用于治疗或预防免疫缺陷病毒感染的核酸
阅读：1020发布：2020-05-17
专利汇可以提供用于治疗或预防免疫缺陷病毒感染的核酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种核酸构建体，其包含可与人免疫 缺陷 型病毒的反式作用因子作用而诱导转录的转录调节序列，和编码具有单链RNA-特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因，且该基因位于其表达可被转录调节序列调控的 位置 ；一种生产细胞的方法，该细胞中的人免疫缺陷型病毒的复制受到抑制，该方法包括将所述核酸转入细胞的步骤；一种可 治疗 或 预防 人免疫缺陷型 病毒感染 的方法。，下面是用于治疗或预防免疫缺陷病毒感染的核酸专利的具体信息内容。
1.一种核酸，包括：
转录调节序列，其与Tat蛋白作用而诱导转录，其中所述转录调节序列是人免疫缺陷型病毒LTR；和
编码具有单链RNA-特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因，其中所述具有单链RNA-特异性核糖核酸内切酶活性的多肽是MazF蛋白，
其中该基因置于人免疫缺陷型病毒LTR的下游，从而其表达可被所述序列调控。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述具有单链RNA-特异性核糖核酸内切酶活性的多肽具有以核苷酸序列特异性方式裂解RNA的活性。
3.根据权利要求1所述的核酸，其被连接到载体中。
4.一种在活体外生产细胞的方法，该细胞中的人免疫缺陷型病毒的复制受到抑制，该方法包括将权利要求1所述的核酸转入细胞中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中该细胞是含T细胞或T细胞前体的细胞群。
6.根据权利要求4所述的方法，其中用病毒载体将所述核酸转入细胞中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中用反转录病毒载体将所述核酸转入细胞中。
8.权利要求1中所述的核酸在生产用于治疗或预防人免疫缺陷型病毒感染的组合物中的用途。
用于治疗或预防免疫缺陷病毒感染的核酸
技术领域
背景技术
[0002] 人免疫缺陷病毒(HIV)感染从而破坏表达CD4分子的细胞(例如，T细胞)。因此，在感染HIV的人体中，CD4-阳性的T细胞(辅助T细胞)数量会下降且细胞免疫力会降低。感染最终导致严重的免疫缺陷状况和机会感染，例如卡氏肺炎的发作。这种情况被称为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。
[0003] 关于治疗HIV感染的方法，阻断HIV生命周期的抗病毒剂(反转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂等)和疫苗已经研制出来，几种抗病毒剂已经被实际应用。然而，由于HIV的突变频率很高，在感染病人体内形成会对上述药剂无效的突变体。因此，还不能说已经具有一种完善、特殊的治疗法。另一方面，研制基因治疗药物，如用核酸(RNA诱杀剂，核糖核酸酶等)或蛋白(反式显性突变体蛋白，细胞内抗体等)作为有效成分来抑制HIV多重复制的尝试还在进行。
[0004] 一种可特异性地导致HIV感染细胞死亡的方法已经建立(例如，专利文件1，非专利文件1，2和3)。在该方法中，编码一种可产生细胞毒性的产物基因被连接到HIV中LTR启动子的下游。迄今为止，此方法尚未应用于临床。使用核糖核酸酶作为产生细胞毒性物质的方法在专利文件2中有所描述(美国专利号5837510)，虽然核糖核酸酶是否会引起HIV-感染细胞死亡尚不能确定。众所周知，人胰核糖核酸酶(RNase1)是典型的核糖核酸酶，其在胞质中可被核糖核酸酶抑制剂所抑制(非专利文件4)。因此还不能说其适于上述目的。
[0005] 据报道，几种原核质粒具有分离后杀死(post-segregation killing，PSK)宿主的功能，他们在离开宿主后杀死宿主以维持宿主内的质粒。这种质粒具有毒素-抗毒素基因。抗毒素可与细胞内的毒素结合从而使该毒素失活。抗毒素易被蛋白酶降解。抗毒素被蛋白酶降解将导致毒素被激活，这一激活过程是很稳定的。这些毒素-抗毒素基因还存在于多数原核细胞的染色体中。他们对不同的应激作出反应，且在程序性细胞凋亡中起作用。虽然毒素的作用还不能完全被证实，已知MazF是一种mazE-mazF系统的毒素(非专利文件
5)，PemK是一种pemI-pemK系统的毒素(非专利文件6)，两者均具有序列特异性核糖核酸酶活性。此外，已经提出了一种获得高纯度目标蛋白的方法(专利文件3)。在这种方法中，mRNA被毒素降解，只有编码目标蛋白的mRNA被翻译，其他被毒素降解的序列在此之前已被去除。
5)，PemK是一种pemI-pemK系统的毒素(非专利文件6)，两者均具有序列特异性核糖核酸酶活性。此外，已经提出了一种获得高纯度目标蛋白的方法(专利文件3)。在这种方法中，mRNA被毒素降解，只有编码目标蛋白的mRNA被翻译，其他被毒素降解的序列在此之前已被去除。
[0006] 专利文件1：美国专利号5554528
[0007] 专利文件2：美国专利号5837510
[0008] 专利文件3：WO 2004/113498
[0009] 非专利文件1：Hum.Gene Therapy，2：53-61(1991)
[0010] 非专利文件2：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：365-369(1994)
[0011] 非专利文件3：Hum.Gene Therapy，10：103-112(1999)
[0012] 非专利文件4：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：10407-10412(1998)[0013] 非专利文件5：Molecular Cell，12：913-920(2003)
[0014] 非专利文件6：J.Biol.Chem.，279：20678-20684(2004)
发明内容
[0015] 发明所要解决的问题
[0016] 本发明是基于上述现有技术进行的。本发明的主要目的是为了提供一种更有效治疗HIV感染的方法。
[0017] 解决问题的手段
[0018] 本发明人发现，HIV感染导入了下述核酸构建体的细胞后，诱导了具有单链RNA特异性内源核酸酶活性的多肽表达，从而分解细胞内的mRNA，由此可以防止上述的细胞中HIV的复制并防止其感染他细胞，所述核酸构建体中，在可与人免疫缺陷病毒的反式激活蛋白作用诱导转录的转录调节序列的下游，连接了编码具有单链RNA特异性内源核酸酶活性的多肽的基因。本发明基于此原理而完成。
[0019] 本发明涉及：
[0020] 一种核酸，包含：
[0021] 可与人免疫缺陷病毒的反式激活蛋白作用从而诱导转录的转录调节序列；和[0022] 编码具有单链RNA-特异性内切酶活性的多肽的基因，且该基因位于其表达可被所述序列调控的位置；
[0023] 根据[1]所述的核酸，其包括转录调节序列，其可与Tat蛋白和/或Rev蛋白作用从而诱导转录；
[0024] 根据[1]所述的核酸，其中编码具有单链RNA-特异性内切酶活性多肽的基因位于人免疫缺陷病毒的LTR的下游；
[0025] 根据[1]所述的核酸，其中具有单链RNA-特异性内切酶活性的多肽具有以核酸序列特异性方式裂解RNA的活性；
[0026] 根据[1]所述的核酸，其中具有单链RNA-特异性内切酶活性的多肽是MazF蛋白；
[0027] 根据[1]-[4]任一项所述的核酸，其连接于载体中；
[0028] 一种制备其中的人免疫缺陷病毒的复制被抑制的细胞的方法，该方法包括将[1]-[6]任一项所述的核酸转入到细胞中；
[0029] 根据[7]所述的方法，其中该细胞是包含T细胞或T细胞前体的细胞群；
[0030] 根据[7]所述的方法，其中使用病毒载体将核酸转移到所述细胞中；
[0031] 根据[9]所述的方法，其中使用反转录病毒载体或腺病毒载体将核酸转移到所述细胞中；
[0032] 一种治疗或预防人免疫缺陷病毒感染的方法，该方法包括将[1]-[6]任一项所述的核酸转移到细胞中。
[0033] 有益效果
[0034] 本发明提供了一种核酸构建体，其能够抑制细胞中人免疫缺陷病毒(HIV)的复制。此核酸构建体用于治疗HIV感染。
[0036] 图1举例说明在感染了HIV的细胞的培养上清液中HIV-衍生蛋白的数量。
[0037] 图2举例说明在感染了HIV的细胞的培养上清液中HIV-衍生蛋白的数量。
[0038] 图3举例说明在感染了HIV的细胞的培养液中活细胞数量的经时变化。
[0039] 本发明的最佳实施方案
[0040] 本发明的核酸构建体包括可与人免疫缺陷病毒的反式激活蛋白作用从而诱导转录的转录调节序列；编码具有单链RNA-特异性内切酶活性的多肽的基因，且该基因位于其表达可被所述序列调控的位置。
[0041] 对于可与人免疫缺陷病毒的反式激活蛋白作用从而诱导转录的转录调节序列没有特殊的限制。例如，可以使用与HIV的Tat蛋白作用从而诱导转录的转录调节序列。Tat蛋白与RNA中的TAR(反式激活应答元件)序列结合，RNA的转录可通过HIV的LTR启动子的作用而开始，并激活该序列下游区域的转录。因此，根据本发明，可使用包含转录起始位点下游TAR区域的核苷酸序列的转录调节序列。特别是，可优选使用HIV的LTR，或通过把LTR进行适当修饰而得到的转录调节序列。修饰的例子包括去除启动子中来自宿主细胞的转录因子的结合位点，和去除Tat特异性转录中非必需的区域。使用前一修饰，有可能降低与HIV感染不相关的、来自宿主细胞的转录因子的转录水平。例如，转录调节序列的修饰在非专利文件2中有相关描述。后一种修饰，例如去除LTR的TAR序列的U5区域或下游区域(R区域的一部分和U5区域)。本发明中含有被部分去除的LTR的核酸有利于产生包含核酸的高滴度反转录病毒载体。
[0042] 众所周知，HIV基因组中的RRE(Rev应答元件)与HIV-衍生的反式激活蛋白，Rev蛋白作用而促进蛋白的表达(非专利文件3)。已知，gag和pol基因中被称为INS的区域在Rev蛋白缺失时可抑制HIVmRNA的转录，但此抑制作用会被RRE和Rev蛋白的相互作用而取消(J.Virol.，66：7176-7182(1992))。因此，如果这样一种转录调节序列被连接到本发明核酸的外源多肽编码基因的3’端，其可能会以依赖Rev蛋白，即HIV感染的方式表达核酸编码的多肽。
[0043] 与HIV-衍生的反式激活蛋白作用的序列可与功能性序列联合使用，从而掺入该序列(例如，启动子)或与异源功能性序列相联合。例如，本发明所使用的“转录调节序列”包括在细胞中通过将该序列与非HIV衍生的、能起始mRNA转录的启动子联合而构建的序列，为此，需要转移本发明的核酸。
[0044] 本发明的核酸是通过将编码具有单链RNA-特异性内切酶活性的多肽的基因与上述转录调节序列连接而构建的，因此基因的表达可被转录调节序列所调控。
[0045] 此处所述单链RNA-特异性内切酶活性是指能水解单链核酸中核糖核酸3’端的磷酸二酯键的活性，所述单链核酸包含至少一个核糖核酸分子作为组成核苷。经上述活性水解的核酸产生下列产物：含羟基的3’端和含磷酸基的5’端；含磷酸基的3’端和含羟基的5’端；或含2’，3’-环磷酸和羟基的5’端。根据本发明可使用一种不能裂解诸如双链RNA或RNA-DNA杂合体之类双链核酸的多肽，其不作为对本发明的限制。考虑到HIV基因组单链RNA的有效降解，这样的底物特异性非常适用于本发明。优选具有以核苷序列特异性方式裂解RNA的活性的，或能够以核糖体非依赖性方式降解mRNA的多肽。这些多肽的例子包括mRNAinterferases，例如如前所述的MazF或PemK(专利文件2)。
[0046] 具有以序列特异性方式或以核糖体非依赖性方式降解单链RNA的活性的多肽可从微生物中获得，其不作为对本发明的限制。在这种情况下，编码该多肽的基因可从微生物基因组或质粒中分离。例如，根据本发明可使用编码MazF或PemK的基因，如非专利文件4或5所述，MazF或PemK是一种能形成毒素-抗毒素系统中的一种毒素的核糖核酸内切酶。MazF是一种能在单链RNA中裂解5’-A/CA-3’序列的酶，而PemK是一种能在单链RNA中主要裂解5’-U/A(C，A或U)-3’序列的酶。也可以选择一种能编码与已知数据库中MazF或PemK氨基酸序列高度同源的氨基酸序列的基因，根据本发明分离和使用这种基因。具有如此活性的多肽已经在多种微生物中发现，例如蓝绿海藻和古细菌[枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168(NP_388347；5′-U/ACAU-3′)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)ATCC13090(NP_275029；5′-/ACU-3′)，耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)R1(NP_294385；5 ′-UU/CCUUU-3 ′)，牛 球 菌 (Micobacterium bovis)BCG(NP_855664；5′-U/CCUU-3′)，念珠蓝细菌属某种(Nostoc sp.)PCC7120(NP_487251；
5 ′-U/ACA-3 ′ )，粪 肠 球 菌 (Enterococcus faecalis)V583(NP_816859；5 ′ -U/ACAU-3′)，欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)ATCC19718(NP_841355；5′-GA/AU-3′，5′-G/AAU-3′，5′-AA/AU-3′或5′-A/AAU-3′)，极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)ATCC700860(NP_143082；5′-U/GG-3 ′，5′-U/UG-3′，5′-U/GA-3 ′，
5′-A/GG-3′或5′-A/AG-3′)：NCBI蛋白数据库中具有所述活性的多肽以及多肽所识别和裂解的核苷酸序列的登记号在括号中表示]。更优选使用本发明编码MazF的基因。
MazF的氨基酸序列和编码MazF基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NOS.1和2所示。
5 ′-U/ACA-3 ′ )，粪 肠 球 菌 (Enterococcus faecalis)V583(NP_816859；5 ′ -U/ACAU-3′)，欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)ATCC19718(NP_841355；5′-GA/AU-3′，5′-G/AAU-3′，5′-AA/AU-3′或5′-A/AAU-3′)，极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)ATCC700860(NP_143082；5′-U/GG-3 ′，5′-U/UG-3′，5′-U/GA-3 ′，
5′-A/GG-3′或5′-A/AG-3′)：NCBI蛋白数据库中具有所述活性的多肽以及多肽所识别和裂解的核苷酸序列的登记号在括号中表示]。更优选使用本发明编码MazF的基因。
MazF的氨基酸序列和编码MazF基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NOS.1和2所示。
[0047] 由于组成毒素-抗毒素系统中毒素的核糖核酸内切酶不能被胞浆中的核糖核酸酶抑制剂(如人胎盘核糖核酸酶抑制剂)所抑制(专利文件3)，因而适用于本发明。如果核糖核酸内切酶被持续表达，起始蛋白合成在细胞内不能发生，导致细胞生长抑制和诱导细胞死亡。然而，由于酶不能降解组成核糖体的rRNA，或形成高级结构的tRNA，当HIVRNA被降解和清除时，细胞生长的能力得以恢复，在转入本发明核酸的细胞中，内切酶的表达被终止。因此，即使细胞中的HIV作为前病毒整合入染色体，细胞中病毒的复制被阻滞，细胞仍保持其生长力。鉴于能够在活体中T细胞数量不大量减少的情况下阻止HIV的复制和AIDS的发作，使用上述核糖核酸内切酶是很有益的。
[0048] 组成毒素-抗毒素系统中毒素的核糖核酸内切酶识别短的核苷酸序列(约3-7个核苷酸)来裂解单链RNA。因此，如果核糖核酸内切酶在细胞中表达，细胞中多数mRNAs被降解，细胞内蛋白质合成和细胞生长会受到抑制。而且由于作为HIV基因组的RNA也被裂解，HIV的复制和由细胞释放出HIV(出芽)也会受到阻滞。另外，由于编码入HIV基因组的多肽的表达也得以抑制，例如，在由于释放到胞外的Tat蛋白而未被HIV感染的细胞中细胞调亡的诱导也被抑制。
[0049] 为治疗或预防HIV感染，可将本发明的核酸构建体转入感染了HIV的细胞，即CD4-阳性细胞等的细胞(或细胞群)中。因此，根据本发明，将基因转移入CD4-阳性细胞(例如，T细胞)，即能够分化成CD4-阳性细胞的前体细胞(例如，造血干细胞)，或包含此类细胞的细胞群。根据本发明，鉴于要将核酸构建体全部转入可能感染了HIV的细胞中，转入造血干细胞或包含所述细胞的细胞群是优选的方法。对细胞群没有其他特殊要求，只要其中含有CD4-阳性细胞或其前体细胞即可。例如，所述细胞可包括血细胞(外周血细胞，脐带血细胞)，或从人采集来的骨髓细胞，以及CD4-阳性细胞，CD4-阳性细胞的前体细胞和根据已知方法从上述细胞中分离出的造血干细胞。
[0050] 对于将本发明的核酸构建体转入细胞中的方法未作特殊限制。例如，可将本发明的核酸连接入质粒载体或病毒载体中，再以适当的方法将其转入细胞中。如果使用质粒载体，可使用的转染基因的方法包括磷酸钙法，阳离子脂质法，脂质体法，或电击法。如果将核酸连接入病毒载体(例如，反转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体或疱疹病毒载体)，需在适合病毒载体转移本发明中的核酸的条件下进行感染。根据本发明，能将本发明核酸整合入染色体中的反转录病毒载体是优选的载体。
[0051] 根据本发明，在选用反转录病毒载体的方案中对所用的反转录病毒载体没有特殊限制。根据本发明，复制缺陷型反转录病毒载体对于防止无限制的感染和基因转染而言是优选的。将此种载体制成复制缺陷型是为了使其在被感染的细胞中不能自主复制，且因此不会有毒性。该载体可侵染宿主细胞，如脊椎动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)，将插入载体中的外来基因稳定的整合入染色体DNA中。已知的复制缺陷型反转录病毒载体包括反转录病毒载体(例如，MFG载体，α-SGC载体(WO92/07943)，pBabe(Nucleic Acids Research，18：3587-3596(1990))，pLXIN(Clontech)或pDON-AI(Takara Bio))，慢病毒载体及其修饰物。慢病毒载体包括但并不限于人免疫缺陷型病毒(HIV)-衍生载体(包含野生型LTR的HIV载体(例如，美国专利号5,665,577)或包含经修饰的LTR的HIV载体(例如，pLenti6/V5，Invitrogen))和猿免疫缺陷型病毒(SIV)-衍生载体(例如，Human Gene Therapy，11：
1863-1874(2000)).
1863-1874(2000)).
[0052] 反转录病毒载体可用已知方法制备并用于本发明。对制备方法没有特殊限制。根据本发明，可以使用从反转录病毒生成细胞的细胞培养液收集的上清液，而该反转录病毒生成细胞可生成合适的反转录病毒载体。反转录病毒生成细胞可以是在上清液中稳定生成反转录病毒颗粒的细胞，也可以是在转染反转录病毒载体质粒后瞬时生成反转录病毒颗粒的细胞。
[0053] 已知包装细胞系可用于制备反转录病毒生成细胞，例如，PG13(ATCCCRL-10686)，PA317(ATCC CRL-9078)，GP+E-86 或 GP+envAm-12(US 5,278,056)，或 Psi-Crip(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：6460-6464(1988))。具有高转染效率的293或293T细胞也可用于制备反转录病毒生成细胞。
[0054] 根据本发明，也可以使用从假型包装(pseudotyped packaging)中制备的反转录病毒，此假型包装有一层从不同于衍生出反转录病毒载体基因组的病毒的病毒衍生的包膜。例如，可使用含一层包膜的假型反转录病毒，此包膜可衍生于Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)，猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus(GaLV))，水泡性口炎病毒(vesicularstomatitis(VSV))或猫原生病毒(feline endogenous virus)，或衍生于一种具包膜功能的蛋白。另外，根据本发明，也可使用一种反转录病毒载体，其表面有糖链能被修饰蛋白。反转录病毒载体可用反转录病毒生成细胞制备，该细胞有一种编码糖基化的酶转染基因。
[0055] 根据本发明，将转录调节序列和置于转录调节序列下游的、编码具有单链RNA-特异性内切酶活性的多肽基因连接到上述不同载体中(优选上述反转录病毒载体)，该转录调节序列与人免疫缺陷病毒作用后可诱导转录。另外，还可包括调节基因转录的序列(操纵子，增强子，终止子等)。另外，本发明的核酸可具有与该基因无关的适当的标记基因，籍此可对含有转染基因(例如，抗药基因，编码荧光蛋白的基因，编码作为报告酶，如β-半乳糖苷酶和荧光素酶的基因)和报告基因等的细胞进行筛选。另外，本发明中的核酸可与自杀基因一起转染，从而，在对含转染基因的细胞的治疗已完成或产生了副作用的情况下，能从活体中清除含有转染基因的细胞。
[0056] 在本发明的一种实施方案中，使用了先体外后体内(ex vivo)基因转移，即在活体外将载体转入从生物个体中采集的细胞中。如果使用病毒载体，基因转移可通过将活体中采集的靶细胞与病毒载体(例如，病毒生成细胞的培养上清液，或从培养上清液中纯化的病毒载体)混合并在适当条件下培养该混合物来实现。如果使用体内(in vivo)转移基因时所用的载体(例如，腺病毒载体)，可将含有本发明核酸的载体直接转入个体。
[0057] 如果将反转录病毒载体用于先体外后体内基因转移，当功能性物质具有反转录病毒-结合活性时，其可能会高效地影响含反转录病毒载体的靶细胞。
[0058] 例如，在WO 95/26200，WO 97/18318和Nature Medicine，2：876-882(1996)中描述了一种方法，该方法使用具有反转录病毒-结合活性的功能性物质进行基因转移。该方法包括，其一，使用单一分子中同时含有反转录病毒结合位点和靶细胞结合位点的功能性物质，另一方法则使用包含反转录病毒结合位点的功能性物质和包含靶细胞结合位点的功能性物质的混合物。根据本发明，两种方法均可使用。
[0059] 对功能性物质没有特殊限制，只要其具有反转录病毒结合活性和/或靶细胞结合活性。例如，具有反转录病毒结合活性的功能性物质可以下述为例：纤连蛋白的肝素结合区域(肝素-II区域)，成纤维细胞生长因子，V型胶原质的片段，该多肽的衍生物或变异体，聚赖氨酸，DEAE-葡聚糖或类似物。任何能结合目标靶细胞的物质均可作为具有靶细胞结合活性的功能性物质。具有靶细胞结合活性的功能性物质例如：具有细胞结合活性的多肽(例如，细胞骨架蛋白)，在细胞表面识别细胞或生物分子的抗体，生长因子，细胞因子或糖链。其不作为对本发明的限制。
[0060] 下列方法提供了本发明优选方案的实例：在含有纤连蛋白肝素结合区域的功能性物质存在时将基因转入靶细胞。含细胞粘连区域和肝素结合区域的纤连蛋白片段可作为功能性物质的优选例子。特别是，结合VLA-5和/或VLA-4区域的多肽可优选用作细胞粘连区域。该纤连蛋白片段可从纤连蛋白中制备，而纤连蛋白可通过蛋白酶消化从活体中纯化或用DNA重组技术合成。例如，Takara Bio公司生产的名为RetroNectin(注册商标)的重组纤连蛋白片段在本发明中是优选的。
[0061] 如上所述，本发明可有效制备用于治疗或预防人免疫缺陷病毒感染的细胞组合物。另外，本发明提供了一种用细胞组合物治疗或预防HIV感染的方法。将那些转入了本发明核酸的细胞施用于个体可以减少个体内的HIV感染细胞或抑制细胞内HIV的复制。
[0062] 如果转入了本发明核酸的CD4-阳性细胞感染了HIV，或由转入了本发明核酸的CD4-阳性细胞的前体细胞中分化成的CD4-阳性细胞(例如，造血干细胞)感染了HIV，且在细胞中生成HIV衍生的反激活子时，则会诱导编码位于转录调节序列下游、具有单链RNA-特异性内切酶活性的多肽的基因表达；细胞中的mRNA被生成的多肽降解，则蛋白的生物合成受到抑制。同时，HIV复制过程中形成的RNA基因组也会被降解。由于HIV基因组编码的多肽的翻译过程和HIV基因组的复制过程如上所述被抑制，可防止有感染力的HIV颗粒的起始合成和其他细胞被感染。
[0063] 组成毒素-抗毒素系统中毒素的核糖核酸内切酶的活性可因相应抗毒素(例如，MazE或PemI)的共存而被抑制。因此，应用本发明的编码毒素核糖核酸内切酶的基因，在未感染HIV的细胞中，由核糖核酸内切酶活性引起的细胞毒性作用就能通过抗毒素的作用被抑制或通过联合使用抗毒素基因被控制。在一种优选实施方案中，毒素的活性可被抗毒素的作用所抑制，在未感染HIV的细胞中，这种抗毒素的作用是通过连接在合适的管家基因(例如，3-磷酸甘油醛脱氢酶基因，β-肌动蛋白基因)启动子下游的抗毒素基因所编码的痕量抗毒素的表达而实现的。如果该细胞感染了HIV，毒素的表达可被反激活子的作用所促进，只有在所表达的毒素量超过所表达的抗毒素量的时候细胞毒性才能被显示出来。因此，有可能进一步提高对HIV-感染细胞的细胞毒性的选择性。
[0064] 根据上述的方法通过细胞毒性蛋白(例如，白喉毒素)或激活非毒性前体形成细胞毒性物质的酶的作用(例如，胸苷激酶)可破坏HIV-感染细胞，被破坏的细胞中释放出的毒素或被激活的化合物会进入未被HIV感染的细胞而造成细胞毒性。另一方面，根据本发明所述的使用具有单链RNA-特异性内切酶活性的多肽的方法，损伤周围细胞的可能性是很低的。
[0065] 多药联合治疗法，即3或4种抗病毒剂(反转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂等)被联合使用(HAART)，是如今HIV感染治疗方法的主流。这种疗法显著降低了HIV感染病人血液中HIV的数量，导致临床症状的改善。然而，完全清除HIV是很困难的，因为存在不主动生成病毒颗粒的HIV-感染细胞(长时期存活的被感染细胞；细胞库)。本发明可与HAART联合进行。
[0066] 在转入了本发明核酸构建体的细胞中，Tat蛋白表达时，具有核糖核酸内切酶活性的多肽即表达。在HIV作为前病毒整合入其染色体的细胞中，如果核酸构建体存在，则前病毒RNA的转录被起始，具有核糖核酸内切酶活性的多肽被RNA转录生成的Tat诱导表达，细胞中的单链RNA(包括HIV基因组)被降解。从而，在该细胞中HIV的复制和出芽被抑制。细胞中HIV-衍生的RNA降解、Tat的表达终止，并且使具有所表达的Tat蛋白从细胞中消失的内切酶活性活性的多肽的表达也被终止。本发明中使用的具有核糖核酸内切酶活性的多肽特异性地作用于单链RNA(非专利文件5)，根据本发明，由于细胞核小体或tRNA未被破坏，当多肽的表达被终止后，正常的蛋白合成可重新开始，同时未被破坏的细胞的生长也可继续。
[0067] 实施例
[0068] 下列实施例更详细地解释了本发明，但并不是限制其范围。
[0069] 实施例1：Tat表达质粒的构建
[0070] 用SacII和EcoRI双消化pQBI-tatGFP质粒(Quantum生物技术公司)去除编码Tat和sgGFP的基因片段，将Tat-编码序列插入质粒，该序列的5’和3’端已分别连接了起始密码子和终止密码子。如上所述构建的质粒被称为pQBI-TAT。该质粒可在CMV起始子/增强子的控制下表达Tat蛋白。
[0071] 实施例2：MazF表达质粒的构建
[0072] 用限制性内切酶SalI和XbaI双消化pQBI-LTRgagGFP质粒(Quantum生物技术公司)去除编码gag，sgGFP和RRE的基因片段，将化学合成的MazF蛋白的DNA编码序列插入质粒。如上所述构建的质粒被称为pQBI-LTRMazFcv1。
[0073] 该质粒可在HIV 5’LTR的控制下表达MazF蛋白。SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码MazF的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。在核苷酸序列中，MazF基因中的ACA核苷酸序列被其他核苷酸序列所取代而并不改变自然形成的MazF氨基酸序列。由于从该质粒转录的MazF的RNA有MazF活性而不被裂解，其能在细胞中稳定地表达MazF。
[0074] 实施例3：将质粒转入细胞
[0075] 将1×105个人293T/17细胞(ATCC CRL-11268)加入到胶原包被的24孔板的每一孔中并培养24小时。含10％胎牛血清(Gibco)的Dulbecco′s modified Eagle培养基(DMEM，Sigma)用作细胞培养液。将0.25μg的pQBI-LTRMazFcv1或0.25μg的pQBI-LTRMazFcv1和0.25μg的pQBI-TAT转入每一孔的细胞中。TransIT-293(Mirus)用于转染质粒，其操作步骤见附带说明。每一组均进行双份平行操作。转染了0.25μgpQBI-LTRgagGFP(Quantum生物技术公司)和0.25μg pQBI-TAT的一组作为对照，pQBI-LTRgagGFP不包含MazF基因。
[0076] 转染了质粒的细胞在37℃，5％CO2的条件下培养48小时。培养后在显微镜下观察细胞。在转染了pQBI-LTRgagGFP和pQBI-TAT的对照组，由于同时转染pQBI-LTRgagGFP和pQBI-TAT，GFP蛋白的表达得到证实。因此可以证实，LTR的启动子活性可以TAT-依赖性方式被诱导。在只转染了pQBI-LTRMazFcv1的孔中，没有发现与对照组的不同。在同时转染了pQBI-LTRMazF和pQBI-TAT的组中，与对照组比较，可清晰地识别出细胞生长抑制现象。这说明，pQBI-LTRMazF中MazF的表达依赖于Tat蛋白。这表明将MazF基因置于可受Tat蛋白诱导的LTR控制的位置时，此种质粒结构可被用于抑制HIV感染细胞的生长。
[0077] 实施例4：反转录病毒载体质粒的构建
[0078] (1)表达MazF的反转录病毒载体质粒pSIN-HLTR-MazF的构建
[0079] 用限制性内切酶StuI和XbaI裂解实施例1中构建的pQBI-LTRMazFcv1质粒，得到约1340bp的表达盒(expression cassette)，其能在HIV-LTR的控制下表达MazF，而HIV-LTR可用DNA钝化试剂盒(DNA Blunting Kit(Takara Bio))使其钝化。
[0080] 为消除反转录病毒载体质粒pDON-AI(Takara Bio)中的LTR启动子活性，3′LTR的U3区域中从NheI位点到SacI位点的一段被去除，质粒重建而获得一种可自我失活的反转录病毒载体质粒pSIN，其丧失了LTR启动子活性。将pSIN从PmeI位点切开，用碱性磷酸酶大肠杆菌E.coli C75(Takara Bio)使其去磷酸化，用DNA连接试剂盒Mighty Mix(Takara Bio)将表达盒插入此位点。如上所述构建的质粒称为pSIN-HLTR-MazF。
[0081] (2)表达MazF的反转录病毒载体质粒pMTD3-U3R-MazF和pMTD3-U3TAR-MazF的构建
[0082] 质粒载体pMTD3可通过去除pMT载体U3区域中3′LTR的第43到第309位的核苷酸片段而构建(Gene Therapy，11：94-99(2004))。被用作内部启动子的HIV的U3-R区域和U3-TAR区域，可以实施例4-(1)中构建的质粒pSIN-HLTR-MazF为模板，通过PCR而获得。用于扩增U3-R区域的引物的核苷酸序列，5′HIV1 U3和3′HIV1 R，分别如SEQ IDNOS：4和5所示。可联合使用引物5′HIV U3和引物3′HIV1 TAR(SEQ IDNO：6)来扩增U3-TAR区域。每个PCR扩增的片段均由MluI和BamHI消化，并插入到质粒载体pMTD的MluI和BamHI位点中间，从而构建出两种反转录病毒载体质粒pMTD3-U3R和pMTD3-U3TAR。
[0083] MazF编码基因可以质粒pSIN-HLTR-MazF为模板，通过PCR而获得。用于扩增的两条引物5′MazF和3′MazF的核苷酸序列分别如SEQ IDNOS：7和8所示。其扩增片段被BglII和BamHI消化，并被插入到质粒载体pMTD3-U3R或pMTD3-TAR中的BamHI位点。如上所述构建的两种表达MazF的反转录病毒载体质粒被分别称为pMTD3-U3R-MazF和pMTD3-U3TAR-MazF。
[0084] (3)对照反转录病毒载体质粒的构建
[0085] 构建将荧光蛋白eGFP编码基因插入pMTD3-U3R的表达质粒并作为对照。将含有从质粒pGemT-Easy-eGFP中通过BamHI和BglII的消化而切割出的eGFP基因(J.Gene Med.，6：724-733(2004))的一段DNA片段特异性地插入到pMTD3-U3R或pMTD3-TAR的BamHI位点，从而构建出两种反转录病毒载体质粒pMTD3-U3R-GFP和pMTD3-U3TAR-GFP作为eGFP表达质粒。
[0086] 实施例5：表达MazF的CEM-SS细胞系的建立
[0087] (1)用于制备GaLV假型病毒的包膜表达质粒可用如下方法构建。首先，以PG13细胞(ATCC CRL-10686)中的基因组DNA作为模板，用PCR扩增编码GaLV病毒包膜蛋白的DNA片段。用于扩增的两条引物5′KpnI和3′ClaI的核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：9和10所示。双嗜性包膜表达质粒pVM-AE(Gene Therapy，10：706-711(2003))由KpnI和ClaI消化而制备一个质粒片段，在该片段中，R肽部分以外的包膜蛋白编码区已删除。上述扩增片段经KpnI和ClaI消化后，插入质粒片段而制备成GaLV包膜表达质粒pVM-GeR。
[0088] (2)将2×106个293T细胞加入到6cm培养皿中，含10％胎牛血清(FBS)的DMEM用作细胞培养液。用磷酸钙的方法将4μg反转录病毒载体质粒(实施例4中制备的质粒之一)，4μg包装质粒pVM-GP(Gene Therapy，10：706-711(2003))和GaLV包膜表达质粒pVM-GeR转染到细胞中。转染开始6小时后更换成新鲜细胞培养液并继续培养。两天后收集细胞培养上清液并用0.45-μm过滤器进行过滤，滤液在后续实验中用作病毒上清液。
[0089] 在37℃和5％CO2条件下，于含10％FBS的RPMI1640(LifeTechnologies)细胞培养液中培养CEM-SS细胞。将1ml实施例6-(1)中制备的反转录病毒载体(病毒上清液)和5
终浓度为8μg/ml的凝聚胺加入到6孔培养板的每一孔中，而在每一孔中，5×10 个CEM-SS细胞培养于2ml细胞培养液中。将培养板用CR322离心机(Jouan)在25℃以2800rpm的速度离心99分钟而促进细胞对反转录病毒载体的吸收。离心后将细胞在37℃，5％CO2的条件下培养2小时。然后将细胞转入T25培养皿中，继续在37℃，5％CO2的条件下培养。两天后，用1mg/ml的Geneticin(G418)筛选含转染基因的细胞，从而建立转染了各种病毒的多克隆细胞系。
终浓度为8μg/ml的凝聚胺加入到6孔培养板的每一孔中，而在每一孔中，5×10 个CEM-SS细胞培养于2ml细胞培养液中。将培养板用CR322离心机(Jouan)在25℃以2800rpm的速度离心99分钟而促进细胞对反转录病毒载体的吸收。离心后将细胞在37℃，5％CO2的条件下培养2小时。然后将细胞转入T25培养皿中，继续在37℃，5％CO2的条件下培养。两天后，用1mg/ml的Geneticin(G418)筛选含转染基因的细胞，从而建立转染了各种病毒的多克隆细胞系。
[0090] 实施例6：HIV感染
[0091] 将2×106个实施例5中所制备细胞系中的一种细胞培养于24孔细胞培养板的每一孔的1ml细胞培养液中，且该细胞接种了不同数量的HIV-1 IIIb(相当于0.2，2，20或200ng的p24蛋白)，并在37℃下培养2小时。用PBS洗细胞并将细胞悬浮于10ml含10％FBS的RPMI中并转移至T25培养皿中。定时从培养皿中采集一部分细胞培养上清液，用ELISA方法测定p24的量(p24ELISA试剂盒，PerkinElmer)从而估计HIV的量。实验结果显示于图1和2中。图1和2所显示的结果分别是感染后7天和10天的结果。图中，CEM-SS代表不含转入基因的CEM-SS细胞的结果，对照代表转入了pMTD3-U3R-GFP病毒的细胞的结果，而A，B和C分别代表转入了pSIN-HLTR-MazF，pMTD3-U3R-MazF病毒和pMTD3-U3TAR-MazF病毒的细胞的结果。纵轴代表以ng/ml为单位的p24蛋白的量。另外，在感染后第4天，第7天或第10天用台盼蓝排斥试验(trypan blue exclusion test)进行活细胞计数。结果显示于图3中。在图3中，菱形代表不含转入基因的CEM-SS细胞的结果，x代表转入了pMTD3-U3R-GFP病毒的细胞的结果，而方框，三角和圆圈分别代表转入了pSIN-HLTR-MazF，pMTD3-U3R-MazF病毒和pMTD3-U3TAR-MazF病毒的细胞的结果。纵轴代
4
表活细胞数量(10)。
4
表活细胞数量(10)。
[0092] 如图1和2所示，转入了含MazF基因的反转录病毒的细胞，与未转入基因的CEM-SS细胞，或转入了不含MazF基因的pMTD3-U3R-GFP病毒的对照细胞相比较，其细胞培养上清液中HIV的数量是很低的。另外，图3中各组细胞的生长速率比较结果显示出，转入了含MazF基因的反转录病毒的细胞的生长速率在感染后7天升高。此证明，HIV引起的细胞死亡在这些细胞中受到抑制。另外，转入了pSIN-HLTR-MazF，pMTD3-U3R-MazF病毒或pMTD3-U3TAR-MazF病毒的细胞经HIV感染后，细胞培养可持续60天。虽然在细胞培养上清液中未检测到HIV，在细胞的DNA提取物中检测到了HIV-衍生的DNA。因此，这显示出HIV作为前病毒保留在细胞中。这也提示，转入了本发明核酸的细胞在HIV感染后继续生长，而HIV的复制和出芽则被抑制。
[0093] 此外还进行了相类似的感染试验，不同的是，接种的HIV的量升高至相当于1000ng的p24的量，而细胞培养上清液中p24的量在感染16天后被测定。同时，转入了各种含有MazF基因的反转录病毒载体的细胞，其细胞培养上清液中p24的量只有非转染细胞或对照细胞的量的1/1000或更少。
[0094] 实施例7：以Tat-依赖性方式表达不同的mRNA interferase引起的细胞生长抑制
[0095] (1)从欧洲亚硝化单胞菌ATCC19718和反转录病毒载体质粒结构中分离NE1181基因
[0096] 来自欧洲亚硝化单胞菌ATCC19718的NE1181基因所编码的多肽的氨基酸序列，及相对应的核苷酸序列可从NCBI数据库中获得(登记号NP_841237和NC_004757)。基于NE1181核苷酸序列的信息，引物NE1181-F(SEQ ID NO：11)和引物NE1181-R(SEQ ID NO：12)合成后用于编码整个多肽的DNA片段的PCR扩增。
[0097] 欧洲亚硝化单胞菌ATCC19718基因组DNA可从ATCC(ATCCNo.19718D)获得。
[0098] 在所进行的PCR反应中，使用了Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)，50ng的欧洲亚硝化单胞菌ATCC19718基因组DNA，以及引物NE1181-F和NE1181-R，获得了362-bp的DNA扩增片段。该扩增片段被限制性内切酶NdeI和XhoI消化，进行琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中回收341-bp的一段DNA片段。然后将此341-bp的DNA片段与经过限制性内切酶NdeI和XhoI消化的pET21a载体(Novagen)连接而得到重组质粒。该重组质粒用于转染大肠杆菌JM109。从如上所述的转化株的菌落中提取质粒，并确定其核苷酸序列。该质粒称为表达载体pET-NE1181。
[0099] 插入表达载体pET-NE1181中的、来自欧洲亚硝化单胞菌ATCC19718的NE1181多肽的编码核苷酸序列，和此多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NOS：13和14所示。在表达载体pET-NE1181表达的多肽中，包含八个氨基酸残基，其中六个是组氨酸残基的组氨酸标记被连接到多肽的C末端，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。现已证实，用合成的寡核糖核苷酸作为底物，从NE1181转录生成的多肽能够识别4-核苷酸序列GAAU或AAAU来裂解RNA。
[0100] 由于NE1181基因的mRNA中有识别序列可被NE1181多肽本身所裂解，人工合成一种具有变异编码子的基因，其中识别序列去除，而其编码的氨基酸序列不变。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。人工合成的NE1181基因插入到实施例4中构建的反转录病毒载体质粒pMTD3-U3TAR的BamHI位点。如上所述构建的NE1181表达反转录病毒载体质粒称为pMTD3-U3TAR-N4。
[0101] (2)从耐放射异常球菌R1中分离DR0662以及反转录病毒载体质粒的构建[0102] 从耐放射异常球菌R1中分离DR0662，从牛球菌BCG中分离Mb2014c同系物，以及表达质粒的构建
[0103] 耐放射异常球菌R1-衍生的DR0662的氨基酸序列和核苷酸序列可从NCBI数据库获得(登记号NP_294385和NC_001263)。基于DR0062核苷酸序列的信息，引物DR0662-F(SEQ ID NO：16)和引物DR0062-R(SEQ ID NO：17)被合成后用于编码整个多肽的DNA片段的PCR扩增。
[0104] 耐放射异常球菌R1的基因组DNA可从ATCC获得(ATCC No.13939D)。在所进行的PCR反应中，使用了Pyrobest DNA聚合酶(TakaraBio)，50ng的耐放射异常球菌R1基因组DNA，以及引物DR0662-F和DR0662-R，获得了368-bp的DNA扩增片段。该扩增片段经限制性内切酶NdeI和XhoI消化，进行琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中回收347-bp的一段DNA片段。然后将此347-bp的DNA片段与经过限制性内切酶NdeI和XhoI消化的pET21a载体(Novagen)连接而得到重组质粒。该重组质粒用于转染大肠杆菌JM109。从如上所述的转化株的菌落中提取质粒，并确定其核苷酸序列。该质粒称为表达载体pET-DR0662。
[0105] 插入表达载体pET-DR0662中的、来自耐放射异常球菌R1的DR0662多肽的编码核苷酸序列，和此多肽的氨基酸序列被分别如SEQID NOS：18和19所示。在表达载体pET-DR0662和pET-Mb2014Hlg表达的多肽中，包含八个氨基酸残基，其中六个是组氨酸残基的组氨酸标记连接到SEQ ID NO：1多肽的C末端。现已证实，用合成的寡核糖核苷酸作为底物，从DR0662转录生成的多肽能够识别7-核苷酸序列UUCCUUU来裂解RNA。
[0106] 以pET-DR0662为模板用PCR扩增出的DR0662基因被插入到实施例4中构建的反转录病毒载体质粒pMTD3-U3TAR的BamHI位点。如上所述构建的DR0662表达反转录病毒载体质粒称为pMTD3-U3TAR-D3。用于扩增DR0662基因的引物如SEQ ID NOS：20和21所示。
[0107] (3)Tat表达反转录病毒载体的构建
[0108] 实施例1中所述的pQBI-Tat经限制性内切酶SacII和EcoRV消化和钝化后被插入到反转录病毒载体质粒pDON-AI中的PmeI位点而构建成pDON-Tat。pDON-Tat经BamHI和XhoI消化后去除SV40启动子和新霉素磷酸转移酶基因。IRES-ZsGreen基因片段可从pIRES2-ZsGreen1(Clontech)中经限制性内切酶消化获得，并被插入到pDON-Tat中Tat基因的下游而构建出pDON-Tat-ZsGreen。
[0109] 将G3T-hi细胞(Takara Bio)加入到6cm培养皿中，含10％胎牛血清(FBS)的DMEM用作细胞培养液。用磷酸钙的方法将10μg反转录病毒载体质粒pDON-Tat-ZsGreen和反转录病毒包装试剂盒Ampho(Retrovirus Packaging Kit Ampho(Takara Bio))转染到细胞中。转染开始8小时后更换成新鲜细胞培养液并继续培养。转染开始24小时后再次更换新鲜细胞培养液。24小时后收集细胞培养上清液并用0.45-μm过滤器进行过滤，滤液在后续实验中用作病毒上清液。转染了该病毒的细胞表达Tat蛋白和绿色荧光蛋白ZsGreen。
[0110] (4)转入MazF，NE1181或DR0662编码基因的CEM细胞系的建立
[0111] 将G3T-hi细胞(Takara Bio)加入 到6cm培养皿中，含 10％胎牛血 清(FBS)的DMEM被用作细胞培养液。用磷酸钙的方法将10μg反转录病毒载体质粒(pMTD3-U3TAR-MazF，pMTD3-U3TAR-N4或pMTD3-U3TAR-D3)和反转录病毒包装试剂盒Ampho(RetrovirusPackaging Kit Ampho(Takara Bio))转染到细胞中。转染开始8小时后更换成新鲜细胞培养液并继续培养。转染开始24小时后再次更换新鲜细胞培养液。24小时后收集细胞培养上清液并用0.45-μm过滤器进行过滤，滤液在后续实验中用作病毒上清液。
[0112] 在37℃和5％CO2条件下，将CEM细胞培养于含有10％FBS的RPMI-1640细胞培养液中。根据操作步骤，将非组织培养处理过的24孔板用RetroNectin(Takara Bio)包被。将0.5ml上述病毒上清液中的一种加入到每一孔中。将培养板在32℃以2000xg的速度离心2小时，使反转录病毒载体被吸收到RetroNectin包被的培养板上。去除上清液后，加入
5
1ml浓度为1×10 细胞/ml的CEM细胞悬液，并在37℃和5％CO2条件下培养24小时。将含转染基因的细胞在含1mg/ml的Geneticin(G418)的细胞培养液中培养三个星期，从而建立起被相关病毒转化的多克隆细胞系。
5
1ml浓度为1×10 细胞/ml的CEM细胞悬液，并在37℃和5％CO2条件下培养24小时。将含转染基因的细胞在含1mg/ml的Geneticin(G418)的细胞培养液中培养三个星期，从而建立起被相关病毒转化的多克隆细胞系。
[0113] (5)通过诱导MazF，NE1181和DR0662的表达而形成的细胞生长抑制[0114] (1)根据操作步骤，将非组织培养处理过的24孔板用RetroNectin(Takara Bio)包被。将0.5ml实施例8中制备的Tat表达反转录病毒载体加入到每一孔中。将培养板在32℃以2000xg的速度离心2小时，使反转录病毒载体被吸收到RetroNectin包被的培5
养板上。去除上清液后，加入1ml实施例9中制备的浓度为1×10 细胞/ml的CEM细胞系的细胞悬液到每一孔中用于感染，这些CEM细胞系表达MazF，NE1181或DR0662。不含转入的mRNA interferase基因的CEM细胞用作对照，且以类似方式被Tat表达反转录病毒载体所感染。Tat表达反转录病毒载体的感染效率通过在感染2或15天后用流式细胞仪测定ZsGreen-阳性细胞的比率来确定。结果如表1所示。根据表1的结果，在被转入了编码MazF，NE1181或DR0662的mRNA interferases的基因的CEM细胞中，基因以Tat蛋白依赖性方式被表达，从而诱导细胞死亡，其与mRNA的降解和ZsGreen阳性细胞比率的下降相关联。上述结果显示，当使用的mRNA interferases的基因所具有的核苷酸序列特异性与MazF的不同时，HIV影响的细胞生长也可被抑制。
养板上。去除上清液后，加入1ml实施例9中制备的浓度为1×10 细胞/ml的CEM细胞系的细胞悬液到每一孔中用于感染，这些CEM细胞系表达MazF，NE1181或DR0662。不含转入的mRNA interferase基因的CEM细胞用作对照，且以类似方式被Tat表达反转录病毒载体所感染。Tat表达反转录病毒载体的感染效率通过在感染2或15天后用流式细胞仪测定ZsGreen-阳性细胞的比率来确定。结果如表1所示。根据表1的结果，在被转入了编码MazF，NE1181或DR0662的mRNA interferases的基因的CEM细胞中，基因以Tat蛋白依赖性方式被表达，从而诱导细胞死亡，其与mRNA的降解和ZsGreen阳性细胞比率的下降相关联。上述结果显示，当使用的mRNA interferases的基因所具有的核苷酸序列特异性与MazF的不同时，HIV影响的细胞生长也可被抑制。
[0115] 表1
[0116] ZsGreen阳性细胞比率
[0117] (Tat病毒阳性细胞比率)(％)
[0118] 第二天 第五天
[0119] 转入MazF的CEM 6.64 1.38
[0120] 转入NE1181的CEM 28.62 15.96
[0121] 转入DR0662的CEM 49.51 13.70
[0122] CEM 54.31 43.42
[0123] 实施例8：MazF表达引起的mRNA降解以及核糖体RNA的分析
[0124] (1)按如下所述构建载体，通过此载体，MazF和荧光蛋白ZsGreen可由单一mRNA中表达。以实施例2中所述的pQBI-LTRMazFcv1为模板，MazF基因可通过PCR获得。PCR扩增出的MazF基因被插入到pIRES2-ZsGreen1(Clontech)载体的SacI和BamHI位点中间。所构建的能同时表达MazF和ZsGreen的质粒称为pMazF-IZ。用于扩增MazF基因的引物如SEQ ID NOS：22和23所示。质粒pLuc-IZ被构建用于对照，即在pIRES2-ZsGreen1的SacI和BamHI位点中间插入荧光素酶基因。
[0125] (2)将人293细胞(ATCC CRL-1573)在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养5
液中培养。将0.5ml浓度为2×10 细胞/ml的293细胞悬液种植到胶原蛋白包被的24孔板(Corning)的每一孔中并培养24小时。用TransIT-293(Mirus)将pMazF-IZ或pLuc-IZ转染到细胞中。24，48或72小时后，用流式细胞仪FACS Vantage(Becton Dickinson)分析荧光蛋白的表达。用RNeasy micro(Qiagen)回收总RNA。被回收的总RNA用微电泳仪Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent)进行分析。进行了基因转移的细胞的荧光强度值用流式细胞分析法进行测定，结果见表2。表2显示，在转染了pMazF-IZ的细胞中，ZsGreen的表达被抑制。可考虑为，这是由于被表达的MazF的作用导致ZsGreen翻译抑制，进而引起mRNA的降解。对总RNA的电泳分析而确定的28s核糖体RNA和18s核糖体RNA的比率结果如表3所示。如表3所示，在转染了pMazF-IZ和pLuc-IZ的细胞中，28s核糖体RNA和
18s核糖体RNA的比率是等同的。因此，核糖体RNA未被MazF的表达所降解。
液中培养。将0.5ml浓度为2×10 细胞/ml的293细胞悬液种植到胶原蛋白包被的24孔板(Corning)的每一孔中并培养24小时。用TransIT-293(Mirus)将pMazF-IZ或pLuc-IZ转染到细胞中。24，48或72小时后，用流式细胞仪FACS Vantage(Becton Dickinson)分析荧光蛋白的表达。用RNeasy micro(Qiagen)回收总RNA。被回收的总RNA用微电泳仪Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent)进行分析。进行了基因转移的细胞的荧光强度值用流式细胞分析法进行测定，结果见表2。表2显示，在转染了pMazF-IZ的细胞中，ZsGreen的表达被抑制。可考虑为，这是由于被表达的MazF的作用导致ZsGreen翻译抑制，进而引起mRNA的降解。对总RNA的电泳分析而确定的28s核糖体RNA和18s核糖体RNA的比率结果如表3所示。如表3所示，在转染了pMazF-IZ和pLuc-IZ的细胞中，28s核糖体RNA和
18s核糖体RNA的比率是等同的。因此，核糖体RNA未被MazF的表达所降解。
[0126] 表2
[0127] ZsGreen荧光强度
[0128] 24小时后 48小时后 72小时后[0129] 293细胞 2.68 3.67 3.81[0130] 转入pMazF-IZ的293细胞 6.88 15.46 14.2[0131] 转pLuc-IZ的293细胞 129.44 450.35 583.94[0132] [0075]
[0133] 表3
[0134] rRNA比率(28s/18s)
[0135] 24小时后 48小时后 72小时后[0136] 转pMazF-IZ的293细胞 2.1 2.0 2.2[0137] 转pLuc-IZ的293细胞 2.1 2.0 2.3[0138] 实施例9：MazE对MazF活性的抑制
[0139] 按如下方法制备能表达MazE的反转录病毒载体质粒pMSN-MazE，MazE是MazF的一种抗毒素。
[0140] pMT-MazE质粒通过将MazE基因(SEQ ID NO：24)插入到pMT载体的BamHI和XhoI位点中间而制备(Gene Therapy，11：94-99(2004))。SV40启动子和新霉素磷酸转移酶基因可从pDON-AI中通过SalI和XhoI消化获得。该片段被插pMT-MazE中的XhoI位点。如此获得的MazE表达反转录病毒载体质粒被称为pMSN-MazE。
[0141] 将G3T-hi细胞(Takara Bio)加入到6cm培养皿中，含10％胎牛血清(FBS)的DMEM被用作细胞培养液。用磷酸钙的方法将10μg反转录病毒载体质粒pMSN-MazE和反转录病毒包装试剂盒Ampho(Retrovirus Packaging Kit Ampho(Takara Bio))转染到细胞中。转染开始8小时后更换成新鲜细胞培养液并继续培养。转染开始24小时后再次更换新鲜细胞培养液。24小时后收集细胞培养上清液并用0.45-μm过滤器进行过滤，滤液被用作pMSN-MazE病毒上清液。根据操作步骤，将非组织培养处理过的24孔板用RetroNectin(Takara Bio)包被。将0.5ml的MSN-MazE病毒载体加入到每一孔中。将培养板在32℃以2000xg的速度离心2小时，使MazE表达反转录病毒载体被吸收到RetroNectin5
包被的培养板上。去除上清液后，加入1ml浓度为1×10 细胞/ml的293细胞悬液到每一孔中用于感染细胞，并在37℃和5％CO2条件下培养24小时。然后在含0.5mg/ml的Geneticin(G418)的细胞培养液中培养含转染基因的细胞两个星期，从而建立起可持续表达MazE的多克隆细胞系293-MazE。
包被的培养板上。去除上清液后，加入1ml浓度为1×10 细胞/ml的293细胞悬液到每一孔中用于感染细胞，并在37℃和5％CO2条件下培养24小时。然后在含0.5mg/ml的Geneticin(G418)的细胞培养液中培养含转染基因的细胞两个星期，从而建立起可持续表达MazE的多克隆细胞系293-MazE。
[0142] 反转录病毒载体质粒pSINH-HLTR-MazF是通过去除实施例4所述的pSIN-HLTR-MazF中的新霉素磷酸转移酶基因，并将潮霉素抗性基因插入该位置而制备的。
[0143] 将G3T-hi细胞(Takara Bio)加入到6cm培养皿中，含10％胎牛血清(FBS)的DMEM被用作细胞培养液。用磷酸钙的方法将10μg反转录病毒载体质粒pSINH-HLTR-MazF和反转录病毒包装试剂盒Ampho(Retrovirus Packaging Kit Ampho(Takara Bio))转染到细胞中。转染开始8小时后更换成新鲜细胞培养液并继续培养。转染开始24小时后再次更换新鲜细胞培养液。24小时后收集细胞培养上清液并用0.45-μm过滤器进行过滤，滤液被用作pSINH-HLTR-MazF病毒上清液。根据操作步骤，将非组织培养处理过的24孔板用RetroNectin(Takara Bio)包被。将0.5ml的SINH-HLTR-MazF病毒载体加入到每一孔中。将培养板在32℃以2000xg的速度离心2小时，使MazF表达反转录病毒载体被吸收到5
RetroNectin包被的培养板上。去除上清液后，加入1ml浓度为1×10 细胞/ml的293-MazE或293细胞悬液到每一孔中用于感染细胞，并在37℃和5％CO2条件下培养24小时。然后在含0.2mg/ml潮酶素-B(hygromycin)的细胞培养液中培养含转染基因的细胞两个星期，从而建立多克隆细胞系293-MazE-MazF和293-MazF。
RetroNectin包被的培养板上。去除上清液后，加入1ml浓度为1×10 细胞/ml的293-MazE或293细胞悬液到每一孔中用于感染细胞，并在37℃和5％CO2条件下培养24小时。然后在含0.2mg/ml潮酶素-B(hygromycin)的细胞培养液中培养含转染基因的细胞两个星期，从而建立多克隆细胞系293-MazE-MazF和293-MazF。
[0144] 根据操作步骤，将非组织培养处理过的24孔板用RetroNectin(Takara Bio)包被。将0.5ml实施例8中所述的Tat表达反转录病毒载体加入到每一孔中。将培养板在32℃以2000xg的速度离心2小时，使反转录病毒载体被吸收到RetroNectin包被的培养板
5
上。去除上清液后，加入1ml浓度为1×10 细胞/ml的293-MazE-MazF或293-MazF细胞悬液到每一孔中用于感染细胞。293细胞也被同时感染而用于对照。感染两天后在显微镜下观察细胞生长。Tat蛋白作用诱导的MazF的表达使293-MazF细胞的生长受到抑制。而
293-MazE-MazF细胞，由于MazF的作用被MazE中和，其细胞生长情况与293细胞相同。因此，在真核细胞中，MazE也是MazF的一种抗毒素。
5
上。去除上清液后，加入1ml浓度为1×10 细胞/ml的293-MazE-MazF或293-MazF细胞悬液到每一孔中用于感染细胞。293细胞也被同时感染而用于对照。感染两天后在显微镜下观察细胞生长。Tat蛋白作用诱导的MazF的表达使293-MazF细胞的生长受到抑制。而
293-MazE-MazF细胞，由于MazF的作用被MazE中和，其细胞生长情况与293细胞相同。因此，在真核细胞中，MazE也是MazF的一种抗毒素。
[0145] 工业实用性
[0146] 本发明提供了一种可有效治疗和预防人免疫缺陷型病毒(HIV)感染的核酸构建体。由于该核酸构建体被转入细胞后，HIV的复制可被抑制，因此其可有效治疗和预防HIV的感染。
[0147] 序列列表
[0148] SEQ ID NO：3；编码MazF的合成DNA。
[0149] SEQ ID NO：4；用于扩增一段HIV LTR的引物5’HIV1U3。
[0150] SEQ ID NO：5；用于扩增一段HIV LTR的引物3’HIV1R。
[0151] SEQ ID NO：6；用于扩增一段HIV LTR的引物3’HIV1TAR。
[0152] SEQ ID NO：7；用于扩增编码MazF的DNA的引物5’MazF。
[0153] SEQ ID NO：8；用于扩增编码MazF的DNA的引物3’MazF。
[0154] SEQ ID NO：9；用于扩增编码GaLV包装的DNA的引物5’KpnI。
[0155] SEQ ID NO：10；用于扩增编码GaLV包装的DNA的引物3’ClaI。
[0156] SEQ ID NO：11；用于扩增编码NE1181多肽的DNA的引物NE1181-F。
[0157] SEQ ID NO：12；用于扩增编码NE1181多肽的DNA的引物NE1181-R。
[0158] SEQ ID NO：15；编码NE1181多肽的合成DNA。
[0159] SEQ ID NO：16；用于扩增编码DR0662多肽的DNA的引物DR0662-F。
[0160] SEQ ID NO：17；用于扩增编码DR0662多肽的DNA的引物DR0662-R。
[0161] SEQ ID NO：20；用于扩增编码DR0662多肽的DNA的引物。
[0162] SEQ ID NO：21；用于扩增编码DR0662多肽的DNA的引物。
[0163] SEQ ID NO：22；用于扩增MazF编码DNA的引物。
[0164] SEQ ID NO：23；用于扩增MazF编码DNA的引物。
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