严重联合免疫缺陷动物模型的构建以及应用
阅读：162发布：2020-05-13
专利汇可以提供严重联合免疫缺陷动物模型的构建以及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种严重联合免疫 缺陷 动物模型的构建以及相关应用，该构建方法通过CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码动物T、B细胞的Rag2基因及参与编码细胞因子受体的Il2rg基因，实现了免疫缺陷程度更高的动物模型的构建。，下面是严重联合免疫缺陷动物模型的构建以及应用专利的具体信息内容。
1.一种严重联合免疫缺陷的动物模型的构建方法，该方法涉及对动物T、B细胞的Rag2基因及参与编码细胞因子受体的Il2rg基因的靶向敲除。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的靶向敲除是通过CRISPR/Cas9技术进行动物T、B细胞的Rag2基因及参与编码细胞因子受体的Il2rg基因的靶向敲除。
3.权利要求2所述的方法，其中所述的靶向敲除涉及针对Il2rg基因和Rag2基因设计并合成sgRNA。
4.权利要求3所述的方法，其中所述针对Il2rg基因和Rag2基因的sgRNA分别是针对Il2rg基因第1外显子和Rag2基因第2外显子。
5.权利要求4所述的方法，其中所述sgRNA的结构具体如表1中所示。
6.权利要求1-5任一项所述的方法制备获得的动物模型在制备疾病模型中的用途。
7.针对Il2rg和Rag2基因的sgRNA在制备严重联合免疫缺陷动物模型中的应用。
8.权利要求7所述的应用，其中所述针对Il2rg基因和Rag2基因的sgRNA分别是针对IL2rg基因第1外显子和Rag2基因第2外显子。
9.权利要求8所述的应用，其中所述sgRNA的结构具体如表1中所示。
10.前述任一项权利要求所述的方法或应用，其中所述的动物为小鼠。
严重联合免疫缺陷动物模型的构建以及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种严重联合免疫缺陷动物模型的构建方法以及应用。
背景技术
[0002] 建立免疫缺陷的动物模型普遍用于治疗肿瘤药物的筛选、癌症的治疗方法等试验。利用免疫缺陷的动物模型对研究肿瘤药物、以及其它疾病的治疗机理有着极大的作用，从而可以实现对疾病的治疗和预防控制，从而提高治愈率。
[0003] 1966年研究者发现Foxn1基因突变后小鼠T细胞功能障碍，不能产生细胞特异性免疫反应，由此开辟了自发性免疫缺陷动物研究的先河。随之B细胞缺陷的Beige小鼠、T细胞及B细胞联合缺陷SCID小鼠也相继被发现并在生物医学研究的多个领域得到广泛应用。尽管T细胞和/或B细胞功能障碍后形成的免疫缺陷小鼠在生物医学研究中取得了很多重大的研究成果，但其体内残存的NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等介导的先天性免疫应答反应仍然会对移植物产生免疫排斥反应，从而影响肿瘤在其体内存活。近年来，研究者进行了许多努力，试图找到免疫缺陷程度更高、免疫包容性更强的实验用小鼠以替代裸鼠或SCID小鼠。
[0004] BALB/c小鼠由于其生物学特性明确，是目前免疫学、微生物学等研究领域常用的近交系小鼠。nude基因导入BALB/c小鼠后可培育成传统的免疫缺陷小鼠品系BALB/c-nu/nu，该类小鼠T细胞缺陷，因而T细胞介导的细胞免疫功能严重下降[6]。但该类小鼠B细胞及其他免疫细胞正常，这些细胞介导的免疫反应常会影响动物模型复制效果。如人类肿瘤模型复制时，一些人类肿瘤模型难以在BALB/c-nu/nu裸鼠中建立，除肿瘤细胞致瘤性外，BALB/c-nu/nu裸鼠免疫细胞状态也是影响肿瘤模型复制的关键因素之一。为了克服以上弊端，有必要研究出免疫缺陷程度更高、免疫包容性更强、且遗传背景来源于BALB/c小鼠的动物用于免疫学、微生物学、肿瘤学等领域研究。
[0005] 基于此目的，本发明研究制备出了一种免疫缺陷程度更高的动物模型，有利于各种疾病模型的构建，并进一步利于治疗药物的筛选。
发明内容
[0006] 为了解决现有技术中建立免疫缺陷小鼠品系周期长、品系不纯的技术缺陷，以及冲破美国、日本对我国的技术封锁。本发明研究制备了一种免疫缺陷程度更高、免疫包容性更强的动物模型的构建方法以及应用，从而能够实现各种疾病模型的制备，进一步利于治疗或预防药物的筛选。
[0007] 本发明一方面涉及一种严重联合免疫缺陷的动物模型的构建方法，该方法涉及对动物T、B细胞的Rag2基因及参与编码细胞因子受体的Il2rg基因的靶向敲除。
[0008] 本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述的靶向敲除是通过CRISPR/Cas9技术进行动物T、B细胞的Rag2基因及参与编码细胞因子受体的Il2rg基因的靶向敲除。
[0009] 本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述的靶向敲除涉及针对Il2rg基因和Rag2基因设计并合成sgRNA。
[0010] 本发明第一方面任一项所述的方法，其中针对Il2rg基因和Rag2基因的sgRNA分别是针对IL2rg基因第1外显子和Rag2基因第2外显子。
[0011] 本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述sgRNA的结构具体如表1中所示。
[0012] 本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述的动物为小鼠。
[0013] 本发明第二方面涉及针对Il2rg和Rag2基因的sgRNA在制备严重联合免疫缺陷动物模型中的应用。
[0014] 本发明第二方面任一项所述的应用，其中所述针对Il2rg基因和Rag2基因的sgRNA分别是针对Il2rg基因第1外显子和Rag2基因第2外显子。
[0015] 本发明第二方面任一项所述的应用，其中所述sgRNA的结构具体如表1中所示。
[0016] 本发明第二方面任一项所述的应用，其中所述的动物为小鼠。
[0017] 本发明第三方面涉及一种构建严重联合免疫缺陷小鼠的方法，包括以下步骤：
[0018] (1)寡核苷酸合成及质粒构建；
[0019] (2)体外转录；
[0020] (3)mRNA显微注射及受精卵细胞移植；
[0021] (4)基因敲除小鼠品系建立以及基因型与表型的鉴定。
[0022] 本发明第三方面任一项所述的方法，其中步骤(1)中的寡核苷酸合成是针对Il2rg基因第1外显子和Rag2基因第2外显子设计并合成sgRNA。
[0023] 本发明第三方面任一项所述的方法，其中针对Il2rg和Rag2基因的sgRNA结构具体如表1中所示。
[0024] 本发明第三方面任一项所述的方法，步骤(1)中的sgRNA合成后经退火，连入pX330载体，构建含有sgRNA的pX330质粒。
[0025] 本发明第三方面任一项所述的方法，步骤(1)中获得质粒经测序表明构建正确后，克隆sgRNA及Cas9并在T7启动子作用下进行体外转录，转录产物经电泳鉴定后为单一条带。
[0026] 本发明第三方面任一项所述的方法，步骤(3)涉及在输卵管部位获取受精卵细胞，分别取已转录好的20μg/μL Rag2-sgRNA及10μg/μL Il2rg-sgRNA和5μg/μL Cas9mRNA混合，以Eppendorf NK2显微注射仪注射到受精卵细胞胞质中。
[0027] 本发明第三方面任一项所述的方法，步骤(3)还涉及将受精卵细胞在37℃5％CO2培养箱中继续培养2～3h，取生长状态良好，发育至2细胞期受精卵细胞移植到ICR假孕鼠输卵管部位。
[0028] 本发明第三方面任一项所述的方法，步骤(4)涉及将突变的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得F1代杂合子小鼠，并进一步将F1代杂合子小鼠互交获得双基因突变的纯合子小鼠。
[0029] 本发明第三方面任一项所述的方法，步骤(4)中的基因型检测是指取出生2周左右的F0代小鼠尾组织，裂解后以试剂盒提取小鼠基因组DNA，PCR方法克隆F0代小鼠Rag2和Il2rg基因。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火40s，65℃延伸40s，共进行35个循环。循环结束后以65℃延伸6min。取10μL PCR产物进行电泳，大小正确后进行测序。
[0030] 本发明第三方面任一项所述的方法，步骤(4)中的表型检测是通过剪尾方法取50μL F0代小鼠外周血，红细胞裂解液裂解后以FACS缓冲液洗脱，加入1:1000稀释的FITC-CD3、PE-NKp46及APC-B220抗体室温避光染色30min。FACS缓冲液洗脱后上机检测小鼠外周血白细胞中CD3、B220及NKp46的阳性细胞情况。
[0031] 本发明的有益技术效果：传统基因敲除主要是应用同源重组原理通过插入突变和基因靶向技术使目的基因功能丧失，但这些方法制作周期长，只能在一些专业实验室才能完成。本发明通过CRISPR/Cas9技术，利用sgRNA与同源性的DNA特异性结合，通过sgRNA发挥靶向作用，引导核酸内切酶Cas9在靶点处进行切割，从而达到基因修饰的目的。本发明技术方案中的Rag2和II2rg基因序列分析表明，这两个基因紧邻其上、下游分子，且有部分重叠，如对其进行大片段缺失突变将会影响到上、下游分子表达。据此，本发明以Il2rg基因第1外显子和Rag2基因第2外显子为靶点进行点突变，这种突变不仅可导致Rag2和II2rg基因功能失活，而且也对其上、下游基因表达无明显影响。与传统基因敲除方法相比，本发明的技术方案具有快速、可靠及敲除效率高的特点。本发明通过一步敲除了两个不同的基因，敲除后T细胞、B细胞及NK细胞基本完全缺失，而且细胞因子受体功能也发生障碍，接种人乳腺癌细胞系后肿瘤细胞生长良好，表现出与传统免疫缺陷动物相似的生物学特性。由此获得的免疫缺陷程度更高、免疫包容性更强、且遗传背景来源于BALB/c小鼠的动物可广泛用于免疫学、微生物学、肿瘤学等领域研究。附图说明
[0032] 图1 sgRNA序列设计示意图。
[0033] 图2基因敲除小鼠的基因型鉴定，其中图2A为突变小鼠的PCR鉴定，图2B为靶基因测序结果。
[0034] 图3基因敲除小鼠的表型鉴定，其中图3A为流式细胞检测T细胞、B细胞及NK细胞数量；图3B为基因敲除小鼠接种SKBR-2HL细胞后肿瘤生长情况。
具体实施方式
[0035] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0036] 实施例1 寡核苷酸合成以及质粒构建
[0037] 根据Genbank报道的Rag2和Il2rg基因序列，分别针对Rag2基因第2个外显子及Il2rg基因第1个外显子设计具有靶向作用的sgRNA，sgRNA序列见表1。sgRNA合成后经退火，连入pX330载体，构建含有sgRNA的pX330质粒。质粒小提并经测序后表明质粒构建正确。sgRNA及Cas9克隆后，在T7启动子作用下进行体外转录，转录产物经电泳鉴定后为单一条带，且OD260/280>1.9，OD260/230>2.3。
[0038] 表1 sgRNA靶点及寡核苷酸序列
[0039]sgRNA名称 sgRNA寡核苷酸序列
Rag2-up 5’-caccggcctaagagatcctgtcctac-3’
Rag2-down 5’-aaacgtaggacaggatctcttaggcc-3’
Il2rg-up 5’-caccggagcagctgaaggactaaga-3’
Il2rg-down 5’-aaactcttagtccttcagctgctcc-3’
Rag2-up 5’-caccggcctaagagatcctgtcctac-3’
Rag2-down 5’-aaacgtaggacaggatctcttaggcc-3’
Il2rg-up 5’-caccggagcagctgaaggactaaga-3’
Il2rg-down 5’-aaactcttagtccttcagctgctcc-3’
[0040] 实施例2 体外转录、mRNA显微注射及受精卵细胞移植
[0041] 以pX330-Rag2-sgRNA和pX330-Il2rg-sgRNA质粒为模板，PCR法克隆含T7启动子的Rag2-sgRNA和Il2rg-sgRNA。相同方法克隆Cas9基因，纯化后回收，DNA溶于DEPC水中保存。分别取200ng的Rag2-sgRNA、Il2rg-sgRNA及Cas9纯化后产物进行体外转录，定量后-80℃保存。
[0042] 8周龄BALB/c小鼠雄性与雌性小鼠使用前一天合笼，24h后取见栓的雌性小鼠解剖，在输卵管部位获取受精卵细胞。分别取已转录好的20μg/μL Rag2-sgRNA及10μg/μL Il2rg-sgRNA和5μg/μL Cas9mRNA混合，以Eppendorf NK2显微注射仪注射到受精卵细胞胞质中。受精卵细胞在37℃5％CO2培养箱中继续培养2～3h，取生长状体良好，发育至2细胞期受精卵细胞移植到ICR假孕鼠输卵管部位。
[0043] 实施例3:基因敲除小鼠品系的建立及基因型鉴定
[0044] 取出生2周左右的F0代小鼠尾组织，裂解后以试剂盒提取小鼠基因组DNA，PCR方法克隆F0代小鼠Rag2和Il2rg基因。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火40s，65℃延伸40s，共进行35个循环。循环结束后以65℃延伸6min。取10μL PCR产物进行电泳，大小正确后进行测序。突变的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得F1代杂合子小鼠，F1代杂合子小鼠互交即可获得双基因突变的纯合子小鼠共收集BALB/c小鼠胚胎数740枚，其中
609枚为受精卵细胞，显微注射后有249枚存活，移植到ICR受体鼠后制备F0代首建鼠。测序后取F0代突变小鼠与野生型BALB/c小鼠交配获得F1代小鼠，突变的F1代小鼠互交后获得Rag2和Il2rg双基因突变的F2代纯合子小鼠。F0、F1及F2代小鼠出生约2w后，剪取小鼠尾尖
3mm～5mm组织用于基因组DNA提取。取1μL DNA为模板进行PCR反应，1％凝胶电泳鉴定后发现Rag2基因片段大小为821bp，Il2rg片段大小为686bp，与预期大小相符(图2A)。测序结果表明F0、F1及F2代小鼠IL2rg基因有两个突变型，分别是10bp和11bp的缺失突变；而Rag2基因只有一个突变型，为8bp的缺失突变(图2B)。
609枚为受精卵细胞，显微注射后有249枚存活，移植到ICR受体鼠后制备F0代首建鼠。测序后取F0代突变小鼠与野生型BALB/c小鼠交配获得F1代小鼠，突变的F1代小鼠互交后获得Rag2和Il2rg双基因突变的F2代纯合子小鼠。F0、F1及F2代小鼠出生约2w后，剪取小鼠尾尖
3mm～5mm组织用于基因组DNA提取。取1μL DNA为模板进行PCR反应，1％凝胶电泳鉴定后发现Rag2基因片段大小为821bp，Il2rg片段大小为686bp，与预期大小相符(图2A)。测序结果表明F0、F1及F2代小鼠IL2rg基因有两个突变型，分别是10bp和11bp的缺失突变；而Rag2基因只有一个突变型，为8bp的缺失突变(图2B)。
[0045] 实施例3 基因敲除小鼠表型鉴定
[0046] 通过剪尾方法取50μL F0代小鼠外周血，红细胞裂解液裂解后以FACS缓冲液洗脱，加入1:1000稀释的FITC-CD3、PE-NKp46及APC-B220抗体室温避光染色30min。FACS缓冲液洗脱后上机检测小鼠外周血白细胞中CD3、B220及NKp46的阳性细胞情况。
[0047] 与正常野生型小鼠比较，基因敲除小鼠CD3+T细胞、B220+B细胞及NKp46+NK细胞数量下降明显(图3A)，表明CRISPR/Cas9技术对Rag2和Il2rg基因进行编辑后影响到这两个基因编码的生物学功能，导致T细胞、B细胞及NK细胞数量降低。进一步通过复制人源肿瘤移植模型验证基因敲除小鼠生物学特性，人乳腺癌细胞SKBR-2HL分别接种3只基因敲除小鼠，1周后可见肿瘤细胞在小鼠体内生长，且随着时间延长，肿瘤体积不断增大(图3B)。结合流式检测结果，可见Rag2和Il2rg基因敲除小鼠不仅T细胞、B细胞及NK细胞基本缺失，而且其免疫功能缺陷，移植物可在其体内增殖。
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