一种治疗癌症的新联合用药方案
阅读：561发布：2020-05-16
专利汇可以提供一种治疗癌症的新联合用药方案专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 治疗 癌症（尤其是肝癌）的新联合用药方案，即索拉菲尼和 磷酸 氟达拉滨 联合用药方案。具体包括索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联用在制备 癌症治疗 药物方面的应用，以及包含索拉菲尼和磷酸氟达拉滨的药物。索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药显示出了协同增效的结果，有进一步提高索拉菲尼对肝癌患者的疗效及肝癌患者的生存获益的潜 力 ，对于索拉菲尼 单药治疗 疗效有限或者 副作用 较大的患者，可以进行索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药 治疗方案 ，以提高索拉菲尼的疗效，提高患者的生存 质量 和生存时间，该联合用药方案为肝癌的临床治疗提供了新的治疗思路和方案策略，具有推向肝癌临床治疗的巨大开发潜力和应用前景。，下面是一种治疗癌症的新联合用药方案专利的具体信息内容。
1.索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联用在制备癌症治疗药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症为肝癌。
3.索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联用在制备抑制癌细胞的药物方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述癌细胞为肝癌细胞。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制为抑制癌细胞的生长和/或转移。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝癌细胞为肝癌细胞种Hep3B、SMMC-
7721、BEL-7402、Huh-7、PLC/PRF/5或SK-Hep-1。
7.一种癌症治疗药物，其特征在于，所述药物包含索拉菲尼和磷酸氟达拉滨。
8.根据权利要求7所述癌症治疗药物，其特征在于，所述癌症为肝癌。
9.根据权利要求7所述癌症治疗药物，其特征在于，所述索拉菲尼和磷酸氟达拉滨的比例为1～12：1～20。
10.根据权利要求7所述癌症治疗药物，其特征在于，所述药物是抑制肝癌细胞生长和/或转移的药物。
一种治疗癌症的新联合用药方案
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种治疗癌症的新联合用药方案。
背景技术
[0002] 癌症通常是由生长迅速的细胞组成，而且他们可能具有各种各样异常的染色体，常呈多形性和不同程度的间变形。从人类词语字典中第一次出现“癌症”这个词至今，人们都是“谈癌色变”，得了癌症，无异于被宣判了死刑。从最初的恐慌、消极等待，到后来的积极治疗、药物治疗、手术治疗等等，人类开始了漫长了“抗癌之争”。如肝癌，是严重威胁人类生命和健康的重要疾病，是世界第五大常见肿瘤，第三大肿瘤相关死亡原因。根据美国癌症协会发布的2012年全球癌症统计数据，2012年，全球新发癌症病例大约为782,500，死亡病例大约为745,500，而其中50%都来自中国。虽然肝癌的传统治疗方法较多，如手术、介入、放疗、化疗、肝移植等，但是只有不到30%的病人能够接受手术或者肝移植等治愈性疗法，且术后复发和转移率很高。而剩余的大部分病人则多为晚期患者，失去了手术或者肝移植的机会。对此，系统性化疗药物治疗，可能是唯一有效的治疗方法。
[0003] 目前，索拉菲尼（Nexavar®）是唯一一个被美国FDA批准用于晚期肝癌患者的标准治疗药物。索拉菲尼是一种口服的多靶点激酶抑制剂，其作用靶点包括Raf-1 and B-Raf, vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFR β), c-KIT 以及 FLT3。两个大规模三期临床试验的结果表明，与安慰剂相比，索拉菲尼能够明显提高肝癌病人的临床获益和生存时间，延缓病人的疾病进展。另外，研究发现，索拉菲尼还适用于肾肿瘤、对放射性碘治疗不再有效的局部复发或转移性、逐步分化型甲状腺等。
[0004] 但是，研究结果同时显示，索拉菲尼使病人获益时间十分有限，生存期延长大概只有2～3个月。因此，急需发现新的肝癌治疗策略，有效提高病人生存期和生活质量。一种全新的治疗药物从研发、试验、注册到上市的整个过程，大约需要10～15年的时间以及500万到20亿美元的投入，周期长，费用高，回报不及时，因此，很多制药公司都不愿意研发全新的抗癌药物。在这个过程中，很多病人因为等不及新的有效药物的上市最终遗憾去世。鉴于此，重新利用FDA已经批准的抗癌药物，以发现其原有治疗效果之外的新疗效，对FDA已经批准的药物进行重新利用，具有重大的现实意义和开发优势。首先，这些药物进行了严格的药理学研究，药物的活性、配方、剂型和有效剂量等已有明确的结论；其次，这些药物进行了严格的药代动力学和药效学研究，药物的安全性和毒性有严格的测评和参考指导；第三，这些药物的原材料大多容易获得，制作工艺成熟，并且已经获得药物监督管理机构的上市批准，这些优势使得有重新利用价值的药物可以更快的进入临床试验，更快的用于新适用症的病人。
[0005] 但是，药物与药物之间的联合用药方案是一个非常复杂的过程，需要考虑两个药物的细胞增殖动力学、作用机制、药物毒性和毒理、抗瘤谱、剂量等等方面。因此，旧药的联合用药新方案的研究利用，是一项庞大复杂的研究课题。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有癌症治疗药物的缺陷和不足，提供一种癌症治疗的联合用药方案，即将索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合应用，可以实现协同增效的作用，显著提高索拉菲尼治疗癌症的疗效，尤其是治疗肝癌的疗效。
[0007] 本发明的目的是提供索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联用在制备癌症治疗药物方面的应用。
[0008] 本发明另一目的是一种包含索拉菲尼和磷酸氟达拉滨的癌症治疗药物。
[0009] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联用在制备癌症治疗药物方面的应用。
[0010] 优选地，所述癌症为肝癌。
[0011] 索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联用在制备抑制癌细胞的药物方面的应用。
[0012] 优选地，所述癌细胞为肝癌细胞。
[0013] 优选地，上述抑制癌细胞的药物为抑制癌细胞的生长和/或转移的药物。
[0014] 更优选地，所述肝癌细胞为肝癌细胞种Hep3B、SMMC-7721、BEL-7402、Huh-7、PLC/PRF/5或SK-Hep-1。
[0015] 一种癌症治疗药物，所述药物包含索拉菲尼和磷酸氟达拉滨。
[0016] 优选地，所述癌症为肝癌。
[0017] 优选地，所述索拉菲尼和磷酸氟达拉滨的比例为1～12：1～20。
[0018] 更优选地，所述索拉菲尼和磷酸氟达拉滨的比例为3：10。
[0019] 更优选地，所述药物是抑制肝癌细胞生长和/或转移的药物。
[0020] 为了寻找与索拉菲尼联合应用能够产生协同抗癌作用的药物，我们用了几十种美国FDA已批准的肿瘤治疗相关药物，与索拉菲尼联合应用于肝癌细胞Hep3B，通过MTS的方法检测细胞增殖，通过计算药物相互作用系数CDI (The coefficient of drug interaction)，将不同药物与索拉菲尼联用的联合用药方案分为协同作用（CDI＜1）、相加作用（CDI=1）、拮抗作用（CDI＞1）三类，结果发现，索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药能够产生协同作用（CDI＜1），显著增强抗癌效率。
[0021] 进一步地，我们又在SMMC-7721、BEL-7402、Huh-7、PLC/PRF/5和SK-Hep-1这五种类型的肝癌细胞中，对索拉菲尼和磷酸氟达拉滨的联合方案进行进一步验证，发现索拉菲尼和磷酸氟达拉滨的联合用药方案在其中四种细胞中都显示出协同作用（CDI＜1）。另外，我们还用从药物公司购买的磷酸氟达拉滨和索拉菲尼联合应用，再次在Hep3B、SMMC-7721、BEL-7402、Huh-7、PLC/PRF/5和SK-Hep-1六种肝癌细胞种进行验证，计算CDI值，也得到相同结论，索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案显著优于索拉菲尼单药方案，对肝癌细胞具有协同抑制作用。
[0022] 利用肝癌细胞进一步进行细胞生长曲线实验、平板克隆形成实验、细胞凋亡检测实验、划痕实验、迁移实验以及Western实验，证实了二者联合用药能够协同抑制肿瘤细胞生长和增殖、促进肿瘤细胞凋亡，以及抑制肿瘤细胞运动和迁移能力。利用肝癌皮下成瘤动物模型以及肝癌肺转移动物模型，也证实二者联合用药优于索拉菲尼单独用药，能够协同抑制肿瘤在小鼠体内的生长和转移，并且具有延长荷瘤鼠生存时间的潜力。联合用药的机制探索实验证实，索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案优于索拉菲尼单药方案，是因为二者对p-Erk具有协同抑制作用，同时，磷酸氟达拉滨能够逆转索拉菲尼单独用药导致的p-Akt的升高，这论证了联合用药能够产生协同作用的分子机制。
[0023] 因此，本发明将索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合应用于肝癌患者的治疗，显示出更好的肝癌抑制效果，对于索拉菲尼单药治疗疗效有限或者副作用较大的患者，可以考虑进行索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药治疗方案，以提高索拉菲尼的疗效，提高患者的生存质量和生存时间。
[0024] 索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药有进一步提高索拉菲尼对肝癌患者的疗效及肝癌患者的生存获益的潜力，具有推向肝癌临床治疗的巨大开发潜力和应用前景。
[0025] 本发明具有以下有益效果：本发明公开了一种治疗癌症（尤其是肝癌）的新联合用药方案，即索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案。这种联合用药方案显示出了协同增效的结果，具有提高索拉菲尼单独用药抑制肝癌的效果，为肝癌的临床治疗提供了新的治疗思路和方案策略。
[0026] 索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药有进一步提高索拉菲尼对肝癌患者的疗效及肝癌患者的生存获益的潜力，对于索拉菲尼单药治疗疗效有限或者副作用较大的患者，可以考虑进行索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药治疗方案，以提高索拉菲尼的疗效，提高患者的生存质量和生存时间，该联合用药方案具有推向肝癌临床治疗的巨大开发潜力和应用前景。附图说明
[0027] 图1是六种肝癌细胞和一种肝永生化细胞L02对索拉菲尼的药物敏感性和IC50值。
[0028] 图2是索拉菲尼与FDA批准抗肿瘤药物联合用药在Hep3B细胞中的筛选结果。
[0029] 图3是索拉菲尼与FDA批准抗肿瘤药物联合用药在SMMC-7721，BEL-7402，Huh-7，PLC/PRF/5，SK-Hep-1五种肝癌细胞中的验证结果。
[0030] 图4是磷酸氟达拉滨和索拉菲尼联合在Hep3B，SMMC-7721，BEL-7402，Huh-7，PLC/PRF/5，SK-Hep-1六种肝癌细胞中再次验证的结果。
[0031] 图5是索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案对肝癌细胞生长增殖、克隆形成以及细胞凋亡的作用。
[0032] 图5为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后的细胞生长曲线图。
[0033] 图6为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后的细胞克隆形成结果。
[0034] 图7为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后流式细胞术检测细胞凋亡结果。
[0035] 图8为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后western blot实验检测细胞凋亡标志性分子。
[0036] 图9为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后细胞划痕愈合实验结果。
[0037] 图10为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后细胞迁移实验结果。
[0038] 图11为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后western blot实验检测EMT分子表达变化情况。
[0039] 图12是索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案对肝癌皮下成瘤小鼠模型的作用；A图为随给药进行各组小鼠皮下瘤体积变化图；B图为剥取各组小鼠皮下瘤称重得到的瘤重图；C图为剥取各组小鼠皮下瘤拍照对比图；D图为随给药进行各组小鼠体重变化图。
[0040] 图13为索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案对肝癌皮下成瘤小鼠模型的作用，各组小鼠皮下瘤组织切片的HE染色图、Ki-67染色图以及TUNEL染色图。
[0041] 图14为索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案对肝癌肺转移小鼠模型的作用，A图为各组小鼠肝癌肺转移情况；B图为各组小鼠肺脏中形成的肝癌转移瘤的HE染色图；图C为各组小鼠肺脏中形成的肝癌转移瘤的大小和数量统计图。
[0042] 图15为肝癌肺转移小鼠模型的各组小鼠生存曲线图。
[0043] 图16是索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案产生协同增效作用的机制研究。
具体实施方式
[0045] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0046] 实施例1 细胞对索拉菲尼的药物敏感性实验首先检测六种肝癌细胞Hep3B，SMMC-7721，BEL-7402，Huh-7，PLC/PRF/5, SK-Hep-1和一种肝永生化细胞L02对索拉菲尼的药物敏感性。
[0047] 1、实验方法细胞铺96孔板，贴壁过夜之后，配制一系列从高到低浓度的索拉菲尼，并设置对照组，加入孔中，每个浓度设置3个复孔。在细胞培养箱中孵育48小时之后，加入MTS，2小时之后利用多功能酶标仪检测490nm波长的细胞OD值，计算索拉菲尼作用于不同细胞的IC50（half maximal inhibitory concentration）值。
[0048] 2、结果如图1所示，图1中，A图为用不同浓度的索拉菲尼处理各肝癌细胞之后的量效曲线；B图为各肝癌细胞对应的IC50值所绘制的柱状图。
[0049] 结果显示，Sk-Hep-1细胞敏感性最高，BEL-7402细胞最低。
[0050] 另外，可根据不同肝癌细胞的IC50值，确定在每种细胞中索拉菲尼单药组的用药浓度。
[0051] 实施例2 联合用药方案研究利用从美国NIH/NCI申请的几十种肿瘤相关治疗药物与索拉菲尼进行联合用药方案在Hep3B 细胞中的筛选。
[0052] 1、实验方法Hep3B肝癌细胞铺96孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为空白对照组，DMSO对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育48小时之后，MTS法检测细胞增殖情况，并根据细胞OD值计算不同联合用药方案的药物相互作用系数CDI值。
[0053] CDI＜1，表示联合用药方案显示出协同作用；CDI=1，表示联合用药方案显示出相加作用；CDI＞1，表示联合用药方案显示出拮抗作用。
[0054] 2、结果如图2所示，图2中，A图为Hep3B细胞接受不同NCI药物与索拉菲尼联合用药处理之后，各实验组中细胞的相对存活率经Z-score转化之后得到的点线图；B图为Hep3B细胞接受不同NCI药物与索拉菲尼联合用药处理之后，显示协同作用的联合用药组合CDI值以及该组合在其他五种肝癌细胞中的CDI值汇总得到的CDI值分布热图；C图为Hep3B细胞接受不同NCI药物与索拉菲尼联合用药处理之后，计算各联合用药方案的CDI值得到的散点图以及所有显示协同作用的联合用药方案的CDI值所绘制的柱状图。
[0055] 结果显示，索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案的CDI＜1，表示索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案显示出明显协同增效的作用。
[0056] 实施例3 索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案研究1、为了验证以上结果，对SMMC-7721，BEL-7402，Huh-7，PLC/PRF/5, SK-Hep-1五种肝癌细胞应用索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案，方法同实施例2中对于Hep3B的方法。
[0057] 2、结果如图3所示，图3中，A图为在SMMC-7721细胞中验证的结果；B图为在BEL-7402细胞中验证的结果；C图为在Huh-7细胞中验证的结果；D图为在PLC/PRF/5细胞中验证的结果；E图为在SK-Hep-1细胞中验证的结果。
[0058] 索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案显示出最为明显的协同增效作用，在五种细胞中的四种细胞都显示出协同增效作用（CDI＜1）。
[0059] 实施例4 索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案验证研究1、为了进一步验证以上结果，用从药物公司购买的磷酸氟达拉滨和索拉菲尼联合应用，再次在Hep3B，SMMC-7721，BEL-7402，Huh-7，PLC/PRF/5, SK-Hep-1六种肝癌细胞中进行验证，方法同实施例2中对于Hep3B的方法。
[0060] 2、结果如图4所示，也得到相同结论，索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案显著优于索拉菲尼单药方案，对肝癌细胞显示出协同抑制作用。
[0061] 实施例5 索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案对肝癌细胞生长增殖、克隆形成以及细胞凋亡的作用1、另外，为了更加全面的论证索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案优于索拉菲尼单药方案，对肝癌具有协同抑制作用，分别进行了细胞生长曲线实验、平板克隆形成实验、细胞凋亡检测实验、划痕实验、迁移实验以及Western实验，肝癌皮下成瘤动物模型以及肝癌肺转移动物模型实验，以及联合用药的分子机制探索实验。
[0062] 2、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞铺96孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育7天，每24小时MTS法检测细胞增殖情况，并根据细胞OD值绘制细胞生长曲线。
[0063] 结果如图5所示，图5为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后的细胞生长曲线图。与对照组以及单药组相比，联合用药对细胞增殖具有明显的协同抑制作用，联合用药组细胞生长速率最慢。
[0064] 3、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育14天，检测细胞平板克隆形成情况。
[0065] 结果如图6所示，图6为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后的细胞克隆形成图。与对照组以及单药组相比，联合用药对细胞克隆形成具有明显的协同抑制作用，联合用药组细胞克隆数量最少，体积最小。
[0066] 4、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时，然后收集各组细胞，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。
[0067] 结果如图7所示，图7为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后流式细胞术检测细胞凋亡图。与对照组以及单药组相比，联合用药对细胞凋亡具有明显的协同促进作用，联合用药组细胞凋亡比例最多。
[0068] 5、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时，然后收集各组细胞，提取细胞蛋白，western方法检测细胞凋亡标志性分子caspase和PARP的剪切情况。
[0069] 结果如图8所示，图8为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后western blot实验检测细胞凋亡标志性分子。与对照组以及单药组相比，联合用药明显促进了细胞凋亡，剪切形式的caspase和PARP明显增多。
[0070] 实施例6 索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案对肝癌细胞迁移能力的作用1、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，进行细胞划痕实验，然后将细胞分为对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时和48小时的时候，分别进行拍照，观察细胞划痕愈合情况。
[0071] 结果如图9所示，图9为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后细胞划痕愈合实验。与对照组以及单药组相比，联合用药对细胞划痕愈合具有明显的协同抑制作用，联合用药组细胞划痕愈合最慢。
[0072] 2、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞铺Transwell小室，分为对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时，观察细胞迁移情况。
[0073] 结果如图10所示，图10为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后细胞迁移实验。与对照组以及单药组相比，联合用药对细胞迁移能力具有明显的协同抑制作用，联合用药组细胞迁移数量最少。
[0074] 3、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时，然后收集各组细胞，提取细胞蛋白，western方法检测EMT过程的标志性分子E-cadherin、N-cadherin、β-catenin的表达情况。
[0075] 结果如图11所示，图11为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞接受各不同组处理之后western blot实验检测EMT分子表达变化情况。与对照组以及单药组相比，联合用药明显抑制了细胞的EMT过程，E-cadherin表达增多，N-cadherin、β-catenin表达减少。
[0076] 实施例7 索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案对肝癌皮下成瘤小鼠模型以及肝癌肺转移小鼠模型的作用1、方法
用Hep3B细胞通过皮下接种构建裸鼠肝癌皮下成瘤模型，用Sk-Hep-1细胞通过尾静脉注射构建裸鼠肝癌肺转移模型，模型构建成功之后，将小鼠分为四组，对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，并进行给药处理，索拉菲尼口服灌胃给药，一天1次，30mg/day/kg，磷酸氟达拉滨腹腔注射给药，一天1次，100mg/day/kg，共给药21天。观察小鼠体内肿瘤的生长和转移情况。
用Hep3B细胞通过皮下接种构建裸鼠肝癌皮下成瘤模型，用Sk-Hep-1细胞通过尾静脉注射构建裸鼠肝癌肺转移模型，模型构建成功之后，将小鼠分为四组，对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，并进行给药处理，索拉菲尼口服灌胃给药，一天1次，30mg/day/kg，磷酸氟达拉滨腹腔注射给药，一天1次，100mg/day/kg，共给药21天。观察小鼠体内肿瘤的生长和转移情况。
[0077] 2、结果如图12~图15所示，（1）肝癌皮下成瘤结果显示（如图12中A～D图所示），图12中，A图为随给药进行各组小鼠皮下瘤体积变化图；B图为剥取各组小鼠皮下瘤称重得到的瘤重图；C图为剥取各组小鼠皮下瘤拍照对比图；D图为随给药进行各组小鼠体重变化图。与对照组以及单药组相比，联合用药对肿瘤生长具有明显的抑制作用，联合用药组肿瘤生长速度最慢，最终剥取的肿瘤体积最小和重量最轻。
[0078] （2）Ki-67以及TUNEL染色结果如图13所示，图13为各组小鼠皮下瘤组织切片的HE染色图、Ki-67染色图以及TUNEL染色图。结果显示，联合用药明显抑制了肿瘤增殖，促进了肿瘤凋亡，联合用药组Ki-67以及TUNEL染色阳性细胞比例和强度最高。
[0079] （3）肝癌肺转移模型结果如图14和图15所示。图14中A图为各组小鼠肝癌肺转移情况；B图为各组小鼠肺脏中形成的肝癌转移瘤的HE染色图；图C为各组小鼠肺脏中形成的肝癌转移瘤的大小和数量统计图。图15为各组小鼠生存曲线图。
[0080] 结果显示，与对照组以及单药组相比，联合用药明显抑制了肝癌细胞的肺转移能力，联合用药组小鼠肺中形成的转移瘤数量最少、面积最小。统计小鼠的生存时间，联合用药组小鼠的生存时间延长。
[0081] 实施例8 索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药方案机制研究1、为了论证联合用药具有协同作用的分子机制，Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组，索拉菲尼单药组，NCI单药组，以及索拉菲尼和NCI药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时，然后收集各组细胞，提取细胞蛋白，检测Erk/p-Erk以及Akt/mTOR信号通路相关分子的表达情况。
[0082] 2、结果如附图16所示。图16中，A图为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞分别接受对照溶液、索拉菲尼单药溶液、NCI单药溶液以及索拉菲尼和NCI药物联合用药溶液处理之后，western blot实验检测Erk/p-Erk和Akt/mTOR信号通路关键分子的表达变化情况；B图为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞分别接受对照溶液、索拉菲尼单药溶液、MK2206溶液（AKT抑制剂）、索拉菲尼和MK2206联合用药溶液处理之后，western blot实验检测AKT/p-AKT分子的表达变化情况；C图为Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞分别接受对照溶液、索拉菲尼单药溶液、Rapamycin溶液（mTOR抑制剂）、索拉菲尼和Rapamycin联合用药溶液处理之后，western blot实验检测mTOR/p-mTOR、S6/p-S6分子的表达变化情况。
[0083] 结果显示，索拉菲尼和磷酸氟达拉滨联合用药对p-Erk具有协同抑制作用，同时，磷酸氟达拉滨能够逆转索拉菲尼单独用药导致的Akt/mTOR信号通路的升高，这是联合用药能够产生协同作用的分子机制。
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