用于改善蛋白质、肽和其他分子的F-18标记的方法和组合物
阅读：1021发布：2021-03-24
专利汇可以提供用于改善蛋白质、肽和其他分子的F-18标记的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 公开了合成和使用在PET、SPECT和/或MR显像中使用的18F或19F-标记的分子的组合物和方法。优选地，通过与IIIA族金属形成复合物并且使复合物结合可与靶向分子直接或间接连接的双功能螯合剂来使18F或19F与靶向分子缀合。在其他实施方案中，18F或19F标记的部分可包含与双特异性 抗体 组合使用的可靶向的构建体以靶向 疾病 相关 抗原 。所述公开的方法和组合物使得可在30分钟或更少时间内以非常高的效率和比活性简单和重复标记分子。在优选的实施方案中，标记的分子可用于在标记后未纯化的情况下在受试者中显像。，下面是用于改善蛋白质、肽和其他分子的F-18标记的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种包含以下结构的化合物的双功能螯合剂：
其中R1和R2独立地选自：
并且R3选自：
2.根据权利要求1所述的双功能螯合剂，其进一步包含选自氟化烷基、氟化乙酸酯、氟烷基磷酸酯、氟苯胺、三氟甲基苯胺和三氟甲氧基苯胺的19F部分。
3.根据权利要求1所述的双功能螯合剂，其中所述双功能螯合剂选自1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-甲基苯甲酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-乙基苯甲酸；
1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-甲基苯基-对硝基；1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-乙基苯基-对硝基；1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-甲基苯基-对氨基；
1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-乙基苯基-对氨基；1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-甲基苯基-p-异硫氰酸酯基；1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-乙基苯
基-p-异硫氰酸酯基；1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-丁酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-丙酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-己酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1-丁胺-4,7-二乙酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1-丙胺-4,7-二乙酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1-丁炔-4,7-二乙酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1-丁基酰氨基乙基马来酰亚胺-4,7-二乙酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-甲基苯基乙酰氨基乙基马来酰亚胺；1,4,7-三氮杂环壬烷-1-丁基异硫氰酸酯基-4,7-二乙酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1-丁基叠氮基-4,7-二乙酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1-乙醇-4,7-二乙酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1-丙醇-4,7-二乙酸；1,4,7-三氮杂环壬烷-1-丁醇-4,7-二乙酸；及其衍生物。
4.根据权利要求1所述的双功能螯合剂，其进一步包含金属(M)和配位种类(X)，其中所述双功能螯合剂具有以下结构：
其中M选自Fe、Cu、Al、Ga、In、Tl、Lu、La、Sm、Ta、Si、Ge、Sn、Co、Cr、Mn、Ti、V、Sc、Y、-
Tc、Zr、Mo、W、Ru、Rh、Ir和Ni；并且X选自OH、Cl、Br、F、I、NO3、O2、CH3、CN、ClO4、H2O、BF4、SCN、N3、RCOO、CF3COO、CH3COO、HCO3、RSH和ROH。
5.根据权利要求4所述的双功能螯合剂，其中M选自铝、镓、铜、铬、钇、钆、铁、锝和铟。
64 68 111 27 99m 86
6.根据权利要求4所述的双功能螯合剂，其中M选自 Cu、Ga、In、Al、 Tc和 Y。
19 18
7.根据权利要求4所述的双功能螯合剂，其中X是OH、F或 F。
18 19 18
8.根据权利要求4所述的双功能螯合剂，其中M-X是金属- F、Al F、Al F、Al-OH、Al-H2O。
9.根据权利要求8所述的双功能螯合剂，其中通过在介于50℃和130℃之间的温度下
18
在水介质中加热使所述金属- F连接所述双功能螯合剂。
18
10.根据权利要求8所述的双功能螯合剂，其中通过微波照射使所述金属- F连接所述螯合部分。
11.根据权利要求8所述的双功能螯合剂，其中通过在介于50℃和130℃之间的温度下
18 - 18
在水介质中加热所述双功能螯合剂与 F 的铝复合物来使所述金属- F连接所述双功能螯合剂。
12.一种在水介质中包含根据权利要求1所述的双功能螯合剂的组合物。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物在约3.5至4.5的pH下。
18
14.根据权利要求12所述的组合物，其进一步包含有机溶剂以增加所述M- F复合物与所述双功能螯合剂的结合。
15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述有机溶剂选自乙腈、乙醇、二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮、丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、四氢呋喃、二噁烷和二甲亚砜。
16.根据权利要求12所述的组合物，其进一步包含抗坏血酸、邻苯二甲酸氢钾、乙醇和海藻糖。
18 64 68 111 99m
17.根据权利要求4所述的双功能螯合剂，其进一步包含选自 F、Cu、Ga、In、 Tc
86
和 Y的放射性核素。
18.根据权利要求4所述的双功能螯合剂，其中通过酰胺、酯、酸酐、碳酸酯、氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、三唑基、胺、亚胺、肟或腙键使所述双功能螯合剂与分子缀合。
19.根据权利要求18所述的双功能螯合剂，其中所述分子选自寡核苷酸、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子、抗血管生成因子、免疫调节剂、肽、多肽、蛋白质、核酸、抗体、抗体片段、药物、白介素、干扰素、寡糖、多糖、脂质、细胞受体-结合剂、铁载体和维生素。
20.根据权利要求18所述的双功能螯合剂，其中所述分子是抗体、促生长素抑制素、EGF、VEGF、铃蟾素、甲氨喋呤、生长激素、前列腺癌特异性抗体、乳癌特异性抗体、RGD、叶酸、叶酸衍生物或其类似物。
18 64 68 111 99m
21.根据权利要求18所述的双功能螯合剂，其中所述分子经 F、Cu、Ga、In、 Tc或
86
Y放射性标记。
22.根据权利要求21所述的双功能螯合剂，其中所述放射标记的分子用于显像受体。
23.根据权利要求21所述的双功能螯合剂，其中所述放射标记的分子用于显像血液系统、淋巴网状内皮系统、神经系统、内分泌和外分泌系统、骨骼肌肉系统、皮肤、肺部系统、胃肠系统、生殖系统、免疫系统、心血管系统、泌尿系统、听觉或嗅觉系统中的肿瘤。
24.根据权利要求21所述的双功能螯合剂，其中所述放射标记的分子用于诊断血管壁、毗邻血管壁的组织、或连接冠状、颈动脉或周围血管的血管壁的动脉粥样硬化斑块中的疾患。
25.根据权利要求21所述的双功能螯合剂，其中所述放射标记的分子用于正电子发射断层扫描(PET)、功能性磁共振显像(MRI)和/或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。
26.根据权利要求21所述的双功能螯合剂，其中所述放射标记的分子具有以下结构：
其中R3是选自寡核苷酸、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子、抗血管生成因子、免疫调节剂、肽、多肽、蛋白质、核酸、抗体、抗体片段、药物、白介素、干扰素、寡糖、多糖、脂质、细胞受体-结合剂和维生素的分子。
18 19
27.一种用于 F或 F标记的试剂盒，其包含：
a)至少一种缓冲剂；
b)根据权利要求1所述的双功能螯合剂；
c)填充剂；
d)辐射分解保护剂；以及
e)IIIA族金属。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述双功能螯合剂包含反应基团以结合分子。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述反应基团选自马来酰亚胺、异硫氰酸酯、酯、炔烃、叠氮化物、胺、醛和烯烃。
30.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述双功能螯合剂选自NODA-MPAEM、
NODA-MPAA、NODA-EPN、NODA-MPN、NODA-HA、NODA-MBA、NODA-EBA、NODA- 丁 炔、NODA-BA、NODA-BAEM、NODA-PM、NODA-PAEM、NODA-PI、NODA-MPI、NODA-MPAA NHS酯及其衍生物。
31.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述填充剂选自海藻糖、山梨醇、葡萄糖和甘露醇。
32.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述辐射分解保护剂是抗坏血酸。
33.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述缓冲剂选自邻苯二甲酸氢钾、HEPES、MES和醋酸盐。
34.根据权利要求27所述的试剂盒，其进一步包含选自乙醇、乙腈、MeCN、DMF和THF的有机溶剂。
35.根据权利要求27所述的试剂盒，其进一步包含在介于3.9和4.2之间的pH下水介质中的铝、海藻糖、邻苯二甲酸氢钾、乙醇和抗坏血酸。
36.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂盒内容物被冻干以用于储存。
18 19 18 19
37.一种用 F或 F标记分子的方法，其包括使 F或 F与IIIA族金属的复合物连接
根据权利要求1所述的双功能螯合剂，其中所述双功能螯合剂连接所述分子或所述双功能螯合剂随后连接所述分子。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述分子选自蛋白质、肽、抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗原结合抗体片段、亲和体和可靶向的构建体。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述IIIA族金属是铝。
18 19
40.根据权利要求39所述的方法，其中在所述 F或 F与所述铝络合之前，使所述铝连接所述双功能螯合剂。
41.根据权利要求37所述的方法，其中通过在介于50℃和110℃之间的温度下在水介
18 19
质中加热来使金属- F或金属- F复合物连接所述双功能螯合剂。
18
42.根据权利要求41所述的方法，其中在50℃下用 F标记的效率为至少35%。
43.根据权利要求37所述的方法，其中所述标记的分子的比活性为至少4,000Ci/
mmol。
44.根据权利要求37所述的方法，其中在介于3.9和4.2之间的pH下在包含铝、海藻
18
糖、邻苯二甲酸氢钾、乙醇和抗坏血酸的水介质中使金属- F复合物连接所述双功能螯合剂。
45.根据权利要求37所述的方法，其中使所述双功能螯合剂的多个拷贝连接所述分子。
46.根据权利要求37所述的方法，其中由所述方法的开始在小于30分钟内制备所述
18
F-标记的分子。
47.根据权利要求37所述的方法，其进一步包括使用正电子发射断层扫描(PET)、磁共振显像(MRI)和/或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)以在受试者中显像所述标记的分子的分布。
48.根据权利要求37所述的方法，其中通过点击化学反应或者通过马来酰亚胺-巯基反应来使所述双功能螯合剂连接所述分子。
49.根据权利要求37所述的方法，其中所述标记的分子的产率为至少95%。
18 19
50.根据权利要求47所述的方法，其进一步包括通过在所述受试者中所述 F或 F标记的分子的分布来检测、诊断或显像疾病或病原体的存在。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述疾病选自癌症、心血管疾病、传染病、炎性疾病、自身免疫性疾病、免疫功能异常疾病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥和神经疾病。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述标记的分子结合选自以下的抗原：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、c-met、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸盐受体、GRO-β、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述传染病与选自以下的病原体相关：真菌、病毒、寄生虫、细菌、人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猪白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳房肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、艾普斯登－巴尔病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病病毒、无乳链球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎球菌、流感嗜血杆菌B、苍白密螺旋体、莱姆氏病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌、结核分枝杆菌和破伤风杆菌。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自免疫介导的血小板减少症、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、舍格伦氏综合症、多发性硬化症、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、阿狄森氏病、类风湿关节炎、肉样瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘氏综合征、闭塞性血栓性脉管炎、原发性胆汁性肝硬变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血病、急进性肾小球性肾炎和纤维化肺泡炎。
55.根据权利要求50所述的方法，其中所述标记的分子是选自以下的抗体：
hR1(抗-IGF-1R)、hPAM4(抗-胰腺癌粘蛋白)、hA20(抗-CD20)、hA19(抗-CD19)、
hIMMU31( 抗 -AFP)、hLL1( 抗 -CD74)、hLL2( 抗 -CD22)、hMu-9( 抗 -CSAp)、hL243(抗-HLA-DR)、hMN-14(抗-CEACAM5)、hMN-15(抗-CEACAM6)、hRS7(抗-EGP-1)和hMN-3(抗-CEACAM6)。
用于改善蛋白质、肽和其他分子的F-18标记的方法和组合
物
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2011年12月2日提交的美国专利申请号13/309,714；和2010年12月13日提交的临时美国专利申请号61/422,258；2011年4月27日提交的61/479,660；2011年6月2日提交的61/492,613；2011年8月15日提交的61/523,668；2011年9月28日提交的61/540,248；和2011年10月14日提交的61/547,434的优先权。各优先权申请全文通过引用方式并入本文。
[0003] 领域
[0004] 本发明涉及使用用于例如PET或NMR体内显像中的18F或19F来标记肽或其他分18 19
子的方法。优选地，将 F或 F作为与铝或另外的金属(诸如IIIA族金属)的复合物通
18
过螯合部分来连接，所述螯合部分可与蛋白质、肽或其他分子共价连接。在结合金属- F或
19
金属- F复合物之前或之后，可将螯合部分连接至蛋白质、肽或其他分子。当进行热敏分子的标记时，标记可在较低温度下发生；或者可选择地，可在较高温度下标记螯合部分，并且然后使其与热敏分子缀合。在某些实施方案中，可将标记的分子用于靶向待显像或检测的细胞、组织、器官或病原体。示例性的靶向分子包括但不限于抗体、抗原结合抗体片段、双特异性抗体、亲和体(affibody)、双体抗体(diabody)、微抗体(minibody)、ScFv、适体(aptamer)、avimer、靶向肽、促生长素抑制 素、铃蟾素、奥曲肽(octreotide)、RGD肽、叶酸盐、叶酸盐类似物或任何其他已知结合与疾病相关的靶标的分子。
子的方法。优选地，将 F或 F作为与铝或另外的金属(诸如IIIA族金属)的复合物通
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过螯合部分来连接，所述螯合部分可与蛋白质、肽或其他分子共价连接。在结合金属- F或
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金属- F复合物之前或之后，可将螯合部分连接至蛋白质、肽或其他分子。当进行热敏分子的标记时，标记可在较低温度下发生；或者可选择地，可在较高温度下标记螯合部分，并且然后使其与热敏分子缀合。在某些实施方案中，可将标记的分子用于靶向待显像或检测的细胞、组织、器官或病原体。示例性的靶向分子包括但不限于抗体、抗原结合抗体片段、双特异性抗体、亲和体(affibody)、双体抗体(diabody)、微抗体(minibody)、ScFv、适体(aptamer)、avimer、靶向肽、促生长素抑制 素、铃蟾素、奥曲肽(octreotide)、RGD肽、叶酸盐、叶酸盐类似物或任何其他已知结合与疾病相关的靶标的分子。
[0005] 使用本文所述技术，高比活性的18F-标记的分子可在30分钟或更少时间内制备，并且无需标记分子的HPLC纯化而适用于显像技术。标记可在适于体内直接使用的盐水介质中进行。在可选择的实施方案中，可添加有机溶剂以提高标记效率。在生理条件下标记的分子是稳定的，但为了某些目的，例如试剂盒配制物，可添加稳定剂，诸如抗坏血酸、海藻糖、山梨醇或甘露醇。在其他可选择的实施方案中，在用18F标记之前，螯合部分可用铝预加载，并冻干以用于储存。
[0006] 背景
[0007] 正电子发射断层扫描(PET)在诊断医学中已经成为最突出的功能显像形式之一，其具有非常高的灵敏度(fmol)、高分辨率(4-10mm)和可充分定量的组织增生18
(tissue accretion)(Volkow等，1988,Am.J.Physiol.Imaging3:142)。 尽 管[ F]2- 脱
18
氧-2-氟-D-葡萄糖([ F]FDG)是在肿瘤学中最广泛使用的PET显像剂(Fletcher等，
2008,J.Nucl.Med.49:480)，但对开发用于功能显像的其他标记化合物以补充和增加解剖显像方法有浓厚兴趣(Torigian等，2007,CA Cancer J.Clin.57:206)，尤其是用当前使用的混合PET/计算机断层扫描系统。因此，存在对使发射正电子的放射性核素与具有生物和医学用途的各种分子缀合的容易的方法的需求。
(tissue accretion)(Volkow等，1988,Am.J.Physiol.Imaging3:142)。 尽 管[ F]2- 脱
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氧-2-氟-D-葡萄糖([ F]FDG)是在肿瘤学中最广泛使用的PET显像剂(Fletcher等，
2008,J.Nucl.Med.49:480)，但对开发用于功能显像的其他标记化合物以补充和增加解剖显像方法有浓厚兴趣(Torigian等，2007,CA Cancer J.Clin.57:206)，尤其是用当前使用的混合PET/计算机断层扫描系统。因此，存在对使发射正电子的放射性核素与具有生物和医学用途的各种分子缀合的容易的方法的需求。
[0008] 可用正电子发射体18F、64Cu、11C、66Ga、68Ga、76Br、94mTc、86Y和124I来标记肽或其他靶向分子。PET同位素的低喷射能是理想的，从而最小化正电子在它生成被PET照相机显像的两条511keVγ射线之前由靶位置运行的距离。发射正电子的许多同位素也具有其他发射物，例如在它们衰变链中的γ射线、α粒子或β粒子。理想的是具有为纯正电子发射体的PET同位素，从而将最小化任何放射量测定问题。同位素的半衰期也重要，因为半衰期必须足够长以将同位素连接 至靶向分子、分析产物、将它注射至患者内、并使产物定位、由非靶组织清除，然后显像。因为它的低正电子发射能、没有侧向发射以及合适的半衰期，18 +
F(β97%,635keV,t1/2110分钟)是最广泛使用的PET发射同位素之一。
F(β97%,635keV,t1/2110分钟)是最广泛使用的PET发射同位素之一。
[0009] 通常，通过使它结合碳原子来使18F连接化合物(Miller等，2008,Angew Chem Int Ed47:8998-9033)，但 也 已 经 报 道 与 硅(Shirrmacher 等，2007,Bioconj Chem18:2085-89;Hohne等，2008,Bioconj Chem19:1871-79)和硼(Ting等，2008,Fluorine Chem129:349-58)的连接。结合硼通常涉及多步骤合成，包括多个纯化步骤，其对具有11018
分钟半衰期的同位素仍有问题。用于肽的 F-标记的当前方法通常涉及以低比活性标记试剂；试剂的HPLC纯化；然后与目标肽的缀合。在缀合之后通常将缀合物再纯化以得到标记的肽的所需比活性。
分钟半衰期的同位素仍有问题。用于肽的 F-标记的当前方法通常涉及以低比活性标记试剂；试剂的HPLC纯化；然后与目标肽的缀合。在缀合之后通常将缀合物再纯化以得到标记的肽的所需比活性。
[0010] 例子为Poethko等，(J.Nucl.Med.2004;45:892-902)的标记方法，其中首先合成18
4-[ F]氟苯甲醛以及纯化(Wilson等，J.Labeled Compounds and Radiopharm.1990;XXVIII:1189-1199)，然后与肽缀合。然后通过HPLC来纯化肽缀合物以去除过量肽，这用于
18
推动缀合完成。其他例子包括用珀酰亚胺基[ F]氟苯甲酸酯(SFB)(例如，Vaidyanathan等，1992,Int.J.Rad.Appl.Instrum.B19:275)；其他酰基化合物(Tada等，1989,Labeled Compd.Radiopharm.XXVII:1317；Wester 等，1996,Nucl.Med.Biol.23:365；Guhlke 等，
1994,Nucl.Med.Biol21:819)；或者点击化学加合物(Li等，2007,Bioconj Chem.18:1987)来标记。这些方法的总合成和配制时间介于1–3小时之间，其中大部分时间用于标记的肽
18
的HPLC纯化以得到体内靶向所需的比活性。对于2小时半衰期，将 F连接至肽所需的所有操作是个巨大负担。进行这些方法也是繁琐的，并且需要使用用于产生标记的产物的特别设计的设备和/或专业化学人员的努力。它们并无益于在临床环境中可常规使用的试剂盒配制物。
4-[ F]氟苯甲醛以及纯化(Wilson等，J.Labeled Compounds and Radiopharm.1990;XXVIII:1189-1199)，然后与肽缀合。然后通过HPLC来纯化肽缀合物以去除过量肽，这用于
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推动缀合完成。其他例子包括用珀酰亚胺基[ F]氟苯甲酸酯(SFB)(例如，Vaidyanathan等，1992,Int.J.Rad.Appl.Instrum.B19:275)；其他酰基化合物(Tada等，1989,Labeled Compd.Radiopharm.XXVII:1317；Wester 等，1996,Nucl.Med.Biol.23:365；Guhlke 等，
1994,Nucl.Med.Biol21:819)；或者点击化学加合物(Li等，2007,Bioconj Chem.18:1987)来标记。这些方法的总合成和配制时间介于1–3小时之间，其中大部分时间用于标记的肽
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的HPLC纯化以得到体内靶向所需的比活性。对于2小时半衰期，将 F连接至肽所需的所有操作是个巨大负担。进行这些方法也是繁琐的，并且需要使用用于产生标记的产物的特别设计的设备和/或专业化学人员的努力。它们并无益于在临床环境中可常规使用的试剂盒配制物。
[0011] 存在对诸如蛋白质或肽的靶向部分的18F标记的快速、简单方法 的需求，其导致靶向合适比活性以及检测和/或显像的体内稳定性的构建体、同时最小化对专业设备或高度训练人员的要求并降低操作者对高水平辐射的暴露。更优选地，存在对制备在预靶向技术中使用的18F-标记的靶向肽的方法的需求。还存在对可提供进行这些新方法所需的组合物的预包装的试剂盒的需求。另外存在对有效地标记温度敏感性分子的方法的需求。 发明概要
[0012] 在各实施方案中，本发明涉及与用于PET或NMR显像的18F-或 19F-标记的分子相18
关的组合物和方法。如本文所讨论，在本申请提及 F的情况下，熟练技术人员认识到，可利
18 19 68 18 18
用 F、F或另外的放射性核素，例如 Ga。在示例性的方法中，F结合金属，并且 F-金属
18
复合物连接至肽或其他分子上的配体。如下所述，IIIA族金属(铝、镓、铟和铊)适用于 F结合，但优选铝。也可使用镥。金属结合配体优选为螯合剂，例如NOTA、NODA、NETA、DOTA、DTPA和其他以下更详细讨论的螯合基团。可选择地，可首先将金属连接至分子，然后添加
18 18
F以结合金属。在又一其他实施方案中，可首先将 F-金属连接至螯合部分，然后将标记
18
的螯合部分连接至分子，例如温度敏感性分子。以这种方式，可在较高温度下将 F-金属连接至螯合部分，例如介于90℃至110℃之间，更优选为介于95℃至105℃之间，并且可在较
18
低温度下例如在室温下将 F-标记的螯合部分连接至温度敏感性分子。
关的组合物和方法。如本文所讨论，在本申请提及 F的情况下，熟练技术人员认识到，可利
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用 F、F或另外的放射性核素，例如 Ga。在示例性的方法中，F结合金属，并且 F-金属
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复合物连接至肽或其他分子上的配体。如下所述，IIIA族金属(铝、镓、铟和铊)适用于 F结合，但优选铝。也可使用镥。金属结合配体优选为螯合剂，例如NOTA、NODA、NETA、DOTA、DTPA和其他以下更详细讨论的螯合基团。可选择地，可首先将金属连接至分子，然后添加
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F以结合金属。在又一其他实施方案中，可首先将 F-金属连接至螯合部分，然后将标记
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的螯合部分连接至分子，例如温度敏感性分子。以这种方式，可在较高温度下将 F-金属连接至螯合部分，例如介于90℃至110℃之间，更优选为介于95℃至105℃之间，并且可在较
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低温度下例如在室温下将 F-标记的螯合部分连接至温度敏感性分子。
[0013] 熟练技术人员认识到，可使几乎任何递送分子连接至18F以用于显像目的，只要它含有在不影响在递送分子和细胞或组织靶受体之间的配体-受体结合相互作用的情况下18
可被修饰的可衍生基团。尽管以下实施例主要涉及 F-标记的肽部分，但可将许多其他类
18
型的递送分子经 F-标记并用于显像目的，所述其他类型的递送分子诸如寡核苷酸、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子、抗血管生成因子、免疫调节剂、蛋白质、核酸、抗体、抗体片段、药物、白 介素、干扰素、寡糖、多糖、铁载体、脂质等。 [0014] 在预靶向递送18F或其他试剂中使用的在以下实施例中所述的示例性可靶向的构建体肽包括但不限于IMP449、IMP460、IMP461、IMP467、IMP469、IMP470、IMP471、IMP479、IMP485、IMP486、IMP487、IMP488、IMP490、IMP493、IMP495、IMP497和IMP500，其包含螯合部分，该螯合部分包括但不限于DTPA、NOTA、苄基-NOTA、NOTA的烷基或芳基衍生物、NODA、NODA-GA、C-NETA、琥珀酰基-C-NETA和双-叔丁基-NODA。
可被修饰的可衍生基团。尽管以下实施例主要涉及 F-标记的肽部分，但可将许多其他类
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型的递送分子经 F-标记并用于显像目的，所述其他类型的递送分子诸如寡核苷酸、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子、抗血管生成因子、免疫调节剂、蛋白质、核酸、抗体、抗体片段、药物、白 介素、干扰素、寡糖、多糖、铁载体、脂质等。 [0014] 在预靶向递送18F或其他试剂中使用的在以下实施例中所述的示例性可靶向的构建体肽包括但不限于IMP449、IMP460、IMP461、IMP467、IMP469、IMP470、IMP471、IMP479、IMP485、IMP486、IMP487、IMP488、IMP490、IMP493、IMP495、IMP497和IMP500，其包含螯合部分，该螯合部分包括但不限于DTPA、NOTA、苄基-NOTA、NOTA的烷基或芳基衍生物、NODA、NODA-GA、C-NETA、琥珀酰基-C-NETA和双-叔丁基-NODA。
[0015] 在某些实施方案中，可利用双特异性或多特异性抗体或抗体片段，将示例性18
F-标记的肽用作在预靶向方法中的可靶向的构建体。在这种情况下，抗体或片段包含与疾病或病症相关的靶标的一个或多个结合位点，所述靶标例如肿瘤相关或自身免疫疾病相关抗原、或者通过诸如病毒、细菌、真菌或其他微生物的病原生物所产生或展示的抗原。第二结合位点特异性结合可靶向的构建体。使用双特异性或多特异性抗体预靶向的方法是本领域熟知的(参见，例如，美国专利号6,962,702，其实施例部分通过引用方式并入本文。)类似地，结合可靶向的构建体的抗体或其片段也是本领域熟知的，例如结合HSG(组胺琥珀酰甘氨酸)的679单克隆抗体或者结合In-DTPA的734抗体(参见美国专利号7,429,381；
7,563,439；7,666,415；和7,534,431，其实施例部分通过引用方式各自并入本文)。通常，在预靶向方法中，首先施用双特异性或多特异性抗体，然后使其结合细胞或组织靶抗原。在
18
将未结合的抗体从循环中清除的适当时间之后，将例如 F-标记的可靶向的构建体施用至患者，并结合位于靶细胞或组织中的抗体。然后通过例如PET扫描来进行显像。
F-标记的肽用作在预靶向方法中的可靶向的构建体。在这种情况下，抗体或片段包含与疾病或病症相关的靶标的一个或多个结合位点，所述靶标例如肿瘤相关或自身免疫疾病相关抗原、或者通过诸如病毒、细菌、真菌或其他微生物的病原生物所产生或展示的抗原。第二结合位点特异性结合可靶向的构建体。使用双特异性或多特异性抗体预靶向的方法是本领域熟知的(参见，例如，美国专利号6,962,702，其实施例部分通过引用方式并入本文。)类似地，结合可靶向的构建体的抗体或其片段也是本领域熟知的，例如结合HSG(组胺琥珀酰甘氨酸)的679单克隆抗体或者结合In-DTPA的734抗体(参见美国专利号7,429,381；
7,563,439；7,666,415；和7,534,431，其实施例部分通过引用方式各自并入本文)。通常，在预靶向方法中，首先施用双特异性或多特异性抗体，然后使其结合细胞或组织靶抗原。在
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将未结合的抗体从循环中清除的适当时间之后，将例如 F-标记的可靶向的构建体施用至患者，并结合位于靶细胞或组织中的抗体。然后通过例如PET扫描来进行显像。
[0016] 在可选择的实施方案中，可将诸如促生长素抑制素、奥曲肽、铃蟾素、叶酸盐或叶酸盐类似物、RGD肽或其他已知的受体配体的直接结合受体的分子标记并用于显像。受体靶向剂可包括例如TA138，其是整联蛋白ανβ3受体的非肽拮抗剂(Liu等，2003,Bioconj.Chem. 14:1052-56)。使用金属螯合物的受体靶向显像的其他方法是本领域已知的，并可将其用于所要求保护的方法的实践中(参见，例如，Andre等，2002,J.Inorg.Biochem.88:1-6；Pearson等，1996,J.Med.,Chem.39:1361-71)。
[0017] 可被显像的疾病或病症的类型仅受用于靶向与疾病或病症相关的细胞或组织的合适递送分子的利用率的限制。已知许多此类递送分子。例如，通过公开的方法可将结合18
诸如癌症的患病组织或靶标的任何蛋白质或肽用 F标记，并将其用于检测和/或显像。在某些实施方案中，此类蛋白质或肽可包括但不限于结合肿瘤相关的抗原(TAA)的抗体或抗
18
体片段。通过描述的方法可将任何已知的TAA-结合抗体或片段用 F标记，并将其通过例如PET扫描或其他已知技术来用于显像和/或检测肿瘤。
诸如癌症的患病组织或靶标的任何蛋白质或肽用 F标记，并将其用于检测和/或显像。在某些实施方案中，此类蛋白质或肽可包括但不限于结合肿瘤相关的抗原(TAA)的抗体或抗
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体片段。通过描述的方法可将任何已知的TAA-结合抗体或片段用 F标记，并将其通过例如PET扫描或其他已知技术来用于显像和/或检测肿瘤。
[0018] 某些可选择的实施方案涉及使用“点击”化学以用于将18F-标记的部分连接至靶向分子。优选地，点击化学涉及包含诸如炔烃、硝酮或叠氮基的官能团的诸如抗体或抗原结18
合抗体片段的靶向分子与包括诸如叠氮化物、炔烃或硝酮的对应反应部分的 F-标记的部分的反应。在靶向分子包含炔烃的情况下，螯合部分或载体将包含叠氮化物、硝酮或类似的
18
反应部分。点击化学反应可在体内发生以形成高度稳定的 F-标记的靶向分子，然后将其施用至受试者。
合抗体片段的靶向分子与包括诸如叠氮化物、炔烃或硝酮的对应反应部分的 F-标记的部分的反应。在靶向分子包含炔烃的情况下，螯合部分或载体将包含叠氮化物、硝酮或类似的
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反应部分。点击化学反应可在体内发生以形成高度稳定的 F-标记的靶向分子，然后将其施用至受试者。
[0019] 在其他可选择的实施方案中，可将诸如NODA-马来酰亚胺部分的辅基用18F-金属标记，然后例如通过马来酰亚胺-巯基反应使其与靶向分子缀合。示例性的NODA-马来酰亚胺部分包括但不限于NODA-MPAEM、NODA-PM、NODA-PAEM、NODA-BAEM、NODA-BM、NODA-MPM和NODA-MBEM。
[0021] 涵盖以下附图以图示本发明的特定实施方案，并且并不旨在限制所要求主题的范围。
[0022] 图1.通过microPET显像在携带肿瘤的裸小鼠中18F-标记的试剂的生物分18 18
布。在注射(A) F-FDG、(B)用抗-CEA x抗-HSG bsMAb预靶向的Al F(IMP449)、(C)仅
18
Al F(IMP449)(未用bsMAb靶向)之后在各左侧腹上携带小的皮下LS174T肿瘤的3只裸小鼠的冠状切片。给出在显像过程结束时从动物移除的组织的表示为每克注射的剂量百分比(%ID/g)的生物分布数据。缩写：B，骨髓；H，心脏；K，肾脏；T，肿瘤。
布。在注射(A) F-FDG、(B)用抗-CEA x抗-HSG bsMAb预靶向的Al F(IMP449)、(C)仅
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Al F(IMP449)(未用bsMAb靶向)之后在各左侧腹上携带小的皮下LS174T肿瘤的3只裸小鼠的冠状切片。给出在显像过程结束时从动物移除的组织的表示为每克注射的剂量百分比(%ID/g)的生物分布数据。缩写：B，骨髓；H，心脏；K，肾脏；T，肿瘤。
[0023] 图2.对在上侧腹中携带35-mg LS174T人结肠直肠癌异种移植物的裸小鼠进行18
预靶向的Al F(IMP449)的动态显像研究。顶部3个图分别显示在120分钟显像过程内在
6个不同的5分钟间隔处从位于肿瘤的外周位置中心的躯体区域得到的冠状、矢状和横切片。在各剖视图中左侧第一个图像显示在十字准线的交叉处肿瘤的定位，其通过箭头突出表示。在显像过程中将动物向它右侧部分倾斜。底部2个图显示另外的冠状和矢状切片，其集中于冠状切片中较前平面以突出显示在肝脏和肠中的分布，而矢状视图在躯体较中心处交叉。缩写：Cor，冠状；FA，前臂；H，心脏；K，肾脏；Lv，肝脏；Sag，矢状；Tr，横切片；UB，膀胱。
预靶向的Al F(IMP449)的动态显像研究。顶部3个图分别显示在120分钟显像过程内在
6个不同的5分钟间隔处从位于肿瘤的外周位置中心的躯体区域得到的冠状、矢状和横切片。在各剖视图中左侧第一个图像显示在十字准线的交叉处肿瘤的定位，其通过箭头突出表示。在显像过程中将动物向它右侧部分倾斜。底部2个图显示另外的冠状和矢状切片，其集中于冠状切片中较前平面以突出显示在肝脏和肠中的分布，而矢状视图在躯体较中心处交叉。缩写：Cor，冠状；FA，前臂；H，心脏；K，肾脏；Lv，肝脏；Sag，矢状；Tr，横切片；UB，膀胱。
[0024] 图3.使用Al18F(IMP466)铃蟾素类似物的体内组织分布。
[0025] 图4.在携带AR42J肿瘤小鼠中注射两小时之后Al18F(IMP466)和68Ga(IMP466)的生物分布的比较(n=5)。作为对照，在单独的组(n=5)中的小鼠接受过量的未标记的奥曲肽以证实受体特异性。
[0026] 图5.在颈部携带皮下AR42J肿瘤的小鼠中注射2小时之后Al18F(IMP466)和68
Ga(IMP466)的PET/CT扫描的冠状切片。在肿瘤和肾脏中累积清晰可见。
Ga(IMP466)的PET/CT扫描的冠状切片。在肿瘤和肾脏中累积清晰可见。
[0027] 图6.在具有皮下LS174T和SK-RC52肿瘤的BALB/c裸小鼠中在静脉注射68 125 68
Ga(IMP288)1小时之后的6.0nmol I-TF2(0.37MBq)和0.25nmol Ga(IMP288)(5MBq)的生物分布。值以平均值±标准偏差 (n=5)给出。
Ga(IMP288)1小时之后的6.0nmol I-TF2(0.37MBq)和0.25nmol Ga(IMP288)(5MBq)的生物分布。值以平均值±标准偏差 (n=5)给出。
[0028] 图7.在用6.0nmol TF2预靶向之后在静脉注射1小时之后5MBqFDG和68
5MBq Ga(IMP288)(0.25nmol)的生物分布。值以平均值±标准偏差(n=5)给出。
5MBq Ga(IMP288)(0.25nmol)的生物分布。值以平均值±标准偏差(n=5)给出。
[0029] 图8.接受5MBq18F-FDG、以及一天之后以16小时间隔接受6.0nmol TF2和68
5MBq Ga(IMP288)(0.25nmol)的在右后腿(浅色箭头)上具有皮下LS174T肿瘤(0.1g)和
18
在左腿肌(深色箭头)上具有炎症的BALB/c裸小鼠的PET/CT图像。在注射 F-FDG和
68
Ga(IMP288)一小时之后将动物显像。图显示FDG-PET扫描的3D体绘制(A)、肿瘤区域的横切片(B)、以及预靶向的免疫PET扫描的3D体绘制(C)、肿瘤区域的横切片(D)。 [0030] 图9.在更早16小时时施用6.0nmol TF2之后、在静脉注射1小时之后0.25nmol
18 18 18
Al F(IMP449)(5MBq)的生物分布。未预靶向的Al F(IMP449)的生物分布或[Al F]的生物分布。值以平均值±标准偏差给出。
5MBq Ga(IMP288)(0.25nmol)的在右后腿(浅色箭头)上具有皮下LS174T肿瘤(0.1g)和
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在左腿肌(深色箭头)上具有炎症的BALB/c裸小鼠的PET/CT图像。在注射 F-FDG和
68
Ga(IMP288)一小时之后将动物显像。图显示FDG-PET扫描的3D体绘制(A)、肿瘤区域的横切片(B)、以及预靶向的免疫PET扫描的3D体绘制(C)、肿瘤区域的横切片(D)。 [0030] 图9.在更早16小时时施用6.0nmol TF2之后、在静脉注射1小时之后0.25nmol
18 18 18
Al F(IMP449)(5MBq)的生物分布。未预靶向的Al F(IMP449)的生物分布或[Al F]的生物分布。值以平均值±标准偏差给出。
[0031] 图10.以16小时间隔静脉内接受6.0nmol TF2和0.25nmolAl18F(IMP449)(5MBq)的在右侧(箭头)具有皮下LS174T肿瘤(0.1g)的BALB/c裸小鼠的静态PET/CT显像研究。18
在注射Al F(IMP449)一小时之后将动物显像。图显示3D体绘制(A)在肿瘤区域处的后视图、和横切片；(B)冠状；(C)矢状。
在注射Al F(IMP449)一小时之后将动物显像。图显示3D体绘制(A)在肿瘤区域处的后视图、和横切片；(B)冠状；(C)矢状。
[0032] 图11.IMP479(SEQ ID NO:54)的结构。
[0033] 图12.IMP485(SEQ ID NO:55)的结构。
[0034] 图13.(A)IMP487(SEQ ID NO:56)；(B)IMP490(SEQ ID NO:52)；(C)IMP493(SEQ ID NO:53)；(D)IMP495；(E)IMP496；和(F)IMP500的结构。
[0035] 图14.双-叔丁基-NODA-MPAA的合成。
[0036] 图15.NOTA的马来酰亚胺缀合物的合成。
[0037] 图16.示例性NODA-基双功能螯合剂的化学结构。
[0038] 图17.NODA-BM衍生的双功能螯合剂的化学结构。
[0039] 图18.NODA-基双功能螯合剂的进一步示例性结构。
[0040] 图19(A)和19(B).18F-标记的官能化TACN配体的放射色谱图。
[0041] 图20(A)和20(B).18F-hMN14-Fab’的放射色谱图，它在人血清中的稳定性以及与CEA的免疫反应性。
[0042] 图21.通过[Al18F]-螯合用于18F-标记的自动合成模块的示意图。
[0043] 发明详述
[0044] 提供以下定义以便于理解本文的公开内容。未明确定义的术语根据它们简单且普通的含义来使用。
[0045] 如本文所使用，“一个(a)”或“一种(an)”是指一种或多于一种事物。 [0046] 如本文所使用，术语“和”以及“或”可用于表示连接连词或转折连词。即，除非另有说明，两术语应当理解为等同于“和/或”。
[0047] 如本文所使用，“约”是指在数字的正或负10%内。例如，“约100”是指介于90和110之间的任何数字。
[0048] 如本文所使用，“肽”是指长度介于2和100个氨基酸残基之间、更优选为长度介于2至10之间、更优选介于2至6个氨基酸之间的天然存在或非天然存在的氨基酸的任何序列。“氨基酸”可以为L-氨基酸、D-氨基酸、氨基酸类似物、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。
[0049] 如本文所使用，术语“病原体”包括但不限于真菌、病毒、寄生虫和细菌，其包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒(Sendai virus)、猪白血病病毒、呼肠孤病毒(Reovirus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、人血清细小样病毒(human serum parvo-like virus)、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳房肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster virus)、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、艾普斯登－巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病病毒、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、流感嗜血杆菌B(Hemophilus influenzae B)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆氏病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和破伤风杆菌(Clostridium tetani)。
[0050] 如本文所使用，“辐射分解保护剂(radiolysis protection agent)”是指可添加18 18
至 F-标记的复合物或分子以降低 F-标记的复合物或分子通过辐射分解的断裂速率的任何分子、化合物或组合物。可使用任何已知的辐射分解保护剂，包括但不限于抗坏血酸。 [0051] 18F标记技术
至 F-标记的复合物或分子以降低 F-标记的复合物或分子通过辐射分解的断裂速率的任何分子、化合物或组合物。可使用任何已知的辐射分解保护剂，包括但不限于抗坏血酸。 [0051] 18F标记技术
[0052] 已知用18F标记分子的多种技术。表1列出多种较常见报道的氟化程序的性质。18
通过碳的标记肽通常涉及通过亲核取代使 F结合辅基，其通常为2或3个步骤，其中将辅基标记和纯化，使其连接至化合物，然后将其再纯化。已使用该通用方法通过酰胺键、醛和“点击”化学来连接辅基(Marik等，2006,Bioconj Chem17:1017-21；Poethko 等，2004,J Nucl Med45:892-902；Li等，2007,Bioconj Chem18:989-93)。最常见的形成酰胺键的试
18 18
剂为N-琥珀酰亚胺基4- F-氟苯甲酸酯( F-SFB)，但已经测试大量其他基团(Marik等，
18
2006)。在一些情况下，例如当使用形成 F-标记的活性酯酰胺基团时，可能有必要在偶联
18
反应中保护肽上的某些基团，在此后将其裂解。该 F-SFB试剂的合成以及随后与肽的缀合需要许多合成步骤，并需约2-3小时。
通过碳的标记肽通常涉及通过亲核取代使 F结合辅基，其通常为2或3个步骤，其中将辅基标记和纯化，使其连接至化合物，然后将其再纯化。已使用该通用方法通过酰胺键、醛和“点击”化学来连接辅基(Marik等，2006,Bioconj Chem17:1017-21；Poethko 等，2004,J Nucl Med45:892-902；Li等，2007,Bioconj Chem18:989-93)。最常见的形成酰胺键的试
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剂为N-琥珀酰亚胺基4- F-氟苯甲酸酯( F-SFB)，但已经测试大量其他基团(Marik等，
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2006)。在一些情况下，例如当使用形成 F-标记的活性酯酰胺基团时，可能有必要在偶联
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反应中保护肽上的某些基团，在此后将其裂解。该 F-SFB试剂的合成以及随后与肽的缀合需要许多合成步骤，并需约2-3小时。
[0053] 由Poethko等，(2004)开发了更加简便、更加有效18F-肽标记方法，其中在约18
75-90分钟内通过肟键使4- F-氟苯甲醛试剂与肽缀合，包括脱水(dry-down)步骤。在铜催
18
化剂的存在下，最新“点击化学”方法用乙炔或叠氮化物将 F-标记的分子连接至肽上(Li等，2007；Glaser和Arstad,2007,Bioconj Chem18:989-93)。在叠氮化物和乙炔基团之间的反应形成三唑连接，其非常稳定并在无需保护基团的情况下非常有效地在肽上形成。点
18
击化学用脱水步骤在约75-90分钟内以良好产率(约50%)产生 F-标记的肽。
75-90分钟内通过肟键使4- F-氟苯甲醛试剂与肽缀合，包括脱水(dry-down)步骤。在铜催
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化剂的存在下，最新“点击化学”方法用乙炔或叠氮化物将 F-标记的分子连接至肽上(Li等，2007；Glaser和Arstad,2007,Bioconj Chem18:989-93)。在叠氮化物和乙炔基团之间的反应形成三唑连接，其非常稳定并在无需保护基团的情况下非常有效地在肽上形成。点
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击化学用脱水步骤在约75-90分钟内以良好产率(约50%)产生 F-标记的肽。
[0054] 表1.选择的18F-标记方法的概况
[0055]a
[0056] 包括脱水时间b
[0057] 校正的衰变18 18 19
[0058] 使 F结合硅的最新方法使用同位素交换以用 F置换 F(Shirrmacher等，2007)。在室温下进行10分钟，该反应产生具有高比活性(225-680GBq/μmol;6,100-18,400Ci/
18 18
mmol)的 F-辅醛基。随后使 F-标记的醛与肽缀合，并通过HPLC纯化，且在40分钟内(包括脱水)获得产率约55%的经纯化的标记的肽。随后通过在标记反应之前将硅并入肽
18
内将这修改为单步骤工序(Hohne等，2008)。然而，使用 F-硅-铃蟾素衍生物在小鼠中的生物分布研究显示骨骼摄取随着时间增加(在0.5小时时为1.35±0.47%注射的剂量
18 18
(ID)/g比对在4.0小时时5.14±2.71%ID/g)，这表明 F由肽释放，因为已知未结合的 F
18
位于骨骼中(Hohne等，2008)。尿的HPLC分析显示在空隙体积中大量 F活性，其大概是由
18 - 18
于由肽释放的氟离子( F)。因而 F-硅标记的分子似乎在血清中不稳定。也报道大量肝
18
胆排泄，这归因于 F-硅-结合底物的亲脂性，并需要以后的衍生物更加亲水。也已经探索
18
将 F连接至硼的方法；然而，当前方法产生具有低比活性的缀合物(Ting等，2008)。 [0059] 通常在15分钟内和以定量产率使抗体和肽与放射性金属常规地偶联(Meares等，1984,Acc Chem Res17:202-209；Scheinberg 等，1982,Science215:1511-13)。 对 于
64 68
PET显像，Cu和 Ga通过螯合物结合肽，并显示相当好的PET-显像性能(Heppler等，
18
2000,Current Med Chem7:971-94)。因为氟化物结合大部分金属，所以我们尝试确定 F-金属复合物是否能够结合靶向分子上的螯合剂(Tewson,1989,Nucl Med Biol.16:533-51；
Martin,1996,Coordination Chem Rev141:23-32)。由于氟化铝体内可相当地稳定，所以
18
我们关注Al F复合物的结合(Li,2003,Crit Rev Oral Biol Med14:100-114；Antonny等，1992,J Biol Chem267:6710-18)。初始研究显示该方法使用双特异性抗体(bsMAb)
18
预靶向体系(定位癌症的高灵敏性和特异性技术)制备体内靶向癌症的 F-标记的肽
18
的可行性，在一些情况下其优于[ F]FDG(氟脱氧葡萄糖)(McBride等，2008,J Nucl Med( 增 刊 )49:97P；Wagner,2008,J Nucl Med49:23N-24N；Karacay 等，2000,Bioconj Chem11:842-54；Sharkey 等，2008,Cancer Res68;5282-90；Gold 等，2008,Cancer Res68:4819-26；Sharkey 等，2005,Nature Med11:1250-55；Sharkey 等，2005,Clin Cancer Res11:7109s-7121s；McBride 等，2006,J Nucl Med47:1678-88；Sharkey 等，
18
2008,Radiology246:497-508)。这些研究揭示Al F复合物可与1,4,7-三氮杂环壬
烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)稳定地结合，但产率低。
18 18
mmol)的 F-辅醛基。随后使 F-标记的醛与肽缀合，并通过HPLC纯化，且在40分钟内(包括脱水)获得产率约55%的经纯化的标记的肽。随后通过在标记反应之前将硅并入肽
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内将这修改为单步骤工序(Hohne等，2008)。然而，使用 F-硅-铃蟾素衍生物在小鼠中的生物分布研究显示骨骼摄取随着时间增加(在0.5小时时为1.35±0.47%注射的剂量
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(ID)/g比对在4.0小时时5.14±2.71%ID/g)，这表明 F由肽释放，因为已知未结合的 F
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位于骨骼中(Hohne等，2008)。尿的HPLC分析显示在空隙体积中大量 F活性，其大概是由
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于由肽释放的氟离子( F)。因而 F-硅标记的分子似乎在血清中不稳定。也报道大量肝
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胆排泄，这归因于 F-硅-结合底物的亲脂性，并需要以后的衍生物更加亲水。也已经探索
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将 F连接至硼的方法；然而，当前方法产生具有低比活性的缀合物(Ting等，2008)。 [0059] 通常在15分钟内和以定量产率使抗体和肽与放射性金属常规地偶联(Meares等，1984,Acc Chem Res17:202-209；Scheinberg 等，1982,Science215:1511-13)。 对 于
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PET显像，Cu和 Ga通过螯合物结合肽，并显示相当好的PET-显像性能(Heppler等，
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2000,Current Med Chem7:971-94)。因为氟化物结合大部分金属，所以我们尝试确定 F-金属复合物是否能够结合靶向分子上的螯合剂(Tewson,1989,Nucl Med Biol.16:533-51；
Martin,1996,Coordination Chem Rev141:23-32)。由于氟化铝体内可相当地稳定，所以
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我们关注Al F复合物的结合(Li,2003,Crit Rev Oral Biol Med14:100-114；Antonny等，1992,J Biol Chem267:6710-18)。初始研究显示该方法使用双特异性抗体(bsMAb)
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预靶向体系(定位癌症的高灵敏性和特异性技术)制备体内靶向癌症的 F-标记的肽
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的可行性，在一些情况下其优于[ F]FDG(氟脱氧葡萄糖)(McBride等，2008,J Nucl Med( 增 刊 )49:97P；Wagner,2008,J Nucl Med49:23N-24N；Karacay 等，2000,Bioconj Chem11:842-54；Sharkey 等，2008,Cancer Res68;5282-90；Gold 等，2008,Cancer Res68:4819-26；Sharkey 等，2005,Nature Med11:1250-55；Sharkey 等，2005,Clin Cancer Res11:7109s-7121s；McBride 等，2006,J Nucl Med47:1678-88；Sharkey 等，
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2008,Radiology246:497-508)。这些研究揭示Al F复合物可与1,4,7-三氮杂环壬
烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)稳定地结合，但产率低。
[0060] 在以下例子中，检查新标记条件和多种新螯合部分，其使产率由约10%增加至约18
80%，这提供在PET显像中使用的肽和其他分子的 F-标记的可行方法。
80%，这提供在PET显像中使用的肽和其他分子的 F-标记的可行方法。
[0061] 可靶向的构建体
[0062] 在某些实施方案中，用18F或其他诊断和/或治疗剂标记的部分可包含肽或其他可靶向的构建体。可选择经标记的肽(或蛋白质)例如RGD肽、奥曲肽、铃蟾素或促生长素抑制素以直接结合靶向的细胞、组织、病原生物或其他靶标以用于显像、检测和/或诊断。在其他实施方案中，可使用例如双特异性抗体选择经标记的肽以间接结合与疾 病或病症相关的可靶向的构建体肽的一个或多个结合位点以及靶抗原的一个或多个结合位点。可例如在预靶向技术中使用双特异性抗体，其中可首先向受试者施用抗体。使有充足时间以使得双特异性抗体结合靶抗原以及由循环中清除未结合的抗体。然后可向受试者施用诸如标记的肽的可靶向的构建体，并使其结合双特异性抗体以及定位在患病细胞或组织处。通过PET18
扫描或其他已知技术可测定 F-标记的可靶向的构建体的分布。
扫描或其他已知技术可测定 F-标记的可靶向的构建体的分布。
[0063] 此类可靶向的构建体可具有不同结构，并且不仅选择其与可靶向的构建体以高亲和力结合的抗体或片段的利用率，而且也选择其当在预靶向方法和双特异性抗体(bsAb)或多特异性抗体内使用时快速的体内清除。在诱导强免疫应答方面疏水性试剂最佳，而对于快速体内清除则优选亲水性试剂。因此，建立介于疏水性和亲水性之间的平衡。这部分可通过使用亲水性螯合剂来实现以抵消许多有机部分的固有疏水性。而且，可选择具有相反溶解性的可靶向的构建体的亚单位，例如，含有其中一些为疏水性以及另一些为亲水性的氨基酸的肽。除了肽之外，也可使用碳水化合物。
[0064] 可使用具有仅仅2个氨基酸残基、优选2至10个残基的肽，并也可将其与其他部分偶联，例如螯合剂。接头应当为低分子量缀合物，优选具有小于50,000道尔顿的分子量，并且有利地小于约20,000道尔顿、10,000道尔顿或5,000道尔顿。更通常地，可靶向的构建体肽将具有4个或更多残基，例如肽DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:1)，其中DOTA是1,4,7,10-四氮杂环十二烷1,4,7,10-四乙酸并且HSG是组胺琥珀酰甘氨酰基。可选择地，DOTA可被NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、TETA(p-溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)、NETA([2-(4,7-双羧基甲基[1,4,7]三氮杂环壬烷-1-基-乙基]-2-羰基甲基-氨基]乙酸)或其他已知的螯合部分替换。
[0065] 可靶向的构建体在主链结构中也可包含非天然氨基酸，例如D- 氨基酸以增加肽的体内稳定性。在可选择的实施方案中，可使用其他主链结构，诸如由非天然氨基酸或类肽构建的那些结构。
[0066] 使用固相支撑物和重复正交脱保护和偶联的标准技术在自动化肽合成仪上方便地合成用作可靶向的构建体的肽。使用诸如Boc基团的标准保护基团来有利地阻断随后用于与螯合部分或其他试剂缀合的肽中的游离氨基，同时可将N-末端残基乙酰化以增加血清稳定性。此类保护基团是熟练技术人员熟知的。参见Greene and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis,1999(John Wiley和Sons,N.Y.)。当在双特异性抗体体系内制备肽用于随后使用时，将它们从树脂有利地裂解以生成对应的C-末端酰胺，从而抑制体内羧肽酶活性。肽合成的示例性方法公开在以下实施例中。
[0067] 在使用用双特异性抗体预靶向的情况下，抗体将含有通过靶组织产生或与靶组织相关的抗原的第一结合位点和可靶向的构建体上的半抗原的第二结合位点。示例性的半抗原包括但不限于HSG和In-DTPA。由HSG半抗原获得的抗体是已知的(例如679抗体)，并可容易地病人合适的双特异性抗体内(参见，例如，美国专利号6,962,702；7,138,103和7,300,644，关于其实施例部分通过引用方式并入本文)。然而，其他半抗原和结合它们的抗体是本领域已知的，并可使用，例如In-DTPA和734抗体(例如，美国专利号7,534,431，其实施例部分通过引用方式并入本文)。
[0068] 熟练的技术人员认识到，尽管在以下实施例中公开的大部分可靶向的构建体是肽，但可将其他类型的分子用作可靶向的构建体。例如，使用螯合部分可容易地使诸如聚乙18
二醇(PEG)的聚合分子衍生以结合Al F。此类载体分子的许多例子是本领域已知的，并可
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利用，其包括但不限于聚合物、纳米例子、微球体、脂质体和胶团。对于在 F的预靶向递送
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中使用，唯一要求是载体分子包含连接金属- F的一个或多个螯合部分以及结合双特异性或多特异性抗体或其他靶向分子的一个或多个半抗原部分。
二醇(PEG)的聚合分子衍生以结合Al F。此类载体分子的许多例子是本领域已知的，并可
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利用，其包括但不限于聚合物、纳米例子、微球体、脂质体和胶团。对于在 F的预靶向递送
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中使用，唯一要求是载体分子包含连接金属- F的一个或多个螯合部分以及结合双特异性或多特异性抗体或其他靶向分子的一个或多个半抗原部分。
[0069] 螯合部分
[0070] 在一些实施方案中，18F-标记的分子可包含一个或多个亲水性螯合部分，其可结合金属离子并且也可有助于确保快速体内清除。可选择螯合剂的特定金属结合性质，并可容易地交换。
[0071] 特别有用的金属螯合物组合包括2-苄基-DTPA以及它的一甲基和环己基类似物。也可将诸如NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、DOTA、TETA(p-溴乙酰氨基-苄
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基-四乙胺四乙酸)和NETA的大环螯合剂与可能用作 F-标记的配体的多种金属一起使用。
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基-四乙胺四乙酸)和NETA的大环螯合剂与可能用作 F-标记的配体的多种金属一起使用。
[0072] 其中配体包括诸如羧酸酯或胺基的硬碱螯合官能性的DTPA和DOTA-类型螯合剂对螯合硬酸阳离子，特别是IIa族和IIIa族金属阳离子最有效。通过调节环尺寸适合目标金属可使这些金属-螯合物复合物非常稳定。用于稳定结合核素的诸如大环聚醚的其他环类型的螯合剂也引起关注。卟啉螯合剂可与多种金属复合物一起使用。可使一种以上的螯合剂与载体缀合以结合多种金属离子。诸如在美国专利号5,753,206中公开的那些的螯合剂，特别是氨硫脲乙醛酰半胱氨酸(thiosemicarbazonylglyoxylcysteine)(Tscg-Cys)和氨硫脲-乙酰半胱氨酸(thiosemicarbazinyl-acetylcysteine)(Tsca-Cys)螯合剂有利地用于结合Tc、Re、Bi和其他过渡金属的软酸阳离子、镧族元素和紧密结合软碱配体的锕系元素。它可用于将一种以上的螯合剂连接至肽。因为双DTPA半抗原的抗体是已知的(Barbet等，美国专利号5,256,395)，并且容易与靶向抗体偶联以形成双特异性抗体，所以18
在预靶向方案中可能将肽半抗原与冷的双DTPA螯合剂和另一螯合剂用于结合 F复合物。
这种肽的一个例子是Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(如SEQ ID NO:2所公开的核心肽)。诸如DOTA、TETA等的其他硬酸螯合剂可被DTPA和/或Tscg-Cys基团取代，并且使用与生成抗-双DTPA MAb所使用技术类似的技术可产生对它们特异的MAb。 [0073] 例如在Chong等，(J.Med.Chem.,2008,51:118-25)中所公开，另一种有用的螯合剂可包含NOTA-类型部分。Chong等公开了基于NOTA结构的双功能C-NETA配体的制备和
177 205/206
使用，当与 Lu或 Bi络合时，该配体显示在血清中至多14天的稳定性。螯合剂并非是限制性的，并且本领域已知和/或在以下实施例中描述的螯合剂的这些和其他例子可用于本发明的实施中。
在预靶向方案中可能将肽半抗原与冷的双DTPA螯合剂和另一螯合剂用于结合 F复合物。
这种肽的一个例子是Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(如SEQ ID NO:2所公开的核心肽)。诸如DOTA、TETA等的其他硬酸螯合剂可被DTPA和/或Tscg-Cys基团取代，并且使用与生成抗-双DTPA MAb所使用技术类似的技术可产生对它们特异的MAb。 [0073] 例如在Chong等，(J.Med.Chem.,2008,51:118-25)中所公开，另一种有用的螯合剂可包含NOTA-类型部分。Chong等公开了基于NOTA结构的双功能C-NETA配体的制备和
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使用，当与 Lu或 Bi络合时，该配体显示在血清中至多14天的稳定性。螯合剂并非是限制性的，并且本领域已知和/或在以下实施例中描述的螯合剂的这些和其他例子可用于本发明的实施中。
[0074] 应理解，可将例如具有不同螯合环尺寸的两种不同硬酸或软酸螯合剂并入可靶向的构建体内，从而由于阳离子的不同尺寸、螯合环的几何形状和优选的阳离子的络合离子18
结构来优先结合两种不同的硬酸或软酸阳离子。这使得其中之一或两者均连接至 F的两种不同金属可并入可靶向的构建体内以便于通过预靶向的双特异性抗体的最终捕获。 [0075] 抗体
结构来优先结合两种不同的硬酸或软酸阳离子。这使得其中之一或两者均连接至 F的两种不同金属可并入可靶向的构建体内以便于通过预靶向的双特异性抗体的最终捕获。 [0075] 抗体
[0076] 靶抗原
[0077] 使用的靶向抗体可对多种细胞表面或疾病相关抗原具特异性或选择性。用于显像或治疗诸如恶性疾病、心血管疾病、传染病、炎性疾病、自身免疫性疾病、代谢疾病或神经(例如，神经变性)疾病的各种疾病或病症的示例性靶抗原可包括：α-胎蛋白(AFP)、A3、β-淀粉样蛋白、CA125、结肠特异性抗原-p(CSAp)、碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、AFP、CEACAM5、CEACAM6、c-met、B7、纤连蛋白的ED-B、EGP-1、EGP-2、因子H、FHL-1、血纤蛋白(fibrin)、Flt-3、叶酸盐受体、糖蛋白IIb/IIIa、GRO-β、 人绒毛膜促性腺激素(HCG)、HER-2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、HLA-DR、Ia、ICAM-1、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、KS-1、Le(y)、低密度脂蛋白(LDL)、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5a-c、MUC16、NCA-95、NCA-90、as NF-κB、胰腺癌粘蛋白、PAM4抗原、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、Pr1、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、腱生蛋白、RANTES、T101、TAC、TAG72、TF、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、凝血酶、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、TROP2、VEGFR、EGFR、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
[0078] 在某些实施方案中，诸如显像或治疗肿瘤，使用的抗体可靶向肿瘤相关的抗原。这些抗原性标志物可以是由肿瘤产生的物质或者可以是在肿瘤位置处、在肿瘤细胞表面上或在肿瘤细胞内累积的物质。此类肿瘤相关的标志物是在Herberman,“Immunodiagnosis of Cancer”；Fleisher编辑，“The Clinical Biochemistry of Cancer”，347页(American Association of Clinical Chemists,1979)以及美国专利号4,150,149；4,361,544；和4,444,744中公开的那些，这些专利的每个的实施例部分通过引用并入本文。肿瘤相关抗原(TAA)的报道包括Mizukami等，(2005,Nature Med.11:992-97)；Hatfield等，(2005,Curr.Cancer DrugTargets5:229-48)；Vallbohmer等，(2005,J.Clin.Oncol.23:3536-44)；以及Ren等，(2005,Ann.Surg.242:55-63)，关于经鉴定的TAA，所述参考文献各自通过引用方式并入本文。
[0079] 已由Herberman(见上)归类了多种类型的肿瘤相关的标志物，包括癌胚抗原、胎盘抗原、致癌或肿瘤病毒相关的抗原、组织相关的抗原、器官相关的抗原、异位激素和正常抗原或其变体。有时，将肿瘤相关的标志物的亚单位有利地用于产生具有更高肿瘤特异性的抗体，例如，人绒毛膜促性腺激素(HCG)的β-亚单位或者癌胚抗原(CEA)的 γ区，其刺激具有极大降低的与非肿瘤物质的交叉反应性的抗体的产生，如在美国专利号4,361,644和4,444,744中所公开的。
[0080] 另一目标标志物是跨膜激活剂和CAML-相互作用蛋白(interactor)(TACI)。参见Yu等，Nat.Immunol.1:252-256(2000)。简言之，TACI是B-细胞恶性肿瘤(例如，淋巴瘤)的标志物。TACI和B-细胞成熟抗原(BCMA)由肿瘤坏死因子同系物-增殖诱导配体(APRIL)结合。APRIL刺激原代B和T-细胞的体内增殖并且由于B细胞体内聚集而增加脾重量。APRIL也与TALL-I(也称为BLyS或BAFF)竞争受体结合。可溶性BCMA和TACI特异性阻止APRIL的结合并且阻断原代B细胞的APRIL刺激的增殖。BCMA-Fc也抑制小鼠中针对钥孔虫戚血兰素(keyhole limpet hemocyanin)和纽莫法(Pneumovax)的抗体的产生，这表明通过BCMA和/或TACI的APRIL和/或TALL-I信号转导是发生体液免疫所需要的。因此，PRIL-TALL-I和BCMA-TACI形成参与B和T-细胞功能的刺激的两种配体-两种受体途径。
[0081] 在疾病包括淋巴瘤、白血病或自身免疫疾患的情况下，靶向的抗原可选自：CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、B7、MUC1、Ia、Ii、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、PlGF、ED-B纤连蛋白、致癌基因(例如，c-met或PLAGL2)、致癌基因产物、CD66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。 [0082] 在一些实施方案中，靶抗原可选自：(A)先天免疫系统的促炎效应子、(B)凝结因子、(C)补体因子和补体调节蛋白以及(D)与炎症或免疫调节异常疾患或与病理性血管生成或癌症特异性相关的靶标，其中后者的靶标不是(A)、(B)、或(C)。合适的靶标描述在2005年12月8日提交的美国专利申请号11/296,432中，其实施例部分通过引用方式并入本文。
[0083] 先天免疫系统的促炎效应子可以是促炎效应子细胞因子、促炎效应子趋化因子或促炎效应子受体。合适的促炎效应子细胞因子包括MIF、HMGB-1(高迁移率族盒蛋白1(high mobility group box protein1))、TNF-α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15和IL-18。促炎效应子趋化因子的例子包括CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、GRO-β和嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)。促炎效应子受体包括IL-4R(白介素-4受体)、IL-6R(白介素-6受体)、IL-13R(白介素-13受体)、IL-15R(白介素-15受体)和IL-18R(白介素-18受体)。
[0084] 靶向分子可结合凝结因子，例如组织因子(TF)或凝血酶。在其他实施方案中，靶向分子可结合补体因子或补体调节蛋白。在优选的实施方案中，补体因子选自C3、C5、C3a、C3b、和C5a。当靶向分子结合补体调节蛋白时，补体调节蛋白优选地选自CD46、CD55、CD59和mCRP。
[0085] MIF是先天免疫系统的重要细胞因子，并且在控制炎症应答中发挥着重要作用。最初描述的抑制巨噬细胞的无规迁移的来源于T淋巴细胞的因子，即称为巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的蛋白质在将近30年内是种神秘细胞因子。近年来，MIF作为垂体前叶产物的发现以及生物活性、重组MIF蛋白的克隆和表达引起对它体内关键生物作用的定义。MIF具有由通过糖皮质激素刺激的巨噬细胞和T淋巴细胞释放的独特性质。一旦释放，MIF克服糖皮质激素对由LPS-刺激的单核细胞体外产生TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的抑制作用，并且遏制甾体针对致死性内毒素血症的体内保护作用。通过恢复IL-2和IFN-γ产生，MIF也体外对抗T-细胞增殖的糖皮质激素抑制。MIF是可反向调节糖皮质激素的抑制作用的待鉴定的第一介体，并因而在炎症和免疫的宿主控制中发挥着关键作用。MIF特别用于癌症、病理性血管生成和败血症或者败血症性休克。最近，连同CD44、CXCR2和CXCR4，CD74被鉴定为MIF的内源性受体(参见，例如，Baron等，2011,JNeuroscience Res89:711-17)。结合MIF、CD74、CD44、CXCR2和/ 或CXCR4的靶向分子可用于显像各种这些病症。
[0086] HMGB-1，一种DNA结合细胞核和细胞溶质蛋白，是通过已经由IL-1β、TNF或LPS激活的单核细胞和巨噬细胞释放的促炎细胞因子。通过它的B盒结构域，它诱导DC的表型成熟。它也导致促炎细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α和RANTES的分泌增加。由坏死细胞释放的HMGB-1可以是组织或细胞损伤的信号，当通过DC感知时，HMGB-1诱导和/或增强免疫反应。Palumbo等报道，HMBG1诱导成血管细胞(mesoangioblast)迁移和增殖(J Cell Biol,164:441-449,2004)。靶向HMBG-1的靶向分子可用于检测、诊断或治疗关节炎，特别是骨胶原诱导的关节炎、败血症和/或败血症性休克。Yang等，PNAS USA101:296-301(2004)；Kokkola 等，Arthritis Rheum,48:2052-8(2003)；Czura 等，J Infect Dis,187增刊2:S391-6(2003)；Treutiger等，J Intern Med,254:375-85(2003)。 [0087] TNF-α是参与全身炎症和急性期反应的重要的细胞因子。TNF-α由受刺激的单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞释放。巨噬细胞、T-细胞和B-淋巴细胞、粒细胞、平滑肌细胞、嗜酸细胞、软骨细胞、成骨细胞、肥大细胞、胶质细胞和角质形成细胞在刺激之后也产生TNF-α。在例如由感染引起的损伤的过程中，它的释放由诸如白介素-1和细菌性内毒素的多种其他介体来刺激。通常连同白介素-1和-6，它对各种器官系统具有多种作用。TNF-α是败血症或败血症性休克的有用的靶标。
[0088] 补体系统是参与通常由细胞受体激活的血清糖蛋白的溶蛋白性裂解的复合物级联。“补体级联”为构成性且非特异性的，但必须将它激活才能起作用。补体激活导致酶和生化反应的单向顺序。在该级联体，特异性补体蛋白，C5，形成两种高活性、炎性副产物，C5a和C5b，其共同激活白细胞。这反过来引起大量其他炎性副产物，包括有害细胞因子、炎性酶和细胞粘着分子。同时，这些副产物可导致在许多炎性疾病中可见的组织破坏。该级联最终导致诱导炎症应答、吞 噬细胞趋化性和调理作用以及细胞裂解。
[0089] 补体系统可通过两种不同途径来激活，即经典途径和替代途径。必须将一些组分酶促裂解以激活它们的功能；其他则简单地结合以形成有活性的复合物。经典途径的活性组分包括C1q、C1r、C1s、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a和C4b。替代途径的活性组分包括C3a、C3b、因子B、因子Ba、因子Bb、因子D和备解素(Properdin)。各途径的最后阶段相同，并包括组分组装至膜攻击复合物内。膜攻击复合物的活性组分包括C5a、C5b、C6、C7、C8和C9n。 [0090] 虽然可靶向补体系统的任何这些组分，但优选某些补体组分。C3a、C4a和C5a导致肥大细胞释放趋化因子。诸如组胺和血清素，其吸引吞噬细胞、抗体和补体等。这些形成一组优选的靶标。另一组优选的靶标包括C3b、C4b和C5b，其增强外源细胞的吞噬作用。另一组优选的靶标是这两组的前驱物组分，即，C3、C4和C5。C5b、C6、C7、C8和C9诱导外源细胞(膜攻击复合物)的裂解，并形成又一组优选的靶标。
[0091] 凝结因子也是优选的靶标，特别是组织因子(TF)和凝血酶。TF也称为组织促凝血酶原激酶、CD142、凝结因子III或因子III。TF是完整膜受体糖蛋白和细胞因子受体超家族的成员。TF的配体结合胞外结构域由具有与作为2-型细胞因子受体的成员的TF类别一致的特征的两个结构模块组成。TF包含在血液凝固蛋白酶级联中，并且通过在TF的胞外结构域和循环血液凝结因子(丝氨酸蛋白酶因子VII或因子VIIa)之间的高亲和力复合物来引发外在和内在血液凝固级联。然后这些酶促活性复合物激活因子IX和因子X，导致凝血酶生成和血块形成。
[0092] TF由包括单核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞的各种细胞类型表达，并由IL-1、TNF-α或细菌脂多糖来诱导。蛋白激酶C参与内皮细胞TF表达的细胞因子激活。通过内毒素和细胞因子对TF的诱导 是引发在患有革兰氏阴性败血症的患者中可见的弥散性血管内凝血的重要机制。TF也似乎参与多种非止血功能，包括炎症、癌症、脑功能、免疫应答和肿瘤相关的血管生成。因此，靶向TF的靶向分子用于凝血紊乱、败血症、癌症、病理性血管生成和其他免疫和炎症调节异常疾病。
[0093] 在其他实施方案中，靶向分子可结合I型MHC、II型MHC或辅助分子，例如CD40、CD54、CD80或CD86。结合分子也可结合T-细胞激活细胞因子或者结合细胞因子介体，例如NF-κB。与败血症和免疫调节异常以及其他免疫疾患相关的靶标包括MIF、IL-1、IL-6、IL-8、CD74、CD83和C5aR。已经发现针对C5aR的抗体和抑制剂改善患有败血症的啮齿类存活(Huber-Lang等，FASEB J2002；16:1567-1574；Riedemann等，J Clin Invest2002；110:101-108)以及猴中的败血症性休克和成年呼吸窘迫综合征(Hangen等，J Surg Res1989；46:195-199；Stevens等，J Clin Invest1986；77:1812-1816)。因此，对于败血症，优选的靶标与感染相关，例如LPS/C5a。其他优选的靶标包括HMGB-1、TF、CD14、VEGF和IL-6，其各自与败血病或败血症性休克相关。
[0094] 在又一其他实施方案中，靶标可与移植物抗宿主疾病或移植排斥相关，例如MIF(Lo 等，Bone Marrow Transplant,30(6):375-80(2002))、CD74 或 HLA-DR。 靶 标也与急性呼吸窘迫综合征相关，例如IL-8(Bouros等，PMC Pulm Med,4(1):6(2004))；与动脉粥样硬化或再狭窄有关，例如MIF(Chen等，Arterioscler Thromb Vasc
Biol,24(4):709-14(2004))；与哮喘有关，例如IL-18(Hata等，Int Immunol，2004年10月11日，印刷前电子版)；与肉芽肿病有关，例如TNF-α(Ulbricht等，Arthritis Rheum，
50(8):2717-8(2004)；与神经病有关，例如氨甲酰EPO(促红细胞生成素)(Leist等，Science305(5681):164-5(2004)；或与者恶病质有关，例如IL-6和TNF-α。
Biol,24(4):709-14(2004))；与哮喘有关，例如IL-18(Hata等，Int Immunol，2004年10月11日，印刷前电子版)；与肉芽肿病有关，例如TNF-α(Ulbricht等，Arthritis Rheum，
50(8):2717-8(2004)；与神经病有关，例如氨甲酰EPO(促红细胞生成素)(Leist等，Science305(5681):164-5(2004)；或与者恶病质有关，例如IL-6和TNF-α。
[0095] 其他靶标包括C5a、LPS、IFN-γ、B7、CD2、CD4、CD14、CD18、 CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD18、CD27、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147、CD154。通过CD18、CD11b或CD11c的抗体可在一定程度上抑制由包括LPS的某些微生物抗原对单核细胞的激活，从而牵连β2-整联蛋白(Cuzzola等，J Immunol2000；164:5871-5876;Medvedev等，J Immunol1998；160:4535-4542)。已经发现CD83在巨细胞动脉炎(GCA)中发挥作用，该巨细胞动脉炎(GCA)是影响中等和大尺寸动脉(主要是主动脉弓的颅外分支和主动脉本身)的系统性脉管炎，导致血管狭窄和随后组织缺血、以及失眠、中风和主动脉弓综合征的严重并发症(Weyand和Goronzy,N Engl JMed2003；349:160-169；Hunder和Valente,在:Inflammatory Diseases of Blood Vessels.G.S.Hoffman和C.M.Weyand编辑,Marcel Dekker,New York,2002;255-265)。发现CD83的抗体消除在人GCA的SCID小鼠模型中血管炎(Ma-Krupa等，J Exp Med2004;199:173-183)，其向这些研究者表明，当激活时表达CD83的树突细胞在GCA中是关键的抗原提呈细胞。在这些研究中，他们使用小鼠抗-CD83MAb(来自Research Diagnostics的IgG1克隆HB15e)。CD154，TNF家族的成员，在CD4-阳性T-淋巴细胞的表面上表达，并且已经报道，CD154的人源化单克隆抗体在患有活性全身性红斑狼疮(SLE)的患者中产生显著临床益处(Grammar等，J Clin Invest2003;112:1506-1520)。也表明，该抗体可用于其他自身免疫性疾病(Kelsoe,J Clin Invest2003;112:1480-1482)。的确，也据报道该抗体对患有难治免疫血小板减少性紫癜的患者有效(Kuwana等，Blood2004;103:1229-1236)。
[0096] 在类风湿关节炎中，重组白介素-1受体拮抗剂，IL-1Ra或阿那白滞素，已经显 示 活 性 (Cohen等，Ann Rheum Dis2004;63:1062-8；Cohen,Rheum Dis Clin North Am2004;30:365-80)。迄今需要与甲氨蝶呤联合治疗的对这些患者治疗的改善是联合阿那白滞素与一种或多种抗-促炎效应子细胞因子或促炎效应子趋化因子(如上所示)。的确，在类风湿关节炎的抗体治疗的综述中，Taylor(Curr Opin Pharmacol2003;3:323-328)表明，除了TNF之外，可使用诸如IL-1、IL-6、IL-8、 IL-15、IL-17和IL-18的细胞因子的其他抗体。
[0097] 产生抗体的方法
[0098] 可通过多种非常确认的技术由杂交瘤培养物分离和纯化MAb。这些分离技术包括使用蛋白-A或蛋白-G琼脂糖的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法。参见，例如，Coligan，在2.7.1-2.7.12页和2.9.1-2.9.3页。还参见Baines等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG),”在METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY中，第10卷，79-104页(The Humana Press,Inc.1992)。在最初产生免疫原的抗体之后，可通过重组技术对抗体进行测序和随后制备。如下所讨论，鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员熟知的。
[0099] 嵌合抗体
[0100] 嵌合抗体是重组蛋白，其中人抗体的可变区由例如包括小鼠抗体的互补决定区(CDR)的小鼠抗体的可变区来替换。当向受试者施用时，嵌合抗体表现出降低的免疫原性和增加的稳定性。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开在例如Orlandi等，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA6:3833(1989)。用于构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员熟知的。例如，Leung等，Hybridama13:469(1994)通过使编码鼠LL2的Vκ和VH结构域的DNA序列、抗-CD22单克隆抗体与各自的人κ和IgG1恒定区结构域结合来产生LL2嵌合体。 [0101] 人源化抗体
[0102] 用于产生人源化MAb的技术是本领域熟知的(参见，例如，Jones等，Nature321:522(1986)；Riechmann 等，Nature332:323(1988)；Verhoeyen 等，
Science239:1534(1988)；Carter 等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA89:4285(1992)；
Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)；和Singer等，J.Immun.150:2844(1993))。可通过将来自小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链的小鼠CDR转移至人抗体的对应可变结构域来使 嵌合或鼠单克隆抗体人源化。也用人FR序列来替换嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)。因为简单地将小鼠CDR转移至人FR内通常导致抗体亲和力降低或者甚至丧失，所以为了恢复鼠抗体的初始亲和力可能需要另外的修饰。这可通过用鼠对应物来替换FR区中的一种或多种人残基来实现以获得对其表位具有的良好结合亲和力的抗体。参见，例如，Tempest等，Biotechnology9:266(1991)和Verhoeyen等，Science239:1534(1988)。
用于取代的优选残基包括FR残基，所述FR残基位于CDR残基侧链的1、2或3埃内，邻近CDR序列或者预期与CDR残基相互作用。
Science239:1534(1988)；Carter 等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA89:4285(1992)；
Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)；和Singer等，J.Immun.150:2844(1993))。可通过将来自小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链的小鼠CDR转移至人抗体的对应可变结构域来使 嵌合或鼠单克隆抗体人源化。也用人FR序列来替换嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)。因为简单地将小鼠CDR转移至人FR内通常导致抗体亲和力降低或者甚至丧失，所以为了恢复鼠抗体的初始亲和力可能需要另外的修饰。这可通过用鼠对应物来替换FR区中的一种或多种人残基来实现以获得对其表位具有的良好结合亲和力的抗体。参见，例如，Tempest等，Biotechnology9:266(1991)和Verhoeyen等，Science239:1534(1988)。
用于取代的优选残基包括FR残基，所述FR残基位于CDR残基侧链的1、2或3埃内，邻近CDR序列或者预期与CDR残基相互作用。
[0103] 人抗体
[0104] 使用组合方法或经人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生人抗体的方法是本领域已知的(例如，Mancini等，2004,New Microbiol.27:315-28；Conrad和 Scheller,2005,Comb.Chem.High Throughput Screen.8:117-26；Brekke 和Loset,2003,Curr.Opin.Pharmacol.3:544-50)。也可通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建完全人抗体，所有这些均是本领域已知的。参见，例如，McCafferty等，Nature348:552-553(1990)。预期此类完全人抗体表现出比嵌合或人源化抗体甚至更低少的副作用并且在体内用作基本内源性人抗体。
[0105] 在一种替代的方案中，噬菌体展示技术可用于生成人抗体(例如，Dantas-Barbosa等，2005,Genet.Mol.Res.4:126-40)。人抗体可由正常人或表现出特定疾病诸如癌症的人生成(Dantas-Barbosa等，2005)。由患病个体构建人抗体的优势在于循环抗体库(repertoire)可偏向针对疾病相关抗原的抗体。
[0106] 在该方法的一个非限制性例子中，Dantas-Barbosa等，(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常，由循环血液淋巴细胞获得总RNA(同前)。由μ、γ和κ链抗体库克隆重 组Fab并将其插入噬菌体展示文库内(同前)。将RNA转化为cDNA并使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物将该cDNA用于制备Fab cDNA文库(Marks等，1991,J.Mol.Biol.222:581-97)。根据Andris-Widhopf等，(2000,在：Phage Display Laboratory Manual中；Barbas等，(编辑),第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY9.1页至9.22页)来进行文库构建。
使用限制性核酸内切酶来消化Fab片段并将其插入噬菌体基因组内以制备噬菌体展示文库。可通过如本领域已知的标准噬菌体展示方法筛选此类文库。可以各种形式进行噬菌体展示，对于它们的概述，参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology3:5564-571(1993)。
使用限制性核酸内切酶来消化Fab片段并将其插入噬菌体基因组内以制备噬菌体展示文库。可通过如本领域已知的标准噬菌体展示方法筛选此类文库。可以各种形式进行噬菌体展示，对于它们的概述，参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology3:5564-571(1993)。
[0107] 也可由体外激活的B-细胞生成人抗体。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其全部以引用方式并入本文。熟练技术人员意识到，这些技术为示例性，并且可利用制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
[0108] 在另一种替代的方案中，使用标准免疫方案，可将经遗传工程化以制备人抗体的转基因动物用于生成基本针对任何免疫原性靶标的抗体。由转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等，Nature Genet.7:13(1994)；Lonberg等，Nature368:856(1994)；和Taylor等，Int.Immun.6:579(1994)公开。这种系统的非限制性例子是来自Abgenix(Fremont,CA)的(例如，Green等，1999,J.Immunol.Methods231:11-23，其以引用方式并入本文)。在 和类似的动物中，已经使小鼠抗体基因失活并由功能性人抗体基
因替换，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
因替换，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
[0109] 用含有包括大部分可变区序列、以及附加基因和调控序列的部分人IgH和Igκ基因座的种系配置的YAC(酵母人工染色体)来转化 人可变区库可用于生成产生抗体的B-细胞，可通过已知技术将产生抗体的B-细胞加工成杂交瘤。经靶抗原免疫的 将通过正常免疫应答产生人抗体，所述人抗体可通过如 上所讨论的
标准技术收获和/或制备。可获得 的大量菌株，其各自能够产生不同类型
的抗体。已经显示转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药物代谢动力学性质(Green等，1999)。熟练技术人员意识到，所要求保护的组合物和方法并不限于使用 系统，也可利用经遗传工程化以产生人抗体的任何转基因动物。
标准技术收获和/或制备。可获得 的大量菌株，其各自能够产生不同类型
的抗体。已经显示转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药物代谢动力学性质(Green等，1999)。熟练技术人员意识到，所要求保护的组合物和方法并不限于使用 系统，也可利用经遗传工程化以产生人抗体的任何转基因动物。
[0110] 已知的抗体
[0111] 熟练技术人员意识到，用于显像、检测和/或诊断的靶向分子可并入对与疾病状况或病症相关的靶抗原具有结合特异性的本领域已知的任何抗体或片段。这些已知的抗体包括但不限于hR1(抗-IGF-1R，美国专利申请系列号12/772,645，3/12/10提交)；hPAM4(抗-胰腺癌粘蛋白，美国专利号7,282,567)；hA20(抗-CD20，美国专利号7,251,164)；hA19(抗-CD19，美国专利号7,109,304)；hIMMU31(抗-AFP，美国专利号7,300,655)；hLL1(抗-CD74，美国专利号7,312,318)；hLL2(抗-CD22，美国专利号7,074,403)；hMu-9(抗-CSAp，美国专利号7,387,773)；hL243(抗-HLA-DR，美国专利号
7,612,180)；hMN-14(抗-CEACAM5，美国专利号6,676,924)；hMN-15(抗-CEACAM6，美国专利号7,662,378，美国专利申请系列号12/846,062，7/29/10提交)；hRS7(抗-TROP2)；
美 国 专 利 号7,238,785)；hMN-3( 抗-CEACAM6，美 国 专 利 号7,541,440)；Ab124 和Ab125(抗-CXCR4，美国专利号7,138,496)，各引用专利或申请的实施例部分均通过引用方式并入本文。
7,612,180)；hMN-14(抗-CEACAM5，美国专利号6,676,924)；hMN-15(抗-CEACAM6，美国专利号7,662,378，美国专利申请系列号12/846,062，7/29/10提交)；hRS7(抗-TROP2)；
美 国 专 利 号7,238,785)；hMN-3( 抗-CEACAM6，美 国 专 利 号7,541,440)；Ab124 和Ab125(抗-CXCR4，美国专利号7,138,496)，各引用专利或申请的实施例部分均通过引用方式并入本文。
[0112] 使用的可选择的抗体包括但不限于阿昔单抗(abciximab)(抗-糖蛋白IIb/IIIa)；阿仑单抗(alemtuzumab)(抗-CD52)；贝伐单抗(bevacizumab)(抗-VEGF)；西妥昔单抗(cetuximab)(抗-EGFR)；吉妥单抗(gemtuzumab)(抗-CD33)；替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗-CD20)；潘尼单抗(panitumumab)(抗-EGFR)；利妥昔单抗(rituximab)(抗-CD20)；托西莫单抗(tositumomab)(抗-CD20)；曲妥珠单
抗 (trastuzumab)(抗-ErbB2)；阿巴伏单抗(abagovomab)(抗-CA-125)；阿德木单抗(adecatumumab)(抗-EpCAM)；atlizumab(抗-IL-6受体)；benralizumab(抗-CD125)；
CC49(抗-TAG-72)；AB-PG1-XG1-026(抗-PSMA，美国专利申请11/983,372；保存为ATCC PTA-4405和 PTA-4406)；D2/B( 抗-PSMA；WO2009/130575)；托 珠 单 抗 (tocilizumab)(抗-IL-6受体)；巴利昔单抗(basiliximab)(抗-CD25)；达利珠单抗(daclizumab)(抗-CD25)；依法珠单抗(efalizumab)(抗-CD11a)；GA101(抗-CD20；Glycart Roche)；
莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)(抗-CD3受体)；那他珠单抗(natalizumab)(抗-α4整联蛋白)；奥马珠单抗(omalizumab)(抗-IgE)；抗-TNF-α抗体，例如CDP571(Ofei等，
2011；Diabetes45:881-85)；MTNFAI；M2TNFAI；M3TNFAI；M3TNFABI；M302B；M303(Thermo Scientific；Rockford；IL)；英夫利昔单抗(infliximab)(CENTOCOR；Malvern；PA)；赛妥珠 单 抗(certolizumabpegol)(UCB；Brussels；Belgium)；抗-CD70L(UCB；Brussels；
Belgium)；阿达木单抗(adalimumab)(Abbott；Abbott Park；IL)；贝利单抗(Benlysta)(Human Genome Sciences)；以及针对诸如CR6261的病原体的抗体(抗流感)；艾韦单抗(exbivirumab)(抗-乙型肝炎)；泛维珠单抗(felvizumab)(抗-呼吸道合胞病毒)；夫瑞韦如(foravirumab)(抗-狂犬病毒)；莫维珠单抗(motavizumab)(抗-呼吸道合胞病毒)；
帕利珠单抗(palivizumab)(抗-呼吸道合胞病毒)；帕诺库单抗(panobacumab)(抗-假单胞菌)；瑞非韦鲁(rafivirumab)(抗-狂犬病毒)；瑞加韦单抗(regavirumab)(抗-巨细胞病毒)；司韦单抗(sevirumab)(抗-巨细胞病毒)；tivirumab(抗-乙型肝炎)；以及乌珠单抗(urtoxazumab)(抗-大肠杆菌)。
抗 (trastuzumab)(抗-ErbB2)；阿巴伏单抗(abagovomab)(抗-CA-125)；阿德木单抗(adecatumumab)(抗-EpCAM)；atlizumab(抗-IL-6受体)；benralizumab(抗-CD125)；
CC49(抗-TAG-72)；AB-PG1-XG1-026(抗-PSMA，美国专利申请11/983,372；保存为ATCC PTA-4405和 PTA-4406)；D2/B( 抗-PSMA；WO2009/130575)；托 珠 单 抗 (tocilizumab)(抗-IL-6受体)；巴利昔单抗(basiliximab)(抗-CD25)；达利珠单抗(daclizumab)(抗-CD25)；依法珠单抗(efalizumab)(抗-CD11a)；GA101(抗-CD20；Glycart Roche)；
莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)(抗-CD3受体)；那他珠单抗(natalizumab)(抗-α4整联蛋白)；奥马珠单抗(omalizumab)(抗-IgE)；抗-TNF-α抗体，例如CDP571(Ofei等，
2011；Diabetes45:881-85)；MTNFAI；M2TNFAI；M3TNFAI；M3TNFABI；M302B；M303(Thermo Scientific；Rockford；IL)；英夫利昔单抗(infliximab)(CENTOCOR；Malvern；PA)；赛妥珠 单 抗(certolizumabpegol)(UCB；Brussels；Belgium)；抗-CD70L(UCB；Brussels；
Belgium)；阿达木单抗(adalimumab)(Abbott；Abbott Park；IL)；贝利单抗(Benlysta)(Human Genome Sciences)；以及针对诸如CR6261的病原体的抗体(抗流感)；艾韦单抗(exbivirumab)(抗-乙型肝炎)；泛维珠单抗(felvizumab)(抗-呼吸道合胞病毒)；夫瑞韦如(foravirumab)(抗-狂犬病毒)；莫维珠单抗(motavizumab)(抗-呼吸道合胞病毒)；
帕利珠单抗(palivizumab)(抗-呼吸道合胞病毒)；帕诺库单抗(panobacumab)(抗-假单胞菌)；瑞非韦鲁(rafivirumab)(抗-狂犬病毒)；瑞加韦单抗(regavirumab)(抗-巨细胞病毒)；司韦单抗(sevirumab)(抗-巨细胞病毒)；tivirumab(抗-乙型肝炎)；以及乌珠单抗(urtoxazumab)(抗-大肠杆菌)。
[0113] 已知已知靶向与患病细胞、组织或器官相关的抗原的其他抗体。例如，巴皮纽阻单抗(bapineuzumab)处于阿耳茨海默氏病治疗的临床试验阶段。对于阿耳茨海默氏病所提出的其他抗体包括Alz50(Ksiezak-Reding等，1987,J Biol Chem263:7943-47)、罗氏单抗(gantenerumab)和苏兰珠单抗(solanezumab)。已经提议抗-CD3抗体用于1型糖尿病(Cernea等，2010,Diabetes Metab Rev26:602-05)。已知 血纤蛋白的抗体(例如，scFv(59D8)；T2G1s；MH1)，并在临床试验中作为显像剂以用于显示血纤蛋白凝块和肺栓子，同时诸如MN-3、MN-15、抗-NCA95和抗-CD15抗体的抗-粒细胞抗体可靶向心肌梗塞和心肌缺血。(参见，例如，美国专利号5,487,892；5,632,968；6,294,173；
7,541,440，其实施例部分通过引用方式各自并入本文)抗-巨噬细胞、抗-低密度脂蛋白(LDL)和抗-CD74(例如，hLL1)抗体可用于靶向动脉粥样硬化斑块。阿昔单抗
(抗-糖蛋白IIb/IIIa)已经被批准用于辅助预防经皮冠状动脉介入治疗的再狭窄和治疗不稳定心绞痛(Waldmann等，2000,Hematol1:394-408)。已经报道抗-CD3抗体降低动脉粥样硬化的发展和进程(Steffens等，2006,Circulation114:1977-84)。针对氧化的LDL的抗体诱导在小鼠模型中建立的动脉粥样硬化退化(Ginsberg,2007,J Am Coll Cardiol52:2319-21)。在大鼠中脑动脉闭塞之后，显示抗-ICAM-1抗体减少缺血细胞损伤(Zhang等，1994,Neurology44:1747-51)。白细胞抗原的市售单克隆抗体表示为：结合正常T-淋巴细胞的OKT抗-T细胞单克隆抗体(购自Ortho Pharmaceutical Company)；由具有ATCC登录号HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体；G7Ell、W8E7、NKP15和GO22(Becton Dickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；以及FMCll(Sera Labs)。针对血纤蛋白和血小板抗原的抗体的描述涵盖在Knight,Semin.Nucl.Med.,20:52-67(1990)中。
7,541,440，其实施例部分通过引用方式各自并入本文)抗-巨噬细胞、抗-低密度脂蛋白(LDL)和抗-CD74(例如，hLL1)抗体可用于靶向动脉粥样硬化斑块。阿昔单抗
(抗-糖蛋白IIb/IIIa)已经被批准用于辅助预防经皮冠状动脉介入治疗的再狭窄和治疗不稳定心绞痛(Waldmann等，2000,Hematol1:394-408)。已经报道抗-CD3抗体降低动脉粥样硬化的发展和进程(Steffens等，2006,Circulation114:1977-84)。针对氧化的LDL的抗体诱导在小鼠模型中建立的动脉粥样硬化退化(Ginsberg,2007,J Am Coll Cardiol52:2319-21)。在大鼠中脑动脉闭塞之后，显示抗-ICAM-1抗体减少缺血细胞损伤(Zhang等，1994,Neurology44:1747-51)。白细胞抗原的市售单克隆抗体表示为：结合正常T-淋巴细胞的OKT抗-T细胞单克隆抗体(购自Ortho Pharmaceutical Company)；由具有ATCC登录号HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体；G7Ell、W8E7、NKP15和GO22(Becton Dickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；以及FMCll(Sera Labs)。针对血纤蛋白和血小板抗原的抗体的描述涵盖在Knight,Semin.Nucl.Med.,20:52-67(1990)中。
[0114] 使用的已知抗体可结合由诸如HIV的病原体产生或者与病原体相关的抗原。此类抗体可用于检测、诊断和/或治疗传染病。候选抗-HIV抗体包括由
Johansson等，(AIDS.2006年10月3日;20(15):1911-5)描述的抗-包膜抗体；以
及由Polymun(Vienna,Austria)描述和售卖、也在美国专利5,831,034、美国专利
5,911,989、和Vcelar 等，AIDS2007;21(16):2161-2170和Joos等，Antimicrob.Agents Chemother.2006;50(5):1773-9中描述的抗-HIV抗体；这些参考文献的全部通过引用方式并入本文。
Johansson等，(AIDS.2006年10月3日;20(15):1911-5)描述的抗-包膜抗体；以
及由Polymun(Vienna,Austria)描述和售卖、也在美国专利5,831,034、美国专利
5,911,989、和Vcelar 等，AIDS2007;21(16):2161-2170和Joos等，Antimicrob.Agents Chemother.2006;50(5):1773-9中描述的抗-HIV抗体；这些参考文献的全部通过引用方式并入本文。
[0115] 可使针对疟疾寄生虫的抗体指向孢子体、裂殖子、裂殖体和配子 母细胞阶段。单克隆抗体已针对孢子体(环子孢子抗原)生成，并已显示体外和在啮齿类中结合孢子体(N.Yoshida等，Science207:71-73,1980)。已经开发多组弓形虫(T.gondii)的抗体，弓形虫是在弓形体病中涉及的原生动物寄生虫(Kasper等，J.Immunol.129:1694-1699,1982;Id.,30:2407-2412,1983)。已经开发针对血吸虫童虫(schistosomular)表面抗原的抗体，并已经发现其体内或体外结合血吸虫童虫(Simpson等，Parasitology,83:163-177,1981；
Smith 等，Parasitology,84:83-91,1982；Gryzch 等，J.Immunol.,129:2739-2743,1982；
Zodda等，J.Immunol.129:2326-2328,1982；Dissous等，J.Immunol.,129:2232-2234,1982)。
Smith 等，Parasitology,84:83-91,1982；Gryzch 等，J.Immunol.,129:2739-2743,1982；
Zodda等，J.Immunol.129:2326-2328,1982；Dissous等，J.Immunol.,129:2232-2234,1982)。
[0116] 克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)是查加斯氏病(Chagas'disease)的致病物，并通过吸血椿象科昆虫传播。已经生成体内特异性抑制寄生虫从一种形式分化为另一形式(上鞭毛体至锥虫样鞭毛型阶段)的抗体，并且其与细胞表面糖蛋白相互作用；然而，该抗原没有寄生虫的哺乳动物(血流)形式(Sher等，Nature,300:639-640,1982)。
[0117] 抗-真菌抗体是本领域已知的，例如抗-核盘霉(anti-Sclerotinia)抗体(美国专利7,910,702)；抗酸性多糖抗体(antiglucuronoxylomannan antibody)(Zhong和Priofski,1998,Clin Diag Lab Immunol5:58-64)；抗-念珠菌抗体(Matthews和Burnie,2001,2:472-76)；以及抗-鞘糖脂抗体(Toledo等，2010,BMC Microbiol10:47)。 [0118] 在使用双特异性抗体的情况下，第二MAb可选自本领域已知的任何抗-半抗原抗体，包括但不限于h679(美国专利号7,429,381)和734(美国专利号7,429,381；7,563,439；7,666,415；和7,534,431)，个专利的实施例部分各自通过引用方式并入本文。 [0119] 使用的各种其他抗体是本领域已知的(例如，美国专利号5,686,072；5,874,540；
6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；
6,962,702；7,074,403；7,230,084； 7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；
7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239和 美国 专利 申请 公开 号
20060193865；其各自通过引用方式并入本文)。此类已知的抗体用于检测和/或显像多种疾病状态或病症(例如，hMN-14或TF2(表达CEA的癌)、hA20或TF-4(淋巴瘤)、hPAM4或TF-10(胰腺癌)、RS7(肺癌、乳腺、卵巢癌、前列腺癌)、hMN-15或hMN3(炎症)、抗-gp120和/或抗-gp41(HIV)、抗-血小板和抗-凝血酶(血凝块显像)、抗-肌球蛋白(心肌坏死)、抗-CXCR4(癌症和炎性疾病))。
6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；
6,962,702；7,074,403；7,230,084； 7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；
7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239和 美国 专利 申请 公开 号
20060193865；其各自通过引用方式并入本文)。此类已知的抗体用于检测和/或显像多种疾病状态或病症(例如，hMN-14或TF2(表达CEA的癌)、hA20或TF-4(淋巴瘤)、hPAM4或TF-10(胰腺癌)、RS7(肺癌、乳腺、卵巢癌、前列腺癌)、hMN-15或hMN3(炎症)、抗-gp120和/或抗-gp41(HIV)、抗-血小板和抗-凝血酶(血凝块显像)、抗-肌球蛋白(心肌坏死)、抗-CXCR4(癌症和炎性疾病))。
[0120] 使用的抗体可商购自多个已知来源。例如，多种分泌抗体的杂交瘤获自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC,Manassas,VA)。针对包括但不限于肿瘤相关的抗原的各种疾病靶标的大量抗体已保存于ATCC和/或具有公开的可变区序列，并可用于所要求保护的方法和组合物中。参见，例如，美国专利号 7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；
7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；
6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；
6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；
6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；
6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；
6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；
6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；
6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；
6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；
6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；
6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572;856；
6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058； 6,528,625；6,528,269；
6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；
6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；
6,455,040,6,451,310；6,444,206’6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；
6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；
6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；
6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；
6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；
6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；
5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953；5,525,338。这些仅是示例性的，并且多种其他抗体和它们的杂交瘤是本领域已知的。熟练技术人员意识到，通过简单检索针对选择的目标疾病相关靶标的抗体的ATCC、NCBI和/或USPTO数据库可获得分泌针对几乎所有疾病相关抗原的抗体序列或抗体的杂交瘤。使用本领域熟知的标准技术，可将克隆的抗体的抗原结合结构域扩增、剪切、连接至表达载体、转染至适应的宿主细胞内，并用于蛋白质生成。
7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；
6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；
6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；
6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；
6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；
6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；
6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；
6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；
6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；
6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；
6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572;856；
6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058； 6,528,625；6,528,269；
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6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；
6,455,040,6,451,310；6,444,206’6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；
6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；
6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；
6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；
6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；
6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；
5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953；5,525,338。这些仅是示例性的，并且多种其他抗体和它们的杂交瘤是本领域已知的。熟练技术人员意识到，通过简单检索针对选择的目标疾病相关靶标的抗体的ATCC、NCBI和/或USPTO数据库可获得分泌针对几乎所有疾病相关抗原的抗体序列或抗体的杂交瘤。使用本领域熟知的标准技术，可将克隆的抗体的抗原结合结构域扩增、剪切、连接至表达载体、转染至适应的宿主细胞内，并用于蛋白质生成。
[0121] 抗体片段
[0122] 可通过已知技术生成识别特异性表位的抗体片段。抗体片段是抗体的抗原结合部分，例如F(ab')2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab’)2片段可通过抗体分子的胃蛋白酶消化来产生并且Fab′片段可通过还原F(ab’)2片段的二硫键来生成。可选择地，可构建Fab′表达文库(Huse等,1989,Science,246:1274-1281)以允许快速且简单地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab′片段。通过全长抗体的蛋白水解或者通过在大肠杆菌或编码片段的DNA的另一宿主中表达可制备抗体片段。通过例如Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647以及其中所包含的参考文献来描述这些方法，其专利全部通过引用方式并入本文。而且，参见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89:230(1960)；Porter,Biochem.J.73:119(1959)；Edelman等，在METHODS IN ENZYMOLOGY中 第1卷，422页(Academic Press1967)；和Coligan，在2.8.1-2.8.10页和2.10.-2.10.4页中。
[0123] 单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合形成靶结合位点。这两个结构域通过肽接头(L)进一步共价连接。用于制备scFv分子
和设计合适的肽接头的方法描述在美国专利号4,704,692；美国专利No.4,946,778；
R.Raag和M.Whitlow,“Single Chain Fvs”FASEB9:第73-80卷(1995)以及R.E.Bird和 B.W.Walker,“Single Chain Antibody Variable Regions,”TIBTECH, 第 9 卷：
132-137(1991)，其通过引用方式并入本文。
和设计合适的肽接头的方法描述在美国专利号4,704,692；美国专利No.4,946,778；
R.Raag和M.Whitlow,“Single Chain Fvs”FASEB9:第73-80卷(1995)以及R.E.Bird和 B.W.Walker,“Single Chain Antibody Variable Regions,”TIBTECH, 第 9 卷：
132-137(1991)，其通过引用方式并入本文。
[0124] 使用对应所有已知VH、Vκ和V80基因家族的PCR引物通过由非人源化人供体中分离V-基因可构建具有大库的scFv文库。参见，例如，Vaughn等，Nat.
Biotechnol.,14:309-314(1996)。在扩增之后，将Vκ和Vλ集合组合形成一个集合。将这些片段连接至噬菌粒载体。然后将scFv接头连接至VL片段的噬菌粒上游。使VH和接头-VL片段扩增和组装在JH区上。将所得VH-接头-VL片段连接至噬菌粒载体。可淘选噬菌粒文库的与选择的抗原的结合。
Biotechnol.,14:309-314(1996)。在扩增之后，将Vκ和Vλ集合组合形成一个集合。将这些片段连接至噬菌粒载体。然后将scFv接头连接至VL片段的噬菌粒上游。使VH和接头-VL片段扩增和组装在JH区上。将所得VH-接头-VL片段连接至噬菌粒载体。可淘选噬菌粒文库的与选择的抗原的结合。
[0125] 其他抗体片段，例如单个结构域抗体片段是本领域已知的并且可用于所要求保护的构建体中。可通过标准免疫技术由骆驼、羊驼或美洲驼获得单个结构域抗体(VHH)。( 参 见，例 如，Muyldermans等，TIBS26:230-235,2001；Yau 等，J Immunol Methods281:161-75,2003；Maass等，J Immunol Methods324:13-25,2007)。VHH可具有强效抗原结合能力并且可与常规VH-VL对无法到达的新型表位相互作用。(Muyldermans等，2001)羊驼血清IgG仅含有约50%骆驼重链IgG抗体(Cab)(Maass等，2007)。可使用已知抗原免疫羊驼，并可分离结合和中和靶抗原的VHH(Maass等，2007)。已经鉴定了扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物，并可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库，通过本领域熟知的标准生物淘选技术可将该羊驼VHH噬菌体展示文库用于抗体片段分离(Maass等，2007)。
这些和其他已知抗原 结合抗体片段可用于所要求保护的方法和组合物中。
这些和其他已知抗原 结合抗体片段可用于所要求保护的方法和组合物中。
[0126] 抗体克隆和制备的通用技术
[0127] 各种技术，例如嵌合或人源化抗体的制备，可包括抗体克隆和构建的程序。目标抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可通过多种分子克隆程序获得，例如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文库筛选。可通过PCR扩增克隆来自表达鼠MAb的细胞的MAb的V基因，并对其测序。为了证实它们的可靠性，如通过Orlandi等，(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:3833(1989))所述，可将克隆的VL和VH基因作为嵌合Ab表达在细胞培养物中。基于V基因序列，然后如通过Leung等，(Mol.Immunol.,32:1413(1995))所述可设计和构建人源化MAb。
[0128] 可通过一般分子克隆技术由产生鼠MAb的任何已知杂交瘤系或转染细胞 系 制 备 cDNA(Sambrook等，Molecular Cloning,A laboratory manual, 第 二 版(1989))。 可 使用 引 物VK1BACK 和VK1FOR(Orlandi等，1989)或 者 通 过Leung 等，(BioTechniques,15:286(1993))描述的扩展的引物集扩增MAb的Vκ序列。可使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等，1989)或者通过Leung等，(Hybridom,13:469(1994))描述的与鼠IgG的恒定区退火的引物扩增VH序列。可通过如Leung等(Mol.
Immunol.,32:1413(1995))所描述的长寡核苷酸模板合成和PCR扩增的组合构建人源化V基因。
Immunol.,32:1413(1995))所描述的长寡核苷酸模板合成和PCR扩增的组合构建人源化V基因。
[0129] 可将Vκ的PCR产物亚克隆至含有Ig启动子、信号肽序列和常见限制位点的分期载体(staging vector)，例如基于pBR327的分期载体，VKpBR。可将VH的PCR产物亚克隆至类似分期载体，例如基于pBluescript的VHpBS。可将含有Vκ和VH序列以及启动子和信号肽序列的表达盒由VKpBR和VHpBS切除，并分别连接至合适的表达载体，诸如pKh和pG1g(Leung等，Hybridoma,13:469(1994))。可将表达载体共转染至合适的细胞，并监控上清液中嵌合、人源化或人 MAb的产生。可选择地，如Gillies等(J.Immunol.Methods125:191(1989)中所述和也在Losman等，Cancer,80:2660(1997))中所显示，可将Vκ和VH表达盒切除并亚克隆至单个表达载体，诸如pdHL2。
[0130] 在可选择的实施方案中，可将表达载体转染至已经预先适应在无血清培养物中转染、生长和表达的宿主细胞内。可使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见，例如，美国专利号7,531,327；7,537,930和7,608,425；其实施例部分各自通过引用方式并入本文)。这些示例性细胞系基于Sp2/0骨髓瘤细胞系，用突变Bcl-EEE基因转染，暴露于甲氨蝶呤以扩增转染的基因序列，并预先适应无血清细胞系以用于蛋白质表达。
[0131] 双特异性和多特异性抗体
[0132] 某些实施方案涉及使用双特异性抗体和含有半抗原的可靶向的构建体的预靶向方法。如在例如美国专利号7,405,320中所公开，制备双特异性或多特异性抗体的多种方法是已知的，所述专利的实施例部分通过引用方式并入本文。可通过细胞杂交瘤方法制备双特异性抗体，该方法包括各自产生识别不同抗原位点的单克隆抗体的两种不同杂交瘤的融合(Milstein和Cuello,Nature,1983;305:537-540)。
[0133] 产生双特异性抗体的另一种方法使用异双功能交联剂来化学连接两种 不 同 的 单 克 隆 抗 体 (Staerz, 等，Nature.1985;314:628-631；Perez, 等，Nature.1985;316:354-356)。通过将两种亲本单克隆抗体分别还原成对应的半分子、然后将该半分子混合并使再氧化以得到混合结构也可产生双特异性抗体(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci U S A.1986;83:1453-1457)。其他方法包括通过经来源于逆转录病毒的穿梭载体将不同的可选择标志物基因转移至各自的亲本杂交瘤、随后将其融合(DeMonte,等，Proc Natl Acad Sci U S A.1990,87:2941-2945)；或者用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系来改善生成混合杂交瘤的效率。
[0134] 如上所讨论，可使同源VH和VL结构域与合适组成和长度的肽接头(通常由超过12个氨基酸残基组成)接合以形成的单链Fv(scFv)。将肽接头长度减少为小于12个氨基酸残基防止VH和VL结构域在相同链上配对，并迫使具有互补结构域的VH和VL结构域在其他链上配对，这导致功能性多聚体的形成。与介于3至12个氨基酸残基之间的接头接合的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双体抗体)。对于介于0至2个氨基酸残基的接头，优选三聚体(称为三体)和四聚体(称为四体)，但除了接头长度之外，寡聚的精确模式似乎取决于组成以及V-结构域的定向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。
[0135] 制备多特异性或双特异性抗体的这些技术在低产率、需要纯化、低稳定性或者技术的劳动密集性的方面上表现出多种困难。最近，已利用以下更详细讨论的称为“对接和锁定(dock and lock)”(DNL)的技术来制备几乎任何所需抗体、抗体片段和其他效应分子的组合(参见，例如，美国专利申请公开号20060228357；20060228300；20070086942；20070140966和20070264265，其实施例部分通过引用方式各自并入本文)。DNL技术使得可作为裸抗体部分或者与大量其他效应分子组合来组装单特异性性、双特异性或多特异性抗体，所述其他效应分子例如免疫调节剂、酶、化疗剂、趋化因子、细胞因子、诊断剂、治疗剂、放射性核素、显像剂、抗-血管生成剂、生长因子、寡核苷酸、铁载体、激素、肽、毒素、促凋亡剂或其组合。用于制备双特异性或多特异性抗体的本领域已知的任何技术可用于当前所要求保护的方法中的实施中。
[0136] 对接和锁定(DNL)
[0137] 在优选的实施方案中，可使用对接和锁定技术制备双特异性或多特异性抗体或其他构建体(参见，例如，美国专利号7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400，其实施例部分通过引用方式各自并入本文)。DNL方法利用在cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的调控(R)亚单位和A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间 发生的特异性蛋白质/蛋白质相互作用(Baillie等，FEBS Letters.2005;579:3264.Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004;5:959)。在1968年首先从兔骨骼肌中分离了在由第二信使cAMP与R亚单位的结合触发的研究最好的信号转导途径之一中发挥主要作用的PKA(Walsh等，J.Biol.Chem.1968;243:3763)。全酶的结构由两种催化亚单位组成，这两种催化亚单位通过R亚单位保持不活跃形式(Taylor,J.Biol.Chem.1989;264:8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚单位(RI和RII)，并且每种类型具有α和β同种型(Scott,Pharmacol.Ther.1991;50:123)。仅将R亚单位分离为稳定二聚体，并且已经显示二聚结构域由开头的44个氨基末端残基组成(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999;6:222)。
cAMP与R亚单位的结合导致广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚单位的释放，通过经它与AKAP的对接的PKA的区室化使活性催化亚单位定向选择的底物(Scott等，J.Biol.Chem.1990;265;21561)。
cAMP与R亚单位的结合导致广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚单位的释放，通过经它与AKAP的对接的PKA的区室化使活性催化亚单位定向选择的底物(Scott等，J.Biol.Chem.1990;265;21561)。
[0138] 自从1984年对第一种AKAP，微管相关蛋白-2表征以来(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984;81:6723)，已经在酵母至人的物种内鉴定了具有各种结构的超过50种AKAP，这些AKAP位于各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网(Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004;5:959)。PKA的AKAP的AD是14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等，J.Biol.Chem.1991;266:14188)。在单个AKAP，AD的氨基酸序列非常不同，其中所报道的RII二聚体的结合亲和力的范围为2至90nM(Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003;100:4445)。AKAP仅结合二聚R亚单位。对于人RIIα，AD结合由23个氨基酸末端残基形成的疏水性表面(Colledge和Scott,Trends Cell Biol.1999;6:216)。因此，人RIIα的二聚结构域和AKAP结合结构域均位于相同的N-末端44个氨基酸序列内(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999;6:222；Newlon等，EMBO J.2001;20:1651)，在本文中其称为DDD。
[0139] 我们已经开发了平台技术以利用人RIIα的DDD和AKAP的AD 作为将下文称为A和B的任何两个实体对接为非共价复合物的接头组件的极佳对，通过引入半胱氨酸残基至策略位置处的DDD和AD可将该非共价复合物进一步锁定至结合分子内以便于形成二硫键。“对接和锁定”方案的一般方法如下。通过将DDD序列连接至A的前体来构建实体A，这得到下文称为a的第一组分。因为DDD序列作用于二聚体的自发形成，所以A由a2构成。通过将AD序列连接至B的前体来构建实体B，这得到下文称为b的第二组分。在a2中含有的DDD的二聚基序将产生用于结合b中含有的AD序列的对接位点，从而便于缔合a2和b以形成由a2b构成的二元、三聚复合物。该结合事件与随后的反应不可逆进行以通过二硫键共价固定两个实体，因为初始结合相互作用应使位于DDD和AD上的反应硫醇基更加接近(Chmura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001;98:8480)以位点特异性进行连接，所以根据有效局部浓度的原理，所以该过程非常有效地发生。使用接头、适配体模块和前体的各种组合，可制备和使用不同化学计量的多种DNL构建体，其包括但不限于二聚、三聚、四聚、五聚和六聚DNL构建体(参见，例如，U.S.号7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和
7,666,400)。
7,666,400)。
[0140] 通过使DDD和AD远离两种前体的官能团连接，也预期这些位点特异性连接保留两种前体的初始活性。该方法本质上模块化，并可能应用于位点特异性和共价连接多种物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有多种活性的其他效应物部分。利用在以下实施例中描述的构建AD和DDD缀合效应物的融合蛋白方法，可将几乎任何蛋白质或肽并入DNL构建体内。然而，技术不是限制性的并且可利用其他缀合方法。
[0141] 已知制备融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增的，从而制备编码目标融合蛋白的合成双链核酸。通过标准分子生物技术可将此类双链核酸插入表达载体内用于产生融合蛋白(参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning,A laboratory manual,第2版,1989)。在这些优选的实施方案中，可将AD和/或DDD部分连接至效应蛋白 或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练技术人员意识到，取决于它的生理活性所涉及的效应物部分以及部分效应物部分的化学性质，AD或DDD部分与效应物部分的连接位点可变化。使用本领域已知的技术，例如使用二价交联剂和/或其他化学缀合技术可进行各种效应物部分的位点特异性连接。
[0142] 预靶向
[0143] 双特异性或多特异性抗体可用于预靶向技术。预靶向是多步骤的过程，最初开发用于解决直接靶向抗体的缓慢血液清除，这导致对诸如骨髓的正常组织的非期望毒性。使用预靶向，使放射性核素或者其他诊断或治疗剂连接至在数分钟内由血液清除的小递送分子(可靶向的构建体)。首先施用预靶向双特异性或多特异性抗体，其具有可靶向的构建体以及靶抗原的结合位点，使得游离抗体可由循环清除，然后施用可靶向的构建体。 [0144] 预靶向方法公开在诸如Goodwin等，美国专利号4,863,713；Goodwin等，J.Nucl.Med.29:226,1988；Hnatowich 等，J.Nucl.Med.28:1294,1987；Oehr 等，J.Nucl.Med.29:728,1988；Klibanov 等，J.Nucl.Med.29:1951,1988；Sinitsyn 等，J.Nucl.Med.30:66,1989；Kalofonos 等，J.Nucl.Med.31:1791,1990；Schechter 等，Int.J.Cancer48:167,1991；Paganelli 等，Cancer Res.51:5960,1991；Paganelli等，Nucl.Med.Commun.12:211,1991；美 国 专 利 号 5,256,395；Stickney 等，Cancer Res.51:6650,1991；Yuan 等，Cancer Res.51:3119,1991；美 国 专 利 号 6,077,499；7,011,812；7,300,644；7,074,405；6,962,702；7,387,772；7,052,872；7,138,103；
6,090,381；6,472,511；6,962,702；和6,962,702，其各自通过引用方式并入本文。 [0145] 通过以下可提供在受试者中治疗或诊断疾病或疾患的预靶向方法：(1)向受试者施用双特异性抗体或抗体片段；(2)向受试者任选地施用清除组合物，并使组合物可由循环中清除抗体；以及(3)向受试 者施用包含一种或多种螯合或化学结合的治疗或诊断剂的可靶向的构建体。
6,090,381；6,472,511；6,962,702；和6,962,702，其各自通过引用方式并入本文。 [0145] 通过以下可提供在受试者中治疗或诊断疾病或疾患的预靶向方法：(1)向受试者施用双特异性抗体或抗体片段；(2)向受试者任选地施用清除组合物，并使组合物可由循环中清除抗体；以及(3)向受试 者施用包含一种或多种螯合或化学结合的治疗或诊断剂的可靶向的构建体。
[0146] 免疫缀合物
[0147] 可使本文所述的任何抗体、抗体片段或抗体融合蛋白与螯合部分或其他载体分子缀合以形成免疫缀合物。螯合部分和其他官能团的共价缀合方法是本领域已知的，并可利用任何这些已知方法。
[0148] 例如，可通过形成二硫键在还原的抗体组分的铰链区处连接螯合部分或载体。可选择地，可使用诸如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)的异双功能交联剂连接这些试剂。Yu等，Int.J.Cancer56:244(1994)。这种缀合的一般技术是本领域已知的。参见，例如，Wong,CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press1991)；Upeslacis 等，“Modification of Antibodies by Chemical Methods”在MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS中；Birch等，(编辑)，187-230页(Wiley-Liss,Inc.1995)；Price,“Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodie,” 在 MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION中；Ritter等，(编辑)，60-84页(Cambridge University Press1995)。
[0149] 可选择地，在抗体的Fc区中通过碳水化合物部分可缀合螯合部分或载体。通过抗体碳水化合物部分使肽与抗体组分缀合的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Shih等，Int.J.Cancer41:832(1988)；Shih等，Int.J.Cancer46:1101(1990)；和Shih等，美国专利号5,057,313，其实施例部分通过引用方式并入本文。一般方法包括使具有氧化的碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能团的载体聚合物反应。该反应产生初始席夫碱(Schiff base)(亚胺)键合，其可通过还原为仲胺来稳定以形成最终缀合物。
[0150] 如果用作免疫缀合物的抗体组分的抗体是抗体片段，则可不存在Fc区。然而，可能将碳水化合物部分引入至全长抗体或抗体片段的轻链可变区。参见，例如，Leung等，J.Immunol.154:5919(1995)；美国专利号5,443,953和6,254,868，其实施例部分通过引用方式并入本文。工程化碳水化合物部分用于连接抗体片段的官能团。
[0151] 使螯合剂与蛋白质缀合的其他方法是本领域熟知的(参见，例如，美国专利申请号7,563,433，其实施例部分通过引用方式并入本文)。例如通过引用方式全部并入本文的美国专利4,824,659所公开，可使螯合物直接连接质抗体或肽。
[0152] 点击化学
[0153] 在各实施方案中，可使用点击化学技术制备免疫缀合物。最初设想点击化学方法是通过模块化方式将小亚单位接合至一起来快速生成复合物的方法。(参见，例如，Kolb等，2004,Angew Chem Int Ed40:3004-31；Evans,2007,Aust J Chem60:384-95)。点击化学反应的各种形式是本领域已知的，例如Huisgen1,3-双极环加成铜催化的反应(Tornoe等，2002,J Organic Chem67:3057-64)，其通常称为“点击反应”。其他可选择项包括诸如Diels-Alder的环加成反应；亲核取代反应(特别是小应变环(strained ring)，如环氧和氮丙啶化合物)；脲化合物的羰基化学形成以及涉及碳-碳双键的反应，例如在硫醇-炔反应中的炔烃。
[0154] 叠氮炔烃Huisgen环加成反应在还原剂存在下使用铜催化剂以催化连接第一分子的末端炔基的反应。在包含叠氮部分的第二分子的存在下，叠氮与活化的炔烃反应以形成1,4-二取代的1,2,3-三唑。铜催化的反应在室温下发生，并且针对性强，通常无需纯化反应产物。(Rostovstev等，2002,Angew Chem Int Ed41:2596；Tornoe等，2002,JOrg Chem67:3057)。叠氮和炔官能团对水介质中的生物分子惰性大，使得反应可在多元溶液中发生。形成的三唑化学稳定，并且不经历酶 分解，这使得点击化学产物在生物体系中高度稳定。然而，铜催化剂对活细胞有毒，这妨碍了生物应用。
[0155] 提出无铜点击反应用于活体体系中生物分子的共价修饰。(参见，例如，Agard等，2004,J Am Chem Soc126:15046-47)。无铜反应使用环张力代替铜催化剂以促进[3+2]叠氮-炔环加成反应(同前)。例如，环辛炔是包含内部炔键的8-碳环结构。闭环结构诱导乙炔的大键角变形，乙炔与叠氮基的反应性极高以形成三唑。因此，在没有毒性铜催化剂下，环辛炔衍生物可用于无铜点击反应(同前)。
[0156] 由Ning等(2010,Angew Chem Int Ed49:3065-68)报道另一类无铜点击反应，其包括张力促进的炔-硝酮环加成。为了解决初始环辛炔反应的缓慢速率，使吸电子基团连接邻近三键(同前)。这些取代的环辛炔的例子包括二氟化环辛炔、4-二苯并环辛醇和氮杂环辛炔(同前)。可选择的无铜反应涉及张力促进的炔-硝酮环加成以得到N-烷基化异噁唑啉(同前)。报道反应具有格外快的反应动力学，并且用于肽和蛋白质的位点特异性修饰的一锅三步方案(one-pot three-step protocol)(同前)。通过合适的醛与N-甲基羟胺的缩合来制备硝酮，并且环加成反应发生在乙腈和水的混合物中(同前)。然而，尝试在Jurkat细胞中使用与硝酮-标记的单糖衍生物的反应和代谢标记均不成功(同前)。 [0157] 在一些情况下，可使用细胞的内源性合成途径将用于点击化学反应的活化基团并入生物分子内。例如，Agard等，(2004,J Am Chem Soc126:15046-47)证实，在全乙酰化N-叠氮乙酰基甘露糖胺的存在下在CHO细胞中表达的重组糖蛋白导致在糖蛋白的碳水化合物中并入对应的N-叠氮乙酰基唾液酸。叠氮基衍生的糖蛋白与生物素酰化的环辛炔特异性反应以形成生物素酰化的糖蛋白，同时没有叠氮部分的对照糖蛋白保持未标记(同前)。Laughlin等，(2008,Science320:664-667)使用类似的技术以代谢地标记与全乙酰化N-叠氮乙酰基半乳糖胺孵育的斑马鱼(zebrafish)胚胎中的细胞表面聚糖。叠氮基衍生的聚糖与 二氟化环辛炔(DIFO)试剂反应以使聚糖体内可视化。
[0158] Diels-Alder反应也已经用于分子的体内标记。Rossin等，(2010,Angew Chem Int Ed49:3375-78)报道在携有反式-环辛烯(TCO)反应部分的肿瘤定位的抗-TAG72(CC49)抗111
体和 In-标记的四嗪DOTA衍生物之间52%的体内产率。向携带有结肠癌异种移植物的
111
小鼠施用TCO-标记的CC49抗体，1天之后注射 In-标记的四嗪探针(同前)。如通过在注射放射标记的探针之后三小时活小鼠的SPECT显像所证实，放射标记的探针与肿瘤定位的抗体的反应导致肿瘤中显著的放射活性，其中肿瘤与肌肉比率为13:1(同前)。结果证实TCO和四嗪-标记的分子的体内化学反应。
体和 In-标记的四嗪DOTA衍生物之间52%的体内产率。向携带有结肠癌异种移植物的
111
小鼠施用TCO-标记的CC49抗体，1天之后注射 In-标记的四嗪探针(同前)。如通过在注射放射标记的探针之后三小时活小鼠的SPECT显像所证实，放射标记的探针与肿瘤定位的抗体的反应导致肿瘤中显著的放射活性，其中肿瘤与肌肉比率为13:1(同前)。结果证实TCO和四嗪-标记的分子的体内化学反应。
[0159] 使用标记部分的生物合并的抗体标记技术进一步公开在美国专利号6,953,675中(其实施例部分通过引用方式并入本文)。制备在糖基化位点上具有反应性酮基的这些“美化(landscaped)”抗体。方法包括表达经表达载体转染的细胞，该表达载体在包含糖或糖前体的酮衍生物的培养基中编码在CH1或Vκ结构域中具有一个或多个N-糖基化位点的抗体。酮衍生的糖或前体包括N-乙酰丙酰基甘露糖胺和N-乙酰丙酰基岩藻糖。随后使美化的抗体与包含酮反应部分的试剂,诸如酰肼、肼、羟氨基或氨基硫脲反应以形成标记的靶向分子。连接美化的抗体的示例性试剂包括类似DTPA的螯合剂；大药物分子，例如阿霉素-葡聚糖；以及包含肽的酰基-酰肼。然而，美化技术并不限于产生包含酮部分的抗体，但也可替代用于在抗体或其他生物分子上引入点击化学反应基团，诸如硝酮、叠氮或环辛炔。
[0160] 点击化学反应的修饰适于体外或体内使用。通过化学缀合或通过生物合并可形成反应性靶向分子。可使用叠氮部分、经取代的环辛炔或炔基、或者硝酮部分活化靶向分子，诸如抗体或抗体片段。在靶向分子包含叠氮或硝酮基的情况下，相应的可靶向的构建体将包含经取代的环辛炔或炔基，反之亦然。如上所讨论，可通过在活细胞中代谢合并来制备这些活化分子。可选择地，这些部分与生物分子的化学缀 合方法是本领域熟知的，并且可利18 19
用任何这些已知方法。所公开的技术可与如下所述的 F或 F标记方法组合用于PET或NMR显像，或者可选择地可用于递送可与这些适当活化的可靶向的构建体和/或靶向分子缀合的任何治疗和/或诊断剂。
用任何这些已知方法。所公开的技术可与如下所述的 F或 F标记方法组合用于PET或NMR显像，或者可选择地可用于递送可与这些适当活化的可靶向的构建体和/或靶向分子缀合的任何治疗和/或诊断剂。
[0161] 亲和体
[0162] 亲和体是用作抗体模拟物和用于结合靶分子的小蛋白质。通过在α螺旋蛋白质支架上的组合工程化来开发亲和体(Nord等，1995,Protein Eng8:601-8；Nord等，1997,Nat Biotechnol15:772-77)。亲和体设计基于包含蛋白A的IgG结合结构域的三螺旋束结构(Nord等，1995;1997)。通过随机化在细菌蛋白A的Fc结合活性中涉及的十三种氨基酸可制备具有大量结合亲和力的亲和体(Nord等，1995;1997)。在随机化之后，将PCR扩增的文库克隆至噬菌粒载体内以用于通过突变蛋白的噬菌体展示进行筛选。
[0163] 已经证实，对HER2/neu特异的177Lu-标记的亲和体体内靶向表达HER2的异种移植物(Tolmachev等，2007,Cancer Res67:2773-82)。尽管由于低分子量的放射性标记化合物的累积所致的肾毒性开始是个问题，但与白蛋白的可逆结合降低肾累积，使得能够使用标记的亲和体进行基于放射性核素的治疗(同前)。
[0164] 最近证实使用用于体内肿瘤显像的放射性标记的亲和体的可行性(Tolmachev等，2011,Bioconjugate Chem22:894-902)。使马来酰亚胺-衍生的NOTA与抗-HER2亲和111
体缀合，并用 In进行放射性标记(同前)。向携带表达HER2的DU-145异种移植物的小鼠施用，随后通过γ照相机显像，使异种移植物可视化(同前)。
体缀合，并用 In进行放射性标记(同前)。向携带表达HER2的DU-145异种移植物的小鼠施用，随后通过γ照相机显像，使异种移植物可视化(同前)。
[0165] 熟练技术人员意识到，在所要求保护的方法和组合物的实践中可将亲和体用作18
靶向分子。如在以下实施例中所述可进行用金属缀合的 F的标记。亲和体由Affibody AB(Solna,Sweden)商购。
靶向分子。如在以下实施例中所述可进行用金属缀合的 F的标记。亲和体由Affibody AB(Solna,Sweden)商购。
[0166] 噬菌体展示肽
[0167] 在一些可选择的实施方案中，可通过本领域熟知的噬菌体展示方法制备结合肽。例如，通过针对合适靶抗原、细胞、组织或病原体的噬菌体展示淘选以及筛选具有高亲和力的噬菌体可鉴定结合多种疾病相关抗原中任何一种的肽。
[0168] 制备肽的不同群噬菌体展示的各种方法和技术是本领域熟知的。例如，其各自通过引用方式并入本文的美国专利号5,223,409；5,622,699和6,068,829公开了制备噬菌体文库的方法。噬菌体展示技术包括遗传操纵噬菌体，使得小肽可在它们的表面 上 表 达(Smith和 Scott,1985,Science228:1315-1317；Smith和 Scott,1993,Meth.Enzymol.21:228-257)。
[0169] 在噬菌体展示的肽文库的构建上以及在筛选方法的发展上过去几十年可见相当大的发展，其中文库用于分离肽配体。例如，肽文库的使用使得可能对在诸如参与炎症反应的抗体或者介导细胞粘附的整联蛋白的许多蛋白质内的相互作用位点和受体-配体结合基序进行表征。也使用该方法鉴定可用于引导肽模拟药物或显像剂的开发的新型肽配体(Arap等，1998a,Science279:377-380)。除了肽之外，也可将诸如单链抗体的较大蛋白质结构域展示在噬菌体颗粒的表面上(Arap等，1998a)。
[0170] 通过淘选可分离对于给定靶分子所选择的靶向氨基酸序列(Pasqualini和Ruoslahti,1996,Nature380:364-366；Pasqualini,1999,The Quart.J.Nucl.Med.43:159-162)。简而言之，向靶分子施用含有推定靶向肽的噬菌体的文库，并收集含有结合的噬菌体的样本。例如，可使靶分子连接在96-孔板中微量滴定孔的底部。可洗脱结合靶标的噬菌体并且通过使它们在宿主细菌中生长来扩增。
[0171] 在某些实施方案中，在多轮淘选之间可在宿主细菌中增殖噬菌体。不是通过噬菌体裂解，而是细菌分泌展示特定插入物的噬菌体的 多个拷贝。如果需要，可将扩增的噬菌体再次暴露于靶分子并且收集另外的多轮的淘选物。可进行多伦淘选直至获得选择性或特异性粘合剂的群。通过对对应于噬菌体基因组中的靶向肽插入物的DNA进行测序可测定肽的氨基酸序列。然后通过标准蛋白化学技术可将经鉴定的靶向肽制备为合成肽(Arap等，1998a,Smith等，1985)。
[0172] 适体
[0173] 在某些实施方案中，靶向分子可包含适体。构建和测定适体的结合特征的方法是本领域熟知的。例如，这些技术描述在美国专利号5,582,981；5,595,877和5,637,459中，其各自通过引用方式并入本文。
[0174] 适体可通过包括合成、重组和纯化方法的任何已知方法可制备，并可单独使用或与对相同靶标特异的其他配体组合使用。通常，最小约3个核苷酸、优选最少5个核苷酸对实现特异性结合是必需的。尽管可优选10、20、30或40个核苷酸的适体，但少于10个碱基的序列的适体也可行。
[0175] 适体需要含有赋予结合特异性的序列，但可使用侧翼区延伸以及另外衍生。在优选的实施方案中，适体的结合序列的侧翼可以是连接引物结合序列，这便于通过PCR或其他扩增技术来扩增适体。在进一步的实施方案中，侧翼序列可包含优选识别或结合增强适体对底物的固定作用的部分的特异序列。
[0176] 可将适体分离、测序和/或扩增或合成为常规DNA或RNA分子。可选择地，目标适体可包含经修饰的寡聚物。通常在适体上存在的任何羟基可被受标准保护基团保护的膦酸酯基、磷酸酯基替换，或者被活化以制备与其他核苷酸的另外的键，或者可与固体支撑物缀合。一个或多个磷酸二酯键可被可选择的连接基团替换，例如P(O)O被P(O)S、P(O)NR.sub.2、P(O)R、P(O)OR'、CO或CNR.sub.2替换，其中R是H或者烷基(1-20C)并且R'是烷基(1-20C)；此外，该基团可通过O或S连接邻近核苷酸。在寡聚体所有键不必是相同的。
[0177] 制备和筛选结合特定目标靶标的适体的方法是熟知的，例如美国专利号5,475,096和美国专利号5,270,163，其各自通过引用方式并入。技术通常包括从候选适体的混合物中选择以及结合、将结合的适体与未结合的适体分离和扩增的逐步重复。因为仅少量对应于最高亲和力适体的的序列(可能仅一个适体分子)存在于混合物中，所以通常需要设置分隔标准，从而在分离过程中将显著量的适体保留在混合物(约5-50%)中。各循环导致对靶标具有高亲和力的适体的富集。三至六次选择和扩增循环的重复可用于生成以高亲和力和特异性结合靶标的适体。
[0178] Avimer
[0179] 在某些实施方案中，靶向分子可包含一种或多种avimer序列。Avimer是在对各种靶分子的亲和力和特异性上一定程度类似于抗体的一类结合蛋白。其通过体外外显子改组和噬菌体展示来由人细胞外受体结构域开发(Silverman等，2005,Nat.Biotechnol.23:1493-94；Silverman等，2006,Nat.Biotechnol.24:220)。所得多结构域蛋白质可包含可表现出相比于单表位结合蛋白改善的亲和力(在一些情况下，低于纳摩尔)和特异性的多种非依赖性结合结构域(同前)。涉及avimer的构建和使用的方法的另外细节公开在例如美国专利申请公开号20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384中，其实施例部分各自通过引用方式并入本文。
[0180] 施用方法
[0181] 在各实施方案中，双特异性抗体和可靶向的构建体可用于显像正常或患病组织和器官(参见，例如美国专利号6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093；5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；5,128,119；
5,101,827；和4,735,210，其实施例部分各自通过引用方式并入本文)。
5,101,827；和4,735,210，其实施例部分各自通过引用方式并入本文)。
[0182] 通过在施用可靶向的构建体之前一段时间施用bsAb抗体可进行 双特异性抗体18
(bsAb)和 F-标记的可靶向的构建体的施用。试剂的剂量和时间可由熟练技术人员容易地设计，并且取决于待所采用的试剂的具体性质。如果首先给予bsAb-F(ab’)2衍生物，则在施用可靶向的构建体之前24-72小时(可选择地，48-96小时)的等待期合适。如果IgG-Fab’bsAb缀合物是主要靶向载体，则指定在施用可靶向的构建体之前范围3-10天的
18
较长等待期。在对于bsAb通过足够时间以靶向患病组织之后，施用 F-标记的可靶向的构建体。在施用可靶向的构建体之后，可进行显像。
(bsAb)和 F-标记的可靶向的构建体的施用。试剂的剂量和时间可由熟练技术人员容易地设计，并且取决于待所采用的试剂的具体性质。如果首先给予bsAb-F(ab’)2衍生物，则在施用可靶向的构建体之前24-72小时(可选择地，48-96小时)的等待期合适。如果IgG-Fab’bsAb缀合物是主要靶向载体，则指定在施用可靶向的构建体之前范围3-10天的
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较长等待期。在对于bsAb通过足够时间以靶向患病组织之后，施用 F-标记的可靶向的构建体。在施用可靶向的构建体之后，可进行显像。
[0183] 某些实施方案涉及多价靶结合蛋白的使用，其具有如在专利申请系列号60/220,782中所述的至少三个不同的靶结合位点。通过经化学接头交联多个Fab-样片段来制备多价靶结合蛋白。参见美国专利号5,262,524；5,091,542和Landsdorp等，Euro.J.Immunol.16:679-83(1986)。也通过共价连接多个单链Fv分子(scFv)来制备多价靶结合蛋白以形成单个多肽。参见美国专利号5,892,020。多价靶结合蛋白公开在美国专利号
6,025,165和5,837,242中，其基本上是scFv分子的聚集物。包含三个scFv分子的三价靶结合蛋白描述在Krott等，Protein Engineering10(4):423-433(1997)中。
6,025,165和5,837,242中，其基本上是scFv分子的聚集物。包含三个scFv分子的三价靶结合蛋白描述在Krott等，Protein Engineering10(4):423-433(1997)中。
[0184] 可选择地，以下更加详细描述的称为“对接和锁定”(DNL)的技术已经证实用于包括包含两种或多种不同抗体或抗体片段的复合物的多种多价复合物的简单和可重复构建。(参见，例如，美国专利号7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400，其实施例部分各自通过引用方式并入本文)。这些构建体也用于实施本文所述的所要求保护的方法和组合物。
[0185] 可使用清除剂，其在双特异性抗体(bsAb)和可靶向的构建体的给药之间给予。可使用新型机械作用的清除剂，即靶向bsAb的疾病靶向臂的糖基化的抗独特型Fab’片段。在一个例子中，给予抗-CEA(MN-14Ab)x抗-肽bsAb，并使在疾病靶中可生长至最大程度。为了由循环中清除残基bsAb，给予MN-14的抗独特型Ab，称为WI2， 优选作为糖基化的Fab’片段。清除剂以单价方式结合bsAb，同时它所附糖基残基将整个复合物导向至肝脏，在那里18
发生快速代谢。然后向受试者给予 F-标记的可靶向的构建体。bsAb的MN-14臂的WI2Ab具有高亲和力，并且因为它不包括交联，且WI2-Fab’是单价部分，所以清除机制不同于所公开的机制(参见Goodwin等，同前)，然而，已知清除剂的可选择方法和组合物，并且可使用任何已知清除剂。
发生快速代谢。然后向受试者给予 F-标记的可靶向的构建体。bsAb的MN-14臂的WI2Ab具有高亲和力，并且因为它不包括交联，且WI2-Fab’是单价部分，所以清除机制不同于所公开的机制(参见Goodwin等，同前)，然而，已知清除剂的可选择方法和组合物，并且可使用任何已知清除剂。
[0186] 配制和施用
[0187] 可配制18F-标记的分子以获得包含一种或多种药学上合适的赋形剂、一种或多种另外的成分或者这些的一些组合的组合物。通过已知方法可完成这些以制备药学上可使用18
的剂量，从而将活性成分(即， F-标记的分子)合并在具有一种或多种药学上合适的赋形剂的混合物中。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个例子。其他合适的赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea和Febiger1990)；以及Gennaro(编辑),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company1990)，及其修订版。 [0188] 本文所述的施用组合物的优选途径为胃肠外注射。注射可以为静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘内、皮下或腔内(即，胃肠外)。在胃肠外施用中，以单位剂量可注射形式，例如溶液、混悬液或乳剂，联合药学上可接受的赋形剂配制组合物。此类赋形剂是内在无毒的且非治疗性的。这些赋形剂的例子是盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank溶液。也可使用诸如固定油和油酸乙酯的非水性赋形剂。优选的赋形剂是在盐水中5%葡萄糖。赋形剂可含有少量的添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质，包括缓冲液和防腐剂。也涵盖其他施用方法，包括口服施用。
的剂量，从而将活性成分(即， F-标记的分子)合并在具有一种或多种药学上合适的赋形剂的混合物中。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个例子。其他合适的赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea和Febiger1990)；以及Gennaro(编辑),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company1990)，及其修订版。 [0188] 本文所述的施用组合物的优选途径为胃肠外注射。注射可以为静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘内、皮下或腔内(即，胃肠外)。在胃肠外施用中，以单位剂量可注射形式，例如溶液、混悬液或乳剂，联合药学上可接受的赋形剂配制组合物。此类赋形剂是内在无毒的且非治疗性的。这些赋形剂的例子是盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank溶液。也可使用诸如固定油和油酸乙酯的非水性赋形剂。优选的赋形剂是在盐水中5%葡萄糖。赋形剂可含有少量的添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质，包括缓冲液和防腐剂。也涵盖其他施用方法，包括口服施用。
[0189] 包含18F-标记的分子的配制的组合物可用于通过例如弹丸注射或 连续输注的静脉内施用。注射用组合物可与添加的防腐剂以单位剂量形式存在，例如在安瓿中或者多剂量容器中。组合物也可采用诸如在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳剂的形式，以及可含有配制试剂，例如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地，在使用之前，组合物可以为使用诸如无菌无热原的水的合适媒介物配制的粉末形式。
[0190] 组合物可以溶液的形式施用。溶液的pH应当在pH5至9.5的范围内，优选pH6.5至7.5。其配制应当在具有诸如磷酸酯、TRIS(羟甲基)氨基甲烷-HCl或柠檬酸盐等的合适的药学上可接受的缓冲液的溶液中。在某些优选的实施方案中，缓冲液是邻苯二甲酸氢18
钾(KHP)，其可用作转移配体以便于 F-标记。缓冲液浓度应当在1至100mM的范围内。配制的溶液可含有浓度为50至150mM的盐，例如氯化钠或氯化钾。也可包括有效量稳定剂，诸如甘油、白蛋白、球蛋白、清洁剂、明胶、鱼精蛋白或者鱼精蛋白的盐。可通过皮下、静脉内、肌肉内或者通过其他胃肠外途径向哺乳动物施用组合物。而且，可通过连续输注或者通过单次或多次弹丸来施用。
钾(KHP)，其可用作转移配体以便于 F-标记。缓冲液浓度应当在1至100mM的范围内。配制的溶液可含有浓度为50至150mM的盐，例如氯化钠或氯化钾。也可包括有效量稳定剂，诸如甘油、白蛋白、球蛋白、清洁剂、明胶、鱼精蛋白或者鱼精蛋白的盐。可通过皮下、静脉内、肌肉内或者通过其他胃肠外途径向哺乳动物施用组合物。而且，可通过连续输注或者通过单次或多次弹丸来施用。
[0191] 在施用双特异性抗体的情况下，例如在预靶向技术中，取决于诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医疗状况和之前用药史的因素，向人施用的抗体的剂量将发生变化。通常，对于显像目的，理想的是提供范围为约1mg至200mg剂量的双特异性抗体的赋形剂作为单次静脉内输注，但视情况而定也可使用更高或更低剂量。通常，对于普通成人，理想的是提供范围为约10mg/平方米的体表面积剂量的赋形剂或者17至18mg的抗体，但视情况而定也可使用更高或更低剂量。可向人受试者施用的用于显像目的的双特异性抗体的剂量例子为1至200mg，更优选为1至70mg，最优选为1至20mg，但可使用更高或更低剂量。 [0192] 通常，取决于诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医疗状况以及之前用药史的因18 18
素，待施用的 F标记的剂量将发生变化。优选 地，向患者施用饱和剂量的 F-标记的分子。
18 18
对于 F-标记的分子的施用，以毫居里计量剂量。 F显像研究的常见范围为5至10mCi。 [0193] 肽的施用
素，待施用的 F标记的剂量将发生变化。优选 地，向患者施用饱和剂量的 F-标记的分子。
18 18
对于 F-标记的分子的施用，以毫居里计量剂量。 F显像研究的常见范围为5至10mCi。 [0193] 肽的施用
[0194] 所要求保护方法和/或组合物的各个实施方案可涉及待向受试者施用的一种或18
多种 F-标记的肽。可通过本领域已知的任何途径来进行施用，包括但不限于口服、鼻腔、面颊、吸入、直肠、阴道、局部、正位、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、动脉内、鞘内或静脉内注
18
射。例如，在预靶向方案中施用 F-标记的肽的情况下，优选静脉内施用肽。
多种 F-标记的肽。可通过本领域已知的任何途径来进行施用，包括但不限于口服、鼻腔、面颊、吸入、直肠、阴道、局部、正位、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、动脉内、鞘内或静脉内注
18
射。例如，在预靶向方案中施用 F-标记的肽的情况下，优选静脉内施用肽。
[0195] 在某些实施方案中，标准肽键连接可被一种或多种可选择连接基团，例如CH2-NH、CH2-S、CH2-CH2、CH=CH、CO-CH2、CHOH-CH2等替换。制备肽模拟物的方法是熟知的(例如，Hruby,1982,Life Sci31:189-99；Holladay 等，1983,Tetrahedron Lett.24:4401-04；Jennings-White 等，1982,Tetrahedron Lett.23:2533；Almquiest 等，1980,J.Med.Chem.23:1392-98；Hudson 等，1979,Int.J.Pept.Res.14:177-185；Spatola 等，1986,Life Sci38:1243-49；美国专利号5,169,862；5,539,085；5,576,423；5,051,448；5,559,103)。
肽模拟物可表现出与它们肽类似物相比增加的稳定性和/或体内吸收。
肽模拟物可表现出与它们肽类似物相比增加的稳定性和/或体内吸收。
[0196] 通过特别是在已知内肽酶发挥作用的位置处将D-氨基酸取代为天然存在的L-氨基酸也可使肽稳定化。内肽酶结合和裂解序列是本领域已知的，并且已经描述了用于制备和使用并入D-氨基酸的肽的方法(例如，美国专利申请公开号20050025709，McBride等，2004年6月14日提交，其实施例部分通过引用方式并入本文)。
[0197] 使用标记的分子显像
[0198] 使用标记的分子显像的方法是本领域熟知的，并且任何这些已知方法可与本文18
所公开的 F-标记的分子一起使用。参见，例如，美国 专利号6,241,964；6,358,489；
6,953,567和所公开的美国专利申请公开号20050003403；20040018557；20060140936，其实施例部分通过引用方式各自并入本文。而且，参见Page等，Nuclear Medicine And Biology,21:911-919,1994；Choi等，Cancer Research55:5323-5329,1995；Zalutsky等，J.Nuclear Med.,33:575-582,1992；Woessner等Magn.Reson.Med.2005,53:790-99。 [0199] 在某些实施方案中，18F-标记的分子可用于显像正常或患病组织和器官，例如使用在美国专利号6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093；
5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；5,128,119；5,101,827；和
4,735,210中所述的方法，所述专利各自通过引用方式并入本文。通过合适靶向分子的直
18
接 F标记或者通过预靶向的显像方法可进行这种显像，如在Goldenberg等，(2007,Update Cancer Ther.2:19-31)；Sharkey 等，(2008,Radiology246:497-507)；Goldenberg 等，(2008,J.Nucl.Med.49:158-63)；Sharkey 等，(2007,Clin.Cancer Res.13:5777-5585)；
McBride 等，(2006,J.Nucl.Med.47:1678-88)；Goldenberg 等，(2006,J.Clin.
Oncol.24:823-85)中所 述，也 参见 美国专 利公 开号20050002945；20040018557；
20030148409和20050014207，其各自通过引用方式并入本文。
所公开的 F-标记的分子一起使用。参见，例如，美国 专利号6,241,964；6,358,489；
6,953,567和所公开的美国专利申请公开号20050003403；20040018557；20060140936，其实施例部分通过引用方式各自并入本文。而且，参见Page等，Nuclear Medicine And Biology,21:911-919,1994；Choi等，Cancer Research55:5323-5329,1995；Zalutsky等，J.Nuclear Med.,33:575-582,1992；Woessner等Magn.Reson.Med.2005,53:790-99。 [0199] 在某些实施方案中，18F-标记的分子可用于显像正常或患病组织和器官，例如使用在美国专利号6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093；
5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；5,128,119；5,101,827；和
4,735,210中所述的方法，所述专利各自通过引用方式并入本文。通过合适靶向分子的直
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接 F标记或者通过预靶向的显像方法可进行这种显像，如在Goldenberg等，(2007,Update Cancer Ther.2:19-31)；Sharkey 等，(2008,Radiology246:497-507)；Goldenberg 等，(2008,J.Nucl.Med.49:158-63)；Sharkey 等，(2007,Clin.Cancer Res.13:5777-5585)；
McBride 等，(2006,J.Nucl.Med.47:1678-88)；Goldenberg 等，(2006,J.Clin.
Oncol.24:823-85)中所 述，也 参见 美国专 利公 开号20050002945；20040018557；
20030148409和20050014207，其各自通过引用方式并入本文。
[0200] 使用标记的肽或MAb的诊断性显像的方法是熟知的。例如，在免疫闪烁法的技术中，使用发射γ放射性同位素标记配体或抗体，并引入患者内。γ照相机用于检测发射γ放射性同位素的位置和分布。参见，例如，Srivastava(编辑),RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY(Plenum Press1988),Chase,"Medical Applications of Radioisotopes,"在REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES中，第18版；Gennaro等，(编辑),624-652页(Mack Publishing Co.,1990)；以及Brown,"Clinical Use of Monoclonal Antibodies,"在BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY中227-49；Pezzuto等，(编辑)(Chapman&Hall1993)。也优选例如与511 keV的能量一起使用发射正电子的放18 68 64 124
射性核素(PET同位素)，例如 F、 Ga、Cu和 I。可通过熟知的PET扫描技术显像这些放射性核素。
射性核素(PET同位素)，例如 F、 Ga、Cu和 I。可通过熟知的PET扫描技术显像这些放射性核素。
[0201] 在优选的实施方案中，18F-标记的肽、蛋白质和/或抗体用于显像癌症。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或者淋巴系统恶性肿瘤。这些癌症的更加具体的例子示出如下并且包括：鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃癌，包括胃肠癌；胰腺癌；成胶质细胞瘤；子宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；肝细胞瘤；乳癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌；
肛门癌；阴茎癌；以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，细胞尚未转移至初始恶性肿瘤或肿瘤的位置以外受试者身体部位处的那些)以及继发性恶性细胞或肿瘤(例如，引起转移、恶性细胞或肿瘤细胞迁移至不同于初始肿瘤位置的继发位置的那些)。
肛门癌；阴茎癌；以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，细胞尚未转移至初始恶性肿瘤或肿瘤的位置以外受试者身体部位处的那些)以及继发性恶性细胞或肿瘤(例如，引起转移、恶性细胞或肿瘤细胞迁移至不同于初始肿瘤位置的继发位置的那些)。
[0202] 癌症或恶性肿瘤的其他例子包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成年(原发性)肝细胞癌、成年(原发性)肝癌、急性成年淋巴细胞性白血病、急性成年骨髓性白血病、成年霍奇金氏病(Adult Hodgkin's Disease)、成年霍奇金氏淋巴瘤、成年淋巴细胞性白血病、成年非霍奇金氏淋巴瘤、成年原发性肝癌、成年软组织肉瘤、AIDS相关的淋巴瘤、AIDS相关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳癌、肾盂和输尿管的癌症、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体 和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因氏肉瘤(Ewing's Sarcoma)和相关的肿瘤、外分泌物胰腺癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、高歇氏病(Gaucher's Disease)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性障碍、巨球蛋白血症、男性乳癌、恶性间皮细胞瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移不明原发灶鳞状颈部癌(Metastatic Occult Primary Squamous Neck Cancer)、转移原发性鳞状颈部癌症、转移性鳞状颈部癌症、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓性白血病、脊髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、孕期非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、不明原发灶转移鳞状颈部癌、口咽癌、骨-/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨骼的骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤、塞扎莱综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈部癌症、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、过渡性肾盂和输尿管癌、滋养层肿瘤；输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、沃尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms'Tumor)、以及任何其他增生过多疾病、位于以上列出的器官系统中的旁侧瘤。 [0203] 本文所述和所要求保护的方法和组合物可用于检测或诊断恶性或恶化前的病症。这些用途示出在已知或疑似进展为瘤或癌之前的病症中，特别是在由增生、组织转化组成的非赘生性细胞生长的情况下；或者更特别是出现发育异常的情况下(对于这些异常生长病症的概述，参见Robbins和Angell,Basic Pathology,第2版,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,68-79页(1976))。
[0204] 发育异常通常是癌症的预兆，并且主要在上皮细胞中发现。它是非赘生性细胞生长的最无序形式，包括在单个细胞均质性上以及细胞结构方向上缺失。发育异常特有地发生在存在慢性刺激或炎症的情况下。可检测出的发育异常疾病包括但不限于：无汗性外胚层发育异常(anhidrotic ectodermal dysplasia)、异侧发育异常(anterofacial dysplasia)、窒息性胸廓发育异常(asphyxiating thoracic dysplasia)、心房-手指发育不良(atriodigital dysplasia)、支气管肺发育异常(bronchopulmonary dysplasia)、大脑发育异常、宫颈发育异常、软骨外胚层发育异常(chondroectodermal dysplasia)、锁骨头颅发育异常、先天性外胚层发育异常、颅骨骨干发育异常(craniodiaphysial dysplasia)、颅腕跖骨发育异常(craniocarpotarsal dysplasia)、颅骨干骺端发育异常(craniometaphysial dysplasia)、牙质发育异常、骨干发育异常、外胚层发育异常、牙釉质发育异常、脑-眼发育异常、偏侧骨骺发育异常(dysplasia epiphysialis hemimelia)、多发性骨骺发育异常(dysplasia epiphysialis multiplex)、点状骨骺发育异常(dysplasia epiphysialis punctata)、上皮异常增生、脸指生殖器发育异常(faciodigitogenital dysplasia)、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱襞性发育不良(familial white folded dysplasia)、纤维肌性发育异常、骨骼的纤维发育异常、旺盛骨性发育异常(florid osseous dysplasia)、遗传性肾脏-视网膜发育异常、有汗性外胚层发育异常、少汗性外胚层发育异常、淋巴细胞减少性胸腺发育异常、乳房发育异常、下腭面骨发育异常、干骺 端发育异常、蒙迪尼发育异常(Mondini dysplasia)、单骨性纤维性发育异常(monostotic fibrous dysplasia)、黏膜上皮发育不良(mucoepithelial dysplasia)、多发性骨骺发育异常(multiple epiphysial dysplasia)、眼耳脊椎发育异常(oculoauriculovertebral dysplasia)、眼齿指发育异常(oculodentodigital dysplasia)、眼-脊椎发育异常(oculovertebral dysplasia)、牙源性发育异常、眼下颌支发育异常(opthalmomandibulomelic dysplasia)、根尖周牙骨质发育异常、多骨纤维发育异常、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育异常(pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia)、视网膜发育异常、中隔-眼发育异常、脊柱骨骺发育异常(spondyloepiphysial dysplasia)以及室径向发育异常(ventriculoradial dysplasia)。 [0205] 可被检测的另外的肿瘤前疾患包括但不限于：良性增殖不良疾患(例如，良性肿瘤、纤维囊性病症、组织肥大、肠息肉、结肠息肉以及食道发育异常)、粘膜白斑病、角化病(keratoses)、鲍文氏病(Bowen's disease)、慢性光化性皮炎(Farmer's Skin)、日光性唇炎以及日光性角化病。
[0206] 另外的增生过多疾病、疾患和/或病症包括但不限于：恶性肿瘤和相关疾患的进展和/或转移，例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))；真性红细胞增多症(polycythemia vera)；淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)；多发性骨髓瘤；瓦尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；重链病；以及实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头 状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆斯氏瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤(emangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
[0207] 在优选的实施方案中，使用所要求保护的组合物和方法可诊断、检测或显像的疾病包括心血管疾病，例如血纤蛋白凝块、动脉粥样硬化、心肌缺血和梗塞。已知血纤蛋白的抗体(例如，scFv(59D8)；T2G1s；MH1)，并在临床试验中作为显像剂以用于显示所述凝块和肺栓子，同时诸如MN-3、MN-15、抗-NCA95和抗-CD15抗体的抗-粒细胞抗体可靶向心肌梗塞和心肌缺血。(参见，例如，美国专利号5,487,892；5,632,968；6,294,173；7,541,440，其实施例部分通过引用方式各自并入本文)抗-巨噬细胞、抗-低密度脂蛋白(LDL)和抗-CD74(例如，hLL1)抗体可用于靶向动脉粥样硬化斑块。阿昔单抗(抗-糖蛋白IIb/IIIa)已经被批准用于辅助预防经皮冠状动脉介入治疗的再狭窄和不稳定心绞痛的治疗(Waldmann等，2000,Hematol1:394-408)。已经报道抗-CD3抗体降低动脉粥样硬化的发展和进程(Steffens等，2006,Circulation114:1977-84)。已经报道使用阻断MIF抗体的治疗诱导建立的动脉粥样硬化病变的退化(Sanchez-Madrid和Sessa,2010,Cardiovasc Res86:171-73)。针对氧化的LDL的抗体诱导在小鼠模型中建立的动脉粥样硬化退化(Ginsberg,2007,J Am Coll Cardiol52:2319-21)。抗-ICAM-1抗体在大鼠中大脑动脉闭塞之后显示减少缺血性细胞损伤(Zhang等，1994,Neurology44:1747-51)。白细胞抗原的市售单克隆抗体表示为：结合正常T-淋巴细胞的OKT抗-T细胞单克隆抗体(获自Ortho Pharmaceutical Company)；具有ATCC登录号HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的由杂交瘤产生的单克隆抗体；G7Ell、W8E7、NKP15和GO22(Becton Dickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；以及FMCll(Sera Labs)。针对血纤蛋白和血小板抗原的抗体的描述涵盖在 Knight,Semin.Nucl.Med.,20:52-67(1990)中。
[0208] 在一个实施方案中，药物组合物可用于诊断患有以下疾病的受试者：代谢疾病，例如淀粉样变性；或神经变性疾病，例如阿耳茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、亨延顿氏舞蹈病(Huntington's disease)、橄榄体脑桥小脑萎缩、多系统萎缩症、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性(corticodentatonigral degeneration)、进行性家族性肌阵挛性癫痫(progressive familial myoclonic epilepsy)、纹状体黑质变性(strionigral degeneration)、扭转性肌张力不全(torsion dysonia)、家族性震颤、日勒德拉图雷特综合征(Gilles de la Tourette syndrome)或者哈-斯二氏病(Hallervorden-Spatz disease)。用于阿耳茨海默氏病治疗的巴皮纽阻单抗处于临床试验中。用于阿耳茨海默氏病所提出的其他抗体包括Alz50(Ksiezak-Reding等，1987,J Biol Chem263:7943-47)、罗氏单抗和苏兰珠单抗。已经报道英夫利昔单抗(抗-TNF-α抗体)减少淀粉样斑块和改善认知力。已经提出通过保存于International Depositary Authority of Canada(登记号ADI-290806-01、ADI-290806-02、ADI-290806-03)产生的针对突变SOD1的抗体用于治疗ALS、帕金森氏病和阿耳茨海默氏病(参见美国专利申请公开号20090068194)。已经提出抗-CD3抗体用于治疗1型糖尿病(Cernea等，2010,Diabetes Metab Rev26:602-05)。此外，本发明的药物组合物可用在患有免疫调节异常疾患的受试者上，例如移植物抗宿主疾病或器官移植排斥。
[0209] 可被检测、诊断和/或显像的以上列出的示例性病症并非是限制性的。熟练技术人员意识到，已知抗体、抗体片段或靶向肽用于多种病症，例如自身免疫性疾病、心血管疾病、神经变性疾病、代谢病、癌症、传染病和增生过多疾病。可如本文所述显像、诊断和/或18
检测任何这些病症，用于其的 F-标记的分子，例如蛋白质或肽，可通过本文所述的方法来制备和利用。
检测任何这些病症，用于其的 F-标记的分子，例如蛋白质或肽，可通过本文所述的方法来制备和利用。
[0210] 试剂盒
[0211] 各个实施方案可涉及包含适合于使用标记的化合物显像、诊断和/或检测患者中的患病组织的组分的试剂盒。示例性的试剂盒可含有抗体、片段或融合蛋白，例如在本文所述的预靶向方法中使用的双特异性抗体。其他组分可包括与这些双特异性抗体一起使用的可靶向的构建体。在优选的实施方案中，将可靶向的构建体与螯合基团预先缀合，该螯合基18 18
团可用将Al F复合物或者 F的复合物与不同的金属连接。然而，在可选择的实施方案中，
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预期可靶向的构建体可连接一种或多种不同诊断剂，例如 Ga。
团可用将Al F复合物或者 F的复合物与不同的金属连接。然而，在可选择的实施方案中，
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预期可靶向的构建体可连接一种或多种不同诊断剂，例如 Ga。
[0212] 可包括能够递送试剂盒组分的装置。用于例如胃肠道外递送应用的一种装置是注射器，其用于将组合物注射至受试者体内。吸入装置也可用于在某些应用中。
[0213] 可将试剂盒组分包装在一起或者分装至两个或多个容器内。在一些实施方案中，容器可以为含有适于复水的组合物的无菌、冻干配制物的小瓶。试剂盒也可含有适于复水和/或稀释其他试剂的一种或多种缓冲液。可使用的其他容器包括但不限于小袋、托盘、盒、管等。试剂盒组件可无菌地包装和保存在容器内。可包括的另外的组件是对于使用试剂盒人员的使用说明书。实施例
[0214] 实施例1.肽IMP272的18F-标记
[0215] 制备和18F-标记的第一种肽是IMP272：
[0216] DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:3)
[0217] 醋酸盐缓冲溶液-乙酸，将1.509g稀释在约160mL水中并通过加入1M NaOH来调节pH，然后稀释至250mL以制备pH4.03的0.1M溶液。
[0218] 醋酸铝缓冲溶液-通过在42.6mL DI水中溶解0.1028g的AlCl3 六水合物来制备铝溶液。将4mL等份的铝溶液与16mL的0.1MNaOAc溶液在pH4下混合以得到2mM Al储备溶液。
[0219] IMP272醋酸盐缓冲溶液-将肽，0.0011g,7.28x10-7mol IMP272溶解在364μL的0.1M pH4醋酸盐缓冲溶液中以得到肽的2mM储备溶液。
[0220] IMP272的18F-标记-将3μL等份的铝储备溶液放置在REACTI-VIALTM中，并与18
50μL F(按来样计算)和3μL的IMP272溶液混合。在110℃下将溶液在加热器(heating
18
block)中加热15分钟，并通过反相HPLC来分析。HPLC迹线(未显示)显示93%游离 F和7%结合肽。将另外10μL的IMP272溶液加入反应，并再次加热和通过反相HPLC来分析
18
(未显示)。HPLC迹线显示8% F处于空隙体积以及92%连接至肽的活性。将肽的剩余部分与150μL PBS在室温下孵育约1小时，然后通过反相HPLC来检查。HPLC(未显示)显示
18 18
58% F未结合以及42%仍然连接肽。数据表明，当当与磷酸酯混合时，Al F(DTPA)复合物可能不稳定。
50μL F(按来样计算)和3μL的IMP272溶液混合。在110℃下将溶液在加热器(heating
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(未显示)。HPLC迹线显示8% F处于空隙体积以及92%连接至肽的活性。将肽的剩余部分与150μL PBS在室温下孵育约1小时，然后通过反相HPLC来检查。HPLC(未显示)显示
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58% F未结合以及42%仍然连接肽。数据表明，当当与磷酸酯混合时，Al F(DTPA)复合物可能不稳定。
[0221] 实施例2.用其他金属的IMP27218F-标记
[0222] 将约3μL等份的金属储备溶液(6x10-9mol)放置在聚丙烯圆锥形小瓶中并与18
75μL F(按来样计算)混合，在室温下孵育约2分钟，然后与在0.1M NaOAc pH4缓冲液-8
中的20μL的2mM(4x10 mol)IMP272溶液混合。在100℃下将溶液在加热器中加热15分钟，并通过反相HPLC来分析。用铟(24%)、镓(36%)、锆(15%)、镥(37%)和钇(2%)来标记
18
IMP272(未显示)。这些结果证实，F金属标记技术并不限于铝配体，但也可利用其他金属。
18
使用不同金属配体，可利用不同的螯合部分以优化 F-金属缀合物的结合。
75μL F(按来样计算)混合，在室温下孵育约2分钟，然后与在0.1M NaOAc pH4缓冲液-8
中的20μL的2mM(4x10 mol)IMP272溶液混合。在100℃下将溶液在加热器中加热15分钟，并通过反相HPLC来分析。用铟(24%)、镓(36%)、锆(15%)、镥(37%)和钇(2%)来标记
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IMP272(未显示)。这些结果证实，F金属标记技术并不限于铝配体，但也可利用其他金属。
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使用不同金属配体，可利用不同的螯合部分以优化 F-金属缀合物的结合。
[0223] 实施例3.血清稳定的18F-标记的肽IMP449的制备和使用
[0224] NOTA-苄基
[0225] -ITC-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:4)
[0226] 通过以以下所示顺序将以下氨基酸添加至树脂来在Sieber Amide树脂上制备肽，IMP448D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:5)：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH；Trt-HSG-OH，Aloc被裂解，Fmoc-D-Tyr(But)-OH；Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH；Trt-HSG-OH,Aloc被裂解；Fmoc-D-Ala-OH，以及最后Fmoc裂解，从而制备所需肽。然后将肽由树脂裂解以及通过HPLC纯化以制备IMP448，然后将其与ITC-苄基NOTA偶联。
[0227] 将IMP448(0.0757g,7.5x10-5mol)与0.0509g(9.09x10-5mol)ITC苄基NOTA混合，并溶解在1mL水中。然后将无水碳酸钾(0.2171g)缓慢加入搅拌的肽/NOTA溶液。在加入所有碳酸盐之后反应溶液的pH为10.6。将反应在室温下搅拌过夜。在14小时之后用1M HCl仔细猝灭反应，并通过HPLC纯化以得到48mg的IMP449。
[0228] IMP449的18F-标记
[0229] 将 IMP449(0.002g,1.37x10-6mol) 溶 解 在 686μL(2mM 肽 溶 液 )0.1M18
NaOAc(pH4.02)中。将三微升在pH4醋酸盐缓冲液中Al的2mM溶液与15μL、1.3mCi的 F混合。然后将溶液与20μL的2mMIMP449溶液混合，并且在105℃下加热15分钟。反相HPLC分析显示，35%(tR约10分钟)的活性连接至肽以及65%的活性洗脱在柱的空隙体积(3.1分钟，未显示)处，这表明大量活性未与肽缔合。将粗品标记的混合物(5μL)与混合人血清混合，并在37℃下孵育。在15分钟之后将等份移除，并通过HPLC来分析。HPLC显示9.8%的活性仍然连接至肽(由35%下降)。在1小时之后移除另一等份，并通过HPLC来分析。HPLC显示7.6%的活性仍然连接至肽(由35%下降)，其基本上与15分钟迹线(数据未显示)相同。
NaOAc(pH4.02)中。将三微升在pH4醋酸盐缓冲液中Al的2mM溶液与15μL、1.3mCi的 F混合。然后将溶液与20μL的2mMIMP449溶液混合，并且在105℃下加热15分钟。反相HPLC分析显示，35%(tR约10分钟)的活性连接至肽以及65%的活性洗脱在柱的空隙体积(3.1分钟，未显示)处，这表明大量活性未与肽缔合。将粗品标记的混合物(5μL)与混合人血清混合，并在37℃下孵育。在15分钟之后将等份移除，并通过HPLC来分析。HPLC显示9.8%的活性仍然连接至肽(由35%下降)。在1小时之后移除另一等份，并通过HPLC来分析。HPLC显示7.6%的活性仍然连接至肽(由35%下降)，其基本上与15分钟迹线(数据未显示)相同。
[0230] IMP449的高剂量18F-标记
[0231] 使用纯化的IMP449的进一步研究证实，18F-标记的肽在37℃下在人血清中高度稳定(91%，未显示)至少1小时，并且在37℃下在人血清中部分稳定(76%，未显示)至少4小时。进行另外的研究，其中在抗坏血酸作为稳定剂的情况下制备IMP449。在那些研究(未18
显示)中，F-金属-肽复合物显示在37℃下4小时之后在血清中无可检测的分解。发现
18 18
在注射 F-标记的肽之后30分钟小鼠尿液含有结合肽的 F(未显示)。这些结果证实，本
18 18
文所公开的 F-标记的肽在待用于 F显像研究的接近体内条件下表现出充足稳定性。 [0232] 因为IMP449肽含有对辐射分解敏感的硫脲键，所以通过RP-HPLC观察到多种产物。然而，当将抗坏血酸加入反应混合物时，生成的副产物显著减少。
显示)中，F-金属-肽复合物显示在37℃下4小时之后在血清中无可检测的分解。发现
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在注射 F-标记的肽之后30分钟小鼠尿液含有结合肽的 F(未显示)。这些结果证实，本
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文所公开的 F-标记的肽在待用于 F显像研究的接近体内条件下表现出充足稳定性。 [0232] 因为IMP449肽含有对辐射分解敏感的硫脲键，所以通过RP-HPLC观察到多种产物。然而，当将抗坏血酸加入反应混合物时，生成的副产物显著减少。
[0233] 实施例4.通过预靶向制备用于18F显像的DNL构建体
[0234] DNL技术可用于制备包含几乎任何抗体或其片段或者其他效应物部分的二聚体、三聚体、四聚体、六聚体等。对于某些优选的实施方案，可将IgG抗体、Fab片段或其他蛋白质或肽制备为含有DDD(二聚化和对接结构域)或者AD(锚定结构域)序列的融合蛋白。通过将第一抗体的Fab-DDD融合蛋白与第二抗体的Fab-AD融合蛋白结合可形成双特异性抗18
体。可选择地，可制备使IgG-AD融合蛋白与Fab-DDD融合蛋白结合的构建体。为了 F检测的目的，可将含有与待显像的靶组织(例如肿瘤)相关的抗原的结合位点的抗体或片段与结合可靶向的构建体上半抗原的第二抗体或片段结合，所述靶向的构建体诸如IMP449，
18
金属- F可与其连接。向受试者施用双特异性抗体(DNL构建体)，使得循环抗体由血液中
18
清除并定位至靶组织，并将 F-标记的可靶向的构建体加入并与定位的抗体结合以用于显像。
体。可选择地，可制备使IgG-AD融合蛋白与Fab-DDD融合蛋白结合的构建体。为了 F检测的目的，可将含有与待显像的靶组织(例如肿瘤)相关的抗原的结合位点的抗体或片段与结合可靶向的构建体上半抗原的第二抗体或片段结合，所述靶向的构建体诸如IMP449，
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金属- F可与其连接。向受试者施用双特异性抗体(DNL构建体)，使得循环抗体由血液中
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清除并定位至靶组织，并将 F-标记的可靶向的构建体加入并与定位的抗体结合以用于显像。
[0235] 可培养用于各Fab或IgG融合蛋白的非依赖性转基因细胞系。一旦制备，如果需要则可将模块纯化或者保持在细胞培养物上清液中。在制备之后，可将任何DDD2-融合蛋白模块与任何对应的AD-融合蛋 白模块结合以生成双特异性DNL构建体。对于不同类型的构建体，可利用不同的AD或DDD序列。以下DDD序列基于PKA RIIα的DDD部分，而AD序列则基于优化合成AKAP-IS序列的AD部分(Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003;100:4445)。 [0236] DDD1:SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO:6)
[0237] DDD2:CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO:7)
[0238] AD1:QIEYLAKQIvDNAIQQA(SEQIDNO:8)
[0239] AD2:CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQIDNO:9)
[0240] 质粒载体pdHL2已用于产生大量抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等，J Immunol Methods(1989),125:191-202；Losman 等，Cancer(Phila)(1997),80:2660-6。二-顺反子哺乳动物表达载体引导IgG的重和轻链的合成。对于许多不同的IgG-pdHL2构建体，载体序列大部分相同，唯一差别仅在于可变结构域(VH和VL)序列。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化为Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了生成Fab-DDD表达载体，用编码铰链的开始4个残基、14个残基的Gly-Ser接头和人RIIα(称为DDD1)的开始44个残基的序列替换铰链、重链的CH2和CH3结构域的编码序列。为了生成Fab-AD表达载体，用编码铰链的开始4个残基、15个残基的Gly-Ser接头和叫做AKAP-IS(称为AD1)的17个残基的合成AD的序列替换铰链、IgG的CH2和CH3结构域的序列，所述17个残基的合成AD使用生物信息学和肽阵列技术来生成，并且显示以具有非常高亲和力(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto,等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A(2003),100:4445-50。
[0241] 如下所述，设计两种穿梭载体以便于将IgG-pdHL2载体转化为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体。
[0242] CH1的制备
[0243] 通过使用pdHL2质粒载体作为模板的PCR来扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5’)端和SacII限制性核酸内切酶位点组成，所述SacII限制性核酸内切酶位点是CH1编码序列的5’。右侧引物由编码铰链的开始4个残基、随后为4个甘氨酸和1个丝氨酸的序列、以及包含Bam HI限制位点的最后两个密码子(GS)组成。将410bp PCR扩增引物克隆至pGemT PCR克隆载体(Promega,Inc.)，并在T7(5’)方向上筛选克隆的插入物。
[0244] 合成双链体寡核苷酸以编码其前面为11个残基的接头肽的DDD1的氨基酸序列，其中开始2个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附加至3’端。编码的多肽序列显示如下，其中DDD1序列标记下划线。GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO:10)
[0245] 合成在它们的3’端上重叠30个碱基对的称为RIIA1-44顶端和RIIA1-44底端的两个寡核苷酸(Sigma Genosys)，并将其合并以包含174bp DDD1序列的中心154个碱基对。将寡核苷酸退火并且用Taq聚合酶进行引物延伸反应。在引物延伸之后，通过PCR来扩增双链体。将扩增引物克隆至pGemT，并在T7(5’)方向筛选插入物。
[0246] 合成双链体寡核苷酸以编码其前面为11个残基的接头肽的AD1的氨基酸序列，其中开始2个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附加至3’端。编码的多肽序列显示如下，其中AD1的序列标记下划线。
[0247] GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO:11)
[0248] 合成称为AKAP-IS顶端和AKAP-IS底端的编码以上肽序列的两种互补重叠寡核苷酸，并退火。通过PCR来扩增双链体。将扩增引物克隆至pGemT载体，然后以T7(5’)方向筛选插入物。
[0249] 用CH1连接DDD1
[0250] 使用BamHI和NotI限制酶将编码DDD1序列的190bp片段由pGemT切除，然后连接至CH1-pGemT中的相同位点以生成穿梭载体CH1-DDD1-pGemT。
[0251] 用CH1连接AD1
[0252] 使用BamHI和NotI将含有AD1序列的110bp片段由pGemT切除，然后连接至CH1-pGemT中的相同位点以生成穿梭载体CH1-AD1-pGemT。
[0253] 将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆至基于pdHL2的载体
[0254] 使用该模块化设计，可将CH1-DDD1或CH1-AD1并入pdHL2载体中的任何IgG构建体。通过由pdHL2去除SacII/EagI限制片段(CH1-CH3)并用CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段来替换它，用以上构建体之一来替换全部重链恒定结构域，所述CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段由各自的pGemT穿梭载体切除。
[0255] h679-Fd-AD1-pdHL2的构建
[0256] h679-Fd-AD1-pdHL2是用于产生h679Fab的表达载体，其中AD1通过由14该氨基酸残基构成的柔性Gly/Ser肽间隔子偶联至Fd的CH1结构域的羧基末端。通过用CH1-AD1片段替换SacII/EagI片段，将含有h679的可变结构域的基于pdHL2的载体转化为h679-Fd-AD1-pdHL2，所述CH1-AD1片段用SacII和EagI由CH1-AD1-SV3穿梭载体切除。 [0257] C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建
[0258] C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生包含融合蛋白C-DDD1-Fab-hMN-14的两个拷贝的稳定二聚体的表达载体，其中DDD1在CH1的羧基末端处通过柔性肽间隔子连接至hMN-14Fab。通过用SacII和EagI限制性核酸内切酶消化将用于产生hMN-14IgG 的质粒载体hMN14(I)-pdHL2转化为C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2以去除CH1-CH3结构域和CH1-DDD1片段的插入，所述CH1-DDD1片段用SacII和EagI由CH1-DDD1-SV3穿梭载体切除。
[0259] 已利用相同技术来产生用于多种已知抗体诸如hLL1、hLL2、hPAM4、hR1、hRS7、hMN-14、hMN-15、hA19、hA20等的Fab表达的质粒。通常，抗体可变区编码序列存在于pdHL2表达载体中，并且将表达载体转化以用于产生如上所述的AD-或DDD-融合蛋白。可使包含任何这些抗体的Fab片段的AD-和DDD-融合蛋白以每一个AD-融合蛋白两个DDD-融合蛋白的合适比率合并，从而生成包含第一抗体的两个Fab片段和第二抗体的一个Fab片段的三聚DNL构建体。
[0260] C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
[0261] C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其具有通过14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附加至hMN-14的Fd的羧基末端的DDD2的二聚化和对接结构域序列。分泌的融合蛋白由hMN-14Fab的两个相同拷贝构成，这两个拷贝通过DDD2结构域的非共价相互作用保持在一起。
[0262] 通过合成制备两个重叠、互补的寡核苷酸，其包含部分接头肽和DDD2的残基1-13的编码序列。将寡核苷酸退火并用T4PNK来磷酸化，得到5'和3'端上的突出(overhang)，其与分别用限制性核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA相容用于连接。
[0263] 将双链体DNA与通过用BamHI和PstI消化制备的穿梭载体CH1-DDD1-pGemT连接，从而生成穿梭载体CH1-DDD2-pGemT。507bp片段用SacII和EagI由CH1-DDD2-pGemT切除，并与通过用SacII和EagI的消化制备的IgG表达载体hMN14(I)-pdHL2连接。最终表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已利用类似的技术生成大量不同人源化抗体的Fab片段的DDD2-融合蛋白。
[0264] H679-Fd-AD2-pdHL2
[0265] 设 计 称 为 B 的 h679-Fab-AD2 以 配 对 称 为 A 的 C-DDD2-Fab-hMN-14。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于产生h679-Fab-AD2的表达载体，其具有通过14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附加至CH1结构域的羧基末端的AD2的锚定结构域序列。AD2在AD1的锚定结构域序列之前具有一个半胱氨酸残基以及在AD1的锚定结构域序列之后具有另一个半胱氨酸残基。
[0266] 如下工程化表达载体。通过合成制备两种重叠、互补的寡核苷酸(AD2顶端和AD2底端)，其包含AD2和部分接头序列的编码序列。将寡核苷酸退火并用T4PNK来磷酸化，得到在5'和3'端上的突出，其与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA相容以用于连接。
[0267] 双链体DNA与连接至通过用BamHI和SpeI消化制备的穿梭载体CH1-AD1-pGemT，从而生成穿梭载体CH1-AD2-pGemT。含有CH1和AD2编码序列的429个碱基对片段用SacII和EagI限制酶由穿梭载体切除，并将其连接至通过用这些相同的酶消化制备的h679-pdHL2载体。最终表达载体是h679-Fd-AD2-pdHL2。
[0268] 实施例5.TF2DNL构建体的生成
[0269] 通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应来获得命名为TF2的三聚DNL构建体。如下生成产率>90%的试验批量的TF2。将蛋白L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4:1摩尔比混合。在含有1mM EDTA的PBS中的总蛋白质浓度是1.5mg/ml。随后步骤包括TCEP还原、HIC色谱法、DMSO氧化以及IMP291亲和色谱法。在加入TCEP之前，SE-HPLC未显示a2b形成的任何证据。加入5mM TCEP的快速导致形成与预期二元结构的157kDa蛋白一致的a2b复合物。通过IMP291亲和色谱法来纯化TF2至接近均质化(未显示)。IMP291是含有与679Fab结合的HSG 半抗原的合成肽(Rossi等，
2005,Clin Cancer Res11:7122-29)。IMP291未结合部分的SE-HPLC分析证实由产物中去除a4、a2和游离κ链(未显示)。
2005,Clin Cancer Res11:7122-29)。IMP291未结合部分的SE-HPLC分析证实由产物中去除a4、a2和游离κ链(未显示)。
[0270] 非还原性SDS-PAGE分析证实，大多数TF2作为具有接近IgG的相对流动性的大的、共价结构而存在(未显示)。另外的带表明，在试验条件下二硫化物形成不完全(未显示)。还原性SDS-PAGE显示，非还原性凝胶中任何另外明显的带均与产物相关(未显示)，因为仅表示TF2的构成多肽的带明显。MALDI-TOF质谱测分析法(未显示)揭示156,434Da的单峰，其是在TF2的计算质量(157,319Da)的99.5%内。
[0271] 通过BIACORE测定法来测定TF2的官能性。将TF2,C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样本)、或者C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未还原a2和b组分的对照样本)稀释至1μg/ml(总蛋白)并通过用HSG固定的传感芯片。TF2的应答是两个对照样本的约两倍，这表明在对照样本中仅h679-Fab-AD组分结合并保留在传感芯片上。随后注射WI2IgG(hMN-14的抗-独特型抗体)证实仅TF2具有如通过另外的信号应答所表明的与h679-Fab-AD紧密缔合的DDD-Fab-hMN-14组分。由WI2与固定在传感芯片上TF2的结合所致的应答单元的另外增加对应于两个完全功能性结合位点，其各自由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚单位构成。通过TF2与WI2的两个Fab片段结合的能力来证实这点(未显示)。
[0272] 实施例6.TF10DNL构建体的制备
[0273] 类似的方案用于生成三聚TF10DNL构建体，其包含C-DDD2-Fab-hPAM4的两个拷贝和C-AD2-Fab-679的一个拷贝。使用如上所述对于制备(抗CEA)2x抗HSG bsAb TF2所公开的方法来制备TF10双特异性([hPAM4]2x h679)抗体。TF10构建体具有两个人源化PAM4Fab以及一个人源化679Fab。
[0274] 两种融合蛋白(hPAM4-DDD2和h679-AD2)独立地在稳定转染的骨髓瘤细胞中表达。合并组织培养上清液，得到两倍摩尔过量的hPAM4-DDD2。在室温下在温和还原条件下使用1mM还原的谷胱甘肽将反应混合物孵育24小时。在还原之后，使用2mM氧化的谷胱甘肽通过温和氧化来完成DNL反应。通过使用IMP291-affigel树脂的亲和力色谱法来分离TF10，所述IMP291-affigel树脂以高特异性与h679Fab结合。
[0275] 实施例7.DNL的序列变体
[0276] 在某些优选的实施方案中，并入细胞因子-MAb DNL复合物的AD和DDD序列包含如上所讨论的AD1或AD2以及DDD1或DDD2的氨基酸序列。然而，在可选择的实施方案中，在DNL复合物的构建中可利用AD和/或DDD部分的序列变体。例如，仅存在人PKADDD序列的四个变体，其对应于PKA RIα、RIIα、Riβ和RIIβ的DDD部分。RIIα DDD序列是以上所公开的DDD1和DDD2的基础。以下示出四种人PKA DDD序列。DDD序列表示RIIα的残基1-44；RIIβ的残基1-44；RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(注意，DDD1的序列由人PKA RIIα DDD部分轻度修饰而来)。
[0277] PKARIα
[0278] SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQIDNO:12) [0279] PKARIβ
[0280] SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHEEKLEKEENRQILA(SEQIDNO:13) [0281] PKARIIα
[0282] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQIDNO:14)
[0283] PKARIIβ
[0284] SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQIDNO:15)
[0285] AD和DDD结构域的结构-功能关系曾作为研究主题。(参见，例如，Burns-Hamuro等，2005, Protein Sci 14:2982-92；Carr 等，2001, J Biol Chem 276:17332-38；Alto等，2003, Proc Natl Acad Sci USA100:4445-50；Hundsrucker等，2006, Biochem J 396:297-306；Stokka 等，2006, Biochem J 400:493-99；Gold 等，2006, Mol Cell
24:383-95； Kinderman等，2006,Mol Cell24:397-408，其全部内容各自通过引用方式并入本文)。
24:383-95； Kinderman等，2006,Mol Cell24:397-408，其全部内容各自通过引用方式并入本文)。
[0286] 例如，Kinderman等，(2006,Mol Cell24:397-408)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并推论人DDD序列含有对二聚体形成或AKAP结合均重要的大量保守的氨基酸残基，以下在SEQ ID NO:6中用下划线标记。(参见Kinderman等，2006的图1，其通过引用并入本文)。熟练技术人员意识到，在设计DDD序列的序列变体时，人们可合理地避免改变标记下划线的残基的任何一种，但可对对于二聚化和AKAP结合不那么关键的残基进行保守性氨基酸取代。SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO:6)
[0287] 如本领域所知，已对二十种常见L-氨基酸的保守性氨基酸取代进行了表征。因此，根据Kinderman(2006)的数据和保守性氨基酸取代，基于SEQ ID NO:6的可能的可选择DDD序列示出在表2中。在设计表2时，仅考虑高度保守氨基酸取代。例如，带电残基仅被相同电荷的残基取代；具有小侧链的残基被类似大小的残基取代；羟基侧链仅被其他羟基类取代等。因为脯氨酸对氨基酸二级结构的独特作用，所以没有其他残基取代脯氨酸。即使仅这些保守性取代，对于44个残基的肽仍存在超过两千万可能的可选择序列(2x3x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x4x2x2x2x2x2x4x2x4)。熟练技术人员意识到，可通过标准技术，例如使用市售肽合成仪或者熟知的位点定向的诱变技术，来构建在DDD部分的种类内几乎不受限制数量的可选择种类。例如在Alto等，(2003,Proc Natl Acad Sci USA100:4445-50)中所公开，也可通过标准结合测定容易地测定氨基酸取代对AD部分结合的作用。 [0288] 表2.在DDD1(SEQ ID NO:6)中的保守性氨基酸取代。如SEQ ID NO:16所公开的共有序列。
[0289]
[0290]
[0291] Alto等，(2003,Proc Natl Acad Sci USA100:4445-50)进行各种AKAP蛋白的AD序列的生物信息学分析以设计称为AKAP-IS(SEQID NO:8)的对DDD的结合常数为0.4nM的RII选择性AD序列。将AKAP-IS序列设计为结合PKA的AKAP的肽拮抗剂。以下在SEQ IDNO:8中对AKAP-IS序列(其中取代倾向于降低与DDD的结合)中的残基标记下划线。熟练技术人员意识到，在设计AD序列的序列变体时，人们可合理地避免改变标下划线的残基，但对对于DDD结合不那么关键的残基可进行保守性氨基酸取代。表3显示AKAP-IS(AD1,SEQID NO:8)的序列中可能的保守性氨基酸取代，这与在以上表2中所显示DDD1(SEQ ID NO:6)类似。
[0292] 即使有这些保守性取代，对于17个残基的AD1(SEQ ID NO:8)肽序列仍存在超过三万五千种可能的可选择的序列(2x3x2x4x3x2x2x2x2x2x2x4)。而且，根据Alto等(2003)的数据，通过熟练技术人员可制备、测试和使用在可能的AD部分序列的种类内非常大数量的种类。注意，Alto(2003)的图2显示可进行的甚至大量的可能的氨基酸取代，同时根据实际结合试验仍保持与DDD部分的结合活性。
[0293] AKAP-/S
[0294] QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO:8)
[0295] 表3.AD1(SEQ ID NO:8)中的保守性氨基酸取代。如SEQ ID NO:17 所公开的共有序列。
[0296]
[0297] Gold(2006,Mol Cell24:383-95)利用结晶学和肽筛选以开发SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO:18)，其表现出与RI同种型相比对PKA的RII同种型高五个数量级的选择性。标记下划线残基表明相对于AKAP-IS序列的氨基酸取代的位置，其增加与RIIα的DDD部分的结合。在该序列中，N-末端Q残基编号为残基号4并且C-末端A残基为残基号20。在其中进行取代以作用于对RIIα的亲和力的残基为残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等，
2006)。据预期，在某些可选择的实施方案中，SuperAKAP-IS序列可取代AKAP-IS AD部分序列以制备DNL构建体。其他可取代AKAP-IS AD序列的可选择序列示出在SEQ ID NO:19-21中。对相对于AKAP-IS序列的取代标记下划线。据预期，与在SEQ ID NO:9中所显示AD2序列一样，AD部分也可包括另外的N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
2006)。据预期，在某些可选择的实施方案中，SuperAKAP-IS序列可取代AKAP-IS AD部分序列以制备DNL构建体。其他可取代AKAP-IS AD序列的可选择序列示出在SEQ ID NO:19-21中。对相对于AKAP-IS序列的取代标记下划线。据预期，与在SEQ ID NO:9中所显示AD2序列一样，AD部分也可包括另外的N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
[0298] 超级AKAP-IS
[0299] QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQIDNO:18)
[0300] 可选择的AKAP序列
[0301] QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO:19)
[0302] QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO:20)
[0303] QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO:21)
[0304] Gold等的图2公开来自多种AKAP蛋白的另外的DDD-结合序列，可利用其任一种来设计DNL构建体。
[0305] Stokka等，(2006,Biochem J400:493-99)开发了在SEQ IDNO:22-24中所显示的结合PKA的AKAP的肽竞争剂。将肽拮抗剂设计为Ht31(SEQ ID NO:22)、RIAD(SEQ ID NO:23)和PV-38(SEQ IDNO:24)。Ht-31肽表现出对PKA的RII同种型较高的亲和力，但RIAD和PV-38显示对RI更高的亲和力。
[0306] Ht31
[0307] DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQIDNO:22)
[0308] RIAD
[0309] LEQYANQLADQIIKEATE(SEQIDNO:23)
[0310] PV-38
[0311] FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQIDNO:24)
[0312] Hundsrucker等，(2006,Biochem J396:297-306)开发了结合PKA的AKAP的其他肽竞争剂，其具有与PKA的RII形式的DDD低至0.4nM的结合常数。各种AKAP拮抗肽的序列提供在Hundsrucker等的表1中，其在以下表4中再现。AKAPIS表示合成的RII亚单位-结合肽。所有其他肽均来源于指定AKAP的RII-结合结构域。
[0313] 表4.AKAP肽序列
[0314]
[0315] 通过参照AKAP IS序列(SEQ ID NO:8)标记下划线来如下示出在不同AKAP蛋白的AD结构域之间高度保守的残基。除了C-末端丙氨酸残基之外，残基与如由Alto等，(2003)所观察到的相同。(参见Hundsrucker等，(2006)的图4，其通过引用方式并入本文)。对RII DDD序列具有特别高的亲和力的肽拮抗剂的序列是AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的那些序列。
[0316] AKAP-IS
[0317] QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO:8)
[0318] Carr等，(2001,J Biol Chem276:17332-38)检查了人和非人蛋白 质的不同AKAP-结合DDD序列之间序列同源性程度并且鉴定了在不同DDD部分中呈现出最高保守的DDD序列。以下通过参照SEQ IDNO:6的人PKA RIIαDDD序列标记下划线来示出这些。通过斜体进一步表示特别保守的残基。残基与Kinderman等，(2006)表明对与AKAP蛋白结合重要的那些残基重叠、但不相同。熟练的技术人员将意识到，在设计DDD的序列变体时，最优选避免改变最保守的残基(斜体表示)，也优选避免改变保守的残基(下划线表示)，但可能考虑既未标记下划线也未斜体表示的残基的保守性氨基酸取代。
[0319] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO:6)
[0320] 根据Carr等，(2001)的数据，对于DDD1(SEQ ID NO:6)序列的保守性氨基酸取代的修饰组示出在表5中。即使仅该取代序列的减少的组，仍有超过65,000种在未过度实验下由熟练技术人员可制备、测试和使用的可能的可选择的DDD部分序列。熟练技术人员可容易地获得如表2和表3以上所公开的这些可选择的DDD氨基酸序列。
[0321] 表5.DDD1(SEQ ID NO:6)中的保守性氨基酸取代。如SEQ ID NO:43所公开的共有序列。
[0322]
[0323]
[0324] 熟练技术人员意识到，使用本领域标准的技术以及仅常规实验，可利用在DDD或AD氨基酸序列中这些和其他氨基酸取代以制备在AD或DDD部分的种类内可选择的类型。 [0325] 实施例8.用18F-标记的肽体内显像以及与18F-FDG比较
[0326] 将使用双特异性抗体和标记的靶向肽的预靶向的体内显像技术用于成功检测相18 TM
对小尺寸的肿瘤。将 F在 ACCELL PlusQMA轻柱体(Light cartridge)上纯
18 - 3+ 18
化。将用0.4M KHCO3洗脱的 F 与3μL2mM Al 在pH4醋酸盐缓冲液中混合。然后将Al F溶液注入抗坏血酸IMP449标记小瓶内，并加热至105℃持续15分钟。将反应溶液冷却并与0.8mL DI水混合。将反应内容物装载在 1cc HLB柱上并且用
2x200μL1:1EtOH/H2O来洗脱。如上所述制备TF2。TF2二价结合癌胚抗原(CEA)并且一价结合合成半抗原，HSG(组胺-琥珀酰基-甘氨酸)。
对小尺寸的肿瘤。将 F在 ACCELL PlusQMA轻柱体(Light cartridge)上纯
18 - 3+ 18
化。将用0.4M KHCO3洗脱的 F 与3μL2mM Al 在pH4醋酸盐缓冲液中混合。然后将Al F溶液注入抗坏血酸IMP449标记小瓶内，并加热至105℃持续15分钟。将反应溶液冷却并与0.8mL DI水混合。将反应内容物装载在 1cc HLB柱上并且用
2x200μL1:1EtOH/H2O来洗脱。如上所述制备TF2。TF2二价结合癌胚抗原(CEA)并且一价结合合成半抗原，HSG(组胺-琥珀酰基-甘氨酸)。
[0327] 生物分布和microPET显像
[0328] 向 六 周 龄 NCr nu-m雌 性 裸 小 鼠 皮 下 移 植 人 克 隆 癌 细 胞 系，LS174T(ATCC,Manassas,VA)。当形成可观察到的肿瘤时，向预靶向的动物静脉内注射162μg(约1纳摩尔/0.1mL)TF2或者TF10(对照非靶向三-Fab bsMAb)，然后16-18小时
18
之后，将约0.1nmol的Al F(IMP449)(84μCi,3.11MBq/0.1mL)静脉内注射。使其他非靶预
18 18
向对照动物接受单独的 F(150μCi,5.5MBq)、单独的Al F复合物(150μCi,5.55MBq)、单
18 18
独的Al F(IMP449)肽(84μCi,3.11MBq)、或者 F-FDG(150μCi,5.55MBq)。在使用当天由
18 18 18
IBA Molecular(Somerset,NJ)获得 F和 F-FDG。使接受 F-FDG的动物禁食过夜，但供水不限。
18
之后，将约0.1nmol的Al F(IMP449)(84μCi,3.11MBq/0.1mL)静脉内注射。使其他非靶预
18 18
向对照动物接受单独的 F(150μCi,5.5MBq)、单独的Al F复合物(150μCi,5.55MBq)、单
18 18
独的Al F(IMP449)肽(84μCi,3.11MBq)、或者 F-FDG(150μCi,5.55MBq)。在使用当天由
18 18 18
IBA Molecular(Somerset,NJ)获得 F和 F-FDG。使接受 F-FDG的动物禁食过夜，但供水不限。
[0329] 在注射放射性示踪剂之后1.5小时，麻醉动物，心脏取血，并进行尸体解剖。称重18
组织以及与由各产物分别制备的标准稀释物一起计重。由于 F的短暂物理半衰期，将标准品插入在来自各动物的各组组织之间。在组织中的摄入量表示为每克计数除以总注射活性以得到每克注射的剂量百分比(%ID/g)。
组织以及与由各产物分别制备的标准稀释物一起计重。由于 F的短暂物理半衰期，将标准品插入在来自各动物的各组组织之间。在组织中的摄入量表示为每克计数除以总注射活性以得到每克注射的剂量百分比(%ID/g)。
[0330] 进行两种类型的显像研究。在一组中，3只携带有小LS174T皮 下肿瘤18 18
的裸小鼠接受预靶向的Al F(IMP449)、单独的Al F(IMP449)(未预靶向)(均为
18
135μCi(5MBq;0.1nmol))、或者 F-FDG(135μCi,5MBq)。在静脉内注射放射性示踪剂之后2小时，用O2/N2O和异氟烷(2%)的混合物麻醉动物，并在 动物PET扫描仪
(Siemens Preclinical Solutions,Knoxville,TN)上进行的扫描中保持温暖。
的裸小鼠接受预靶向的Al F(IMP449)、单独的Al F(IMP449)(未预靶向)(均为
18
135μCi(5MBq;0.1nmol))、或者 F-FDG(135μCi,5MBq)。在静脉内注射放射性示踪剂之后2小时，用O2/N2O和异氟烷(2%)的混合物麻醉动物，并在 动物PET扫描仪
(Siemens Preclinical Solutions,Knoxville,TN)上进行的扫描中保持温暖。
[0332] 在单独的动态显像研究中，用O2/N2O和异氟烷(2%)的混合物麻醉16小时之前给予TF2bsMAb的携带有LS174T的裸小鼠，使其仰卧在照相台上，然后静脉内注射18
219μCi(8.1MBq)Al F(IMP449)(0.16nmol)。在120分钟时间段内立即开始采集数据。使用OSEM3D/MAP重新构建扫描图。用于显示，展示在5、15、30、60、90和120分钟的时间范围的各截面图(冠状、矢状和横截面)。对于含有肿瘤的切片，在各间隔处，调节图像强度直至在肿瘤中首先出现像素饱和。图像强度随时间增加以在肿瘤内维持像素饱和。将在相同间隔下取样的没有肿瘤的冠状和矢状截面调节至与含有肿瘤的横切片相同强度。不调整背景活性。
219μCi(8.1MBq)Al F(IMP449)(0.16nmol)。在120分钟时间段内立即开始采集数据。使用OSEM3D/MAP重新构建扫描图。用于显示，展示在5、15、30、60、90和120分钟的时间范围的各截面图(冠状、矢状和横截面)。对于含有肿瘤的切片，在各间隔处，调节图像强度直至在肿瘤中首先出现像素饱和。图像强度随时间增加以在肿瘤内维持像素饱和。将在相同间隔下取样的没有肿瘤的冠状和矢状截面调节至与含有肿瘤的横切片相同强度。不调整背景活性。
[0333] 结果
[0334] 尽管单独的18F和[Al18F]复合物在所有组织中具有类似摄取，但当复合物与IMP449螯合时发现相当大的差异(表6)。发现最显著差异在于骨骼中摄取，其中在肩胛骨18
中非螯合的 F高60至接近100倍并且在脊柱中高约200倍。对该分布的预期是由于已知
18
F或者甚至金属-氟化物复合物在骨骼中增生(Franke等，1972,Radiobiol.Radiother.(Berlin)13:533)。也在肿瘤和肠道以及肌肉和血液中观察到较高的摄取。在除肾脏之外
18
的所有组织中，螯合的Al F(IMP449)具 有显著较低的摄取，这说明通过尿排泄由体内有效去除螯合物-复合物的能力。
中非螯合的 F高60至接近100倍并且在脊柱中高约200倍。对该分布的预期是由于已知
18
F或者甚至金属-氟化物复合物在骨骼中增生(Franke等，1972,Radiobiol.Radiother.(Berlin)13:533)。也在肿瘤和肠道以及肌肉和血液中观察到较高的摄取。在除肾脏之外
18
的所有组织中，螯合的Al F(IMP449)具 有显著较低的摄取，这说明通过尿排泄由体内有效去除螯合物-复合物的能力。
[0335] 使用TF2抗-CEA bsMAb预靶向Al18F(IMP449)将摄取物转移至肿瘤，由每克注射剂量0.20±0.05增加至1.5小时时的6.01±1.72%，但在正常组织中摄取类似于单独18
的Al F(IMP449)。对于血液、肝脏、肺和肾脏，肿瘤/非肿瘤比率分别为146±63、59±24、
18 18
38±15和2.0±1.0，在此时其他肿瘤/组织比率>100:1。尽管单独的 F和单独的[Al F]
18
在肿瘤中具有比螯合的Al F(IMP449)更高的摄取，所得肿瘤/血液比率分别为6.7±2.7和11.0±4.6比5.1±1.5，但用预靶向显著增加了肿瘤摄取和肿瘤/血液比率(所有P值<0.001)。
的Al F(IMP449)。对于血液、肝脏、肺和肾脏，肿瘤/非肿瘤比率分别为146±63、59±24、
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38±15和2.0±1.0，在此时其他肿瘤/组织比率>100:1。尽管单独的 F和单独的[Al F]
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在肿瘤中具有比螯合的Al F(IMP449)更高的摄取，所得肿瘤/血液比率分别为6.7±2.7和11.0±4.6比5.1±1.5，但用预靶向显著增加了肿瘤摄取和肿瘤/血液比率(所有P值<0.001)。
[0336] 也将生物分布与最常用肿瘤显像剂[18F]FDG比较，该显像剂靶向具有高葡萄糖消耗和代谢活性的组织(表6)。除了肾脏之外，在所有正常组织中它的摄取明显比18 18 18
Al F(IMP449)要高。预靶向的Al F(IMP449)和 F-FDG的肿瘤摄取类似，但由于在大部分
18 18
正常组织中[ F]FDG的较高增生，用 F-FDG的肿瘤/非肿瘤比率比预靶向动物中那些显著较低(所有P值<0.001)。
Al F(IMP449)要高。预靶向的Al F(IMP449)和 F-FDG的肿瘤摄取类似，但由于在大部分
18 18
正常组织中[ F]FDG的较高增生，用 F-FDG的肿瘤/非肿瘤比率比预靶向动物中那些显著较低(所有P值<0.001)。
[0337] 表6.在携带有LS174T人结肠异种移植物的裸小鼠中TF2-预靶向的18 18 18
Al F(IMP449)和其他对照 F-标记的试剂的生物分布。对于预靶向，在注射Al F(IMP449)之前16小时对动物给予TF2。静脉内进行所有注射。
Al F(IMP449)和其他对照 F-标记的试剂的生物分布。对于预靶向，在注射Al F(IMP449)之前16小时对动物给予TF2。静脉内进行所有注射。
[0338] 注射后1.5小时时每克注射剂量百分比(均值土SD)
[0339]
[0340]
[0341] 显像多种动物以进一步分析单独的Al18F(IMP449)或者使用TF2预靶向的18 18
Al F(IMP449)、以及[ F]FDG的生物分布。在注射放射性物质之后2.0小时时取得的静态图像证实之前组织分布数据，其显示几乎所有摄取物均仅在肾脏中(图1)。在预靶向的
18
动物中容易可见21-mg肿瘤，但定位仅给予Al F(IMP449)的动物的肿瘤失败，其仅有肾摄
18
取。未观察到骨骼增生的证据，这表明Al F与IMP449牢固结合。这在另一预靶向的动物中得到证实，对这些动物进行动态显像 研究，所述研究监控在120分钟内每5-分钟间隔中
18
Al F(IMP449)的分布(图2)。冠状和矢状切片主要显示在开始5分钟内心脏、肾脏和一些肝脏摄取，但在下一10分钟内心脏和肝脏活性大幅降低，而肾脏在整个研究中持续显著。
在全部120分钟扫描中没有在肠道或骨骼中活性的证据。在15分钟时首先观察到35-mg LS174T肿瘤的摄取，并且到30分钟时，信号从背景中明显突出，在整个120分钟扫描中肿瘤活性显著。
Al F(IMP449)、以及[ F]FDG的生物分布。在注射放射性物质之后2.0小时时取得的静态图像证实之前组织分布数据，其显示几乎所有摄取物均仅在肾脏中(图1)。在预靶向的
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动物中容易可见21-mg肿瘤，但定位仅给予Al F(IMP449)的动物的肿瘤失败，其仅有肾摄
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取。未观察到骨骼增生的证据，这表明Al F与IMP449牢固结合。这在另一预靶向的动物中得到证实，对这些动物进行动态显像 研究，所述研究监控在120分钟内每5-分钟间隔中
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Al F(IMP449)的分布(图2)。冠状和矢状切片主要显示在开始5分钟内心脏、肾脏和一些肝脏摄取，但在下一10分钟内心脏和肝脏活性大幅降低，而肾脏在整个研究中持续显著。
在全部120分钟扫描中没有在肠道或骨骼中活性的证据。在15分钟时首先观察到35-mg LS174T肿瘤的摄取，并且到30分钟时，信号从背景中明显突出，在整个120分钟扫描中肿瘤活性显著。
[0342] 相比之下，给予18F-FDG的动物的静态图像显示在之前观察的骨骼、心肌和脑中预期的放射活性图谱(McBride等，2006,J.Nucl.Med.47:1678；Sharkey等，2008,Radiology246:497)，在体内具有相当高的背景活性(图1)。在静态显像研究的结束
18
时尸体解剖的3只动物中测定的组织摄取证实在所有组织中远远更高的组织 F放射活性
18
(未显示)。尽管在该动物中 F-FDG的肿瘤摄取比预靶向的高，但预靶向的肿瘤/血液比例更有利；并且在体内具有远远更低残留活性，通过预靶向增强肿瘤可视性。
18
时尸体解剖的3只动物中测定的组织摄取证实在所有组织中远远更高的组织 F放射活性
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(未显示)。尽管在该动物中 F-FDG的肿瘤摄取比预靶向的高，但预靶向的肿瘤/血液比例更有利；并且在体内具有远远更低残留活性，通过预靶向增强肿瘤可视性。
[0343] 这些研究证实，通过简单地形成可由合适的螯合物随后结合并且并入半抗原-肽18
内的氟化铝复合物，可用 F快速地标记在预靶向显像中使用的半抗原-肽(60分钟总制备
18
时间)。这可通过简单地将[Al F]-螯合物偶联至可连接至螯合部分以及随后纯化的任何分子更常规制备。
内的氟化铝复合物，可用 F快速地标记在预靶向显像中使用的半抗原-肽(60分钟总制备
18
时间)。这可通过简单地将[Al F]-螯合物偶联至可连接至螯合部分以及随后纯化的任何分子更常规制备。
[0344] 该报告描述通过铝缀合物将18F结合至各种化合物的直接、简便和快速的方法。当18 18
由基于NOTA的螯合物结合时，[Al F]肽体外和体内稳定。产率在常规 F标记程序测定的
18
范围之内。这些结果进一步证实使用与大量靶向分子螯合的金属 F来进行PET显像的可
18
行性。实施例9.用Al- F制备和标记IMP460
由基于NOTA的螯合物结合时，[Al F]肽体外和体内稳定。产率在常规 F标记程序测定的
18
范围之内。这些结果进一步证实使用与大量靶向分子螯合的金属 F来进行PET显像的可
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行性。实施例9.用Al- F制备和标记IMP460
[0345] 化 学 合 成 IMP460NODA-Ga-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:44)。NODA-Ga配体购自 并且类似其他氨基酸附着在肽合成仪上。在具有以下顺序添加的氨基酸和其他试剂的Sieber酰胺树脂上
合 成 肽：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、 去 除 Aloc、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、去除Aloc、Fmoc-D-Ala-OH以及NODA-GA(tBu)3。然后将肽裂解并通过HPLC纯化以得到产物。
合 成 肽：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、 去 除 Aloc、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、去除Aloc、Fmoc-D-Ala-OH以及NODA-GA(tBu)3。然后将肽裂解并通过HPLC纯化以得到产物。
[0346] IMP460的放射性标记
[0347] 将IMP460(0.0020g)溶解在732μL,pH4,0.1M NaOAc中。如上所述纯化18F，用冰醋酸中和，并与Al溶液混合。然后加入肽溶液20μL，并在99℃下加热溶液25分钟。然18
后将粗品在 HLB柱上纯化。[Al F]标记的肽在1:1EtOH/H2O柱洗脱剂中。在
0.1%TFA缓冲液中的反相HPLC迹线显示在标记的肽的预期位置处清晰的HPLC单峰(未显示)。
后将粗品在 HLB柱上纯化。[Al F]标记的肽在1:1EtOH/H2O柱洗脱剂中。在
0.1%TFA缓冲液中的反相HPLC迹线显示在标记的肽的预期位置处清晰的HPLC单峰(未显示)。
[0348] 实施例10.IMP461和IMP462NOTA-缀合的肽的合成和标记
[0349] 制备最简单的可能的NOTA配体(被保护以用于肽合成)，并将其并入用于预靶向的两种肽–IMP461和IMP462。
[0350] 双-叔丁基-NOTA的合成
[0351] 将NO2AtBu(0.501g1.4x10-3mol)溶解在5mL无水乙腈中。将苄基-2-溴乙酸盐-3(0.222mL,1.4x10 mol)加入溶液中，随后加入0.387g的无水K2CO3。将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物过滤和浓缩以得到0.605g(86%产率)的苄基酯缀合物。然后将粗品溶解在50mL的异丙醇中，与0.2g的10%Pd/C混合(在Ar下)，并在50psi H2下放置3天。
-
然后将产物过滤并在真空下浓缩以得到0.462g的所需产物ESMS[M-H]415。
-
然后将产物过滤并在真空下浓缩以得到0.462g的所需产物ESMS[M-H]415。
[0352] IMP461的合成
[0353] 在具有以下顺序添加的氨基酸和其他试剂的Sieber酰胺树脂上合成 肽：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、 去 除 Aloc、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、去除Aloc、Fmoc-D-Ala-OH和双-叔丁基NOTA。然后+
将肽裂解和通过HPLC纯化以得到产物IMP461ESMS MH1294NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2;SEQ ID NO:45)。
将肽裂解和通过HPLC纯化以得到产物IMP461ESMS MH1294NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2;SEQ ID NO:45)。
[0354] IMP462的合成
[0355] 在具有以下顺序添加的氨基酸和其他试剂的Sieber酰胺树脂上合成 肽：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、 去 除 Aloc、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、去除Aloc、Fmoc-D-Asp(But)-OH、和双-叔丁基NOTA。
+
然后将肽裂解和通过HPLC纯化以得到产物IMP462ESMSMH1338(NOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2;SEQ IDNO:46)。
+
然后将肽裂解和通过HPLC纯化以得到产物IMP462ESMSMH1338(NOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2;SEQ IDNO:46)。
[0356] IMP461&IMP462的18F标记
[0357] 将肽溶解在pH4.13,0.5M NaOAc中以制备0.05M肽溶液，将其保存在冰箱中直至TM需要。用2mL水吸收F-18，然后在 Light, ACCELL Plus QMA
18
柱体上来收集。用200μL等份的0.4M KHCO3由柱子洗脱 F。通过在加入放射性物质之
18
前向小瓶加入10μL的冰醋酸来中和碳酸氢盐至约pH4。去除100μL等份的纯化的 F溶液，并与在pH4,0.1M NaOAc中的3μL,2mM Al混合。将肽，10μL(0.05M)加入，然后在约
100℃下加热溶液15分钟。用700μL DI水来稀释粗品反应混合物，然后放置在HLB柱上，
18 18
并且在洗涤之后用2x100μL的1:1EtOH/H2O来洗脱 F以得到纯化的 F-标记的肽。 [0358] 实施例11.IMP467的制备和18F-标记
18
柱体上来收集。用200μL等份的0.4M KHCO3由柱子洗脱 F。通过在加入放射性物质之
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前向小瓶加入10μL的冰醋酸来中和碳酸氢盐至约pH4。去除100μL等份的纯化的 F溶液，并与在pH4,0.1M NaOAc中的3μL,2mM Al混合。将肽，10μL(0.05M)加入，然后在约
100℃下加热溶液15分钟。用700μL DI水来稀释粗品反应混合物，然后放置在HLB柱上，
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并且在洗涤之后用2x100μL的1:1EtOH/H2O来洗脱 F以得到纯化的 F-标记的肽。 [0358] 实施例11.IMP467的制备和18F-标记
[0359] IMP467C-NETA-琥珀酰基-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:47) [0360] 制备四叔丁基C-NETA-琥珀酰。如在Chong等，(J.Med.Chem.2008,51:118-125)中所述制备叔丁基{4-[2-(双-(叔丁氧基羰基)甲基-3-(4-硝基苯基)丙基]-7-叔丁氧基羰基[1,4,7]三氮杂壬烷-1-基}。
[0361] 通过以下所示顺序添加以下氨基酸至树脂在Sieber酰胺树脂上制备 肽，IMP467C-NETA- 琥 珀 酰 基 -D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:47)：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH；Trt-HSG-OH、Aloc 被 裂 解；Fmoc-D-Tyr(But)-OH；
Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH；Trt-HSG-OH、Aloc被裂解；{4-[双-(叔丁氧基羰基甲基)氨基)-3-(4-琥珀酰酰氨苯基)丙基]-7-叔丁氧基羰基甲基[1,4,7]三氮杂壬烷-1-基}乙酸叔丁酯。然后由树脂裂解肽，并通过RP-HPLC来纯化以得到6.3mg的IMP467。通过使用C18柱的高效液相色谱法(HPLC)来纯化粗品肽。
Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH；Trt-HSG-OH、Aloc被裂解；{4-[双-(叔丁氧基羰基甲基)氨基)-3-(4-琥珀酰酰氨苯基)丙基]-7-叔丁氧基羰基甲基[1,4,7]三氮杂壬烷-1-基}乙酸叔丁酯。然后由树脂裂解肽，并通过RP-HPLC来纯化以得到6.3mg的IMP467。通过使用C18柱的高效液相色谱法(HPLC)来纯化粗品肽。
[0362] 放射性标记
[0363] 将IMP467的2mM溶液在pH4,0.1M NaOAc中制备。通过 ACCELLTM18 -
Plus Light QMA柱体来洗脱 F,139mCi，然后使用1mL的0.4M KHCO3来洗脱
18 -
F。通过HLBRP-HPLC来纯化标记的IMP467。RP-HPLC显示两洗脱峰(未显示)，据认为其
18
为Al F(IMP467)的非对映异构体。支持该假设，当在37℃下孵育IMP467时，显示在两个
18
HLB峰之间的一定程度互变(未显示)。在如下所讨论的预靶向技术中，因为[Al F]-螯合剂复合物不是抗体结合的半抗原位点的一部分，所以非对映异构体的存在未呈现出影响
18
F-标记的肽靶向患病组织。
Plus Light QMA柱体来洗脱 F,139mCi，然后使用1mL的0.4M KHCO3来洗脱
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F。通过HLBRP-HPLC来纯化标记的IMP467。RP-HPLC显示两洗脱峰(未显示)，据认为其
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为Al F(IMP467)的非对映异构体。支持该假设，当在37℃下孵育IMP467时，显示在两个
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HLB峰之间的一定程度互变(未显示)。在如下所讨论的预靶向技术中，因为[Al F]-螯合剂复合物不是抗体结合的半抗原位点的一部分，所以非对映异构体的存在未呈现出影响
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F-标记的肽靶向患病组织。
[0364] 放射性标记的肽的产率比较
[0365] 在尝试改善标记产率同时保持体内稳定性时，合成预靶向肽的3 种NOTA衍生物(IMP460、IMP461和IMP467)。在这些中，IMP467的标记产率几乎是其他肽的两倍(表7)。使用相同摩尔量的肽和铝来进行在表7中所有标记研究。在表7中显示的结果展示各肽的示例性标记试验。
[0366] 当仅40nmol(小于IMP449约13倍)与1.3GBq(35mCi)的18F一起使用时，IMP46718 18
的 F-标记产率为约70%，这表明该配体对Al F复合物具有改善的结合性能。通过增加配体结合的动力学，基本上改善产率(平均65-75%产率)，而相对于IMP449(520nmol,44%产率)使用更少摩尔量的IMP467(40nmol)。
的 F-标记产率为约70%，这表明该配体对Al F复合物具有改善的结合性能。通过增加配体结合的动力学，基本上改善产率(平均65-75%产率)，而相对于IMP449(520nmol,44%产率)使用更少摩尔量的IMP467(40nmol)。
[0367] 表7.含有肽的不同NOTA的产率比较
[0368]肽 产率
IMP449 44%
IMP460 5.8%
IMP461 31%
IMP467 87%
IMP449 44%
IMP460 5.8%
IMP461 31%
IMP467 87%
[0369] 实施例12.作用于IMP467标记的产率和稳定性的因素
[0370] 肽浓度
[0371] 为了检查不同肽浓度对产率的作用，在具有恒定量的Al3+(6nmol)和18F的恒定18
体积(63μL)、但添加不同量的肽中测定Al F与肽的结合量。如下随着肽浓度降低标记的肽IMP467的产率降低：40nmol肽(82%产率)；30nmol(79%产率)；20nmol(75%产率)；
10nmol(49%产率)。因此，改变介于20和40nmol之间肽的量对IMP467的产率影响小。然而，标记混合物中在10nmol的肽时开始观察到降低的产率。
体积(63μL)、但添加不同量的肽中测定Al F与肽的结合量。如下随着肽浓度降低标记的肽IMP467的产率降低：40nmol肽(82%产率)；30nmol(79%产率)；20nmol(75%产率)；
10nmol(49%产率)。因此，改变介于20和40nmol之间肽的量对IMP467的产率影响小。然而，标记混合物中在10nmol的肽时开始观察到降低的产率。
[0372] 铝浓度
[0373] 当在增加量的Al3+(在pH4醋酸盐缓冲液中0、5、10、15、20μL的2mM Al并且保持总体积恒定)存在下标记IMP467时，分别得到3.5%、80%、77%、78%和74%的产率。这些结3+ 18 3+
果表明：(a)在不存在Al 下，F与该肽的非特异性结合最小；(b)10nmol的Al 足够使得
18 3+
F结合最大化；以及(c)较大量的Al 基本上没有降低结合，这表明在该肽浓度下有足够螯合能力。
果表明：(a)在不存在Al 下，F与该肽的非特异性结合最小；(b)10nmol的Al 足够使得
18 3+
F结合最大化；以及(c)较大量的Al 基本上没有降低结合，这表明在该肽浓度下有足够螯合能力。
[0374] Al18F(IMP467)放射性标记的动力学
[0375] 动力学研究显示在107℃下5分钟内结合不完全(5分钟，68%；10分钟，61%；15分钟，71%；以及30分钟，75%)，在长达30分钟的反应时间内分离产率仅中等增加。在50℃下进行的IMP467的反射性标记反应显示在较低温度下未达到结合。在以下实施例中公开的另外的试验显示在一些条件下在降低温度下可出现有限量的标记。
[0376] pH的作用
[0377] 标记的最佳pH介于4.3和5.5之间。在pH2.88下产率为54%；在pH3.99下70-77%；在pH5下70%；在pH6下41%至在pH7.3下为3%。通过从用硝酸盐或氯离子替代碳酸根离
18 -
子的阴离子交换柱洗脱 F 可加快该过程，这使得不再需要在与AlCl3混合之前用冰醋酸调节洗脱剂至pH4。
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子的阴离子交换柱洗脱 F 可加快该过程，这使得不再需要在与AlCl3混合之前用冰醋酸调节洗脱剂至pH4。
[0378] IMP467的高剂量放射性标记
[0379] 将五微升的2mM Al3+储备溶液与50μL的18F1.3GBq(35mCi)混合，随后加入在0.1mM,pH4.1醋酸盐缓冲液中的20μL的2mMIMP467。将反应溶液加热至104℃达15分钟，然后如上所述在HLB柱上纯化(约10分钟)，以69%的放射化学产率分离具有17GBq/μmol(460Ci/mmol)的比活性的0.68GBq(18.4mCi)的纯化肽。反应时间为15分钟并且纯
18 - 18 -
化时间为12分钟。在纯化1.3GBq(35mCi) F 之后开始反应10分钟，使得从分离 F 至纯化最终产物的总时间为 37分钟，其具有未校正衰变的52%产率。
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化时间为12分钟。在纯化1.3GBq(35mCi) F 之后开始反应10分钟，使得从分离 F 至纯化最终产物的总时间为 37分钟，其具有未校正衰变的52%产率。
[0380] 人血清稳定性测试
[0381] 用200μL人血清(之前冷冻)稀释等份的HLB纯化的肽(约30μL)，然后放置在18
37℃HPLC样本室中。在各时间点移开各等份，并通过HPLC来分析。HPLC分析显示 F-标记的肽的非常高的稳定性，其在37℃下在血清中稳定至少五小时(未显示)。在血清中孵
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育五小时之后没有可检测的 F-标记的肽的分解(未显示)。
37℃HPLC样本室中。在各时间点移开各等份，并通过HPLC来分析。HPLC分析显示 F-标记的肽的非常高的稳定性，其在37℃下在血清中稳定至少五小时(未显示)。在血清中孵
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育五小时之后没有可检测的 F-标记的肽的分解(未显示)。
[0382] IMP461和IMP462配体具有可结合铝的两个羧基，而在IMP467中NOTA配体具有四个羧基。血清稳定性研究显示，在体内复制使用的条件下具有IMP467的复合物在血清中18
稳定。用标记的IMP467的体内生物分布研究显示，在实际体内条件下Al F-标记的肽稳定(未显示)。
稳定。用标记的IMP467的体内生物分布研究显示，在实际体内条件下Al F-标记的肽稳定(未显示)。
[0383] 通过形成可结合肽上的NOTA配体的Al18F复合物可使用18F快速(30分钟)和高18
产率以及至少17GBq/μmol的比活性下标记肽，而无需HPLC纯化。Al F(NOTA)-肽在血清
18
和体内均稳定。NOTA配体的修饰可导致产率和比活性的提高，同时仍然保持Al F(NOTA)复合物的所需体内稳定性，并且连接至亲水性接头有助于肽的肾脏清除。而且，该方法避免了
18 18
通常用于使用 F标记肽的脱水步骤。如在以下实施例中所显示，该新的 F-标记方法可应用于大量靶向肽的标记。
产率以及至少17GBq/μmol的比活性下标记肽，而无需HPLC纯化。Al F(NOTA)-肽在血清
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和体内均稳定。NOTA配体的修饰可导致产率和比活性的提高，同时仍然保持Al F(NOTA)复合物的所需体内稳定性，并且连接至亲水性接头有助于肽的肾脏清除。而且，该方法避免了
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通常用于使用 F标记肽的脱水步骤。如在以下实施例中所显示，该新的 F-标记方法可应用于大量靶向肽的标记。
[0384] Al18F(IMP467)的优化标记
[0385] 鉴定用于IMP467的18F-标记的优化条件。这些由使用市售无菌盐水(pH5-7)洗18 -
脱 F ；以100μL总体积在pH4醋酸盐缓冲液中与20nmol的AlCl3和40nmol IMP467混合；在102℃下加热15分钟；以及进行SPE分离组成。在无需HPLC纯化下简单固相萃取(SPE)分离之后，在单一步骤、30分钟程序工序中使用IMP467获得高产率(85%)和高比活
18
性(115GBq/μmol)。Al F(IMP467)在PBS或人血清中稳定， 在37℃下任一培养基中孵育
18 -
6小时之后有2%的 F 损耗。
脱 F ；以100μL总体积在pH4醋酸盐缓冲液中与20nmol的AlCl3和40nmol IMP467混合；在102℃下加热15分钟；以及进行SPE分离组成。在无需HPLC纯化下简单固相萃取(SPE)分离之后，在单一步骤、30分钟程序工序中使用IMP467获得高产率(85%)和高比活
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性(115GBq/μmol)。Al F(IMP467)在PBS或人血清中稳定， 在37℃下任一培养基中孵育
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6小时之后有2%的 F 损耗。
[0386] 18F-的浓缩和纯化
[0387] 放射化学级18F-在使用之前需要纯化和浓缩。我们检查4种不同SPE纯化程序以18 - 18 -
在使用它之前处理 F。使用通过常规方法制备的 F 来进行大部分放射性标记程序。将
18 -
在2mL的水中的 F 装载于用10mL的0.4M KHCO3、随后为10mL水预先洗涤的
TM 18 -
Light,Waters Accell QMA Plus柱体上。在将 F 装载于柱体上之后，使用5mL水洗涤以去除任何溶解的金属和放射性金属杂质。然后用约1mL的0.4M KHCO3以数种级分来洗脱同位素，从而分离具有最高活性浓度的级分。每100μL溶液使用5μL的冰醋酸来中和洗脱的级分以调节洗脱液至pH4-5。
在使用它之前处理 F。使用通过常规方法制备的 F 来进行大部分放射性标记程序。将
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在2mL的水中的 F 装载于用10mL的0.4M KHCO3、随后为10mL水预先洗涤的
TM 18 -
Light,Waters Accell QMA Plus柱体上。在将 F 装载于柱体上之后，使用5mL水洗涤以去除任何溶解的金属和放射性金属杂质。然后用约1mL的0.4M KHCO3以数种级分来洗脱同位素，从而分离具有最高活性浓度的级分。每100μL溶液使用5μL的冰醋酸来中和洗脱的级分以调节洗脱液至pH4-5。
[0388] 在第二过程中，用10mL pH8.4,0.5M NaOAc，随后为10mL DIH2O来洗涤QMA柱18 -
体。如上所述将 F 装载于柱上，并用在每一级分具有60-70%活性的200μL级分中的
1mL,pH6,0.05M KNO3来洗脱。无需调整该溶液pH。
体。如上所述将 F 装载于柱上，并用在每一级分具有60-70%活性的200μL级分中的
1mL,pH6,0.05M KNO3来洗脱。无需调整该溶液pH。
[0389] 在第三过程中，用10mL pH8.4,0.5M NaOAc，随后为10mL DIH2O来洗涤QMA柱18 -
体。如上所述将 F 装载于柱上，并用在每一级分具有80%活性的200-μL级分中的
1mL,pH5-7,0.154M市售生理盐水来洗脱。无需调整该溶液pH。
体。如上所述将 F 装载于柱上，并用在每一级分具有80%活性的200-μL级分中的
1mL,pH5-7,0.154M市售生理盐水来洗脱。无需调整该溶液pH。
[0390] 最后，我们设计使用串联式离子交换来制备更加浓缩和高活性 18F-溶液的方法。TM
简而言之，将Tygon管(1.27cm长，0.64cm OD)插入TRICORN 5/20柱内并以约200μL的AG1-X8树脂，100-200筛目填充。用6mL0.4M K2CO3，随后为6mL H2O洗涤树脂。用DI H2OTM
来洗涤 light Waters ACCELL Plus CM柱体。使用注射泵，使容纳在5-mL
18 - TM
注射器中的在2mL DI H2O中的粗品 F 在约5分钟内缓慢流过CM柱体和TRICORN 柱，随后用6mL DI H2O洗涤通过两个离子结合柱。最后，将0.4M K2CO3推进以50μL级分仅通过 TM
TRICORN 柱。通常，在一个50-μL级分中洗脱活性为40至60%。在含有5μL冰醋酸的
2.0mL独立式螺旋帽微量离心管中收集级分以中和碳酸盐溶液。然后将具有最大活性的洗脱小瓶用作反应小瓶。
18 -
简而言之，将Tygon管(1.27cm长，0.64cm OD)插入TRICORN 5/20柱内并以约200μL的AG1-X8树脂，100-200筛目填充。用6mL0.4M K2CO3，随后为6mL H2O洗涤树脂。用DI H2OTM
来洗涤 light Waters ACCELL Plus CM柱体。使用注射泵，使容纳在5-mL
18 - TM
注射器中的在2mL DI H2O中的粗品 F 在约5分钟内缓慢流过CM柱体和TRICORN 柱，随后用6mL DI H2O洗涤通过两个离子结合柱。最后，将0.4M K2CO3推进以50μL级分仅通过 TM
TRICORN 柱。通常，在一个50-μL级分中洗脱活性为40至60%。在含有5μL冰醋酸的
2.0mL独立式螺旋帽微量离心管中收集级分以中和碳酸盐溶液。然后将具有最大活性的洗脱小瓶用作反应小瓶。
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[0391] 实施例13.通过添加 F 至与铝络合的肽来标记
[0392] 使用F-18成功标记含有HSG的肽(IMP465,Al(NOTA)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)(SEQ IDNO:48)，该肽连接与铝络合的大环NOTA。使用40nmol的IM46518
的 F并入为13.20%。如上所述制备中间体肽，IMP461。然后将25.7mg的IMP461溶解在
2mL DI水中，向其加入10.2mg AlCl3·3H2O，并将所得溶液加热至100℃持续1小时。通过RP-HPLC来纯化粗品反应混合物以得到19.6mg的IMP465。
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的 F并入为13.20%。如上所述制备中间体肽，IMP461。然后将25.7mg的IMP461溶解在
2mL DI水中，向其加入10.2mg AlCl3·3H2O，并将所得溶液加热至100℃持续1小时。通过RP-HPLC来纯化粗品反应混合物以得到19.6mg的IMP465。
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[0393] 对于 F-标记，将50μL F溶液[0.702mCi的 F]和20μL(40nmol)2mM IMP465溶液(0.1M NaOAc,pH4.18)加热至101℃持续17分钟。反相HPLC分析显示15.38%(RT约8.60分钟)的活性连接至肽以及84.62%的活性洗脱在柱的空隙体积(2.60分钟)处。
18
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[0394] 在单独的试验中，F-标记的肽的产率百分比可通过改变添加的肽量来提高。观察到的IMP465产率百分比在10nmol肽下为0.27%，在20nmol的肽下为1.8%并且在40nmol的肽下为49%。18
[0395] 当在暴露于 F之前与铝预孵育肽时，IMP467显示比IMP461更高产率。在室温下与铝孵育IMP467，然后冷冻和冻干。用于预孵育所添加的铝的量可变化。18 -
[0396] 表8.在加入 F 前与铝预孵育的IMP467的标记
[0397]
[0398]18
[0399] 产率与当通过加入Al F复合物来标记IMP467时所获得的产率相当。因此，通过18 18 18 -
将 F添加至其螯合部分已经结合铝的肽的 F标记是在加入螯合部分之前与 F 预孵育金属的可行的可替代方法。
将 F添加至其螯合部分已经结合铝的肽的 F标记是在加入螯合部分之前与 F 预孵育金属的可行的可替代方法。
[0400] 实施例14.IMP468铃蟾素肽的合成和标记18
[0401] F标记的靶向部分并不仅限于抗体或抗体片段，也可包括特异性或选择性结合细18
胞靶标的任何分子，该细胞靶与可通过 F PET显像的疾病状况或其他病症相关或者可诊断这些疾病状况或其他病症。铃蟾素是14个氨基酸的肽，其与神经调节肽B和胃泌素释放肽同源、并且是诸如肺癌和胃癌以及成神经细胞瘤的癌症的肿瘤标志物。将IMP468(NOTA-NH-(CH2)7CO-Gln-Trp-Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2;SEQ ID NO:49)合成为铃蟾素
18
类似物并且用 F标记以靶向胃泌素释放肽受体。
胞靶标的任何分子，该细胞靶与可通过 F PET显像的疾病状况或其他病症相关或者可诊断这些疾病状况或其他病症。铃蟾素是14个氨基酸的肽，其与神经调节肽B和胃泌素释放肽同源、并且是诸如肺癌和胃癌以及成神经细胞瘤的癌症的肿瘤标志物。将IMP468(NOTA-NH-(CH2)7CO-Gln-Trp-Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2;SEQ ID NO:49)合成为铃蟾素
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类似物并且用 F标记以靶向胃泌素释放肽受体。
[0402] 使用在文献(Prasanphanich等，2007,PNAS USA104:12463-467)中报道的各种合成流程，在Sieber酰胺树脂上通过基于Fmoc的固相肽合成来合成肽。合成的不同之处在于在树脂上合成肽时将双-叔丁基NOTA配体加入肽。-5
[0403] 将IMP468(0.0139g,1.02x10 mol)溶解在203μL的0.5M pH4.13NaOAc缓冲液中。肽溶解但在静置时形成凝胶，因而用609μL的0.5M pH4.13NaOAc缓冲液和406μL的乙醇-3 18
稀释肽凝胶以制备肽的8.35x10 M溶液。在QMA柱体上纯化 F并用在200μL级分中的
18
0.4M KHCO3来洗脱，用10μL的冰醋酸来中和。将纯化的 F,40μL,1.13mCi与3μL的2mM -7 18
AlCl3在pH4,0.1M NaOAc缓冲液中混合。将IMP468(59.2μL,4.94x10 mol)加入到Al F溶液并放置在 108℃的加热器上15分钟。在HLB柱子纯化粗品，用2x200μL的1:1EtOH/
18
H2O来洗脱以得到34%产率的纯化的 F-标记的肽。
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稀释肽凝胶以制备肽的8.35x10 M溶液。在QMA柱体上纯化 F并用在200μL级分中的
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0.4M KHCO3来洗脱，用10μL的冰醋酸来中和。将纯化的 F,40μL,1.13mCi与3μL的2mM -7 18
AlCl3在pH4,0.1M NaOAc缓冲液中混合。将IMP468(59.2μL,4.94x10 mol)加入到Al F溶液并放置在 108℃的加热器上15分钟。在HLB柱子纯化粗品，用2x200μL的1:1EtOH/
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H2O来洗脱以得到34%产率的纯化的 F-标记的肽。
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[0404] 实施例15.使用 F标记的铃蟾素的肿瘤的显像
[0405] 如上所述制备NOTA-缀合的铃蟾素衍生物(IMP468)。同Prasanphanich等，(PNAS104:12462-12467,2007)一样测定它阻断放射性标记的铃蟾素结合PC-3细胞的能力。我们开始的试验是测定IMP468是否能够特异性阻断铃蟾素与PC-3细胞的结合。我6
们使用IMP333作为非特异性对照。在该试验中，使3x10 个PC-3细胞暴露于恒定量(约
125
50,000cpms)的 I-铃蟾素(Perkin-Elmer)，向其加入增加量的IMP468或IMP333。56至
0.44nM的范围用作我们的抑制浓度。
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们使用IMP333作为非特异性对照。在该试验中，使3x10 个PC-3细胞暴露于恒定量(约
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50,000cpms)的 I-铃蟾素(Perkin-Elmer)，向其加入增加量的IMP468或IMP333。56至
0.44nM的范围用作我们的抑制浓度。
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[0406] 结果显示，我们可阻断 I-BBN与IMP468的结合，但不能阻断与对照肽(IMP333)的结合(未显示)，因此证实IMP468的特异性。Prasanphanich指出在3.2nM下这些肽的IC50，其比我们使用IMP468得到的测定值(21.5nM)低约7倍。
[0407] 使用市售BBN肽重复该试验。我们将抑制肽的量由250增加至2nM以阻断125I-BBN结合PC-3细胞。我们观察到IMP468的非常类似的IC50-值，而BBN阳性对照具有比之前所报道(3.2nM)更高的IC50-值(35.9nM)，但与BBN对照所达到的(24.4nM)接近。
[0408] 为了检查体内靶向，在携带有皮下PC3前列腺癌异种移植物的裸雄性小鼠中检查18
Al F(IMP468)的分布；单独比对用铃蟾素阻断。对于放射性标记，在100℃下加热氯化铝
18
(10μL,2mM)、51.9mCi的 F(来自QMA柱体)、乙酸和60μL的IMP468(在乙醇/NaOAc中
8.45mM)15分钟。将反应混合物在反相HPLC上纯化。将级分40和41(3.56,1.91mCi)混合并应用至HLB柱以用于溶剂交换。在800μL(3.98mCi)中洗脱产物并且910μCi保留在柱上。在饱和NaCl中显色的iTLC显示0.1%未结合活性。
Al F(IMP468)的分布；单独比对用铃蟾素阻断。对于放射性标记，在100℃下加热氯化铝
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(10μL,2mM)、51.9mCi的 F(来自QMA柱体)、乙酸和60μL的IMP468(在乙醇/NaOAc中
8.45mM)15分钟。将反应混合物在反相HPLC上纯化。将级分40和41(3.56,1.91mCi)混合并应用至HLB柱以用于溶剂交换。在800μL(3.98mCi)中洗脱产物并且910μCi保留在柱上。在饱和NaCl中显色的iTLC显示0.1%未结合活性。
[0409] 对一组携带肿瘤的小鼠注射Al18F(IMP468)(167μCi,约9x10-10mol)，并在1.518
小时之后尸体解剖。在施用Al F(IMP468)之前18分钟对另一组六只小鼠静脉注射
-8
100μg(6.2x10 mol)的铃蟾素。在注射之后1.5小时也尸体解剖第二组。数据显示使用
18 18
[Al F]IMP468特异性靶向肿瘤(图3)。当在Al F(IMP468)之前18分钟给予铃蟾素时，肽
18
的肿瘤摄取减少(图3)。生物分布数据表明的Al F(IMP468)的体内稳定性为至少1.5小时(未显示)。
小时之后尸体解剖。在施用Al F(IMP468)之前18分钟对另一组六只小鼠静脉注射
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100μg(6.2x10 mol)的铃蟾素。在注射之后1.5小时也尸体解剖第二组。数据显示使用
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[Al F]IMP468特异性靶向肿瘤(图3)。当在Al F(IMP468)之前18分钟给予铃蟾素时，肽
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的肿瘤摄取减少(图3)。生物分布数据表明的Al F(IMP468)的体内稳定性为至少1.5小时(未显示)。
[0410] 较大肿瘤显示Al18F(IMP468)的更高摄取，这可能是由于在较大肿瘤中更高受体68
表达(未显示)。生物分布数据显示与Prasanphanich等，(未显示)使用 Ga标记相同肽
18 18
所报道的范围相同的Al F(IMP468)肿瘤靶向。结果证实，使用除抗体之外的靶向分子，F肽标记方法可用于体内靶向在肿瘤中上调的受体。在这种情况下，IMP468靶向利用天然存在的配体-受体相互作用。肿瘤靶向显著，其中P值为P=0.0013。已知许多这些配体-受
18
体对，并且使用本文所述的方法，任何这种靶向相互作用可形成 F显像的基础。 [0411] 实施例16.促生长素抑制素类似物IMP466的合成和标记
表达(未显示)。生物分布数据显示与Prasanphanich等，(未显示)使用 Ga标记相同肽
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所报道的范围相同的Al F(IMP468)肿瘤靶向。结果证实，使用除抗体之外的靶向分子，F肽标记方法可用于体内靶向在肿瘤中上调的受体。在这种情况下，IMP468靶向利用天然存在的配体-受体相互作用。肿瘤靶向显著，其中P值为P=0.0013。已知许多这些配体-受
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体对，并且使用本文所述的方法，任何这种靶向相互作用可形成 F显像的基础。 [0411] 实施例16.促生长素抑制素类似物IMP466的合成和标记
[0412] 促生长素抑制素是另一种非抗体靶向肽，其用于显像促生长素抑制素受体蛋白123
的分布。 I-标记的奥曲肽(促生长素抑制素类似物)已经用于显像表达促生长素抑制素受体的肿瘤(例如，Kvols等，1993,Radiology187:129-33；Leitha等，1993,J Nucl Med34:1397-1402)。然而，由于它费用、短暂的物理半衰期和难于制备放射性标记的化合
123 18
物， I尚未广泛用于显像。本文描述的 F-标记方法优选用于显像表达促生长素抑制素受体的肿瘤。
的分布。 I-标记的奥曲肽(促生长素抑制素类似物)已经用于显像表达促生长素抑制素受体的肿瘤(例如，Kvols等，1993,Radiology187:129-33；Leitha等，1993,J Nucl Med34:1397-1402)。然而，由于它费用、短暂的物理半衰期和难于制备放射性标记的化合
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物， I尚未广泛用于显像。本文描述的 F-标记方法优选用于显像表达促生长素抑制素受体的肿瘤。
[0413] IMP466NOTA-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Throl(SEQ IDNO:50)
[0414] 通过标准的基于Fmoc固相肽合成来制备促生长素抑制素类似物奥曲肽(IMP466)的NOTA-缀合的衍生物，从而制备线性肽。C-末端 Throl残基是苏氨醇。通过用DMSO处-6理过夜来环化肽。将肽，0.0073g,5.59x10 mol溶解在111.9μL的0.5M pH4NaOAc缓冲液中以制备IMP466的0.05M溶液。溶液随时间形成凝胶，从而通过加入更多的0.5M NaOAc缓冲液来将它稀释至0.0125M。
[0415] 用QMA柱体将18F纯化和浓缩以得到在0.4M KHCO3中的200μL的18F。用10μL18
的冰醋酸来中和碳酸氢盐溶液。将40μL等份的中和的 F洗脱液与3μL的2mM AlCl3混合，随后加入40μL的0.0125M IMP466溶液。在105℃下加热混合物持续17分钟。然后通
18
过将反应溶液加载至柱上并且用水(3mL)洗涤去未结合的 F，然后用2x200μL1:1EtOH水洗脱放射性标记的肽，在Waters1cc(30mg)HLB柱上纯化反应物。在HLB纯化之后放射性标记的肽的产率为34.6%。
的冰醋酸来中和碳酸氢盐溶液。将40μL等份的中和的 F洗脱液与3μL的2mM AlCl3混合，随后加入40μL的0.0125M IMP466溶液。在105℃下加热混合物持续17分钟。然后通
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过将反应溶液加载至柱上并且用水(3mL)洗涤去未结合的 F，然后用2x200μL1:1EtOH水洗脱放射性标记的肽，在Waters1cc(30mg)HLB柱上纯化反应物。在HLB纯化之后放射性标记的肽的产率为34.6%。
[0416] 离子强度的作用
[0417] 为了降低反应混合物的离子强度，将逐渐增加量的乙腈加入标记混合物(最终浓度：0-80%)。随着在培养基中乙腈的浓度增加，放射性标记的IMP466的产率增加。尽管体积增加(在80%中500μL比对在0%乙腈中200μL)，但在80%乙腈的最终浓度下获得最佳放射性标记产率(98%)。在0%乙腈中，在三次试验中放射性标记产率的范围为36%至55%。 [0418] 实施例17.使用18F-和68Ga-标记的IMP466的神经内分泌肿瘤的显像
[0419] 进行研究以比较使用18F比对68Ga-标记的促生长素抑制素类似肽获得的PET图像以及引导靶向表达促生长素抑制素受体的肿瘤。
[0420] 方法
[0421] 18F标记-合成IMP466并通过在以上实施例中所述的各种方法来标记18F。用18 -
3mL无金属水洗涤具有2-6GBq F(BV Cyclotron VU,Amsterdam,The Netherlands)的QMA 轻柱体(Waters, Milford,MA)。用0.4M KHCO3由柱体洗脱18F-，并收集
200μL的级分。使用10μL无金属冰醋酸，将该级分的pH调节至pH4。加入在0.1M醋酸钠缓冲液(pH4)中的3μL的2mM AlCl3。然后，将10-50μLIMP466(10mg/mL)加入在0.5M醋酸钠(pH4.1)中。除非另有说明，将反应混合物在100℃下孵育15分钟。将放射性标记
18
的肽在RP-HPLC上纯化。收集含有Al F(IMP466)的级分并且用H2O稀释两倍，并在1-cc Oasis HLB柱体(Waters,Milford,MA)上纯化以去除乙腈和TFA。简而言之，将该级分应用至柱体上，并用3mL H2O来洗涤柱体。然后用2x200μL50%乙醇来洗脱放射性标记的肽。对于在小鼠中注射，用0.9%NaCl来稀释肽。得到45,000GBq/mmol的最大比活性。
3mL无金属水洗涤具有2-6GBq F(BV Cyclotron VU,Amsterdam,The Netherlands)的QMA 轻柱体(Waters, Milford,MA)。用0.4M KHCO3由柱体洗脱18F-，并收集
200μL的级分。使用10μL无金属冰醋酸，将该级分的pH调节至pH4。加入在0.1M醋酸钠缓冲液(pH4)中的3μL的2mM AlCl3。然后，将10-50μLIMP466(10mg/mL)加入在0.5M醋酸钠(pH4.1)中。除非另有说明，将反应混合物在100℃下孵育15分钟。将放射性标记
18
的肽在RP-HPLC上纯化。收集含有Al F(IMP466)的级分并且用H2O稀释两倍，并在1-cc Oasis HLB柱体(Waters,Milford,MA)上纯化以去除乙腈和TFA。简而言之，将该级分应用至柱体上，并用3mL H2O来洗涤柱体。然后用2x200μL50%乙醇来洗脱放射性标记的肽。对于在小鼠中注射，用0.9%NaCl来稀释肽。得到45,000GBq/mmol的最大比活性。
[0422] 68Ga标记-用由使用0.1M超纯HCl(J.T.Baker,Deventer,The Netherlands)的68 68 68
TiO2-基1,110MBq Ge/ Ga发生器(Cyclotron Co.Ltd.,Obninsk,Russia)洗脱的 GaCl3
68
来标记IMP466。将IMP466溶解在1.0M HEPES缓冲液(pH7.0)中。将四体积的 Ga洗脱液(120-240MBq)加入，并在95℃下将混合物加热20分钟。然后将50mM EDTA加入至5mM
68 3+ 68
的最终浓度以络合未并入 Ga 。将 Ga-标记的IMP466在Oasis HLB柱体上纯化并用50%乙醇洗脱。
TiO2-基1,110MBq Ge/ Ga发生器(Cyclotron Co.Ltd.,Obninsk,Russia)洗脱的 GaCl3
68
来标记IMP466。将IMP466溶解在1.0M HEPES缓冲液(pH7.0)中。将四体积的 Ga洗脱液(120-240MBq)加入，并在95℃下将混合物加热20分钟。然后将50mM EDTA加入至5mM
68 3+ 68
的最终浓度以络合未并入 Ga 。将 Ga-标记的IMP466在Oasis HLB柱体上纯化并用50%乙醇洗脱。
[0423] 辛醇-水分配系数(log P辛醇/水)-为了测定放射性标记的肽的亲脂性，将约50,000dpm的放射性标记的肽稀释在0.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将等体积的辛醇加入以获得二相体系。在使体系形成涡旋之后2分钟，通过离心(100xg,5分钟)分离两层。
从各层中取三次100μL样本，并在孔型γ粒子计数器(Wallac Wizard3”,Perkin-Elmer,Waltham,MA)中测定放射性。
从各层中取三次100μL样本，并在孔型γ粒子计数器(Wallac Wizard3”,Perkin-Elmer,Waltham,MA)中测定放射性。
[0424] 稳定性-将10μL的18F-标记的IMP466在500μL的新鲜采集的人血清中孵育，并且在37℃下孵育4小时。加入乙腈，并使混合物形成涡旋，随后在1000xg下离心5分钟以沉淀血清蛋白。在如上所述的RP-HPLC上分析上清液。
[0425] 细胞培养物-将AR42J大鼠胰腺肿瘤细胞系培养在补充有4500mg/L D-葡萄糖、10%(v/v)胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)(Gibco Life Technologies,Gaithersburg,MD,USA)中。在37℃下将细胞培养在用5%CO2湿润的气氛下。 [0426] IC50测定-在使用Al19F(IMP466)、69Ga(IMP466)或115In(DTPA-奥曲肽)竞争与
111
In(DTPA-奥曲肽)的结合的竞争性结合测定法中测定将促生长素抑制素受体结合在AR42J细胞上的明显50%抑制浓度(IC50)。
111
In(DTPA-奥曲肽)的结合的竞争性结合测定法中测定将促生长素抑制素受体结合在AR42J细胞上的明显50%抑制浓度(IC50)。
[0427] 通过混合氟化铝(Al19F)溶液(在0.5M NaAc(pH4)中0.02MAlCl3，以及在0.5M19
NaAc(pH4)中0.1M NaF)与IMP466并在100℃下加热15分钟来形成Al F(IMP466)。在如上所述的C-18柱上通过RP-HPLC来纯化反应混合物。
NaAc(pH4)中0.1M NaF)与IMP466并在100℃下加热15分钟来形成Al F(IMP466)。在如上所述的C-18柱上通过RP-HPLC来纯化反应混合物。
[0428] 通过溶解在10mM NaAc(pH5.5)中与20μL IMP466(1mg/mL)混合的30μL的硝酸-8 69镓(2.3x10 mol)并且在90℃下加热15分钟来制备 Ga(IMP466)。在未进一步纯化下使用混合物的样本。
[0429] 通过在50mM NaAc(pH5.5)中混合氯化铟(1x10-5mol)与10μLDTPA-奥曲肽(1mg/115
mL)、并且在室温(RT)下孵育15分钟来制备 In(DTPA-奥曲肽)。在未进一步纯化下使
111
用该样本。根据制造商的方案对 In(DTPA-奥曲肽) 进行放射性标
记。
mL)、并且在室温(RT)下孵育15分钟来制备 In(DTPA-奥曲肽)。在未进一步纯化下使
111
用该样本。根据制造商的方案对 In(DTPA-奥曲肽) 进行放射性标
记。
[0430] 使AR42J细胞在12-孔板中生长至汇合，并用结合缓冲液(具有0.5%牛血清白蛋白的DMEM)洗涤两次。在RT下在结合缓冲液中孵育10分钟之后，加入最终浓度范围为0.1-1000nM的Al19F(IMP466)、 69Ga(IMP466)或115In(DTPA-奥曲肽)，以及痕量(10,000cpm)的 111In(DTPA-奥曲肽)(放射化学纯度>95%)。在RT下孵育3小时之后，用冰冷PBS洗涤细胞两次。刮落细胞，并测定细胞相关的放射性。 在这些条件下，可出现有限程度的内化。因此，我们描述该竞争性结合测定的结果为“明显IC50”而不是IC50。明显IC50定义为没有竞争剂下达到50%结合的肽浓度。
[0431] 生物分布研究-对雄性裸BALB/c小鼠(6-8周)的在右腹注射使用107个细胞/mL的0.2mL AR42J细胞混悬物。在肿瘤细胞接种之后约两周，当肿瘤直径为5-8mm时，静脉内施用370kBq18F或68Ga-标记的IMP466(n=5)。对单独的组(n=5)注射1,000-倍摩尔过量的未经标记的IMP466。对一组三只小鼠注射未螯合的[Al18F]。在注射后(p.i.)2小时通过CO2/O2窒息来处死所有小鼠。收集目标器官，称重并且在γ粒子计数器中计数。计算各组织的每克组织注射剂量的百分比(%ID/g)。动物实验由当地动物福利委员会批准并且按照国际规定进行。
[0432] PET/CT显像-对具有皮下AR42J肿瘤的小鼠静脉内注射10MBqAl18F(IMP466)或68Ga(IMP466)。在注射肽之后一至两小时之后，在具有1.5mm的固有空间分辨率的Inveon动物PET/CT扫描仪(Siemens Preclinical Solutions,Knoxville,TN)上扫描小鼠(Visser等，JNM,2009)。将动物以仰卧位放置在扫描仪上。在15分钟内采集PET发射扫描，随后进行用于解剖参考的CT扫描(空间分辨率113μm,80kV,500μA)。使用具有以下参数的有序集合预期最大化-3D/最大后验概率(OSEM3D/MAP)算法，使用Acquisition Workplace软件版本1.2(Siemens Preclinical Solutions,Knoxville,TN)重新构建扫描：矩阵
256x256x159；像素大小0.43x0.43x0.8mm3和在0.5mm之前的MAP。
256x256x159；像素大小0.43x0.43x0.8mm3和在0.5mm之前的MAP。
[0433] 结果
[0434] 缓冲液的作用-研究缓冲液对IMP466的标记效率的作用。将IMP466溶解在10mg/mL(7.7mM)的柠檬酸钠缓冲液、醋酸钠缓冲液、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES) 缓冲液中。所有缓冲液的摩尔浓度均为1M并且pH为4.1。18
向200μg(153nmol)的IMP466中加入100μL[Al F](pH4)，并在100℃下培养15分钟。用RP-HPLC测定放射性标记产率和比活性。当使用醋酸钠、MES或HEPES时，放射性标记产率分别为49%、44%和46%。在柠檬酸钠的存在下，未观察到标记(<1%)。当在醋酸钠缓冲液中进行标记反应时，制剂的比活性为10,000GBq/mmol，而在MES和HEPES缓冲液中，分别获得
20,500和16,500GBq/mmol的比活性。
向200μg(153nmol)的IMP466中加入100μL[Al F](pH4)，并在100℃下培养15分钟。用RP-HPLC测定放射性标记产率和比活性。当使用醋酸钠、MES或HEPES时，放射性标记产率分别为49%、44%和46%。在柠檬酸钠的存在下，未观察到标记(<1%)。当在醋酸钠缓冲液中进行标记反应时，制剂的比活性为10,000GBq/mmol，而在MES和HEPES缓冲液中，分别获得
20,500和16,500GBq/mmol的比活性。
[0435] AlCl3浓度的作用-制备在醋酸钠(pH4.1)中AlCl3的三种储备溶液：0.2、2.0和18 - 18
20mM。由这些溶液，将3μL加入200μL的 F 以形成[Al F]。向这些样本中，加入153nmol的肽，并在100℃下孵育15分钟。在6nmol AlCl3的最终浓度下孵育之后放射性标记产率为49%。与0.6nmol AlCl3和60nmol AlCl3孵育导致放射性标记产率的巨大降低：分别为
10%和6%。
20mM。由这些溶液，将3μL加入200μL的 F 以形成[Al F]。向这些样本中，加入153nmol的肽，并在100℃下孵育15分钟。在6nmol AlCl3的最终浓度下孵育之后放射性标记产率为49%。与0.6nmol AlCl3和60nmol AlCl3孵育导致放射性标记产率的巨大降低：分别为
10%和6%。
[0436] 肽的量的作用-研究肽的量对标记效率的作用。将IMP466溶解在7.7mM(10mg/mL)的浓度下的醋酸钠缓冲液(pH4.1)中，并且将38、153或363nmol的IMP466加入到18
200μL[Al F](581-603MBq)。随着肽的量增加，放射性标记产率增加。在38nmol下，放射性标记产率的范围为4-8%；在153nmol下，产率增加至42-49%，并且在最高浓度下，放射性标记产率为48-52%。
200μL[Al F](581-603MBq)。随着肽的量增加，放射性标记产率增加。在38nmol下，放射性标记产率的范围为4-8%；在153nmol下，产率增加至42-49%，并且在最高浓度下，放射性标记产率为48-52%。
[0437] 辛醇-水分配系数-为了测定18F和68Ga-标记的IMP466的亲脂性，测定辛醇-水18 68
分配系数。Al F(IMP466)的log P辛醇/水值为-2.44±0.12并且 Ga(IMP466)的log P辛醇
18
/水值为-3.79±0.07，这表明 F-标记的IMP466亲水性稍低。
分配系数。Al F(IMP466)的log P辛醇/水值为-2.44±0.12并且 Ga(IMP466)的log P辛醇
18
/水值为-3.79±0.07，这表明 F-标记的IMP466亲水性稍低。
[0438] 稳定性-在37℃下在人血清中孵育4小时之后18F-标记的IMP466未显示18F的18
释放，这表明Al[ F]NOTA复合物的极好稳定性。
释放，这表明Al[ F]NOTA复合物的极好稳定性。
[0439] IC50测定-Al19F(IMP466)的明显IC50为3.6±0.6nM，而 69Ga(IMP466)的明显IC50115
为13±3nM。参照肽，In(DTPA-奥曲 肽) 的明显IC50为6.3±0.9nM。
为13±3nM。参照肽，In(DTPA-奥曲 肽) 的明显IC50为6.3±0.9nM。
[0440] 生物分布研究-研究在具有皮下AR42J肿瘤的裸BALB/c小鼠中在2h p.i.下18 68 18 18
Al F(IMP466)和 Ga(IMP466)的生物分布(图4)。将Al F作为对照。Al F(IMP466)的肿瘤靶向高，其在2h p.i.下累积有28.3±5.7%ID/g。在过量的未标记的IMP466存在下，摄取为8.6±0.7%ID/g，这表明肿瘤摄取是受体介导的。血液水平非常低(0.10±0.07%ID/g,2h pi)，得到299±88的肿瘤与血液比率。在器官中摄取低，在表达受体的器官中，例如
18 18
肾上腺、胰腺和胃，具有特异性摄取。如与非螯合的Al F的摄取相比，Al F(IMP466)的骨
18
骼摄取微不足道(在2h p.i.下分别为0.33±0.07比对36.9±5.0%ID/g)，这表明 F-标记的NOTA-肽的良好体内稳定性。
Al F(IMP466)和 Ga(IMP466)的生物分布(图4)。将Al F作为对照。Al F(IMP466)的肿瘤靶向高，其在2h p.i.下累积有28.3±5.7%ID/g。在过量的未标记的IMP466存在下，摄取为8.6±0.7%ID/g，这表明肿瘤摄取是受体介导的。血液水平非常低(0.10±0.07%ID/g,2h pi)，得到299±88的肿瘤与血液比率。在器官中摄取低，在表达受体的器官中，例如
18 18
肾上腺、胰腺和胃，具有特异性摄取。如与非螯合的Al F的摄取相比，Al F(IMP466)的骨
18
骼摄取微不足道(在2h p.i.下分别为0.33±0.07比对36.9±5.0%ID/g)，这表明 F-标记的NOTA-肽的良好体内稳定性。
[0441] 比较Al18F(IMP466)和68Ga(IMP466)的生物分布(图4)。 68Ga(IMP466)的肿瘤摄18 68
取(29.2±0.5%ID/g,2h pi)类似于Al F-IMP466的肿瘤摄取(p<0.001)。 Ga(IMP466)的
18
肺摄取比Al F(IMP466)的肺摄取高两倍(分别为4.0±0.9%ID/g比对1.9±0.4%ID/g)。此
68 18
外， Ga(IMP466)的肾保留量比Al F(IMP466)的肾保留量稍低(分别为16.2±2.86%ID/g比对9.96±1.27%ID/g)。
取(29.2±0.5%ID/g,2h pi)类似于Al F-IMP466的肿瘤摄取(p<0.001)。 Ga(IMP466)的
18
肺摄取比Al F(IMP466)的肺摄取高两倍(分别为4.0±0.9%ID/g比对1.9±0.4%ID/g)。此
68 18
外， Ga(IMP466)的肾保留量比Al F(IMP466)的肾保留量稍低(分别为16.2±2.86%ID/g比对9.96±1.27%ID/g)。
[0442] 联合的PET和CT扫描显示在图5中。PET扫描证实生物分布数据。Al18F(IMP466)68
和 Ga(IMP466)显示在肿瘤中的高摄取和在肾脏中保留。在肾脏中活性主要位于肾皮质
18
中。而且，因为未观察到骨骼摄取，证明[Al F]由NOTA螯合剂稳定螯合。
和 Ga(IMP466)显示在肿瘤中的高摄取和在肾脏中保留。在肾脏中活性主要位于肾皮质
18
中。而且，因为未观察到骨骼摄取，证明[Al F]由NOTA螯合剂稳定螯合。
[0443] 图5明确地显示促生长素抑制素(奥曲肽)的18F-标记的类似物的分布拟似68
Ga-标记的促生长素抑制素类似物的分布。这些结果重要，因为已经显示与常规促生长素
68
抑制素受体闪烁扫描术和诊断CT相比，在具有神经内分泌肿瘤的人受试者中 Ga-标记的奥曲肽PET显像具有显著更高的检出率，其中敏感性为97%；特异性为92%以及精确度为
68
96%(例如，Gabriel等，2007,J Nucl Med48:508-18)。据报 道，使用 Ga-标记的奥曲肽
111
的PET显像比使用 In-标记的奥曲肽的SPECT分析显著更优并且对甚至小脑膜瘤的检测
18 68
都高度敏感(Henze等，2001,J Nucl Med42:1053-56)。因为与 F相比 Ga的能量更高，预
18 68
期基于 F的PET显像显示比基于 Ga的PET显像甚至更好的空间分辨率。通过比较使用
18 68
F-标记的IMP466(图5，左)比对 Ga-标记的IMP466(图5，右)获得的肾图像在图5中
68 18
示出这点。使用 Ga获得的PET图像显示比使用 F获得的图像更加分散的边缘线和更低
18
分辨率。这些结果证实使用本文所述的方法和组合物制备的 F-标记的靶向部分获得更优
18
图像并且确认将描述的 F-标记技术用于非抗体靶向肽。
Ga-标记的促生长素抑制素类似物的分布。这些结果重要，因为已经显示与常规促生长素
68
抑制素受体闪烁扫描术和诊断CT相比，在具有神经内分泌肿瘤的人受试者中 Ga-标记的奥曲肽PET显像具有显著更高的检出率，其中敏感性为97%；特异性为92%以及精确度为
68
96%(例如，Gabriel等，2007,J Nucl Med48:508-18)。据报 道，使用 Ga-标记的奥曲肽
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的PET显像比使用 In-标记的奥曲肽的SPECT分析显著更优并且对甚至小脑膜瘤的检测
18 68
都高度敏感(Henze等，2001,J Nucl Med42:1053-56)。因为与 F相比 Ga的能量更高，预
18 68
期基于 F的PET显像显示比基于 Ga的PET显像甚至更好的空间分辨率。通过比较使用
18 68
F-标记的IMP466(图5，左)比对 Ga-标记的IMP466(图5，右)获得的肾图像在图5中
68 18
示出这点。使用 Ga获得的PET图像显示比使用 F获得的图像更加分散的边缘线和更低
18
分辨率。这些结果证实使用本文所述的方法和组合物制备的 F-标记的靶向部分获得更优
18
图像并且确认将描述的 F-标记技术用于非抗体靶向肽。
[0444] 实施例18.使用预靶向来比较68Ga和18F PET显像
[0445] 我们比较使用用如上所述制备的双特异性TF2抗体预靶向的 68Ga-或18F-标记的68
肽获得的PET图像。因为在肿瘤中它的最大增生在数小时内达到，所以 Ga(t1/2=68分钟)
18 68
和 F(t1/2=110分钟)的半衰期与放射性标记的肽的药物代谢动力学相符。而且，Ga容易
68 68 18
由 Ge/ Ga发生器获得，而 F是在PET中最常和广泛使用的放射性核素。
肽获得的PET图像。因为在肿瘤中它的最大增生在数小时内达到，所以 Ga(t1/2=68分钟)
18 68
和 F(t1/2=110分钟)的半衰期与放射性标记的肽的药物代谢动力学相符。而且，Ga容易
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由 Ge/ Ga发生器获得，而 F是在PET中最常和广泛使用的放射性核素。
[0446] 方法
[0447] 使具有皮下表达CEA的LS174T肿瘤的小鼠静脉内接受TF2(6.0nmol;0.94mg)和68 18
5MBq Ga(IMP288)(0.25nmol)或Al F(IMP449)(0.25nmol)，在双特异性抗体和放射性标记的肽的注射之间间隔16小时。在注射放射性标记的肽之后一或两小时，采集PET/CT图像并且测定放射性标记的肽的生物分布。比较在LS174T肿瘤中摄取与在皮下CEA-阴性SK-RC52肿瘤中摄取。在具有皮下LS174T肿瘤和对侧发炎腿肌的小鼠中比较预靶向的免疫PET显
18
像和 F-FDG PET显像。
5MBq Ga(IMP288)(0.25nmol)或Al F(IMP449)(0.25nmol)，在双特异性抗体和放射性标记的肽的注射之间间隔16小时。在注射放射性标记的肽之后一或两小时，采集PET/CT图像并且测定放射性标记的肽的生物分布。比较在LS174T肿瘤中摄取与在皮下CEA-阴性SK-RC52肿瘤中摄取。在具有皮下LS174T肿瘤和对侧发炎腿肌的小鼠中比较预靶向的免疫PET显
18
像和 F-FDG PET显像。
[0448] IMP288DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(SEQID NO:51)
[0449] 预靶向-通过如上所述的DNL方法来制备双特异性TF2抗体。TF2是包含来自h679抗体的HSG-结合Fab片段和来自hMN-14抗体的两个CEA-结合Fab片段的三价双特异性抗体。通过如上所述的肽合成法来合成缀合DOTA、含有HSG的肽IMP288。如上所述合18
成的IMP449肽含有1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)螯合部分以便于用 F来标记。作为抗体组分的示踪剂，通过iodogen法(Fraker和Speck,1978,Biochem Biophys
125
Res Comm80:849-57)用 I(PerkinElmer,Waltham,MA)来标记TF2以得到58MBq/nmol的比活性。
成的IMP449肽含有1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)螯合部分以便于用 F来标记。作为抗体组分的示踪剂，通过iodogen法(Fraker和Speck,1978,Biochem Biophys
125
Res Comm80:849-57)用 I(PerkinElmer,Waltham,MA)来标记TF2以得到58MBq/nmol的比活性。
[0450] IMP288的标记-在严格 无金属条件下 在32MBq/nmol的比活性下 用111
In(Covidien,Petten,The Netherlands)来标记IMP288以用于生物分布研究。使用
68 68
由0.1M超纯HCl的基于TiO的1,110MBq Ge/ Ga发生器(Cyclotron Co.Ltd.,Obninsk
68
Russia)洗脱的 Ga来标记IMP288。收集五份1ml级分，并将第二级分用于标记肽。将
68
一体积的1.0M HEPES缓冲液(pH7.0)加入到3.4nmol IMP288。将四体积的 Ga洗
脱液(380MBq)加入，并将混合物加热至95℃持续20分钟。然后将50mM EDTA加入至
68 3+ 68
5mM的最终浓度以络合未螯合的 Ga 。将 Ga(IMP288)肽在1-mL Oasis HLB-柱体
(Waters,Milford,MA)上纯化。在用水洗涤柱体之后，使用25%乙醇洗脱肽。在45分钟内
68
进行用 Ga标记IMP288的程序，准备制剂体内使用。
In(Covidien,Petten,The Netherlands)来标记IMP288以用于生物分布研究。使用
68 68
由0.1M超纯HCl的基于TiO的1,110MBq Ge/ Ga发生器(Cyclotron Co.Ltd.,Obninsk
68
Russia)洗脱的 Ga来标记IMP288。收集五份1ml级分，并将第二级分用于标记肽。将
68
一体积的1.0M HEPES缓冲液(pH7.0)加入到3.4nmol IMP288。将四体积的 Ga洗
脱液(380MBq)加入，并将混合物加热至95℃持续20分钟。然后将50mM EDTA加入至
68 3+ 68
5mM的最终浓度以络合未螯合的 Ga 。将 Ga(IMP288)肽在1-mL Oasis HLB-柱体
(Waters,Milford,MA)上纯化。在用水洗涤柱体之后，使用25%乙醇洗脱肽。在45分钟内
68
进行用 Ga标记IMP288的程序，准备制剂体内使用。
[0451] IMP449的标记-如上所述用18F来标记IMP449。由具有0.4MKHCO3的QMA柱体洗脱18 18
555-740MBq F(B.V.Cyclotron VU,Amsterdam,The Netherlands)。将Al F活性加入含有肽(230μg)和抗坏血酸(10mg)的小瓶。在100℃下将混合物孵育15分钟。通过RP-HPLC来纯化反应混合物。在加入一体积的水之后，在1-mL Oasis HLB柱体上纯化肽。在用水洗
18
涤之后，使用50%乙醇来洗脱放射性标记的肽。在60分钟内制备Al F(IMP449)，准备制剂体内使用。
555-740MBq F(B.V.Cyclotron VU,Amsterdam,The Netherlands)。将Al F活性加入含有肽(230μg)和抗坏血酸(10mg)的小瓶。在100℃下将混合物孵育15分钟。通过RP-HPLC来纯化反应混合物。在加入一体积的水之后，在1-mL Oasis HLB柱体上纯化肽。在用水洗
18
涤之后，使用50%乙醇来洗脱放射性标记的肽。在60分钟内制备Al F(IMP449)，准备制剂体内使用。
[0452] 在研究中使用的125I-TF2、111In(IMP288)和68Ga(IMP288)以及Al18F(IMP449)制剂的放射化学纯度通常超过95%。
[0453] 动物实验-在称重20-25克的雄性裸BALB/c小鼠(6-8周龄)中进行实验。使小6
鼠接受0.2mL的1x10LS174T-细胞(表达CEA的人结肠癌细胞系(美国模式培养物保藏所,Rockville,MD,USA))的混悬物的皮下注射。当肿瘤大小达到约0.1-0.3g(在接种肿瘤之后10-14天)时开始研究。
鼠接受0.2mL的1x10LS174T-细胞(表达CEA的人结肠癌细胞系(美国模式培养物保藏所,Rockville,MD,USA))的混悬物的皮下注射。当肿瘤大小达到约0.1-0.3g(在接种肿瘤之后10-14天)时开始研究。
[0454] TF2和IMP288注射之间的间隔是16小时，因为这个时间段足够由循环中清除未125 111 68
结合的TF2。在一些研究中， I-TF2,(0.4MBq)与未标记的TF2共同注射。用 In或 Ga
18
来标记IMP288。用 F来标记IMP449。使小鼠静脉内接受TF2和IMP288(0.2mL)。在注射
68 18
Ga-标记的肽一小时之后，并且在注射Al F(IMP449)两小时之后，通过CO2/O2使小鼠安乐死，并通过心脏穿刺来获得血液并解剖组织。
结合的TF2。在一些研究中， I-TF2,(0.4MBq)与未标记的TF2共同注射。用 In或 Ga
18
来标记IMP288。用 F来标记IMP449。使小鼠静脉内接受TF2和IMP288(0.2mL)。在注射
68 18
Ga-标记的肽一小时之后，并且在注射Al F(IMP449)两小时之后，通过CO2/O2使小鼠安乐死，并通过心脏穿刺来获得血液并解剖组织。
[0455] 用Inveon动物PET/CT扫描仪(Siemens Preclinical Solutions,Knoxville,TN)来采集PET图像。采集PET发射扫描15分钟，在此之前为用于解剖参照的CT扫描(空间分辨率113μm，80kV，500μA，暴露时间300毫秒)。
[0456] 在显像之后，将目标肿瘤和器官解剖、称重和在具有用于125I、 111In、68Ga或18F的合适能量窗的γ粒子计数器中计数。计算每克组织注射的剂量百分比(%ID/g)。
[0457] 结果
[0458] 在1小时内，预靶向的免疫PET在肿瘤中产生68Ga-IMP288的高和特异性靶向(10.7±3.6%ID/g)，而在正常组织(例如，肿瘤/血液69.9±32.3)中、在CEA-阴性肿瘤(0.35±0.35%ID/g)中和发炎肌肉(0.72±0.20%ID/g)中具有非常低的摄取。用TF2不能68 18
预靶向的肿瘤也具有低 Ga(IMP288)摄取(0.20±0.03%ID/g)。[ F]FDG不仅在肿瘤中有效地增生(7.42±0.20%ID/g)，也在发炎肌肉(4.07±1.13%ID/g)和大量正常组织中增生，
68
并且因此，预靶向的 Ga-IMP288提供更好的特异性和敏感性。在用TF2预靶向之后接受
68 18
Ga(IMP288)或Al F(IMP449) 的小鼠的对应PET/CT图像明确显示在皮下LS174T肿瘤中
18
放射性标记的肽的有效靶向，但在发炎肌肉中不可见。相比之下，将使用 F-FDG的肿瘤以及炎症绘图。
预靶向的肿瘤也具有低 Ga(IMP288)摄取(0.20±0.03%ID/g)。[ F]FDG不仅在肿瘤中有效地增生(7.42±0.20%ID/g)，也在发炎肌肉(4.07±1.13%ID/g)和大量正常组织中增生，
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并且因此，预靶向的 Ga-IMP288提供更好的特异性和敏感性。在用TF2预靶向之后接受
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Ga(IMP288)或Al F(IMP449) 的小鼠的对应PET/CT图像明确显示在皮下LS174T肿瘤中
18
放射性标记的肽的有效靶向，但在发炎肌肉中不可见。相比之下，将使用 F-FDG的肿瘤以及炎症绘图。
[0459] 剂量优化-测定TF2bsMAb剂量对固定的0.01nmol(15ng)剂量的IMP288的肿瘤靶125
向的作用。对一组五只小鼠静脉内注射0.10、0.25、0.50或1.0nmol用痕量的 I(0.4MBq)
111
标记的TF2(分别为16、40、80或160μg)。在注射 In(IMP288)(0.01nmol,0.4MBq)一小时之后，测定放射性标记物的生物分布。
向的作用。对一组五只小鼠静脉内注射0.10、0.25、0.50或1.0nmol用痕量的 I(0.4MBq)
111
标记的TF2(分别为16、40、80或160μg)。在注射 In(IMP288)(0.01nmol,0.4MBq)一小时之后，测定放射性标记物的生物分布。
[0460] TF2快速地由血液和正常组织中清除。在注射之后18小时，在所有测试的TF2剂量下的血液浓度小于0.45%ID/g。在2h p.i.下在肿瘤中TF2的靶向为3.5%ID/g，并且独111
立于TF2剂量(数据未显示)。在所有TF2剂量下，In(IMP288)在肿瘤中有效地累积(未
111
显示)。在较高TF2剂量下，在肿瘤中观察到 In(IMP288)增加的摄取：在1.0nmolTF2剂量下，达到IMP288的最大靶向(26.2±3.8%ID/g)。因此，在0.01nmol肽剂量下，最高肿瘤靶向和肿瘤与血液比率在1.0nmol的最高TF2剂量下达到(TF2:IMP288摩尔比=100:1)。
111
在正常组织中，肾脏具有 In(IMP288)的最高摄取(1.75±0.27%ID/g)，并且在肾脏中摄取不受TF2剂量的影响(未显示)。所有其他正常组织具有非常低的摄取，产生极高的肿瘤与非肿瘤比率，在所有测试的TF2剂量下超过50:1(未显示)。
立于TF2剂量(数据未显示)。在所有TF2剂量下，In(IMP288)在肿瘤中有效地累积(未
111
显示)。在较高TF2剂量下，在肿瘤中观察到 In(IMP288)增加的摄取：在1.0nmolTF2剂量下，达到IMP288的最大靶向(26.2±3.8%ID/g)。因此，在0.01nmol肽剂量下，最高肿瘤靶向和肿瘤与血液比率在1.0nmol的最高TF2剂量下达到(TF2:IMP288摩尔比=100:1)。
111
在正常组织中，肾脏具有 In(IMP288)的最高摄取(1.75±0.27%ID/g)，并且在肾脏中摄取不受TF2剂量的影响(未显示)。所有其他正常组织具有非常低的摄取，产生极高的肿瘤与非肿瘤比率，在所有测试的TF2剂量下超过50:1(未显示)。
[0461] 对于使用68Ga-标记的IMP288的PET显像，因为如果在注射后1小时进行68
PET显像则每只小鼠需要注射5-10MBq Ga的最小活性，所以需要较高肽剂量。在注射
68
时 Ga(IMP288)制剂的比活性为50-125MBq/nmol。因此，对于PET显像，必须施用至少
0.1-0.25nmol的IMP288。在0.1nmol IMP288剂量下测得相同的TF2:IMP288摩尔比。通过注射1.0、2.5、5.0或10.0nmol TF2(160、400、800或1600μg)来预靶向LS174T肿瘤。相比
111
于在较低肽剂量下的结果，在肿瘤中 In(IMP288)摄取不受TF2剂量的影响(在所有测试的剂量下 15%ID/g，数据未显示)。在较高剂量下在肿瘤中根据%ID/g的TF2靶向降低(在
1.0nmol和10.0nmol的注射剂量下分别为3.21±0.61%ID/g比对1.16±0.27%ID/g)(数据未显示)。肾脏摄取也独立于bsMAb剂量(2%ID/g)。基于这些数据，我们选择6.0nmol的bsMAb剂量用于将0.1-0.25nmol的IMP288靶向至肿瘤。
PET显像则每只小鼠需要注射5-10MBq Ga的最小活性，所以需要较高肽剂量。在注射
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时 Ga(IMP288)制剂的比活性为50-125MBq/nmol。因此，对于PET显像，必须施用至少
0.1-0.25nmol的IMP288。在0.1nmol IMP288剂量下测得相同的TF2:IMP288摩尔比。通过注射1.0、2.5、5.0或10.0nmol TF2(160、400、800或1600μg)来预靶向LS174T肿瘤。相比
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于在较低肽剂量下的结果，在肿瘤中 In(IMP288)摄取不受TF2剂量的影响(在所有测试的剂量下 15%ID/g，数据未显示)。在较高剂量下在肿瘤中根据%ID/g的TF2靶向降低(在
1.0nmol和10.0nmol的注射剂量下分别为3.21±0.61%ID/g比对1.16±0.27%ID/g)(数据未显示)。肾脏摄取也独立于bsMAb剂量(2%ID/g)。基于这些数据，我们选择6.0nmol的bsMAb剂量用于将0.1-0.25nmol的IMP288靶向至肿瘤。
[0462] PET显像-为了证实使用TF2和68Ga(IMP288)的预靶向免疫PET显像对显像表达CEA的肿瘤的有效性，在五只小鼠中诱导皮下肿瘤。在右腹中诱导皮下LS174T肿瘤，同时在6
相同小鼠的左腹接种1x10 个SK-RC52细胞以诱导CEA-阴性肿瘤。在14天之后，当肿瘤
125
具有0.1-0.2g的尺寸时，用6.0nmol I-TF2静脉内预靶向小鼠。在16小时之后，使小鼠
68
接受5MBq Ga(IMP288)(0.25nmol,20MBq/nmol的比活性)。使单独组的三只小鼠单独接受
68 68
相同量的 Ga-IMP288，而未使用TF2预靶向。在注射 Ga(IMP288)之后1小时获得小鼠的PET/CT扫描。
相同小鼠的左腹接种1x10 个SK-RC52细胞以诱导CEA-阴性肿瘤。在14天之后，当肿瘤
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具有0.1-0.2g的尺寸时，用6.0nmol I-TF2静脉内预靶向小鼠。在16小时之后，使小鼠
68
接受5MBq Ga(IMP288)(0.25nmol,20MBq/nmol的比活性)。使单独组的三只小鼠单独接受
68 68
相同量的 Ga-IMP288，而未使用TF2预靶向。在注射 Ga(IMP288)之后1小时获得小鼠的PET/CT扫描。
[0463] 小鼠中125I-TF2和[68Ga]IMP288的生物分布示出在图6中。再次观察到肿瘤中bsMAb(2.17±0.50%ID/g)和肽(10.7±3.6%ID/g)的高摄取，在正常组织中具有非常低的68
摄取(肿瘤与血液比率：64±22)。在CEA-阴性肿瘤SK-RC52中 Ga(IMP288)的靶向非
68
常低(0.35±0.35%ID/g)。类似地，未使用TF2预靶向的肿瘤具有低的 Ga(IMP288)摄取(0.20±0.03%ID/g)，这表明在表达CEA的LS174T肿瘤中IMP288的特异性累积。
摄取(肿瘤与血液比率：64±22)。在CEA-阴性肿瘤SK-RC52中 Ga(IMP288)的靶向非
68
常低(0.35±0.35%ID/g)。类似地，未使用TF2预靶向的肿瘤具有低的 Ga(IMP288)摄取(0.20±0.03%ID/g)，这表明在表达CEA的LS174T肿瘤中IMP288的特异性累积。
[0464] 在注射68Ga-标记的肽1小时之后采集的PET显像中可清晰看到在用TF2预靶向68
的表达CEA肿瘤中 Ga(IMP288)的特异性摄取(未显示)。使用最大强度的50%阈值，通过目标绘图区域(ROI)来定量评估在肿瘤中摄取。在腹腔中区域用作背景区域。在接受TF2
68
和 Ga(IMP288)的小鼠的显像中肿瘤与背景比率为38.2。
的表达CEA肿瘤中 Ga(IMP288)的特异性摄取(未显示)。使用最大强度的50%阈值，通过目标绘图区域(ROI)来定量评估在肿瘤中摄取。在腹腔中区域用作背景区域。在接受TF2
68
和 Ga(IMP288)的小鼠的显像中肿瘤与背景比率为38.2。
[0465] 我们然后用18F-FDG来检查预靶向的免疫PET。在两组每组五只 小鼠中，通过肌肉内注射50μL松节油(18)在右后腿上诱导皮下LS174T肿瘤以及在左腿肌中诱导炎症病灶。在注射松节油之后三天，使一组小鼠接受6.0nmol TF2，在16小时之后接受5MBq68 18
Ga(IMP288)(0.25nmol)。其他组接受 F-FDG(5MBq)。在注射之前将小鼠禁食10小时，然后麻醉，并在37℃下保持温暖直至在注射1小时之后进行安乐死。
Ga(IMP288)(0.25nmol)。其他组接受 F-FDG(5MBq)。在注射之前将小鼠禁食10小时，然后麻醉，并在37℃下保持温暖直至在注射1小时之后进行安乐死。
[0466] 在发炎肌肉中68Ga(IMP288)的摄取非常低，但在相同动物的肿瘤中摄取高(0.72±0.20%ID/g比对8.73±1.60%ID/g,p<0.05,图7)。在发炎肌肉中摄取与在肺、肝脏和脾脏中摄取处于相同范围(分别为0.50±0.14%ID/g、0.72±0.07%ID/g、
68
0.44±0.10%ID/g)。在这些小鼠中 Ga(IMP288)的肿瘤与血液比率为69.9±32.3；发炎肌肉与血液比率为5.9±2.9；肿瘤与发炎肌肉比率为12.5±2.1。在其他组的小鼠中，
18 18
F-FDG在肿瘤中有效地增生(7.42±0.20%ID/g，肿瘤与血液比率6.24±1.5，图4)。F-FDG也基本上在发炎肌肉中累积(4.07±1.13%ID/g)，其中发炎肌肉与血液比率为3.4±0.5，以及肿瘤与发炎肌肉比率为1.97±0.71。
68
0.44±0.10%ID/g)。在这些小鼠中 Ga(IMP288)的肿瘤与血液比率为69.9±32.3；发炎肌肉与血液比率为5.9±2.9；肿瘤与发炎肌肉比率为12.5±2.1。在其他组的小鼠中，
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F-FDG在肿瘤中有效地增生(7.42±0.20%ID/g，肿瘤与血液比率6.24±1.5，图4)。F-FDG也基本上在发炎肌肉中累积(4.07±1.13%ID/g)，其中发炎肌肉与血液比率为3.4±0.5，以及肿瘤与发炎肌肉比率为1.97±0.71。
[0467] 在用TF2预靶向之后接受68Ga(IMP288)的小鼠的对应PET/CT图像清楚显示在肿18
瘤中放射性标记的肽的有效增生，但在发炎肌肉中不可见(图8)。与之相比，在接受 F-FDG
68
的小鼠的图像上，可见肿瘤以及炎症(图8)。在接受 Ga(IMP288)的小鼠中，肿瘤与发炎
18
组织比率为5.4；肿瘤与背景比率为48；发炎肌肉与背景比率为8.9。 F-FDG摄取的肿瘤与发炎肌肉比率为0.83；肿瘤与背景比率为2.4；发炎肌肉与背景比率为2.9。
瘤中放射性标记的肽的有效增生，但在发炎肌肉中不可见(图8)。与之相比，在接受 F-FDG
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的小鼠的图像上，可见肿瘤以及炎症(图8)。在接受 Ga(IMP288)的小鼠中，肿瘤与发炎
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组织比率为5.4；肿瘤与背景比率为48；发炎肌肉与背景比率为8.9。 F-FDG摄取的肿瘤与发炎肌肉比率为0.83；肿瘤与背景比率为2.4；发炎肌肉与背景比率为2.9。
[0468] 使用Al18F(IMP449)来测试预靶向的免疫PET显像方法。五只小鼠接受6.0nmol18
TF2，随后在16小时之后接受5MBqAl[ F]IMP449(0.25nmol)。在未提前施用TF2下，使三
18 18
只另外的小鼠接受5MBq Al F(IMP449)，同时对两只对照小鼠注射[Al F](3MBq)。该试验
18
的结果概述在图9中。在用TF2预靶向的肿瘤中Al F(IMP449) 的摄取高(10.6±1.7%ID/
18
g)，而在非预靶向的小鼠中它非常低(0.45±0.38%ID/g)。[Al F]在骨骼中累积
(50.9±11.4%ID/g)，而在骨骼中放射性标记的IMP449肽的摄取非常低(0.54±0.2%ID/
18
g)，这表明Al F(IMP449)在体内稳定。在具有皮下LS174T肿瘤的TF2预靶向的小鼠中
18 68
Al F(IMP449)的生物分布与 Ga(IMP288)非常类似。
TF2，随后在16小时之后接受5MBqAl[ F]IMP449(0.25nmol)。在未提前施用TF2下，使三
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只另外的小鼠接受5MBq Al F(IMP449)，同时对两只对照小鼠注射[Al F](3MBq)。该试验
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的结果概述在图9中。在用TF2预靶向的肿瘤中Al F(IMP449) 的摄取高(10.6±1.7%ID/
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g)，而在非预靶向的小鼠中它非常低(0.45±0.38%ID/g)。[Al F]在骨骼中累积
(50.9±11.4%ID/g)，而在骨骼中放射性标记的IMP449肽的摄取非常低(0.54±0.2%ID/
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g)，这表明Al F(IMP449)在体内稳定。在具有皮下LS174T肿瘤的TF2预靶向的小鼠中
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Al F(IMP449)的生物分布与 Ga(IMP288)非常类似。
[0469] 使用Al18F(IMP449)的预靶向免疫PET的PET-显像显示在肿瘤中与使用68 18 68
Ga(IMP288)那些的相同强度，但 F PET图像的分辨率优于 Ga的分辨率(图10)。
18
Al F(IMP449)信号的肿瘤与背景比率为66。
Ga(IMP288)那些的相同强度，但 F PET图像的分辨率优于 Ga的分辨率(图10)。
18
Al F(IMP449)信号的肿瘤与背景比率为66。
[0470] 结论
[0471] 本研究显示使用抗-CEA x抗-HSG双特异性抗体TF2结合68Ga-或18F-标记的二-HSG-DOTA-肽的预靶向的免疫PET是用于表达CEA的肿瘤的PET显像的快速和特异性技术。
[0472] 使用TF2结合68Ga(IMP288)或Al18F(IMP449)进行的预靶向免疫PET包括两次静脉内施用。使用bsMAb和放射性标记的肽之间输液间隔16小时。在16小时之后，大部分TF2由血液清除(血液浓度<1%ID/g)，这防止在循环中TF2和IMP288的络合。
[0473] 对于这些研究，优化用68Ga标记IMP288的程序，得到一步标记技术。我们发现，需要在C18/HLB柱体上纯化以去除当在95℃下超过150GBq/nmol的比活性下标记肽时形成的68 68
Ga胶体。如果制剂含有小百分比的胶体并且静脉内施用，Ga胶体累积在单核吞噬细胞系
68
统(肝脏、脾脏和骨髓)的组织中，破坏图像质量。在C18-柱体上可快速纯化 Ga-标记的肽。可在45分钟内完成用于施用的放射性标记和纯化。
Ga胶体。如果制剂含有小百分比的胶体并且静脉内施用，Ga胶体累积在单核吞噬细胞系
68
统(肝脏、脾脏和骨髓)的组织中，破坏图像质量。在C18-柱体上可快速纯化 Ga-标记的肽。可在45分钟内完成用于施用的放射性标记和纯化。
[0474] 68Ga的半衰期与在预靶向系统中IMP288肽的动力学相符：在肿瘤中最大增生在68 68 68
1小时内达到。可由 Ge/ Ga发生器一天两次洗脱 Ga，这无需使用现场回旋加速器。然
68
而，通过 Ga(1.9MeV)发射的 正电子的高能量限制所采集图像的空间分辨率至3mm，但microPET系统的固有分辨率低至1.5mm。
1小时内达到。可由 Ge/ Ga发生器一天两次洗脱 Ga，这无需使用现场回旋加速器。然
68
而，通过 Ga(1.9MeV)发射的 正电子的高能量限制所采集图像的空间分辨率至3mm，但microPET系统的固有分辨率低至1.5mm。
[0475] 18F，在PET中最广泛使用的放射性核素，具有用于预靶向的PET显像的甚至更加18
有利的半衰期(t1/2=110分钟)。如上所述用 F来标记NOTA-缀合的肽IMP449。类似于用
68 18 68
Ga标记，它是一步程序。获得高达50%的标记产率。Al F(IMP449)的生物分布与 Ga-标
18
记的IMP288的生物分布高度类似，这表明使用该标记方法，F是剩余场化放射性核素。 [0476] 与FDG-PET相比，预靶向的放射免疫检测是肿瘤特异性显像形式。尽管在患者中报道在检测复发结肠直肠癌病变中对FDG-PET的高敏感性和特异性(Huebner等，2000,J Nucl Med41:11277-89)，但如通过炎症观察到的高水平的标记所表明，FDG-PET图像可导致
68 18
由良性病变中识别恶性病变的诊断困境。与之相比，使用经TF2 Ga-或 F-标记的肽的预靶向的免疫PET对CEA-阳性肿瘤的高肿瘤与背景比率和清晰可视化支持使用用于癌症和其他病症的临床显像的所述方法。除了检测转移和由其他病变中识别CEA-阳性肿瘤之外，预靶向的免疫PET也可用于评估在预靶向的放射免疫治疗之前递送至肿瘤和正常组织的辐射剂量。因为TF2是人源化抗体，它具有低免疫原性，所以这为多种显像或治疗循环开辟途径。
有利的半衰期(t1/2=110分钟)。如上所述用 F来标记NOTA-缀合的肽IMP449。类似于用
68 18 68
Ga标记，它是一步程序。获得高达50%的标记产率。Al F(IMP449)的生物分布与 Ga-标
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记的IMP288的生物分布高度类似，这表明使用该标记方法，F是剩余场化放射性核素。 [0476] 与FDG-PET相比，预靶向的放射免疫检测是肿瘤特异性显像形式。尽管在患者中报道在检测复发结肠直肠癌病变中对FDG-PET的高敏感性和特异性(Huebner等，2000,J Nucl Med41:11277-89)，但如通过炎症观察到的高水平的标记所表明，FDG-PET图像可导致
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由良性病变中识别恶性病变的诊断困境。与之相比，使用经TF2 Ga-或 F-标记的肽的预靶向的免疫PET对CEA-阳性肿瘤的高肿瘤与背景比率和清晰可视化支持使用用于癌症和其他病症的临床显像的所述方法。除了检测转移和由其他病变中识别CEA-阳性肿瘤之外，预靶向的免疫PET也可用于评估在预靶向的放射免疫治疗之前递送至肿瘤和正常组织的辐射剂量。因为TF2是人源化抗体，它具有低免疫原性，所以这为多种显像或治疗循环开辟途径。
[0477] 实施例19.叶酸NOTA缀合物的合成
[0478] 如所述(Wang等Bioconjugate Chem.1996,7,56-62.)激活叶酸并且使叶酸与Boc-NH-CH2-CH2-NH2缀合。通过色谱法来纯化缀合物。然后通过使用TFA处理来去除Boc基团。然后将氨基叶酸盐衍生物与p-SCN-Bn-NOTA(Macrocyclics)在碳酸盐缓冲液中混合。18
然后通过HPLC来纯化产物。如在之前实施例中所述用Al F来标记叶酸盐-NOTA衍生物，
18
然后通过HPLC纯化。将 F-标记的叶酸盐静脉内注射至受试者内，并成功地在例如癌症或炎性疾病中用于显像叶酸盐受 体的分布(参见，例如，Ke等，Advanced Drug Delivery Reviews,56:1143-60,2004)。
然后通过HPLC来纯化产物。如在之前实施例中所述用Al F来标记叶酸盐-NOTA衍生物，
18
然后通过HPLC纯化。将 F-标记的叶酸盐静脉内注射至受试者内，并成功地在例如癌症或炎性疾病中用于显像叶酸盐受 体的分布(参见，例如，Ke等，Advanced Drug Delivery Reviews,56:1143-60,2004)。
[0479] 实施例20.在人中预靶向的PET显像
[0480] 对患有疑似复发肿瘤的患者(1.7m2体表面积)注射17mg的双特异性单克隆抗体(bsMab)。使bsMab可定位至靶标并且由血液中清除。当99%的bsMab由血液中清除时，注18 -9
射 F-标记的肽(在5.7x10 mol上5-10mCi)。PET显像显示存在微转移肿瘤。
射 F-标记的肽(在5.7x10 mol上5-10mCi)。PET显像显示存在微转移肿瘤。
[0481] 实施例21.通过18F-标记显像血管生成受体
[0482] 标记的Arg-Gly-Asp(RGD)肽已用于显像例如在缺血组织中的血管生成，其中涉及αvβ3整联蛋白。(Jeong等，J.Nucl.Med.2008,4月15日电子公开)。根据Jeong等，18
(2008)使RGD与SCN-Bn-NOTA缀合。如上所述通过混合铝储备溶液与 F和衍生的RGD肽
18
以及在110℃下加热15分钟、使用过量肽以使得标记反应朝向完成发生，使[Al F]连接
18
NOTA-衍生的RGD肽。如在Jeong等，(2008)中所公开， F标记的RGD肽用于体内生物
18
分布和PET显像。RGD-NOTA的[Al F]缀合物吸收至缺血组织内并提供血管生成的PET显像。
(2008)使RGD与SCN-Bn-NOTA缀合。如上所述通过混合铝储备溶液与 F和衍生的RGD肽
18
以及在110℃下加热15分钟、使用过量肽以使得标记反应朝向完成发生，使[Al F]连接
18
NOTA-衍生的RGD肽。如在Jeong等，(2008)中所公开， F标记的RGD肽用于体内生物
18
分布和PET显像。RGD-NOTA的[Al F]缀合物吸收至缺血组织内并提供血管生成的PET显像。
[0483] 实施例22.碳水化合物标记
[0484] 通过使p-SCN-Bn-NOTA与肼反应、然后通过HPLC纯化配体来制备NOTA氨基硫脲18 18
衍生物。如在之前实施例所述制备[Al F]，并将[Al F]加入至NOTA氨基硫脲，并加热15
18 18
分钟。任选地，通过HPLC来纯化Al F(NOTA氨基硫脲)复合物。通过已知方法使Al F(NOTA
18
氨基硫脲)与氧化的碳水化合物缀合。 F-标记的碳水化合物成功地用于使用PET扫描的显像研究。
衍生物。如在之前实施例所述制备[Al F]，并将[Al F]加入至NOTA氨基硫脲，并加热15
18 18
分钟。任选地，通过HPLC来纯化Al F(NOTA氨基硫脲)复合物。通过已知方法使Al F(NOTA
18
氨基硫脲)与氧化的碳水化合物缀合。 F-标记的碳水化合物成功地用于使用PET扫描的显像研究。
[0485] 实施例23.有机溶剂对F-18标记的作用
[0486] 诸如NETA和NOTA的螯合部分对铝的亲和力比铝对18F的亲和 力远远更高。Al对18
F的亲和力受到多种因素影响，例如溶液的离子强度，这是由于其他平衡离子的存在倾向于彼此保护正电荷铝和负电荷氟离子，因而降低离子结合的强度。因此，低离子强度介质应
18
当增加Al和 F的有效结合。
F的亲和力受到多种因素影响，例如溶液的离子强度，这是由于其他平衡离子的存在倾向于彼此保护正电荷铝和负电荷氟离子，因而降低离子结合的强度。因此，低离子强度介质应
18
当增加Al和 F的有效结合。
[0487] 据发现，将乙醇加入至18F反应的初始研究增加放射性标记的肽的产率。如上所述制备IMP461。
[0488] 表9.在乙醇中IMP461的18F-标记
[0489]# 2mM AlCl3 18F- 2mM IMP461 溶剂 产率*
1 10μL 741μCi 20μL EtOH60μL 64.9%
2 10μL 739μCi 20μL H2O60μL 21.4%
3 10μL 747μCi 20μL EtOH60μL 46.7%
4 5μL 947μCi 10μL EtOH60μL 43.2%
1 10μL 741μCi 20μL EtOH60μL 64.9%
2 10μL 739μCi 20μL H2O60μL 21.4%
3 10μL 747μCi 20μL EtOH60μL 46.7%
4 5μL 947μCi 10μL EtOH60μL 43.2%
[0490] *在HLB柱纯化之后产率，将Rxn#1、2和4加热至101℃持续5分钟；在微波烘箱中将Rxn#3加热1分钟。
[0491] 初步结果显示，将乙醇加入至反应混合物使18F-标记的肽产率超过翻倍。表9也18
显示，微波照射可用于代替加热以促进将[Al F]并入至IMP461的螯合部分内。60秒的微波辐射(#3)似乎比加热至101℃持续5分钟(#1)效率稍低(18%)。
显示，微波照射可用于代替加热以促进将[Al F]并入至IMP461的螯合部分内。60秒的微波辐射(#3)似乎比加热至101℃持续5分钟(#1)效率稍低(18%)。
[0492] 检查另外的试剂对肽的Al19F络合的作用。在每种情况下，反应物的浓度相同，并19
且仅改变溶剂。反应条件包括混合25μL Na F+20μL AlCl3+20μL IMP461+60μL溶剂，随
19
后为在101℃下加热5分钟。表10显示溶剂的存在确实相当大地提高Al F(IMP461)(即，IMP473)的产率。
且仅改变溶剂。反应条件包括混合25μL Na F+20μL AlCl3+20μL IMP461+60μL溶剂，随
19
后为在101℃下加热5分钟。表10显示溶剂的存在确实相当大地提高Al F(IMP461)(即，IMP473)的产率。
[0493] 表10.在各种溶剂中IMP461与Al19F的络合
[0494]溶剂 H2O MeOH EtOH CH3CN
Al-IMP461 2.97 3.03 2.13 1.54
IMP465 52.46 34.19 31.58 24.58
IMP473 14.99 30.96 33.00 37.48
IMP473 15.96 31.81 33.29 36.40
IMP461 13.63 - - -
溶剂 IPA 丙酮 THF 二噁烷
Al-IMP461 2.02 2.05 2.20 16.67
IMP465 32.11 28.47 34.76 10.35
IMP473 27.31 34.35 29.38 27.09
IMP473 27.97 35.13 29.28 11.62
IMP461 10.58 - 4.37 34.27
Al-IMP461 2.97 3.03 2.13 1.54
IMP465 52.46 34.19 31.58 24.58
IMP473 14.99 30.96 33.00 37.48
IMP473 15.96 31.81 33.29 36.40
IMP461 13.63 - - -
溶剂 IPA 丙酮 THF 二噁烷
Al-IMP461 2.02 2.05 2.20 16.67
IMP465 32.11 28.47 34.76 10.35
IMP473 27.31 34.35 29.38 27.09
IMP473 27.97 35.13 29.28 11.62
IMP461 10.58 - 4.37 34.27
[0495]
[0496]
[0497]溶剂 DMF DMSO tR(分钟)
Al-IMP461 - - 9.739
IMP465 19.97 37.03 10.138
IMP473 27.77 31.67 11.729
IMP473 27.34 31.29 11.952
IMP461 - - 12.535
19
Al-IMP461 - - 9.739
IMP465 19.97 37.03 10.138
IMP473 27.77 31.67 11.729
IMP473 27.34 31.29 11.952
IMP461 - - 12.535
19
[0498] Al[ F]IMP461=IMP47318 -
[0499] 实施例24.用碳酸氢盐洗脱 F18
[0500] 将 F,10.43mCi容 纳 在 2mL的 注 射 器 中。 使 溶 液 通 过TM
Light, ACCELL Plus QMA柱体。然后用5mL的DI水来洗涤柱。在如以下表
3 18 -
11中所示的级分中用0.4M KHCO 洗脱 F。表11.用KHCO3洗脱QMA柱体
Light, ACCELL Plus QMA柱体。然后用5mL的DI水来洗涤柱。在如以下表
3 18 -
11中所示的级分中用0.4M KHCO 洗脱 F。表11.用KHCO3洗脱QMA柱体
[0501]
[0502] 检查另外的溶剂(CH3CN)的量对IMP461的18F-标记的作用。在每种情况下，反应物的浓度相同，并且仅溶剂的量改变。反应条件包括混合10μL AlCl3+20μL18F+20μL IMP461+CH3CN，随后在101℃下加热5分钟。表12显示在过量溶剂存在下，在开始的改善之后标记效率降低。
[0503] 表12.使用不同量的CH3CN对IMP461的18F-标记
[0504]CH3CN(μL) 18F-mCi tR2.70分钟(%) tR8.70分钟(%) RCY%(HLB)
0 0.642 13.48 86.52 50.7
100 0.645 1.55 98.45 81.8*
200 0.642 2.85 97.15 80.8
400 0.645 14.51 85.49 57.8
0 0.642 13.48 86.52 50.7
100 0.645 1.55 98.45 81.8*
200 0.642 2.85 97.15 80.8
400 0.645 14.51 85.49 57.8
[0505] *水性洗涤液含有标记的肽。RCY=在HLB纯化之后放射化学产率
[0506] 实施例25.IMP461的高剂量放射性标记18 -
[0507] 将 F,163mCi容 纳 在 2mL的 注 射 器 中。 使 溶 液 通 过TM
Light, ACCELL Plus QMA柱体。然后使用5mL的DI水来洗涤柱。在如以下
18 -
表13中所示的级分中用0.4M K2CO3来洗脱 F。
Light, ACCELL Plus QMA柱体。然后使用5mL的DI水来洗涤柱。在如以下
18 -
表13中所示的级分中用0.4M K2CO3来洗脱 F。
[0508] 表13.高剂量标记
[0509]小瓶 乙酸体积μL 0.4M K2CO3体积μL 活性mCi
1 18.5 185 5.59
2 5 50 35.8
3 5 50 59.9
4 5 50 20.5
5 5 50 5.58
6 50 500 4.21
1 18.5 185 5.59
2 5 50 35.8
3 5 50 59.9
4 5 50 20.5
5 5 50 5.58
6 50 500 4.21
[0510] 将氯化铝溶液(在pH4，2mM NaOAc中10μL，2mM)加入表13的小瓶编号3。将肽(在pH4，2mM NaOAc中20μL，2mM)加入小瓶，随后加入170μL的CH3CN。在103℃下将溶液加热10分钟，用6mL的水稀释。将溶液装入10mL注射器，并注射到串联设置的两个 HLB Plus柱体中。用8mL水来洗涤柱体。然后用10mL1:1EtOH/18
H2O,30.3mCi,63.5%产率，比活性750Ci/mmol来洗脱放射性标记的肽Al F(IMP461)。通过
18
HPLC使标记的肽没有未结合的 F。 总反应和纯化时间为20分钟。
H2O,30.3mCi,63.5%产率，比活性750Ci/mmol来洗脱放射性标记的肽Al F(IMP461)。通过
18
HPLC使标记的肽没有未结合的 F。 总反应和纯化时间为20分钟。
[0511] 实施例26.Al19F肽的制备
[0512] 将含有27Al和/或19F的产物用于类似MR显像的某些应用。开发制备[Al19F]化19
合物的改善的方法。如上所述制备IMP461，并用 F来标记。使IMP461与AlCl3+NaF反应导致形成三种产物(未显示)。然而，通过使IMP461与AlF3·3H2O反应，我们获得更高产
19
率的Al F(IMP461)。
合物的改善的方法。如上所述制备IMP461，并用 F来标记。使IMP461与AlCl3+NaF反应导致形成三种产物(未显示)。然而，通过使IMP461与AlF3·3H2O反应，我们获得更高产
19
率的Al F(IMP461)。
[0513] IMP473的 合 成：[Al19F(IMP461)] 向 在 2mL NaOAc(2mM,pH4.18)溶 液 中 的(14.1mg,10.90μmol)IMP461加入(4.51mg,32.68μmol)AlF3·3H2O和500μL乙醇。使用3μL1N NaOH将溶液的pH调节至4.46，并在沸水浴中加热30分钟。通过制备型RP-HPLC+
来纯化粗品反应混合物以得到4.8mg(32.9%)的IMP473。HRMS(ESI-TOF)MH 预计值
1337.6341；测定值1337.6332。
来纯化粗品反应混合物以得到4.8mg(32.9%)的IMP473。HRMS(ESI-TOF)MH 预计值
1337.6341；测定值1337.6332。
[0514] 这些结果证实，如上对18F标记所讨论，通过形成金属-19F复合物和将金属-19F结19
合至螯合部分可制备 F标记的分子。本实施例显示，使用本方法可制备用于预靶向检测、诊断和/或显像的靶向肽。
合至螯合部分可制备 F标记的分子。本实施例显示，使用本方法可制备用于预靶向检测、诊断和/或显像的靶向肽。
[0515] 实施例27.IMP479、IMP485和IMP487的合成和标记
[0516] 设计用于18F-标记的另外的肽(IMP479、IMP485和IMP487)的结构示出在图11至图13中。IMP485示出在图12中。通过以下所示顺序将下列氨基酸加入至树
脂来在Sieber酰胺树脂上制备IMP485：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH；Trt-HSG-OH、Aloc被裂 解；Fmoc-D-Tyr(But)-OH；Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH；Trt-HSG-OH、Aloc 被 裂 解；(叔 丁基)2NODA-MPAA(甲基苯基乙酸)。然后由树脂裂解肽，并通过RP-HPLC来纯化以得到44.8mg的IMP485。
脂来在Sieber酰胺树脂上制备IMP485：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH；Trt-HSG-OH、Aloc被裂 解；Fmoc-D-Tyr(But)-OH；Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH；Trt-HSG-OH、Aloc 被 裂 解；(叔 丁基)2NODA-MPAA(甲基苯基乙酸)。然后由树脂裂解肽，并通过RP-HPLC来纯化以得到44.8mg的IMP485。
[0517] 双-叔丁基-NODA-MPAA的合成：用于IMP485合成的(tBu)2NODA-MPAA
[0518] 在0 ℃ 下 向 在 CH3CN(无 水 )(50mL) 中 的4-( 溴 甲 基 ) 苯 基 乙 酸(Aldrich310417)(0.5925g,2.59mmol)溶液在1小时内逐滴加入在CH3CN(50mL)中的NO2AtBu(1.0087g,2.82mmol)溶液。在4小时之后，将无水K2CO3(0.1008g,0.729mmol)加入至反应混合物，并使在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发，并通过制备型RP-HPLC来纯化粗品混合物以得到白色固体(0.7132g,54.5%)。
[0519]
[0520] 尽管这是一步合成，但由于通过4-(溴甲基)苯乙酸对产物的酯化，产率低。使用(4-溴甲基)苯基乙酸甲酯对NO2AtBu的烷基化用于防止酯化(图14)。
[0521] 18F-标记
[0522] 对于在水中18F标记研究，向40nmol的IMP479/485/487(使用海藻糖+抗坏血酸18 - 18 -
+AlCl3配制)中加入250μL F 溶液[约919-1112μCi的 F]，并且加热至101℃持续15分钟。在乙醇中，向40nmol的IMP479/485/487(使用海藻糖+抗坏血酸+AlCl3配制)加
18 - 18 -
入250μL F 溶液[1.248-1.693mCi的 F]、100μL EtOH，并且加热至101℃持续15分钟。
显示不同肽的标记的示例性试验示出在表14中。经最小优化，观察到IMP485的放射性标记具有至多88%产率和2,500Ci/mmol的比活性。在该比活性下，对于使用放射性标记的肽的体内PET显像，无需放射性标记的肽的HPLC纯化。
+AlCl3配制)中加入250μL F 溶液[约919-1112μCi的 F]，并且加热至101℃持续15分钟。在乙醇中，向40nmol的IMP479/485/487(使用海藻糖+抗坏血酸+AlCl3配制)加
18 - 18 -
入250μL F 溶液[1.248-1.693mCi的 F]、100μL EtOH，并且加热至101℃持续15分钟。
显示不同肽的标记的示例性试验示出在表14中。经最小优化，观察到IMP485的放射性标记具有至多88%产率和2,500Ci/mmol的比活性。在该比活性下，对于使用放射性标记的肽的体内PET显像，无需放射性标记的肽的HPLC纯化。
[0523] 表14.IMP479、IMP485和IMP487的标记
[0524] HLB纯化之后的分离产率
[0525]
[0526] 血清中的稳定性
[0527] 使用在200 μL盐水中纯化的18F-使调节至pH 3.9的含有40 nmol的IMP485或IMP487、20 nmol AlCl3、0.1 mg抗坏血酸和0.1 g海藻糖的试剂盒复水，并加热至106℃持续15分钟。然后用800 μL水来稀释反应混合物，并将混合物放置在HLB柱上。在洗涤之18
后，用2 x200μL1:1EtOH/H2O来洗脱柱以得到分离产率为64.6%的纯化的Al F(IMP485)。
将50μL的放射性标记的肽与250μL的新鲜人血清在小瓶中混合，并在37℃下孵育。 [0528] 在测试的四小时内在37℃下两种放射性标记的肽在新鲜人血清中稳定(未显示)。
后，用2 x200μL1:1EtOH/H2O来洗脱柱以得到分离产率为64.6%的纯化的Al F(IMP485)。
将50μL的放射性标记的肽与250μL的新鲜人血清在小瓶中混合，并在37℃下孵育。 [0528] 在测试的四小时内在37℃下两种放射性标记的肽在新鲜人血清中稳定(未显示)。
[0529] 填充剂对冻干肽的产率的作用
[0530] 使用具有在200微升的盐水中用2 mCi的F-18(来自F-18的相同批次)标记的不同填充剂的IMP485试剂盒(40 nmol)来进行试验以比较产率。以200微升/小瓶的剂量以在水中5重量%的浓度引入填充剂。我们测试作为填充剂的山梨醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇和甘氨酸。结果显示在表15中。
[0531] 表15.填充剂对放射性标记产率的作用
[0532]填充剂 活性mCi 产率%
山梨醇 2.17 82.9
甘氨酸 2.17 41.5
甘露醇 2.11 81.8
蔗糖 2.11 66.1
海藻糖 2.10 81.3
山梨醇 2.17 82.9
甘氨酸 2.17 41.5
甘露醇 2.11 81.8
蔗糖 2.11 66.1
海藻糖 2.10 81.3
[0533] 山梨醇、甘露醇和海藻糖均给予相同产率的放射性标记的产物。甘露醇试剂盒和海藻糖试剂盒均形成良好团块。蔗糖试剂盒和甘氨酸试剂盒均具有显著更低产率。我们最近也测试作为填充剂的2-羟丙基-β-环糊精并且对于40nmol试剂盒获得58%的产率。我们发现，放射性标记对pH非常敏感并且需要根据配体并且甚至可能是肽+配体来调整。
在IMP485的情况下，最佳pH是pH4.0±0.2，而IMP467的最佳pH是pH4.5±0.5。在两种情况下，产率快速下降至理想pH范围外。
在IMP485的情况下，最佳pH是pH4.0±0.2，而IMP467的最佳pH是pH4.5±0.5。在两种情况下，产率快速下降至理想pH范围外。
[0534] 标记的时间过程
[0535] 检查 IMP485的 标记 的 时 间过 程。 向40nmol的IMP485( 使用 海 藻 糖18 -
+AlCl3(20nmol)+抗坏血酸配制)加入约200-250μL F 溶液(0.9%盐水)，并且加热至
104℃持续5至15分钟。标记产率的结果为：5分钟(28.9%)；10分钟(57.9%)；15分钟(83.7%)和30分钟(88.9%)。因此，标记的时间过程为约15分钟。
+AlCl3(20nmol)+抗坏血酸配制)加入约200-250μL F 溶液(0.9%盐水)，并且加热至
104℃持续5至15分钟。标记产率的结果为：5分钟(28.9%)；10分钟(57.9%)；15分钟(83.7%)和30分钟(88.9%)。因此，标记的时间过程为约15分钟。
[0536] 单独的IMP485的生物分布
[0537] 检查在携带有小BXPC3胰腺癌异种移植物或者没有BXPC3胰腺癌异种移植物的雌性Taconic裸小鼠(10周龄)中不存在任何预靶向抗体下IMP485的生物分布。对小鼠静18 -9
脉内注射Al F(IMP485),(在盐水中100μL340μCi,2.29x10 mol)。在注射之后30分钟和90分钟时尸体解剖每时间点6只小鼠。在不存在预靶向抗体下，在肿瘤和大部分正常组织中见到低水平的累积。在膀胱中发现大量放射性标记物，并且在肾脏中范围更小。在90分钟时间点之前清除大部分活性。
脉内注射Al F(IMP485),(在盐水中100μL340μCi,2.29x10 mol)。在注射之后30分钟和90分钟时尸体解剖每时间点6只小鼠。在不存在预靶向抗体下，在肿瘤和大部分正常组织中见到低水平的累积。在膀胱中发现大量放射性标记物，并且在肾脏中范围更小。在90分钟时间点之前清除大部分活性。
[0538] 用TF2DNL靶向分子来预靶向IMP485
[0539] IMP485放射性标记-将18F-(218mCi)纯化以分离145.9mCi。将纯化的18F-(135mCi)加入到含有40nmol的预络合的Al(IMP485)的冻干小瓶中。在110℃下将反应小瓶加热17分钟。在HLB纯化之前，将 水(0.8mL)加入到反应混合物。用0.6mL的水:乙醇(1:1)混合物来洗脱产物(22mCi)至含有冻干的抗坏血酸的小瓶内。用盐水来稀释产物。用于注射18
的Al F(IMP485)比活性为550Ci/mmol。
的Al F(IMP485)比活性为550Ci/mmol。
[0540] 单独的Al18F(IMP485)的生物分布-对携带有皮下LS174T异种移植物的小鼠注射18 -11
Al F(IMP485)(28μCi,5.2x10 mol,100μL)。在注射之后1小时和3小时对小鼠进行尸体解剖，每时间点下6只小鼠。
Al F(IMP485)(28μCi,5.2x10 mol,100μL)。在注射之后1小时和3小时对小鼠进行尸体解剖，每时间点下6只小鼠。
[0541] 用20:1bsMAb与肽比率的预靶向的TF2+Al18F(IMP485)的生物分布-对携带-9有皮下LS174T异种移植的小鼠注射TF2(163.2μg,1.03x10 mol，静脉内)，并在注射
18 -11
Al F(IMP485)(28μCi,5.2x10 mol,100μL静脉内)之前使可清除16.3小时。在注射之后1小时和3小时对小鼠进行尸体解剖，每时间点下7只小鼠。
18 -11
Al F(IMP485)(28μCi,5.2x10 mol,100μL静脉内)之前使可清除16.3小时。在注射之后1小时和3小时对小鼠进行尸体解剖，每时间点下7只小鼠。
[0542] 尿稳定性-对携带有皮下Capan-1异种移植物的10只小鼠注射Al18F(IMP485)(400μCi，在盐水中，100μL)。在注射之后55分钟从3只小鼠收集的尿液。通过反相和SE-HPLC来分析尿样本。观察尿中放射性标记的IMP485的稳定性。
[0543] 表16.注射之后1小时单独的Al18F(IMP485)：
[0544]18
[0545] 表17.注射之后3小时单独的Al F(IMP485)：
[0546]
[0547] 表18.肽注射之后1小时，TF2+Al18F(IMP485)：
[0548]
[0549] 表19.肽注射之后3小时，TF2+Al18F(IMP485)：
[0550]
[0551] 结论
[0552] IMP485标记与IMP467相当或者IMP485标记优于IMP467，其中血清中稳定性相18
当。然而，IMP485比IMP467更容易合成。初步 研究显示，冻干的IMP485的 F-标记与非冻干的肽作用相当(数据未显示)。检查在将螯合部分连接至肽的其余部分的接头中烷基或芳基的存在。相对于接头中烷基的存在，接头中芳基的存在似乎增加放射性标记产率。 [0553] 在存在或不存在预靶向抗体下IMP485的生物分布类似于IMP467所观察到的分布。在不存在预靶向抗体下，在肿瘤和大部分正常组织中放射性标记的肽的分布低，并且肽通过肾排泄由循环中移除。在TF2抗体的存在下，发现放射性标记的IMP485主要在肿瘤中，而在正常组织中分布少。在预靶向抗体的存在下，肾放射性标记基本上降低。我们得出结
18
论，接头中具有芳基的IMP485和其他肽非常适合于使用 F-标记的PET显像。
当。然而，IMP485比IMP467更容易合成。初步 研究显示，冻干的IMP485的 F-标记与非冻干的肽作用相当(数据未显示)。检查在将螯合部分连接至肽的其余部分的接头中烷基或芳基的存在。相对于接头中烷基的存在，接头中芳基的存在似乎增加放射性标记产率。 [0553] 在存在或不存在预靶向抗体下IMP485的生物分布类似于IMP467所观察到的分布。在不存在预靶向抗体下，在肿瘤和大部分正常组织中放射性标记的肽的分布低，并且肽通过肾排泄由循环中移除。在TF2抗体的存在下，发现放射性标记的IMP485主要在肿瘤中，而在正常组织中分布少。在预靶向抗体的存在下，肾放射性标记基本上降低。我们得出结
18
论，接头中具有芳基的IMP485和其他肽非常适合于使用 F-标记的PET显像。
[0554] 实施例28.用于显像的IMP485的试剂盒配制
[0555] 我们报道使用18F标记肽的简单、一般试剂盒配制。含有连接至甲基苯基乙酸2+
(MPAA)基团的1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二醋酸盐(NODA)的配体用于形成具有(AlF)
18 -
的单一稳定复合物。冻干的试剂盒含有IMP485、用于预靶向的di-HSG半抗原肽。用 F 的水溶液使试剂盒复水，在100-110℃下加热15分钟，随后通过固相萃取(SPE)来快速纯化。检查在携带有用抗-CEACAM5双特异性抗体预靶向的人结肠癌异种移植物的裸小鼠中
18
Al F(IMP485)的体外和体内稳定性和肿瘤靶向。也评估MPAA-铃蟾素和促生长素抑制素
18
肽的 F-标记。
(MPAA)基团的1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二醋酸盐(NODA)的配体用于形成具有(AlF)
18 -
的单一稳定复合物。冻干的试剂盒含有IMP485、用于预靶向的di-HSG半抗原肽。用 F 的水溶液使试剂盒复水，在100-110℃下加热15分钟，随后通过固相萃取(SPE)来快速纯化。检查在携带有用抗-CEACAM5双特异性抗体预靶向的人结肠癌异种移植物的裸小鼠中
18
Al F(IMP485)的体外和体内稳定性和肿瘤靶向。也评估MPAA-铃蟾素和促生长素抑制素
18
肽的 F-标记。
[0556] 用作为单一异构体复合物的18F-以高产率(50-90%)和高比活性(至多153GBq/μmol)在30分钟内标记HSG肽。在37℃下它在人血清中稳定4小时，并且在体内显示在18
骨骼中低摄取(0.06%±0.02ID/g)。在3小时时，预靶向的动物具有高Al F(IMP485)肿瘤摄取(26.5%±6.0ID/g)，肾脏、肝脏、血液和骨骼的比率分别为12±3；189±43；1240±490和502±193。以相当的产率标记铃蟾素和奥曲肽类似物。总之，可在简单一步试剂盒中将
18 18
F-标记的肽制备为具有良好放射化学产率和高 比活性的稳定、单一[Al F]复合物。 [0557] 试剂清单
骨骼中低摄取(0.06%±0.02ID/g)。在3小时时，预靶向的动物具有高Al F(IMP485)肿瘤摄取(26.5%±6.0ID/g)，肾脏、肝脏、血液和骨骼的比率分别为12±3；189±43；1240±490和502±193。以相当的产率标记铃蟾素和奥曲肽类似物。总之，可在简单一步试剂盒中将
18 18
F-标记的肽制备为具有良好放射化学产率和高 比活性的稳定、单一[Al F]复合物。 [0557] 试剂清单
[0558] 试剂由以下来源获得：醋酸(JT Baker6903-05或9522-02)；氢氧化钠(Aldrich半导体级99.99%30,657-6)；α,α-海藻糖(JT Baker4226-04)；氯化铝六水合物(Aldrich99%237078)；抗坏血酸(Aldrich25,556-4)。
[0559] 醋酸盐缓冲液2mM-用200mL水来稀释醋酸,22.9μL(4.0x10-4mol)，然后用6N NaOH(约15μL)来中和以调节溶液至pH4.22。
[0560] 铝溶液2mM-将铝六水合物,0.0225g(9.32x10-5mol)溶解在47mL DI水中。 [0561] α,α-海藻糖溶液-将α,α-海藻糖,4.004g溶解在40mL DI水中以制备10%溶液。
[0562] 肽溶液，IMP4852mM-将肽IMP485(0.0020g,1.52μmol)溶解在762μL的2mM醋酸盐缓冲液中。pH是2.48(将肽冻干为TFA盐)。通过加入4.1μL的1M NaOH来将肽溶液的pH调节至pH4.56。
[0563] 抗坏血酸溶液5mg/mL-将抗坏血酸，0.0262g(1.49x10-4mol)溶解在5.24mL DI水中。
[0564] 肽试剂盒的配制
[0565] 将肽，20μL(40nmol)与12μL(24nmol)的Al、100μL的海藻糖、 (0.1mg)抗坏血酸和 的DI水在3mL冻干小瓶中混合。溶液的最终pH为约pH4.0。将小瓶冷冻、冻干和在真空下密封。制备10和20nmol试剂盒。这些试剂盒与40nmol试剂盒制备相同，保持肽与Al3+比例为1肽比0.6Al3+，但在具有0.5mL总填充量的2mL小瓶中配制。 [0566] 18F-的纯化
[0567] 将粗品18F-容纳在注射器的2mL的DI水中。将注射器放置在注射泵上，并使液体通过Waters CM柱体，随后通过QMA柱体。用10mL DI水洗涤两柱体。打开在两柱体之间无菌一次性三通阀，并使1mL市售无菌盐水以200μL级分通过QMA柱体。无论施加的18F-的量为多少(测试10-300mCi加载量)，第二部分通常含有约80%的18F-。
[0568] 我们可选择地使用在盐水中的市售18F-，将其在QMA柱体上纯化。这是市售骨骼显像剂的浓缩形式，使得它容易获得以及用于人中。在0.5mL结核菌素注射器中以200μL提供活性。
[0569] 放射性标记
[0570] 通过在弯曲密封小瓶中将200μL盐水中的18F-加入至冻干肽、然后加热溶液至90-110℃持续15分钟来放射性标记肽。通过将1mL注射器中800mL的DI水加入至反应小瓶，用1mL注射器去除液体以及将液体施加至Waters HLB柱(1cc,30mg)来纯化肽。将HLB柱放置在弯曲密封5mL小瓶上，并通过远处(使用无菌一次性线)10mL注射器在真空下将液体抽入小瓶内。用两次1mL等份的DI水来洗涤反应小瓶，还抽吸使其通过柱。然后再用
1mL的DI水来洗涤柱。然后将柱子移动至含有缓冲的冻干抗坏血酸(约pH5.5,15mg)的小瓶。使用三次1:1EtOH/DI水的200μL部分来洗脱放射性标记的产物。通过测定在HLB柱体上、在反应小瓶中、在洗涤水中和在产物小瓶中活性来测定产率，从而得到产率百分比。 [0571] 将乙醇加入至放射性标记反应可增加标记产率。用盐水中200μL 18F-和200μL乙醇的混合物可使20nmol试剂盒复水。然后将溶液在弯曲密封的小瓶中加热至110℃持续
16分钟。在加热之后，将0.8mL的水加入至反应小瓶，并使用注射器去除活性，然后放置在含有2mL的DI水的稀释小瓶中。用2x1mL DI水洗涤反应小瓶，并将各洗涤液加入至稀释小瓶。将在稀释小瓶中的溶液以1-mL等份施加至HLB 柱。然后用2x1-mL水来洗涤柱和稀释小瓶。然后用3x200μL的1:1乙醇/水以不同级分由柱洗脱放射性标记的肽。肽可以良好的产率标记并且使用该方法达至多4,100Ci/mmol比活性。
1mL的DI水来洗涤柱。然后将柱子移动至含有缓冲的冻干抗坏血酸(约pH5.5,15mg)的小瓶。使用三次1:1EtOH/DI水的200μL部分来洗脱放射性标记的产物。通过测定在HLB柱体上、在反应小瓶中、在洗涤水中和在产物小瓶中活性来测定产率，从而得到产率百分比。 [0571] 将乙醇加入至放射性标记反应可增加标记产率。用盐水中200μL 18F-和200μL乙醇的混合物可使20nmol试剂盒复水。然后将溶液在弯曲密封的小瓶中加热至110℃持续
16分钟。在加热之后，将0.8mL的水加入至反应小瓶，并使用注射器去除活性，然后放置在含有2mL的DI水的稀释小瓶中。用2x1mL DI水洗涤反应小瓶，并将各洗涤液加入至稀释小瓶。将在稀释小瓶中的溶液以1-mL等份施加至HLB 柱。然后用2x1-mL水来洗涤柱和稀释小瓶。然后用3x200μL的1:1乙醇/水以不同级分由柱洗脱放射性标记的肽。肽可以良好的产率标记并且使用该方法达至多4,100Ci/mmol比活性。
[0572] 当用1.0mCi的18F-标记时，如所述该试剂盒和标记的产率达80-90%。当使用更高剂量的18F-(约100mCi)时，产率下降。然而，如果将乙醇加入至标记混合物，则产率上升。如果肽在盐水中稀释过多，则产率下降。标记也对pH敏感。对于我们使用该配体的肽，发现最终配制物的最佳pH为pH4.0±0.2。
[0573] 将在50μL1:1EtOH/H2O中纯化的放射性标记的肽与150μL的人血清混合，然后放置在HPLC自动进样器中，加热至37℃，并通过RP-HPLC来分析。即使在4小时之后在空18
隙体积处未观察到超过背景的可检测的 F。
隙体积处未观察到超过背景的可检测的 F。
[0574] 表20.IMP485标记
[0575]
[0576] IMP486:Al-OH(IMP485)的合成和放射性标记
[0577] 将IMP485(21.5mg,0.016mmol) 溶 解 在 1mL 的 2mM NaOAc(pH4.4) 中，并 用AlCl3.6H2O(13.2mg,0.055mmol)来处理。将pH调节至4.5-5.0，并使反应混合物回流15分钟。通过制备型RP-HPLC来纯化粗品混合物以得到白色固体(11.8mg)。
[0578] 在配制为冻干的试剂盒之后，也以极好产率放射性标记预填充 Al(NODA)的复合物(IMP486)。当在盐水中标记时，用IMP486(表21)的标记产率与(表20)相当或比IMP485试剂盒更好。用铝预加载的螯合剂的放射性标记的高效率尚未在经测试的任何其他Al(NOTA)复合物中观察到(数据未显示)。在盐水中和在1:1乙醇/水中标记相当，使用其他螯合部分也未观察到标记产率(未显示)。
[0579] 表21.IMP486标记
[0580]
[0581] 填充剂的作用
[0582] 进行试验来比较使用具有不同填充剂的IMP485试剂盒(40nmol)的产率。使用在18 - 18 -
200微升盐水中来自相同批次的 F 的2mCi的 F 来标记肽。以5重量%的浓度、200微升/小瓶的剂量将填充剂引入水中。我们测试作为填充剂的山梨醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇和甘氨酸。结果显示在表22中。
200微升盐水中来自相同批次的 F 的2mCi的 F 来标记肽。以5重量%的浓度、200微升/小瓶的剂量将填充剂引入水中。我们测试作为填充剂的山梨醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇和甘氨酸。结果显示在表22中。
[0583] 表22.填充剂对放射性标记产率的作用(参照表15)
[0584]填充剂 活性mCi 产率%
山梨醇 2.17 82.9
甘氨酸 2.17 41.5
甘露醇 2.11 81.8
蔗糖 2.11 66.1
海藻糖 2.10 81.3
山梨醇 2.17 82.9
甘氨酸 2.17 41.5
甘露醇 2.11 81.8
蔗糖 2.11 66.1
海藻糖 2.10 81.3
[0585] 山梨醇、甘露醇和海藻糖所有均以相同产率提供放射性标记的产物。蔗糖试剂盒和甘氨酸试剂盒具有显著更低的产率。当在200μL中复水时，将2.5%至50重量%的浓度的海藻糖配制成IMP485试剂 盒。对于所有浓度，均获得相同的放射性标记产率，约83%，18
这表明IMP485的 F-放射性标记对海藻糖填充剂的浓度不敏感。在冻干之前在氮气下将IMP485试剂盒配制和保存在2-8℃下至多三天以评估冻干延缓对放射性标记的影响。放射性标记试验表明，在计时起点时产率均为约80%，并且在冻干之前延缓1、2、和3天。 [0586] 在制备过程中通常将抗坏血酸和龙胆酸加入到放射性药物以最小化辐射分解。当在pH4.1-4.2下使用0.1、0.5和1.0mg的抗坏血酸配制IMP485(20nmol)以及在200μL盐
18 -
水中用 F 标记时，最终产率分别为51、31和13%分离产率，这表明0.1mg的抗坏血酸是在没有降低产率下可包括在配制物中最大量。包含龙胆酸的配制物未标记好。作为确保标记后稳定性的另外的方式，也在用于分离HLB纯化的产物的小瓶中包括抗坏血酸。IMP485与
3+
Al 比率在1:0.6下呈现出最佳，但从1:0.5的比率至至多1:1的比率获得良好产率。放-4
射性标记反应也对肽浓度敏感，在1x10 M和更高的浓度下获得良好产率。
这表明IMP485的 F-放射性标记对海藻糖填充剂的浓度不敏感。在冻干之前在氮气下将IMP485试剂盒配制和保存在2-8℃下至多三天以评估冻干延缓对放射性标记的影响。放射性标记试验表明，在计时起点时产率均为约80%，并且在冻干之前延缓1、2、和3天。 [0586] 在制备过程中通常将抗坏血酸和龙胆酸加入到放射性药物以最小化辐射分解。当在pH4.1-4.2下使用0.1、0.5和1.0mg的抗坏血酸配制IMP485(20nmol)以及在200μL盐
18 -
水中用 F 标记时，最终产率分别为51、31和13%分离产率，这表明0.1mg的抗坏血酸是在没有降低产率下可包括在配制物中最大量。包含龙胆酸的配制物未标记好。作为确保标记后稳定性的另外的方式，也在用于分离HLB纯化的产物的小瓶中包括抗坏血酸。IMP485与
3+
Al 比率在1:0.6下呈现出最佳，但从1:0.5的比率至至多1:1的比率获得良好产率。放-4
射性标记反应也对肽浓度敏感，在1x10 M和更高的浓度下获得良好产率。
[0587] pH对放射性标记的作用
[0588] pH对IMP485的放射性标记的作用显示在表23中。标记的效率对pH敏感，并在相比约4.0的最佳pH更高或更低pH下降低。
[0589] 表23.pH对IMP485放射性标记效率的作用
[0590]pH 产率%
3.27 33
3.53 61
3.84 85
3.99 88
4.21 89
4.49 80
5.07 14
3+
3.27 33
3.53 61
3.84 85
3.99 88
4.21 89
4.49 80
5.07 14
3+
[0591] 总之，这些研究得到含有调节至4.0±0.2的具有20nmol IMP485、12纳摩尔Al 、0.1mg抗坏血酸和10mg海藻糖的0.5mL的无菌溶液的最终配制的试剂盒，然后将其冻干。 [0592] 生物分布
[0593] 在携带有皮下LS174T肿瘤异种移植物的Taconic裸小鼠中进行生物分布研究。18
[0594] 单独的Al F(IMP485)：对携带有皮下皮下LS174T异种移植物的小鼠注射18 -11
Al F(IMP485)(28μCi,5.2x10 mol,100μL,静脉内)。在注射之后1小时和3小时对小鼠进行尸体解剖，每时间点下6只小鼠。
18
Al F(IMP485)(28μCi,5.2x10 mol,100μL,静脉内)。在注射之后1小时和3小时对小鼠进行尸体解剖，每时间点下6只小鼠。
18
[0595] 在20:1bsMab与肽比率下的TF2+Al F(IMP485)预靶向：对携带有皮下LS174T异-9 18种移植物的小鼠注射TF2(163.2μg,1.03x10 mol,静脉内)，并使得在注射Al F(IMP485)-11
(28μCi,5.2x10 mol,100μL,静脉内)之前清除16.3小时。在注射之后1小时和3小时对小鼠进行尸体解剖，每时间点下7只小鼠。
(28μCi,5.2x10 mol,100μL,静脉内)之前清除16.3小时。在注射之后1小时和3小时对小鼠进行尸体解剖，每时间点下7只小鼠。
[0596] 表24.在携带有LS174T人结肠癌异种移植物的裸小鼠中在肽注射之后1小时和18 18
3小时时TF2预靶向的Al F(IMP485)或单独的Al F(IMP485)的生物分布
3小时时TF2预靶向的Al F(IMP485)或单独的Al F(IMP485)的生物分布
[0597]
[0598]
[0599] IMP492或Al19F(IMP485)的合成
[0600] 将IMP485(16.5mg,0.013mmol)溶解在1mL的2mM NaOAc(pH4.43)，0.5mL乙醇中并且用AlF3.3H2O(2.5mg,0.018mmol)来处理。将pH调节至4.5-5.0，然后将反应混合物回流15分钟。一旦冷却，则再次将pH增加至4.5-5.0，然后将反应混合物回流15分钟。通过制备型RP-HPLC来纯化粗品以得到白色固体(10.3mg)。
[0601] IMP490的合成
[0602] NODA-MPAA-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Throl(SEQ IDNO:52)
[0603] 用以 下顺序 添加 的氨基 酸在 苏氨醇 上合 成肽：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(But)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH和(tBu)2NODA-MPAA。然后将肽裂解，并通过制备型RP-HPLC来纯化。通过用DMSO处理双硫醇肽来环化肽。
[0604] IMP491或Al19F(IMP490)的合成
[0605] 如上(IMP492)所述制备Al19F(IMP490)，从而在HPLC纯化之后制备所需肽。 [0606] IMP493的合成
[0607] NODA-MPAA-(PEG)3-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(S EQ ID NO:53) [0608] 用以下顺序添加的氨基酸在Sieber酰胺树脂上合成肽：Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、
Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-NH-(PEG)3-COOH和(tBu)2NODA-MPAA。然后将肽裂解，并通过制备型RP-HPLC来纯化。
Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-NH-(PEG)3-COOH和(tBu)2NODA-MPAA。然后将肽裂解，并通过制备型RP-HPLC来纯化。
[0609] IMP493的Al19F复合物的亲和力为EC50=183nm比对125I-铃蟾素的EC50=59nm。用18 - 18 -
约100MBq的 F 放射标记的IMP493试剂盒具有70%产率。用100MBq的 F 放射性标记的
18 -
IMP490得到80%产率，当使用2.11GBq F 时，其降低至65%。使用HPLC，肽洗脱为在15.4分钟下放射性标记的单峰(未显示)。
约100MBq的 F 放射标记的IMP493试剂盒具有70%产率。用100MBq的 F 放射性标记的
18 -
IMP490得到80%产率，当使用2.11GBq F 时，其降低至65%。使用HPLC，肽洗脱为在15.4分钟下放射性标记的单峰(未显示)。
[0610] IMP494或Al19F(IMP493)的合成
[0611] 如上所述(IMP492)制备Al19F(IMP493)，从而在HPLC纯化之后制备所需肽。 [0612] 实施例29.使用Al18F的其他辅基标记方法
[0613] 在某些实施方案中，对于对热敏感的分子，可使用辅基标记方法来进行氟化铝标记方法。对于热敏性分子可在较低温度下进行辅基缀合。
[0614] 如上所述用18F来标记辅基NOTA，然后使它连接靶向分子。在一个非限制性例子中，使用醛NOTA来进行这个，然后使醛NOTA它连接在靶向分子上的氨基-氧化合物。可选择地，使氨基-氧马来酰亚胺与醛反应，然后使马来酰亚胺连接在靶向分子上的半胱氨酸(Toyokuni等，2003,Bioconj Chem14:1253)。
[0615] 在另一可选择处，通过点击化学使AlF-螯合剂复合物连接靶向分子。如上所述首18 18
先用Al F来标记配体。然后通过点击化学反应使 Al F-螯合物与靶向分子缀合。例如，根据Marik和Stucliffe(2006,Tetrahedron Lett47:6681)来标记炔烃NOTA，并且使其与含有叠氮的靶向剂缀合。
先用Al F来标记配体。然后通过点击化学反应使 Al F-螯合物与靶向分子缀合。例如，根据Marik和Stucliffe(2006,Tetrahedron Lett47:6681)来标记炔烃NOTA，并且使其与含有叠氮的靶向剂缀合。
[0616] 在盐水中具有18F-的试剂盒的放射性标记
[0617] 如上所述使18F-(0.01mCi或更高)容纳在0.5mL注射器中200μL的盐水中，然后将溶液与200μL的乙醇混合，并注入冻干的试剂盒内。在100-110℃下将溶液在弯曲密封容器中加热15分钟。用3mL水稀释溶液，然后通过HLB柱体洗脱。用2x1mL部分的水来洗涤反应小瓶和柱体，然后使用在0.5mL级分中的1:1乙醇水将产物洗脱至含有缓冲的抗坏血酸的小瓶内。在惰性气流下可将一些乙醇蒸发。然后在注射之前将溶液稀释在盐水中，并通过0.2μm无菌过滤器。
[0618] 实施例30.用于18F-标记的NOTA的马来酰亚胺缀合物
[0619] 以上实施例描述18F-标记的新型方法，其使用结合在肽上来源于NOTA的配体捕获18 2+
([ F]AlF) 复合物。这些标记的肽体内稳定并保留它们的结合能力(McBride等，2009,J.Nucl.Med.50,991-998;McBride 等，2010,Bioconjug.Chem.21,1331-1340；Laverman 等，
2010,J.Nucl.Med.51,454-461；McBride等，2011,J.Nucl.Med.52(增刊1),313-314P(摘要1489))。尽管该方法使得肽可在30分钟内以简单的一步放射性氟化，但它需要将试剂加热至约100℃，这对大部分蛋白质和一些肽来说并不合适。我们以及其他人员已经发现，与一些烷基和羧基取代基相比，连接NODA的三氮杂环壬烷环的一个氮原子的芳香基
18 2+
可增加([ F]AlF) 络合的产率(D'Souza等，2011,Bioconjug.Chem.1793-1803；McBride等，2010,Bioconjug.Chem.21,1331-1340；Shetty 等，2011,Chem.Comm.DOI:10.1039/c1cc13151f)。在本实施例中，我们探索使用含有连接甲基苯乙酸基(MPAA)的1,4,7-三氮
18 2+ 18 2+
杂环壬烷-1,4-二醋酸盐(NODA)的新的([ F]AlF) -结合配体来标记具有([ F]AlF)的热不稳定化合物的可能性。将其与N-(2-氨基乙基)马来 酰亚胺(N-AEM)缀合以形成
18 2+
NODA-MPAEM。(合成的细节示出在图15中)。在105℃下用([ F]AlF) 以49-82%产率标记NODA-MPAEM，并且在室温下使其与抗体Fab’片段以69-80%产率缀合(总时间约50分
18
钟)，并保留放射反应性。这些数据表明，快速和简单的[Al F]-标记方法可快速简便地并
18
以高产率适于制备具有 F的热敏化合物。
([ F]AlF) 复合物。这些标记的肽体内稳定并保留它们的结合能力(McBride等，2009,J.Nucl.Med.50,991-998;McBride 等，2010,Bioconjug.Chem.21,1331-1340；Laverman 等，
2010,J.Nucl.Med.51,454-461；McBride等，2011,J.Nucl.Med.52(增刊1),313-314P(摘要1489))。尽管该方法使得肽可在30分钟内以简单的一步放射性氟化，但它需要将试剂加热至约100℃，这对大部分蛋白质和一些肽来说并不合适。我们以及其他人员已经发现，与一些烷基和羧基取代基相比，连接NODA的三氮杂环壬烷环的一个氮原子的芳香基
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可增加([ F]AlF) 络合的产率(D'Souza等，2011,Bioconjug.Chem.1793-1803；McBride等，2010,Bioconjug.Chem.21,1331-1340；Shetty 等，2011,Chem.Comm.DOI:10.1039/c1cc13151f)。在本实施例中，我们探索使用含有连接甲基苯乙酸基(MPAA)的1,4,7-三氮
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杂环壬烷-1,4-二醋酸盐(NODA)的新的([ F]AlF) -结合配体来标记具有([ F]AlF)的热不稳定化合物的可能性。将其与N-(2-氨基乙基)马来 酰亚胺(N-AEM)缀合以形成
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NODA-MPAEM。(合成的细节示出在图15中)。在105℃下用([ F]AlF) 以49-82%产率标记NODA-MPAEM，并且在室温下使其与抗体Fab’片段以69-80%产率缀合(总时间约50分
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钟)，并保留放射反应性。这些数据表明，快速和简单的[Al F]-标记方法可快速简便地并
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以高产率适于制备具有 F的热敏化合物。
[0620] 双-叔丁基-NODA-MPAA NHS酯:(tBu)2NODA-MPAA NHS酯的合成
[0621] 向 在CH2Cl2(5mL)中 的(tBu)2NODA-MPAA(175.7mg,0.347mmol)的 溶 液 加 入347μL(0.347mmol)DCC(在CH2Cl2中1M)、42.5mg(0.392mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和
20μL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。在3小时之后，将DCU滤除，并蒸发掉溶剂。通过快速色谱法在(230-400筛目)硅胶凝胶上(CH2Cl2:MeOH,100:0比80:20)纯化粗品混合物以得+
到(128.3mg,61.3%)的NHS酯。经HRMS(ESI)的C31H46N4O8(M+H) 计算值为603.3388，测定值为603.3395。
20μL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。在3小时之后，将DCU滤除，并蒸发掉溶剂。通过快速色谱法在(230-400筛目)硅胶凝胶上(CH2Cl2:MeOH,100:0比80:20)纯化粗品混合物以得+
到(128.3mg,61.3%)的NHS酯。经HRMS(ESI)的C31H46N4O8(M+H) 计算值为603.3388，测定值为603.3395。
[0622] NODA-MPAEM:(MPAEM=甲基苯基乙酰氨基乙基马来酰亚胺)的合成
[0623] 向在CH2Cl2(5mL)中的(tBu)2NODA-MPAA NHS酯(128.3mg,0.213mmol)的溶液加入在250μL DMF和20μL DIEA中的52.6mg(0.207mmol))N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟醋酸盐的溶液。在3小时之后，将溶剂蒸发，然后用2mL TFA来处理浓缩物。用水来稀释粗品，然后通过制备型RP-HPLC来纯化以得到(49.4mg,45%)的所需产物。经HRMS(ESI)的C25H33N5O7(M+H)+的计算值为516.2453，测定值为516.2452。
[0624] NODA-MPAEM的18F-标记
[0625] 将溶解在2mM醋酸钠(pH4)中NODA-MPAEM配体(20nmol;10μL)与AlCl3(5μL的18 -
在2mM醋酸盐缓冲液中2mM溶液；200μL的 在盐水中 F(0.73和1.56GBq)和200μL的乙腈)混合。在105-109℃下加热15-20分钟之后，将800μL的去离子(DI)水加入反应溶液，然后将全部内容物移至含有1mL去离子(DI)水的小瓶(稀释小瓶)。用2x1mL DI水来洗涤反应小瓶，并加入稀释小瓶中。然后使粗品通过1-mL HLB柱，用2x1mL的DI水的级分来洗涤柱。使用3x200μL的1:1EtOH/水将标记的产物由柱洗脱。
在2mM醋酸盐缓冲液中2mM溶液；200μL的 在盐水中 F(0.73和1.56GBq)和200μL的乙腈)混合。在105-109℃下加热15-20分钟之后，将800μL的去离子(DI)水加入反应溶液，然后将全部内容物移至含有1mL去离子(DI)水的小瓶(稀释小瓶)。用2x1mL DI水来洗涤反应小瓶，并加入稀释小瓶中。然后使粗品通过1-mL HLB柱，用2x1mL的DI水的级分来洗涤柱。使用3x200μL的1:1EtOH/水将标记的产物由柱洗脱。
[0626] Al18F(NODA-MPAEM)与hMN-14Fab’的缀合
[0627] 通过胃蛋白酶消化，随后为通过TCEP(三(2-羧乙基)膦)还原来制备人源化MN-14抗-CEACAM5IgG(labetuzumab)的Fab’片段，然后配制至含有在5%海藻糖和0.025M醋酸钠(pH6.72)中1mg(20nmol)的Fab’(2.4硫醇/Fab’)的冻干试剂盒内。使用0.1mL18
PBS(pH7.01)使试剂盒复水，并与Al F(NODA-MPAEM)(600μL1:1EtOH/H2O)混合。在室温下孵育10分钟之后，将产物在在3-mL SEPHADEX G50-80旋转柱上于0.1M,pH6.5醋酸钠缓冲液中纯化(5分钟)。通过将在洗脱液中的活性量除以在洗脱液中的活性和柱上活性总量来计算分离产率。
PBS(pH7.01)使试剂盒复水，并与Al F(NODA-MPAEM)(600μL1:1EtOH/H2O)混合。在室温下孵育10分钟之后，将产物在在3-mL SEPHADEX G50-80旋转柱上于0.1M,pH6.5醋酸钠缓冲液中纯化(5分钟)。通过将在洗脱液中的活性量除以在洗脱液中的活性和柱上活性总量来计算分离产率。
[0628] 通过加入过量的CEA以及在SE-HPLC上分离，与单独的产物性能比较来分析纯化18
的产物的免疫反应性。通过RP-HPLC也分析产物以评估未结合的Al F(NODA-MPAEM)的百分比。
的产物的免疫反应性。通过RP-HPLC也分析产物以评估未结合的Al F(NODA-MPAEM)的百分比。
[0629]
[0630] 根据制造商说明书用在1mL盐水中的453MBq99mTcO4-Na+来标记含有1.2mg的-2IMMU-4，鼠抗-CEACAM5Fab’(抗-CEA,2.4x10 μmol)的 试剂盒，并在未进
一步纯化下使用。
一步纯化下使用。
[0631] 动物研究
[0632] 用 CaPan-1人 胰 腺 癌 (ATCC 登 记 号 HTB-79,Manassas,VA) 皮 下 接 种裸小鼠。当可见肿瘤时，对动物静脉内注射100μL的放射性标记 的Fab’。将18
Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’稀释在含有约2.8μg的Fab’的3.7MBq/100μL的盐
99m
水中。将 Tc-IMMU-4Fab’等份(16.9MBq)移除并用盐水(含有约2.8μg的Fab’的
0.85MBq/100μL)来稀释。在注射之后3小时对动物进行尸体解剖，取组织和肿瘤，称重，并连同由注射的产品制备的标准品通过γ闪烁法来计数。数据表示为每克注射剂量的百分比。
Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’稀释在含有约2.8μg的Fab’的3.7MBq/100μL的盐
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水中。将 Tc-IMMU-4Fab’等份(16.9MBq)移除并用盐水(含有约2.8μg的Fab’的
0.85MBq/100μL)来稀释。在注射之后3小时对动物进行尸体解剖，取组织和肿瘤，称重，并连同由注射的产品制备的标准品通过γ闪烁法来计数。数据表示为每克注射剂量的百分比。
[0633] 结果
[0634] 合成和试剂制备
[0635] 如图15中所示制备NODA-MPAEM，其中使(tBu)2NODA-MPAA与2-氨基乙基-马来酰亚胺偶联，然后脱保护以形成所需产物。用水来稀释粗品，并通过制备型RP-HPLC来纯化+以得到(49.4mg,45%)的所需产物[经HRMS(ESI)的C25H33N5O7(M+H) 计算值516.2453，测定值516.2452]。
[0636] 放射性标记
[0637] 将NODA-MPAEM(20nmol)与10nmol的Al3+混合，然后用在盐水中0.73GBq和18 - 18
1.56GBq的 F 来标记。在SPE纯化之后，Al F(NODA-MPAEM)的分离产率分别为82%和49%，其合成时间为约30分钟。在用于低和高剂量蛋白质标记的旋转柱纯化之后分别以74%和
18
80%产率来分离Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’缀合物。在50分钟内完成全部过程。对
18
于高剂量标记，纯化的Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’的比活性为19.5GBq/μmol，而对于低剂量标记为10.9GBq/μmol。
1.56GBq的 F 来标记。在SPE纯化之后，Al F(NODA-MPAEM)的分离产率分别为82%和49%，其合成时间为约30分钟。在用于低和高剂量蛋白质标记的旋转柱纯化之后分别以74%和
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80%产率来分离Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’缀合物。在50分钟内完成全部过程。对
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于高剂量标记，纯化的Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’的比活性为19.5GBq/μmol，而对于低剂量标记为10.9GBq/μmol。
[0638] 0.74-GBq试验的标记的蛋白质的SE-HPLC分析显示作为单峰的 18F-标记的Fab’，并且当加入过量CEA时所有活动转移(未显示)。在C4柱上的RP-HPLC分析显示在7.5分18
钟时洗脱的标记的马来酰亚胺标准品，而纯化的 F-蛋白在16.6分钟时洗脱(未显示)。
18
在旋转柱纯 化的产物中没有未结合的Al F(NODA-MPAEM)。
钟时洗脱的标记的马来酰亚胺标准品，而纯化的 F-蛋白在16.6分钟时洗脱(未显示)。
18
在旋转柱纯 化的产物中没有未结合的Al F(NODA-MPAEM)。
[0639] 血清稳定性
[0640] 将Al18F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’与新鲜人血清混合，并在37℃下孵育。在有和没有CEA下在3小时时间段内SE-HPLC分析显示产物稳定以及保持与CEA结合(未显示)。 [0641] 生物分布
[0642] 评 估 在 携 带 有 Capan-1 胰 腺 癌 异 种 移 植 物 的 裸 小 鼠 中18 99m
Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’和 Tc-IMMU-4鼠Fab’的生物分布。在注射之后3小时，两种试剂显示在肾脏中预期的高摄取，这是因为Fab’是由血液由肾脏滤除(表25)。在血液
18 99m
中[Al F]-Fab’浓度显著(P<0.0001)低于 Tc-Fab’，在肝脏和脾脏中具有相应增加的摄
18 99m
取。[Al F]-Fab’的更快的血液清除率可能是由于如与 Tc-Fab’相比更低肿瘤摄取(分别为2.8±0.3比对6.8±0.7)，但它也导致对氟化的Fab’相对更有利的肿瘤/血液比率
18
(分别为5.9±1.3比对0.9±0.1)。两种产物的骨骼摄取类似，这表明Al F(NODA)由Fab’紧紧吸附。
Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’和 Tc-IMMU-4鼠Fab’的生物分布。在注射之后3小时，两种试剂显示在肾脏中预期的高摄取，这是因为Fab’是由血液由肾脏滤除(表25)。在血液
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中[Al F]-Fab’浓度显著(P<0.0001)低于 Tc-Fab’，在肝脏和脾脏中具有相应增加的摄
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取。[Al F]-Fab’的更快的血液清除率可能是由于如与 Tc-Fab’相比更低肿瘤摄取(分别为2.8±0.3比对6.8±0.7)，但它也导致对氟化的Fab’相对更有利的肿瘤/血液比率
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(分别为5.9±1.3比对0.9±0.1)。两种产物的骨骼摄取类似，这表明Al F(NODA)由Fab’紧紧吸附。
[0643] 表25.在携带有Capan-1人胰腺癌异种移植物的裸小鼠中注射0.37MBq(约3μg)18 99m
的各缀合物后3小时时Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’和 Tc-IMMU-4Fab’的生物分布(N=6)。
的各缀合物后3小时时Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’和 Tc-IMMU-4Fab’的生物分布(N=6)。
[0644]
[0645]
[0646] 讨论
[0647] 我们制备在具有巯基的温度敏感性蛋白质或其他分子上用于连接硫醇的简单NODA-MPAEM配体。为了避免将热不稳定化合物暴露于高温下，首先将NODA-MPAEM与在盐水中的Al3+和18F-混合并且在100-115℃下加热15分钟以形成Al18F(NODA-MPAEM)中间体。取决于加入至固定量(20nmol)的NODA-MPAEM的活性量，以49-82%的分离产率(67.7±13.0%,n=5)通过SPE将该中间体快速纯化。然后使用旋转柱凝胶过滤程序在10-15分钟内使Al18F(NODA-MPAEM)与还原的Fab’有效地(69-80%分离产率,74.3±5.5,n=3))偶联，以分离放射性标记的蛋白，在该例子中为抗体Fab’片段。在约50分钟内完成全部两步骤程序，并且标记的产物保留它的分子完整性和免疫反应性。因此，建立延伸对热敏性化合物的[Al18F]标记工序的简化性的可行性。
[0648] 已经显示，[Al18F]-配体复合物在血清中体内非常稳定，并且在动物测试中，可观察到最少的骨骼摄取(McBride等，2009,J.Nucl.Med.50,991-998；D’Souza等，2011a,J.Nucl.Med.52(增刊1),171P(摘要577))。在该系列的研究中，与缀合至Fab’
18
的NODA-MPAEM化合物 缔合的 F在血清中体内稳定，并且缀合物保持与CEA结合。当注射至裸小鼠内时，在肿瘤中有选择性定位，其提供约6:1肿瘤/血液比率。对于
18 99m 18
Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’和 Tc-IMMU-4鼠Fab’，骨骼摄取类似，这再次反映 F或
18 99m 18
Al F复合物的体内稳定性。然而，如与 Tc-IMMU-4相比较，[Al F]-Fab’肝和脾摄取较高。可以不同方式修饰特定的NODA衍生物以适应与在肽或蛋白质上其他反应位点的缀合。
18
然而，这些特定衍生物的使用显示，Al F-标记工程序可适用于热不稳定化合物的使用。 [0649] 结论
18
的NODA-MPAEM化合物 缔合的 F在血清中体内稳定，并且缀合物保持与CEA结合。当注射至裸小鼠内时，在肿瘤中有选择性定位，其提供约6:1肿瘤/血液比率。对于
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Al F(NODA-MPAES)-hMN-14Fab’和 Tc-IMMU-4鼠Fab’，骨骼摄取类似，这再次反映 F或
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Al F复合物的体内稳定性。然而，如与 Tc-IMMU-4相比较，[Al F]-Fab’肝和脾摄取较高。可以不同方式修饰特定的NODA衍生物以适应与在肽或蛋白质上其他反应位点的缀合。
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然而，这些特定衍生物的使用显示，Al F-标记工程序可适用于热不稳定化合物的使用。 [0649] 结论
[0650] 在盐水中用18F-快速标记NODA-MPAEM，然后以高产率与免疫球蛋白Fab’蛋白缀合。标记方法仅使用廉价一次性纯化柱，同时不需要自动化装置进行标记和纯化，它很容易适用于该体系。因此，NODA-MPAEM衍生物确定，该或其他含有NODA的衍生物可扩展易于18 2+
([ F]AlF) 氟化至热不稳定化合物的能力。
([ F]AlF) 氟化至热不稳定化合物的能力。
[0651] 实施例31.NOTA-奥曲肽的改善的18F-标记
[0652] 该研究的目的是进一步改善用于NOTA-缀合的奥曲肽的18F-标记的快速一步方18
法。将奥曲肽与NOTA配体缀合，然后用 F以一步、一锅方法标记。如以上实施例中所述，
3+ 18 - 2+
将铝(Al )加入至 F，并将AlF 并入NOTA-奥曲肽。根据铝:NOTA比率、离子强度和温度来优化标记程序。测定放射化学产率和比活性。
法。将奥曲肽与NOTA配体缀合，然后用 F以一步、一锅方法标记。如以上实施例中所述，
3+ 18 - 2+
将铝(Al )加入至 F，并将AlF 并入NOTA-奥曲肽。根据铝:NOTA比率、离子强度和温度来优化标记程序。测定放射化学产率和比活性。
[0653] 在优化条件下，以98%产率用Al18F来一步标记NOTA-奥曲肽。在45分钟内进行包括纯化的放射性标记。观察到最佳标记产率的Al:NOTA比率为约1:20。更低比率导致标记效率降低。在醋酸钠(pH4.1)中0%、25%、50%、67%和80%乙腈的存在下标记效率分别为36%、43%、49%、70%和98%，这表明增加有机溶剂浓度可相当大地提高标记效率。在乙醇、DMF和THF的存在下获得类似结果。在DMSO的存在下标记失败。在40℃、50℃和60℃下在18
80%MeCN中的标记 效率分别为34%、65%、83%。在80℃和100℃下标记效率为>98%。 F-标记的肽的比活性大于45,000GBq/mmol。
80%MeCN中的标记 效率分别为34%、65%、83%。在80℃和100℃下标记效率为>98%。 F-标记的肽的比活性大于45,000GBq/mmol。
[0654] 在80-100℃下在具有80%(v/v)乙腈和介于1:20至1:50之间Al:NOTA比率的醋18 18
酸钠缓冲液中进行用Al F对NOTA-奥曲肽的优化 F-标记。标记效率通常为>98%。因为在60℃下标记效率为83%，所以该方法也允许诸如蛋白质和抗体片段的温度敏感性生物分
18 18
子的 F-标记。这些条件使得可在施用和PET显像之前无需纯化即可对肽进行常规 F-标记。
酸钠缓冲液中进行用Al F对NOTA-奥曲肽的优化 F-标记。标记效率通常为>98%。因为在60℃下标记效率为83%，所以该方法也允许诸如蛋白质和抗体片段的温度敏感性生物分
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子的 F-标记。这些条件使得可在施用和PET显像之前无需纯化即可对肽进行常规 F-标记。
[0655] 实施例32.用于分子显像的官能化三氮杂环壬烷配体
[0656] 本实施例涉及用于分子显像的一类新的来源于三氮杂环壬烷的配体和它们的复19
合物的合成和用途。示例性结构示出在图16至图18。用以有效地提供可检测 F NMR信号的量的选自氟化烷基、氟化乙酸酯、氟烷基磷酸酯、氟苯胺、三氟甲基苯胺和三氟甲氧基
19
苯胺的 F部分可将配体官能化。这些配体与放射性同位素或顺磁阳离子的络合导致它们
18 68
在核医学和磁共振显像(MRI)中用作诊断剂。优选地，这些配体的Al F和 Ga复合物用于
111
PET显像，而 In复合物可用于SPECT显像。也公开使这些放射性标记的配体与类似于抗体、蛋白质或肽的靶向分子缀合的方法。
合物的合成和用途。示例性结构示出在图16至图18。用以有效地提供可检测 F NMR信号的量的选自氟化烷基、氟化乙酸酯、氟烷基磷酸酯、氟苯胺、三氟甲基苯胺和三氟甲氧基
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苯胺的 F部分可将配体官能化。这些配体与放射性同位素或顺磁阳离子的络合导致它们
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在核医学和磁共振显像(MRI)中用作诊断剂。优选地，这些配体的Al F和 Ga复合物用于
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PET显像，而 In复合物可用于SPECT显像。也公开使这些放射性标记的配体与类似于抗体、蛋白质或肽的靶向分子缀合的方法。
[0657] 用111In、68Ga、64Cu、177Lu、Al18F、99mTc或86Y可放射性标记所公开的双功能螯合剂(BFCs)，或者与类似于镁、铁、铬或钆的顺磁金属络合，随后连接至靶向分子(生物分子)。标记的生物分子可用于显像血液系统、淋巴网状内皮系统、神经系统、内分泌和外分泌系统、骨骼肌肉系统(skeletomuscular system)、皮肤、肺部系统、胃肠系统、生殖系统、免疫系统、心血管系统、泌尿系统、听觉或嗅觉系统或者用于显像在各种医学病症中受感染的细胞或组织。
[0658] 双功能螯合剂的合成
[0659] 2-{4-(羧甲基)-7-[2-(4-硝基苯基)乙基]-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基)乙酸。NODA-EPN
[0660] 在0℃下向在无水CH3CN中的4-硝基苯乙基溴(104.5mg,0.45mmol)的溶液在20分钟内液逐滴加入在CH3CN(10mL)中的(tBu)2NODA(167.9mg,0.47mmol)溶液。在1小时之后，将无水K2CO3(238.9mg,1.73mmol)加入至反应混合物，并在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发，并用4mL TFA来酸化浓缩物。在5小时之后，用水来稀释反应混合物，并通过制备型+RP-HPLC来纯化以得到浅黄色固体(60.8mg,32.8%)。经HRMS(ESI)的C18H26N4O6(M+H) 计算值395.1925；测定值395.1925。
[0661] 2-{4-(羧甲基)-7-[2-(4-硝基苯基)甲基]-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基)乙酸。NODA-MPN
[0662] 在0℃下向在无水CH3CN中的4-硝基苄基溴(61.2mg,0.28mmol)的溶液在20分钟内逐滴加入在CH3CN(10mL)中的(tBu)2NODA(103.6mg,0.29mmol)溶液。在1小时之后，将无水K2CO3(57.4mg,0.413mmol)加入至反应混合物，并在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发，并用3mL TFA来酸化浓缩物。在5小时之后，用水来稀释反应混合物，并通过制备型RP-HPLC纯+
化以得到浅黄色固体(19.2mg,17.4%)。经HRMS(ESI)的C17H24N4O6(M+H) 计算值381.1769；
测定值381.1774。
化以得到浅黄色固体(19.2mg,17.4%)。经HRMS(ESI)的C17H24N4O6(M+H) 计算值381.1769；
测定值381.1774。
[0663] 6-(4,7-双{[(叔丁基)氧基羰基]甲基}-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基)己酸。(tBu)2NODA-HA
[0664] 向在10mL CH3CN中的(tBu)2NODA(208.3mg,0.58mmol)溶液加入6-溴己酸(147.3mg,0.755mmol)和K2CO3(144.5mg,1.05mmol)。将反应烧瓶放置在温水浴中48小时。将溶剂蒸发，并用水来稀释浓缩物，并通过制备型RP-HPLC来纯化以得到白色固体+
(138.5mg,50.1%)。经ESMS的C24H45N3O6(M+H) 计算值472.3381；测定值47227。 [0665] 4-[(4,7-双{[(叔丁基)氧基羰基]甲基}-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基)甲基]苯甲酸。(tBu)2NODA-MBA
(138.5mg,50.1%)。经ESMS的C24H45N3O6(M+H) 计算值472.3381；测定值47227。 [0665] 4-[(4,7-双{[(叔丁基)氧基羰基]甲基}-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基)甲基]苯甲酸。(tBu)2NODA-MBA
[0666] 向在无水CH3CN中的α-溴-对甲苯酸(126.2mg,0.59mmol)溶液在20分钟内逐滴加入在CH3CN(10mL)中的(tBu)2NODA(208mg,0.58mmol)溶液，并在室温下静置48小时。将溶剂蒸发，并用水/DMF来稀释浓缩物，并通过制备型RP-HPLC纯化以得到白色固体+(74.6mg)。经HRMS(ESI)的C26H41N3O6(M+H) 计算值492.3068；测定值492.3071。 [0667] 4-[(4,7-双{[(叔丁基)氧基羰基]甲基}-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基)乙基]苯甲酸。(tBu)2NODA-EBA
[0668] 向在无水CH3CN中的4-(2-溴乙基)苯甲酸(310.9mg,1.36mmol)溶液在20分钟内逐滴加入在CH3CN(10mL)中的(tBu)2NODA(432.3mg,1.21mmol)溶液以及
K2CO3(122.4mg,0.89mmol)。在室温下搅拌反应72小时。将溶剂蒸发，并用水/DMF来稀释浓缩物，并通过制备型RP-HPLC纯化以得到白色固体(35.1mg)。经HRMS(ESI)的+
C27H43N3O6(M+H) 计算值506.3225；测定值506.3234。
K2CO3(122.4mg,0.89mmol)。在室温下搅拌反应72小时。将溶剂蒸发，并用水/DMF来稀释浓缩物，并通过制备型RP-HPLC纯化以得到白色固体(35.1mg)。经HRMS(ESI)的+
C27H43N3O6(M+H) 计算值506.3225；测定值506.3234。
[0669] 2-[7-丁-3-炔基-4-(羧甲基]-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基)乙酸。NODA-丁炔
[0670] 向在5mL CH3CN中的(tBu)2NODA(165.8mg,0.46mmol)溶液加入4-溴-1-丁炔(44μL,62.3mg,0.47mmol)，然后在室温下将反应混合物搅拌72小时。将溶剂蒸发，并通过+制备型RP-HPLC来纯化以得到油状物。经HRMS(ESI)的C22H39N3O4(M+H) 计算值410.3013；
测定值410.3013。用2mL TFA来酸化纯化的产物，并且在5小时之后用水稀释，冷冻和冻+
干。经HRMS(ESI)的C14H23N3O6(M+H) 计算值298.1761；测定值298.1757。
测定值410.3013。用2mL TFA来酸化纯化的产物，并且在5小时之后用水稀释，冷冻和冻+
干。经HRMS(ESI)的C14H23N3O6(M+H) 计算值298.1761；测定值298.1757。
[0671] 叔丁基-2-(7-(4-氨基丁基)-4-{[(叔丁基)氧基羰基]甲基}-1,4,7-三 氮杂环壬烷-1-基)乙酸。(tBu)2NODA-BA
[0672] 向在5mL CH3CN中的(tBu)2NODA(165.2mg,0.46mmol)溶液加入4-(Boc-氨基)丁基溴(124.7mg，0.49mmol)，在室温下将少量K2CO3和反应混合物搅拌72小时。将溶剂蒸发，并用1mL CH2Cl2和0.5mLTFA来处理浓缩物。在5分钟之后，将溶剂蒸发，并用水/DMF来稀释粗品油状物，并通过制备型RP-HPLC来纯化以得到白色固体(137.2mg,69.3%)。经+HRMS(ESI)的C22H44N4O4(M+H) 计算值429.3435；测定值429.3443。
[0673] NODA-BAEM:(BAEM=丁基氨基乙基马来酰亚胺)
[0674] 向在CH2Cl2(3mL)中的(tBu)2NODA-BM(29.3mg,0.068mmol)溶液加入β-马来酰亚胺基丙酸NHS酯(16.7mg,0.063mmol)，20μLDIEA，并在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发，并用1mL TFA来酸化浓缩物。在3小时之后，用水来稀释反应混合物，并通过制备型RP-HPLC来纯+
化以得到白色固体。经HRMS(ESI)的C21H33N5O7(M+H) 计算值468.2453；测定值468.2441。 [0675] 2-{4-[(4,7-双-叔丁氧基羰基甲基)-[1,4,7]-三氮杂环壬烷-1-基)甲基]苯基}乙酸。(tBu)2NODA-MPAA
化以得到白色固体。经HRMS(ESI)的C21H33N5O7(M+H) 计算值468.2453；测定值468.2441。 [0675] 2-{4-[(4,7-双-叔丁氧基羰基甲基)-[1,4,7]-三氮杂环壬烷-1-基)甲基]苯基}乙酸。(tBu)2NODA-MPAA
[0676] 在0℃下向在无水CH3CN(50mL)中的4-(溴甲基)苯乙酸(593mg,2.59mmol)溶液在1小时内逐滴加入在CH3CN(50mL)中的(tBu)2NODA(1008mg,2.82mmol)溶液。在4小时之后，将无水K2CO3(100.8mg,0.729mmol)加入至反应混合物，并在室温下搅拌过夜。将1
溶剂蒸发，并通过制备型RP-HPLC(方法5)纯化粗品以得到白色固体(713mg,54.5%)。H NMR(500MHz,CDCl3,25℃,TMS)δ1.45(s,18H),2.64-3.13(m,16H),3.67(s,2H),4.38(s,2H
13
),7.31(d,2H),7.46(d,2H); C(125.7MHz,CDCl3)δ28.1,41.0,48.4,50.9,51.5,57.0,59.+
6,82.3,129.0,130.4,130.9,136.8,170.1,173.3.经HRMS(ESI)的C27H43N3O6(M+H) 计算值
506.3225；测定值506.3210。
溶剂蒸发，并通过制备型RP-HPLC(方法5)纯化粗品以得到白色固体(713mg,54.5%)。H NMR(500MHz,CDCl3,25℃,TMS)δ1.45(s,18H),2.64-3.13(m,16H),3.67(s,2H),4.38(s,2H
13
),7.31(d,2H),7.46(d,2H); C(125.7MHz,CDCl3)δ28.1,41.0,48.4,50.9,51.5,57.0,59.+
6,82.3,129.0,130.4,130.9,136.8,170.1,173.3.经HRMS(ESI)的C27H43N3O6(M+H) 计算值
506.3225；测定值506.3210。
[0677] 2-(4-(羧甲基)-7-{[4-(羧甲基)苯基]甲基}-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基)乙酸。NODA-MPAA
[0678] 在0℃下向在无水CH3CN中的4-(溴甲基)苯乙酸(15.7mg,0.068mmol)溶液在20分钟内逐滴加入在CH3CN(5mL)中的(tBu)2NODA(26mg,0.073mmol)溶液。在2小时之后，将无水K2CO3(5mg)加入至反应混合物，并在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发，并用2mL TFA来酸化浓缩物。在3小时之后，用水来稀释反应混合物，并通过制备型RP-HPLC纯化以得到1
白色固体(11.8mg,43.7%)。H NMR(500MHz,DMSO-d6,25℃)δ2.65-3.13(m,12H),3.32(d,
13
2H),3.47(d,2H),3.61(s,2H),4.32(s,2H),7.33(d,2H),7.46(d,2H); C(125.7MHz,DMSO-d6)40.8,47.2,49.6,50.7,55.2,58.1,130.4,130.5,130.9,136.6,158.4,158.7,172.8,17+
2.9.经HRMS(ESI)的C19H27N3O6(M+H) 计算值394.1973；测定值394.1979。
白色固体(11.8mg,43.7%)。H NMR(500MHz,DMSO-d6,25℃)δ2.65-3.13(m,12H),3.32(d,
13
2H),3.47(d,2H),3.61(s,2H),4.32(s,2H),7.33(d,2H),7.46(d,2H); C(125.7MHz,DMSO-d6)40.8,47.2,49.6,50.7,55.2,58.1,130.4,130.5,130.9,136.6,158.4,158.7,172.8,17+
2.9.经HRMS(ESI)的C19H27N3O6(M+H) 计算值394.1973；测定值394.1979。
[0679] (tBu)2NODA-MPAA NHS酯
[0680] 向在CH2Cl2(5mL)中的(tBu)2NODA-MPAA(175.7mg,0.347mmol)溶液加入(CH2Cl2中1M)DCC(347μL,0.347mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(42.5mg,0.392mmol)和20μL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。在3小时之后，将二环己基脲(DCU)滤除，并蒸发溶剂。通过快速色谱法在(230-400筛目)硅胶凝胶上(CH2Cl2:MeOH(100:0至80:20)纯化以得到NHS酯+(128.3mg,61.3%)。经HRMS(ESI)的C31H46N4O8(M+H) 计算值603.3388；测定值603.3395。 [0681] NODA-MPAEM:(MPAEM=甲基苯基乙酰氨基乙基马来酰亚胺)
[0682] 向 在 CH2Cl2(5mL) 中 的 (tBu)2NODA-MPAA NHS 酯 (128.3mg,0.213mmol) 溶液加入在250μL DMF和20μL DIEA中的N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟醋酸盐(52.6mg,0.207mmol)溶液。在3小时之后，将溶剂蒸发，并用2mL TFA来处理浓缩物。用水来稀释粗品，并通过制备型RP-HPLC纯化以得到白色固体(49.4mg,45%)。经 HRMS(ESI)的+
C25H33N5O7(M+H) 计算值516.2453；测定值516.2452。
C25H33N5O7(M+H) 计算值516.2453；测定值516.2452。
[0683] 叔丁基-2-(7-(4-氨基丙基)-4-{[(叔丁基)氧基羰基]甲基}-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基)乙酸。(tBu)2NODA-PA
[0684] 向在5mL CH3CN中的(tBu)2NODA(391.3mg,1.09mmol)溶液加入苄基-3-溴丙基氨基甲酸酯(160μL)，然后在室温下将反应混合物搅拌28小时。将溶剂蒸发，并将浓缩物溶解在40mL2-丙醇中，与128.7mg的10%Pd-C混合，并且放置在43psi H2下过夜。然后将产物过滤，并将滤液浓缩。用水/DMF来稀释粗品，并通过制备型RP-HPLC纯化以得到白色固+体(353mg)。经HRMS(ESI)C21H42N4O4(M+H) 的计算值415.3291；测定值415.3279。 [0685] NODA-PAEM:(PAEM=丙基氨基乙基马来酰亚胺)
[0686] 向在CH2Cl2(3mL)中的(tBu)2NODA-PM(109.2mg,0.263mmol)溶液加入β-马来酰亚胺基丙酸NHS酯(63.6mg,0.239mmol),20μLDIEA，并在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发，并用1mL TFA来酸化浓缩物。在3小时之后，用水来稀释反应混合物，并通过制备型RP-HPLC+纯化以得到白色固体(79mg)。经HRMS(ESI)的C20H31N5O7(M+H) 计算值454.2319；测定值
454.2296。
454.2296。
[0687] 官能化三氮杂环壬烷配体的18F-标记
[0688] 将溶解在2mM醋酸钠(pH4)中的官能化三氮杂环壬烷配体(20nmol;10μL)与18 -
AlCl3(5μL在2mM醋酸盐缓冲液中的2mM溶液、25-200μL在盐水中的 F 和25-200μL的乙醇)混合。在90-105℃下加热15-20分钟后，将800μL的去离子(DI)水加入至反应溶液，并将全部内容物移至含有1mL的去离子(DI)水的小瓶(稀释小瓶)。用2x1mL DI水来洗涤反应小瓶，并加入至稀释小瓶。然后使粗品通过1-mLHLB柱，用2x1mL的DI水的级分来洗涤柱。使用3x200μL的1:1EtOH/水将标记的产物由柱中洗脱。官能化TACN配体的
18
F-标记的 放射色谱图示出在图19中。
AlCl3(5μL在2mM醋酸盐缓冲液中的2mM溶液、25-200μL在盐水中的 F 和25-200μL的乙醇)混合。在90-105℃下加热15-20分钟后，将800μL的去离子(DI)水加入至反应溶液，并将全部内容物移至含有1mL的去离子(DI)水的小瓶(稀释小瓶)。用2x1mL DI水来洗涤反应小瓶，并加入至稀释小瓶。然后使粗品通过1-mLHLB柱，用2x1mL的DI水的级分来洗涤柱。使用3x200μL的1:1EtOH/水将标记的产物由柱中洗脱。官能化TACN配体的
18
F-标记的 放射色谱图示出在图19中。
[0689] NODA-MPAEM的18F-标记
[0690] 向10μL(20nmol)2mM NODA-MPAEM 溶 液 加 入5μL2mMAlCl3、200μL18F- 溶 液18 3
[15.94mCi,Na F,PETNET]，随后为200μLCHCN，并加热至110℃持续15分钟。通过将所得溶液转移至 HLB1cc(30mg)柱体(P#186001879,L#099A30222A)内并用DI H2O洗脱
18 - 18
以去除未结合的 F，随后为1:1EtOH/H2O以洗脱 F-标记的肽来纯化粗品反应混合物。使粗品反应溶液通过HLB柱体至10mL小瓶内，并用DI H2O(4.34mCi)的6x1mL级分洗涤柱体。
然后将HLB柱体放置在新的3mL小瓶上，并用4×150μL1:1EtOH/H2O洗脱以收集标记的肽(7.53mCi)。反应容器保留165.1μCi，而柱体保留270μCi的活性。7.53mCi 61.2%的
18
Al[ F]NODA-MPAEM。
18
[15.94mCi,Na F,PETNET]，随后为200μLCHCN，并加热至110℃持续15分钟。通过将所得溶液转移至 HLB1cc(30mg)柱体(P#186001879,L#099A30222A)内并用DI H2O洗脱
18 - 18
以去除未结合的 F，随后为1:1EtOH/H2O以洗脱 F-标记的肽来纯化粗品反应混合物。使粗品反应溶液通过HLB柱体至10mL小瓶内，并用DI H2O(4.34mCi)的6x1mL级分洗涤柱体。
然后将HLB柱体放置在新的3mL小瓶上，并用4×150μL1:1EtOH/H2O洗脱以收集标记的肽(7.53mCi)。反应容器保留165.1μCi，而柱体保留270μCi的活性。7.53mCi 61.2%的
18
Al[ F]NODA-MPAEM。
18
[0691] NODA-MPAEM的 F-标记：18 -
[0692] 向10μL(20nmol)2mM NODA-MPAEM 溶 液 加 入5μL2mMAlCl3,200μL F 溶 液18
[15.94mCi,Na F,PETNET，随后为200μLCH3CN，并加热至110℃持续15分钟。通过将所得溶液转移至 HLB1cc(30mg)柱体(P#186001879,L#099A30222A)和用DI H2O洗脱以
18 - 18
去除未结合的 F，随后为1:1EtOH/H2O以洗脱 F-标记的肽来纯化粗品反应混合物。使粗品反应溶液通过HLB柱体至10mL小瓶内，并用DI H2O(4.34mCi)的6x1mL级分洗涤柱体。
然后将HLB柱体放置在新的3mL小瓶上，并用4×150μL1:1EtOH/H2O洗脱以收集标记的肽(7.53mCi)。反应容器保留165.1μCi，而柱体保留270μCi的活性。
的Al[18F]NODA-MPAEM。
[15.94mCi,Na F,PETNET，随后为200μLCH3CN，并加热至110℃持续15分钟。通过将所得溶液转移至 HLB1cc(30mg)柱体(P#186001879,L#099A30222A)和用DI H2O洗脱以
18 - 18
去除未结合的 F，随后为1:1EtOH/H2O以洗脱 F-标记的肽来纯化粗品反应混合物。使粗品反应溶液通过HLB柱体至10mL小瓶内，并用DI H2O(4.34mCi)的6x1mL级分洗涤柱体。
然后将HLB柱体放置在新的3mL小瓶上，并用4×150μL1:1EtOH/H2O洗脱以收集标记的肽(7.53mCi)。反应容器保留165.1μCi，而柱体保留270μCi的活性。
的Al[18F]NODA-MPAEM。
[0693] 表26.20nmol NODA-MPAEM+10nmol Al3+的18F-标记
[0694]
[0695]a 3+
[0696] 10μL NODA-MPAEM,5μL Al ,105-110℃,15分钟.b
[0697] HLB柱纯化(SPE)之后在(1:1)EtOH/H2O中的分离的活性。c
[0698] 校正衰变的RCY–根据27-42分钟的合成时间。18
[0699] hMN14-Fab’-SH与Al F(NODA-MPAEM)的缀合：
[0700] 向含有hMN14-Fab’-SH(1mg,约20纳摩尔)L#112310的小瓶加入200μL18
PBS(pH7.38)和600μL的HLB纯化的Al F(NODA-MPAEM)(EtOH:H2O::1:1)。使粗品反应混合物通过sephadex(G-50/80,0.1M NaOAc,pH6.5)3mL旋转柱。洗脱液中的活性为4.27mCi，而1.676mCi保留在旋转柱上以及0.178mCi在空白反应小瓶中。 的
18
[Al F]-hMN14-Fab。
PBS(pH7.38)和600μL的HLB纯化的Al F(NODA-MPAEM)(EtOH:H2O::1:1)。使粗品反应混合物通过sephadex(G-50/80,0.1M NaOAc,pH6.5)3mL旋转柱。洗脱液中的活性为4.27mCi，而1.676mCi保留在旋转柱上以及0.178mCi在空白反应小瓶中。 的
18
[Al F]-hMN14-Fab。
[0701] 向800μL的PBS加入1μL的洗脱液 在2.08p.m.下注入40μL(SEC-HPLC)在10.312分钟时的主要产物。
[0702] 血清稳定性：
[0703] 在自动进样器小瓶中，200μL的新鲜人血清+50μL的洗脱液 149.6μCi18
在2.45p.m.37℃下下孵育 在血清中[Al F]-hMN14-Fab。向在血清中4μL的
18
[Al F]-hMN14-Fab加入280μL的缓冲液B(PBS) 在3.51p.m.下注入40μL(SEC-HPLC)在10.331分钟时的主要产物。
在2.45p.m.37℃下下孵育 在血清中[Al F]-hMN14-Fab。向在血清中4μL的
18
[Al F]-hMN14-Fab加入280μL的缓冲液B(PBS) 在3.51p.m.下注入40μL(SEC-HPLC)在10.331分钟时的主要产物。
[0704] 18F-hMN14-Fab的免疫反应性：
[0705] 向100μg癌胚抗原(CEA)[L#2371505,Scripp’s Labs]加入在PBS(pH7.38)中的200μL1%HAS+100μL PBS(pH7.38) 在PBS中CEA。在37℃下将在血清中18
的4μL[Al F]-hMN14-Fab 加 入 至 PBS 中 的 150μL CEA 在 4.33p.m.中 注 入
18
40μL(SEC-HPLC)在7.208分钟时的主要产物。旋转柱纯化的[Al F]-hMN14-Fab的放射色
18
谱图、[Al F]-hMN14-Fab在人血清中的稳定性和它与CEA的免疫反应性示出在图20中。 [0706] 双功能螯合剂的示例性合成流程图示出如下。
的4μL[Al F]-hMN14-Fab 加 入 至 PBS 中 的 150μL CEA 在 4.33p.m.中 注 入
18
40μL(SEC-HPLC)在7.208分钟时的主要产物。旋转柱纯化的[Al F]-hMN14-Fab的放射色
18
谱图、[Al F]-hMN14-Fab在人血清中的稳定性和它与CEA的免疫反应性示出在图20中。 [0706] 双功能螯合剂的示例性合成流程图示出如下。
[0707]
[0708] 流程1:NODA-MBA的合成
[0709]
[0710] 流程2：NODA-EBA的合成
[0711]
[0712] 流程3：NODA-MPN的合成
[0713]
[0714] 流程4:NODA-EPN的合成
[0715]
[0716] 流程5:NODA-丁炔的合成
[0717]
[0718] 流程6:NODA-MPH的合成
[0719]
[0720] 流程7:NODA-乙醇的合成
[0721]
[0722] 流程8:NODA-PBr的合成
[0723]
[0724] 流程9:NODA-MBEM的合成
[0725]
[0726] 流程10:NODA-BM的合成
[0727]
[0728] 流程11:NODA-BAEM的合成
[0729]
[0730] 流程12:NODA-MPAPEG3N3的合成
[0731]
[0732] 流程13:Al18F(NODA-MPAA NHS酯)的合成
[0733]
[0734] 流程14:Al18F(NODA-BAEM)的合成
[0735]
[0736] 流程15:NODA-BAMA的合成
[0737]
[0738] 流程16:NODA-BAO的合成
[0739]
[0740] 流程17:NODA-MPAFO的合成
[0741]
[0742] 流程18:NODA-MPAFSA的合成
[0743] 18F-标记的探针的示例性结构如下所示。
[0744]
[0745]
[0746]
[0747] 结论
[0748] 我们已经发现具有官能性的一类新型来源于三氮杂环壬烷(TACN)的BFC与多种金属形成稳定复合物，所述官能性通过固相或在溶液中提供至生物分子上的更容易的连接。这些BFC也形成显著 稳定的Al18F螯合物。大部分18F-标记方法操作繁杂，需要专业化学人员的努力，涉及多种中间体的纯化，无水条件，而且通常以低RCY结束。该类型新的BFC的优势在于在水介质中以高比活性一步可将它们快速地放射性氟化。
[0749] 实施例33.试剂盒配制的进一步优化
[0750] 测定不同缓冲液组合物对标记效率的作用。用在5%α,α-海藻糖中的20nmol IMP485和10nmol AlCl3·6H2O配制试剂盒。在不同配制物中缓冲液和抗坏血酸不同。将肽和海藻糖溶解在DI水中，并将AlCl3·6H2O溶解在待测试的缓冲液中。
[0751] MES缓冲液-将4-吗啉乙磺酸(MES,Sigma M8250),0.3901g(0.002mol)溶解在250mL的DI H2O中，并用乙酸(8mM缓冲液)调节至pH4.06。
[0752] KHP缓冲液-将邻苯二甲酸氢钾(KHP,Baker2958-1),0.4087g(0.002mol)溶解在250mL DI H2O pH4.11(8mM缓冲液)中。
[0753] HEPES缓冲液-将N-2羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES,Calbiochem391338)0.4785g(0.002mol)溶解在250mL DI H2O中，并用AcOH(8mM缓冲液)调节至pH4.13。 [0754] HOAc缓冲液-将乙酸(HOAc,Baker9522-02),0.0305g(0.0005mol)溶解在250mL DI H2O，并用NaOH(2mM缓冲液)调节至pH4.03。
[0755] 将AlCl3·6H2O(Aldrich23078)溶解在缓冲液中以获得在2mM缓冲液中Al3+的2mM-7溶液。将IMP4850.0011g(MW1311.67,8.39x10 mol)溶解在419μL DI H2O中。将抗坏血-4
酸，0.1007g(Aldrich25,556-4,5.72x10 mol)溶解在20mL DI H2中。
酸，0.1007g(Aldrich25,556-4,5.72x10 mol)溶解在20mL DI H2中。
[0756] 制备各种试剂盒(概述在表27中)并且根据需要通过加入NaOH或HOAc调节至合适的pH。然后将溶液分散在1mL等份中，装入4 个3mL冻干的小瓶内，冷冻在干冰上，并冻干。冻干的初始储存温度为-10℃。将样本放置在真空下，并将储存温度增加至0℃。在真空下将小瓶密封和由冷冻干燥器移走之前，将样本冻干15小时，并将储存温度增加至20℃持续1小时。在不同pH值下，使用或不使用抗坏血酸以及使用或不使用乙酸盐下，用不同缓冲液制备试剂盒。在冻干之后，将试剂盒溶解在400μL的盐水中，并且用具有pH微探针的校正的pH计测定pH。
[0757] 放射性标记-用在具有乙醇(200μL)的盐水(200μL,PETNET)中的 18F-来标记所有试剂盒，并加热至约105℃持续15分钟。用0.6mL DIH2O来稀释标记的肽，然后加入至含有2mL DI H2O的稀释小瓶。用2x1mL部分的DI H2O来洗涤反应小瓶，将其加入稀释小瓶。使稀释的溶液过滤通过1mL(30mg)HLB柱体(一次1mL)，并用2mL DIH2O洗涤。将柱体移至
18
空小瓶中，并用3x200μL1:1EtOH/DI H2O来稀释。Al[ F]IMP485在1:1EtOH/DI H2O级分中。通过计量在反应小瓶、稀释小瓶、HLB柱体、DI H2O柱子洗涤液和1:1EtOH/DI H2O洗涤液中活性加起来得到总量，然后在1:1EtOH/DI H2O级分中的量除以总量，再乘以100来测定分离产率。
18
空小瓶中，并用3x200μL1:1EtOH/DI H2O来稀释。Al[ F]IMP485在1:1EtOH/DI H2O级分中。通过计量在反应小瓶、稀释小瓶、HLB柱体、DI H2O柱子洗涤液和1:1EtOH/DI H2O洗涤液中活性加起来得到总量，然后在1:1EtOH/DI H2O级分中的量除以总量，再乘以100来测定分离产率。
[0758] 结果
[0759] 研究结果显示在表27中。在0.1mg的抗坏血酸存在下所有均标记良好。抗坏血酸似乎用作在冻干前后保持pH相同的重要的非挥发性缓冲液(试剂盒1-4)。当未使用抗坏血酸时(试剂盒5-8)，pH可连同放射性标记产率一起显著改变。KHP缓冲液，试剂盒8是18
第二批中最好的试剂盒。较高水平的抗坏血酸盐也可稳定在溶液中的Al F复合物并且用
18 18
作Al F的转移配体。KHP缓冲液也可用作Al F的转移配体，所以KHP的量由试剂盒8的-7 -6
5x10 mol/试剂盒增加至试剂盒11的6x10 mol/试剂盒。KHP的增加较试剂盒8更好地稳定pH，并得到远远更好的标记产率。具有KHP+抗坏血酸盐(试剂盒12)以及KHP+MES(试剂盒13)的试剂盒具有稍微更高的标记产率。可能是较 高水平的KHP和抗坏血酸盐两者
18
用作缓冲液并且用作转移配体以增加使用那些赋形剂的标记产率。柠檬酸不是[Al F]-标记(试剂盒14)的良好缓冲液，甚至在0.1mg的抗坏血酸盐存在下仅使用50μL的2mM柠檬酸盐，也会得到低标记产率。KHP,0.1M和以上(试剂盒16-18)的量增加导致较低标记产率，其中在HLB柱的水性洗涤液中测得更大活性。
第二批中最好的试剂盒。较高水平的抗坏血酸盐也可稳定在溶液中的Al F复合物并且用
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作Al F的转移配体。KHP缓冲液也可用作Al F的转移配体，所以KHP的量由试剂盒8的-7 -6
5x10 mol/试剂盒增加至试剂盒11的6x10 mol/试剂盒。KHP的增加较试剂盒8更好地稳定pH，并得到远远更好的标记产率。具有KHP+抗坏血酸盐(试剂盒12)以及KHP+MES(试剂盒13)的试剂盒具有稍微更高的标记产率。可能是较 高水平的KHP和抗坏血酸盐两者
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用作缓冲液并且用作转移配体以增加使用那些赋形剂的标记产率。柠檬酸不是[Al F]-标记(试剂盒14)的良好缓冲液，甚至在0.1mg的抗坏血酸盐存在下仅使用50μL的2mM柠檬酸盐，也会得到低标记产率。KHP,0.1M和以上(试剂盒16-18)的量增加导致较低标记产率，其中在HLB柱的水性洗涤液中测得更大活性。
[0760] 表27标记和pH研究的结果
[0761]
[0762] 由这些结果得出，邻苯二甲酸氢钾是用于标记的优选缓冲液。因此，将肽标记试剂盒重新配制以利用标记缓冲液中的KHP。当在1:1乙醇/盐水中标记100nmol的肽时，重新配制的试剂盒得到约97%的非常高的分离标记产率。也可缩短标记和纯化时间，并降低至20分钟。除了使用新的缓冲剂，邻苯二甲酸氢钾(KHP)之外，我们也加入更多摩尔量的缓冲液，其可有助于在标记过程中稳定pH。在加热和使粗品通过柱体之后，通过加入更多盐水至反应，使肽通过Alumina N柱体纯化。未结合的18F-和Al18F粘合氧化铝，并用盐水将标记的肽由柱体非常有效地洗脱。以下显示的配制物是用于20nmol肽试剂盒，但通过加入更多肽和更多Al3+(100nmol肽试剂盒为60nmol Al3+)，相同配制物用于100nmol肽试剂盒。 [0763] 2mM KHP中的2mM Al3+-将氯化铝六水合物，0.0196g(8.12x10-5mol,Aldrich2307
8,MW241.43)溶解在40.6mL的2mM邻苯二甲酸氢钾(KHP,JT Baker2958-1,MW204.23)中。
这可在室温下保存数月。
8,MW241.43)溶解在40.6mL的2mM邻苯二甲酸氢钾(KHP,JT Baker2958-1,MW204.23)中。
这可在室温下保存数月。
[0764] 抗坏血酸-将抗坏血酸，0.100g溶解在20mL DI H2O中。在使用当天新鲜配制。 [0765] 5%海藻糖-将α,α-海藻糖二水合物，2.001g(JT Baker,4226-04,MW378.33)溶解在20mL DI H2O中。这可在室温下保存数周。
[0766] KHP试剂盒缓冲液-将KHP，0.2253g溶解在18mL DI H2O(0.06M)中。该溶液可在室温下保存数月。
[0767] IMP485溶液-将IMP485,0.0049g(3.74x10-6mol,MW1311.67)溶解在1.494mL DI -3H2O(2.5x10 M)中。该溶液可在-20℃下保存数月。
[0768] 1M KOH-将氢氧化钾(99.99%半导体级，MW56.11,Aldrich306568)溶解在DI H2O中以制备1M溶液。
[0769] 试剂盒配制物(20nmol试剂盒，40试剂盒)-将肽，IMP485(320μL,8x10-7mol)3+
放置在 50mL无菌聚 丙烯离 心管(无 金属)中，并与240μL的2mM Al 溶 液
-7
(4.8x10 mol)800μL的抗坏血酸溶液、1600μL的0.06M KHP溶液、8mL的5%海藻糖溶液混合，并用DI H2O稀释混合物至40mL。用数微升的1M KOH来调节溶液至pH3.99-4.03。将肽溶液以1mL/小瓶使用1mL移液管分散至3mL玻璃冷冻小瓶(未洗涤)内。
放置在 50mL无菌聚 丙烯离 心管(无 金属)中，并与240μL的2mM Al 溶 液
-7
(4.8x10 mol)800μL的抗坏血酸溶液、1600μL的0.06M KHP溶液、8mL的5%海藻糖溶液混合，并用DI H2O稀释混合物至40mL。用数微升的1M KOH来调节溶液至pH3.99-4.03。将肽溶液以1mL/小瓶使用1mL移液管分散至3mL玻璃冷冻小瓶(未洗涤)内。
[0770] 冻干-将小瓶在干冰上冷冻，用冷冻塞子盖住，并放置在-20℃下冷冻干燥器中保存。打开真空泵，并在真空度低于100mtorr之后将储存温度升高至0℃。第二天早上，在真空下盖上样本和弯曲密封之前将储存温度升高至20℃持续4小时。
[0771] 放射性标记-盐水中的18F-来自0.5mL结核菌素注射器中200μL盐水中的18 -
PETNET。将乙醇，200μL推入 F 溶液，然后将混合物注入含有肽的冻干的试剂盒内。然后将溶液在105℃加热器中加热15分钟。然后将无菌盐水，0.6mL加入反应小瓶，并将溶液由小瓶中去除并推动通过氧化铝N柱体(SEP-PAK light,WAT023561，之前用5mL无菌盐水洗涤)至收集小瓶内。用2x1mL盐水来洗涤反应小瓶，并使洗涤液通过氧化铝柱。总标记和纯化时间为约20分钟。
PETNET。将乙醇，200μL推入 F 溶液，然后将混合物注入含有肽的冻干的试剂盒内。然后将溶液在105℃加热器中加热15分钟。然后将无菌盐水，0.6mL加入反应小瓶，并将溶液由小瓶中去除并推动通过氧化铝N柱体(SEP-PAK light,WAT023561，之前用5mL无菌盐水洗涤)至收集小瓶内。用2x1mL盐水来洗涤反应小瓶，并使洗涤液通过氧化铝柱。总标记和纯化时间为约20分钟。
[0772] 实施例34.在低温下标记
[0773] 检查在低温下改变螯合剂结构对标记效率的作用。IMP466(NOTA-奥曲肽)与IMP485的低温标记的比较显示在低温下简单的NOTA配体比NODA-MPAA配体标记更好。 [0774] 在一个实施方案中，诸如蛋白质的温度敏感性分子可与简单的NOTA配体的多个18
拷贝缀合。然后可纯化和配制(例如，冻干)用于Al F-标记的蛋白质。用在盐水中的
18 -
F 来使蛋白试剂盒复水，加热适当长度时间，并通过凝胶过滤或氧化铝柱来纯化。表27和
28显示IMP466比对IMP485对标记的作用。
拷贝缀合。然后可纯化和配制(例如，冻干)用于Al F-标记的蛋白质。用在盐水中的
18 -
F 来使蛋白试剂盒复水，加热适当长度时间，并通过凝胶过滤或氧化铝柱来纯化。表27和
28显示IMP466比对IMP485对标记的作用。
[0775] 表28.Al18F(IMP466)的温度依赖性标记
[0776]
[0777] 表29.Al18F(IMP485)的温度依赖性标记
[0778]
[0779] 数据显示，通过改变不同螯合部分，在50℃下用Al18F的低温标记的效率可翻三倍。螯合部分的进一步修饰可提供对低温标记的另外的改善。然而，如果充足数量的螯合部分连接分子，则由IMP466所观察到的37%效率足够使得用温度敏感分子进行18F PET显像。
[0780] 我们也检查了肽浓度对IMP485的低温标记的作用。分别用10、20、40、100和200nmol的肽和0.6当量的Al3+来制备试剂盒。配制物的其他部分对于所有试剂盒均相同。
用400μL盐水/EtOH来标记试剂盒，并在50-110℃下加热15分钟，并通过氧化铝N柱体纯化。标记结果报告为在表30中分离产率。在任何温度下，增加肽的浓度均增加标记效率。
结果表明，如果使用微流体装置可减少反应体积，则我们可大大地降低制备用于PET显像的单剂量标记的肽所需要的肽和18F-的量。
用400μL盐水/EtOH来标记试剂盒，并在50-110℃下加热15分钟，并通过氧化铝N柱体纯化。标记结果报告为在表30中分离产率。在任何温度下，增加肽的浓度均增加标记效率。
结果表明，如果使用微流体装置可减少反应体积，则我们可大大地降低制备用于PET显像的单剂量标记的肽所需要的肽和18F-的量。
[0781] 表30.肽浓度对作为温度函数的标记效率的作用。
[0782]
[0783] 实施例35.18F-标记的分子的自动化合成
[0784] 以下实施例比较通过Kiesewetter等，(2011,Appl Radiat Isot69:410-4)公开的18 18
F-FBEM的自动化合成与Al F(NODA-MPAEM)的自动化合成。在95分钟内用17%的RCY使用
18
复杂合成模块(见下)来完成 F-FBEM的自动化合成。一个合成模块(图21)包括加热装置和HLB柱体或HPLC柱。用NODA-MPAEM，我们能够在40分钟内以单一步得到67-79%RCY(校正衰变)。
F-FBEM的自动化合成与Al F(NODA-MPAEM)的自动化合成。在95分钟内用17%的RCY使用
18
复杂合成模块(见下)来完成 F-FBEM的自动化合成。一个合成模块(图21)包括加热装置和HLB柱体或HPLC柱。用NODA-MPAEM，我们能够在40分钟内以单一步得到67-79%RCY(校正衰变)。
[0785]
[0786] 流程19:Al18F(NODA-MPAEM)的合成
[0787] 在18F-FBEM和18F-FDG-MHO中，首先引入18F，随后为马来酰亚胺(流程20和21)。18
同时NODA-MPAEM-含有马来酰亚胺的BFC-在最后一步中经 F标记(流程19)。
同时NODA-MPAEM-含有马来酰亚胺的BFC-在最后一步中经 F标记(流程19)。
[0788]
[0789] 流程20:18F-FBEM的合成
[0790]
[0791] 流程21:18F-FDG-MHO的合成
[0792]
[0793]
[0794] *未经校正衰变
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