利用NK/T淋巴瘤细胞株所构建的免疫缺陷小鼠模型
专利汇可以提供利用NK/T淋巴瘤细胞株所构建的免疫缺陷小鼠模型专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 属于动物 肿瘤 模型构建技术领域，具体涉及一种利用NK/T淋巴瘤细胞株所构建的、可稳定传代的免疫 缺陷 小鼠模型及其构建方法的 专利 申请事宜。该方法包括：分别对接种对象及淋巴瘤细胞株进行预处理，制备肿瘤混悬液并注射小鼠，肿瘤细胞传代等步骤。所述免疫缺陷小鼠模型在医学中可用于药物筛选或疗效评估。本申请所提供的利用NK/T淋巴瘤细胞株构建淋巴瘤动物模型的构建方法，其利用基质胶的固定作用，可将淋巴瘤细胞固定在皮下，从而保证小鼠的成瘤率，表现出成瘤快、成瘤率高的技术优势；另一方面，传代过程中，配合相关肿瘤组织培养液的冻存操作，可随时复苏和直接构建传代用淋巴瘤动物模型。，下面是利用NK/T淋巴瘤细胞株所构建的免疫缺陷小鼠模型专利的具体信息内容。
1.一种利用NK/T淋巴瘤细胞株构建的免疫缺陷小鼠模型的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）分别对接种对象及淋巴瘤细胞株进行预处理，
接种对象采用免疫缺陷型小鼠；在接种淋巴瘤细胞前，注射免疫抑制药物；
肿瘤细胞采用NK/T淋巴瘤细胞株；接种当天，调整细胞浓度为：（1 3）×107/200μL；
~
（2）制备肿瘤悬液混合液，并注射小鼠；
将步骤（1）中预处理后NK/T淋巴瘤细胞株培养液与基质胶混合均匀，以此作为肿瘤混悬液，制备完成后，皮下注射至小鼠腋窝；每只小鼠注射300 500μL注射液；
~
以体积比计，所述淋巴瘤细胞株培养液与基质胶的比例为1:0.8 1.5；
~
注射完肿瘤悬液混合液后，小鼠腹腔内注射rhIL-2，注射量以1.2-3万IU/kg计，每周注射一次至肿瘤肉眼可见；
注射完成后，正常饲养小鼠；
（3）肿瘤细胞传代，待步骤（2）中小鼠体内肿瘤直径长至成熟瘤体后，无菌环境操作剥离瘤块，并剪成小块，在研磨器里研磨分散肿瘤细胞；
与步骤（2）相同，调整细胞浓度后与基质胶混合，注射小鼠；同样小鼠腹腔内注射rhIL-
2；
注射完成后，正常培养小鼠，直至肿瘤长出，表明传代成功，此为第一代小鼠，重复此传代步骤，在传至不少于5代时，表明可稳定传代的淋巴瘤模型构建成功。
2.如权利要求1所述利用NK/T淋巴瘤细胞株构建的免疫缺陷小鼠模型的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，所述免疫缺陷型小鼠为NOD/SCID小鼠。
3.如权利要求2所述利用NK/T淋巴瘤细胞株构建的免疫缺陷小鼠模型的构建方法，其特征在于，注射免疫抑制药物时，所述免疫药物采用环磷酰胺注射液，注射方式为：小鼠腹腔内连续注射环磷酰胺注射液两天，注射量按100mg/kg计、注射液体积按0.2mL计，每天一次。
4.如权利要求1所述利用NK/T淋巴瘤细胞株构建的免疫缺陷小鼠模型的构建方法，其特征在于：步骤（2）中，淋巴瘤细胞株培养液与基质胶的比例为1:1，每只小鼠注射400μL注射液。
5.利用权利要求1 4任一项所述利用NK/T淋巴瘤细胞株构建的免疫缺陷小鼠模型的构~
建方法所构建的免疫缺陷小鼠模型。
6.权利要求5所述免疫缺陷小鼠模型在医学中的应用，其特征在于，用于药物筛选或疗效评估。
利用NK/T淋巴瘤细胞株所构建的免疫缺陷小鼠模型
技术领域
背景技术
发明内容
接种对象采用免疫缺陷型小鼠（如NOD/SCID小鼠）；
以NOD/SCID小鼠（3-4周龄、15-20g）为例，具体预处理方式为，在接种淋巴瘤细胞前，注射免疫抑制药物，例如环磷酰胺或环孢素；以注射环磷酰胺为例，具体注射方式为：小鼠腹腔内连续注射环磷酰胺两天，注射量按100mg/kg计（注射液体积按0.2mL计），每天一次；
淋巴瘤细胞株采用NK/T淋巴瘤细胞株；接种当天，按如下方式处理待接种细胞：
将生长状态良好的细胞培养液离心、收集细胞，并用无血清的1640培养液清洗不少于两遍，清洗后1000rpm离心5min收集细胞，再用无血清的1640培养液重悬细胞，调整细胞浓
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度为：（1 3）×10/200μL，优选为2×10/200μL；
~
（2）制备肿瘤混悬液，并注射小鼠；
将步骤（1）中预处理后NK/T淋巴瘤细胞株培养液与基质胶混合均匀，以此作为注射液（肿瘤混悬液），制备完成后，皮下注射至小鼠腋窝；每只小鼠注射300 500μL（优选注射液体~
积为400μL）；
以体积比计，所述淋巴瘤细胞株培养液与基质胶的比例为1:0.8 1.5；优选比例为1:1，~
即，以注射液体积为400μL计，每只小鼠注射200μL的淋巴瘤细胞株培养液与200μL基质胶的混合物；
需要解释的是，实验中发现，随着基质胶用量的适当增加，肿瘤的最终成瘤率及瘤体生长状况虽无明显影响，但由于基质胶影响细胞转移，导致动物体吸收瘤体细胞时间较长，进而影响最终肿瘤大小测定，而当基质胶用量较少时，肿瘤成瘤率虽然也无影响，但肿瘤生长速度明显变慢，因此，对于基质胶用量需要慎重确定最适用量范围。
（3）肿瘤细胞传代，待步骤（2）中小鼠体内肿瘤直径长至1.0 1.5cm左右至成熟瘤体后，~
无菌环境操作剥离瘤块，并剪成小块，在研磨器里研磨分散肿瘤细胞；
与步骤（2）相同，调整细胞浓度后与基质胶混合，注射小鼠；同样小鼠腹腔内注射rhIL-
2；
需要说明的是，采用将肿瘤组织研磨成悬液方式进行传代，或者将研磨分散后肿瘤细胞培养扩增后再进行传代均可，也可直接将肿瘤组织剪成小块进行接种（但已有实验及经验表明，这种方法成瘤率较低，并不适合实际应用）；
注射完成后，正常饲养小鼠，直至肿瘤长出，表明传代成功，此为第一代小鼠（一般记录为F1代），
重复此传代步骤，在传至不少于5代时，表明可稳定传代的淋巴瘤模型构建成功。
图3为对传代过程中不同代系的NKYS肿瘤组织的的免疫组化检测结果；
图4为对传代过程中不同代系的NKYS肿瘤组织的细胞流式检测结果；
图5为原位杂交结果；
附图中F0表示传代前所形成初始肿瘤代系的小鼠，F1表示第一代小鼠，以此类推，F4表示第四代小鼠，F7表示第7代小鼠。
具体实施方式
NK/T淋巴瘤细胞株NKYS细胞株，由美国City of Hope 贝克曼研究所 John Chen实验室赠送；
实验试剂：
环磷酰胺（0.2g规格），江苏盛迪医药有限公司；
无血清1640（500ml规格）：GIBCO公司产品；
rhIL-2（白介素-2, 欣吉尔）：北京双鹭药业股份有限公司；
基质胶，Corning公司产品 （类型为高浓度基质胶，货号为324548），需要强调的是，相关操作时注意要在冰上操作，否则基质胶容易凝固；
实验设备：
流式细胞仪FACS Canto TM，BD公司产品。
实施例
NK/T淋巴瘤细胞株接种当天，按如下方式处理待接种细胞：
将生长状态良好的细胞培养液离心、收集细胞，并用无血清的1640培养液清洗不少于两遍，清洗后1000rpm离心5min收集细胞，再用无血清的1640培养液重悬细胞，调整细胞浓
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度为2×10/200μL；
（2）制备肿瘤悬液混合液，并注射小鼠；
将步骤（1）中预处理后NK/T淋巴瘤细胞株培养液与基质胶混合均匀，以此作为注射液，制备完成后，皮下注射至小鼠腋窝；每只小鼠注射400μL注射液；
以体积比计，所述淋巴瘤细胞株培养液与基质胶的比例为1:1，即，以注射液体积为400μL计，每只小鼠注射200μL的NKYS细胞株培养液与200μL基质胶的混合物。
（3）肿瘤细胞传代，待步骤（2）中小鼠体内肿瘤长径达1.0 1.5cm左右至成熟瘤体后，无~
菌环境操作剥离瘤块，并剪成小块，在研磨器里研磨分散肿瘤细胞；
与步骤（2）相同，调整细胞浓度后与基质胶混合，注射小鼠；同样在小鼠腹腔内注射rhIL-2；
注射完成后，正常培养小鼠，直至肿瘤长出，表明传代成功，此为第一代小鼠，重复此传代步骤，构建不同代系的小鼠肿瘤模型，并对不同代系小鼠的肿瘤组织进行检测、对比和分析，以具体评价传代的正确和稳定性。
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