用于龋齿治疗的方法和产品
阅读：555发布：2023-03-11
专利汇可以提供用于龋齿治疗的方法和产品专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了包含能够在一定pH下经历自组装的自组装肽(SAP)的新的 牙齿 护理产品，用于牙齿护理，例如 预防 和/或 治疗 牙齿损伤例如龋齿损伤，使牙齿表面再矿化，增加平滑度或光泽，或增加牙齿表面的硬度。所述牙齿护理产品可按照涉及多个步骤的简单方案施用，例如，包括用 声波 牙刷 例如 超声波 牙刷 刷牙和/或使用 口腔 冲洗器，从而能够不依赖于活性龋齿(即，之前未成功治疗的龋齿)的诊断来非定向处理受试者的多个牙齿。本发明还涉及所述方法以及对其适合的套盒和装置。，下面是用于龋齿治疗的方法和产品专利的具体信息内容。
1.牙齿护理产品，用于治疗或预防牙齿损伤和/或使牙齿表面再矿化的方法，其中所述牙齿护理产品包含自组装肽，和其中在步骤(v)中施用后所述自组装肽保持单体形式至少1分钟，其中所述自组装肽能够在低于7.5的pH下经历自组装，其中所述方法包括(i) 通过选自刷牙、用牙线清洁牙齿、使用口腔冲洗器以及用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去牙齿生物膜；
(ii) 通过选自刷牙、用牙线清洁牙齿、使用口腔冲洗器以及用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去牙齿表膜；
(iii) 任选地，通过选自刷牙、用酸性溶液冲洗或用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去无机沉积物，所述冲洗任选地使用口腔冲洗器；和
(iv) 任选地，在步骤(v)之前用具有7或更大的pH的溶液冲洗牙齿；和
(v) 施用所述牙齿护理产品至多个牙齿，其中所述牙齿护理产品优选地使用口腔冲洗器施用；
其中步骤(i)、(ii)和任选的(iii)可以任何次序序贯进行，或同时地进行，和其中步骤(v)在其它步骤之后进行。
2.权利要求1的牙齿护理产品，其中步骤(i)、(ii)和(iii)通过用声波牙刷刷牙进行。
3.权利要求1或2的任一项的牙齿护理产品，其中步骤(i)、(ii)和(iii)通过用超声波牙刷刷牙进行。
4.权利要求1-3中任一项的牙齿护理产品，其中步骤(i)、(ii)和(v)，以及任选的(iii)和/或(iv)使用口腔冲洗器进行。
5.前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，其中所述方法包括刷牙，接着使用口腔冲洗器，其中口腔冲洗器至少用于步骤(v)，其中优选地，口腔冲洗器还用于步骤(i)、(ii)以及任选的(iii)和/或(iv)。
6.前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，其中在步骤(i)、(ii)以及任选的(iii)中使用口腔冲洗器包括用包含水、盐和洗涤剂的溶液冲洗口腔。
7.前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，其中所述牙齿护理产品不依赖于龋齿、优选地活性龋齿的在先诊断而使用。
8.前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，其中所述牙齿护理产品适合于家用，其中它在没有在先浸蚀或NaOCl处理的情况下使用。
9.前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，用于治疗牙齿损伤，优选地龋齿损伤。
10.前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，用于使牙齿表面再矿化。
11. 前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，其中所述牙齿护理产品的pH是7.5 -
9.0，优选地7.8 - 8.5，更优选地8.0 - 8.2。
12.前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，其中所述溶液的pH高出所述肽开始经历自组装的pH大于0.5个pH单位。
13. 前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，其中所述自组装肽的浓度是1 – 50000 mg/kg。
14. 前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，其中所述自组装肽包含SEQ ID NO: 3的序列，其中所述肽优选地包含SEQ ID NO: 4或5的任一个的序列。
15. 前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，其中所述自组装肽包含与SEQ ID NO: 1或2的序列之一具有至少80%序列同一性的序列，其中所述肽优选地包含SEQ ID NO: 1的序列。
16. 前述权利要求中任一项的牙齿护理产品，其中所述产品至少每6个月、优选地至少每2个月或至少每个月施用。
17.一种用于处理牙齿的非治疗方法，包括施用包含自组装肽的牙齿护理产品至多个牙齿，和其中在步骤(v)中施用后所述自组装肽保持单体形式至少1分钟，其中所述自组装肽能够在低于7.5的pH下经历自组装，其中所述方法包括
(i) 通过选自刷牙、用牙线清洁牙齿、使用口腔冲洗器以及用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去牙齿生物膜，所述刷牙优选地用声波牙刷例如超声波牙刷；
(ii) 通过选自刷牙、用牙线清洁牙齿、使用口腔冲洗器以及用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去牙齿表膜，所述刷牙优选地用声波牙刷例如超声波牙刷；
(iii) 任选地，通过选自刷牙、用酸性溶液冲洗或用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去无机沉积物，所述刷牙优选地用声波牙刷例如超声波牙刷，所述冲洗任选地使用口腔冲洗器；和
(iv) 任选地，在步骤(v)之前用具有7或更大的pH的溶液冲洗牙齿；和
(v) 施用所述牙齿护理产品至多个牙齿，其中所述牙齿护理产品优选地使用口腔冲洗器施用；
其中步骤(i)、(ii)和任选的(iii)可以任何次序序贯进行，或同时进行，和其中步骤(v)在其它步骤之后进行。
18.权利要求17的非治疗方法，其中步骤(i)、(ii)和(iii)通过用声波牙刷刷牙进行。
19. 权利要求17或18的任一项的非治疗方法，其中步骤(i)、(ii)和(iii)通过用超声波牙刷刷牙进行。
20. 一种套盒，包含：牙齿护理产品，所述牙齿护理产品包含自组装肽，其中在步骤(v)中施用后所述自组装肽保持单体形式至少1分钟，其中所述自组装肽能够在低于7.5的pH下经历自组装，所述牙齿护理产品适用于根据前述权利要求中任一项的步骤(v)；和(a) 声波牙刷，例如超声波牙刷，或
(b1) 适用于根据前述权利要求中任一项的步骤(i)和(ii)的溶液，和
(b2) 任选的适用于根据前述权利要求中任一项的步骤(iii)的溶液，和/或(b3) 任选的适用于根据前述权利要求中任一项的步骤(iv)的溶液。
21.一种口腔冲洗器，其适合进行根据权利要求1-16中任一项的方法，其中所述口腔冲洗器包含适合容纳权利要求20b的套盒的溶液的至少2个罐，或包含适合序贯递送所述溶液的至少2个隔室的1个罐，其中任选地，所述罐包含所述溶液。
用于龋齿治疗的方法和产品
[0001] 本发明提供了包含能够在一定pH下经历自组装的自组装肽(SAP)的新的牙齿护理产品，用于牙齿护理，例如预防和/或治疗牙齿损伤例如龋齿损伤，使牙齿表面再矿化，增加平滑度或光泽，或增加牙齿表面的硬度。所述牙齿护理产品可按照涉及多个步骤的简单方案施用，例如，包括用声波牙刷优选地超声波牙刷刷牙和/或使用口腔冲洗器，从而能够不依赖于活性龋齿(即，之前未成功治疗的龋齿)的诊断来非定向处理受试者的多个牙齿。本发明还涉及所述方法以及对其适合的套盒和装置。
[0002] 至今，牙齿再矿化主要通过将钙和磷酸根离子递送到牙齿损伤或牙洞而实现。钙和磷酸根离子通常包含在牙膏中，牙膏还包含例如磨料、氟化物、表面活性剂和其它再矿化剂。钙和磷酸根离子可以各种结晶形式使用，例如作为基于羟基磷灰石的材料，或者作为无定形磷酸钙，例如，在一些基于酪蛋白磷酸肽的材料中。例如，WO 2013/050432描述了这样的再矿化剂和用于使牙龈与这些试剂接触的选项。WO 2009/100276教导了与游离形式或盐形式的碱性氨基酸有关的牙线，例如用于促进再矿化。
[0003] 最近已描述一种牙齿再矿化的替代方法，该方法基于合理设计的自组装短肽。WO 2004/007532公开了能够形成三维支架，从而促进新生磷酸钙成核的肽。这些人工肽组装形成β-片层带状组装体。肽组装体可响应化学或物理触发剂而从流体转变成向列相的较硬凝胶态。肽经设计以在响应一定pH、离子强度和/或温度条件时按以下分级次序形成组装体：
带、条、原纤和纤维。Aggeli等(2003, J. Am. Chem. Soc. 125, 9619-9628)分析pH作为肽β-片层自组装的触发剂。
带、条、原纤和纤维。Aggeli等(2003, J. Am. Chem. Soc. 125, 9619-9628)分析pH作为肽β-片层自组装的触发剂。
[0004] 在现有技术中已描述几种其它自组装肽。例如，WO 2010/041636 A1描述一种包含人工肽的生物可吸附肽组织闭塞剂，所述人工肽具有亲水氨基酸和疏水氨基酸交替键合的8-200个氨基酸残基，在生理pH下自组装成β-结构。在WO 2008/113030 A2中也公开了与胞外基质相互作用的具有交替疏水和亲水残基或段的自组装肽。WO 2010/103887 A1公开了包含特定一级序列的碱性、疏水和酸性氨基酸的自组装肽，和其具有高强度的肽凝胶。
[0005] 另一个申请WO 2007/000979 A1描述具有极性氨基酸和非极性氨基酸的自组装肽。该肽能够形成β-片层结构，其中非极性氨基酸残基以组装形式排列在该结构的一侧上。在US 6,548,630中描述两亲性自组装肽，所述两亲性自组装肽用作用于生物材料应用(例如慢扩散药物递送)的稳定宏观膜。
[0006] EP 2 327 428 A2涉及一种用于修复损伤组织(例如，心肌梗塞后的组织)的药物组合物，其包含彼此互补的自组装肽纳米纤维，并进一步包含至少一种细胞。
[0007] EP 2 853 256 A1和WO 2015/044268 A1教导了进一步包含特定尺寸的矿物颗粒和荧光团的自组装肽水凝胶可用于牙齿增白。
[0008] 用自组装肽递送生物活性剂已描述于例如US 2008/199431 A1和WO 2009/026729 A1。WO 2006/073889 A2涉及一种组合物，其中人PDGF直接结合到肽，所述肽组装成缓慢体内释放PDGF的凝胶。WO 2006/047315 A2提出用生物素/链霉抗生物素连接使治疗剂连接到自组装肽。
[0009] Kirkham等和Kind等涉及促进牙釉质再矿化的自组装肽支架(Kirkham等2007, Dent. Res. 86(5), 426-430; Kind等2017, Journal of Dental Research 1-8, doi10.1177/0022034517698419)。
[0010] 为了有效治疗牙齿损伤，特别是表面下损伤(即，早期龋齿损伤或白斑)，自组装肽需要在牙齿损伤外部呈单体形式/状态以能够扩散至损伤中，并且一旦在牙齿损伤内部，它需要转换为组装形式。如果肽在损伤外部组装，那么它不能在损伤(具有低pH和高离子强度)内促进再矿化，因为形成的三维结构太大而不能通过孔扩散。因此，肽的组装应该被阻止，直到它到达其作用部位。
[0011] WO 2014/027012 A1和EP 2 698 162 A1提供了包含自组装肽的冻干溶液，用于靶向治疗牙齿损伤。因为包含肽的溶液必须直接施用到早期龋齿损伤的表面上，所述施用受限于专业使用者，例如牙科医生。此外，待治疗的牙齿的预处理是非常复杂的，包括专业清洁牙齿以除去牙菌斑、食物残渣和色斑，以及用潜在危险的化学品例如次氯酸钠和磷酸处理，随后用水冲洗和干燥牙齿表面。Brunton等, 2013 (Br. Dent. J.215(4): E6 doi:10.1038/sj.bdj.2013.741)证实，在治疗前，损伤用预防糊剂清洁，用浸蚀溶液处理30秒以打开表面下损伤的孔，随后洗涤和干燥。冻干的单体形式的自组装肽用无菌水再水化，和将一滴所得溶液立刻直接施用至损伤表面。确保湿度控制，直到P11−4溶液不再可见(大约2分钟)。受试者被要求在受治疗的齿板上不刷牙，直到治疗后4天。Schlee等, 2014, Stomatologie 111:175-181证实需要预处理和湿度控制。
[0012] 然而，由于复杂的处理程序，这些溶液不适合家用，因此用途限于专业牙科从业者。此外，为了施用这些溶液，需要预处理牙齿，包括对人类健康具有潜在风险的化学品，例如次氯酸钠和磷酸，其可引起在吸入后呼吸道的粘膜刺激，和在意外皮肤接触后刺激皮肤，漂白衣服，以及隐含滥用的危险。
[0013] 因为存在由于心理原因而回避或延迟访问牙科从业者，直至龋齿损伤已发展得太广泛以致牙科医生可能宁可选择钻孔和填充而非使用自组装肽的治疗方法的受试者，所以对于涉及的患者和/或健康系统存在巨大成本。
[0014] 因此，根据当前技术水平，本发明人解决了提供能够治疗龋齿损伤的牙齿护理产品的问题，所述牙齿护理产品按照简单方案是安全和容易施用的，优选地用于柜台上出售或零售，和其适合由患者或消费者家用，以治疗或预防龋齿和/或使牙齿表面再矿化。
[0015] 该问题通过本发明，特别是通过所要求保护的主题而解决。
[0016] 在第一方面，本发明提供一种牙齿护理产品，用于治疗或预防牙齿损伤和/或使牙齿表面再矿化的方法，其中牙齿护理产品包含自组装肽和其中在步骤(v)中施用后自组装肽保持单体形式至少1分钟，其中自组装肽能够在低于7.5的pH下经历自组装，其中所述方法包括(i) 通过选自刷牙(优选地用声波牙刷(例如超声波牙刷)刷牙)、用牙线清洁牙齿、使用口腔冲洗器以及用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去牙齿生物膜；
(ii)通过选自刷牙(优选地用声波牙刷(例如超声波牙刷)刷牙)、用牙线清洁牙齿、使用口腔冲洗器以及用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去牙齿表膜；
(iii)任选地，通过选自刷牙(优选地用声波牙刷(例如超声波牙刷)刷牙)、用酸性溶液冲洗或用盐和洗涤剂溶液冲洗(任选地使用口腔冲洗器冲洗)的方法，从多个牙齿除去无机沉积物；和
(iv)任选地，在步骤(v)之前用具有7或更大的pH的溶液冲洗牙齿；和
(v)施用牙齿护理产品至多个牙齿，其中牙齿护理产品可使用口腔冲洗器施用；
其中步骤(i)、(ii)和可能存在的(iii)可以任何次序序贯进行或同时进行，和其中步骤(v)在其它步骤之后进行。
(ii)通过选自刷牙(优选地用声波牙刷(例如超声波牙刷)刷牙)、用牙线清洁牙齿、使用口腔冲洗器以及用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去牙齿表膜；
(iii)任选地，通过选自刷牙(优选地用声波牙刷(例如超声波牙刷)刷牙)、用酸性溶液冲洗或用盐和洗涤剂溶液冲洗(任选地使用口腔冲洗器冲洗)的方法，从多个牙齿除去无机沉积物；和
(iv)任选地，在步骤(v)之前用具有7或更大的pH的溶液冲洗牙齿；和
(v)施用牙齿护理产品至多个牙齿，其中牙齿护理产品可使用口腔冲洗器施用；
其中步骤(i)、(ii)和可能存在的(iii)可以任何次序序贯进行或同时进行，和其中步骤(v)在其它步骤之后进行。
[0017] 优选地，牙齿护理产品是液体，例如包含自组装肽的溶液。液体适用于口腔冲洗器。也可使用固体或半固体牙齿护理产品。
[0018] 在本发明的方法中，刷牙优选地用选自碳酸氢钠牙膏或牙凝胶和研磨剂牙膏或研磨剂牙凝胶的牙膏或牙凝胶进行。成分可包含例如，碳酸盐、磷酸盐(特别是磷酸二钙)、硅酸盐、丙烯酸盐、氧化铝和/或生物膜除去剂(例如碳酸钠)、表面活性剂例如SDS和/或磷酸盐缓冲液。用这样的研磨剂牙膏或研磨剂牙凝胶刷牙可不仅除去牙齿表膜和生物膜，而且可促进除去无机沉积物。刷牙优选地进行2-3分钟。可使用电动牙刷。刷牙可与使用齿间刷组合以清洁齿间空隙。当然，手动刷牙也是可能的。
[0019] 因为本发明人能够显示声处理出乎意料地改进自组装肽吸收至表面下损伤中，所以优选地，步骤(i)、(ii)和(iii)包括声处理，并且特别地，可通过用声波牙刷刷牙进行。
[0020] 声波牙刷产生在声波范围或之上的刷头速度，即，它至少以位于人类可听到的频率范围内(即约70-20,000 hz，优选地约100-约1000 Hz)的速度振动。典型的声波牙刷以约200-约400 Hz的频率振动。在本申请的情况下如果未另外指明，术语“声波牙刷”包括超声波牙刷。超声波牙刷以大于20,000 Hz、优选地约1-2 MHz或约1.6 MHz (其转化为192,000,
000次运动/分钟)的频率振动。例如，Sonicare®牙刷可能够进行31,000次刷冲程/分钟，其对应于约258 hz。为比较，非声波电动牙刷具有产生2,500-7,500次冲程/分钟的水平的刷牙机制。声波牙刷的硬毛的强烈振动速度搅动围绕使用者的牙齿的流体，在该搅动的程度下，流体可破坏甚至在牙刷的硬毛实际接触的区域外的牙菌斑(https://www.animated-teeth.com/electric_toothbrushes/t3_sonic_toothbrushes.htm)。示例性的声波牙刷可获自Philips (例如，Sonicare®牙刷)或Oral B。
000次运动/分钟)的频率振动。例如，Sonicare®牙刷可能够进行31,000次刷冲程/分钟，其对应于约258 hz。为比较，非声波电动牙刷具有产生2,500-7,500次冲程/分钟的水平的刷牙机制。声波牙刷的硬毛的强烈振动速度搅动围绕使用者的牙齿的流体，在该搅动的程度下，流体可破坏甚至在牙刷的硬毛实际接触的区域外的牙菌斑(https://www.animated-teeth.com/electric_toothbrushes/t3_sonic_toothbrushes.htm)。示例性的声波牙刷可获自Philips (例如，Sonicare®牙刷)或Oral B。
[0021] 如本文所用的，“冲洗牙齿”可包括将一小口相应的溶液保持在口腔中持续需要的时间。任选地，“冲洗牙齿”还可意指使用合适的装置，例如口腔冲洗器，施用所述溶液至口腔中。
[0022] 用牙线清洁牙齿包括使用标准牙线或研磨条来清洁掉齿间空隙的牙齿生物膜和/或表膜。研磨条(亦称为磨光条或抛光条)可除去牙齿生物膜和/或表膜，和另外除去无机沉积物。
[0023] 用盐和洗涤剂溶液(例如包含单价、二价和/或三价离子以及离子和/或非离子洗涤剂)冲洗可除去生物膜以及表膜。其还可有助于除去无机沉积物，特别是如果所述溶液是酸性的(例如，3-6的pH，优选地pH 4-6或pH 4-5)。合适的盐是例如，NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4。例如，0.8 % NaCl、0.02 % KCl、0.142 % Na2HPO4和0.027 % KH2PO4可与洗涤剂例如SDS (例如，0.1-5%)组合使用。合适的洗涤剂是例如，SDS，例如，浓度为0.1-5%；或椰油酰氨基丙基甜菜碱，例如，浓度为0.1-5%；或Sulfopon G1216G，例如，浓度为0.1-5%。
[0024] 用缓冲的酸性溶液冲洗例如10-30秒或约20-30秒，可除去无机沉积物。合适在步骤(iii)中除去有机沉积物的酸溶液可具有3-6的pH，优选地pH 4-6或pH 4-5。优选的酸性溶液具有pH 5。例如，可使用柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液。
[0025] 冲洗可通过引入一口溶液至口腔并且在口中四处移动它来进行。通常，用于冲洗的溶液然后被吐出。该过程可重复。冲洗也可通过使用口腔冲洗器进行，其改进齿间间隙的可及性。冲洗可进行例如约10秒-5分钟，优选地20秒-1.5分钟或30秒-1分钟。
[0026] 口腔冲洗器(亦称为冲洗口腔装置或水牙线清洁装置)还可通过用水冲洗口腔，例如，使用微滴技术和/或高压冲洗和/或脉动冲洗，用于除去表膜和/或生物膜。使用口腔冲洗器是特别有利的，因为口腔冲洗器容易操作，和允许有效清洁牙齿和牙龈，包括难以到达的空隙，例如齿间空隙，因此对龋齿相当灵敏。
[0027] 使用口腔冲洗器施用纯水/自来水是可能的，但不是必需的。例如，可使用Philips Sonicare AirFloss Ultra®、Waterpik Aquarius Water Flosser ®或其它标准口腔冲洗器，以及本文所述的专用冲洗器。冲洗口腔可持续约20秒-5分钟，优选地30秒-3分钟或40秒-2分钟或1秒-1.5分钟。口腔冲洗器可用于施用本文所述的盐和洗涤剂溶液和/或本文所述的酸性溶液。US 2011/027746 A1、EP 2 727 556A1和US 2016/128815 A1描述了可用于本发明的口腔冲洗器。
[0028] 在步骤(iii)中除去无机沉积物(特别是牙结石)对于治疗活性龋齿损伤不是必需的，活性龋齿损伤通常不被牙结石覆盖(Keyes等, J Oral Biol 3(1):4-7)。然而，它在其它方面可能是有益的，例如，用于使牙齿表面再矿化。
[0029] 任选地，在步骤(i)和(ii)以及可能存在的(iii)之后，牙齿在步骤(iv)中用具有7或更大、任选地7.5或更大的pH的溶液冲洗。可使用水例如自来水。在步骤(i)-(iii)的任一个包括酸、盐和/或洗涤剂以防止自组装肽的组装状态被影响(例如通过酸性条件)的情况下，步骤(iv)是特别有利的。即使并非如此，如果例如步骤(i)和(ii)通过例如用声波牙刷(例如超声波牙刷)刷牙和/或用牙线清洁进行，那么冲洗也可有助于从牙齿除去松散的生物膜或表膜。与较长时间直接使用本发明的牙齿护理产品(这也是可能的)相比，该步骤可节省自组装肽。然而，直接使用包含肽的溶液减少该方法的复杂性，因此可提高顺从性。
[0030] 在一个实施方案中，步骤(i)、(ii)和(v)以及可能存在的步骤(iii)和/或(iv)可使用口腔冲洗器进行。在该方法的所有步骤中使用口腔冲洗器是优选的。
[0031] 在本发明的情况下，“a”被理解为“一个或多个”。因此，本文所述的用于清洁掉牙齿的生物膜、表膜和/或无机沉积物的两种或更多种方法可组合使用，这是优选的。如果至少一种清洁方法清洁齿间间隙，特别是通过用牙线清洁或冲洗口腔，那么是有利的。
[0032] 例如，本发明的方法可包括刷牙，例如，用声波牙刷例如超声波牙刷刷牙，接着使用口腔冲洗器，其中口腔冲洗器至少用于步骤(v)，其中优选地，口腔冲洗器还用于步骤(i)、(ii)以及任选的(iii)和/或(iv)，最优选地，用于所有步骤(i)-(v)。本发明的方法可包含刷牙和用牙线清洁，接着使用口腔冲洗器，其中口腔冲洗器至少用于步骤(v)，其中优选地，口腔冲洗器还用于步骤(i)、(ii)以及任选的(iii)和/或(iv)，最优选地，用于所有步骤(i)-(v)。任选地，在步骤(i)、(ii)以及任选的(iii)中使用口腔冲洗器包括用包含水、盐和洗涤剂的溶液冲洗口腔。所述溶液可以是酸性的。
[0033] 在优选的实施方案中，所述方法包括刷牙，例如用研磨剂牙膏刷牙，接着使用口腔冲洗器来冲洗口腔，例如用盐和洗涤剂溶液冲洗口腔，并且作为最后一个步骤，用本发明的牙齿护理产品冲洗口腔。
[0034] 本发明的牙齿护理产品可适合用于家用，其中它们在没有在先浸蚀或NaOCl处理的情况下使用。本发明人发现，尽管如此，用本发明的处理方案，可治疗龋齿损伤和/或再矿化。
[0035] 特别地，本发明的牙齿护理产品可用于治疗牙齿损伤，优选地龋齿损伤，例如表面下龋齿损伤。如本文所用的，龋齿"损伤"是牙齿或牙齿表面中的表面下损伤或表面下微损伤，其通常由口腔生物膜中存在的细菌的酸形成引起(ICDAS-II等级1-4)。如本文所用的，牙"洞"是牙齿的表面中的孔(ICDAS-II等级≥5)。
[0036] 备选地或另外，所述牙齿护理产品可用于使牙齿表面，例如牙洞、白斑损伤或暴露的牙本质再矿化。优选地，本发明的产品可用于防止早期龋齿损伤进展为成洞的龋齿损伤。
[0037] 细菌，特别是链球菌属、乳酸杆菌属和放线菌属的细菌，由源自食物的碳水化合物发酵而产生酸。在发酵时生成的酸使硬牙组织(即，牙釉质、牙本质和牙骨质)去矿化。牙损伤和牙洞也可以是物理创伤的结果。如果不治疗，龋齿损伤或牙洞可引起包含血管和神经的髓室感染，这可最终导致牙缺失。
[0038] 通常，损伤或牙洞可存在于任何牙齿上，例如门牙(门齿)、犬牙(犬齿)、前磨牙(前臼齿)和/或磨牙(臼齿)。类似地，损伤或牙洞可影响牙齿的任何表面，即唇面、近中面、颊面、腭面、邻接面、咬合面和/或远中面。例如，提及"损伤"包括提及超过一种损伤，特别地，受试者的所有损伤。
[0039] 本发明的产品意图不依赖于龋齿(优选地活性龋齿)的在先诊断，优选地在没有龋齿(特别是活性龋齿)的在先诊断的情况下，更优选地还在没有去矿化或牙齿侵蚀的诊断的情况下，用于常规牙齿护理。活性龋齿(例如，被认为是龋齿的第一阶段的白斑，或更加进展的阶段)的诊断通常通过牙科专业人员进行。本发明有利地避免了对专业牙科从业人员进行的诊断和治疗的需要，和能够使受试者自身有效地治疗和预防牙齿损伤。或者，本发明的产品当然也可在活性龋齿的诊断后施用。
[0040] 优选地，受试者定期施用牙齿护理产品，使得刚开始的龋齿，例如白斑或去矿化，可通过本发明的产品再矿化，和新近发生的龋齿损伤在早期阶段得到有效治疗。因此，本发明的牙齿护理产品可至少每6个月，优选地至少每2个月，至少每个月，至少每周或每日施用。该产品可在寿命的剩余时间内施用，例如，从一天一次至每6个月一次。
[0041] 如本文所用的，"龋齿的在先诊断"或"活性龋齿的在先诊断"是指已被专业人员例如牙科医生诊断，但尚未被治疗的龋齿损伤。相比之下，活性龋齿的在先诊断不涉及在施用本发明的产品之前已被成功治疗的龋齿损伤。
[0042] 本领域已知不需要治疗静止龋。相比之下，静止龋被认为比健康的牙釉质或牙本质对龋齿复发更有抵抗力。因此，技术人员将知道，本领域常规治疗的任何龋齿损伤是活性龋齿损伤。在任何情况下，静止龋损伤的存在不排除施用本发明的牙齿护理产品。牙齿护理产品也可促进静止龋损伤的进一步再矿化。因此，对技术人员显而易见的是，本发明的产品还可不依赖于诊断或在没有静止龋损伤的在先诊断的情况下使用。
[0043] 在前治疗涉及通常由牙科专业人员给予的靶向治疗，其能够至少阻止龋齿的进展，即，其包括用自组装肽的靶向治疗，或靶向氟化物施用以及钻孔和填充方法。
[0044] 在施用至口腔后，肽保持单体非组装状态一段特定的时间，以确保产品分配至多个牙齿和允许进入表面下损伤(如果存在的话)。特别地，本发明的牙齿护理产品可用于填充牙齿损伤和/或牙洞，其中互连的肽的网络通过例如在唾液中存在的钙和磷酸根离子的沉积，促进损伤的再矿化。
[0045] 本发明特别基于以下见解：通过应用包括少数步骤和不包括潜在有害的试剂例如浸蚀剂或NaOCl的特定方法来清洁和预处理牙齿用于随后的治疗，包含自组装肽的溶液适合于在没有专业人员的帮助(例如通过牙科医生或牙科从业人员)下由患者或消费者家用。
[0046] 此外，所述方法的所有步骤可使用合适的容易操作的施用装置例如口腔冲洗器进行。
[0047] 在本发明的牙齿护理产品中，在步骤(v)中进行的施用后，自组装肽可以单体状态存在至少1分钟，优选地至少2分钟，更优选地至少3分钟。优选地，自组装肽以单体状态的存在持续牙齿护理产品施用至牙齿的时间范围。具体地，牙齿护理产品可施用至少20秒、至少30秒、至少1分钟、至少3分钟或至少5分钟。
[0048] 施用意指受试者的多个牙齿，或优选地所有牙齿以这种相应类型的产品通常使用的方式与牙齿护理产品接触。例如，漱口水通常用于冲洗牙齿20秒-5分钟、特别地约30秒-1分钟的时间。口腔冲洗器通常使用20秒-5分钟、优选地30-90秒、特别地约1分钟。牙齿护理产品可在正常牙齿护理后，例如在晚上刷牙，和任选地用牙线清洁牙齿后使用。
[0049] 如本文所用的，"受试者"是指具有牙齿的任何受试者，例如，哺乳动物，例如人、狗、猫科动物例如猫、啮齿动物例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、牛、马、骆驼、绵羊、山羊或具有牙齿的另外的宠物、农场或动物园动物。
[0050] 本发明还提供用于治疗牙齿损伤、优选地龋齿损伤和/或用于使牙齿表面再矿化的方法，包括施用包含自组装肽的牙齿护理产品和其中在步骤(v)中施用后自组装肽保持单体形式至少1分钟，其中自组装肽能够在低于7.5的pH下经历自组装，其中所述方法包括(i) 通过选自刷牙(优选地用声波牙刷(例如超声波牙刷)刷牙)、用牙线清洁牙齿、使用口腔冲洗器以及用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去牙齿生物膜；(ii)通过选自刷牙(优选地用声波牙刷(例如超声波牙刷)刷牙)、用牙线清洁牙齿、使用口腔冲洗器以及用盐和洗涤剂溶液冲洗的方法，从多个牙齿除去牙齿表膜；
(iii)任选地，通过选自刷牙(优选地用声波牙刷(例如超声波牙刷)刷牙)、用酸性溶液冲洗或用盐和洗涤剂溶液冲洗(任选地使用口腔冲洗器)的方法，从多个牙齿除去无机沉积物；和
(iv)任选地，在步骤(v)之前用具有7或更大的pH的溶液冲洗牙齿；和
(v)施用牙齿护理产品至多个牙齿，其中牙齿护理产品优选地使用口腔冲洗器施用；
其中步骤(i)、(ii)以及任选的(iii)可以任何次序序贯进行或同时进行，和其中步骤(v)在其它步骤后进行。
(iii)任选地，通过选自刷牙(优选地用声波牙刷(例如超声波牙刷)刷牙)、用酸性溶液冲洗或用盐和洗涤剂溶液冲洗(任选地使用口腔冲洗器)的方法，从多个牙齿除去无机沉积物；和
(iv)任选地，在步骤(v)之前用具有7或更大的pH的溶液冲洗牙齿；和
(v)施用牙齿护理产品至多个牙齿，其中牙齿护理产品优选地使用口腔冲洗器施用；
其中步骤(i)、(ii)以及任选的(iii)可以任何次序序贯进行或同时进行，和其中步骤(v)在其它步骤后进行。
[0051] 在进一步的方面，本发明提供用于使牙齿表面再矿化或增加牙齿表面的硬度、例如微硬度的方法，包括不依赖于龋齿、特别是活性龋齿或去矿化或牙齿侵蚀的诊断，施用所述牙齿护理产品至受试者的多个牙齿。
[0052] 能够在低于7.5的pH下经历自组装的自组装肽还可用于制备牙齿护理产品，其用于治疗牙齿损伤、优选地龋齿损伤和/或用于使牙齿表面再矿化和/或用于增加牙齿的硬度。
[0053] 在另一个方面，本发明还涉及用于处理牙齿的非治疗方法，包括施用本发明的产品至受试者的多个牙齿。特别地，本发明还提供了用于处理牙齿、例如用于增加牙齿表面的硬度的非治疗方法，例如美容方法，包括施用本发明的牙齿护理产品至多个牙齿。本发明的牙齿护理产品也可经施用以增加牙齿表面的平滑度和/或提供增加的牙齿光泽。
[0054] 本发明还公开了包含本发明的牙齿护理产品的套盒。特别地，本发明的套盒可包含(a) 包含自组装肽的牙齿护理产品，优选地呈溶液的形式，其中自组装肽能够在低于
7.5的pH下经历自组装，其中自组装肽经配制以在步骤(v)中施用后保持单体形式至少1分钟，其中所述产品适用于根据前述权利要求中任一项的步骤(v)；和
(b) 适用于步骤(i)和(ii)以及任选的(iii)的溶液，
(c) 任选的适用于步骤(iii)的溶液，和/或
(d) 任选的适用于步骤(iv)的溶液，例如水。
7.5的pH下经历自组装，其中自组装肽经配制以在步骤(v)中施用后保持单体形式至少1分钟，其中所述产品适用于根据前述权利要求中任一项的步骤(v)；和
(b) 适用于步骤(i)和(ii)以及任选的(iii)的溶液，
(c) 任选的适用于步骤(iii)的溶液，和/或
(d) 任选的适用于步骤(iv)的溶液，例如水。
[0055] 在优选的实施方案中，本发明的套盒包含在适于安装在口腔冲洗装置中的一个或多个容器中的溶液(a)和(b)以及可任选的(c)和/或(d)。
[0056] 或者，本发明的套盒可包含包含自组装肽的牙齿护理产品，优选地呈溶液的形式，其中自组装肽能够在低于7.5的pH下经历自组装，其中自组装肽经配制以在步骤(v)中施用后保持单体形式至少1分钟，其中所述产品适用于本发明的方法的步骤(v)；和声波牙刷(例如超声波牙刷)。另外，套盒当然可包含一种或多种上文详述的溶液。
[0057] 本发明还提供口腔冲洗器，包含适合安装所述套盒的溶液的至少2个容器(或罐)，其中任选地，所述罐包含所述溶液。任选地，口腔冲洗器包含至少3个或至少4个容器。优选地，本发明的套盒的容器适合所述口腔冲洗器。
[0058] 在一个实施方案中，用于本发明的不同溶液包含在适合安装在口腔冲洗装置中的一个容器(或罐)中，其允许以(b)、任选的(c)、任选的(d)之后(a)的顺序序贯施用所述溶液，而无需受试者调换容器。本发明还提供了包含这样的罐的口腔冲洗器。
[0059] 例如，如果用于递送至口腔冲洗装置的容器出口在容器的底侧上，则溶液可在一个容器的分开隔室中，例如，通过膜隔开，所述膜当底部溶液已(基本上或完全)用尽时被合适的装置刺穿，例如，在容器的底部上包含一个或多个刺，例如，两个刺，使得下一种溶液然后递送至口腔冲洗器。通过使用合适的阀或封条可实现类似结果。例如，可使US7055683B2的柔性多隔室饮料袋或US4256104A的用于序贯施用液体的装置适合用于本发明。
[0060] 例如，提供了包含数个隔室的容器，其适合于安装在口腔冲洗装置中和适合于以首先盐和洗涤剂溶液，然后本发明的包含自组装肽的溶液的次序序贯递送至所述口腔冲洗装置。或者，提供了包含数个隔室的容器，其适合于安装在口腔冲洗装置中和适合于以首先盐和洗涤剂溶液，然后酸性溶液，然后本发明的包含自组装肽的溶液的次序序贯递送至所述口腔冲洗装置。或者，提供了包含数个隔室的容器，其适合于安装在口腔冲洗装置中和适合于以首先盐和洗涤剂溶液，然后酸性溶液，然后具有中性pH的溶液，然后本发明的包含自组装肽的溶液的次序序贯递送至所述口腔冲洗装置。
[0061] 这样的容器可在各个隔室中含有合适的溶液。这样的容器优选地用于单次使用。它们可安装在口腔冲洗器中，用于本发明的方法。
[0062] 用于本发明的产品的自组装肽在响应一定的pH和离子强度时经历自组装。
[0063] 根据本发明使用的特定自组装肽经选择，使得当它们环境的pH低于一定的pH，例如低于pH 7.5，例如，在生理离子强度下时它们呈自组装形式。本发明的优选自组装肽经历自组装的pH为低于7.5，优选地低于7.2，更优选地低于7.0。例如，自组装肽P11-4 (SEQ ID NO:1)和末端修饰的P11-4 (SEQ ID NO:2)开始经历自组装的pH是约7.5。这意味着当pH下降至低于7.5时自组装肽开始自组装至显著程度。
[0064] 如本文所用的，自组装肽开始经历自组装的pH是指低于在溶液中观察到肽的显著程度的自组装的pH的pH，这意味着在牙齿护理产品中存在的肽的至少约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约99%或甚至约100%被组装。在优选的实施方案中，在低于肽开始经历自组装的pH时，在牙齿护理产品中存在的肽的至少约25%被组装。
[0065] 优选地，在启动自组装的pH下，例如对于P11-4和修饰的P11-4为约pH 7.5，仅约20%或更少、优选地仅约15%或更少、更优选地10%或更少和甚至更优选地5%或更少的肽呈聚合物(或聚集)状态。
[0066] 相比之下，低于启动自组装的pH，例如对于P11-4 (SEQ ID NO:1)和修饰的P11-4 (SEQ ID NO:2)为低于pH 7.5，在溶液中观察到肽的显著程度的自组装，这意味着在溶液中存在的肽的至少约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约99%或甚至约100%被组装。
[0067] 如本文所用的，肽的"自组装"是指肽与它们自身种类的其它肽(或具有类似结构的肽)通过非共价相互作用，自发和可逆组构成多聚组装体。引起生成多聚组装体的非共价相互作用包括肽的氨基酸主链和/或氨基酸侧链之间的范德华、π-堆积、氢键、极性和离子相互作用。
[0068] 用于本发明的产品的自组装肽优选组装成β-折叠片。在β-折叠片中，通过不同多肽链中残基之间或折叠多肽的不同区段中残基之间的一系列氢键产生片状结构。一般β-折叠片中的相邻多肽链是反向平行的，这意味着它们以相反方向延伸。然而，相邻链也可平行延伸。如果数个多肽链参与片形成，则片为刚性壁状结构。多个折叠片提供必需的韧度和刚性。可用于本发明的产品的肽在自组装时形成稳定的二级结构。优选用于本发明的肽形成在厚度中包含单一分子的β-折叠结构的长“β-带”。在组装期间肽可形成复合结构，例如螺旋形带(单分子厚度)、扭条(双带)、原纤(扭条堆叠)和纤维(缠绕的原纤)。随着减小pH，可形成螺旋形带、扭条、原纤和最后形成纤维。
[0069] 如技术人员已知的，肽的组装状态还受离子强度的影响。溶液的离子强度是溶液中存在的所有离子的浓度的函数。因此，甚至在高于肽开始经历自组装的pH的pH下，即当肽在溶液中基本上是单体时，特别高的离子强度可能够触发肽的组装。
[0070] 然而，当pH高于7.5和离子强度在生理范围(即对应于或低于相当于150 mM NaCl的离子强度)时，本发明的肽的组装有利地不被触发。技术人员将知道如何确定和测量溶液2
的离子强度。离子强度I通常根据公式I = ½∑ zi bi来计算，其中z是化合价因数和bi是第i种离子浓度的摩尔浓度[mol/kg{H2O}]。对溶液中的所有离子获得总和∑。例如，150 mM NaCl溶液的离子强度为大约0.15。这也近似为血液的离子强度。口腔中存在的唾液的离子强度通常低得多，例如大约0.04。因此，在优选的实施方案中，本发明的牙齿护理产品中的离子强度为小于0.15、小于0.1、小于0.05或小于0.025。在优选的实施方案中，牙齿护理产品的离子强度为小于0.15。在进一步优选的实施方案中，离子强度为小于0.1。
的离子强度。离子强度I通常根据公式I = ½∑ zi bi来计算，其中z是化合价因数和bi是第i种离子浓度的摩尔浓度[mol/kg{H2O}]。对溶液中的所有离子获得总和∑。例如，150 mM NaCl溶液的离子强度为大约0.15。这也近似为血液的离子强度。口腔中存在的唾液的离子强度通常低得多，例如大约0.04。因此，在优选的实施方案中，本发明的牙齿护理产品中的离子强度为小于0.15、小于0.1、小于0.05或小于0.025。在优选的实施方案中，牙齿护理产品的离子强度为小于0.15。在进一步优选的实施方案中，离子强度为小于0.1。
[0071] 技术人员知道许多方法来测定制剂的离子强度。例如，离子强度可根据溶液的电导的测量(S = 1/Ω = A/V)通过Russell因子，如下估算：I = 1.6 x 10-5 x 比电导[µS/cm]。150 mM NaCl溶液具有大约80-100 mS/cm的电导。因此，根据上文和所述电导的估算，牙齿护理产品将具有低于100 mS/cm、优选地低于80 mS/cm的电导。
[0072] 此外，技术人员知道许多方法来测定本发明的肽在给定的离子强度下开始自组装的pH。合适的方法概述于例如Aggeli等(2003, J Am Chem Soc, 125, 9619-9628)的出版物。
[0073] 用于本发明的产品的自组装肽的大小没有明确限制。本发明的肽可具有允许以pH依赖性方式自组装的任何长度。优选肽具有约4-200个氨基酸大小，更优选6-50个氨基酸，8-30个氨基酸，9-20个氨基酸或10-11个氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，自组装肽具有11个氨基酸长度。
[0074] 自组装肽可通过一般在肽合成领域已知的任何适合方法制备。例如，可通过重组方法制备具有大于50个氨基酸长度的肽。在一个实施方案中，自组装肽作为融合肽制备。本文所用的融合肽是指包含目的自组装肽的第一氨基酸序列以N端或C端连接到第二氨基酸序列的融合物。第二氨基酸序列可以为亲和标签，即，融合到自组装肽的C或N末端且对另一种化合物显示增加的亲和性从而允许纯化融合肽的氨基酸序列。优选在纯化后从目的自组装肽去除标签序列，例如，通过在自组装肽和亲和标签之间提供蛋白水解切割位点。在一个实施方案中，自组装肽如Kyle等, 2010, Biomaterials 31, 9395-9405和Kyle等2009, Trends in Biotechnol. 27 (7), 423-433中所公开地制备。
[0075] 较小的自组装肽通常通过化学合成制备。例如，肽可通过固相或液相方法化学合成。溶液相化学合成肽的方案已有描述(参见，例如Andersson等, Biopolymers 55:227-250, 2000)。对于固相合成，可使用Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85, 2149-
2154)所述的技术。在此方法中，使生长的肽锚着在不溶性树脂上，并通过过滤或洗涤步骤去除未反应的可溶性试剂，而没有操作性损失。固相肽合成可容易地用自动装置进行。
2154)所述的技术。在此方法中，使生长的肽锚着在不溶性树脂上，并通过过滤或洗涤步骤去除未反应的可溶性试剂，而没有操作性损失。固相肽合成可容易地用自动装置进行。
[0076] 用于本发明的产品的肽可包含任何天然的蛋白原性氨基酸。另外，肽也可包含不常见的非蛋白原性氨基酸，例如肉碱、γ-氨基丁酸(GABA)、羟基脯氨酸、硒代甲硫氨酸、羟丁赖氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、鸟氨酸(Orn, O)、瓜氨酸、β-丙氨酸(3-氨基丙酸)等。通过翻译后修饰或者在肽化学合成期间直接掺入，可使非蛋白原性氨基酸掺入到肽中。
[0077] 所述肽优选包含包括–COOH基团的氨基酸侧链。具有–COOH的氨基酸侧链在高于其名义pK值的pH值下去质子化。例如，在其侧链包含–COOH基团的氨基酸，例如天冬氨酸(Asp, D)和谷氨酸(Glu, E)，基本上在高于中性(即pH 7)的pH下去质子化，因为它们显示低pKa(Asp:3.71; Glu:4.15)。在用于本发明的产品的自组装肽中，包含–COOH基团的氨基酸侧链特别地位于肽链中，以控制相邻肽之间的静电相互作用，即，以便在–COOH基团去质子化为–COO-时通过静电相互作用排斥相邻、相同的自组装肽，并且使肽之间的键的缔合自由能占优势。使pH降低至低于某一阈值，即肽开始经历自组装的pH，例如，对于P11-4 (SEQ ID NO:1)和修饰的P11-4(SEQ ID NO:2)为约pH 7.5，导致在本发明的自组装肽中–COOH基团质子化，这减小肽之间的排斥性静电相互作用，并允许肽自组装。
[0078] 用于本发明的产品的肽优选包含式X1-X2-X1-X2-X1的序列，其中X1为具有酸性侧链的氨基酸，X2为具有疏水侧链的氨基酸，选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(SEQ ID NO:3)。
[0079] 在更优选的实施方案中，用于本发明的产品的自组装肽包含序列Glu-X2-Glu-X2-Glu，其中X2是具有疏水侧链的氨基酸，选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(SEQ ID NO: 4)；或Asp-X2-Asp-X2-Asp，其中X2是具有疏水侧链的氨基酸，选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(SEQ ID NO:5)。
[0080] 在另一个优选的实施方案中，用于本发明的产品的自组装肽包含序列Gln-Gln-Arg-Phe-Glu-Trp-Glu-Phe-Glu-Gln-Gln (P11-4，SEQ ID NO:1)或与其具有至少40%、至少50%、至少80%或至少90%序列同一性的序列，或由之组成。也可使用如SEQ ID NO:2所示的修饰的P11-4。
[0081] 对于本文中称为P11-4的肽，在本发明的使用中主要通过pH控制从单体形式转换到组装多聚体形式。如果pH低于pH 7.5，则肽组装。如果pH较高，则肽的状态基本上为单体。
[0082] 与SEQ ID NO:1具有至少40%、优选至少80%或更大序列同一性的肽优选在相当于SEQ ID NO:1或2的氨基酸5、7和9的位置包括谷氨酸或天冬氨酸。具体地讲，与SEQ ID NO:1具有至少80%或更大序列同一性的肽序列优选在相当于SEQ ID NO:1的氨基酸5、7和9的位置包括谷氨酸。优选其余氨基酸位置为具有疏水侧链的氨基酸，选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。优选其余氨基酸位置不是具有碱性侧链的氨基酸，即大约中性的pH下带正电荷的氨基酸。
[0083] 在一个实施方案中，用于本发明的产品的肽包含通过1、2或3个氨基酸置换而不同于SEQ ID NO:1和2中所示序列的序列，或由其组成。一般SEQ ID NO:1和2的肽序列内的各氨基酸残基可由另一个残基取代，只要得到的肽仍能够在低于7.5的pH值下经历自组装。优选取代为保守取代，即，由作为功能等价物的相似极性的氨基酸取代一个或多个氨基酸残基。优选地，用作取代基的氨基酸残基选自与要被取代的氨基酸残基相同的氨基酸组。例如，疏水残基可用另一种疏水残基取代，或者极性残基可用具有相同电荷的另一种极性残基取代。可用于保守取代的功能同源氨基酸包括例如非极性氨基酸，例如甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。不带电荷的极性氨基酸的实例包括丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸。带电荷的极性(碱性)氨基酸的实例包括组氨酸、精氨酸和赖氨酸。带电荷的极性(酸性)氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0084] 另外，用于本发明的产品的肽可在结构上在一个或多个氨基酸位置被修饰，例如，通过引入一个或多个修饰的氨基酸。根据本发明，这些修饰的氨基酸可以为已通过例如生物素化、磷酸化、糖基化、乙酰化、支化和/或环化改变的氨基酸。另外，本发明的肽可另外或供选地包含其它修饰，例如末端封端基团、甲酰基-、γ-羧基谷氨酸羟基-、甲基-、磷酰基-、吡咯烷酮羧酸-和/或硫酸酯-基团。在一个优选的实施方案中，本发明的肽在其N-端被乙酰化，和/或在其C-端被酰胺化，例如用NH2-基团。一个特别优选的实施方案是N-端乙酰化和用NH2-基团使C-端酰胺化的肽P11-4，如以下序列所示：CH3CO-QQRFEWEFEQQ-NH2 (SEQ ID NO:2)。
[0085] 在本发明的牙齿护理产品中，自组装肽以单体状态被施用至牙齿表面，以单体状态，它们能够扩散至牙齿损伤，其中将实现再矿化。
[0086] 发现健康人类受试者的唾液的平均pH为约7.06 ± 0.04，对于慢性龈炎的受试者为7.24 ± 0.10，而具有慢性泛发性牙周炎的受试者的唾液的平均pH为6.85 ± 0.11 (Baliga等, 2013. J Indian Soc Periodontol. 17:461-465)，其中pH被充分缓冲，使例如牙齿被酸性食物或饮料的侵蚀最小化。
[0087] 在牙齿损伤中，由于形成口腔的微生物群的乳酸细菌连续产生乳酸，pH通常为5.0-6.5或更低(Murakami等, 2006. Dent Mater J 25(3):423-429)。因为早期龋齿损伤、例如表面下龋齿损伤具有酸性条件和高离子强度，自组装肽将开始原位组装，形成三维网络。因此，pH-诱导的单体肽组装在损伤内开始，从而形成多聚组装体，其可用作支架，用于随后磷酸钙沉积。该过程在本发明的情况下亦称为聚合。在网络形成后，从唾液吸引钙，产生成核岛，用于在早期龋齿损伤中形成磷酸钙结晶(羟基磷灰石)。此外，有洞龋齿的表面积非常高，包括深坑和沟。
[0088] 以其单体非组装状态施用自组装肽对于治疗表面下龋齿损伤是特别关键的，因为形成的支架太大而不能通过孔扩散。为了确保将肽充分递送至损伤，它们的组装必须被阻止，直到它们到达其作用部位。
[0089] 因此，保持pH高于肽开始经历自组装的pH是需要的，优选地直到足够量的肽单体被递送(例如，通过扩散)至作用部位，例如牙齿损伤。在本发明的牙齿护理产品中，有效的单体化可通过使用具有高出肽开始经历自组装的pH大于0.5个pH单位的pH的产品实现。优选地，本发明的产品的pH高出肽开始经历自组装的pH大于0.6个pH单位。甚至更优选地，pH高出肽开始经历自组装的pH大于0.7个pH单位。
[0090] 例如，当使用本文作为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2提及的肽时，产品可具有8.0或更高的pH，因为这些肽的自组装在pH 7.5时开始。因此，在本发明的产品中pH可以为7.5 - 9.0。在优选的实施方案中产品的pH为7.8 - 8.5、更优选地8.0 - 8.2。
[0091] 牙齿护理产品通常包含各种牙齿护理产品的一种或多种典型成分，例如具有所需pH的典型的药学上可接受的基料，其中自组装肽可掺入例如水或缓冲溶液中，例如如本文所述的。
[0092] 本发明的牙齿护理产品的pH可经缓冲以确保显著百分比的自组装肽以单体形式存在足够的时间，以确保它到达潜在损伤部位。
[0093] 合适的缓冲液包括TAPS ({[三(羟基甲基)甲基]氨基}丙磺酸)、Bicine (N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)、TRIS (三(羟基甲基)-氨基甲烷)、Tricine (N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸)、TAPSO (3-[N-三(羟基-甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)、HEPES (4-2-羟基-乙基-1-哌嗪乙磺酸)、TES (2-{[三(羟基-甲基)甲基]氨基}乙磺酸)和保持类似pH范围的其它缓冲液。包含例如柠檬酸、磷酸等的酸性缓冲液也可用于与任何上述缓冲液和/或碱性缓冲液结合，以获得高出肽开始经历自组装的pH大于0.5个pH单位的所需pH和提供缓冲能力，所述碱性缓冲液包含例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、二碱式和三碱式磷酸钠、二碱式和三碱式磷酸钾、三聚磷酸钠、TRIS、三乙醇胺、聚乙撑亚胺。在优选的实施方案中，提供高出肽开始经历自组装的pH大于0.5个pH单位的特定pH、例如pH 7.5的缓冲液是TRIS。
[0094] 为了改进产品的口味和认可度，本发明的牙齿护理产品可包含糖和/或糖代用品，其优选地不促进牙齿腐败，例如，多元醇或糖醇，例如山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽糖醇、木糖醇和/或赤藓糖醇，或D-塔格糖和/或海藻糖。在一个实施方案中，产品是无糖产品，即，它们不包含显著量的蔗糖或葡萄糖，或完全没有。
[0095] 如果除了自组装肽之外，牙齿护理产品还包含木糖醇(D-xylit)是特别有利的，所述木糖醇已表明防止龋齿发生和有助于牙齿的再矿化。其还减少生物膜和牙菌斑，因此有利于本发明的自组装肽到达牙齿表面和潜在损伤。当然，木糖醇不用于施用给狗、牛、山羊、兔或其它动物，该物质对于它们是有毒的。木糖醇可用于本发明的产品，用于人类受试者或例如，猫，优选地人类受试者。
[0096] 包含自组装肽的合适的溶液可例如包含1-10% PVP、0-30%甘油(优选地1-10%甘油)、1-10%的糖代用品(例如蔗糖或木糖醇)、0.01-1% TRIS、0.1-1% NaOH、0.1-1%自组装肽(例如，具有SEQ ID NO: 1的P11-4)和水(补足100)。%是w/w。优选地，溶液具有合适用于口腔冲洗器的粘度。
[0097] WO 2014/027012描述了包含自组装肽的组合物的制备，其具有高出肽开始经历自组装的pH 0.1-0.5个pH单位的pH。所述组合物意图由专业人员直接施用至龋齿损伤。尽管WO 2014/027012中公开的方法可用于或适用于本发明，但本发明的牙齿护理产品优选地不同于根据WO 2014/027012制备的产品，和不同于其中公开的方法的中间体产物，包括增加pH的挥发性化合物。
[0098] 在一个实施方案中，本发明的牙齿护理产品不包含矿物颗粒。
[0099] 在本发明的牙齿护理产品的高pH下，在步骤(v)中施用产品之前，至少70%、优选地至少80%、更优选地至少90%或至少95%或至少99%的自组装肽以单体非组装状态存在于产品中。
[0100] 在步骤(v)中施用至口腔的多个牙齿后，至少40%、至少50%、至少60%、优选地至少70%的肽保持单体形式至少1分钟。优选地，所述百分比的肽在施用后保持单体状态至少2分钟、至少3分钟、至少5分钟或至少10分钟。
[0101] 以此方式，本发明的方法允许有效非定向递送以单体状态存在的单体肽至多个牙齿，优选地至所有牙齿。肽仅在其作用部位处形成组装体和用于再矿化的支架，其中最优选的作用部位是损伤，例如龋齿损伤。在牙齿表面上分配后，自组装肽的聚合膜或组装膜还可形成和导致矿化增加，因此牙齿表面的硬度增加。
[0102] 在特别优选的实施方案中，牙齿护理产品包含肽P11-4 (SEQ ID NO:1)或SEQ ID NO:2所示的修饰的P11-4，和产品具有约8.0或更大的pH，其中优选地，pH被缓冲为约8.0或更大。
[0103] 在一个实施方案中，在步骤(v)中施用至多个牙齿之前，至少70%的肽以单体状态存在于产品中，其中在施用后至少50%、优选地至少60%、更优选地至少70%的肽以单体状态存在至少1分钟、优选地至少2分钟、更优选地至少3分钟或至少5分钟。
[0104] 在另一个实施方案中，在步骤(v)中施用至多个牙齿之前，至少80%的肽以单体状态存在于产品中，其中在施用后至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的肽以单体状态存在至少1分钟、优选地至少2分钟、更优选地至少3分钟或至少5分钟。
[0105] 在特别优选的实施方案中，在步骤(v)中施用至多个牙齿之前，至少90%的肽以单体状态存在于产品中，其中在施用后至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的肽以单体状态存在至少1分钟、优选地至少2分钟、更优选地至少3分钟。
[0106] 优选地，在施用前至少90%的自组装肽以单体状态存在于牙齿护理产品中。
[0107] 优选地，在步骤(v)中施用至多个牙齿后，至少60%的自组装肽以单体状态存在至少1分钟、优选地至少2分钟、更优选地至少3分钟。
[0108] 技术人员通过常规实验能够确定是否基本上所有的自组装肽为单体形式。例如，在溶液中肽的组装状态可如下确定：通过核磁共振(NMR)例如1H-NMR，通过圆二色性分析，通过动态光散射(DLS)分析、扩散性波光谱学、非变性电泳方法、粘度测量(流变学)、耗散型石英晶体微天平(Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, QCMD)等，优选地通过非变性电泳方法。
[0109] 本发明的产品是特别有利的，因为由于肽在作用部位外的自组装导致的显著量的肽损失被避免。同时，本发明的产品有利于分配必要浓度的单体自组装肽到牙齿上，以及如果适用的话，到损伤内部，以能够进行自组装。
[0110] 为了防止溶液中的肽降解和/或沉淀，一般不使pH提高到高于10.5的值。一般已知肽的化学性质取决于氨基酸序列。例如，半胱氨酸和甲硫氨酸残基的可逆氧化可在较高pH下加速，其中硫醇更容易去质子化，并容易形成链内或链间二硫键。技术人员将知道受碱性pH不利影响的氨基酸侧链，并且能够通过常规实验确定保持自组装肽的完整性完整的最高pH。例如，可根据肽中存在的各氨基酸的已知性质预测此最高pH。或者，可用生物化学方法(例如，电泳方法)确定肽的完整性。
[0111] 技术人员已知肽浓度可影响肽的组装，即特别高的肽浓度可提前触发组装。此外，特别低的肽浓度可阻止本发明的肽的组装，即甚至在低pH条件下，如在牙齿损伤和口腔中存在的条件。
[0112] 本发明的牙齿护理产品中的肽浓度可以是1-50000 mg肽/kg批量产品、100-30000 mg肽/kg批量产品、200-10000 mg肽/kg批量产品、500-5000或1000-2000 mg肽/kg批量产品、优选地200-1000 mg/kg。浓度也可以是约100-300 mg/kg批量产品或约200 mg/kg。下文的实施例表明这样的浓度允许自组装肽在表面下损伤中渗透和浓缩。
[0114] 合适的包封方法提供在例如Nedovic等, Procedia Food Science 1, 2011, 1806-1815。优选地，本发明的自组装肽可通过喷雾干燥、挤出方法(例如对于藻酸盐作为外壳材料)、乳化或在磷酸钙颗粒上流化床涂布来包封。例如，可使用包含自组装肽P11-4的藻酸盐胶囊。
[0115] 用于自组装肽的合适的包封外壳可包含淀粉和衍生物例如直链淀粉、支链淀粉、糊精、麦芽糊精、聚葡萄糖、糖浆、纤维素和衍生物、植物渗出物和提取物例如阿拉伯树胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、牧豆树胶、半乳甘露聚糖、果胶和可溶性大豆多醣，海产提取物例如角叉菜胶和藻酸盐，微生物和动物多醣例如葡聚糖、壳聚糖、黄原胶和结冷胶，蛋白质例如乳蛋白质和乳清蛋白质例如酪蛋白、明胶和谷蛋白，合适用于食品施用的脂质材料例如脂肪酸和脂肪醇，蜡例如蜂蜡、巴西棕榈蜡和小烛树蜡，甘油酯和磷脂，或其它材料例如PVP、石蜡、虫胶、无机材料。
[0116] 通常用于牙齿保健的液体牙齿护理产品，例如漱口水、口腔喷雾剂或溶液(例如，适用于口腔冲洗器)特别可用于本发明。
[0117] 本发明的牙齿护理产品在定期施用后有效地用于在受试者中治疗或预防牙齿损伤，和/或使牙齿表面再矿化和/或增加牙齿表面的硬度例如微硬度。在本文中，定期施用包括每2-6个月、至少每2个月、至少每个月、至少每周或每日施用。例如，在每2个月定期施用持续1年后，微硬度，例如去矿化牙齿的微硬度，可增加至少10%、优选地至少20%。微硬度，例如Vickers硬度或Knoop硬度，优选地Knoop硬度，可例如通过Chuenarron等(2009, Materials Research 12(4), 473-476)中描述的方法测量，其中压陷负荷优选地为100 g。
[0118] 以下实施例意图说明而非限制本发明。本文引用的所有参考文献以全文并入本文。
[0120] 图2显示本发明使用的示例性容器。A、B显示一组用于口腔冲洗器的单次使用筒芯(容器)。C显示包含两个隔室的单一筒芯。(1) 容器；(2) 在2A中，酸性表膜除去溶液；在2B中，包含自组装肽的本发明的溶液；(3) 口腔冲洗装置的转接器；(4) 流动方向；(5) 包含酸性表膜除去溶液的隔室；(6) 膜；(7) 包含包含自组装肽的本发明的溶液的隔室；(8) 刺。
[0121] 图3显示P11-4的自组装动力学，通过测量弹性模量G’评价。P11-4用不同的缓冲液组成(见下文)以15 mg/ml制备，以0.1%应变、37°C和1 rad/秒的频率测量。肽单体至聚合物的自组装在中性pH下不依赖于使用的离子强度而耗费大于5 min。
[0122] 正方形(上面符号线) - NaCl: Tris (0.055 M) + NaCl，最终离子强度142 mM；人造唾液(从上面起第二符号线)：Tris、Ca(NO3)2、KH2PO4 (比率0.77:0.14: 0.08)，离子强度142 mM；
Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)：NaCl、NaHCO3、KCl、CaCl2、MgSO4 (比率0.66:0.4:
0.05: 0.02:0.007)，离子强度165 mM；
MgSO4：0.055 M Tris + 0.192 M MgSO4 0.14 M离子强度。
Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)：NaCl、NaHCO3、KCl、CaCl2、MgSO4 (比率0.66:0.4:
0.05: 0.02:0.007)，离子强度165 mM；
MgSO4：0.055 M Tris + 0.192 M MgSO4 0.14 M离子强度。
[0123] 图4A显示在拔出的人臼齿中人造损伤的产生。图4B、C、D和E显示在pH 8.4-8.5下用肽孵育后，荧光标记的肽P11-4渗透至人造损伤。图4F和G显示在pH 6.3-6.8下用肽孵育后荧光标记的肽P11-4。共焦图片显示在孵育前(a)、1 min孵育后(b)、2 min孵育后(c)、5 min孵育后(d)和用再矿化缓冲液洗涤4天后(e)，在4x放大倍率的标记的肽的检测。图4C、D、E和G显示荧光标记的肽P11-4，其中用肽孵育在用人唾液预孵育牙齿后进行。在图4D和E中，在用P11-4孵育前，通过唾液形成的表膜通过NaClO (图4D)和声处理(图4E)被除去。实验详细描述于实施例3。实施例
[0124] 实施例1：用于本发明的示例性的溶液基础制剂溶液I
成分 % (w/w)
甘油 1-30 %
矫味剂 0.1-2
柠檬酸 0.05-1
山梨酸钾 0.05-0.2
泊洛沙姆407 0.1-1
氟化钠 0.1-1
氯化钠 0.5-1.0
磷酸氢二钠 0.1-1
氯化钾 0.001-0.1
磷酸二氢钾 0.01-0.1
表面活性剂 0.1-2
水 补足100
制剂溶液II
成分 % (w/w)
PVP 1-10
甘油 1-30
蔗糖 1-10 %
TRIS 0.01-1
氢氧化钠 0.01-1
P11-4 0.001-1
水 补足100
实施例2：本发明的示例性的处理方法
漱口水
步骤A：除去生物膜
-受试者用牙膏、例如研磨剂牙膏清洁牙齿
-吐出牙膏残余物
步骤B：除去表膜
-受试者摄取5ml漱口水IA，其包含水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、EDTA (浓度参考实施例I)；
-或者，供选地，受试者摄取5ml漱口水IB，其包含水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、月桂基硫酸钠SDS (浓度参考实施例I)；
-或者，供选地，受试者摄取5ml漱口水IC，其包含水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、椰油酰氨基丙基甜菜碱(浓度参考实施例I)
并且在口腔中涡旋漱口水约5 min
-受试者吐出漱口水
步骤C：再生
-受试者摄取5ml漱口水II，其包含PVP/甘油、水、乙醇、蔗糖、P11-4、氢氧化钠、TRIS (浓度参考实施例I)和在口腔中涡旋溶液约5 min
-5min后受试者吐出漱口水。
成分 % (w/w)
甘油 1-30 %
矫味剂 0.1-2
柠檬酸 0.05-1
山梨酸钾 0.05-0.2
泊洛沙姆407 0.1-1
氟化钠 0.1-1
氯化钠 0.5-1.0
磷酸氢二钠 0.1-1
氯化钾 0.001-0.1
磷酸二氢钾 0.01-0.1
表面活性剂 0.1-2
水 补足100
制剂溶液II
成分 % (w/w)
PVP 1-10
甘油 1-30
蔗糖 1-10 %
TRIS 0.01-1
氢氧化钠 0.01-1
P11-4 0.001-1
水 补足100
实施例2：本发明的示例性的处理方法
漱口水
步骤A：除去生物膜
-受试者用牙膏、例如研磨剂牙膏清洁牙齿
-吐出牙膏残余物
步骤B：除去表膜
-受试者摄取5ml漱口水IA，其包含水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、EDTA (浓度参考实施例I)；
-或者，供选地，受试者摄取5ml漱口水IB，其包含水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、月桂基硫酸钠SDS (浓度参考实施例I)；
-或者，供选地，受试者摄取5ml漱口水IC，其包含水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、椰油酰氨基丙基甜菜碱(浓度参考实施例I)
并且在口腔中涡旋漱口水约5 min
-受试者吐出漱口水
步骤C：再生
-受试者摄取5ml漱口水II，其包含PVP/甘油、水、乙醇、蔗糖、P11-4、氢氧化钠、TRIS (浓度参考实施例I)和在口腔中涡旋溶液约5 min
-5min后受试者吐出漱口水。
[0125] 口腔冲洗器步骤A：除去生物膜
-受试者用牙膏、例如研磨剂牙膏清洁牙齿
-吐出牙膏残余物
步骤B：除去表膜
-受试者将筒芯I置于口腔冲洗器上。筒芯I含有300 ml-600 ml酸性溶液(pH 4-7)，其包含：
-溶液IA：水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、EDTA (浓度参考实施例I)；
-或者，供选地，溶液IB，其包含水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、月桂基硫酸钠SDS (浓度参考实施例I)；
-或者，供选地，溶液IC，其包含水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、椰油酰氨基丙基甜菜碱(浓度参考实施例I)-受试者开始用口腔冲洗器清洁牙齿，直至筒芯I被用完。在该程序期间，受试者吐出过剩液体。
-受试者用牙膏、例如研磨剂牙膏清洁牙齿
-吐出牙膏残余物
步骤B：除去表膜
-受试者将筒芯I置于口腔冲洗器上。筒芯I含有300 ml-600 ml酸性溶液(pH 4-7)，其包含：
-溶液IA：水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、EDTA (浓度参考实施例I)；
-或者，供选地，溶液IB，其包含水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、月桂基硫酸钠SDS (浓度参考实施例I)；
-或者，供选地，溶液IC，其包含水、甘油、矫味剂、柠檬酸、山梨酸钾、泊洛沙姆407、氟化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、椰油酰氨基丙基甜菜碱(浓度参考实施例I)-受试者开始用口腔冲洗器清洁牙齿，直至筒芯I被用完。在该程序期间，受试者吐出过剩液体。
[0126] 步骤C：再生-受试者除去筒芯I和将筒芯II置于口腔冲洗器上。筒芯II含有100 ml略微碱性(pH >
7.5)溶液，其包含PVP/甘油、水、乙醇、蔗糖、P11-4、氢氧化钠、TRIS溶液(浓度参考实施例I)。
7.5)溶液，其包含PVP/甘油、水、乙醇、蔗糖、P11-4、氢氧化钠、TRIS溶液(浓度参考实施例I)。
[0127] -受试者开始用口腔冲洗器清洁牙齿，直至筒芯II被用完。在该程序期间，受试者吐出过剩液体。
[0128] 实施例3 - 单体自组装肽渗透至表面下损伤a) 产生人造龋齿损伤
按Lo等2010 (J Dent. 38(4):352–359)所述，对拔出的人臼齿产生人造损伤。为了定义去矿化表面下区域(即，人造龋齿损伤或白斑)的位置，牙齿用无色指甲油覆盖，留下大约
4 × 4 mm的窗口。在37°C下将牙齿置于去矿化缓冲液(2.2 mM CaCl2、2.2 mM NaH2PO4、50 mM乙酸；用1 M KOH调节pH至4.4)中3 d。为确保所有孔打开，正如典型的活性龋齿损伤那样，在室温下将得到的表面下损伤用10 μL 2% NaClO处理(孵育1 min)，冲洗和空气干燥。
按Lo等2010 (J Dent. 38(4):352–359)所述，对拔出的人臼齿产生人造损伤。为了定义去矿化表面下区域(即，人造龋齿损伤或白斑)的位置，牙齿用无色指甲油覆盖，留下大约
4 × 4 mm的窗口。在37°C下将牙齿置于去矿化缓冲液(2.2 mM CaCl2、2.2 mM NaH2PO4、50 mM乙酸；用1 M KOH调节pH至4.4)中3 d。为确保所有孔打开，正如典型的活性龋齿损伤那样，在室温下将得到的表面下损伤用10 μL 2% NaClO处理(孵育1 min)，冲洗和空气干燥。
[0129] 安慰剂处理的样品经历相同的预处理。
[0130] 典型的人造损伤显示于图4A。
[0131] b) 处理-P11-4 (SEQ ID NO: 2)的200 ppm (即，200 µg/ml)溶液，添加有10 ppm ATTO647-P11-4 (荧光标记的P11-4 (SEQ ID NO: 6): Ac-QQRFEWEFEQQSGSGC-(ATTO647)-NH2)，即
1:20，在25 mM TRIS缓冲液中以不同的pH、特别是8.4或8.5或6.3、6.5或6.8制备)。
1:20，在25 mM TRIS缓冲液中以不同的pH、特别是8.4或8.5或6.3、6.5或6.8制备)。
[0132] -如下表所规定的，任选地预处理牙齿，例如，通过在人唾液中孵育1天(约24小时)，任选地接着5 min声处理(258 hz，用声波牙刷Sonicare Diamond Clean ® (Philips))，或通过浸入2% NaClO中1 min。
[0133] -将牙齿浸入P11-4溶液中限定的一段时间，1、2或5 min，然后取出和在水中洗涤10 min或在再矿化缓冲液(2 mM Ca(NO3)、1.2 mM KHPO4和60 mM Tris/HCl，用1 M KOH将pH调节至7.4)中洗涤4天和/或6天。
[0134] -在牙齿处于P11-4溶液中时，和任选地，在水中或在再矿化缓冲液中洗涤10 min或者4或6天后，进行1、2或5 min孵育后的共焦评价。
[0135] c)共焦显微镜检查在dest.水中将样品置于µ-载片I (ibidi, Martinsried)上和通过共焦激光显微镜(Olympus IX81)进行分析。四个2维图像的记录的堆叠各自投射51.4 μm厚度的损伤体积，得到205 μm的总评价深度(物镜：UPLSAPO 20×/NA 0.75；氦-氖气体激光；激发：633 nm和发射：668 nm)。通过Olympus软件(FluoView FV1000)分析图像。
[0136] d)结论尽管视觉分析不允许准确定量结论，但重复实验中检出的趋势允许在不同孵育和预处理条件之间进行比较。
[0137] 表1：显示了处理的条件和在示例性的损伤中荧光P11-4存在情况的评估(1=无荧光P11-4或荧光P11-4低存在，到4= 荧光P11-4高存在)尽管在pH8.5下用P11-4孵育损伤后(牙齿10和1，牙齿10在图4B中)，在1 min孵育后肽已经可检出(图4Bb)，但大多数肽在2 min孵育(图4Bc)或5 min孵育(图4Bd)后在损伤中检出。较低但显著量的肽可在再矿化缓冲液中孵育4天后在损伤中再现地仍被检出(图4Be)。
[0138] 仅在水中进行洗涤而不同的比较实验(牙齿2，图片未显示)显示再矿化缓冲液而不是水使在损伤中自组装肽的存在稳定的趋势。
[0139] 这些实验显示，在略微碱性的缓冲液中浓度为200 ppm的单体荧光标记的P11-4可扩散至人造龋齿损伤和在其中形成稳定网络。在先技术证明，这导致损伤的再矿化。在损伤外部未检出显著量的肽。认为通过肽在损伤中的组装，梯度被改变，和肽从溶液进一步扩散至损伤成为可能，这导致自组装肽在损伤中浓缩。在与含有P11-4的溶液接触后在再矿化缓冲液(其反映人唾液)中孵育，可能通过形成复合物和再矿化，改进自组装肽在损伤中的保持。
[0140] 可得出结论，未标记的P11-4的行为方式与标记的检出肽相同，因此根据本发明，其可以该浓度或类似的低浓度用于非定向治疗早期龋齿损伤，例如表面下龋齿损伤。
[0141] 在用P11-4孵育前声处理作为预处理导致肽在损伤中的存在增加(牙齿ZR1，图片未显示)。
[0142] 在含人造损伤的牙齿用人唾液预孵育后，已知人唾液导致在牙齿上形成表膜(牙齿11、5和ZR4，牙齿10显示在图4C)，存在在pH 8.5下用荧光标记的肽P11-4孵育1、2或5 min导致与没有这样的预孵育相比，荧光肽在牙齿上或在损伤中的存在显著更低的趋势(图4B)。
[0143] 可表明，表膜的这种负面影响可在用人唾液孵育后通过声处理(牙齿ZR3，显示于图4D)或用NaClO处理(牙齿ZR2，显示于图4E)清洁牙齿而被抵消。
[0144] 在形成表膜和通过声处理清洁后，自组装肽因此可出乎意料地以甚至比没有用唾液预孵育更高的量被检出。
[0145] 在pH 6.3-6.8下孵育后(牙齿4、12 (均无唾液)、3、13 (均有唾液)、牙齿12和13分别显示于图4F和4G)，即，当肽为聚合形式时，在损伤中通常可检出比在pH 8.4或8.5下孵育后更低的量的肽。通过用唾液孵育形成表膜(牙齿3、13)进一步降低肽的渗透。
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