斑中的细菌是齿龈炎、慢性和侵袭性牙周炎以及坏死性牙周疾病的主要病因。齿龈(牙龈)是内衬于口中围绕牙齿的软组织的一部分。齿龈炎是一种牙龈炎症，它通常呈现为肿胀、发红或出血性牙龈。一般总体上认为生存在口中和牙齿表面上的形成斑块的细菌是齿龈炎的病因并且由这些细菌释放的某些物质导致牙龈发炎。因此，减少斑块细菌可以减少炎性物质并且实现齿龈炎减少。研究已经显示，在没有口腔卫生实践、允许斑块积累的情况下，将在10-21天内发展齿龈炎。约80％的美国成人具有牙龈/牙周疾病的病例。
齿龈炎是通过常规口腔护理可预防的，但如果不治疗，就会引起严重的牙龈疾病，称为牙周炎。牙周炎的特征是一组感染，这些感染通过斑块诱导的炎症破坏支撑性组织和骨骼。慢性牙周炎是影响约20％美国成人群体的最常见形式。如通过射线照片所检测，症状包括形成深的牙周袋、齿龈退缩、牙齿松动性增加以及骨质流失。如果不治疗，那么牙周炎会导致牙齿缺失。
齿龈炎是通过常规口腔护理可预防的，但如果不治疗，就会引起严重的牙龈疾病，称为牙周炎。牙周炎的特征是一组感染，这些感染通过斑块诱导的炎症破坏支撑性组织和骨骼。慢性牙周炎是影响约20％美国成人群体的最常见形式。如通过射线照片所检测，症状包括形成深的牙周袋、齿龈退缩、牙齿松动性增加以及骨质流失。如果不治疗，那么牙周炎会导致牙齿缺失。
[0008] 伴放线菌聚集菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans；Aa)是早发型牙周炎的主要致病因子，所述早发型牙周炎包括局部和全身性青春前期牙周炎、局部和全身性青少年型牙周炎以及快速进展性或顽固性成人牙周炎。牙齿缺失是破坏性牙周疾病的最终有害作用。美国国家调查显示以下流行率：0.53％的局部青少年型牙周炎和0.13％的全身性青少年型牙周炎。洛(Loe)和布朗(Brown)，《牙周病学杂志》(J.Periodontol.)62:608-616(1991)。来自多个研究的发现证实了以下结论：早发型疾病在其他工业化国家中是类似的并且在发展中国家中更常见。洛和布朗，《牙周病学杂志》62:608-616(1991)。另外，某些类型的成人牙周炎通常是影响超过一半成人群体的极常见的病况，可能是通过口腔内在的一个选定组的微生物引起的。
[0009] 多种化学和生物剂也已经表明能延迟牙垢形成或在牙垢形成之后去除牙垢。焦磷酸盐和其他化学剂已知具有延迟牙垢形成的能力。举例来说，在美国专利号4,999,184和4,610,871中，描述了使用双无水己糖醇的单烷基或二烷基醚来抑制在牙齿上形成斑块和牙垢。美国专利号4,178,363描述了使用正十一碳烯脂肪酸或其钙盐或锌盐来减少牙齿和牙龈的牙斑与感染。美国专利号4,119,711描述了具有减少斑块形成的功效的螺1-(羟基烷基)-哌啶基衍生物。
[0010] 此外，美 国专利号 3,887,712披露了二 氢氟化 阿来西 定(alexidine dihydrofluoride)适用于治疗牙斑、牙垢、齿龈炎以及相关牙周疾病。美国专利号4,160,821披露了当施加到齿龈和牙齿时，氯化锌或其他可接受的锌盐的甘油溶液提供了针对齿龈炎的有效疗法。美国专利号4,060,600传授了一种在牙科学中治疗牙齿的方法，该方法用于预防牙垢、去除龋齿并且溶解斑块，该方法包括向牙齿施加含有碱金属和/或碱土金属的次氯酸盐的水溶液，和能够形成其水溶性非粘液性刺激性N-氯和/或N-二氯衍生物的氨基化合物。
[0011] 当前用于减少齿龈炎的预防性措施包括良好的口腔卫生，如使用抗牙斑或抗牙结石的牙膏并使用含漱液和牙线。这些产品使沉积物/细菌变松并从牙齿中去除这些沉积物/细菌，并且清洁牙齿。用于治疗齿龈炎，除了常见的仔细的刷牙和用牙线洁牙之外，还可以使用抗细菌漱口水。这种类型的漱口水典型地包括海克替啶、氯己定二葡糖酸盐或氯化十六烷基吡啶。这种类型的产品的目的是降低微生物和细菌的量或作用。
[0012] 四环素已经被普遍地用于治疗早发型牙周炎。然而，仍然存在以下问题：菌株发展出对四环素的抗性以及其他病原性微生物生长过度的可能性。考虑到牙周疾病的发病率，在本领域中需要安全的预防性和治疗策略。根据对牙周感染作为全身性疾病(例如冠心病)的风险因素的可能性作用的近期关注，控制牙周疾病也是极其重要的。因此，在本领域中需要早发型牙周炎、局部和全身性青少年型牙周炎以及快速进展性或顽固性成人牙周炎的治疗和预防方法。
[0013] 通过形成多组分粒子来递送口腔护理化合物披露于美国专利号6,589,562中，其中这些组分之一是对湿气敏感的阻挡层，该阻挡层包围由蜡、活性成分以及阳离子型脂质构成的纳米粒子。美国专利号6,696,047披露了在多种口腔护理组合物(如牙膏或漱口液产品)中的稳定化亚氯酸钠。高度反应性亚氯酸钠的稳定是通过确保最终组合物的pH是至少10或更大来实现的。这对口腔护理组合物来说是一个显著的限制，这些口腔护理组合物可以包含pH敏感性组分，如多磷酸盐。
[0014] 通常，化学和生物剂具有一些缺点，如使牙齿或舌变色、口腔粘膜脱落和酸痛、令人讨厌的味道、毒性，并且还可能造成口腔菌丛的不平衡。另外，在出售的口腔护理产品中，几乎所有的活性化学和生物剂都具有抗细菌/抗微生物活性和/或生物膜抑制活性。换句话说，这些药剂不有效抵抗预先存在的牙生物膜(牙斑)中的细菌。因此，需要研发生物学上安全并有效的口腔护理产品，这些产品含有具有抗微生物和生物膜抑制活性以及破坏活性两者的活性成分。发明概述
[0015] 在本领域中仍然需要一种有效的递送系统以将口腔护理化合物有效地结合到口腔护理组合物中。可以在口腔护理组合物中获得这些属性的一种类型的递送系统是吸附型纳米粒子或微粒递送系统。
[0016] 本发明提供了用于通过预防和/或治疗口腔疾病来维持口腔健康的组合物和方法，这些口腔疾病是如龋齿、齿龈炎、牙周炎、龋齿以及口腔细菌感染或疾病。
[0017] 本发明的一个实施例提供了一种组合物，该组合物包含：(a)一种铁多价螯合糖蛋白；和(b)一种或两种螯合剂。
[0018] 在另一个实施例中，本发明的组合物包含：(a)少量的至少一种铁多价螯合糖蛋白，(b)少量的至少一种螯合剂，其中组分(a)和(b)中的每一者的量足以形成一种抵抗口腔中的细菌感染的有效的抗感染组合物。
[0019] 在又一个实施例中，本发明的组合物包含：(a)少量的至少一种铁多价螯合糖蛋白，(b)少量的至少一种螯合剂，以及(c)一种药学上可接受的赋形剂。
[0020] 本发明的再另一个实施例提供了一种抗感染组合物，该组合物包含有效抵抗引起口腔疾病的细菌和真菌的一种铁多价螯合糖蛋白和一种或两种螯合剂，这些口腔疾病是如龋齿、齿龈炎以及牙周炎。该组合物有效抵抗口腔疾病相关的细菌。
[0021] 本发明的另一个实施例提供了一种抗感染组合物，该组合物包含有效抵抗兽医学口腔疾病相关的细菌的一种铁多价螯合糖蛋白和一种或两种螯合剂。
[0022] 在一个实施例中，该铁多价螯合糖蛋白是介于该组合物的约50mg/L与约500mg/L之间。该螯合剂是介于该组合物的约400mg/L与约4,000mg/L之间。
[0023] 该铁多价螯合糖蛋白可以选自下组，该组由以下各项组成：全和脱辅基卵铁传递蛋白、全或脱辅基乳铁传递蛋白和血清铁传递蛋白。这些螯合剂可以选自下组，该组由以下各项组成：EDTA、EGTA、DTPA、EDDHA、IDA、CDTA、HEDTA、HEIDA、NTA、柠檬酸钠、柠檬酸钾以及柠檬酸锌。
[0024] 在另一个实施例中，该铁多价螯合剂是脱辅基-卵铁传递蛋白并且该螯合剂是EDTA二钠。该脱辅基-卵铁传递蛋白能够以约1mg/ml存在并且该EDTA二钠能够以约2mg/ml存在。
[0025] 在又一个实施例中，该铁多价螯合剂是乳铁传递蛋白并且该螯合剂是EDTA二钠。该乳铁传递蛋白能够以约0.05mg/ml存在并且该EDTA二钠能够以约2mg/ml存在。
[0026] 在另一个实施例中，该铁多价螯合剂是乳铁传递蛋白并且这些螯合剂是EDTA二钠和柠檬酸钠。该乳铁传递蛋白能够以约0.05mg/ml存在并且该EDTA二钠和柠檬酸钠能够分别以约2mg/ml和3mg/ml存在。
[0027] 本发明的再另一个实施例提供了一种抗生物膜-抗微生物口服组合物，该组合物包括EDTA二钠和柠檬酸钠。该EDTA二钠能够以约1mg/ml，优选地从约0.5mg/ml到约0.25mg/ml，并且最优选地从约0.025mg/ml到约0.010mg/ml存在。该柠檬酸钠能够以约
3mg/ml，优选地从约2mg/ml到约1mg/ml存在。
3mg/ml，优选地从约2mg/ml到约1mg/ml存在。
[0028] 该组合物可以进一步包含一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：水、柠檬酸盐缓冲液、稳定剂、一种调味剂、维生素、矿物(柠檬酸锌、乳酸锌、葡萄糖酸锌、氯化锌等)、草药、一种表面活性剂、一种抗微生物肽、一种抗微生物剂以及一种pH调节剂。
[0029] 本发明还传授了制备一种用于以多种方式口服给予的合适的配制品的方法，例如呈一种液体、一种干燥的质量块、一种牙粉、一种漱口水、一种漱口液、一种液体悬浮液、一种局部药剂、一种粉末状食物补充剂、一种糊剂、一种凝胶、一种固体食物、一种包装食物、一种薄饼、糖锭、口香糖等形式。这些配制品还可以包括天然的或合成的调味剂和食物质量着色剂。也可以向本发明的组合物中添加增稠剂，如玉米淀粉、瓜尔胶、卡波普、聚乙二醇、普朗尼克F-127以及黄原胶。
[0030] 本领域普通技术人员应容易清楚其他配制品。本发明的组合物可以包含一种营养补充组分并且可以包含多种营养剂中的任一种，如众所周知包括维生素、矿物、必需和非必需氨基酸、碳水化合物、脂质、食物、膳食补充剂等。
[0031] 本发明还传授了脂质体或纳米粒子递送系统的用途，这些系统增强了这些组合物中的抗感染化合物的稳定性和功效。这些递送系统也适用于递送一种与螯合剂EDTA二钠和柠檬酸钠组合的聚乙二醇化和/或氟化的铁多价螯合糖蛋白脱辅基-卵铁传递蛋白或乳铁传递蛋白。附图简要说明
图1是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对形成龋齿相关的牙斑的变形链球菌生物膜的抑制作用。
图2是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对形成龋齿相关的牙斑的表兄链球菌生物膜的抑制作用。
图3是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对形成龋齿相关的牙斑的口腔链球菌生物膜的抑制作用。
图4是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对形成龋齿相关的牙斑的血液链球菌(血链球菌)生物膜的抑制作用。
图5a是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT，125μg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，250μg/ml)组合对齿龈炎相关的牙龈卟啉单胞菌生物膜的抑制作用。
图5b是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT，500μg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，1000μg/ml)组合对齿龈炎相关的牙龈卟啉单胞菌生物膜的抑制作用。
图6是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT，125μg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，250μg/ml)组合对牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生物膜的抑制作用。
图7a是一个条形图，示出了乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)单独和组合形式对形成龋齿相关的牙斑的变形链球菌生长和生物膜形成的抑制作用。
图7b是一个条形图，示出了乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)单独和组合形式对形成龋齿相关的牙斑的血液链球菌(血链球菌)生长和生物膜形成的抑制作用。
图8是一个条形图，示出了乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)单独和组合形式对牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生长和生物膜形成的抑制作用。
图9是一个条形图，示出了乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)配制品对形成龋齿相关的牙斑的牙周炎相关的变形链球菌、表兄链球菌、格氏链球菌、血液链球菌(血链球菌)以及牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生长和生物膜的抑制作用。
图10a是一个条形图，示出了含有乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)的配制品相比于市售宠物口腔护理产品(Pet Dental、Slurp n fresh以及Healthy mouth)的配制品对形成龋齿相关的牙斑的变形链球菌生物膜的抑制作用。
图10b是一个条形图，示出了含有乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)的配制品相比于市售宠物口腔护理产品(Pet Dental、Slurp n fresh以及Healthy mouth)的配制品对形成龋齿相关的牙斑的血液链球菌生物膜的抑制作用。
图10c是一个条形图，示出了含有乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)的配制品相比于市售宠物口腔护理产品(Pet Dental、Slurp n fresh以及Healthy mouth)的配制品对牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生物膜的抑制作用。
图11是一个条形图，示出了含有乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)的饮用水添加剂配制品在比格犬(Beagle dog)中相比于未处理过的对照比格犬在减少斑块、齿龈炎以及牙垢(牙结石)方面的作用。
图12a是一个条形图，示出了不同浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，1.0、0.5以及
0.25mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)组合对形成龋齿相关的牙斑的变形链球菌生物膜的抑制作用。
图12b是一个条形图，示出了不同浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，1.0、0.5以及
0.25mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)组合对形成龋齿相关的牙斑的格氏链球菌生物膜的抑制作用。
图12c是一个条形图，示出了不同浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，1.0、0.5以及
0.25mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)组合对形成龋齿相关的牙斑的血液链球菌(血链球菌)生物膜的抑制作用。
图12d是一个条形图，示出了不同浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，1.0、0.5以及
0.25mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)组合对牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生物膜的抑制作用。
图13a是一个条形图，示出了含有固定浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.5mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)和不同浓度的乳酸锌(ZL，0.10、0.05、0.025mg/ml)的配制品对形成龋齿相关的牙斑的血液链球菌(血链球菌)生物膜的抑制作用。
图13b是一个条形图，示出了含有固定浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.50mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)和不同浓度的乳酸锌(ZL，0.10、0.05、0.025mg/ml)的配制品对牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生物膜的抑制作用。
图14a是一个条形图，示出了乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.25mg/ml)和柠檬酸钠
(S.cit，3.2mg/ml)组合相比于单独化合物对变形链球菌生物膜的作用的协同抑制作用。
图14b是一个条形图，示出了乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.25mg/ml)和柠檬酸钠
(S.cit，1.6mg/ml)组合相比于单独的化合物对变形链球菌生物膜的作用的协同抑制作用。
图14c是一个条形图，示出了乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.25mg/ml)和柠檬酸钠
(S.cit，3.2mg/ml)组合相比于单独化合物对伴放线菌聚集菌生物膜的作用的协同抑制作用。
图14d是一个条形图，示出了乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.25mg/ml)和柠檬酸钠
(S.cit，1.6mg/ml)组合相比于单独的化合物对伴放线菌聚集菌生物膜的作用的协同抑制作用。
发明详细说明
定义
图1是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对形成龋齿相关的牙斑的变形链球菌生物膜的抑制作用。
图2是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对形成龋齿相关的牙斑的表兄链球菌生物膜的抑制作用。
图3是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对形成龋齿相关的牙斑的口腔链球菌生物膜的抑制作用。
图4是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对形成龋齿相关的牙斑的血液链球菌(血链球菌)生物膜的抑制作用。
图5a是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT，125μg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，250μg/ml)组合对齿龈炎相关的牙龈卟啉单胞菌生物膜的抑制作用。
图5b是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT，500μg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，1000μg/ml)组合对齿龈炎相关的牙龈卟啉单胞菌生物膜的抑制作用。
图6是一个条形图，示出了卵铁传递蛋白(OT，125μg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，250μg/ml)组合对牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生物膜的抑制作用。
图7a是一个条形图，示出了乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)单独和组合形式对形成龋齿相关的牙斑的变形链球菌生长和生物膜形成的抑制作用。
图7b是一个条形图，示出了乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)单独和组合形式对形成龋齿相关的牙斑的血液链球菌(血链球菌)生长和生物膜形成的抑制作用。
图8是一个条形图，示出了乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)单独和组合形式对牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生长和生物膜形成的抑制作用。
图9是一个条形图，示出了乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠
(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)配制品对形成龋齿相关的牙斑的牙周炎相关的变形链球菌、表兄链球菌、格氏链球菌、血液链球菌(血链球菌)以及牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生长和生物膜的抑制作用。
图10a是一个条形图，示出了含有乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)的配制品相比于市售宠物口腔护理产品(Pet Dental、Slurp n fresh以及Healthy mouth)的配制品对形成龋齿相关的牙斑的变形链球菌生物膜的抑制作用。
图10b是一个条形图，示出了含有乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)的配制品相比于市售宠物口腔护理产品(Pet Dental、Slurp n fresh以及Healthy mouth)的配制品对形成龋齿相关的牙斑的血液链球菌生物膜的抑制作用。
图10c是一个条形图，示出了含有乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)的配制品相比于市售宠物口腔护理产品(Pet Dental、Slurp n fresh以及Healthy mouth)的配制品对牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生物膜的抑制作用。
图11是一个条形图，示出了含有乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，2mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)的饮用水添加剂配制品在比格犬(Beagle dog)中相比于未处理过的对照比格犬在减少斑块、齿龈炎以及牙垢(牙结石)方面的作用。
图12a是一个条形图，示出了不同浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，1.0、0.5以及
0.25mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)组合对形成龋齿相关的牙斑的变形链球菌生物膜的抑制作用。
图12b是一个条形图，示出了不同浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，1.0、0.5以及
0.25mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)组合对形成龋齿相关的牙斑的格氏链球菌生物膜的抑制作用。
图12c是一个条形图，示出了不同浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，1.0、0.5以及
0.25mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)组合对形成龋齿相关的牙斑的血液链球菌(血链球菌)生物膜的抑制作用。
图12d是一个条形图，示出了不同浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，1.0、0.5以及
0.25mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)组合对牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生物膜的抑制作用。
图13a是一个条形图，示出了含有固定浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.5mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)和不同浓度的乳酸锌(ZL，0.10、0.05、0.025mg/ml)的配制品对形成龋齿相关的牙斑的血液链球菌(血链球菌)生物膜的抑制作用。
图13b是一个条形图，示出了含有固定浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.50mg/ml)和柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)和不同浓度的乳酸锌(ZL，0.10、0.05、0.025mg/ml)的配制品对牙周炎相关的伴放线菌聚集菌生物膜的抑制作用。
图14a是一个条形图，示出了乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.25mg/ml)和柠檬酸钠
(S.cit，3.2mg/ml)组合相比于单独化合物对变形链球菌生物膜的作用的协同抑制作用。
图14b是一个条形图，示出了乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.25mg/ml)和柠檬酸钠
(S.cit，1.6mg/ml)组合相比于单独的化合物对变形链球菌生物膜的作用的协同抑制作用。
图14c是一个条形图，示出了乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.25mg/ml)和柠檬酸钠
(S.cit，3.2mg/ml)组合相比于单独化合物对伴放线菌聚集菌生物膜的作用的协同抑制作用。
图14d是一个条形图，示出了乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA，0.25mg/ml)和柠檬酸钠
(S.cit，1.6mg/ml)组合相比于单独的化合物对伴放线菌聚集菌生物膜的作用的协同抑制作用。
发明详细说明
定义
[0032] 术语“抗微生物剂”是指杀死或抑制微生物的生长的一种化合物或一种组合物，这些微生物包括(但不限于)细菌和酵母。
[0033] 术语“生物膜形成”是指微生物与表面的附接并且随后发展出多层细胞。
[0034] 术语“龋齿”是指通过由细菌降解可发酵的糖产生的酸所造成的牙齿组织的局部破坏。龋齿的主要致病因子是变形链球菌。通过变形链球菌降解可发酵的糖在牙齿表面上产生了一种酸，该酸破坏了口腔组织，并且更具体地说是牙釉质和牙质。
[0035] 术语“牙斑”是用于发现于牙齿表面上、包埋在细菌和唾液来源的聚合物的基质中的多样性微生物群落(主要是细菌)的通用术语。此外，“牙斑相关的变形链球菌”是指作为牙斑的一个组分的变形链球菌。
[0036] 术语“齿龈炎”是指在不缺失结缔组织的情况下齿龈组织的发炎。
[0037] 术语“抑制”是指至少减少牙斑相关的(例如变形链球菌)生长和生物膜形成。
[0039] 术语“口腔疾病”是指影响口腔的疾病和病症或相关的医学病况。口腔疾病包括(但不限于)龋齿；和牙周疾病(例如齿龈炎、成人牙周炎、早发型牙周炎等)。
[0041] 术语“牙周炎”是指在缺失附接的情况下支撑或围绕牙齿结构的结缔组织发炎和缺失。
[0042] 术语“防治(prophylaxis)”或“预防(prevention)”是指至少预防与出现在哺乳动物中的口腔细菌相关的一种病状，特别是当发现该哺乳动物倾向于患有该病状但又尚未诊断为患有该病状时。
[0043] 术语“受试者”是指需要治疗的活的脊椎动物，如哺乳动物(优选地是人类和玩赏动物)。
[0045] 如在此所用的“预防量”包括防治性量，例如可有效预防或保护免遭龋齿和相关疾病及其症状的量，以及可有效缓解或愈合龋齿、相关疾病及其症状的量。通过与一种抗微生物剂并行给予一种适合用于本发明的方法的肽，该肽和/或该抗微生物剂能够以小于当给予该抗微生物剂作为唯一的活性成分时所需的剂量的剂量给予。通过给予更低剂量的活性成分，可以降低与此相关的副作用。
[0046] 术语“治疗”是指伴随预防现有病症的进一步发展或改变其病理学的意图进行的一种干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗与防治性或预防性措施两者。需要治疗的那些受试者包括已经患有该病症的那些受试者以及要预防该病症的那些受试者。就龋齿而言，“治疗(treating)或治疗(treatment)”打算意指至少缓解受试者，如哺乳动物，包括(但不限于)人类中与变形链球菌相关的病状，该受试者至少部分被该病状影响，并且包括(但不限于)调节、抑制该病状和/或缓解该病状。
[0047] 本发明传授了提供抗微生物和抗生物膜活性的抗感染组合物，这些抗感染组合物含有铁多价螯合糖蛋白与其他抗微生物剂的组合，例如像抗微生物剂/抗生物膜化合物、螯合剂与表面活性剂或稳定剂。
[0048] 将铁多价螯合糖蛋白与螯合剂组合在一起从而使得铁多价螯合糖蛋白和/或螯合剂的数量将比抗微生物组合物通常所需的低的新颖组合物被用于获得显著的细菌生长和生物膜抑制。可以使用更高浓度的这些化合物，如果某些应用希望如此的话。
[0049] 待用于本发明的抗微生物组合物中的铁多价螯合糖蛋白的量可以介于25到2000mg/L之间。这个规定范围的较高端可以用于制备一种浓缩产品，该产品将在使用之前进行稀释。关于非浓缩产品，待用于本发明中的铁多价螯合糖蛋白的量优选地是介于约
25到1000mg/L之间。优选地，该范围是介于约25到500mg/L之间，更优选地介于约25到
100mg/L之间。
25到1000mg/L之间。优选地，该范围是介于约25到500mg/L之间，更优选地介于约25到
100mg/L之间。
[0050] 待使用的螯合剂的量应该介于约500到4000mg/L之间。如果将组合物配制为浓缩物，那么可以采用这个范围的较高端。关于非浓缩产品，待用于本发明中的螯合剂的量优选地是介于约500到3000mg/L之间。优选地，该范围是介于约1000到3000mg/L之间，更优选地介于约2000到3000mg/L之间。制备
[0051] 通过一种方法，如果形成一种含有螯合剂和铁多价螯合糖蛋白的双组分组合物，那么可以按以下方式组合这些化合物。在良好搅拌的情况下，螯合剂可以溶解于水中，接着是铁多价螯合糖蛋白。然而，应该指出的是，添加顺序可以颠倒。
[0052] 此外，抗微生物剂/抗微生物肽、抗生素、抗生物膜化合物、季铵化合物以及表面活性剂也可以有利地与铁多价螯合糖蛋白组合于抗微生物组合物中。本发明的组合物包含：(a)少量的至少一种铁多价螯合糖蛋白；(b)少量的一种抗微生物肽或一种抗生素或一种抗生物膜化合物；以及(c)剩下量的至少一种来自下组的化合物，该组由一种稳定剂和/或一种表面活性剂组成，其中，组分(a)、(b)以及(c)中的每一者的量足以组合形成一种用于预防并治疗口腔疾病的有效的抗感染组合物。
[0053] 组合物中的活性组分的浓度可以如所希望的或所需要的变化以减少使用本发明组合物来预防或治疗口腔疾病的时间量。活性组分浓度的这些变化容易地由本领域的普通技术人员决定。组合物
[0054] 本发明包括用于预防或防治口腔疾病的增强型口服抗感染组合物，这些组合物包含至少一种铁多价螯合糖蛋白和一种螯合剂。
[0055] 在一个实施例中，含有一种铁多价螯合糖蛋白和一种螯合剂的组合物包含一种抗微生物化合物。含有一种铁多价螯合糖蛋白和一种螯合剂与一种抗微生物和/抗生物膜化合物的组合物对口腔细菌生长和生物膜形成具有增强的抑制作用。此外，向一种含有一种铁多价螯合糖蛋白和一种螯合剂的组合物中添加一种抗微生物化合物可以使该组合物有效抵抗与龋齿、齿龈炎以及牙周炎相关的口腔致病菌。
[0056] 在本发明的一个实施例中，增强型口服抗微生物-抗生物膜组合物包含至少一种铁多价螯合糖蛋白、一种螯合剂以及一种或多种抗微生物剂，包括苯并咪唑(例如兰索拉唑和奥美拉唑)、多元醇(例如木糖醇、山梨糖醇等)、多酚(例如表没食子儿茶素没食子酸酯)、防腐剂(例如三氯生、氯己定盐、氯化十六烷基吡啶等)、抗生素、抗龋齿剂以及细菌素(例如乳酸链球菌肽、表皮素、没食子丹宁(gallidennin)、肉桂霉素、耐久霉素、乳链球菌素481等)。此外，这些口服组合物可以包含以下成分：如柠檬酸盐(例如柠檬酸、柠檬酸锌、柠檬酸钠、柠檬酸钾等)、矿物(例如矿物盐，如氯化锌、葡萄糖酸锌、乳酸锌、柠檬酸锌等)、三萜系化合物(例如齐墩果酸和乌索酸)以及壳聚糖。
[0057] 在一个实施例中，一种组合物包含一种抗生素和铁多价螯合糖蛋白以及一种螯合剂。抗生素是众所周知的。抗生素组包括(但不限于)β-内酰胺抑制剂(例如青霉素、氨苄西林、阿莫西林、甲氧西林等)、头胞菌素(例如先锋霉素、头霉素等)、氨基糖苷(例如链霉素、托普霉素等)、多烯(例如两性霉素、制霉菌素等)、大环内酯(例如红霉素等)、四环素(例如四环素、强力霉素等)、硝基咪唑(例如甲硝哒唑)、喹诺酮(例如萘啶酸)、利福霉素(例如利福平)以及磺酰胺(例如磺胺)、硝基芳香族物质(例如氯霉素)以及吡啶(例如异烟肼)。
[0058] 在一个实施例中，一种组合物包含一种多酚、一种铁多价螯合糖蛋白以及一种螯合剂。多酚的一个实例是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCg)。EGCg是一种从绿茶中分离的儿茶素并且具有抗氧化剂和免疫调节活性(松永(Matsunaga)等人，2002，《临床与诊断实验室免疫学》(Clin.Diagn.Lab.Immunol.)9:864-871)。多酚(如来自百里香、腰果树以及桉树的丹宁)的抗微生物活性也是有利的(考恩(Cowan)，《临床微生物学评论》(Clin.Microbiol.Rev.)12:564-582,1999)。
[0059] 在一个实施例中，一种组合物包含一种多元醇、一种铁多价螯合糖蛋白以及一种螯合剂。多元醇也称为糖醇，是碳水化合物类无糖甜味剂。多元醇来源于碳水化合物，其中羰基被还原为伯或仲羟基。多元醇包括(但不限于)山梨糖醇、木糖醇、甘露糖醇以及麦芽糖醇。多元醇已知限制与牙斑相关的口腔链球菌的生长和生物膜形成，牙斑是牙垢(牙结石)和龋齿的一种前体。
[0060] 在一个实施例中，一种组合物包含一种细菌素、一种铁多价螯合糖蛋白以及一种螯合剂。细菌素包括羊毛硫抗生素。变形链球菌产生称作变链素(mutacin)的细菌素抗微生物分子。已经将变链素分为两类：羊毛硫抗生素和非抗生素。细菌素的实例包括(但不限于)乳酸链球菌肽、表皮素(epidernin)、没食子丹宁、肉桂霉素、耐久霉素、乳链球菌素481、变链素I、B-Ny266以及变链素1140。还参见美国专利号6,699,970；6,699,839；6,475,771；6,391,285；6,342,385；6,218,362；以及5,932,469。
[0061] 在一个实施例中，一种组合物包含一种防腐剂、一种铁多价螯合糖蛋白以及一种螯合剂。防腐剂是杀死或抑制在身体外表面上的微生物的生长的药剂。防腐剂包括(但不限于)三氯生、氯己定盐以及氯化十六烷基吡啶。
[0062] 在一个实施例中，一种组合物包含一种抗生物膜化合物、一种铁多价螯合糖蛋白以及一种螯合剂。抗生物膜化合物包括(但不限于)DNA酶I、蛋白酶K、腺苷三磷酸双磷酸酶、顺-2-癸烯酸、海藻酸盐裂解酶、乳铁传递蛋白、镓以及5-氟尿嘧啶。
[0063] 在一个实施例中，一种组合物包含一种或多种抗龋齿剂、一种铁多价螯合糖蛋白以及一种螯合剂。不同的抗龋齿剂是众所周知的并且被包括在本发明的一个实施例中。不同的抗龋齿剂包括(但不限于)苯甲酸酯、倍半萜烯醇(例如法呢醇、橙花叔醇、没药醇以及檀香醇)、卤化对称二苯脲、酚类化合物、芳香族卤酚、间苯二酚、儿茶酚、双酚化合物、富含组氨酸的多肽、氟化物(氟化钠、氟化亚锡、氟化胺、单氟磷酸钠、乳酸钙、甘油磷酸钙、富含脯氨酸的蛋白质、非免疫原性氨基酸片段以及变形链球菌的抗体。
[0064] 在一个实施例中，一种组合物有效抑制口腔疾病相关的细菌的生长和生物膜形成。在恰当的环境条件下，变形链球菌的群体和斑块周围的pH将下降。变形链球菌作为居住在牙斑中的耐酸性最强的生物体的变形链球菌优势成员，将在这个酸性环境中增加其数量并且最终变成斑块群落的一个。这种情况最终导致了牙釉质的溶解，从而引起龋齿的发展。可以使用本发明的实施例来调节感染。
[0065] 本发明的一个实施例还可以包含其他药学上可接受的媒剂、稀释剂以及添加剂，如抗氧化剂、缓冲液以及溶质，这些药剂使得该配制品在预定受体中等张；以及水性和非水性无菌悬浮液，这些悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。口服配制品
[0066] 可以将本发明的组合物添加到适用于将该组合物递送到口腔中的多种配制品中，包括(但不限于)漱口水溶液、研磨性牙粉凝胶、义齿洗液、非研磨性牙粉凝胶、义齿洗液或浸泡液、义齿粘合剂或接合剂、口香糖、糖果、软饮料以及运动饮料。为了提供这样的配制品，将本发明的组合物与一种或多种经口可接受的载体和/或赋形剂组合。
[0067] 配制品包括(但不限于)漱口水溶液、研磨性牙粉凝胶、义齿洗液、非研磨性牙粉凝胶、义齿洗液或浸泡液、义齿粘合剂或接合剂、口香糖、糖果、软饮料、运动饮料以及其他经口可接受的组合物，这些组合物包括一种与一种苯并咪唑、一种多元醇、一种多酚、一种防腐剂、一种抗生素、一种细菌素、一种柠檬酸盐或一种三萜系化合物或壳聚糖组合的铁多价螯合糖蛋白和一种螯合剂，可以通过任何已知的方法来制备。
[0068] 通常生产口服抗感染组合物的方法包括将一种经口可接受的载体和一个有效量的铁多价螯合糖蛋白和螯合剂两者与以下各项组合：一种苯并咪唑、一种多元醇、一种多酚、一种防腐剂、一种抗生素、一种细菌素、一种抗龋齿剂、一种柠檬酸盐、一种三萜系化合物或壳聚糖。
[0069] 多种载体和赋形剂可以被用来配制本发明的一个实施例并且是众所周知的。这些经口可接受的媒剂包括(但不限于)水；乙醇；湿润剂，如聚丙二醇、甘油以及山梨糖醇；胶TM凝剂，如纤维素衍生物、聚氧丙烯/聚氧乙烯嵌段共聚物；结合剂，如Gantrez 、焦磷酸盐、TM
二磷酸盐；增稠剂，如Carbopol 934；凝胶稳定剂，如二氧化硅；甜味剂，如糖精钠；以及其他经过批准的调味剂、防腐剂，如苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯；洗涤剂，如月桂基硫酸钠、月桂基肌氨酸钠以及经过批准的颜料。
治疗方法
二磷酸盐；增稠剂，如Carbopol 934；凝胶稳定剂，如二氧化硅；甜味剂，如糖精钠；以及其他经过批准的调味剂、防腐剂，如苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯；洗涤剂，如月桂基硫酸钠、月桂基肌氨酸钠以及经过批准的颜料。
治疗方法
[0070] 本发明的另一个方面包括一种用于治疗龋齿、齿龈炎以及牙周炎的方法。通常与一种或多种抗龋齿/抗微生物剂组合的铁多价螯合糖蛋白和螯合剂接触来治疗，该一种或多种抗龋齿/抗微生物剂有效减少与龋齿、齿龈炎以及牙周炎相关的口腔细菌。，龋齿和牙周疾病可以通过使受试者的口腔与一定量的
[0071] 在一个实施例中，将一种铁多价螯合糖蛋白和一种螯合剂一起配制成一种如在此所述的经口可接受的药物，该药物包含一种载体和一个有效量的组合物，该组合物包含一种铁多价螯合糖蛋白和一种螯合剂作为活性成分。
[0072] 本发明的口服组合物的一个示例性给药方案是每当受试者吃一种含糖饲料或食物时将一种组合物施加到受试者(动物或人类)的口腔。举例来说，人每天通常吃含糖食物从一次到三次。根据这个实施例，受试者将在食用含糖食物或饮料之后不久每天从一次到三次将本发明的组合物施加到口腔中，作为抑制或治疗龋齿的常规口腔卫生程序的一部分、作为预防或治疗齿龈炎的惯例或作为预防或治疗牙周疾病的惯例。对于动物或宠物，本发明的组合物可以一天一次用于饮用水中或饲料中，或一天一次用于刷牙的糊剂中，或一天一次或两次用于咀嚼的饼干中。
[0073] 在本发明的另一个实施例中，一种增强型口服抗感染组合物不存在牙染色和毒性问题。此外，包含一种铁多价螯合糖蛋白(卵铁传递蛋白或乳铁传递蛋白)和螯合剂(NaEDTA和柠檬酸钠)的本发明的组合物具有GRAS(总体上认为安全)状态。
[0074] 本发明本发明。可以参考以下实例更好地理解。这些实例打算是代表本发明的特定实施例，并且不打算限制本发明的范围。实例
实例1：卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对龋齿相关的生物膜的抑制作用。
实例1：卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对龋齿相关的生物膜的抑制作用。
[0075] 使用96孔结晶紫染色生物膜检定来测定卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对参与牙斑(生物膜)形成的引起龋齿的细菌的抑制作用。简单来说，储用培养物生长在厌氧条件下，在含有0.3％酵母提取物(THYE)和0.01％猪胃粘蛋白，pH7.0的托德休伊特培养基(Todd Hewitt media)中。生物膜在96孔科斯塔(Costar)3598微量滴定板(纽约科宁的科宁公司(Corning Inc.,Corning,NY))中发展。静态生物膜的生长是通过将3.3％的过夜培养物接种到半合成最小(SDM)培养基中开始的，该培养基含有盐(58mM K2HPO4、15mM KH2PO4、10mM(NH4)2SO4、35mM NaCl以及2mM MgSO4·7H2O)、维生素(0.04mM烟酸、0.1mM吡哆醇盐酸盐、0.01mM泛酸、1μM核黄素、0.3μM硫胺盐酸盐、0.05μM d-生物素)、氨基酸(4mM L-谷氨酸、1mM L-精氨酸盐酸盐、1.3mM L-半胱氨酸盐酸盐、0.1mM L-色氨酸)、0.2％酪蛋白氨基酸以及20mM葡萄糖，pH7.0。细菌在不存在(对照)或存在卵铁传递蛋白(OT，125μg/ml)和EDTA二钠(NaEDTA，250μg/ml)组合的情况下生长。在37℃下在厌氧条件下孵育各板的变形链球菌UA159、表兄链球菌HNG909S、口腔链球菌NCTC11472以及血液链球菌NCTC10904持续16小时。通过结晶紫染色和光密度测量法来测量生物膜发展。弃去含有浮游细胞的培养基，并且将生物膜用每孔200μl水冲洗一次并空气干燥过夜。用200μl0.4％(重量/体积)结晶紫将生物膜细胞染色15分钟。去除结晶紫并且每次用200μl水冲洗这些孔，进行三次。将板空气干燥15分钟，将每个孔中的染色溶解于200μl33％乙酸中并且使用微量滴定板读取器(芬兰赫尔辛基雷勃公司的木替斯堪阿克森(Multiskan Ascent,Labsystems,Helsinki,Finland))来测量在630nm下的吸光度。关于每个实验，通过扣除结合到未接种的对照的结晶紫来校正背景染色。通过在相同的96孔微量滴定板中孵育不同的菌株以使可变性降到最低来进行所有比较分析。OT(125μg/ml)和NaEDTA(250μg/ml)的组合对与引起牙垢和龋齿的牙斑相关的所有四种测试的链球菌物质(分别为图1、图2、图3以及图4)的生物膜具有显著的抑制作用。
实例2：卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对齿龈炎相关的生物膜的抑制作用
实例2：卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对齿龈炎相关的生物膜的抑制作用
[0076] 使用96孔结晶紫染色生物膜检定来测定卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对齿龈炎相关的生物膜形成的抑制作用。简单来说，甘油储备液生长于补充有0.025％甲萘醌(5mg/ml)、0.1％血晶素(1mg/ml)以及5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂板上，在厌氧条件下持续48小时。液体培养物(25ml)生长于厌氧条件下(24小时)，在补充有0.1％血晶素(1mg/ml)和0.025％甲萘醌(5mg/ml)的托德休伊特培养基中。生物膜在96孔科斯塔3598微量滴定板(纽约科宁的科宁公司)中发展。牙龈卟啉单胞菌W50静态生物膜的生长是通过将过夜培养物以1:10的稀释度接种在改良的盐基培养基中开始的，该培养基含有(10mM Na2H2PO4、10mM KCl、2mM C6H8O7、1.25mM MgCl2、20μM CaCl2、0.1μM Na2MoO4、25μM ZnCl2、50μM MnCl2、5μM CuCl2、10μM CoCl2、5μM H3BO3，调节到pH7.0)。添加到此基质中的是3％牛血清白蛋白、20mMα-酮戊二酸盐以及1％胰蛋白胨，对其进行过滤灭菌并用0.1％血晶素(1mg/ml)和0.025％甲萘醌(5mg/ml)补充。细菌在不存在(对照)或存在卵铁传递蛋白(OT，125μg/ml和500μg/ml)和EDTA钠(NaEDTA，250μg/ml和1000μg/ml)组合的情况下生长。将板在37℃下在厌氧条件下孵育48小时。通过结晶紫染色和光密度测量法来测量生物膜发展。弃去含有浮游细胞的培养基，并且将生物膜用每孔200μl水冲洗两次并空气干燥1小时。用200μl0.4％(重量/体积)结晶紫将生物膜细胞染色
15分钟。去除结晶紫并且用200μl水冲洗这些孔两次。将板空气干燥15分钟，接着溶解于200μl33％乙酸中并且使用微量滴定板读取器(芬兰赫尔辛基雷勃公司的木替斯堪阿克森)来测量在630nm下的吸光度。关于每个实验，通过扣除结合到未接种的对照的结晶紫来校正背景染色。通过在相同的96孔微量滴定板中孵育所有药剂以使可变性降到最低来进行所有比较分析。[注意：所有塑料器皿和培养基在实验之前厌氧地预先孵育最少48小时]。OT(125μg/ml和500μg/ml)和NaEDTA(250μg/ml和1000μg/ml)的组合对与齿龈炎相关的牙龈卟啉单胞菌(图5a和5b)的生物膜具有可观的抑制作用。
实例3：卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对牙周炎相关的生物膜的抑制作用
15分钟。去除结晶紫并且用200μl水冲洗这些孔两次。将板空气干燥15分钟，接着溶解于200μl33％乙酸中并且使用微量滴定板读取器(芬兰赫尔辛基雷勃公司的木替斯堪阿克森)来测量在630nm下的吸光度。关于每个实验，通过扣除结合到未接种的对照的结晶紫来校正背景染色。通过在相同的96孔微量滴定板中孵育所有药剂以使可变性降到最低来进行所有比较分析。[注意：所有塑料器皿和培养基在实验之前厌氧地预先孵育最少48小时]。OT(125μg/ml和500μg/ml)和NaEDTA(250μg/ml和1000μg/ml)的组合对与齿龈炎相关的牙龈卟啉单胞菌(图5a和5b)的生物膜具有可观的抑制作用。
实例3：卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对牙周炎相关的生物膜的抑制作用
[0077] 使用96孔结晶紫染色生物膜检定来测定卵铁传递蛋白(OT)和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)组合对牙周炎相关的生物膜形成的抑制作用。简单来说，甘油储备液生长于补充有5％碳酸氢钠的胰蛋白酶大豆琼脂板上，在厌氧条件下持续48小时。从这些板中移出十个伴放线菌聚集菌UT32的菌落并将其转移到200μl新鲜肉汤[胰蛋白酶大豆肉汤(30g/L)、酵母提取物(6g/L)、右旋糖(8g/L)]中。涡旋10秒，将这200μl转移到2ml新鲜肉汤中并涡旋15秒。使接种体穿过5μM PVDF针筒过滤器(密理博-SV(Millex-SV)目录号SLSVO25LS)。生物膜在96孔科斯塔3598微量滴定板(纽约科宁的科宁公司)中发展。静态生物膜的生长是通过使用接种体将1:10稀释液接种在新鲜肉汤中开始的。细菌在不存在(对照)或存在卵铁传递蛋白(OT，125μg/ml)和EDTA钠(NaEDTA，250μg/ml)组合的情况下生长。将板在37℃下在厌氧条件下孵育48小时。通过结晶紫染色和光密度测量法来测量生物膜发展。弃去含有浮游细胞的培养基，并且将生物膜用每孔200μl水冲洗一次，紧接着用200μl0.4％(重量/体积)结晶紫染色1分钟。去除结晶紫并且每次用200μl水冲洗这些孔，进行三次。将板空气干燥，将每个孔中的染色溶解于200μl33％乙酸中并且使用微量滴定板读取器(芬兰赫尔辛基雷勃公司的木替斯堪阿克森)来测量在630nm下的吸光度。关于每个实验，通过扣除结合到未接种的对照的结晶紫来校正背景染色。通过在相同的96孔微量滴定板中孵育所有药剂以使可变性降到最低来进行所有比较分析。OT(125μg/ml)和NaEDTA(250μg/ml)的组合对与牙周炎相关的伴放线菌聚集菌(图6)的生物膜具有显著的抑制作用。实例4：如通过最小抑制浓度(MIC)检定所测定，卵铁传递蛋白(OT)和EDTA二钠
(NaEDTA)组合对口腔疾病相关的细菌的抑制作用。
(NaEDTA)组合对口腔疾病相关的细菌的抑制作用。
[0078] 测定卵铁传递蛋白和EDTA二钠组合的MIC，以便通过使用肉汤微稀释检定在96孔微量滴定板检定中测定六种生物体，包括变形链球菌(与牙斑和龋齿相关)、口腔链球菌(与牙斑和龋齿相关)、牙龈卟啉单胞菌(与齿龈炎相关)、伴放线菌聚集菌(与牙周炎相关)、绿脓杆菌(与医院感染相关)以及多噬伯克霍尔德氏菌(与肺部感染相关)。简单来说，使细菌菌株在37℃下在厌氧或好氧条件下在用于链球菌属的任一种THYE培养基中生长过夜。然后将用于牙龈卟啉单胞菌的补充有血晶素和甲萘醌的托德休伊特肉汤、用于伴放线菌聚集菌的补充有碳酸氢钠的胰蛋白酶大豆/酵母提取物肉汤以及用于绿脓杆菌和5
多噬伯克霍尔德氏菌的卢里亚(Luria)肉汤稀释到10cfu/mL。向每个孔中添加100mL细菌悬浮液的等分试样。然后向微量滴定板的第一列孔中添加该组合的等分试样(100mL)。
用多头移液器混合微量滴定板孔的内含物并且进行2倍连续稀释以获得所希望浓度的组合。在37℃下在厌氧条件下孵育各板24小时到48小时，并且使用微量滴定板读取器(芬兰赫尔辛基雷勃公司的木替斯堪阿克森)在600nm下进行读取。评定MIC为完全抑制生长的最低抗微生物浓度。在通过平板接种每个浓度评定OD之后验证MIC值。用于MIC测试的最高浓度是4000μg/ml(OT)/8000μg/ml(NaEDTA)。虽然变形链球菌、口腔链球菌、牙龈卟啉单胞菌以及伴放线菌聚集菌的OT/NaEDTA组合的MIC从250μg/ml(OT)/500μg/ml(NaEDTA)到1000μg/ml(OT)/2000μg/ml(NaEDTA)不等，但是该组合即使在高达
4000μg/ml(OT)/8000μg/ml(NaEDTA)的浓度下仍然不对绿脓杆菌和多噬伯克霍尔德氏菌具有任何作用(表1)。因此，测试结果表明OT和NaEDTA组合抵抗与口腔疾病相关的细菌的选择性功效，这些口腔疾病是如龋齿、齿龈炎以及牙周炎。
表1：如通过最小抑制浓度(MIC)检定所测定，卵铁传递蛋白(OT)和EDTA二钠
(NaEDTA)组合对口腔疾病相关的细菌的抑制作用。
实例5：聚乙二醇化卵铁传递蛋白或乳铁传递蛋白的制备方法
多噬伯克霍尔德氏菌的卢里亚(Luria)肉汤稀释到10cfu/mL。向每个孔中添加100mL细菌悬浮液的等分试样。然后向微量滴定板的第一列孔中添加该组合的等分试样(100mL)。
用多头移液器混合微量滴定板孔的内含物并且进行2倍连续稀释以获得所希望浓度的组合。在37℃下在厌氧条件下孵育各板24小时到48小时，并且使用微量滴定板读取器(芬兰赫尔辛基雷勃公司的木替斯堪阿克森)在600nm下进行读取。评定MIC为完全抑制生长的最低抗微生物浓度。在通过平板接种每个浓度评定OD之后验证MIC值。用于MIC测试的最高浓度是4000μg/ml(OT)/8000μg/ml(NaEDTA)。虽然变形链球菌、口腔链球菌、牙龈卟啉单胞菌以及伴放线菌聚集菌的OT/NaEDTA组合的MIC从250μg/ml(OT)/500μg/ml(NaEDTA)到1000μg/ml(OT)/2000μg/ml(NaEDTA)不等，但是该组合即使在高达
4000μg/ml(OT)/8000μg/ml(NaEDTA)的浓度下仍然不对绿脓杆菌和多噬伯克霍尔德氏菌具有任何作用(表1)。因此，测试结果表明OT和NaEDTA组合抵抗与口腔疾病相关的细菌的选择性功效，这些口腔疾病是如龋齿、齿龈炎以及牙周炎。
表1：如通过最小抑制浓度(MIC)检定所测定，卵铁传递蛋白(OT)和EDTA二钠
(NaEDTA)组合对口腔疾病相关的细菌的抑制作用。
实例5：聚乙二醇化卵铁传递蛋白或乳铁传递蛋白的制备方法
[0079] 取100mg卵铁传递蛋白或乳铁传递蛋白放到250ml玻璃瓶中。向该反应混合物中添加含有100mM磷酸钠缓冲液(pH5.0)与20mM氰基硼氢化钠以及有/没有5％山梨糖醇的缓冲液。向以上搅拌过的蛋白质溶液中添加20kDa甲氧基-聚乙二醇-丙醛(mPEG-醛)。然后将mPEG-醛转移到含有蛋白质溶液的瓶中。将蛋白质浓度维持在5mg/ml。然后在2℃到8℃下搅拌反应混合物过夜。通过添加40mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)，在该缓冲液(使体积是反应体积的五倍)中有和没有5％山梨糖醇的情况下，淬灭反应混合物。粗反应混合物通过尺寸排除色谱和离子交换树脂来纯化并且通过MALDI质谱法来表征。
实例6：氟化卵铁传递蛋白和乳铁传递蛋白的制备方法
实例6：氟化卵铁传递蛋白和乳铁传递蛋白的制备方法
[0080] 铁多价螯合糖蛋白，如卵铁传递蛋白和乳铁传递蛋白分别通过用氟脯氨酸或六氟亮氨酸替换若干个脯氨酸或亮氨酸残基进行氟化。将具有末端6xHis标签的表达目标蛋白质(即卵铁传递蛋白或乳铁传递蛋白)的IPTG诱导型载体转移到大肠杆菌表达细胞系中。q q
共转化不含抑制因子基因lacI 的表达载体与编码lacI 的pRE4。所选的表达细胞系对于要结合到重组蛋白质中的氨基酸来说是有营养缺陷的。Pro-营养缺陷型和Leu-营养缺陷型大肠杆菌菌株JM83和JW5807-2分别用于结合氟脯氨酸和六氟亮氨酸。为了结合所选氨基酸类似物，表达细胞系在37℃下在振荡的情况下于50ml M9最小培养基中生长过夜，该培养基补充有营养缺陷型氨基酸(0.05mM)和恰当的抗生素以维持表达质粒。过夜培养物用于接种补充有自养氨基酸(0.035mM)和抗生素的500ml M9最小培养基。使细胞生长直到营养缺陷型氨基酸完全耗尽为止，并且然后补充营养缺陷型氨基酸(1mM)和IPTG(1mM)的氟化类似物以诱导重组蛋白质合成。在37℃下在振荡的情况下将细胞再培养12到18小时，并通过离心收集。将细胞再悬浮于含有50μg/ml溶菌酶、1mM PMSF以及0.001％意格倍(Igepal)的100mM磷酸钠缓冲液中，进行声处理，储存在冰上，持续30分钟。然后给溶菌液补充RNA酶(10μg/ml)和DNA酶(5μg/ml)，在室温下孵育30分钟，并通过离心澄清。
使澄清的溶菌液穿过Ni-琼脂糖管柱，用100mM磷酸钠缓冲液洗涤，并且用100mM磷酸钠缓冲液中0-100mM咪唑梯度洗脱氟化的重组蛋白质。合并含有目标蛋白质的洗脱份并用水透析，并且然后冻干。
实例7：卵铁传递蛋白和乳铁传递蛋白纳米粒子的制备方法
共转化不含抑制因子基因lacI 的表达载体与编码lacI 的pRE4。所选的表达细胞系对于要结合到重组蛋白质中的氨基酸来说是有营养缺陷的。Pro-营养缺陷型和Leu-营养缺陷型大肠杆菌菌株JM83和JW5807-2分别用于结合氟脯氨酸和六氟亮氨酸。为了结合所选氨基酸类似物，表达细胞系在37℃下在振荡的情况下于50ml M9最小培养基中生长过夜，该培养基补充有营养缺陷型氨基酸(0.05mM)和恰当的抗生素以维持表达质粒。过夜培养物用于接种补充有自养氨基酸(0.035mM)和抗生素的500ml M9最小培养基。使细胞生长直到营养缺陷型氨基酸完全耗尽为止，并且然后补充营养缺陷型氨基酸(1mM)和IPTG(1mM)的氟化类似物以诱导重组蛋白质合成。在37℃下在振荡的情况下将细胞再培养12到18小时，并通过离心收集。将细胞再悬浮于含有50μg/ml溶菌酶、1mM PMSF以及0.001％意格倍(Igepal)的100mM磷酸钠缓冲液中，进行声处理，储存在冰上，持续30分钟。然后给溶菌液补充RNA酶(10μg/ml)和DNA酶(5μg/ml)，在室温下孵育30分钟，并通过离心澄清。
使澄清的溶菌液穿过Ni-琼脂糖管柱，用100mM磷酸钠缓冲液洗涤，并且用100mM磷酸钠缓冲液中0-100mM咪唑梯度洗脱氟化的重组蛋白质。合并含有目标蛋白质的洗脱份并用水透析，并且然后冻干。
实例7：卵铁传递蛋白和乳铁传递蛋白纳米粒子的制备方法
[0081] 将100mg聚D,L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)和100mg卵铁传递蛋白或乳铁传递蛋白溶解于6ml丙酮中。将此溶液在搅拌的同时逐滴添加到20ml0.15％SDS溶液中。混合物维持搅拌1小时并在10,000rpm下离心20分钟，从而将纳米粒子制成球粒。弃去液体并洗涤球粒3次，每次通过将球粒再悬浮于25ml水中，接着在10,000rpm下离心20分钟。最后，使球粒在通风橱中空气干燥并储存在于4℃。实例8：(i)“脂质体卵铁传递蛋白和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)配制品”和(iii)“脂质体乳铁传递蛋白、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)”的制备方法[0082] 根据诺瓦柴克(Novaczek)等人(1991《水生生物毒理学》(Aquatic Toxicology)，
21:103-118)的配方制备多层脂质体。使用胆固醇、十八胺以及磷脂酰胆碱的1:2:7μM混合物来封装卵铁传递蛋白和NaEDTA的水溶液。在氯仿中制备脂质混合物并在通风橱下干燥到25mm直径玻璃试管的壁上。然后添加卵铁传递蛋白-NaEDTA溶液，并且涡旋混合物直到脂质膜不再可见为止。超速离心所得脂质体并洗涤三次以去除游离的卵铁传递蛋白和NaEDTA。
实例9：乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独和组合形式对龋齿相关的生物膜的抑制作用。
21:103-118)的配方制备多层脂质体。使用胆固醇、十八胺以及磷脂酰胆碱的1:2:7μM混合物来封装卵铁传递蛋白和NaEDTA的水溶液。在氯仿中制备脂质混合物并在通风橱下干燥到25mm直径玻璃试管的壁上。然后添加卵铁传递蛋白-NaEDTA溶液，并且涡旋混合物直到脂质膜不再可见为止。超速离心所得脂质体并洗涤三次以去除游离的卵铁传递蛋白和NaEDTA。
实例9：乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独和组合形式对龋齿相关的生物膜的抑制作用。
[0083] 使用96孔结晶紫染色生物膜检定来测定乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独和组合形式对参与牙斑(生物膜)形成的引起龋齿的细菌的抑制作用。简单来说，变形链球菌UA159和血液链球菌(血链球菌)NCTC10904的储用培养物生长在厌氧条件下，在含有0.3％酵母提取物(THYE)和0.01％猪胃粘蛋白，pH7.0的托德休伊特培养基中。生物膜在96孔科斯塔3598微量滴定板(纽约科宁的科宁公司)中发展。静态生物膜的生长是通过将3.3％的过夜培养物接种到半合成最小(SDM)培养基中开始的，该培养基含有盐(58mM K2HPO4、15mM KH2PO4、10mM(NH4)2SO4、35mM NaCl以及2mM MgSO4·7H2O)、维生素(0.04mM烟酸、0.1mM吡哆醇盐酸盐、0.01mM泛酸、1μM核黄素、0.3μM硫胺盐酸盐、0.05μM d-生物素)、氨基酸(4mM L-谷氨酸、1mM L-精氨酸盐酸盐、1.3mM L-半胱氨酸盐酸盐、0.1mM L-色氨酸)、0.2％酪蛋白氨基酸以及20mM葡萄糖，pH7.0。细菌在不存在(对照)或存在单独和组合形式的乳铁传递蛋白(LTF，500μg/ml)、EDTA二钠(NaEDTA，2.5mg/ml)以及柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)的情况下生长。将板在37℃下在厌氧条件下孵育16小时。通过结晶紫染色和光密度测量法来测量生物膜发展。弃去含有浮游细胞的培养基，并且将生物膜用每孔200μl水冲洗一次并空气干燥过夜。用200μl0.4％(重量/体积)结晶紫将生物膜细胞染色15分钟。去除结晶紫并且每次用200μl水冲洗这些孔，进行三次。将板空气干燥15分钟，将每个孔中的染色溶解于200μl33％乙酸中并且使用微量滴定板读取器(芬兰赫尔辛基雷勃公司的木替斯堪阿克森)来测量在630nm下的吸光度。关于每个实验，通过扣除结合到未接种的对照的结晶紫来校正背景染色。通过在相同的
96孔微量滴定板中孵育不同的菌株以使可变性降到最低来进行所有比较分析。LTF(0.5mg/ml)、NaEDTA(2.5mg/ml)以及S.cit(3.2mg/ml)的组合当对与引起牙垢和龋齿的牙斑相关的变形链球菌和血液链球菌(血链球菌)(分别为图7a和7b)进行测试时对生物膜具有显著的抑制作用。
实例10：乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独和组合形式对牙周炎相关的生物膜的抑制作用.
96孔微量滴定板中孵育不同的菌株以使可变性降到最低来进行所有比较分析。LTF(0.5mg/ml)、NaEDTA(2.5mg/ml)以及S.cit(3.2mg/ml)的组合当对与引起牙垢和龋齿的牙斑相关的变形链球菌和血液链球菌(血链球菌)(分别为图7a和7b)进行测试时对生物膜具有显著的抑制作用。
实例10：乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独和组合形式对牙周炎相关的生物膜的抑制作用.
[0084] 使用96孔结晶紫染色生物膜检定来测定乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独和组合形式对牙周炎相关的生物膜形成的抑制作用。简单来说，甘油储备液生长于补充有5％碳酸氢钠的胰蛋白酶大豆琼脂板上，在厌氧条件下持续48小时。从这些板中移出十个伴放线菌聚集菌UT32的菌落并将其转移到200μl新鲜肉汤[胰蛋白酶大豆肉汤(30g/L)、酵母提取物(6g/L)、右旋糖(8g/L)]中。涡旋10秒，将这200μl转移到2ml新鲜肉汤中并涡旋15秒。使接种体穿过5μM PVDF针筒过滤器(密理博-SV目录号SLSVO25LS)。生物膜在96孔科斯塔3598微量滴定板(纽约科宁的科宁公司)中发展。静态生物膜的生长是通过使用接种体将1:10稀释液接种在新鲜肉汤中开始的。细菌在不存在(对照)或存在单独和组合形式的乳铁传递蛋白(LTF，0.5mg/ml)和EDTA二钠(NaEDTA，2.0mg/ml)、柠檬酸钠(S.cit，3.2mg/ml)的情况下生长。将板在37℃下在厌氧条件下孵育48小时。通过结晶紫染色和光密度测量法来测量生物膜发展。弃去含有浮游细胞的培养基，并且将生物膜用每孔200μl水冲洗一次，紧接着用200μl0.4％(重量/体积)结晶紫染色1分钟。去除结晶紫并且每次用200μl水冲洗这些孔，进行三次。将板空气干燥，将每个孔中的染色溶解于200μl33％乙酸中并且使用微量滴定板读取器(芬兰赫尔辛基雷勃公司的木替斯堪阿克森)来测量在630nm下的吸光度。关于每个实验，通过扣除结合到未接种的对照的结晶紫来校正背景染色。通过在相同的96孔微量滴定板中孵育所有药剂以使可变性降到最低来进行所有比较分析。LTF(0.5mg/ml)、NaEDTA(2.0mg/ml)以及S.cit(3.2mg/ml)的组合对与牙周炎相关的伴放线菌聚集菌(图8)的生物膜具有显著的抑制作用。
实例11：如通过最小杀细菌浓度(MBC)检定所测定，乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独、成对以及组合形式对口腔疾病相关的细菌的抑制作用。
实例11：如通过最小杀细菌浓度(MBC)检定所测定，乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独、成对以及组合形式对口腔疾病相关的细菌的抑制作用。
[0085] 测定乳铁传递蛋白(LTF)、EDTA二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独的每一个和成对(LTF与NaEDTA、LTF与S.cit以及NaEDTA与S.cit)以及所有三个(LTF/NaEDTA/S.cit)组合形式的MBC，以便通过使用肉汤微稀释检定在96孔微量滴定板检定中测定两种生物体，包括血液链球菌(犬，与牙斑相关)和犬齿龈液卟啉单胞菌(犬，与犬齿龈炎相关)，接着平板接种以证实细胞死亡。简单来说，使细菌菌株在37℃下在厌氧或好氧条件下在用于链球菌属的任一种THYE培养基中生长过夜。然后将用于犬齿龈液卟啉单胞菌的补5
充有血晶素和甲萘醌的托德休伊特肉汤稀释到10cfu/mL。向每个孔中添加100mL细菌悬浮液的等分试样。然后向微量滴定板的第一列孔中添加该组合的等分试样(100mL)。用多头移液器混合微量滴定板孔的内含物并且进行2倍连续稀释以获得所希望浓度的组合。在
37℃下在厌氧条件下孵育各板24小时到48小时，并且使用微量滴定板读取器(芬兰赫尔辛基雷勃公司的木替斯堪阿克森)在600nm下进行读取。评定MBC为完全抑制生长的最低抗微生物浓度。在通过平板接种每个浓度评定OD之后验证MBC值。用于MBC测试的最高浓度是20mg/ml(LTF)、8mg/ml(NaEDTA)以及112mg/ml(S.cit)。
充有血晶素和甲萘醌的托德休伊特肉汤稀释到10cfu/mL。向每个孔中添加100mL细菌悬浮液的等分试样。然后向微量滴定板的第一列孔中添加该组合的等分试样(100mL)。用多头移液器混合微量滴定板孔的内含物并且进行2倍连续稀释以获得所希望浓度的组合。在
37℃下在厌氧条件下孵育各板24小时到48小时，并且使用微量滴定板读取器(芬兰赫尔辛基雷勃公司的木替斯堪阿克森)在600nm下进行读取。评定MBC为完全抑制生长的最低抗微生物浓度。在通过平板接种每个浓度评定OD之后验证MBC值。用于MBC测试的最高浓度是20mg/ml(LTF)、8mg/ml(NaEDTA)以及112mg/ml(S.cit)。
[0086] LTF的MBC显示，单独使用的高达20mg/ml浓度的LTF不能够完全抑制血液链球菌(血链球菌)和犬齿龈液卟啉单胞菌(表2的第一列)。在单独的NaEDTA的情况下，高达8.0mg/ml的浓度不能够完全抑制犬齿龈液卟啉单胞菌，但是能够在2.0mg/ml下完全抑制血液链球菌(血链球菌)的生长(表2的第二列)。在单独的的S.cit的情况下，112和28mg/ml的浓度分别能够完全抑制血液链球菌(血链球菌)和犬齿龈液卟啉单胞菌(表2的第三列)。在三个2种化合物组合(LTF与NaEDTA；LTF与S.cit；以及NaEDTA与S.cit)]的情况下，对于血液链球菌(血链球菌)和犬齿龈液卟啉单胞菌来说，LTF与或者NaEDTA或者S.cit的浓度实质上降低以完全抑制生长(表2的第四和第五列)。在NaEDTA与S.cit组合的情况下，血液链球菌(血链球菌)和犬齿龈液卟啉单胞菌在1.0/1.7浓度的情况下受到完全抑制(表2的第六列)。在所有三种化合物组合使用的情况下，血液链球菌(血链球菌)显示LTF和NaEDTA的浓度的实质性降低可见完全抑制。在犬齿龈液卟啉单胞菌的情况下，LTF、NaEDTA以及S.cit实质性降低可见完全抑制(表2中的第七列)。因此，测试结果表明LTF/NaEDTA/S.cit组合抵抗与口腔病况和疾病相关的细菌的功效，这些口腔病况和疾病是如牙斑、齿龈炎以及牙周炎。
表2：如通过最小杀细菌浓度(MBC)检定所测定，乳铁传递蛋白(LTF)、EDTA二钠
(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独和成对(LTF与NaEDTA、LTF与S.cit、NaEDTA与S.cit)以及然后以组合形式(LTF/NaEDTA/S.cit)对口腔疾病相关的细菌的抑制作用。
实例12：乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)配制品对龋齿和牙周炎相关的生物膜的抑制作用。
表2：如通过最小杀细菌浓度(MBC)检定所测定，乳铁传递蛋白(LTF)、EDTA二钠
(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)单独和成对(LTF与NaEDTA、LTF与S.cit、NaEDTA与S.cit)以及然后以组合形式(LTF/NaEDTA/S.cit)对口腔疾病相关的细菌的抑制作用。
实例12：乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)配制品对龋齿和牙周炎相关的生物膜的抑制作用。
[0087] 使用96孔结晶紫染色生物膜检定来测定乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)配制品对引起龋齿和形成牙斑(生物膜)的细菌的抑制作用。还测试了牙周炎相关的细菌。链球菌菌株变形链球菌UA159、表兄链球菌HNG909S、格氏链球菌以及SK120血液链球菌(血链球菌)NCTC10904根据实例编号10生长。伴放线菌聚集菌根据实例编号11生长。LTF(0.5mg/ml)、NaEDTA(2.0mg/ml)以及S.cit(3.2mg/ml)的配制品对与引起牙垢和龋齿的牙斑相关的所有四种测试链球菌物种和与牙周疾病相关的伴放线菌聚集菌的生物膜具有显著的抑制作用(图9)。实例13：比较乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠
(S.cit)配制品与市售伴侣动物口腔护理产品对生物膜的抑制作用。
(S.cit)配制品与市售伴侣动物口腔护理产品对生物膜的抑制作用。
[0088] 使用12孔聚苯乙烯微量滴定板生物膜检定来测定乳铁传递蛋白(LTF)、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)配制品对口腔疾病细菌的抑制作用。简单来说，变形链球菌UA159、血液链球菌(血链球菌)NCTC10904以及伴放线菌聚集菌生物膜在12孔聚苯乙烯微量滴定板上发展，从而提供一种用于分析生物膜包埋的活口腔细菌的迅速并简单的方法。使用4X稀释的补充有最终浓度为0.01％猪胃粘蛋白的THYE培养基作为用于变形链球菌和血液链球菌(血链球菌)的生物膜培养基(BM)。用于伴放线菌聚集菌，使用一种特定的BM[胰蛋白酶大豆肉汤(30g/L)、酵母提取物(6g/L)、右旋糖(8g/L)]。生物膜是通过将20μl细胞悬浮液接种到含有2ml BM的每个孔中开始的并且将十二个孔设置为：两个用于对照并且两个用于每种处理(Pet Dental、Slurp n fresh、Healthy mouth以及该配制品)以及两个用于空白。在37℃下在厌氧条件下孵育培养物20小时，去除流体培养基。将这些孔用10mM PBS缓冲液(pH7.2)冲洗一次并且通过温和的声处理15秒将生物膜包埋的细胞收集在2ml PBS缓冲液中，稀释，然后展涂在THYE板上并在37℃下在厌氧条件下孵育。生物膜包埋的活细胞在孵育48小时之后通过菌落形成单位(CFU)计数进行定量。
LTF(0.5mg/ml)、NaEDTA(2.0mg/ml)以及S.cit(3.2mg/ml)的配制品比市场上的其他伴侣动物口腔护理产品操作表现更好(图10a、10b以及10c)。
实例14：含有乳铁传递蛋白(LTF)、EDTA二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)作为活性成分的口服配制品的体内功效。
LTF(0.5mg/ml)、NaEDTA(2.0mg/ml)以及S.cit(3.2mg/ml)的配制品比市场上的其他伴侣动物口腔护理产品操作表现更好(图10a、10b以及10c)。
实例14：含有乳铁传递蛋白(LTF)、EDTA二钠(NaEDTA)以及柠檬酸钠(S.cit)作为活性成分的口服配制品的体内功效。
[0089] 使用VOHC(美国宾夕法尼亚州的兽医口腔健康委员会(Veterinary Oral Health Council,PA,USA))推荐的针对犬的测试方案，体内试验性功效研究的目的是为了证实LTF-NaEDTA-S.cit配制品在减少牙斑、牙垢(牙结石)以及齿龈炎方面的作用。招募相同数量的犬(成年比格)用于对照和测试组。研究中的所有犬具有类似的尺寸并且不缺牙。对这些犬进行麻醉并且由兽医为每只犬进行牙齿清洁。在犬进入该研究之前和在牙齿清洁之后，将犬的上颌和下颌两者记分为水平0(意指完全无斑块和牙结石)。将含有LTF(0.5mg/ml)、NaEDTA(2mg/ml)以及S.cit(3.2mg/ml)作为活性成分的配制品添加到测试组中的常规饮用水中并且指定常规饮用水为对照组。用于试验的持续时间，给所有的犬(处理和对照)喂食一种对照饲料(粗磨食物，干式喂食)。关于LTF-NaEDTA-S.cit配制品对比对照，该研究监测食物和水的消耗以及犬的体重变化。每只犬的牙齿记分为：上颌(I3，C，P3，P4，MI)，下颌(C，P3，P4，MI)。研究持续时间是14天。预备试验结果显示牙斑、牙垢/牙结石以及齿龈炎明显减少(图11)。此外，在食物或水消耗方面和在体重方面观察到没有差异，从而表明所有犬都健康良好。此预备试验展示了LTF-NaEDTA-S.cit配制品在犬中抵抗与牙斑和牙周疾病相关的细菌的功效。实例15：含有不同浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)和固定浓度的柠檬酸钠(S.cit)的配制品对口腔疾病相关的生物膜的抑制作用
[0090] 使用12孔聚苯乙烯微量滴定板生物膜检定来测定含有不同浓度的NaEDTA(1、0.5以及0.25mg/ml)和固定浓度的S.cit.(3.2mg/ml)的配制品对口腔疾病细菌的抑制作用。简单来说，变形链球菌UA159、格氏链球菌、血液链球菌(血链球菌)NCTC10904以及伴放线菌聚集菌生物膜在12孔聚苯乙烯微量滴定板上发展，从而提供一种用于分析生物膜包埋的活口腔细菌的迅速并简单的方法。使用4X稀释的补充有最终浓度为0.01％猪胃粘蛋白的THYE培养基作为用于变形链球菌、格氏链球菌以及血液链球菌(血链球菌)的生物膜培养基(BM)。用于伴放线菌聚集菌，使用一种特定的BM[胰蛋白酶大豆肉汤(30g/L)、酵母提取物(6g/L)、右旋糖(8g/L)]。生物膜是通过将20μl细胞悬浮液接种到含有2ml BM的每个孔中开始的并且将十二个孔设置为：三个用于对照并且三个用于每种处理以及三个用于空白。在37℃下在厌氧条件下孵育培养物20小时，去除流体培养基。将这些孔用10mM PBS缓冲液(pH7.2)冲洗一次并且通过温和的声处理15秒将生物膜包埋的细胞收集在2ml PBS缓冲液中，稀释，并且然后展涂在THYE板上并在37℃下在厌氧条件下孵育。生物膜包埋的活细胞在孵育48小时之后通过菌落形成单位(CFU)计数进行定量。含有不同浓度的NaEDTA和固定浓度的S.cit的三个测试配制品显示出测试生物体中不同程度的生物膜减少(图12a、12b、12c以及12d)。
实例16：含有固定浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)和柠檬酸钠(S.cit)以及不同浓度的乳酸锌(ZL)的配制品对口腔疾病相关的生物膜的抑制作用
实例16：含有固定浓度的乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)和柠檬酸钠(S.cit)以及不同浓度的乳酸锌(ZL)的配制品对口腔疾病相关的生物膜的抑制作用
[0091] 使用12孔聚苯乙烯微量滴定板生物膜检定来测定含有固定浓度的NaEDTA(0.5mg/ml)和S.cit.(3.2mg/ml)以及不同浓度的ZL(0.025、0.050以及0.1mg/ml)的配制品对口腔疾病细菌的抑制作用。简单来说，血液链球菌(血链球菌)NCTC10904和伴放线菌聚集菌生物膜在12孔聚苯乙烯微量滴定板上发展，从而提供一种用于分析生物膜包埋的活口腔细菌的迅速并简单的方法。使用4X稀释的补充有最终浓度为0.01％猪胃粘蛋白的THYE培养基作为用于血液链球菌(血链球菌)的生物膜培养基(BM)。用于伴放线菌聚集菌，使用一种特定的BM[胰蛋白酶大豆肉汤(30g/L)、酵母提取物(6g/L)、右旋糖(8g/L)]。生物膜是通过将20μl细胞悬浮液接种到含有2ml BM的每个孔中开始的并且将十二个孔设置为：三个用于对照并且三个用于每种处理以及三个用于空白。在37℃下在厌氧条件下孵育培养物20小时，去除流体培养基。将这些孔用10mM PBS缓冲液(pH7.2)冲洗一次并且通过温和的声处理15秒将生物膜包埋的细胞收集在2ml PBS缓冲液中，稀释，并且然后展涂在THYE板上并在37℃下在厌氧条件下孵育。生物膜包埋的活细胞在孵育48小时之后通过菌落形成单位(CFU)计数进行定量。含有不同浓度的ZL和固定浓度的NaEDTA和S.cit的三个测试配制品显示出测试生物体的生物膜减少略微或多或少类似(图13a和
13b)。
实例17：乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)和柠檬酸钠(S.cit)组合相比于单独化合物的作用的对口腔疾病相关的生物膜的协同抑制作用
13b)。
实例17：乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)和柠檬酸钠(S.cit)组合相比于单独化合物的作用的对口腔疾病相关的生物膜的协同抑制作用
[0092] 使用12孔聚苯乙烯微量滴定板生物膜检定来测定NaEDTA(0.025和0.5mg/ml)和S.cit.(1.6和3.2mg/ml)单独和组合形式对口腔疾病细菌的协同抑制作用。简单来说，变形链球菌和伴放线菌聚集菌生物膜在12孔聚苯乙烯微量滴定板上发展，从而提供一种用于分析生物膜包埋的活口腔细菌的迅速并简单的方法。使用4X稀释的补充有最终浓度为0.01％猪胃粘蛋白的THYE培养基作为用于血液链球菌(血链球菌)的生物膜培养基(BM)。
用于伴放线菌聚集菌，使用一种特定的BM[胰蛋白酶大豆肉汤(30g/L)]、酵母提取物(6g/L)、右旋糖(8g/L)]。生物膜是通过将20μl细胞悬浮液接种到含有2ml BM的每个孔中开始的并且将十二个孔设置为：三个用于对照并且三个用于每种处理以及三个用于空白。在
37℃下在厌氧条件下孵育培养物20小时，去除流体培养基。将这些孔用10mM PBS缓冲液(pH7.2)冲洗一次并且通过温和的声处理15秒将生物膜包埋的细胞收集在2ml PBS缓冲液中，稀释，并且然后展涂在THYE板上并在37℃下在厌氧条件下孵育。生物膜包埋的活细胞在孵育48小时之后通过菌落形成单位(CFU)计数进行定量。出乎意料地，在更低浓度下的NaEDTA和S.cit组合形式显示出相比于单独的化合物在变形链球菌和伴放线菌聚集菌生物膜方面减少得更多，从而表明两种化合物之间的一种强烈的协同作用(图14a、14b、14c以及14d)。
用于伴放线菌聚集菌，使用一种特定的BM[胰蛋白酶大豆肉汤(30g/L)]、酵母提取物(6g/L)、右旋糖(8g/L)]。生物膜是通过将20μl细胞悬浮液接种到含有2ml BM的每个孔中开始的并且将十二个孔设置为：三个用于对照并且三个用于每种处理以及三个用于空白。在
37℃下在厌氧条件下孵育培养物20小时，去除流体培养基。将这些孔用10mM PBS缓冲液(pH7.2)冲洗一次并且通过温和的声处理15秒将生物膜包埋的细胞收集在2ml PBS缓冲液中，稀释，并且然后展涂在THYE板上并在37℃下在厌氧条件下孵育。生物膜包埋的活细胞在孵育48小时之后通过菌落形成单位(CFU)计数进行定量。出乎意料地，在更低浓度下的NaEDTA和S.cit组合形式显示出相比于单独的化合物在变形链球菌和伴放线菌聚集菌生物膜方面减少得更多，从而表明两种化合物之间的一种强烈的协同作用(图14a、14b、14c以及14d)。
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