本发明涉及抗逆转录病毒药物敏感性和抗性试验，试验用于鉴定治 疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的有效药 物制剂。本发明进一步涉及用表型和基因型敏感性分析法监控临床HIV 感染进程及其对抗逆转录病毒治疗的反应。本发明还涉及用于实施表型 敏感性试验的新型载体、宿主细胞和组分。本发明进一步涉及使用各种 基因型方法鉴别因感染而对特定抗逆转录病毒药物制剂产生抗性的病人 的方法。本发明还涉及依据其抑制病毒、选择的病毒序列和/或病毒蛋白 的能力筛选候选抗逆转录病毒的药物。本发明特别涉及到使用表型敏感 性试验和/或基因型试验确定核苷类逆转录酶抑制剂。

HIV感染特点是在发病过程中高频率的病毒更新，最终导致CD4细 胞的消亡和病情发展恶化。Wei X，Ghosh SK，Taylor ME，等(1995)Nature 343，117-122，and Ho DD，Naumann AU，Perelson AS，等(1995)Nature 373，123-126.抗逆转录病毒治疗的目的是获得实质性和持续地抑制病毒 复制，获得持续的控制病毒包括使用系列的治疗，总体上每一治疗包括 3种或更多抗逆转录病毒药物的组合。因此选择开始和后续的治疗应当 建立在对抗性和交叉抗性模式充分了解的理性的基础上，这对于指导治 疗决定至关重要。组合治疗的基本原理涉及到配合剂或添加剂活性以更 大限度地抑制病毒复制。然而药物制剂的耐受性将至关重要，因为治疗 需要持续许多年。

在没有接受治疗的病人体内每天产生大约1010新的病毒颗粒，加上 HIV逆转录酶(RT)没有核酸外切酶校正功能，不能校正转录错误，这种 高水平的病毒更新导致在HIV基因组的每个位置每天有104到105次突 变，结果迅速形成基因组的广泛突变。鉴于某些模板位置或碱基对取代 更倾向于发生错误(Mansky LM，Temin HM(1995)J Virol 69，5087-5094) (Schinazi RF，Lloyd RM，Ramanathan CS，等(1994)Antimicrob Agents Chemother 38，268-274)，数学模型显示在感染的个体中每个可能的单个 位点每天可能发生多到10,000次的突变。

如果产生对抗逆转录病毒药物的抗性，抑制剂存在时靶酶必须在保 持其功能的条件下发生改变。导致单个氨基酸取代的点突变可能导致酶 形状、大小的改变，或者活性部位、底物结合部位或周边区域的改变。 在初始治疗之前已经检测到对抗逆转录病毒制剂在低水平上有抗性的突 变。(Mohri H，Singh MK，Ching WTW，等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90，25-29)(Najera I，Richman DD，Olivares I，等(1994)AIDS Res Hum Retroviruses 10，1479-1488)(Najera I，Holguin A，Quinones-Mateu E，等 (1995)J Virol 69，23-31)。然而，这些突变株仅占整个病毒量的一小部分， 而且与野生型病毒相比可能处于复制和竞争劣势。(Coffin JM(1 995) Science 267，483-489)。抗逆转录病毒治疗产生的选择压力为这些抗药突 变株提供了竞争优势，这样它们逐渐成为优势准种(Frost SDW， McLean AR(1994)AIDS 8，323-332)(Kellam P，Boucher CAB，Tijnagal JMGH(1994) J Gen Virol 75，341-351)，最终导致病人体内抗药和抗病毒失败。

核苷类逆转录酶抑制剂

目前有7种核苷类似的HIV逆转录酶抑制剂zidovudine(瑞得呋 啶)(ZVD：Retrovir，Glaxo Wellcome，Uxbridge，UK英国)，zalcitabine(塞西 太并)(ddC：HIVID，Hoffman-LaRoche，Basle，Switzerland瑞士)，didanosine (地达诺森)(ddI：Videx，Bristol-Myers Squibb，Syracuse，NY，USA美国)， stavudine(斯太呋啶)(d4T：Zerit，Bristol-Myers Squibb，Syracuse，NY，USA 美国)，和lamivudine(拉咪呋啶)(3TC，Epivir)，和abacavir(爱博开呋) (ABC，Ziagen，Glaxo Wellcome)，adefovir(爱得佛呋)(ADV，Preveon，Gilead Sciences)在美国和欧洲获得批准。此外，3种非核苷类逆转录酶抑制剂 (NNRTIs)耐呋络平(nevirapine)(Viramune，Boehringer Ingelheim， Ingelheim am Rhein，Germany德国)，地拉呋啶(delavirdine)(Rescriptor， Pharmacia &Upjohn，Kalamazoo，MI，USA美国)和艾发呋瑞兹 (efavirenz)(EPV，)在美国获得批准。所有的这些制剂都已显示至少在短期 内有抗病毒活性，因此，自然它们会对HIV施加了选择压力，在治疗过 程中产生了抗药突变株。虽然这些药物一般用于组合制剂，但许多得到 的抗性数据来源于I/II期单一治疗研究。在单一治疗过程中所观察到的 突变或许并不能准确反映突变引起的抗性，因为突变是在几种药剂的选 择压力存在下产生的，它们作用于相同的位点和同一基因。

新型突变

虽然在体外和体内的研究工作中建立了与导致对逆转录酶抑制剂 (RTIs)有表型抗性相关的基因型突变模型，但在临床研究中时常产生的 其它抗性突变很少有报道。已经在接受用ZDV加ddI或ddC进行延长 的组合治疗的病人中鉴定出密码子62、75、77、116和151位发生氨基 酸取代独特模式的个体：这些个体对2种药物均有抗性，对stavudine(斯 太呋啶)有交叉抗性，对3TC有部分交叉抗性。没有一致的基因型改变 与表型d4T抗性相关，或确与该药剂病毒治疗效果的丧失有关。

与核苷类似的逆转录酶(RT)抑制剂相关的突变

Zidovudine(瑞得呋啶)

在1989年首次报道对ZDV敏感性降低的HIV变异株；其中一些变 异株要抑制病毒复制的50％需要ZDV的浓度增加100倍以上(Larder BA， Darby G，Richman DD(1989)Science 243，1731-1734)。ZDV抗性表型在 体内表现得相当稳定，治疗停止1年后有时还能检测到抗性病毒，(Boucher CA，O′Sullivan E，Mulder JW等(1992)J Infect Disease 165，105-110)，而 且与是否使用didanosine(地达诺森)治疗无关(Smith MS，Koerber KL， Pagano JS，(1994)J Infect Disease 169，184-188)。

HIV逆转录酶核苷酸测序发现了许多能影响病毒对ZDV敏感性的突 变，它可作为在ZDV抗性存在时的基因型标记(Kellam P，Boucher CAB， Tijnagal JMGH等(1994)J Gen Virol 75，341-351)(Boucher CAB， Tersmette M，Lange JMA，等(1990)Lancet 336，585-590)(Lopez-Galindez C，Rojas JM，Najera R，等(1991)PNAS 88，4280-4284)。有顺序地出现了 抗性水平增加的一系列突变，这些顺序出现的突变与病毒对ZDV敏感性 递增性减少有关。(同上)(Larder BA，Kellam P，Kemp SD，(1991)AIDS 5， 137-144)。密码子70的取代(精氨酸70-赖氨酸)可能会瞬间显性，在 ZDV单一治疗中对于治疗病毒失败起关键作用(DeJong MD，Weenstra J， Stilianakis NI，等(1996)PNAS 93，9501-9506)。继续用ZDV治疗在215 密码子选择进一步突变，这是个较为稳定的突变，已有报道突变发生苏 氨酸215-赖氨酸和苏氨酸215-苯丙氨酸的取代，而且可能同时存在 (Mayers DL，McCutchan FE，Sanders-Buell EE，等(1992)J Acq Imm Def Synd 5，749-759)。接着可能会出现额外突变的病毒，最常见的是41位密 码子发生取代(蛋氨酸41-亮氨酸)，接着在67位密码子(天冬氨酸67- 天冬酰胺)和219位密码子(赖氨酸219-谷氨酰胺)额外突变，或重新 出现70位密码子突变(同上)。

定点突变已用于评价导致不同突变的相互作用(同上)。实验表明对 ZDV高水平抗性(IC50＞1uM)典型地与多位点突变的存在有关。虽然 突变常有协同作用，但也可能有拮抗作用，例如，在用ddI和ddC治疗 中观察到的74位密码子突变(亮氨酸74-缬氨酸)已报道在体外对ZDV215 突变有拮抗作用，减少了对ZDV的抗性水平(St Clair MH，Martin JL， Tudor-Williams F，等(1991)Science 253，1557-1559)。也有报道由非核苷 类逆转录酶抑制剂选择的181位密码突变，和lamivudine(拉咪呋啶)与不 常见的ddC和ddI引发的184位密码子突变在体外对215位密码突变有 拮抗作用(Larder BA，(1992)Antimicrob Agents Chemother 36，2664-2669) (Boucher CAB，Cammack N，Schipper P，et al(1993)Antimicrob Agents Chemother 37，2231-2234)(Tisdale M，Kemp SD，Parry NR，等(1993) PNAS 90，5653-5656)(Larder BA，Kemp SD，Harrigan PR(1995)Science 269，696-699)(Zhang D，Cliendo AM，Eron JJ，等(1994)Antimicrob Agents Chemother 38，282-287)。然而，在联合治疗过程中在体内可以观 察到新型突变模式或额外的“代偿性”突变，这就促使了双重或多重抗 药性(见下)。

对ZDV有抗性的病毒株表现出对包含有3’-叠氮基团如3’-叠氮- 2’，3’双脱氧瑞啶(AZU)的其它核苷类似物的交叉抗性(Rooke R，Parniak AM，Tremblay M，等(1991)Antimicrob Agents Chermother 35，988-991)。 一个研究小组已经报道一个HIV实验室株和一个临床分离株对缺少3′-叠 氮部分的胸腺嘧啶类似物stavudine(斯太呋啶)有交叉抗性(同上)。大多 数研究者发现在ZDV单一治疗中选择突变不会影响ddI、ddC和3TC的 敏感性(Rooke R，Tremblay M，Soudeyns H，等(1989)AIDS 3，411-415)(id) (Larder BA，Chesebro B，Richman DD(1990)Antimicrob Agents Chemother 34，436-441)(id)(Dimitrov DH，Hollinger FB，Baker CJ，等(1993)J Infect Disease 167，818-823)。然而，几乎没有报道在持续ZDV治疗后产生对ddI 的抗性(id)(Japour AJ，Chatis PA，Eigenrauch HA，等(1991)PNAS 88， 3092-3096)，有一个报道称临床分离株中对ZDV的敏感性每降低10倍， 对ddI的敏感性相应减少2.2倍，对ddC的敏感性减少2倍(Mayers DL， Japour AJ，Arduino JM，等(1994)Antimicrob Agent Chemother 38，307- 314)。而且，在基线对ADV有抗性的病人加入ddC和ddI后比那些在基 线野生型病毒的病人获得RNA反应的可能性明显降低(Holodniy M， Katzenstein D，Mole L，等(1996)J Infect Disease 174，854-857)。

Zalcitabine(塞西太并)和Didanosine(地达诺森)

对ddI抗性是通过亮氨酸74-缬氨酸突变来调节的，突变产生了敏感 性6倍至26倍的降低，但通过体外拮抗215位密码子突变部分恢复了对 ZDV的敏感性。该突变还导致对ddC的敏感性降低大约10倍。已有报 道在对一组共64人的调查中，74位密码子的突变频率从开始治疗的0 增加到24周时的56％，这些病人CD4细胞平均数量基线是129/mm，以 前接受ZDV治疗进而接受ddI治疗(Kozal MJ，Kroodsma K，Winterrs MA， 等(1994)Annals Intern Med 121，263-268)。同样，在ACTG143的研究 中在接受了ddI单一治疗，CD4细胞数在200-500/mm的首次接受治疗 和接受过ZDV治疗的病人的混合群体中，1年时26个个体中有17人在 74位密码子发生突变，在本研究中接受ZDV/ddI联合治疗的病人中55 人只有2人在74位密码子发生突变(Shafer RW，Iversen AKN，Winters MA， 等(1995)J Infect Disease 172，70-78)。

已经从长期接受ddI和ddC治疗的几个病人中分离出在65位密码子 突变(赖氨酸65-精氨酸)的病毒，这与ddI的IC50 3倍到5倍增加，ddC 敏感性5倍到10倍的减少和对3TC敏感性20倍减少有关(id)(Gu Z，Gao Q， Fang H，等(1994)Antimicrob Agents Chemother 38，275-281)。69位密码 子突变(苏氨酸69-天冬氨酸)是体外ddC选择最常见的突变，它导致ddC 敏感性降低5倍但不引起对其它核苷类似物交叉抗性(id)(Fitzgibbon JE， Howell RM，Haberzettl CA，等(1992)Antimicrob Agents Chemother 36， 153-157)。对ddC抗性的形成最近已有综述(Craig C，Moyle G(1997)AIDS 11，271-279)。

联合治疗-zidovudine(瑞得呋啶)+zalcitabine(塞西太并)或didanosine (地达诺森)

用ZDV/ddC或ZDV/ddI联合治疗可能影响抗性出现的几率，并且 可能抑制在单一治疗中观察到的一些突变，但可导致新型突变模式的出 现(因此可能更为有害)。

在联合治疗中可能出现新型突变模式。在接受持续用ZDV加ddI或 ZDV/ddC联合治疗的病人中已经在62、75、77、116和151位密码子偶 尔鉴定出氨基酸取代独特模式的病毒株：这些病毒对两种药物均有抗性 (id)(Shafer RW，Kozal MJ，Winter MA，等(1994)J Infect Disease 169， 722-729)(Shirasaka T，Kavlick MF，Ueno T，等(1995)PNAS 92，2398- 2402)，并且使得对stavudine(斯太呋啶)有交叉抗性和对3TC有部分交 叉抗性。在用ZDV治疗大于1年的病人中ddU的几率变化从0到＞10％ (ibid)。由3TC(184缬氨酸)和耐呋络平(nevirapine)(181半胱氨酸) 选择的突变在体外可能加到该背景中(Shafer RW，Winters MA，Iversen AKN，等(1996)Antimicrob Agents Chemother 40，2887-2890)，体外已有 报道184缬氨酸和103天冬氨酸突变(loviride抗性)(Schmit JC，Cogniaux J，Hermans P，等(1996)J Infect Disease 174，962-968)。这些病毒突变体 在药物存在时有复制优势，在单一治疗检测不到这些新型突变的可能原 因也许和它们不能与那些优势突变株竞争有关。

Lamivudine(拉咪呋啶)

在单一治疗和联合治疗中所观察到体内184位密码子替换(id) (Kuritzkes DR，Quinn JB，Benoit SL，等(1996)AIDS 10，975-981)(Bartlett JA，Benoit SL，Johnson VA，等(1996)Annal Intern Med 125，161-172) (Eron JJ，Benoit SL，Jemsek J，等(1995)NEJM 333，1662-1669)(Katlama C， Ingrand K，Loveday C，等(1996)JAMA 276，118-125)(Staszewski S， Loveday C，Picazo JJ，等(1996)JAMA 276，111-117)，就会立刻出现对 3TC的抗性(最常见的是蛋氨酸184-缬氨酸)，该突变的出现至少部分 地与病毒治疗失败有关(id)(Moyle GJ(1996)Drugs 52，168-185)(Goulden MG，Cammack N，Hopewell PL，等(1996)AIDS 10，101-102)。该突变导 致对3TC的高水平的抗性(IC50增加500倍到1000倍)，以及对ddI和 ddC某些交叉抗性(敏感性减少4倍到8倍)(id)(Gu Z，Gao Q，Li X，等 (1992)J Virol 66，7128-7135)。在体外该突变可能拮抗ZDV(id)(id)(id)，尽 管在体外和临床分离株有报道对ZDV/3TC有双抗性。此外，可能作为 补偿，对于ZDV/3TC双抗性而言诸如135位和333位密码子突变是必 须的，该课题正在研究中(id)。在NUCA3002研究中当对使用过ZDV 的病人用3TC治疗时，12周后33个病人中有82％的人产生了对3TC有 抗性的表型。在10个对3TC有抗性的病人中在ZDV抗性的基线处(通 过IC50＞0.2nM确定)有4人体内存在对ZDV更加敏感的病毒株，而6 人对ZDV/3TC有双抗性，这说明体内病毒对ZDV的再次敏感并不普遍。

Stavudine(斯太呋啶)

通过定点突变确定的体外HIV对d4T抗性选择已经在75位密码子 鉴定出一个突变，该突变使得对ddI和ddC的IC50增加7倍，并对其敏 感性减少(Lacey SF，Larder BA(1994)Antimicrob Agent Chemother 38， 1428-1432)。50位密码子突变导致d4T敏感性减少30倍，但它对体外已 发现的其它核苷类似物没有交叉抗性(Gu Z，Gao Q，Fank H，等(1994) Leukemia 8，Suppl.1，166-169)。然而在体内，已有报道一系列氨基酸改 变，包括75位密码子突变但不是50位密码子取代。在13个没有接受过 ZDV治疗病人中在18到22个月治疗后对d4T的敏感性最大减少了12 倍，然而，有5人对ZDV的敏感性减少了9倍到176倍，有3人对ddI 的敏感性减少了7倍至29倍(Lin PF，Samanta H，Rose RE，等(1994)J Infect Disease 170，1157-1164)，这说明在某些病人中使用d4T可能会限 制以后的治疗选择。因此，还没有建立d4T抗性的一致的突变模型。

Abacavir(爱博开呋)

由定点突变证实HIV株在体外对Abacavir(爱博开呋)的抗性选择表 明个体株突变仅引起对Abacavir(爱博开呋)的低水平抗性，产生10倍的 抗性需要多位点突变(至少3个)。M184V是体外在Abacavir(爱博开呋) 存在时最常见的选择抗性突变，并导致敏感性2-5倍的降低。在L74V 和F115Y位的突变也导致对Abacavir(爱博开呋)敏感性丧失(Tisdale M， Alnadaf T，Cousens D(1997)Antimicrob Agent Chemother 41，1094-1098)。 观察到对ddC和ddI交叉抗性，但对d4T或ZDV没有交叉抗性。来自 病人病毒种群的HIV抗性已经归因于先前与核苷类逆转录酶抑制剂抗性 有关的突变，ZDV抗性突变(M41L，L210W，T215Y)与3TC抗性突变 (M184V)二者联合表明对Abacavir(爱博开呋)敏感性降低8倍。多核苷抗 性复合物(A62V，V75I，F77L，Y116F和Q151M)与敏感性降低17倍有关 (Lanier R，Danehower S，Daluge S，等(1998)2nd International Workshop on HIV Drug Resistance and Treatment Strategies)。

Adefovir(爱得佛呋)

在adefovir(爱得佛呋)存在时体外选择导致K65R或者K70E突变的 出现，这使得对adefovir(爱得佛呋)敏感性16-或9-倍降低。对病人的研 究中已经报道了K70E突变，但没有报道K65R突变。许多AZT抗性、 3TC抗性和多药物抗性的病毒对adefovir(爱得佛呋)敏感(Mulato AS， Lamy PD，Miller MD等(1998)Antimicrob Agent Chemother 42，1620- 1628)。

抗性的临床意义

对于HIV感染选择开始和随后的治疗行动应当坚决，但也应该有计 划并在了解抗性和交叉抗性模型的理性基础上进行，以便将来有宽阔的 治疗选择。

本发明的一个目的是提供能够说明病人体内病毒种群是否对给定处 方药物有抗性的药物敏感性和抗性试验。本发明的另一个目的是病人在 治疗过程中对给定的一种或多种药物产生抗性时为医生提供能够在治疗 配方中替代一种或多种药物的试验。本发明的又一个目的是提供一个在 治疗HIV感染和/或AIDS中能够选择有效药物配方的试验。本发明的又 一个目的是提供了一个鉴定病人已经产生抗性的药物，特别是鉴定对核 苷类逆转录酶抑制剂的抗性。本发明的又一个目的是提供一种评价作用 于特定病毒、病毒基因和/或病毒蛋白的候选药物制剂生物有效性的试验 和方法，特别是与核苷类逆转录酶抑制剂相关的病毒抗药的试验和方法。 本发明的再一个目的是提供评价HIV抗逆转录病毒药物抗性和敏感性的 方法和组成，显然本发明的该目的和其它目的技术要求是作为一个整体。

本发明涉及运用表型和基因型方法监控人类免疫缺陷型病毒感染进 程以及它对抗病毒治疗反应的方法。本发明还部分地基于发现了使HIV 对抗病毒治疗产生抗性的逆转录酶(RT)遗传变异可以使用表型或基因 型方法直接通过病人血浆的HIV RNA迅速确定，这些方法基于使用核 苷酸扩增分析，例如聚合酶链反应(PCR)，这里基于核苷酸扩增的分析 指的是基于PCR的分析。或者，不使用扩增步骤使用评价病毒蛋白的病 毒核酸的方法也可使本发明监控和/或改进抗逆转录病毒治疗。本发明还 部分地基于发现了在核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)治疗的病人中HIV逆 转录酶69位密码子单独突变/插入或与41和215位密码子联合突变，这 些突变的存在与对d4T敏感性降低有关，并且对AZT，ddC，ddI，3TC和 abacavir(爱博开呋)的敏感性降低有关，这些突变是在治疗开始一段时间 后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在69位密码子突 变/插入附加41和215位密码子突变可作为形成抗性和最终免疫低下的 指示。特别是逆转录酶在69位密码子突变/插入(T69SSA，T69SSG，T69SSS) 可能与和AZT(例如M41L，L210W，T215Y)和3TC(M184V)或 ddI/ddC(L74V)抗性相关的突变有关，这些突变与核苷类逆转录酶抑制剂 (NRTI)敏感性降低有关，包括d4T敏感性降低和对AZT，ddC，ddI，3TC 和abacavir(爱博开呋)的敏感性降低，还发现逆转录酶在69位密码子突 变/插入(T69SSA，T69SSG，T69SSS)可能与和62位密码子(例如A62V) 和/或75位密码子新型突变(例如V75M)对多种核苷类逆转录酶抑制 剂抗性相关的突变有关，第一次观察到在69位密码子突变/插入(T69SSG) 和75位密码子突变(V75M)与d4T敏感性降低(3倍)和AZT敏感性 实质性降低(30倍)有关。本发明还部分地基于发现了在核苷类逆转录 酶抑制剂(NRTI)治疗的病人中与多种核苷类逆转录酶抑制剂抗性相关的 HIV逆转录酶62、75、77、116和151位密码子突变，该突变的存在与 d4T，ddC，ddI和AZT敏感性降低有关。还发现突变特定地与抗性有关： 41、67、210、215和219位密码突变(例如M41L，D67N，L210W，T215Y， K219Q)与AZT抗性；184位密码突变(M184V)与3TC抗性；69位 密码子(T69D)与ddC抗性；或者215位密码子新型突变(T215V)伴 随与多种核苷类逆转录酶抑制剂抗性相关的在62、75、77、116或151 位密码子突变，它们与d4T，ddC，ddI和AZT敏感性降低有关。本发明还 部分地基于发现了在核苷酸类逆转录酶抑制剂治疗的病人中HIV逆转录 酶与AZT抗性相关的4个或更多的突变，突变是从由41、67、70、210、 215和/或219密码子(例如M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y/F，K 219Q)组成的组群中筛选出的，它们单独突变或与74位(与ddI抗性有 关-V74I)，69位(与ddC抗性有关-T69D)，75位(V75M，V75S)和/ 或219位(K219N)密码子突变同时存在，这些突变的存在与d4T敏感 性降低有关。这些突变是在治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发 现的。通过定点突变构建包含在75位密码子单位点突变(V75I)的抗性 检测载体发现并没有改变d4T的敏感性，但增加了AZT的敏感性，应用 定点突变还发现151位密码子单位点突变(Q151M)减少了d4T和AZT 敏感性。本发明的又一个发现是在75和151位密码子双位点突变 (V75I+Q151M)减少了对d4T和AZT敏感性，应用定点突变还发现包 含有5个(M41L，D67N，K70R，T215Y，K219Q)或6个(M41L，D67N，K70R， L210W，T215Y，K219Q)与AZT抗性相关的突变的抗性检测载体表现出 对d4T和AZT敏感性降低，还发现包含有在62、69和75位密码子单位 点突变(A62V，T69SSA，V75I，V75T)的抗性检测载体没有减低对d4T 的敏感性。然而，发现在75位密码子单位点突变(V75I)或(V75T)对AZT 敏感性轻微增加，T69SSA单位点突变轻微减少了AZT的的敏感性而 A62V突变对AZT敏感性没有影响。应用定点突变进一步研究发现包含 有在62和69位密码子双位点突变(例如A62V+T69SSA)的抗性检测 载体d4T敏感性的减少幅度并不比T69SSA单突变大，但可因T69SSA 的单突变对AZT的敏感性进一步降低。应用定点突变进一步研究还发现 包含有在62和75位密码子双位点突变(例如A62V+V75I)的抗性检测 载体对d4T敏感性没有影响，还发现A62V突变并不改变由V75I突变 引起的对AZT敏感性的降低。应用定点突变进一步研究发现包含有在 62、69和75位密码子3个位点联合突变(例如A62V+T69SSA+V75I) 的抗性检测载体d4T敏感性的减少幅度并不比T69SSA单突变大，还发 现在62、69和75位密码子3个位点联合突变(例如A62V+T69SSA+V75I) 中V75I突变完全抵消了由A62V和T69SSA联合突变引起的对AZT敏 感性的降低。应用定点突变进一步研究还发现包含有在41、69和215位 密码子3个位点突变(例如M41L+T69SSA+T215Y)的抗性检测载体 表现出对d4T和AZT敏感性显著降低。应用定点突变进一步研究发现在 41、62、69和215位密码子4个位点联合突变(例如 M41L+A62V+T69SSA+T215Y)对d4T敏感性的减少幅度比T69SSA单 突变或T69SSA+A62V双突变的减少幅度大，还发现在41、62、69和215 位密码子4个位点联合突变(例如M41L+A62V+T69SSA+T215Y)中所 有4突变联合对AZT敏感性的减低幅度比M41L和T215Y突变联合的 降低幅度更大。应用定点突变进一步研究发现在41、62、69、184和215 位密码子5个位点联合突变(例如M41L+A62V+T69SSA+M184V+ T215Y)中，M184V突变抵消了由M41L，A62V，T69SSA和T215Y突变 联合引起的对AZT敏感性的降低。应用定点突变在又一个研究中发现在 病人病毒的一个克隆中T69SSA突变发生回复(T69SSA-SSA69T)， T69SSA突变的回复体降低了d4T的抗性(即增加敏感性)，而且也降低 了AZT的抗性(即增加敏感性)。

在应用定点突变的进一步研究中，发现在41、69和215位突变(例 如M41L+T69SSA+T215Y)引入L210W突变导致对AZT敏感性实质性 降低，而若没有210突变发现AZT敏感性仅降低140倍。应用定点突变 进一步研究还发现在41、62、69和215位密码子4个位点突变(例如 M41L+A62V+T69SSA+T215Y)表现出对AZT敏感性实质性降低(大于 1000倍)，对其它核苷类逆转录酶抑制剂的敏感性仅轻微降低。在应用 定点突变的进一步研究中，发现在41、62、69和215位突变(例如M41L+ A62V+T69SSA+T215Y)引入L210W突变对药物的敏感性几乎没有影 响，表现出的抗性谱与仅有这4种突变存在时所得到的抗性谱相似。在 应用定点突变的进一步研究中，发现在62和69位突变(例如 A62V+T69SSA)引入T215Y突变导致对AZT敏感性实质性降低(大于 1000倍)，而若没有215突变发现AZT敏感性仅降低7倍，还发现在62 和69位突变(例如A62V+T69SSA)引入L74V突变导致对AZT的敏感 性回复到野生型。在应用定点突变的进一步研究中，发现在41、69、210 和215位突变(例如M41L+T695SA+L210W+T215Y)引入V75M突变 对药物的敏感性几乎没有影响，表现出的抗性谱与仅有这4种突变存在 时所得到的抗性谱相似。

在本发明的又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在 内的PCR分析检测69位密码突变，以及HIV逆转录酶上包括41和/或 215位在内的其它密码子突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗 性的特定模型和随后的免疫力降低相关。更加明确地，在本发明的又一 个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析检测69 位密码突变(T69SSA，T69SSG，T69SSS)，以及HIV逆转录酶上包括 41(M41L)，210(L210W)，215(T215Y)，184(M184V)和/或74(L74V)位在内 的其它密码子突变，正如这里所描述的，这些突变与对抗逆转录病毒治 疗产生抗性的特定模型和随后的免疫力降低相关。在本发明的又一个实 施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析检测HIV逆 转录酶上62、75、77、116或115位密码子单独突变，或与之同时存在 的包括41、67、210、215、219、184、69和/或215位密码子在内的其 它密码子突变，正如这里所描述的，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产 生抗性和免疫力降低相关，以上所述突变的密码子包括，但不仅限于 (A62V，V75I，F77L，F116Y，Q151M)和(M41L，D67N，L210W，T215Y， K219Q，M184V/I，T69D，T215Y)。在本发明的又一个实施方案中，可以 使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析检测逆转录酶上4个或者更 多的突变，这些突变组包括41、67、70、210、215和/或219位密码子 (例如M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y/F，K219Q)单独突变，或与之 同时存在的包括71(V74I)，69(T69D)，75(V75M，V75S)和/或219(K219N) 位密码子突变。正如这里所描述的，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产 生抗性和免疫力降低相关。一旦在正在接受NRTI抗逆转录病毒治疗的 病人体内检测到HIV逆转录酶上69位密码单独突变，或同时还有41和 215位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在 接受特定NRTI抗逆转录病毒治疗的病人体内检测到69和/或41、210、 215、184和/或74位密码突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样， 一旦在正在接受NRTI抗逆转录病毒治疗的病人体内检测到62、75、77、 116和/或151位密码单独突变，或同时还有与AZT、3TC、ddC69抗性 相关的突变或T215V突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦 在正在接受特定NRTI抗逆转录病毒治疗的病人体内检测到从由41、67、 70、210、215和/或219位密码组成的群组中筛选出的4个或更多的突变， 或同时还有74(V74I)、69(T69D)、75(V75M，V75S)和/或219(K219N)位 密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。可以使用包括表型和基因 型分析在内的PCR分析检测HIV逆转录酶上69位密码子突变，和与之 关联的包括41和/或215位密码子在内的其它密码子突变，这些突变与 对抗逆转录病毒治疗产生抗性的特定模型和随后的免疫力降低相关。同 样，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析检测HIV逆转录 酶上69位密码子突变，和与之关联的包括41、210、215、184和/或74 位密码子在内的其它密码子突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生 抗性的特定模型和随后的免疫力降低相关。可以使用包括表型和基因型 分析在内的PCR分析检测HIV逆转录酶上69位密码子突变，和与之关 联的包括62和/或75位密码子在内的其它密码子突变，这些突变与对抗 逆转录病毒治疗产生抗性的特定模型和随后的免疫力降低相关。可以使 用包括表型和基因型分析在内的PCR分析检测HIV逆转录酶上62、75、 77、116和151位密码子突变，或者和与之关联的包括41、67、210、215、 219、184、69位密码子突变和/或T215V在内的其它密码子突变，这些 突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性的特定模型和随后的免疫力降低相 关。在使用PCR分析评价抗逆转录病毒治疗后，应该制定修改治疗药物 配方的时间，它有赖于包括病人病毒的负载量、CD4细胞数量和以前的 治疗历史这几个因素。

本发明另外一个方面是提供了评价核苷类逆转录酶抗逆转录病毒药 物有效性的方法，包括：(a)将包含有源于病人的片段和指示基因的抗 性检测载体导入宿主细胞；(b)培养来自步骤(a)的宿主细胞；(c)检测指 示基因在靶宿主细胞中的表达，其中指示基因的表达依赖于源于病人的 片段；和(d)将来自步骤(c)指示基因的表达与在实施步骤(a)-(c)时不加 入NRTI抗HIV药物的情况下所检测到的指示基因的表达二者进行比较， 其中NRTI、抗HIV药物的试验浓度在步骤(a)-(c)；在步骤(b)-(c)；或 在步骤(c)中存在。

本发明还提供了评价对病人进行非核苷类逆转录酶抗逆转录病毒治 疗的有效性的方法，包括：(a)为NRTI抗HIV药物绘制药物敏感性标 准曲线；(b)使用如上所述的敏感性试验确定病人NRTI抗HIV药物的 敏感性；以及(c)将步骤(b)中NRTI抗HIV药物的敏感性与步骤(a)中确 定的标准曲线进行比较，其中NRTI抗HIV敏感性降低表明在病人体内 形成了对抗HIV药物的抗性。

本发明还提供了评价HIV抗逆转录病毒候选药物药物化合物的生物 有效性的方法，包括：(a)将包含有源于病人的片段和指示基因的抗性 检测载体导入宿主细胞；(b)培养来自(a)的宿主细胞；(c)检测指示基因 在靶宿主细胞中的表达，其中指示基因的表达依赖于源于病人的片段； 和(d)将来自步骤(c)中指示基因的表达与在实施步骤(a)-(c)时不加抗病 毒侯选药物药物化合物时所检测到的指示基因的表达二者进行比较，其 中抗病毒侯选药物药物化合物的试验浓度在步骤(a)-(c)；在步骤(b)- (c)；或在步骤(c)中存在。

靶细胞中在抗性检测载体上指示基因的表达最终依赖于源于病人片 段序列的行为，指示基因的功能可有可无。

本发明的另一个方面是为指导针对HIV/AIDS的抗逆转录病毒药物 敏感性和抗性试验。本发明中用于HIV/AIDS的抗逆转录病毒药物敏感 性和抗性试验的特定抗性检测载体已被鉴定。

本发明的另一个方面是提供了鉴定和评价对于治疗HIV和/或AIDS 有潜力的治疗性抗逆转录病毒药物化合物的生物有效性的方法。另一方 面，本发明针对一个新型抗性检测载体，载体包含有一个源于病人的片 段，进一步包含有一个或更多逆转录酶基因上的突变和一个指示基因。

附图简明描述

图1

抗性检测载体。用图形示意包含有一个源于病人的片段和一个指示 基因的抗性检测载体。

图2

双细胞分析。示意性地表示分析方法。通过将源于病人的片段克隆 到一个指示基因病毒载体中构建抗性检测载体，接着将该抗性检测载体 与一个表达兼嗜性鼠白血病病毒(MLV)外壳蛋白或其它能侵染的病毒或 细胞蛋白的表达载体共转染，这样产生的假型病毒颗粒包含有源于病人 序列的蛋白酶(PR)和逆转录酶(RT)基因产物，接着收集颗粒用于感染新 鲜细胞。使用缺陷的PR和RT序列表明荧光素酶的活性依赖于有功能的 PR和RT。转染后将蛋白酶抑制剂加入到细胞中，这样在颗粒成熟过程 中就存在抑制剂。另一方面，在病毒颗粒感染的同时或之前在细胞中加 入逆转录酶抑制剂，该分析设不加药物和加入宽范围内不同浓度的药物 多个处理，测定荧光素酶的含量，计算不同药物测试浓度下抑制百分比 (％)。

图3

表型药物敏感性图例。通过绘制荧光素酶活性对log10浓度(um)抑制 百分比分析数据。该图用于计算抑制病毒复制的50％(IC50)和95％(IC95) 所需的药物浓度，抑制曲线向更高药物浓度移位可以解释为抗药性的证 据。图中显示出一种核苷类逆转录酶抑制剂(AZT)、一种非核苷类逆转 录酶抑制剂(地拉呋啶delavirdine)和一种蛋白酶抑制剂(ritonavir)这3种 典型曲线，与基线(治疗前)样品或对照药物易感病毒相比，例如在基 线样品不易获得时选用的PNL4-3或HXB-2，药物敏感性曲线向更高 药物浓度(向右)位移反映了药物敏感性(抗性)降低。

图4

d4T抗性病人分离株：多重核苷类逆转录酶抑制剂抗性突变。这4 种病毒表现出对d4T敏感性降低(4-12倍)，并包含与多重核苷类逆转 录酶抑制剂抗性(A62V，V75I，F77L，F116Y，Q151M)相关的逆转录酶突 变。一些病毒还包含有与AZT(M41L，D67N，L210W， T215Y，K219Q)，3TC (M184V/I)或ddC(T69D)抗性有关的特定的突变，或者以前没有描述的突 变(T215V)，受检病毒的突变列在受检病毒图的下面。括号中的突变表 明病毒群体由野生型和突变株混合组成。这里所描述的基因型只是其中 的一部分，病人基因型的完整描述见实施例3。

图5

d4T抗性病人分离株：T69SSX突变/插入。这4种病毒表现出对d4T 敏感性降低(2-10倍)，并在逆转录酶上包含有以前没有描述的突变/插 入(T69SSA，T69SSG，T69SSS)。这些病毒还包含有与AZT(M41L，L210W， T215Y)和3TC(M184V/I)或ddI/ddC(L74V)抗性有关的突变，一些病毒还 包含有与多重核苷类逆转录酶抑制剂抗性有关的突变(A62V)，和/或以 前没有描述的突变(V75M)，受检病毒的突变列在受检病毒图的下面。 括号中的突变表明病毒群体由野生型和突变株混合组成。这里所描述的 基因型只是其中的一部分，病人基因型的完整描述见实施例4。

图6

d4T抗性病人分离株：与AZT抗性相关的突变。这4种病毒表现出 对d4T敏感性降低(3-6倍)，并包含有4个或更多的与AZT抗性有关 的突变(M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y/F，K219Q)，一些病毒还包含 有对ddI(V74I)，ddC(T69D)抗性有关的突变，或以前没有描述的突变 (V75M，V75S，L219N)。受检病毒的突变列在受检病毒图的下面。括号 中的突变表明病毒群体由野生型和突变株混合组成。这里所描述的基因 型只是其中的一部分，病人基因型的完整描述见实施例4。

图7

定点突变：与多重核苷类逆转录酶抑制剂抗性相关的突变。通过定 点突变构建包含单位点(V75I)、(Q151M)和双位点(V75I+Q151M)突变的 抗性检测载体，图中显示出包含有这些定点突变的抗性检测载体对d4T 和AZT的表型敏感性。左栏：Q151M突变对d4T的敏感性大约减少了 3倍，V75I突变不改变对d4T的敏感性。右栏：Q151M突变对AZT的 敏感性大约减少了5倍，V75I突变对AZT的敏感性提高了大约2倍。

图8

定点突变：与AZT抗性相关的突变。通过定点突变构建包含5个 (M41L，D67N，K70R，T215Y，K219Q)或6个(M41L，D67N，K70R， L210W，T215Y，K219Q)与AZT抗性相关的突变的抗性检测载体，图中 显示出包含这些定点突变的抗性检测载体对d4T和AZT的表型易感性。 左栏：包含5个或6个与AZT抗性相关突变的抗性检测载体对d4T的敏 感性比对照抗性检测载体小约2倍。右栏：包含5个或6个与AZT抗性 相关突变的抗性检测载体对AZT的敏感性比对照抗性检测载体小约75- 180倍。

图9

定点突变：在逆转录酶62、69和75位氨基酸的单突变。通过定点 突变构建包含单位点(A62V，T69SSA，V75I，V75T)突变的抗性检测载 体。图中显示出包含这些定点突变的抗性检测载体对d4T和AZT的表型 易感性。左栏：T69SSA和V75T突变对d4T的敏感性没有大的减少(小 于2倍)，A62V和V75I突变对d4T的敏感性没有影响。右栏：V75I和 V75T突变稍微增加了对AZT的敏感性(大约2倍)，T69SSA突变稍微 减少了AZT的敏感性(大约2倍)，A62V突变对AZT的敏感性没有影 响。

图10

定点突变：在逆转录酶62、69和75位氨基酸的多位点突变。通过 定点突变构建包含双位点(A62V+T69SSA)、(A62V+V75I)和三位点 (A62V+T69SSA+V75I)突变的抗性检测载体。图中显示出包含这些定 点突变的抗性检测载体对d4T和AZT的表型易感性。左栏：A62V和 T69SSA突变联合对d4T敏感性的降低程度并不比单独的T69SSA突变 大，然而，这2个突变对AZT的敏感性降低了约6倍。中间栏：A62V 和V75I突变联合对d4T敏感性没有影响，A62V不会改变由V75I突变 引起的AZT敏感性的降低水平。右栏：A62V、T69SSA和V75I突变联 合对d4T敏感性的降低程度并不比单独的T69SSA突变大，V75I突变完 全抵消了由A62V和T69SSA突变引起的AZT抗性增加的6倍。

图11

病人285克隆：T69SSA定点回复体。使用定点突变回复从病人样 品285制得的抗性检测载体分子克隆中的T69SSA突变。图中显示出亲 本克隆(T69SSA)和回复体克隆(SSA69T)对d4T和AZT的表型易感 性。左栏：T69SSA突变的回复突变对d4T的抗性减少约3倍。右栏： T69SSA突变的回复突变对AZT的抗性减少约30倍。

图12

病人770克隆：+/-T69SSG+V75M。从病人样770获得的抗性检测 载体库是不均一的，由突变体或没有T69SSG和T75M突变组成。图中 显示出含有或不含有这些突变的抗性检测载体对d4T和AZT的表型敏感 性。左栏：含有T69SSG和T75M突变的抗性检测载体克隆比没有这些 突变的克隆对d4T的抗性大3倍多。右栏：含有T69SSG和T75M突变 的抗性检测载体克隆比没有这些突变的克隆对AZT的抗性大约30倍。

图13

定点突变：在逆转录酶41、62、69、184和215位氨基酸的多位点 突变。通过定点突变构建包含三位点(M41L+T69SSA+T215Y)和四位 点(M41L+A62V+T69SSA+T215Y)或五位点(M41L+A62V+T69SSA+ M184V+T215Y)突变的抗性检测载体。图中显示出包含这些定点突变 的抗性检测载体对一组共6种核苷类逆转录酶抑制剂(AZT，ddC，DDI， 3TC，d4T和Abacavir(爱博开呋))的表型易感性。M41L+T69SSA+T215Y 显著减低所有供试核苷类逆转录酶抑制剂的敏感性(2-150倍)，加入A62V 突变导致对AZT、d4T和ddI敏感性进一步降低，但不影响对3TC、ddC 和Abacavir(爱博开呋)的敏感性。含有M41L+A62V+T69SSA+M184V+ T215Y的抗性检测载体比含有4个突变M41L+A62V+T69SSA+T215Y 的抗性检测载体对AZT，d4T和ddI更加敏感，加入M184V导致对3TC 敏感性降低，但不影响对ddC和Abacavir(爱博开呋)的敏感性。

本发明涉及监控接受抗逆转录病毒治疗的病人，特别是接受核苷类 逆转录酶抑制剂抗逆转录病毒治疗的病人体内HIV感染的临床进程。

在一个实施方案中，本发明提供了一种评价病人抗逆转录病毒治疗 有效性的方法，包括：(i)从HIV感染的病人中采集生物样品；和(ii)确 定生物样品是否包含有编码HIV逆转录酶的核苷酸，在逆转录酶上有一 个或多个突变位点，这些突变的确与表型的敏感性/抗性的改变相关。在 一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价病人NRTI抗逆转录病 毒治疗有效性的方法，包括：(i)从HIV感染的病人中采集生物样品； 和(ii)确定生物样品是否包含有编码在69位密码子突变的HIV逆转录 酶的核苷酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶在69位 密码单独突变或与41位和215位密码联合突变与d4T敏感性降低有关。 在另一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价病人NRTI抗逆转 录病毒治疗有效性的方法，包括：(i)从HIV感染的病人中采集生物样 品；和(ii)确定生物样品是否包含有编码含有来自一组包括62、75、77、 116和/或151位密码子突变中的一个或更多突变的HIV逆转录酶的核苷 酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶在来自62、75、77、 116和/或151位组成的密码子组单独突变，或与来自一组包括HIV逆转 录酶上41、67、210、215、219、184、69和/或T215V位密码子突变中 的一个或更多突变同时突变，这些突变与d4T敏感性降低(抗性增加) 有关。在上述情况下，感染病人的HIV病毒的表型敏感性/抗性图和基因 型图已经修改以便反映对抗逆转录病毒制剂反应性变化。对于NRTI抗 逆转录病毒治疗，感染病人的HIV病毒可能对这里所描述的一种或多种 NRTIs有抗性，但对其它NRTIs没有抗性，因此在检测到突变后需要或 者增加抗逆转录病毒制剂的剂量，或者改换另外的抗逆转录病毒制剂， 或者在病人治疗的药物化合物中加入一种或多种额外的抗逆转录病毒制 剂。例如，如果病人在接受Stavudine(斯太呋啶)(d4T)治疗时在62、75、 77、116和/或151位密码子单独突变，或与来自一组包括HIV逆转录酶 上41、67、210、215、219、184、69和/或T215V位密码子突变中的一 个或更多突变同时突变，，病人治疗药物化合物可能需要做以下修改，(i) 或者改换不同的NRTI抗逆转录病毒制剂并停止d4T治疗；或者(ii)增加 d4T的剂量；或者(iii)在病人治疗药物化合物中加入其它抗逆转录病毒制 剂。可以通过检测病毒负载量例如HIV RNA拷贝数评价经修改的治疗 的有效性，HIV RNA拷贝数降低与治疗药物化合物的有效性正相关。

用在这里的术语“正相关”指特定的结果得出特定最有可能的结论， 而不是其它结论。

本发明另外一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价病 人NRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(i)从HIV感染的病人 中采集生物样品；(ii)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA 反转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产 物包含有逆转录酶基因；(iii)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR 产物包含有野生型或69和41和215位密码突变；以及(iv)通过PCR产 物确定是否存在69或41或215位密码突变或3个突变都存在。本发明 又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价病人NRTI抗逆 转录病毒治疗有效性的方法，包括：(i)从HIV感染的病人中采集血浆 样品；(ii)从血浆样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA反转录为 cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆 转录酶基因；(iii)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有 野生型或在来自一组包括62、75、77、116和151位组成的密码子中的 突变，和/或来自一组包括41、67、210、215、219、184、69位密码子 突变中的一个或更多突变；以及(iv)通过PCR产物确定是否存在62、75、 77、116和151位密码子突变，和/或来自一组包括41、67、210、215、 219、184、69位密码子突变中的一个或更多突变。本发明又一个优选的、 非限定性特定实施方案如下：一种评价病人NRTI抗逆转录病毒治疗有 效性的方法，包括：(i)从HIV感染的病人中采集血浆样品；(ii)从血浆 样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA反转录为cDNA，并用HIV引 物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(iii)用 引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或在69和41、 210、215、184或74位密码子突变；以及(iv)通过PCR产物确定是否存 在69位(T69SSA，T69SSG，T69SSS)和41位(M41L)、210位(L210W)、 215位(T215Y)、184位(M184V)或74位(L74V)密码子突变。本 发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价病人NRTI 抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(i)从HIV感染的病人中采集 血浆样品；(ii)从血浆样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA反转录 为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含 有逆转录酶基因；(iii)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包 含有野生型或在41、67、70、210、215和219位密码子突变；以及(iv) 通过PCR产物确定是否存在41位(m41L)、67位(D67N)、70位(K70R)、 210位(L210W)、215位(T215Y/F)和219位(K219Q)密码子突变。

HIV逆转录酶存在69位、41位和215位密码子突变表明现行或将 来的核苷类逆转录酶抑制剂治疗的疗效可能需要改变，因为如本发明所 显示的那样，69位密码子突变降低了d4T的敏感性。这里将给出运用本 发明的方法改变核苷类逆转录酶抑制剂治疗方案。同样，使用本发明的 手段和方法证实HIV逆转录酶存在62、75、77、116和/或151位密码突 变表示现行或将来的核苷类逆转录酶抑制剂治疗的疗效可能需要改变， 因为如本发明所显示的那样，在62、75、77、116和/或151位密码子突 变降低了d4T的敏感性。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转 录酶存在69位(T69SSA，T69SSG，T69SSS)和41位(M41L)、210位 (L210W)、215位(T215Y)、184位(M184V)或74位(L74V)位密 码突变表示现行或将来的核苷类逆转录酶抑制剂治疗的疗效可能需要改 变，因为如本发明所显示的那样，在69位密码子的突变/插入，或联同41、 210、215、184或74位密码子突变降低了d4T的敏感性。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV 感染的病人进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括(a)从HIV感染 的病人中采集生物样品；和(b)确定生物样品是否包含有编码HIV逆转 录酶的核苷酸，逆转录酶含有来自一组包括41、67、70、210、215和219 位密码子中的4个或更多突变，或联同74位(V74I)、69位(T69D)、 75位(V75M，V75S)或219位(K219N)密码子同时突变。运用表型敏 感性分析发现这4个或更多突变与d4T抗性明确有关。在又一个实施方 案中，HIV逆转录酶在41、67、70、210、215和219位密码子突变编码 41L，67N，70R，210W，215Y/F和219Q。在一个进一步的实施方案中，逆 转录酶在V74I，T69D，V75M，V25S，K219N位密码子突变，或联合HIV 逆转录酶上41、67、70、210、215和219位密码子中的4个或更多的突 变。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV 感染的病人进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括(a)从HIV感染 的病人中采集生物样品；和(b)确定生物样品是否包含有编码HIV逆转 录酶的核苷酸，逆转录酶含有来自一组包括67、75、77、116和151位 密码子中的1个或更多突变，或联同(E6D，K20R，A33I，T39A，E44D，S68G， Y115F，I167V，E138A，G196A，I202V，T215V，D218E，和T240K)密码子 构成的密码组中的1个或更多的突变。运用表型敏感性分析发现HIV逆 转录酶在62、75、77、116和151位密码子突变，或联合由62、75、77、 116和151位密码子中的1个或更多的突变引起对d4T敏感性的降低。

本发明提供了一种评价HIV感染的病人抗逆转录病毒治疗有效性的 方法，包括(a)从HIV感染的病人中采集生物样品；和(b)确定生物样品 是否包含有编码HIV逆转录酶的核苷酸，逆转录酶含有在69位密码子 (T69SSA，T69SSG，T69SSS)突变/插入，或联同由V75M，A158S，K20R， V21I，K102M，V179I，V241L，L283I，E297R，E6D，Q174R，D177E，R284K， A288S，E291D密码子构成的密码组中的1个或更多的突变。运用表型敏 感性分析发现在69位密码子突变/插入的存在与d4T敏感性的降低正相 关。

本发明提供了一种评价HIV感染的病人抗逆转录病毒治疗有效性的 方法，包括(a)从HIV感染的病人中采集生物样品；和(b)确定生物样品 是否包含有编码HIV逆转录酶的核苷酸，逆转录酶含有由41、67、70、 210、215和219密码子构成的密码组中的4个或更多的突变，或联同由 P1L，P9R，K20R，T39D，K43E，E44D，K64Y，V75M/S，G99R，L109V，V118I， K173E/T，I202T，R211H/T，D218E，K219N，H221Y，L228H，L283I，R284K 和A288T密码子构成的密码组中的1个或更多的突变。运用表型敏感性 分析发现由41、67、70、210、215和219密码子构成的密码组中的4个 或更多突变的存在与d4T敏感性的降低正相关。

本发明还提供了使用抗性检测载体的手段和方法，载体含有HIV基 因，更进一步地含有药物筛选所需的核苷类逆转录酶抑制剂突变。尤其 是，本发明描述了包含有HIV逆转录酶的抗性检测载体，逆转录酶具有 药物筛选所需的69、41和215位密码突变。本发明还描述了HIV逆转 录酶包含有由41、67、70、210、215和219位组成的密码组中的4个或 更多的密码子突变的抗性检测载体。本发明进一步涉及用于分离和鉴定 核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂抗性突变株的新型载体、宿主细胞及化 合物成分，以及使用这些载体、宿主细胞和组份实施抗病毒筛选。本发 明还涉及根据其抑制所述突变株的能力筛选候选药物。

本发明提供了鉴定能够影响HIV-1逆转录酶功能的化合物的方法， 包括将化合物与HIV-1逆转录酶完整肽链或部分肽链接触，其中69位 密码子改变成编码SSS，SSG或SSA氨基酸残基的插入，替换苏氨酸， 其中如果二者能够结合说明该化合物能够影响上述逆转录酶的功能。

本发明提供了鉴定能够影响HIV-1逆转录酶功能的化合物的方法， 包括将化合物与HIV-1逆转录酶完整肽链或部分肽链接触，其中将由62、 75、77、116和151位组成的密码组中的1个或多个密码子突变，这样 编码的氨基酸残基就分别不同于原先的丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、苯 丙酰胺和谷氨酸，其中如果二者能够结合说明该化合物能够影响上述逆 转录酶的功能。

本发明还提供了鉴定能够影响HIV-1逆转录酶功能的化合物的方 法，包括将化合物与HIV-1逆转录酶完整肽链或部分肽链接触，其中将 由41、67、70、210、215和219位组成的密码组中的4个或更多个密码 子突变，这样编码的氨基酸残基就分别不同于原先的甲硫氨酸、天冬氨 酸、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸或赖氨酸，其中如果二者能够结合说明该 化合物能够影响上述逆转录酶的功能。

用在这里的“源于病人的片段”包括来自于人类和各种动物种的片 段，这些动物种包括但不仅限于猩猩、马、牛、猫和狗。

源于病人的片段可以使用几种不同的克隆技术中的任何一种参入抗 性检测载体中，这在PCT国际申请编号：PCT/US97/01609中有详细描 述，该专利与1997年1月29日归档，这里一并参考。例如，克隆可以 通过将class II限制性酶切位点引入质粒主链和源于病人的片段中，或通 过尿嘧啶DNA糖基酶引物克隆。

源于病人的片段可以通过分子克隆或基因扩增的任何方法获得，或 者把要引入抗性检测载体的源于病人的片段二端通过加入下述的接受位 点进行修饰。例如，在诸如PCR的基因修饰的方法中，与病人序列接受 位点相对应的限制性酶切位点可用PCR反应的引物加入到二端。同样， 在诸如cDNA克隆的分子克隆方法中，所述的限制性酶切位点可以掺入 用于cDNA第一或第二条链合成的引物末端，或者在诸如DNA的引物 修补的方法中，无论是否是克隆的还是未克隆的DNA，所述的限制性位 点可以掺入用于修复反应的引物。设计病人序列的接受位点和引物以便 提高源于病人的片段的表现度，设计有病人接受位点的系列抗性检测载 体使得在一个单独抗性检测载体中表达度低的源于病人的片段得到重新 表达。

“抗性检测载体”指包含一并由源于病人的片段和一个指示基因组 成的DNA或RNA的一个或多个载体。抗性检测载体按照1997年1月29 日归档的PCT国际申请号PCT/US97/01609所描述方法制备，这里一并 参考，它是扩增或克隆源于病人的片段，并将扩增或克隆的序列在病人 序列接受位点插入到指示基因病毒载体中。或者，抗性检测载体(也指 抗性检测载体系统)通过将病人序列接受位点引入包装载体，扩增或克 隆源于病人的片段，并将扩增或克隆的序列在病人序列接受位点插入到 包装载体中，用指示基因病毒载体共转染该包装载体。

“指示或指示基因”如1997年1月29日归档的PCT国际申请号 PCT/US97/01609所描述的那样，指编码一个可以直接或通过反应提供一 个可以测量或可见现象的蛋白、DNA或RNA结构，例如该现象是颜色 或可测波长的光，对于用于指示的DNA或RNA是特定DNA或RNA结 构的改变或产生。指示基因的优选的例子是编码β-半乳糖苷酶的大肠杆 菌lacZ基因，编码来自例如Photonis pyralis(萤火虫)或Renilla reniformis (海紫罗兰)的荧光素酶的luc基因，编码碱性磷酸酶的大肠杆菌phoA 基因，绿荧光蛋白和编码氯霉素乙酰转移酶的细菌CAT基因。指示因子 和指示基因如1997年1月29日归档的PCT国际申请号PCT/US97/01609 所描述的那样，可以是有功能的或没有功能的。

本发明的表型药物敏感性和抗性实验可以如1997年1月29日提交 的PCT国际申请号PCT/US97/01609所描述的那样在一种或多个宿主细 胞中实施，这里一并参考。病毒药物敏感性由抑制指示基因表达量的给 定百分率所需的抗病毒制剂的浓度所确定(例如，抗病毒制剂的IC50是 抑制指示基因表达量50％的浓度)。给定抗病毒药物的药物敏感性标准曲 线可以使用上述专利申请所描述的方法为病毒区段绘制，它可以是标准 实验室病毒区段，或者来自没有用药史的病人(即没有接受抗病毒药物 治疗的病人)。相应地，对于一个特定的病人，病毒药物抗性是病毒药物 敏感性的降低，这可以通过将药物敏感性与给定标准比较来确定，或者 在一段时间内相继测定一次或多次指示基因表达抑制的增加来确定(即 减少指示基因的表达)。

加入到检测系统的抗病毒药物所选择的添加时间依赖于抗病毒药物 的靶。例如，对于HIV蛋白酶抑制剂，包括saquinavir，ritonavir，indinavir 和nelfinavir，它们在用抗性检测载体在合适的浓度范围内转染时或之后 立刻加入到包装宿主细胞中，对于HIV逆转录酶抑制剂，包括AZT，ddI， ddC，d4T，3TC，耐呋络平(nevirapine)和地拉呋啶(delavirdine)，它们在用 抗性检测载体病毒颗粒在合适的浓度范围内转染时或之前加入到包装宿 主细胞中。或者，抗病毒药物在整个分析中都存在。在宽范围浓度内选 择检测浓度，一般在大约在0.1nM到100uM之间，而且对于下列每种 药物有特定浓度：AZT，从大约6nM到大约400uM；ddI从大约15nM 到大约1,000uM；3TC，从大约9nM到大约600uM；d4T，从大约6nM 到大约400uM；ddC，从大约15nM到大约1,000uM；耐呋络平 (nevirapine)，从大约0.7nM到大约50uM；地拉呋啶(delavirdine)，从大 约0.07nM到大约5uM；Saquinavir，从大约0.02nM到大约1.5uM； indinavir，从大约0.02nM到大约1.5uM；nelfinavir，从大约0.02nM到 大约1.5uM；和ritonavir，从大约0.05nM到大约3uM。

在本发明的另一个实施方案中，在表型药物敏感性和抗性试验中， 使用包含在69、41和215位密码子突变的逆转录酶的抗性检测载体检测 侯选核苷类逆转录酶抑制剂抗病毒药物化合物。在本发明的又一个实施 方案中，在表型药物敏感性和抗性试验中，使用包含在由62、75、77、 116和/或151位组成的密码子组中选择的一个或多个密码子突变的逆转 录酶的抗性检测载体检测侯选核苷类逆转录酶抑制剂抗病毒药物化合 物。在本发明的又一个实施方案中，在表型药物敏感性和抗性试验中， 使用包含在由M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y/F和/或K219Q位组成 的密码子组中选择的4个或更多个密码子突变的逆转录酶的抗性检测载 体检测候选核苷类逆转录酶抑制剂抗病毒药物化合物。在本发明的又一 个实施方案中，在表型药物敏感性和抗性试验中，使用包含69位密码子 (T69SSA，T69SSG，T69SSS中其一)和M41L和T215Y突变，以及在 由M184V/I，L74V， A62V，V75M组成的密码子组中选择的一个或多个密 码子突变的逆转录酶的抗性检测载体检测侯选核苷类逆转录酶抑制剂抗 病毒药物化合物。侯选抗病毒药物在合适的浓度范围范围和在转染步骤 加入到检测系统中。或者，可以检测一种以上的侯选抗病毒药物，或者 侯选抗病毒药物可以联同已经证实的抗病毒药物一并检测，已经证实的 抗病毒药物是例如AZT，ddI，ddC，d4T，3TC，地拉呋啶(delavirdine)，耐 呋络平(nevirapine)，saquinavir，ritonavir，indinavir，nelfinavir或正在临床 试验的药物，例如Abacavir(爱博开呋)，或amprenavir或efavirenz。侯 选抗病毒药物的有效性将通过测定指示基因的表达或抑制进行评价。在 本发明的另一个方面，药物敏感性和抗性试验可用于筛选病毒突变，在 鉴定出对已知的抗逆转录病毒药物或侯选抗逆转录病毒药物的抗性突变 后，分离抗性突变并分析DNA，这样就可以组建病毒抗性突变库，这就 能筛选单独的或联用的侯选核苷类逆转录酶抑制剂抗逆转录病毒药物。 这就使得一个普通的技术人员也能鉴定有效的核苷类逆转录酶抑制剂抗 逆转录病毒药物，并设计有效的治疗配方。

一般材料和方法

用于构建载体、转染和感染细胞的大多数技术在技术人员中被广泛 使用，多数专业人员都熟悉这些描述了特定条件和方法的标准来源的材 料。然而，为了方便起见，以下段落可以作为指南。

“质粒”和“载体”用小写格p后加字母和/或数字表示。这里的初 始质粒或者市场可以买到，或者不受限制地已公开发表，或者可以根据 已发表的方法从可以得到的质粒进行构建。此外，与那些描述等同的质 粒在该领域中公知，对于一般熟习的技术人员也是熟知的。

本发明中构建载体使用的连接和限制酶切技术在该领域为大家所公 知(见Ausubel等，(1987)Current Protocol in Molecular Biology，Wiley Interscience or Maniatis等，(1992)in Molecular Cloning：A laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.)。分离的质粒、DNA序列或 合成的寡聚核苷酸序列被切割、加尾和再连接成想要的形式，所有已掺 入人工合成DNA的DNA构建体通过DNA序列分析来确定(Sanger等 (1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74，5463-5467)。

DNA的“消化”指用限制性酶催化切割DNA，仅作用于DNA特定 序列、限制性位点。这里使用的各种限制性酶市场能买到，它们的反应 条件、辅因子和其它要求为一般熟悉的技术人员所熟知。为分析目的， 在20ul的缓冲液中一般1ug的质粒或DNA片段使用2单位的酶，或者， 使用过量的限制性酶确保DNA底物的完全消化。在37℃温育大约1 至2小时的时间通常可行，尽管突变体可能有抗性。每次温育后，通过 酚/氯仿抽提去除蛋白，并且可以再用其中的一种抽提，用乙醇沉淀从水 相中回收核酸。可以使用标准方法通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电 泳对酶切片段进行大小排阻分离，大小排阻分离的一般描述见酶学方法 (Methods Enzymology)65：499-560(1980)。

限制性酶切片段可以用大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段处理平端 化，反应加入4种三磷酸脱氧核苷(dNTPs)，20℃使用温育时间15 至25分钟，50mM Tris(pH7.6)50mM NaCl，6mM MgCl2，6mM DDT和 5-10 dNTPs。即使存在有4种dNTPs，Klenow片段会补平5’粘末端， 而切除3’突出的单链。如果需要，可通过仅提供dNTPs中的一种或者 选择的dNTPs，根据粘性末端特性进行选择性修复。用Klenow处理后， 混合物用酚/氯仿抽提和酒精沉淀，在合适的条件下用S1核酸酶或Bal-31 处理水解任何单链部分。

连接在以下标准条件和温度下在15-50ul的体系中进行：20mM Tirs-HCl pH7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，33mg/ml BSA，10mM-50 mM NaCl，和或者40uM ATP，0.01-0.02(Weiss)单位的T4 DNA连接酶， 0℃(用于“粘端”连接)，或者1mM ATP，0.3-0.6(Weiss)单位的T4 DNA 连接酶，14℃(用于“平端”连接)。分子间粘端连接通常在33-100ug/ml 总DNA浓度(5-100mM总最终浓度)下进行，分子间平端连接(通常 使用10-30倍摩尔的过量接头)在1uM总末端浓度下进行。

“瞬时表达”指在大约转染的1天到2周内非放大表达。一个特定 目的异源蛋白瞬时表达的最佳时间可能依赖于几个因素而有所不同，这 包括例如，可能使用的反式作用因子，翻译调控机制和宿主细胞。当转 染的特定质粒起作用即转录和翻译时，就开始了瞬时表达。此时进入细 胞的质粒DNA转移到核中，DNA是非整合状态，在核中自由存在，被 细胞吸收的质粒的转录发生在这一段时间。转染后质粒DNA可能被降 解或由细胞分裂而被稀释，也会发生细胞染色质内的随机整合。

一般来说，载体包含启动子和控制序列，它们来源于与特定宿主细 胞联用的宿主细胞相容的种类。适用于原核宿主的启动子说明性的包括 β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统 和杂交启动子例如tac启动子。然而，其它功能性细菌启动子也可用。 除原核生物外，也可使用真核微生物例如酵母培养，酿酒酵母或正常贝 氏酵母是最常用的真核微生物，尽管许多其它的种类也常用。可以通过 几种来源获得哺乳动物宿主细胞载体的控制转录的启动子，例如，病毒 基因组例如：多瘤病毒、猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙 肝病毒和举细胞病毒，或来自异源哺乳动物的启动子，例如β-肌动蛋白 启动子。能很方便地获得早期和晚期启动子作为猴病毒40(SV40)包含 猴病毒40复制起始的猴病毒40限制性片段，可以很方便地获得人类腺 病毒的早期启动子作为HindIII限制性片段。当然，这里来自宿主细胞或 相关种的启动子也是可用的。

这里使用的载体可以包含选择基因，又定义为可选择性标记。选择 基因编码的蛋白对于转染了质粒的宿主细胞的存活和生长是必需的。对 于哺乳动物细胞适合的选择性标记的例子包括二氢叶酸还原酶基因 (DHFR)、鸟氨酸脱氨甲酰基酶基因、多种药物抗性基因(mdr)、腺苷 脱氨酶基因和谷氨酰胺合成酶基因。当这些选择性标记成功地导入哺乳 动物细胞时，转染的哺乳动物细胞在选择压力下就能存活。有二类截然 不同广泛使用的选择配方，第一类是根据细胞的代谢，使用突变的细胞 株，它们缺乏生长能力，要依赖于添加培养基。第二类是指显性选择， 所指的选择方案用于任何细胞类型，不需要使用突变细胞株。这些方案 通常使用药物捕获宿主细胞的生长，那些有新型基因的细胞会表达带有 药物抗性的蛋白，在选择中存活。这些显性选择的例子使用的药物有新 霉素(Southern and Berg(1982)J.Molec.Appl.Genet.1，327)、霉酚酸 (Mulligan and Berg(1980)Science 209，1422)或潮霉素(Sugden等(1985) Mol.Cell.Biol.5，410-413)。以上给出的3个例子在真核控制下应用细菌 基因分别赋予对相应的药物新霉素(G418或龙胆素)、xgpt(霉酚酸)或潮 霉素的抗性。

“转染”指将DNA导入宿主细胞，这样DNA就表达，不管是否是 功能性表达；DNA还可以作为染色体之外的元件，或整合到染色体中复 制。无论是否提到，这里转染宿主细胞所使用的方法是Graham和van der Eb(1973)Virology 52，456-457所用的磷酸钙共沉淀法。转染另外的方法 是电穿孔、DEAE-葡聚糖法、脂质转染法和biolistics(Kriegler(1990)Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual，Stockton Press)。

宿主细胞可以用本发明的表达载体转染，在经修改以便适合于诱导 启动子、筛选转化子或扩增基因的传统培养基上培养。宿主细胞在F12∶ DMEM(Gibco)50∶50上培养，添加谷氨酰胺不加抗生素。培养条件，例 如温度、pH及诸如此类，是那些以前用于宿主细胞选择性表达的条件， 对于普通技术人员将一目了然。

以下实施例仅仅表示目前已知的实施本发明的最佳模式，但不应当 解释为限制本发明。本说明书引用的所有发表物和专利在这里均作为一 个整体一并参考，就好象每一个发表物或专利应用都是特定的和单独的 说明一并参考。

实施例1

使用抗性检测载体进行表型药物敏感性和抗性试验

使用如1997年1月29日归档的PCT国际申请号PCT/US97/01609 所描述的手段和方法实施表型药物敏感性和抗性试验，这里一并参考。

在这些实验中，对应于HIV蛋白酶和逆转录酶编码区的源于病人的 片段可以使用从HIV感染的个体的血浆中存在的病毒颗粒中分离的病毒 RNA，通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增源于病人的片段， 或者通过对抗性检测载体DNA的亲本克隆点突变制备野生型HIV-1型 的突变株。使用经典方法实施病毒RNA的分离(例如，RNAgents Total RNA Isolation System，Promega，Madison WI或RNAzol，Tel-Test， Friendswood，TX)。RT-PCR程序分二步，使用逆转录病毒的逆转录酶(例 如Moloney MuLV逆转录酶(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg， NJ)，或禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶，(Boehringer Mannheim， Indianapolis，IN))将病毒RNA复制成cDNA，接着使用热稳定DNA 聚合酶扩增cDNA(例如，Taq(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg， NJ)，Tth(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ)，PrimeZyme(从 Thermus brockianus，Biometra，Gottingen中分离，Germany))或者如“长 PCR”操作所描述的将热稳定聚合酶联用(Bames，W.M.，(1994)Proc.Natl. Acad.Sci，USA 91，2216-2220)(例如，扩展的高保真PCR系统(Taq+ Pwo)，(Boehringer Mannheim，Indanapolis，IN)或GeneAmp XL PCR Kit (Tth+Vent)，(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ))。

用于扩增“检测”源于病人的片段的引物，ApaI引物(PDSApa) 和AgeI引物(PDSAge)，包含ApaI和AgeI识别的位点序列，它们引入 到PCR产物的5’和3’末端，这在1997年1月29日归档的PCT国际 申请号PCT/US97/01609分别有描述。

掺入“检测”源于病人片段的抗性检测载体是按照1997年1月29 日归档的PCT国际申请号PCT/US97/01609的描述进行构建的，使用病 毒RNA作为模板和寡聚核苷酸PDSApa和PDSAge作为引物，通过RT- PCR制备1.5kB的DNA扩增产物，然后用ApaI和AgeI或同切点酶PINAI 消化。为了确保和合成的抗性检测载体相对应的质粒DNA含有特定病 人血浆中存在的HIV病毒准种的代表样品，将在给定的抗性检测载体构 建中获得的大量(＞100)的独立的转化子合并，用于质粒DNA的制备。

编码兼嗜性MuLV 4070A env基因产物的包装表达载体能够在抗性 检测载体宿主细胞中产生抗性检测载体病毒颗粒，它能有效感染人类靶 细胞。除env基因外，编码所有HIV基因的抗性检测载体用于转染包装 宿主细胞(一旦转染的宿主细胞是指作为抗性检测载体宿主细胞)。编码 兼嗜性MuLV 4070A env基因产物的包装表达载体与抗性检测载体联 用，能够在抗性检测载体宿主细胞中产生传染性的假型抗性检测载体病 毒颗粒。

使用包装宿主或由人类胚胎肾细胞株293(Cell Culture Facility，UC San Francisco，SF，CA)或Jurkat白血病T细胞株(Arthur Weiss，UC San Francisco，SF，CA)组成的靶宿主细胞，用抗性检测载体实施抗性试验。

使用二种宿主细胞类型用抗性检测载体实施抗性试验。抗性检测载 体病毒颗粒由第一个宿主细胞(抗性检测载体宿主细胞)产生，它是通 过用抗性检测载体和包装表达载体转染包装宿主细胞来制备，接着抗性 检测载体病毒颗粒用于感染第二个宿主细胞(靶宿主细胞)，在该细胞中 可以测量指示基因的表达。

构建包含功能荧光基因盒的抗性检测载体，并用抗性检测载体DNA 转染宿主细胞。包含源于病人的逆转录酶和蛋白酶序列的抗性检测载体 对抗逆转录病毒制剂有敏感性或抗性，例如核苷类逆转录酶抑制剂、非 核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。无论是否存在蛋白酶抑制剂， 通过将抗性检测载体病毒颗粒转染宿主细胞产生抗性检测载体病毒颗 粒，在核苷类逆转录酶抑制剂或非核苷类逆转录酶抑制剂或药物浓度增 加的条件下用于感染靶宿主细胞。药物存在下感染的靶宿主细胞中产生 的荧光酶活性量与药物不存在时感染的靶宿主细胞中产生的荧光酶活性 量二者比较，抑制没有药物时检测荧光素的50％(抑制浓度50％，IC50) 所需要的药物量作为药物抗性检测，通过绘制药物对log10药物浓度的 百分比抑制确定IC50的值。

宿主细胞接种于10厘米直径的培养皿中，接种几天后用抗性检测载 体质粒DNA和包膜表达载体转染。转染用磷酸钙沉淀程序完成，含有 DNA沉淀剂的细胞培养基在转染后的1到24小时换成新鲜的培养基。 转染后的1至4天收集包含抗性检测载体病毒颗粒的细胞培养液，在80℃ 储存前滤过0.45mm的滤膜。在收集的细胞培养液中HIV衣壳蛋白(p24) 的含量通过制造商描述的EIA方法(SIAC；Frederick，MD)确定。感染 前，靶细胞(293和293/T)接种于细胞培养液中，使用来自模拟转染(不 含DNA)或包含没有包膜表达质粒的抗性检测载体质粒DNA的转染的 细胞培养液实施对照感染。感染后的1至3天或更多天移去培养基，在 每个孔加入细胞裂解液(Promega)，分析细胞裂解物的荧光素活性 (Fig.3)。药物的抑制效果用以下公式计算：

％荧光酶抑制＝1-(RLUluc[药物]÷RLUluc)×100

其中RLUluc[药物]是药物存在时感染细胞中荧光素酶活性的相对光 单位，RLUluc是药物不存在时感染细胞中荧光素酶活性的相对光单位。 IC50的值通过S形曲线获得，曲线是从绘制药物对log10药物浓度的百 分比抑制的数据中产生。药物抑制曲线见(Fig.3)。

实施例2

表型敏感性和基因型相关分析

病人HIV样品表型敏感性分析

如实施例1中描述构建抗性检测载体。在表型分析中测定抗性检测 载体，或来源于抗性检测载体库的克隆，以便精确和定量确定抗逆转录 病毒药物栏的敏感性水平，该抗逆转录病毒药物栏可能包括几类成员， 象核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂 (NNRTIs)和蛋白酶抑制剂(PRIs)。在有新的药物或新药物靶时该药 物栏可以扩大。检查所有检测药物敏感性模式，并与已知敏感性模式比 较，病人样品可进一步检测与观察到的敏感性模式相关的基因型变化。

病人HIV样品基因型分析

抗性检测载体DNAs，无论是库或克隆，可通过实施例2所描述的 任何基因型方法进行分析。在本发明的一个实施方案中，运用病毒RNA 纯化、RT/PCR和ABI链终止子自动测序确定病人HIV样品序列，确定 的序列同数据库中存在的对照序列比较，或如果可能，与治疗开始之前 病人的样品比较。基因型检测是找出与对照或治疗前序列不同的序列， 以及它与观察到的表型之间的相关性。

点突变的表型敏感性分析

通过构建包含在限定的野生型(对药物敏感)遗传背景下特定突变 的抗性检测载体评价观察到的基因型变化与药物敏感性表型模式变化之 间的相关性。突变可以单独掺入，和/或其它已知的认为能调节HIV对特 定药物或药物组敏感性的药物抗性突变一并掺入。通过任何广为公知的 定点突变的方法将突变引入抗性检测载体。在本发明的一个实施方案中， 使用大引物PCR的方法进行定点突变，然后使用上述表型敏感性分析检 测包含特定突变或突变组的抗性检测载体，并将敏感性图谱与没有特定 突变的遗传限定的野生型(对药物敏感)抗性检测载体二者比较，对所 检测的抗逆转录病毒药物表型敏感性模式观察到的变化可以归因于引入 到抗性检测载体中的特定突变。

实施例3

表型敏感性与基因型分析的相关性：与多种药物抗性(MDR)突变 相联的D4T抗性

来自病人96-136，97-240，98-955和98-960的抗性检测载体的表型 分析

按照实施例1所描述的方法从标记为96-136，97-240，98-955和98- 960的病人样品中构建抗性检测载体。病人136和240以前已经用包括d4T 的药物化合物进行了不同时间的治疗，病人955和960的药物治疗史还 不清楚。使用病毒RNA的分离和RT/PCR制备包含所有蛋白酶和逆转录 酶1-313位氨基酸的病毒序列的源于病人的片段，源于病人的片段插入 指示基因中，从而构建标记为RTV-136，RTV-240，RTV-955和RTV-960 的抗性检测载体。运用表型敏感性分析检测这些RTVs载体，以便准确 和定量地确定抗逆转录病毒药物栏的敏感性水平。抗逆转录病毒药物栏 包括已知的几组成员，包括核苷类逆转录酶抑制剂(AZT，3TC，d4T，ddI， ddC和abacavir(爱博开呋))、非核苷类逆转录酶抑制剂(地拉呋啶 (delavirdine)和耐呋络平(nevirapine))和蛋白酶抑制剂(indinavir，nelfinavir， ritonavir和saquinavir)。测定每种检测药物的IC50，检验病人病毒对每 种药物的敏感性，并与已知的敏感性模型比较，观察到在这些RTV载体 库中的每一种与野生型对照相比对4dT的敏感性均降低。进一步检查病 人样品可能与观察到的d4T敏感性模式相关的基因型变化。

确定病人RTV DNAs的基因型

通过ABI链终止子自动测序分析RTV DNAs，将核苷酸序列与野生 型分化B HIV-1(HIV Sequence Database Los Alamos，NM)的相同序列比 较，检查核苷酸序列与对照序列不同的序列。RTV-136在M41L，D67N， V75I，F116Y，Q151M，M184V，T200A，和T215Y位点有突变，RTV-136 的所有突变在每个位点是以野生型和突变氨基酸混合存在的。RTV-240 在A62V，S68G，V75I，F77L，F116Y，E138A，Q151M，和M184V位点有突 变，RTV-955在E6D，K20R，V35I，A62V，D67N，T69D，V75I，F77L，K101E， K103N，Y115F，F116Y，Q151M，I167V，Y181C，M184V，G190A，I202V， R211K，F211K，F214L，T215V，和K219Q位有突变，在101、103、181 和190位突变在每个位点是以野生型和突变氨基酸混合存在的。RTV-960 在A33I，T39A，M41L，E44D，D67N，T69D，K103N，Q151M，M184I，G190A， L210W，R211K，T215Y，D218E，T240K，和A288S位有突变，在A62V，V75I， F77L，F116Y，和Q151M位突变以前已经描述会导致对核苷类逆转录酶 抑制剂的广谱交叉抗性，也称作多种药物抗性(MDR)突变。所有这些 RTV DNAs包含一个或几个这些MDR突变。此外，一些RTV DNAs具 有与AZT抗性(M41L，D67N，L210W，T215Y，和K219Q)、ddC抗性 (T69D)、非核苷类逆转录酶抑制剂抗性(K101E，K103N，Y181C，和 G190A)、3TC抗性(M184V)相关的突变，或以前没有发现特性的突变 (E6D，K20R，A33I，T39A，E44D，S68G，Y115F，I167V，E138A，G196A， I202V，T215V，D218E，和T240K)。已经知道在V35I，R211K，和F214L 位突变是HIV野生型(对药物敏感)突变株的多态性。

定点突变

构建包含Q151M单独突变，或与公认的调节HIV对核苷类逆转录 酶抑制剂敏感性的V75I药物抗性突变联合突变的抗性检测载体。使用定 点突变的大引物PCR方法将突变引入抗性检测载体。(Sakar G and Sommar SS(1994)Biotechniques 8(4)，404-407)。运用上述表型敏感性分 析检测含有Q151M突变(Q151M-RTV)的抗性检测载体，将结果与在151 位点是野生型的遗传限制抗性检测载体比较，与野生型相比，Q151M-RTV 对核苷类逆转录酶抑制剂、d4T的表型敏感性模式发生了改变。在其它 野生型背景下(即Q151M单独突变)，Q151M-RTV比野生型对照RTV 对d4T的敏感性要低一些，在Q151M-RTV中还观察到对AZT，ddC和ddI 敏感性的显著变化。还将Q151M突变引入到包含V75I突变的RTV中， 将V75I突变加入Q151M背景中导致对AZT敏感性增加和对d4T敏感 性降低。V75I单独突变对d4T敏感性没有影响，并导致对AZT敏感性 增加。还构建了包含A62V单独突变和与V75I联合突变的RTVs载体， 这些RTVs与野生型RTV相比它们对d4T敏感性不变，然而二者对AZT 的敏感性有轻微增加。

实施例4

表型敏感性与基因型分析的相关性：与在逆转录酶69位氨基酸插入 相关的4dT抗性

来自病人97-621，97-285，98-690，98-770和98-771的抗性检测载 体的表型分析

按照实施例1所描述的方法从标记为97-621，97-285，98-690，98-770 和98-771的病人样品中构建抗性检测载体。病人样品285和690是从同 一病人间隔6个月获得的系列样品，病人285/690，770和771以前已经 用包括d4T的药物化合物进行了不同时间的治疗，病人621的药物治疗 史还不清楚。

有69SSX插入的病毒样品的病人治疗史

病人VL#770(JCW)最初用AZT单一治疗，接着ddC加入到配方中， 这2种药物大约使用了8个月时间。后来15个月时间的治疗不清楚，接 着病人VL#770(JCW)用AZT和3TC联用治疗了约2年半的时间。病人 VL#285/690(JWA)用AZT单一治疗了约1年零9个月时间，接着转入ddI 单一治疗8个月时间，他又回到AZT单一治疗1年零3个月，接着用ddC 治疗了近2年时间。治疗变成AZT和3TC联用近1年时间，接着变为 d4T/3TC/NFV联用大约9个月时间。病人VL#771(BMN)最初用AZT，ddC， 和PRI，RTV联用治疗，3TC接着加入到该联用药物中一直到治疗转入d4T 和RTV为止，该治疗持续了大约6个月，接着变为3TC/d4T/ddI和RTV 联用治疗。有约6个月时间没有接受治疗，接着接受AZT，3TC和ddI治 疗，联合治疗接着转换为3TC，d4T和IDV。病人VL#1057(DHW)用AZT 单一治疗了大约3年，接着变为ddI单一治疗1年，有大约8个月时间 没有接受治疗，接着用AZT和3TC治疗了1年，继续用AZT治疗，但 将3TC换为d4T和PRI，加入IDV。接着短期将d4T变回3TC，直到被 NNRTI，DEL取代。使用病毒RNA分离和RT/PCR制备包含编码所有蛋 白酶和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒序列的源于病人的片段，将源于 病人的片段插入指示基因病毒载体，以便构建标有RTV-621，RTV-285， RTV-690，RTV-770，和RTV-771的抗性检测载体。运用表型敏感性分析 检测这些RTVs载体，以便准确和定量地确定抗逆转录病毒药物栏的敏 感性水平。抗逆转录病毒药物栏包括已知的几组成员，包括核苷类逆转 录酶抑制剂(AZT，3TC，d4T，ddI，ddC和abacavir(爱博开呋))、非核苷类 逆转录酶抑制剂(地拉呋啶(delavirdine)和耐呋络平(nevirapine))和蛋白 酶抑制剂(indinavir，nelfinavir，ritonavir和saquinavir)。测定每种检测药 物的IC50，检验病人病毒对每种药物的敏感性，并与已知的敏感性模型 比较，观察到在这些RTV载体库中的每一种与野生型对照相比对4dT的 敏感性均降低。进一步检查病人样品可能与观察到的d4T敏感性模式相 关的基因型变化。

测定患者RTV DNAs的基因型

使用ABI链终止子技术自动测定抗性试验载体的核酸序列。所得核 酸序列同野生型分枝B HIV-1的保守序列(美国新墨西哥州洛斯阿拉默 斯HIV序列数据库)比较，找出与对照序列不同的序列。RTV-621含有 M41L、A62V、T69SS、V75M、M184V、L210W和T215Y。RTV-621 上41、62和75每一个位点出现的核酸序列既有野生型也有突变的核。 RTV-285含有下列突变：M41L、A62V、T69SSA、L74V、A158S、I178M、 M184V、T200A、L210W和T215Y。RTV-690含有下列突变：K20R、 M41L、A62V、T69SSG、V75M、K102M、K103R、V179I、M184V、T215Y、 V241L、L283I和E297I。158和181两位点每一个位点处的核酸序列既 有野生型也有突变型。RTV-770含有下列突变：V21I、M41L、T69SSG、 V75M、K102M、K103R、V179I、M184V、T215Y、V241L、L283I和E297R。 69和75两位点中任一位点处出现的核酸序列既有野生型也有突变型。 RTV-771含有下列位点突变：E67D、V35I、M41L、T69SSS、V75M、I135V、 Q174R、D177E、M184V、T299I、L210W、R211K、T215Y、R284K、 A288S和E291D。174和200两位点中任一位点处出现的核酸序列既有 野生型也有突变型。在逆转录酶69位或其附近，所有这些抗性试验载体 的核酸均有额外的氨基酸异常插入。这里将这种异常插入记为T69SSX， X代表甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或丙氨酸(A)。以前将A62V突变描 述为多药物抗性突变(MDR)之一。这种多药物突变对实施例3中所述 对于NRTI类药物的广谱交叉抗性发挥一定作用。此外，所有这些抗性 试验载体都具有一些与特定药物抗性相关的突变集合。与AZT-抗性相关 的突变集合：M41L、D67N、L210W、T215Y和K219Q；与ddC-抗性相 关的突变集合：L74V、L74I、T69D；与NNRTI类药物-抗性相关的突变 集合：K103N、Y181C和G190A；与3TC-抗性相关的突变有M184V； 或者以前未鉴定的其它突变：V75M、A158S、K20R、V21I、K102M、 V179I、V241L、1283I、E297R、E6D、Q174R、D177E、R284K、A288S、 E291D。在V35I、K103R、I135V、D177E、I178M、V179I、T200A/I、 R211K和F214L的突变属于已经观察到在HIV野生型变体上的多态性。

反向突变

应用通称作反向突变的方法，进一步鉴定T69SSX突变在d4T-抗性 中的作用。RTV-285库中的克隆，其逆转录酶含有下列突变：M41L、 A62V、T69SSA、L74V、A158S、I178M、M184V、T200A、L210W和 T215Y。从该库中分离出一个功能性克隆。应用定点突变手段将69位三 体“SSA”特异地突变位单个苏氨酸“T”。这个回复突变子含有除69位 SSA三体插入外285-1克隆上出现的其它全部突变。285-1突变子对d4T 和AZT的抗性均表现为显著增加，d4T增加3倍，AZT增加30倍。鉴 定从RTV-770库中分离的单个克隆，获得了T69SSA插入突变在NRTI- 抗性中作用的进一步证据。RTV-770库中出现两类克隆。第一类含有如 下突变：V21I、M41L、K102M、K103R、V179I、M184V、T215Y、V241I、 L283I和E297R；另一类含有第一类的全部突变，同时还含有T69SSG 和V75M。那些带有69和75位突变的第二类突变对d4T和AZT敏感性 均显著增加，d4T增加了4倍，AZT增加了30倍。构建抗性试验载体， 仅含有T69SSA突变的载体，或者还同时含有其它药物抗性突变或是被 怀疑能够调节HIV对NRTI类药物敏感性之突变。与应用大引物PCR方 法进行定点突变，向抗性试验载体导入突变(Saker G and Sommar SS (1994)Biotechniques 8(4)，404-407)。应用以上所述的表型敏感性试 验的方法，对含有突变T69SSA的抗性试验载体T69SSA-RTV进行测试， 所得结果与另一个遗传背景明确的抗性试验载体做比较。该抗性试验载 体的第69位点是“T”，为野生型。与野生型抗性试验载体比较， T69SSA-RTV对d4T的敏感性下降两倍，还观察到T69SSA-RTV对AZT 的敏感性发生轻微而显著的变化。

此外还将T69SSA突变引入到含有V75I的抗性试验载体上。将 V75I引入T69SSA背景导致对AZT敏感性增加而对d4T敏感性下降。V75I 单独突变对d4T敏感性没有作用，但引起AZT敏感性增加。

此外，还将T69SSA突变引入到含有A62V的抗性试验载体上。A62V 单独突变对所有被测试的逆转录酶抑制剂类药物的敏感性没有作用。将 A62V引入T69SSA背景对d4T敏感性没有影响，但对AZT的敏感性则 显著下降(6倍)。

构建了一个含有A62V、T69SSA和V75I的抗性试验载体。三重突 变对AZT的敏感性表现一个非常微小的下降(2倍)(如同T69SSA单 独突变一样)，而对AZT的敏感性则轻微增加(不到2倍)。

构建若干抗性试验载体含有T69SSA插入突变，同时含有AZT-抗性 突变(M41L、A62V、T215Y)和3TC-抗性突变(M184V)的不同组合。 在M41L、T69SSA和T215Y位点含有突变的抗性试验载体对d4T和AZT 的敏感性都有显著的降低，分别降低了5倍和160倍。向该背景加入A62V 突变使得对d4T和AZT的敏感性进一步下降，分别为10倍和超过1000 倍。出现M184V对于d4T敏感性没有影响，但引起AZT敏感性增加。

构建一个抗性试验载体，含有突变M41L、T69SSA、T215Y和 L210W。向一个含有M41L、T69SSA和T215Y三重突变的抗性试验载 体引入突变L210W，导致AZT的抗性发生实质性的降低(大于1000倍)。 与此相对的，M41L-T69SSA-T215Y-RTV对AZT的敏感性降低了140倍。 如果与M41L-T69SSA-T215Y-RTV做比较，L210W对其它的NRTI类药 物敏感性没有影响。与M41 L-T69SSA-T215Y-RTV做比较，M41L- T69SSA-T215Y-L210W-RTV药物敏感性，对ddC降低了3倍，对ddI降 低了3.5倍，对3TC降低了17倍，对d4T降低了10倍，对abacavir降 低了14倍，都只是轻微的改变。相对M41L-T69SSA-T215Y-RTV，L2110W 突变对NNRTI类药物、DEL(0.3倍)和NEV(0.42倍)的敏感性没有附 加作用。而M41L-T69SSA-T215Y-RTV对DEL和NEV的敏感性也表现 出轻微的增加。

构建一个抗性试验载体含有如下四个位点的突变：M41L、A62V、 T69SSA和T215Y。该载体，亦即M41L-A62V-T69SSA-T215Y-RTV，敏 感性表型如下：对AZT的敏感性发生实质性的下降(大于1000倍)，对 ddC的敏感性处于野生型水平(2.1倍)，对ddI的敏感性轻微下降(3倍)， 对3TC的敏感性轻微降低(8倍)，对abacavir的敏感性轻微下降(10倍)。 该载体对NNRTI类药物、DEL(0.2倍)和NEV(0.8倍)的敏感性均增加了。

此外，还将L210W突变引入到另一个载体上。此载体含有另外四个 位点突变：M41L、A62V、T69SSA和T215Y。该载体，亦即M41L- A62V-T69SSA-T215Y-L210W-RTV，对不同药物的敏感性表现如下：对 AZT的敏感性发生实质性的降低(大于1000倍)，对ddC的敏感性轻度 下降(2.1倍)，对ddI的敏感性表现为轻微降低(3倍)，对3TC的敏感 性有中等程度降低(22倍)，对d4T的敏感性有中等程度之降低(13倍)， 对abacavir的敏感性亦有中等程度之降低(16倍)。此载体对NNRTI类 药物、DEL(0.2倍)和NEV(0.6倍)的敏感性表现出了增加。抗性试 验载体M41L-A62V-T69SSA-T215Y-L210W-RTV的敏感性表型相似于缺 乏L210W但含有另外四个突变位点的抗性试验载体。

将T215Y突变导入含有A62V和T69SSA两突变的载体。导入T215Y 导致该载体对AZT的敏感性发生实质性降低(1000倍)，与A62V- T69SSA-RTV相比降低1000倍。后者对AZT的敏感性只降低了7倍。 观察对其它抑制剂的敏感性，结果类似于没有T215Y突变的载体。 A62V-T69SSA-T215Y-RTV对ddC的敏感性表现出野生型水平(1.3倍)， 对ddI的敏感性轻微下降(2.5倍)，对3TC的敏感性有中度下降(15倍)， 对d4T的敏感性轻微下降(7倍)，对abacavir的敏感性轻微下将(10倍)。 此载体对NNRTI类药物，DEL(0.3倍)和NEV(0.6倍)的敏感性增加。

此外，还将突变L74V导入含有A62V和T69SSA的载体。对受试 抑制剂的敏感性试验结果，与在不含有L74V突变的抗性试验载体上观 察所得结果相似，且与在含有T215以及A62V和T69SSA突变的载体上 所测结果相似。最大的变化是在A62V-T69SSA-L74V-RTV上观测到对 AZT的敏感性回复到野生型水平。载体A62V-T69SSA-L74V-RTV对ddC 表现出野生型水平敏感性(1.8倍)，对ddI的表现出野生型水平敏感性(1.9 倍)，对3TC的敏感性轻微下降(2.5倍)，对d4T的敏感性轻微下将(1.5 倍)，对abacavir的敏感性轻微下降(3倍)。该载体对NNRTI类药物、 DEL(0.4倍)和NEV(0.3倍)的敏感性均增加。

构建抗性试验载体，含有突变M41L、T69SSA、L210W和V75M。 将突变V75M导入含有其它四个突变(M41L、T69SSA、L210W和T215Y) 的载体，与没有V75突变的载体比较，对载体的药物敏感性并没有影响。 M41L-T69SSA-T215Y-L210W-V75M-RTV对AZT的敏感性发生实质性 的下降(大于1000倍)，对ddC的敏感性轻微下降(2.9倍)，对ddI的 敏感性轻微下降(3.5倍)，对3TC的敏感性中度降低(17倍)，对d4T 的敏感性中度下降(11倍)，对abacavir的敏感性发生中等程度之下降 (19倍)。该载体对NNRTI类药物、DEL(0.25)和NEV(0.5倍)的敏感 性均增加。

实施例5

建立敏感性表型与基因型分析之间的关联性：与AZT-抗性突变之复 杂组合相关的d4T突变。

从患者98-757、98-844、98-937、98-964和98-966构建抗性试验载 体并进行表型分析

如实例1中所述，从患者样本98-757、98-844、98-937、98-964和98-966 构建抗性试验载体。所有这些患者以前都接受过时间不等的包括d4T在 类的药物治疗。分离病毒RNA，进行逆转录-PCR，得到一段来自患者的 片段。该片段包括编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位的病毒序列。将 此患者来源片段插入一个含有报告基因的病毒载体，获得若干抗性试验 载体，分别记为RTV-757、RTV-844、RTV-937、RTV-964和RTV-966。 应用一种表型试验方法，在这些抗性试验载体上准确定量地其对一组抗 逆转录病毒药物的敏感性水平。这组抗逆转录病毒药物包括通称为NRTI 类的一些药物(AZT、3TC、d4T、ddI、ddC和abacavir)、一些NNRTI 类药物(delavirdine和nevirapine)和一些PRI类药物(indinavir、nelfinavir、 ritonavir和saquinavir)。对每一试验药物测定其半数抑制浓度IC50。检 查患者的病毒对每一种药物的敏感性，并与已知的药物敏感性模型比较。 在每一个这些RTV库上，观察d4T的药物敏感性，较之于野生型对照RTV 都发生了下降。进一步检查患者样本，找出与所观察到的d4T敏感性模 型相关的基因型变化。

测定患者RTV DNA的基因型

使用ABI链终止子技术自动测定抗性试验载体的核酸序列。所得核 酸序列同野生型分枝B HIV-1的保守序列(美国新墨西哥州洛斯阿拉默 斯HIV序列数据库)比较，找出与对照序列不同的序列。RTV-757含有 V35I、D67N、T69D、K70R、V106A、V108I、L109V、Y181C、V189L、 T200A、I202T、R211K、T215F、D218E、K219Q、H221Y、L228H、L283I 和R284K。106、108和109每一个位点出现的核酸序列既有野生型也有 突变的核酸序列。RTV-884含有下列突变：M41L、D67N、T69D、I135V、 L210W、T215Y和K219N。RTV-937含有下列突变：P1L、P9R、K20R、 V35T、K64Y、D67N、K70R、V75M、G99R、I135V、K173E、Y188L、 R211H、T215F、D218E和K219Q。RTV-964含有下列突变：M41L、K43E、 D67N、K70R、L74I、V75S、Y181I、R211T、T215Y、D218E和K219N。 RTV-966含有下列突变：K20R、T39D、M41L、E44D、D67N、L74V、 A98S、V118I、I135T、K166R、K173T、M184V、G196E、L210W、R211K、 T215Y、D218E、K219R、L228H、V245E、K277R、T286A、A288T和 V293I。所有这些抗性试验载体的核酸都含有一个或数个突变；这些突变 包括以前与AZT-抗性关联的突变(M41L、D67N、L210W、T215Y/F和 K219Q/R)、与ddC-抗性关联的突变(T69D和L74I/V)、与NNRTI类药 物抗性关联的突变(V106A、V108I、Y181C/I和Y188L)、与3TC-抗性 关联的突变(M184V)，或者以前尚未鉴定的突变(P1L、P9R、K20R、 T39D、K43E、E44D、K64Y、V75M/S、G99R、L109V、V118I、K173E/T、 I202T、R211H/T、D218E、K219E、H221Y、L228H、L283H、R284K 和A288)。已知在V35I/T、A98S、I135V/T、K166R、G196E、T200A、 R211K、F214L、V245E、K277R、T286A和V293I这些位点的突变是HIV 野生型(药物敏感)的多态性。

在这些患者样本上导致d4T敏感性下降的突变并不清楚。有些患者 样本，含有许多与患者身上发现的突变相同；然而这些患者并不表现出 对d4T的敏感性降低。

定点突变

用定点突变手段构建抗性试验载体，含有五个(M41L、D67N、K70R、 L210W、T215Y和K219Q)或六个(M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y 和K219Q)与AZT-抗性相关的突变。测定对NRTI类药物的敏感性表型。 在这些观察到对AZT(75-180倍)和d4T(2倍)的敏感性显著下降。

实施例6

鉴定HIV-1逆转录酶氨基酸变化，预测对核苷类逆转录酶抑制剂的 反应

HIV-1逆转录酶69位氨基酸变化的表型与基因型之间的关联性

在本发明的一个实施方案中，应用下述方法评价HIV-逆转录酶蛋白 69位氨基酸变化的效应。这些方法包括：(i)从hiv-1感染个体采集 生物样本；(ii)分析生物编码HIV-1逆转录酶的核酸在69位密码子是 否发生突变。(iii)d4T敏感性下降河AZT敏感性降低，69位密码子突 变相关(T69SSX)；这突变可以单独存在，或者处于其它NRTI-抗性突 变的背景(例如，M41L、A62V、D67N、K70R、L74V、V75I/M、T215Y/F、 K219Q)。

生物样本包括全血、血液组成成分包括外周血单核细胞(PBMC)、 血清、血浆(用不同的抗凝剂如EDTA、柠檬酸-右旋糖苷、肝素等制备)、 组织切片、脑脊液(CSF)或其它细胞、组织或体液。在本发明的另一 实施方案中，可以直接从生物样本中分离HIV-1核酸(基因组RNA)或 逆转录酶蛋白，或者在从生物样本中分离纯化病毒粒子以后进行。要分 析HIV-1逆转录酶69位氨基酸是否突变，可用如下数种方法进行，例 如直接对编码逆转录酶的病毒核酸进行鉴定，或者直接鉴定病毒逆转录 酶蛋白本身。可用如下所列的方法确定逆转录酶69位氨基酸：利用经典 或新式蛋白质测序技术、抗体表位识别技术或其它特异结合蛋白或化合 物，直接鉴定逆转录酶蛋白；此外，还可以鉴定HIV-1逆转录酶蛋白编 码序列扩增产物来确定HIV-1逆转录酶蛋白69位氨基酸。对HIV-1核 酸进行扩增，可用如下方法进行，包括逆转录-PCR、NASBA、SDA、RCR 或3SR。具有普通技能的操作人员就将知道这些方法。分析编码HIV-1 逆转录酶的核酸69位密码子是否发生突变，可直接对核酸测序，包括多 引物延伸-链终止方法(Sanger，ABI/PE and Visible Genetics)或链断裂 方法(Maxam and Gilbert)，或者最近开发的其它测序技术，例如飞行时 间质谱法(MALDI-TOF)、质谱法(Sequenom，Gene Trace Systems)。 此外，测定编码69位氨基酸的核酸序列可以应用各种杂交方法进行，例 如基因芯片杂交测序法(Affymetrix)、line probe assay(LiPA；Murex) 和差示杂交(Chion)。

在本发明的一个优先实施方案中，从生物样本制备抗性试验载体进 行敏感性表型试验，分析HIV-1逆转录酶69位氨基酸是野生型还是突 变型。在一实施方案中，采集血浆样品，纯化病毒RNA，进行逆转录扩 增出一段来自患者的片段(PDS)。这段片段编码了病毒蛋白酶和逆转录 酶区域。然后，经由DNA连接和细菌转化，将这个患者来源片段插入 含有报告基因的病毒载体，于是获得一个抗性测试载体。从细菌培养物 中分离抗性试验载体，如实施例1中所述进行表型敏感性试验。对含有 T69SSX突变/插入的患者样本进行表型敏感性试验，结果见Figure5。从 患者样本621、690、770、771得到的患者来源的HIV-1蛋白酶和逆转 录酶区域核酸序列，应用荧光检测链终止循环测序法(ABI/PE)测定其 序列。该方法被用来测定患者个体样本中代表各种HIV-1变体混合物序 列组合的保守核酸序列(代表准属)，且用来测定单个变体的核酸序列。

患者样本的表型敏感性图和定点突变体表现出d4T敏感性显著下降 和AZT-敏感性增加。这两者都与下列突变相关：编码HIV-1逆转录酶69 位的丝氨酸、丝氨酸、丝氨酸(SSS)，丝氨酸、丝氨酸、丙氨酸(SSA) 或丝氨酸、丝氨酸、甘氨酸(SSG)编码系列的突变；以及上述位点一 些子集的突变。这些位点包括以前与NRTI类药物抗性相关的突变(41、 67、70、74、75、184、210、215和219)或在这些患者中观察到但以前 从未鉴定过的位点(1、6、9、20、21、33、39、43、44、64、68、99、 109、115、118、138、158、167、173、174、177、179、196、202、211、 218、221、228、240、241、283、284、288、291和297)。

69位含有插入突变的患者样本，其表型敏感性图显示对AZT、 3TC、ddC、ddI、d4T和abacavir。

HIV-1逆转录酶62、75、77、116和151氨基酸突变的表型和基因 型的关联性

患者样本的表型敏感性图和定点突变体表明：如果HIV-1逆转录酶 62、75、77、116和151这些位点，或者这些位点的子集含有下列氨基 酸62V、75I、77L、116F或151M，则对NRTI类药物敏感性显著下降 (AZT、ddC、ddI、3TC、d4T和abacavir)。在41、67、69、184、210、 215和219出现额外突变会进一步修饰(增加或降低)对NRTI类药物的 敏感性。

建立HIV-1逆转录酶中以前与AZT-抗性相关的突变对d4T抗性的 表型与基因型之间的关联性

患者样本的表型敏感性图和定点突变体表明：如果以前与AZT-抗性 显著降低的位点出现突变(41、67、70、210、215和219)，以及以前与 其它NRTI类药物的敏感性降低相关位点的子集(74、75、184)或者与 前述在患者的病毒上测定得到的以前并有鉴定突变所相关的位点(1、6、 9、20、21、33、39、43、44、64、68、99、109、115、118、138、158、 167、173、174、177、179、196、202、211、218、221、228、240、241、 283、284、288、291、297)。

此外，还将突变L74V导入含有A62V和T69SSA的载体。对受试 抑制剂的敏感性试验结果，与在不含有L74V突变的抗性试验载体上观 察所得结果相似，且与在含有T215以及A62V和T69SSA突变的载体上 所测结果相似。最大的变化是在A62V-T69SSA-L74V-RTV上观测到对 AZT的敏感性回复到野生型水平。载体A62V-T69SSA-L74V-RTV对ddC 表现出野生型水平敏感性(1.8倍)，对ddI的表现出野生型水平敏感性(1.9 倍)，对3TC的敏感性轻微下降(2.5倍)，对d4T的敏感性轻微下将(1.5 倍)，对abacavir的敏感性轻微下降(3倍)。该载体对NNRTI类药物、 DEL(0.4倍)和NEV(0.3倍)的敏感性均增加。

构建抗性试验载体，含有突变M41L、T69SSA、L210W和V75M。 将突变V75M导入含有其它四个突变(M41L、T69SSA、L210W和T215Y) 的载体，与没有V75突变的载体比较，对载体的药物敏感性并没有影响。 M41L-T69SSA-T215Y-L210W-V75M-RTV对AZT的敏感性发生实质性 的下降(大于1000倍)，对ddC的敏感性轻微下降(2.9倍)，对ddI的 敏感性轻微下降(3.5倍)，对3TC的敏感性中度降低(17倍)，对d4T 的敏感性中度下降(11倍)，对abacavir的敏感性发生中等程度之下降 (19倍)。该载体对NNRTI类药物、DEL(0.25)和NEV(0.5倍)的敏感 性均增加。

实施例5

建立敏感性表型与基因型分析之间的关联性：与AZT-抗性突变之复 杂组合相关的d4T突变。

从患者98-757、98-844、98-937、98-964和98-966构建抗性试验载 体并进行表型分析

如实例1中所述，从患者样本98-757、98-844、98-937、98-964和98-966 构建抗性试验载体。所有这些患者以前都接受过时间不等的包括d4T在 类的药物治疗。分离病毒RNA，进行逆转录-PCR，得到一段来自患者的 片段。该片段包括编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位的病毒序列。将 此患者来源片段插入一个含有报告基因的病毒载体，获得若干抗性试验 载体，分别记为RTV-757、RTV-844、RTV-937、RTV-964和RTV-966。 应用一种表型试验方法，在这些抗性试验载体上准确定量地其对一组抗 逆转录病毒药物的敏感性水平。这组抗逆转录病毒药物包括通称为NRTI 类的一些药物(AZT、3TC、d4T、ddI、ddC和abacavir)、一些NNRTI 类药物(delavirdine和nevirapine)和一些PRI类药物(indinavir、nelfinavir、 ritonavir和saquinavir)。对每一试验药物测定其半数抑制浓度IC50。检 查患者的病毒对每一种药物的敏感性，并与已知的药物敏感性模型比较。 在每一个这些RTV库上，观察d4T的药物敏感性，较之于野生型对照RTV 都发生了下降。进一步检查患者样本，找出与所观察到的d4T敏感性模 型相关的基因型变化。

测定患者RTV DNA的基因型

使用ABI链终止子技术自动测定抗性试验载体的核酸序列。所得核 酸序列同野生型分枝B HIV-1的保守序列(美国新墨西哥州洛斯阿拉默 斯HIV序列数据库)比较，找出与对照序列不同的序列。RTV-757含有 V35I、D67N、T69D、K70R、V106A、V108I、L109V、Y181C、V189L、 T200A、I202T、R211K、T215F、D218E、K219Q、H221Y、L228H、L283I 和R284K。106、108和109每一个位点出现的核酸序列既有野生型也有 突变的核酸序列。RTV-884含有下列突变：M41L、D67N、T69D、I135V、 L210W、T215Y和K219N。RTV-937含有下列突变：P1L、P9R、K20R、 V35T、K64Y、D67N、K70R、V75M、G99R、I135V、K173E、Y188L、 R211H、T215F、D218E和K219Q。RTV-964含有下列突变：M41L、K43E、 D67N、K70R、L74I、V75S、Y181I、R211T、T215Y、D218E和K219N。 RTV-966含有下列突变：K20R、T39D、M41L、E44D、D67N、L74V、 A98S、V118I、I135T、K166R、K173T、M184V、G196E、L210W、R211K、 T215Y、D218E、K219R、L228H、V245E、K277R、T286A、A288T和 V293I。所有这些抗性试验载体的核酸都含有一个或数个突变；这些突变 包括以前与AZT-抗性关联的突变(M41L、D67N、L210W、T215Y/F和 K219Q/R)、与ddC-抗性关联的突变(T69D和L74I/V)、与NNRTI类药 物抗性关联的突变(V106A、V108I、Y181C/I和Y188L)、与3TC-抗性 关联的突变(M184V)，或者以前尚未鉴定的突变(P1L、P9R、K20R、 T39D、K43E、E44D、K64Y、V75M/S、G99R、L109V、V118I、K173E/T、 I202T、R211H/T、D218E、K219E、H221Y、L228H、L283H、R284K 和A288)。已知在V35I/T、A98S、I135V/T、K166R、G196E、T200A、 R211K、F214L、V245E、K277R、T286A和V293I这些位点的突变是HIV 野生型(药物敏感)的多态性。

在这些患者样本上导致d4T敏感性下降的突变并不清楚。有些患者 样本，含有许多与患者身上发现的突变相同；然而这些患者并不表现出 对d4T的敏感性降低。

定点突变

用定点突变手段构建抗性试验载体，含有五个(M41L、D67N、K70R、 L210W、T215Y和K219Q)或六个(M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y 和K219Q)与AZT-抗性相关的突变。测定对NRTI类药物的敏感性表型。 在这些观察到对AZT(75-180倍)和d4T(2倍)的敏感性显著下降。

实施例6

鉴定HIV-1逆转录酶氨基酸变化，预测对核苷类逆转录酶抑制剂的 反应

HIV-1逆转录酶69位氨基酸变化的表型与基因型之间的关联性

在本发明的一个实施方案中，应用下述方法评价HIV-逆转录酶蛋白 69位氨基酸变化的效应。这些方法包括：(i)从hiv-1感染个体采集 生物样本；(ii)分析生物编码HIV-1逆转录酶的核酸在69位密码子是 否发生突变。(iii)d4T敏感性下降河AZT敏感性降低，69位密码子突 变相关(T69SSX)；这突变可以单独存在，或者处于其它NRTI-抗性突 变的背景(例如，M41L、A62V、D67N、K70R、L74V、V75I/M、T215Y/F、 K219Q)。

生物样本包括全血、血液组成成分包括外周血单核细胞(PBMC)、 血清、血浆(用不同的抗凝剂如EDTA、柠檬酸-右旋糖苷、肝素等制备)、 组织切片、脑脊液(CSF)或其它细胞、组织或体液。在本发明的另一 实施方案中，可以直接从生物样本中分离HIV-1核酸(基因组RNA)或 逆转录酶蛋白，或者在从生物样本中分离纯化病毒粒子以后进行。要分 析HIV-1逆转录酶69位氨基酸是否突变，可用如下数种方法进行，例 如直接对编码逆转录酶的病毒核酸进行鉴定，或者直接鉴定病毒逆转录 酶蛋白本身。可用如下所列的方法确定逆转录酶69位氨基酸：利用经典 或新式蛋白质测序技术、抗体表位识别技术或其它特异结合蛋白或化合 物，直接鉴定逆转录酶蛋白；此外，还可以鉴定HIV-1逆转录酶蛋白编 码序列扩增产物来确定HIV-1逆转录酶蛋白69位氨基酸。对HIV-1核 酸进行扩增，可用如下方法进行，包括逆转录-PCR、NASBA、SDA、RCR 或3SR。具有普通技能的操作人员就将知道这些方法。分析编码HIV-1 逆转录酶的核酸69位密码子是否发生突变，可直接对核酸测序，包括多 引物延伸-链终止方法(Sanger，ABI/PE and Visible Genetics)或链断裂 方法(Maxam and Gilbert)，或者最近开发的其它测序技术，例如飞行时 间质谱法(MALDI-TOF)、质谱法(Sequenom，Gene Trace Systems)。 此外，测定编码69位氨基酸的核酸序列可以应用各种杂交方法进行，例 如基因芯片杂交测序法(Affymetrix)、line probe assay(LiPA；Murex) 和差示杂交(Chion)。

在本发明的一个优先实施方案中，从生物样本制备抗性试验载体进 行敏感性表型试验，分析HIV-1逆转录酶69位氨基酸是野生型还是突 变型。在一实施方案中，采集血浆样品，纯化病毒RNA，进行逆转录扩 增出一段来自患者的片段(PDS)。这段片段编码了病毒蛋白酶和逆转录 酶区域。然后，经由DNA连接和细菌转化，将这个患者来源片段插入 含有报告基因的病毒载体，于是获得一个抗性测试载体。从细菌培养物 中分离抗性试验载体，如实施例1中所述进行表型敏感性试验。对含有 T69SSX突变/插入的患者样本进行表型敏感性试验，结果见Figure5。从 患者样本621、690、770、771得到的患者来源的HIV-1蛋白酶和逆转 录酶区域核酸序列，应用荧光检测链终止循环测序法(ABI/PE)测定其 序列。该方法被用来测定患者个体样本中代表各种HIV-1变体混合物序 列组合的保守核酸序列(代表准属)，且用来测定单个变体的核酸序列。

患者样本的表型敏感性图和定点突变体表现出d4T敏感性显著下降 和AZT-敏感性增加。这两者都与下列突变相关：编码HIV-1逆转录酶69 位的丝氨酸、丝氨酸、丝氨酸(SSS)，丝氨酸、丝氨酸、丙氨酸(SSA) 或丝氨酸、丝氨酸、甘氨酸(SSG)编码系列的突变；以及上述位点一 些子集的突变。这些位点包括以前与NRTI类药物抗性相关的突变(41、 67、70、74、75、184、210、215和219)或在这些患者中观察到但以前 从未鉴定过的位点(1、6、9、20、21、33、39、43、44、64、68、99、 109、115、118、138、158、167、173、174、177、179、196、202、211、 218、221、228、240、241、283、284、288、291和297)。

69位含有插入突变的患者样本，其表型敏感性图显示对AZT、 3TC、ddC、ddI、d4T和abacavir。

HIV-1逆转录酶62、75、77、116和151氨基酸突变的表型和基因 型的关联性

患者样本的表型敏感性图和定点突变体表明：如果HIV-1逆转录酶 62、75、77、116和151这些位点，或者这些位点的子集含有下列氨基 酸62V、75I、77L、116F或151M，则对NRTI类药物敏感性显著下降 (AZT、ddC、ddI、3TC、d4T和abacavir)。在41、67、69、184、210、 215和219出现额外突变会进一步修饰(增加或降低)对NRTI类药物的 敏感性。

建立HIV-1逆转录酶中以前与AZT-抗性相关的突变对d4T抗性的 表型与基因型之间的关联性

患者样本的表型敏感性图和定点突变体表明：如果以前与AZT-抗性 显著降低的位点出现突变(41、67、70、210、215和219)，以及以前与 其它NRTI类药物的敏感性降低相关位点的子集(74、75、184)或者与 前述在患者的病毒上测定得到的以前并有鉴定突变所相关的位点(1、6、 9、20、2l、33、39、43、44、64、68、99、109、115、118、138、158、 167、173、174、177、179、196、202、211、218、221、228、240、241、 283、284、288、291、297)。

与导入RTV的特定突变相关的表型的表

在含有特定突变的基于HIV的抗性测试载体中观察到的平均敏感

            性降低倍数(检测的复制子数)

本申请是1998年6月24日提交的美国申请号09/104,295的部分继 续申请，其内容引入本文作为参考。

在本申请中各类参考文献在括号中标出，这些文献以其完整形式引 入本文作为参考，以更全面地描述本发明涉及的技术内容。