根据35USC§119(e)，本申请要求1995年10月5日提交的美 国临时申请60/004,834的优先权。

                        发明领域

本发明描述多功能性造血受体激动剂。

                        发明背景

刺激骨髓细胞分化和/或增殖的集落刺激因子(CSFs)引起广泛的 兴趣，是因为它们能恢复来自造血干细胞的细胞抑制水平的治疗潜力。 根据它们的活性，已鉴定和区别出了在人和鼠系统中的CSF。例如，粒 细胞-CSF(G-CSF)和巨噬细胞(M-CSF)体外分别刺激形成 嗜中性细胞和巨噬细胞集落，而GM-CSF和白介素-3(IL-3)有 更广泛的活性，刺激巨噬细胞、嗜中性和嗜酸性粒细胞集落的形成。IL -3也刺激肥大细胞、巨核细胞和纯的及混合的红细胞样集落的形成。

U.S.4,887,729和U.S.4,959,455公开了人IL-3和长臂猿IL-3 的cDNA及由它们编码的蛋白序列。在蛋白序列第8位，公开序列的hIL -3是丝氨酸而不是脯氨酸。

国际专利申请(PCT)WO88/00598号公开了长臂猿样和人样的IL -3。hIL-3含Ser8→Pro8的取代。暗示可进行由丝氨酸取代半胱氨酸， 因而断裂二硫键，和在糖基化位点取代一个或多个氨基酸。

U.S.4,810,643号公开了编码人G-CSF的DNA序列。

WO91/02754号公开了一种包括GM-CSF和IL-3的融合蛋白， 与单独的GM-CSF或IL-3相比，该蛋白增加了生物活性。还公开了 作为多功能性造血受体激动剂组分的非糖基化的IL-3和GM-CSF类 似物蛋白。

WO92/04455号公开了由IL-3和一种来自IL-3、IL-6、IL -7、IL-9、IL-11、EPO和G-CSF的淋巴因子融合而成的融 合蛋白。

WO95/21197和WO95/21254号公开了具有广泛的多功能造血特性 的融合蛋白。

GB2,285,446号专利叙述了c-mpl配体(血小板生成素)和各种 形式的血小板生成素，已表明它们影响巨核细胞和巨核细胞祖细胞的增 殖、分化和成熟，可用于治疗血小板减少症。

EP675,201 A1号专利叙述了c-mpl配体(巨核细胞生长和发育因 子(MGDF))，c-mpl配体的等位基因变异以及附着于如聚乙二醇 的水溶性聚合物上的c-mpl配体。

WO95/21920号提供了鼠和人c-mpl配体和其多肽片段。这些蛋 白用于体内和离体治疗，以刺激产生血小板。

蛋白序列的重排

在进化过程中，DNA序列的重排在产生蛋白结构和功能多样性中 起重要的作用。基因重复和外显子穿梭提供了一种快速产生多样性的重 要机制，因而使生物具有竞争优势，尤其是由于基本突变率低时 (Doolittle，蛋白质科学1:191-200,1992)。

重组DNA方法的发展使研究序列移位对蛋白折叠、结构和功能的影 响成为可能。用于产生新序列的方法与天然产生的蛋白对相似，蛋白对 由于其氨基酸序列的线性改组而相关(Cunningham等，美国国家科学院 院报76:3218-3222,1979；Teather & Erfle，细菌学杂志172: 3837-3841,1990；Schimming等，欧洲生物化学杂志204:13- 19,1992；Yamiuchi和Minamikawa,FEBS Lett.260:127-130, 1991；MacGregor等，FEBS Lett.378:263-266)。这种对蛋白重 排类型的首先体外应用由Goldenberg和Creighton加以描述(分子生物学 杂志165:407-413,1983)。新N-末端选在原始序列的一个内部 位点(断裂点)上，新序列与原始序列自断裂点直到位于原始C-末端 或附近的一个氨基酸的氨基酸顺序相同。在这点上新序列直接或通过序 列的附加部分(连接序列)，与位于原始序列N-末端或其附近的一个 氨基酸相连，然后新序列续以与原始相同的序列，一直到在相对于原始 序列的断裂位点为N-末端的氨基酸或其附近的一点上，该残基形成链 的新的C-末端。

这种方法已被应用到58-462个氨基酸大小的蛋白上(Goldenberg &Creighton，分子生物学杂志165:407-413,1983；Li&Coffino， 分子细胞生物学13:2377-2383,1993)。所检查的蛋白代表广泛 的结构种类，包括含占优势的α-螺旋(白介素-4；Kreitman等，细 胞因子7:311-318,1995),β-片层(白介素-1；Horlick等， 蛋白质工程5:427-431,1992)，或者两者的混和体(酵母磷酸核 糖基邻氨基苯甲酸异构酶；Luger等，科学243:206-210,1989)。 蛋白功能的主要种类表现在这些序列重组研究之中：

酶

T4溶菌酶           Zhang等，生物化学32:12311-12318,

                   1993；Zhang等，天然结构生物学1:434

                   -438(1995)

二氢叶酸还原酶     Buchwalder等，生物化学31:1621-

                   1630,1994；Protasova等，蛋白质工程

                   7:1373-1377,1995)

核酸酶T1           Mullins等，美国化学协会杂志116:5529

                   -5533,1994；Garrett等，蛋白质科学

                   5:204-211,1996)

芽孢杆菌β葡聚糖酶 Hahn等，美国国家科学院院报91:10417

                   -10421,1994)

天冬氨酸转氨甲酰酶 Yang & Schachman，美国国家科学院院报

                   90:11980-11984,1993)

磷酸核糖基邻氨基   Luger等，科学243:206-210,1989；

苯甲酸异构酶       (Luger等，蛋白质工程3:249-258,

                   1990)

胃蛋白酶/胃蛋白酶  Lin等，蛋白质化学4:159-166,1995)

酶原

磷酸甘油醛-3-      Vignais等，蛋白质科学4:994-1000,

磷酸脱氢酶         1995)

鸟氨酸脱羧酶       Li&Coffino，分子细胞生物学13:2377

                   -2383,1993)

酵母磷酸甘油酸     Ritco-Vonsovici等，生物化学34:16543

脱氢酶             -16551,1995)

酶抑制剂

碱性胰蛋白酶抑制剂      Goldenberg & Creighton，分子生物学杂志

                        165:407-413,1983)

细胞因子类

白介素-1β              Horlick等，蛋白质工程5:427-431,

                        1992)

白介素-4                Kreitman等，细胞因子7:311-318,

                        1995)

酪氨酸激酶识别结构域

α-血影蛋白SH3          Viguera等，分子生物学杂志247:670

结构域                  -681,1995)

跨膜蛋白

Omp A                   Koebnik & Krmer，分子生物学杂志

                        250:617-626,1995)

嵌合蛋白

白介素-4-假单胞菌       Kreitman等，美国国家科学院院报91:

外毒素                  6889-6893,1994)

这些研究结果非常易变。在许多情况下，观察到很低的活性、可溶 性或热动力学稳定性(大肠杆菌二氢叶酸还原酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、 磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、鸟氨酸脱 羧酶、Omp A、酵母磷酸甘油酸脱氢酶)。在其他情况下，序列重排蛋 白出现许多与其天然相似物几乎相同的特性(碱性胰蛋白酶抑制剂、T4 溶菌酶、核酸酶T1、芽孢杆菌β-葡聚糖酶、白介素-1β、α-血影 蛋白SH3结构域、胃蛋白酶原、白介素-4)。在例外的情况下，观察 到对天然序列的某些特性未曾预料到的改进，如可溶性和对重排的α- 血影蛋白SH3结构域序列的重新折叠率，变换的白介素-4-假单胞菌 外毒素融合分子的受体亲和性和抗肿瘤活性(Kreitman等，美国国家科 学院院报91:6889-6893,1994；Kreitman等，癌症研究55:3357 -3363,1995)。

对研究的这些类型的原初目的是研究短距离和长距离相互作用在蛋 白折叠和稳定性中的作用。这种类型的序列重排把在原始序列中长距离 相互作用的亚基变换成新序列中的短距离相互作用，反之亦然。许多这 些序列的重排能获得至少具有某些活性的构象的事实，是蛋白质折叠由 多种折叠途径发生的有说服力的证据。(Viguera等，分子生物学杂志 247:670-681,1995)。在α-血影蛋白SH3结构域的情况中，选 择新末端的部位与β-受体激动剂相对应。本发明也叙述了含多功能性 造血受体激动剂的药用组合物，和应用多功能性造血受体激动剂的方 法。

除了本发明体内应用多功能性造血受体激动剂外，还展望了体外应 用包括在输注到病人体内之前刺激骨髓和血细胞活化和生长的能力。

本发明的多功能性受体激动剂也能用下列通式表示： (T1)a-(L1)b-X1-(L)c-X2-(L2)d-(T2)e X1-(L)c-X2-(L)-Y1-(L)c-Y2

其中：

X1是包含对应于原始蛋白n+1到J残基的氨基酸序列的肽，而原 始蛋白具有1～J的氨基酸残基并且其残基1为N-末端；

L是任选的接头；

X2是包含原始蛋白1～n氨基酸残基序列的肽；

Y1是包含对应于原始蛋白的n=1到k的残基序列的蛋白质，而原 始蛋白具有1到k顺序编码的氨基酸残基并且残基1为N-末端；

Y2是包含原始蛋白的1～n氨基酸残基序列的肽；

L1和L2是任选的肽间隔区；

n是1到J-1的整数；

b,c，和d分别各自为0或1；

a和e之一可以是0或1，前提是a和e二者不能都为0；以及

T1和T2是蛋白质。

另外，本发明涉及包括编码多功能性造血受体激动剂和核苷酸序列 的重组表达载体，相关的微生物表达系统和在蛋白质中制备多功能性造 血发夹转折的方法，其中该蛋白质稳定性稍差，但仍能折叠。

发现在此研究中所引用的内部断裂点位置只位于蛋白的表面，分布 于整个线性序列之中，而没有明显的针对末端或中部的偏倚性(从原始 N-末端到断裂点相对距离的变异为总序列长度的大约10～80％)。 在这些研究中，连接原始N-和C-末端的接头为0～9个残基。在一 种情况下(Yang & Schachman，美国国家科学院院报90:11980- 11984,1993)，原始C-末端片段的部分序列已被删去，并在截断 的C-末端与原始的N-末端间进行连接。诸如甘氨酸和丝氨酸这样的 柔性亲水残基常用在接头中。Viguera等(分子生物学杂志247:670 -681,1995)对用3或4残基的接头连接原始N-和C-末端进行 了比较，3个残基的接头具有更低的热动力学上的稳定性。Protasova等 (蛋白质工程7:1373-1377,1994)在连接大肠杆菌二氢叶酸脱氢 酶的原始N-末端时使用了3或5个残基的接头，只有3个残基的接头 产生了大量的蛋白。

                     发明概述

本发明的新型造血蛋白由如下通式表示：

R1-L1-R2,R2-L1-R1,R1-R2，或R2-R1

其中R1和R2分别选自：

(Ⅰ)一种多肽，包括：有下述通式的修饰的人G-CSF氨基酸序 列： 1                                   10 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Xaa

                    20 Leu Leu Xaa Xaa Xaa Glu Gln Val Xaa Lys Xaa Gln Gly Xaa Gly

30                                      40 Ala Xaa Leu Gln Glu Xaa Leu Xaa Ala Thr Tyr Lys Leu Xaa Xaa

                    50 Xaa Glu Xaa Xaa Val Xaa Xaa Gly His Ser Xaa Gly Ile Pro Trp

60                                      70 Ala Pro Leu Ser Ser Xaa Pro Ser Xaa Ala Leu Xaa Leu Ala Gly

                    80 Xaa Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu

90                                      100 Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu

                    110 Xaa Thr Leu Gln Xaa Asp Val Ala Asp Phe Ala Xaa Thr Ile Trp

120                                     130 Gln Gln Met Glu Xaa Xaa Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr

                    140 Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Xaa Gln Xaa Xaa Ala

150                                     160 Gly Gly Val Leu Val Ala Ser Xaa Leu Gln Xaa Phe Leu Xaa Xaa

                    170 Ser Tyr Arg Val Leu Xaa Xaa Leu Ala Gln Pro (SEQ ID NO:1) 其中 Xaa在位点1是Thr,Ser,Arg,Tyr或Gly； Xaa在位点2是Pro或Leu； Xaa在位点3是Leu,Arg,Tyr或Ser； Xaa在位点13是Phe,Ser,His,Thr或Pro； Xaa在位点16是Lys,Pro,Ser,Thr或His； Xaa在位点17是Cys,Ser,Gly,Ala,Ile,Tyr或Arg； Xaa在位点18是Leu,Thr,Pro,His,Ile或Cys； Xaa在位点22是Arg,Tyr,Ser,Thr或Ala； Xaa在位点24是Ile,Pro,Tyr或Leu； Xaa在位点27是Asp或Gly； Xaa在位点30是Ala,Ile,Leu或Gly； Xaa在位点34是Lys或Ser； Xaa在位点36是Cys或Ser； Xaa在位点42是Cys或Ser； Xaa在位点43是His,Thr,Gly,Val,Lys,Trp,Ala,Arg,Cys或Leu； Xaa在位点44是Pro,Gly,Arg,Asp,Val,Ala,His,Trp,Gln或Thr； Xaa在位点46是Glu,Arg,Phe,Arg,Ile或Ala； Xaa在位点47是Leu或Thr； Xaa在位点49是Leu,Phe,Arg或Ser； Xaa在位点50是Leu,Ile,His,Pro或Tyr； Xaa在位点54是Leu或His； Xaa在位点64是Cys或Ser； Xaa在位点67是Gln,Lys,Leu或Cys； Xaa在位点70是Gln,Pro,Leu,Arg或Ser； Xaa在位点74是Cys或Ser； Xaa在位点104是Asp,Gly或Val； Xaa在位点108是Leu,Ala,Val,Arg,Trp,Gln或Gly； Xaa在位点115是Thr,His,Leu或Ala； Xaa在位点120是Gln,Gly,Arg,Lys或His； Xaa在位点123是Glu,Arg,Phe或Thr； Xaa在位点144是Phe,His,Arg,Pro,Leu,Gln或Glu； Xaa在位点146是Arg或Gln； Xaa在位点147是Arg或Gln； Xaa在位点156是His,Gly或Ser； Xaa在位点159是Ser,Arg,Thr,Tyr,Val或Gly； Xaa在位点162是Glu,Leu,Gly或Trp； Xaa在位点163是Val,Gly,Arg或Ala； Xaa在位点169是Arg,Ser,Leu,Arg或Cys； Xaa在位点170是His,Arg或Ser；

其中可选择性地删去N-末端1-11个氨基酸和C-末端的1-5 个氨基酸；以及其中N-末端直接或通过一个可将N-末端连接到C- 末端上的接头连接到C-末端上，并在如下氨基酸位点具有新的C-和 N-末端；

38-39    62-63    123-124

39-40    63-64    124-125

40-41    64-65    125-126

41-42    65-66    126-127

42-43    66-67    128-129

43-44    67-68    128-129

45-46    68-69    129-130

48-49    69-70    130-131

49-50    70-71    131-132

52-53    71-72    132-133

53-54    91-92    133-134

54-55    92-93    134-135

55-56    93-94    135-136

56-57    94-95    136-137

57-58    95-96    137-138

58-59    96-97    138-139

59-60    97-98    139-140

60-61    98-99    140-141

61-62    99-100   141-142

                  or142-143； (Ⅱ)一种多肽，包含：下述通式的修饰的hIL-3氨基酸序列： Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn 1               5                   10                  15 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            20                  25                  30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            35                  40                  45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            50                  55                  60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            65                  70                  75 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            80                   85                 90 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            95                  100                 105 Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            110                 115                  120 Xaa Xaa Xaa Gln Gln Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe

            125                 130 (SEQ ID NO:2)； 其中Xaa在位点17是Ser,Lys,Gly,Asp,Met,Gln，或Arg； Xaa在位点18是Asn,His,Leu,Ile,Phe,Arg，或Gln； Xaa在位点19是Met,Phe,Ile,Arg,Gly,Ala，或Cys； Xaa在位点20是Ile,Cys,Gln,Glu,Arg,Pro，或Ala； Xaa在位点21是Asp,Phe,Lys,Arg,Ala,Gly,Glu,Gln,Asn,Thr,Ser，或

         Val； Xaa在位点22是Glu,Trp,Pro,Ser,Ala,His,Asp,Asn,Gln,Leu,Val，或

         Gly； Xaa在位点23是Ile,Val,Ala,Gly,Trp,Lys,Phe,Leu,Ser，或Arg； Xaa在位点24是Ile,Gly,Val,Arg,Ser,Phe，或Leu； Xaa在位点25是Thr,His,Gly,Gln,Arg,Pro，或Ala； Xaa在位点26是His,Thr,Phe,Gly,Arg,Ala，或Trp； Xaa在位点27是Leu,Gly,Arg,Thr,Ser，或Ala； Xaa在位点28是Lys,Arg,Leu,Gln,Gly,Pro,Val，或Trp； Xaa在位点29是Gln,Asn,Leu,Pro,Arg，或Val； Xaa在位点30是Pro,His,Thr,Gly,Asp,Gln,Ser,Leu，或Lys； Xaa在位点31是Pro,Asp,Gly,Ala,Arg,Leu，或Gln； Xaa在位点32是Leu,Val,Arg,Gln,Asn,Gly,Ala，或Glu； Xaa在位点33是Pro,Leu,Gln,Ala,Thr，或Glu； Xaa在位点34是Leu,Val,Gly,Ser,Lys,Glu,Gln,Thr,Arg,Ala,Phe,Ile,

         或Met； Xaa在位点35是Leu,Ala,Gly,Asn,Pro,Gln，或Val； Xaa在位点36是Asp,Leu，或Val； Xaa在位点37是Phe,Ser,Pro,Trp，或Ile； Xaa在位点38是Asn，或Ala； Xaa在位点40是Leu,Trp，或Arg； Xaa在位点41是Asn,Cys,Arg,Leu,His,Met，或Pro； Xaa在位点42是Gly,Asp,Ser,Cys,Asn,Lys,Thr,Leu,Val,Glu,Phe,Tyr

         Ile,Met，或Ala； Xaa在位点43是Glu,Asn,Tyr,Leu,Phe,Asp,Ala,Cys,Gln,Arg,Thr,

         Gly，或Ser； Xaa在位点44是Asp,Ser,Leu,Arg,Lys,Thr,Met,Trp,Glu,Asn,Gln,

         Ala，或Pro； Xaa在位点45是Gln,Pro,Phe,Val,Met,Leu,Thr,Lys,Trp,Asp,Asn,

         Arg,Ser,Ala,Ile,Glu，或His； Xaa在位点46是Asp,Phe,Ser,Thr,Cys,Glu,Asn,Gln,Lys,His,Ala,

         Tyr,Ile,Val，或Gly； Xaa在位点47是Ile,Gly,Val,Ser,Arg,Pro，或His； Xaa在位点48是Leu,Ser,Cys,Arg,Ile,His,Phe,Glu,Lys,Thr,Ala,Met,

         Val，或Asn； Xaa在位点49是Met,Arg,Ala,Gly,Pro,Asn,His，或Asp； Xaa在位点50是Glu,Leu,Thr,Asp,Tyr,Lys,Asn,Ser,Ala,Ile,Val,His,

         Phe,Met，或Gln； Xaa在位点51是Asn,Arg,Met,Pro,Ser,Thr，或His； Xaa在位点52是Asn,His,Arg,Leu,Gly,Ser，或Thr； Xaa在位点53是Leu,Thr,Ala,Gly,Glu,Pro,Lys,Ser，或Met； Xaa在位点54是Arg,Asp,Ile,Ser,Val,Thr,Gln,Asn,Lys,His,Ala，或

         Leu； Xaa在位点55是Arg,Thr,Val,Ser,Leu，或Gly； Xaa在位点56是Pro,Gly,Cys,Ser,Gln,Glu,Arg,His,Thr,Ala,Tyr,Phe,

         Leu,Val，或Lys； Xaa在位点57是Asn，或Gly； Xaa在位点58是Leu,Ser,Asp,Arg,Gln,Val，或Cys； Xaa在位点59是Glu,Tyr,His,Leu,Pro，或Arg； Xaa在位点60是Ala,Ser,Pro,Tyr,Asn，或Thr； Xaa在位点61是Phe,Asn,Glu,Pro,Lys,Arg，或Ser； Xaa在位点62是Asn,His,Val,Arg,Pro,Thr,Asp，或Ile； Xaa在位点63是Arg,Tyr,Trp,Lys,Ser,His,Pro，或Val； Xaa在位点64是Ala,Asn,Pro,Ser，或Lys； Xaa在位点65是Val,Thr,Pro,His,Leu,Phe，或Ser； Xaa在位点66是Lys,Ile,Arg,Val,Asn,Glu，或Ser； Xaa在位点67是Ser,Ala,Phe,Val,Gly,Asn,Ile,Pro，或His； Xaa在位点68是Leu,Val,Trp,Ser,Ile,Phe,Thr，或His； Xaa在位点69是Gln,Ala,Pro,Thr,Glu,Arg,Trp,Gly，或Leu； Xaa在位点70是Asn,Leu,Val,Trp,Pro，或Ala； Xaa在位点71是Ala,Met,Leu,Pro,Arg,Glu,Thr,Gln,Trp，或Asn； Xaa在位点72是Ser,Glu,Met,Ala,His,Asn,Arg，或Asp； Xaa在位点73是Ala,Glu,Asp,Leu,Ser,Gly,Thr，或Arg； Xaa在位点74是Ile,Met,Thr,Pro,Arg,Gly,Ala； Xaa在位点75是Glu,Lys,Gly,Asp,Pro,Trp,Arg,Ser,Gln或Leu； Xaa在位点76是Ser,Val,Ala,Asn,Trp,Glu,Pro,Gly，或Asp； Xaa在位点77是Ile,Ser,Arg,Thr，或Leu； Xaa在位点78是Leu,Ala,Ser,Glu,Phe,Gly，或Arg； Xaa在位点79是Lys,Thr,Asn,Met,Arg,Ile,Gly，或Asp； Xaa在位点80是Asn,Trp,Val,Gly,Thr,Leu,Glu，或Arg； Xaa在位点81是Leu,Gln,Gly,Ala,Trp,Arg,Val，或Lys； Xaa在位点82是Leu,Gln,Lys,Trp,Arg,Asp,Glu,Asn,His,Thr,Ser,

         Ala,Tyr,Phe,Ile,Met，或Val； Xaa在位点83是Pro,Ala,Thr,Trp,Arg，或Met； Xaa在位点84是Cys,Glu,Gly,Arg,Met，或Val； Xaa在位点85是Leu,Asn,Val,或Gln； Xaa在位点86是Pro,Cys,Arg,Ala，或Lys； Xaa在位点87是Leu,Ser,Trp，或Gly； Xaa在位点88是Ala,Lys,Arg,Val，或Trp； Xaa在位点89是Thr,Asp,Cys,Leu,Val,Glu,His,Asn，或Ser； Xaa在位点90是Ala,Pro,Ser,Thr,Gly,Asp,Ile，或Met； Xaa在位点91是Ala,Pro,Ser,Thr,Phe,Leu,Asp，或His； Xaa在位点92是Pro,Phe,Arg,Ser,Lys,His,Ala,Gly,Ile，或Leu； Xaa在位点93是Thr,Asp,Ser,Asn,Pro,Ala,Leu，或Arg； Xaa在位点94是Arg,Ile,Ser,Glu,Leu,Val,Gln,Lys,His,Ala，或Pro； Xaa在位点95是His,Gln,Pro,Arg,Val,Leu,Gly,Thr,Asn,Lys,Ser,Ala,

         Trp,Phe,Ile，或Tyr； Xaa在位点96是Pro,Lys,Tyr,Gly,Ile，或Thr； Xaa在位点97是Ile,Val,Lys,Ala，或Asn； Xaa在位点98是His,Ile,Asn,Leu,Asp,Ala,Thr,Glu,Gln,Ser,Phe,Met,

         Val,Lys,Arg,Tyr，或Pro； Xaa在位点99是Ile,Leu,Arg,Asp,Val,Pro,Gln,Gly,Ser,Phe，或His； Xaa在位点100是Lys,Tyr,Leu,His,Arg,Ile,Ser,Gln，或Pro； Xaa在位点101是Asp,Pro,Met,Lys,His,Thr,Val,Tyr,Glu,Asn,Ser,

          Ala,Gly,Ile,Leu，或Gln； Xaa在位点102是Gly,Leu,Glu,Lys,Ser,Tyr，或Pro； Xaa在位点103是Asp，或Ser； Xaa在位点104是Trp,Val,Cys,Tyr,Thr,Met,Pro,Leu,Gln,Lys,Ala,

          Phe，或Gly； Xaa在位点105是Asn,Pro,Ala,Phe,Ser,Trp,Gln,Tyr,Leu,Lys,Ile,

          Asp，或His； Xaa在位点106是Glu,Ser,Ala,Lys,Thr,Ile,Gly，或Pro； Xaa在位点108是Arg,Lys,Asp,Leu,Thr,Ile,Gln,His,Ser,Ala，或Pro； Xaa在位点109是Arg,Thr,Pro,Glu,Tyr,Leu,Ser，或Gly； Xaa在位点110是Lys,Ala,Asn,Thr,Leu,Arg,Gln,His,Glu,Ser，或Trp； Xaa在位点111是Leu,Ile,Arg,Asp，或Met； Xaa在位点112是Thr,Val,Gln,Tyr,Glu,His,Ser，或Phe； Xaa在位点113是Phe,Ser,Cys,His,Gly,Trp,Tyr,Asp,Lys,Leu,Ile,Val,

          或Asn； Xaa在位点114是Tyr,Cys,His,Ser,Trp,Arg，或Leu； Xaa在位点115是Leu,Asn,Val,Pro,Arg,Ala,His,Thr,Trp，或Met； Xaa在位点116是Lys,Leu,Pro,Thr,Met,Asp,Val,Glu,Arg,Trp,Ser,

          Asn,His,Ala,Tyr,Phe,Gln，或Ile； Xaa在位点117是Thr,Ser,Asn,Ile,Trp,Lys，或Pro； Xaa在位点118是Leu,Ser,Pro,Ala,Glu,Cys,Asp，或Tyr； Xaa在位点119是Glu,Ser,Lys,Pro,Leu,Thr,Tyr，或Arg； Xaa在位点120是Asn,Ala,Pro,Leu,His,Val，或Gln； Xaa在位点121是Ala,Ser,Ile,Asn,Pro,Lys,Asp，或Gly； Xaa在位点122是Gln,Ser,Met,Trp,Arg,Phe,Pro,His,Ile,Tyr，或Cys； Xaa在位点123是Ala,Met,Glu,His,Ser,Pro,Tyr，或Leu；

其中可选择性地删去N-末端的l～14个氨基酸和/或从C-末端 删去1～15个氨基酸；而其中用Xaa命名的0～44位氨基酸不同于原 始(1-133)人白介素-3的相应的氨基酸；以及

并且N-末端直接或通过一种能把N-末端连接到C-末端上的接 头(L2)连接到C-末端上并在如下的氨基酸位点具有新的C-和N -末端；

26-27    49-50    83-84

27-28    50-51    84-85

28-29    51-52    85-86

29-30    52-53    86-87

30-31    53-54    87-88

31-32    54-55    88-89

32-33    64-65    89-90

33-34    65-66    90-91

34-35    66-67    91-92

35-36    67-68    92-93

36-37    68-69    97-98

37-38    69-70    98-99

38-39    70-71    99-100

39-40    71-72    100-101

40-41    72-73    101-102

41-42    82-83    102-103

                  或103-104； 或者

(Ⅲ)一种多肽，包括：具有下述通式的修饰的人c-mpl配体氨 基酸序列： SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSer 1           5              10             15 HisValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrPro 20             25             30             35 ValLeuLeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGlu    40             45             50             55 ThrLysAlaGlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAla

  60             65             70             75 AlaArgGlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGly

     80             85             90             95 GlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnXaaXaaXaa

        100            105            110 XaaGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHis 115            120            125            130 LeuLeuArgGlyLysValArgPheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysVal    135            140            145            150 ArgArgAlaProProThrThrAlaValProSerArgThrSerLeuValLeuThrLeu

  155            160            165            170 AsnGluLeuProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThrAlaSerAla

     175            180            185            190 ArgThrThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGlyPheArgAlaLysIlePro

        195            200            205 GlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeuAspGlnIleProGlyTyrLeuAsnArg 210            215            220            225 IleHisGluLeuLeuAsnGlyThrArgGlyLeuPheProGlyProSerArgArgThr    230             235           240            245 LeuGlyAlaProAspIleSerSerGlyThrSerAspThrGlySerLeuProProAsn

  250            255            260            265 LeuGlnProGlyTyrSerProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyrThrLeu

     270            275            280            285 PheProLeuProProThrLeuProThrProValValGlnLeuHisProLeuLeuPro

        290            295            300 AspProSerAlaProThrProThrProThrSerProLeuLeuAsnThrSerTyrThr 305            310            315            320 HisSerGlnAsnLeuSerGlnGluGly (SEQ ID NO:3)    325            330   332 153 其中； 112位的Xaa被删去或者是Leu,Ala,Val,Ile,Pro,Phe,Trp，或Met； 113位的Xaa被删去或者是Pro,Phe,Ala,Val,Leu,Ile,Trp，或Met； 114位的Xaa被删去或者是Pro,Phe,Ala,Val,Leu,Ile,Trp，或Met； 115位的Xaa被删去或者是Gln,Gly,Ser,Thr,Tyr，或Asn；和 以及其中N-末端直接或通过一种能把N-末端连接到C-末端上，接头 (L2)连接到C-末端，在如下氨基酸位点具有新的C-和N-末端；

26-27    51-52    108-109

27-28    52-53    109-110

28-29    53-54    110-111

29-30    54-55    111-112

30-31    55-56    112-113

32-33    56-57    113-114

33-34    57-58    114-115

34-35    58-59    115-116

36-37    59-60    116-117

37-38    78-79    117-118

38-39    79-80    118-119

40-41    80-81    119-120

41-42    81-82    120-121

42-43    82-83    121-122

43-44    83-84    122-123

44-45    84-85    123-124

46-47    85-86    124-125

47-48    86-87    125-126

48-49    87-88    126-127

50-51    88-89    或127-128； 或者

(Ⅳ)一种多肽，包括：有如下通式的修饰的hIL-3氨基酸序列： Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn 1               5                   10                  15 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            20                  25                  30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            35                  40                  45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            50                  55                  60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            65                  70                  75 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            80                  85                  90 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            95                  100                 105 Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            110                 115                 120 Xaa Xaa Xaa Gln Gln Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe

            125                 130 (SEQ ID NO:2) 其中Xaa在位点17是Ser,Lys,Gly,Asp,Met,Gln，或Arg； Xaa在位点18是Asn,His,Leu,Ile,Phe,Arg，或Gln； Xaa在位点19是Met,Phe,Ile,Arg,Gly,Ala，或Cys； Xaa在位点20是Ile,Cys,Gln,Glu,Arg,Pro，或Ala； Xaa在位点21是Asp,Phe,Lys,Arg,Ala,Gly,Glu,Gln,Asn,Thr,Ser，或

         Val； Xaa在位点22是Glu,Trp,Pro,Ser,Ala,His,Asp,Asn,Gln,Leu,Val，或

         Gly； Xaa在位点23是Ile,Val,Ala,Gly,Trp,Lys,Phe,Leu,Ser，或Arg； Xaa在位点24是Ile,Gly,Val,Arg,Ser,Phe，或Leu； Xaa在位点25是Thr,His,Gly,Gln,Arg,Pro，或Ala； Xaa在位点26是His,Thr,Phe,Gly,Arg,Ala，或Trp； Xaa在位点27是Leu,Gly,Arg,Thr,Ser，或Ala； Xaa在位点28是Lys,Arg,Leu,Gln,Gly,Pro,Val，或Trp； Xaa在位点29是Gln,Asn,Leu,Pro,Arg，或Val； Xaa在位点30是Pro,His,Thr,Gly,Asp,Gln,Ser,Leu，或Lys； Xaa在位点31是Pro,Asp,Gly,Ala,Arg,Leu，或Gln； Xaa在位点32是Leu,Val,Arg,Gln,Asn,Gly,Ala，或Glu； Xaa在位点33是Pro,Leu,Gln,Ala,Thr，或Glu； Xaa在位点34是Leu,Val,Gly,Ser,Lys,Glu,Gln,Thr,Arg,Ala,Phe,Ile,

         或Met； Xaa在位点35是Leu,Ala,Gly,Asn,Pro,Gln，或Val； Xaa在位点36是Asp,Leu，或Val； Xaa在位点37是Phe,Ser,Pro,Trp，或Ile； Xaa在位点38是Asn，或Ala； Xaa在位点40是Leu,Trp，或Arg； Xaa在位点4l是Asn,Cys,Arg,Leu,His,Met，或Pro； Xaa在位点42是Gly,Asp,Ser,Cys,Asn,Lys,Thr,Leu,Val,Glu,Phe,Tyr

         Ile,Met，或Ala； Xaa在位点43是Glu,Asn,Tyr,Leu,Phe,Asp,Ala,Cys,Gln,Arg,Thr,

         Gly，或Ser； Xaa在位点44是Asp,Ser,Leu,Arg,Lys,Thr,Met,Trp,Glu,Asn,Gln,

         Ala，或Pro； Xaa在位点45是Gln,Pro,Phe,Val,Met,Leu,Thr,Lys,Trp,Asp,Asn,

         Arg,Ser,Ala,Ile,Glu，或His； Xaa在位点46是Asp,Phe,Ser,Thr,Cys,Glu,Asn,Gln,Lys,His,Ala,

         Tyr,Ile,Val，或Gly； Xaa在位点47是Ile,Gly,Val,Ser,Arg,Pro，或His； Xaa在位点48是Leu,Ser,Cys,Arg,Ile,His,Phe,Glu,Lys,Thr,Ala,Met,

         Val，或Asn； Xaa在位点49是Met,Arg,Ala,Gly,Pro,Asn,His，或Asp； Xaa在位点50是Glu,Leu,Thr,Asp,Tyr,Lys,Asn,Ser,Ala,Ile,Val,His,

         Phe,Met，或Gln； Xaa在位点51是Asn,Arg,Met,Pro,Ser,Thr，或His； Xaa在位点52是Asn,His,Arg,Leu,Gly,Ser，或Thr； Xaa在位点53是Leu,Thr,Ala,Gly,Glu,Pro,Lys,Ser，或Met； Xaa在位点54是Arg,Asp,Ile,Ser,Val,Thr,Gln,Asn,Lys,His,Ala，或

         Leu； Xaa在位点55是Arg,Thr,Val,Ser,Leu，或Gly； Xaa在位点56是Pro,Gly,Cys,Ser,Gln,Glu,Arg,His,Thr,Ala,Tyr,Phe,

         Leu,Val，或Lys； Xaa在位点57是Asn,或Gly； Xaa在位点58是Leu,Ser,Asp,Arg,Gln,Val，或Cys； Xaa在位点59是Glu,Tyr,His,Leu,Pro，或Arg； Xaa在位点60是Ala,Ser,Pro,Tyr,Asn，或Thr； Xaa在位点6l是Phe,Asn,Glu,Pro,Lys,Arg，或Ser； Xaa在位点62是Asn,His,Val,Arg,Pro,Thr,Asp，或Ile； Xaa在位点63是Arg,Tyr,Trp,Lys,Ser,His,Pro，或Val； Xaa在位点64是Ala,Asn,Pro,Ser，或Lys； Xaa在位点65是Val,Thr,Pro,His,Leu,Phe，或Ser； Xaa在位点66是Lys,Ile,Arg,Val,Asn,Glu，或Ser； Xaa在位点67是Ser,Ala,Phe,Val,Gly,Asn,Ile,Pro，或His； Xaa在位点68是Leu,Val,Trp,Ser,Ile,Phe,Thr，或His； Xaa在位点69是Gln,Ala,Pro,Thr,Glu,Arg,Trp,Gly，或Leu； Xaa在位点70是Asn,Leu,Val,Trp,Pro，或Ala； Xaa在位点71是Ala,Met,Leu,Pro,Arg,Glu,Thr,Gln,Trp，或Asn； Xaa在位点72是Ser,Glu,Met,Ala,His,Asn,Arg，或Asp； Xaa在位点73是Ala,Glu,Asp,Leu,Ser,Gly,Thr，或Arg； Xaa在位点74是Ile,Met,Thr,Pro,Arg,Gly,Ala； Xaa在位点75是Glu,Lys,Gly,Asp,Pro,Trp,Arg,Ser,Gln或Leu； Xaa在位点76是Ser,Val,Ala,Asn,Trp,Glu,Pro,Gly，或Asp； Xaa在位点77是Ile,Ser,Arg,Thr，或Leu； Xaa在位点78是Leu,Ala,Ser,Glu,Phe,Gly，或Arg； Xaa在位点79是Lys,Thr,Asn,Met,Arg,Ile,Gly，或Asp； Xaa在位点80是Asn,Trp,Val,Gly,Thr,Leu,Glu，或Arg； Xaa在位点8l是Leu,Gln,Gly,Ala,Trp,Arg,Val，或Lys； Xaa在位点82是Leu,Gln,Lys,Trp,Arg,Asp,Glu,Asn,His,Thr,Ser,

         Ala,Tyr,Phe,Ile,Met，或Val； Xaa在位点83是Pro,Ala,Thr,Trp,Arg，或Met； Xaa在位点84是Cys,Glu,Gly,Arg,Met，或Val； Xaa在位点85是Leu,Asn,Val，或Gln； Xaa在位点86是Pro,Cys,Arg,Ala，或Lys； Xaa在位点87是Leu,Ser,Trp，或Gly； Xaa在位点88是Ala,Lys,Arg,Val，或Trp； Xaa在位点89是Thr,Asp,Cys,Leu,Val,Glu,His,Asn，或Ser； Xaa在位点90是Ala,Pro,Ser,Thr,Gly,Asp,Ile，或Met； Xaa在位点91是Ala,Pro,Ser,Thr,Phe,Leu,Asp，或His； Xaa在位点92是Pro,Phe,Arg,Ser,Lys,His,Ala,Gly,Ile，或Leu； Xaa在位点93是Thr,Asp,Ser,Asn,Pro,Ala,Leu，或Arg； Xaa在位点94是Arg,Ile,Ser,Glu,Leu,Val,Gln,Lys,His,Ala，或Pro； Xaa在位点95是His,Gln,Pro,Arg,Val,Leu,Gly,Thr,Asn,Lys,Ser,Ala,

         Trp,Phe,Ile，或Tyr； Xaa在位点96是Pro,Lys,Tyr,Gly,Ile，或Thr； Xaa在位点97是Ile,Val,Lys,Ala，或Asn； Xaa在位点98是His,Ile,Asn,Leu,Asp,Ala,Thr,Glu,Gln,Ser,Phe,Met,

         Val,Lys,Arg,Tyr，或Pro； Xaa在位点99是Ile,Leu,Arg,Asp,Val,Pro,Gln,Gly,Ser,Phe，或His； Xaa在位点100是Lys,Tyr,Leu,His,Arg,Ile,Ser,Gln，或Pro； Xaa在位点101是Asp,Pro,Met,Lys,His,Thr,Val,Tyr,Glu,Asn,Ser,

          Ala,Gly,Ile,Leu，或Gln； Xaa在位点102是Gly,Leu,Glu,Lys,Ser,Tyr，或Pro； Xaa在位点103是Asp，或Ser； Xaa在位点104是Trp,Val,Cys,Tyr,Thr,Met,Pro,Leu,Gln,Lys,Ala,

          Phe，或Gly； Xaa在位点105是Asn,Pro,Ala,Phe,Ser,Trp,Gln,Tyr,Leu,Lys,Ile,

          Asp，或His； Xaa在位点106是Glu,Ser,Ala,Lys,Thr,Ile,Gly，或Pro； Xaa在位点108是Arg,Lys,Asp,Leu,Thr,Ile,Gln,His,Ser,Ala，或Pro； Xaa在位点109是Arg,Thr,Pro,Glu,Tyr,Leu,Ser，或Gly； Xaa在位点110是Lys,Ala,Asn,Thr,Leu,Arg,Gln,His,Glu,Ser，或Trp； Xaa在位点111是Leu,Ile,Arg,Asp，或Met； Xaa在位点112是Thr,Val,Gln,Tyr,Glu,His,Ser，或Phe； Xaa在位点113是Phe,Ser,Cys,His,Gly,Trp,Tyr,Asp,Lys,Leu,Ile,Val,

          或Asn； Xaa在位点114是Tyr,Cys,His,Ser,Trp,Arg，或Leu； Xaa在位点115是Leu,Asn,Val,Pro,Arg,Ala,His,Thr,Trp，或Met； Xaa在位点116是Lys,Leu,Pro,Thr,Met,Asp,Val,Glu,Arg,Trp,Ser,

          Asn,His,Ala,Tyr,Phe,Gln，或Ile； Xaa在位点117是Thr,Ser,Asn,Ile,Trp,Lys，或Pro； Xaa在位点118是Leu,Ser,Pro,Ala,Glu,Cys,Asp，或Tyr； Xaa在位点119是Glu,Ser,Lys,Pro,Leu,Thr,Tyr，或Arg； Xaa在位点120是Asn,Ala,Pro,Leu,His,Val，或Gln； Xaa在位点121是Ala,Ser,Ile,Asn,Pro,Lys,Asp，或Gly； Xaa在位点122是Gln,Ser,Met,Trp,Arg,Phe,Pro,His,Ile,Tyr，或Cys； Xaa在位点123是Ala,Met,Glu,His,Ser,Pro,Tyr，或Leu；

其中可选择性删去N-末端的1-14氨基酸和/或C-末端的1- 15氨基酸；并且由Xaa所指的1-44氨基酸与天然(1-133)人白 介素-3的对应氨基酸不同；或者

(Ⅴ)一种集落刺激因子；并且其中L1是能连接R1到R2的接头， 条件是至少R1或R2选自通式(Ⅰ),(Ⅱ),(Ⅲ)的多肽；并且所 说造血蛋白可任选地直接以(Met-1),(Ala-1)或(Met-2,Ala-1) 启始。

在上述多肽(Ⅰ)中可形成新的N-末端和C-末端的更优选的断 裂位点是：38-39,39-40,40-41,41-42,48-49,53 -54,54-55,55-56,56-57,57-58,58-59,59- 60,60-61,61-62,62-63,64-65,65-66,66-67, 67-68,68-69,69-70,96-97,125-126,126-127, 127-128,128-129,129-130,130-131,131-132,132 -133,133-134,134-135,135-136,136-137,137- 138,138-139,139-140,140-141和141-142。

在上述多肽(Ⅰ)中可形成新的N-末端和C-末端的最优选的断 裂位点是：38-39,48-49,96-97,125-126,132-133 和141-142。

在上述多肽(Ⅱ)中可形成新的N-末端和C-末端的更优选的断 裂位点是：28-29,29-30,30-31,31-32,32-33,33 -34,34-35,35-36,36-37,37-38,38-39,39- 40,66-67,67-68,68-69,69-70,70-71,84-85, 85-86,86-87,87-88,88-89,89-90,90-91,98 -99,99-100,100-101和101-102。

在上述多肽(Ⅱ)中可形成新的N-末端和C-末端的最优选的断 裂位点是：34-35,69-70和90-91。

在上述多肽(Ⅲ)或氨基酸序列(SEQ ID NO:256)中可形成 新的N-末端和C-末端的更优选的断裂位点是：80-81,81-82, 82-83,83-84,84-85,85-86,86-87,108-109, 109-110,110-111,111-112,112-113,113-114,114 -115,115-116,116-117,117-118,118-119,119- 120,120-121,121-122,122-123,123-124,124-125, 125-126和126-127。

在上述多肽(Ⅲ)中或氨基酸序列(SEQ ID NO:256)中可形 成新的N-末端和C-末端的最优选的断裂位点是：81-82,108- 109,115-116,119-120,122-123和125-126。

                  附图简述

图1图解说明蛋白的序列重排。原蛋白的N-末端(N)和C-末 端(C)通过接头相连或直接相连。蛋白在断裂点处被打开，形成了新 的N-末端(新N)和新的C-末端(新-C)，结果使蛋白具有新的 线性氨基酸序列。重排的分子可按线性分子从头合成，而不是经过连接 原始N-末端和C-末端，然后在断裂点处将蛋白断开的步骤形成。

图2显示方法Ⅰ的图解，为产生新蛋白，其中原蛋白的原始N-末 端和C-末端用一接头连接在一起，产生了蛋白的不同N-末端和C- 末端。在实施例中显示的序列重排导致了出现一种编码具有新N-末端 和新C-末端的蛋白的新基因。新N-末端在原始蛋白97位氨基酸处 产生，原始C-末端(氨基酸174位)通过一连接区与氨基酸11位(氨 基酸1-10已被删去)相连，而新C-末端在原始序列96位氨基酸处 产生。

图3显示方法Ⅱ的图解，为产生新蛋白，其中原蛋白的原始N-末 端和C-末端不用接头连接在一起，产生了该蛋白的不同的N-末端和 C-末端。在实施例中显示的序列重排导致了出现一种编码具有新N- 末端和新C-末端的蛋白的新基因。新N-末端在原始蛋白97位氨基 酸处产生，原始C-末端(氨基酸174位)与原始N-末端相接，而新 C-末端在原始序列的96位氨基酸处产生。

图4显示方法Ⅲ的图解，为产生新蛋白，其中原蛋白的原始N-末 端和C-末端用一接头相接，产生了该蛋白的不同的N-末端和C-末 端。在实施例中显示的序列重排导致了产生一种编码具有新N-末端和 新C-末端的蛋白的基因。新N-末端在原始蛋白的97位氨基酸处产 生，原始C-末端(氨基酸174位)通过一连接区与1位氨基酸相连， 而新C-末端在原始序列96位氨基酸处产生。

                      发明详述

本发明包含自共价连接多肽形成的多功能性造血受体激动剂，其中 每-种可通过一种不同的和特异的细胞受体起作用，以启动互补性生物 活性。造血生成需要一系列复杂的细胞事件，其中干细胞持续产生形成 所有主要谱系的成熟细胞大群体。目前至少已知20种调节子具有造血增 殖活性。大多数这些增殖调节子仅能在体外刺激一种或另一种类型的集 落形成，由每一调节子刺激集落形成的精确类型相当不同。由集落数评 价或较重要的由构成逐步形成集落细胞的谱系和成熟类型评价，没有二 种调节子能精确地刺激相同类型的集落形成。增殖应答最容易在简化的 体外培养系统中进行分析。能辨别的三种相当不同的参数是集落体积的 改变、集落数目的改变和细胞谱系。二种或多种因子可对祖细胞起作用， 诱导大量的子细胞形成，因而增加了集落体积。二种或多种因子允许祖 细胞增殖增加数量，是由于祖细胞的不同亚集合存在专门针对一种因子 应答的情况，或者由于某些祖细胞在能在应答前需要二种或多种因子刺 激。通过使用二种或多种因子使细胞的另外受体活化有可能增强有丝分 裂信号，因为不同的起始信号通路连合形成共同的最终通路，到达细胞 核(Metcalf，自然339:27,1989)。其他机制能解释协同作用。例 如，如果一种信号通路受限于由第二个因子引起另外的信号通路中介活 化的话，那么这种情况会导致非常大的附加应答。在某些情况下，一种 受体类型的活化能诱导其他受体的增强表达(Metcalf，血液82:3515 -3523,1993)。二种或多种因子比单一的因子会导致出现不同类型 的细胞谱系。应用多功能性造血受体激动剂可能具有潜在的临床优势， 其原因是不可能由单一因子引起增殖应答。

造血和其他生长因子的受体能分组为相关蛋白的2个不同家族： (1)酪氨酸激酶受体，包括对表皮生长因子、M-CSF(Sherr，血 液75:1,1990)和SCF(Yarden等，EMBO J.6:3341,1987) 的受体：以及(2)造血受体，这些受体不含有酪氨酸激酶结构域，但 在它们的细胞外结构域中显示明显的同源性(Bazan，美国国家科学院 院报87:6934-6938,1990)。在后一组中包括红细胞生成素(EPO) (D′andrea等，细胞57:277,1989),GM-CSF(Gearing等， EMBO J.8:3667,1989)，IL-3(Kitamura等，细胞66:1165, 1991),G-CSF(Fukunaga等，生物化学杂志265:14008-15, 1990),IL-4(Harada等，美国国家科学院院报87:857,1990), IL-5(Takaki等，EMBO J.9:4367,1990),IL-6(Yamasaki 等，科学241:825,1988),IL-7(Goodwin等，细胞60:941 -51,1990),LIF(Gearing等，EMBO J.10:2839,1991)和 IL-2(Cosman等，分子免疫学23:935-94,1986)。后一组的 大多数受体以异二聚体的高亲和力形式存在。与配体结合后，特异的o 链形成至少和一种其他的受体链(β-链，γ-链)缔合。许多这些因 子共同使用共同的受体亚单位。针对GM-CSF、IL-3和IL-5的α -链共同使用相同的β-链(Kitamura等，细胞66:1165,1991), Takaki等，EMBO J.10:2833-8,1991)和针对IL-6、LIF和 IL-11的受体复合物共同使用共同的β-链(gp130)(Taga等，细 胞58:573-81,1989；Gearing等，科学255:1434-7,1992)。 IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15的受体复合物共同使用 共同的γ-链(Kondo等，科学262:1874,1993；Russell等，科学 266:1042-1045,1993；Noguchi等，科学262:1877,1993； Giri等，EMBO J.13:2822-2830,1994)。

多重作用的造血因子的应用亦可通过减少对植入产生因子的细胞和 它们的诱导系统的需求而具有潜在的优点。如果一种细胞产生因子的能 力有限，那么通过降低每种因子的所需浓度和把它们联合使用而减少对 产生因子的细胞的需求，这可能是有用的。多重作用的造血因子的应用 可降低所需因子的数量，也许会减少发生不良副作用的可能性。

本发明的新化合物由选自下组的一种通式表示:

R1-L1-R2,R2-L1-R1,R1-R2和R2-R1

其中对R1和R2的解释如上。优选R2是一种集落刺激因子，与R1 相比具有不同但互补的活性。依靠互补活性意味着增强或改变对另一种 细胞调节物应答的活性。R1多肽要么直接要么通过一种接头片段与R2 多肽相连接。措词“直接”确定为多功能性造血受体激动剂其多肽连接 没有一种肽接头。因而L1代表一种化学键或多肽片段，R1和R2在框 中连接到L1上，最常见的L1是一种线性多肽，R1和R2由酰胺键连接 到L1上，R1的羧基端与L1的氨基端相连而L1的羧基端与R2的氨基 端相连。由于“框内连接”意味着编码R1和R2的DNA的读框之间没 有翻译终止或中断。

其他生长因子的非排除性的列表即集落刺激因子(CSFs)是细胞因 子、淋巴因子、白介素、造血生成因子，这些因子能与(Ⅰ)、(Ⅱ) 或(Ⅲ)相连接，它们包括GM-CSF、G-CSF、c-mpl配体(也 称为TPO或MGDF)、M-CSF、红细胞生成素(EPO)、IL-1、 IL-4、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL- 9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、LIF、flt3/flk2 配体、人生长激素、B-细胞生长因子、B-细胞分化因子、嗜酸性分 化因子和曾称为青灰因子或c-kit配体的干细胞因子(CSF)。另外，本 发明包括修饰过的R1或R2分子或者编码这些R1或R2分子的突变或修 饰过的DNA序列的应用。本发明也包括多功能性造血受体激动剂，其中 R1或R2是hIL-3变异体、c-mpl配体变异体或G-CSF变异体。 “hIL-3变异体”定义为已在WO94/12638、WO94/12639和WO 95/00646专利号公开内容的具有氨基酸替换和/或hIL-3部分缺失的hIL -3分子，以及本领域熟知的其他变异体。“c-mpl配体变异体”定 义为在美国申请系列号08/383,035公开内容的具有氨基酸替换和/或c- mpl配体部分缺失的c-mpl配体分子，以及本领域熟知的其他变异体。 “G-CSF变异体”定义为在此公开内容的具有氨基酸替换和/或G- CSF部分缺失的G-CSF分子，以及本领域熟知的其他变异体。

一般来说，连接基团(L1)是长度介于1～500个氨基酸的多肽。 连接2个分子的接头优选的设计应为(1)允许2分子不依赖对方而折 叠和起作用，(2)没有产生能干扰2种蛋白功能结构域的有序二级结 构的趋向，(3)具有最小的能与功能性蛋白结构域相互作用的疏水特 性以及(4)提供R1和R2空间隔离，这样R1和R2能同时与位于单细 胞上的其相应的受体起作用。在柔性蛋白区典型的表面氨基酸包括甘氨 酸、天冬酰胺和丝氨酸。实际上任何含甘氨酸、天冬酰胺和丝氨酸的氨 基酸序列的置换可望满足上述用作连接序列的标准。其他中性氨基酸如 苏氨酸和丙氨酸也可用于接头序列中。另外的氨基酸也可包括在接头 中，这是由于在连接序列中添加独特的限制性位点便于多功能性造血受 体激动剂的构建。

本发明优选的L1接头包括选自下列通式的序列: (Gly3Ser)n(SEQ ID NO:4),(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:5),(Gly5Ser)n (SEQ ID NO:6),(GlynSer)n(SEQ ID NO:7)或(AlaGlySer)n(SEQ ID NO:8)。

高度柔性接头的一个实施例是存在于丝状噬菌体如噬菌体M13或fd 的pⅢ蛋白中的富含甘氨酸和丝氨酸的间隔区(Schaller等，美国国家 科学院院报72:737-741,1975)。该区提供了在pⅢ表面蛋白的 两个结构域之间的柔性长间隔区。间隔区由如下氨基酸序列组成： GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGlu GlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer  (SEQ ID NO:9)。

本发明也包括其中包含内肽酶识别序列的接头。为分离多功能性造 血受体激动剂的组分而体外测定它们是否合适折叠具有活性，这些裂解 位点可能是有用的。各种内肽酶的实施例包括但不局限于纤维蛋白溶 酶、肠激酶、激肽释放酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原活化子、梭菌 蛋白酶、凝乳酶、胶原酶、Russell′s蝰蛇毒蛋白酶、脯氨酸后裂解酶 (postproline)、V8蛋白酶、凝血酶和Xa因子。

来自重链免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的铰链区的肽 连接片段提供了所连接片段之间的角关系。尤其是这些铰链区中用丝氨 酸取代半胱氨酸是有用的。本发明的优选接头包括来源于鼠IgGγ2b铰 链区的序列，其中半胱氨酸已变换为丝氨酸。这些接头也可包括内肽酶 裂解位点。上述接头的实施例包括在下列序列中： IleSerGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLys GluSerHisLysSerPro(SEQ ID NO:10)和 IleGluGlyArgIleSerGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSer ProProSerLysGluSerHisLysSerPro(SEQ ID NO:11).

然而，本发明不受所用的连接序列的形式、大小或数目所限制，并 且接头的唯一要求是功能上它不干扰多功能性造血受体激动剂的单独分 子的折叠和功能。

接头L2的确定

用于Rl和/或R2中的接头L2的氨基酸序列长度根据经验或结构信 息指导下选出，或结合使用这两种方法选出。

当没有结构信息可参考时，制备用于试验的少量系列接头可用下列 设计，其长度有变化以便包括0～50 的范围，而其序列选择要与表面 暴露(亲水性，Hopp & Woods，分子免疫学20:483-489,1983)， Kyte & Doolittle，分子生物学杂志l57:105-132；溶剂暴露表面区， Lee & Richards，分子生物学杂志55:379-400,1971)和采用必需 的构象而不干扰R1或R2构象的能力(构象柔性；Karplus & Schulz, Naturwissenschaften72:212-213,1985)相一致。假定每残基2.0～ 3.8的翻译平均值，这将意味着所测的长度在0～30个残基之间，以0～ 15个残基为优选范围。上述系列经验的例证是用诸如重复n次的Gly- Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:12)盒式序列构建接头，其中n为l、 2、3或4。本领域的技术人员将识别出许多长度或组成有变化的这样序 列用作接头，主要考虑是它们并不过长或过短就行(cf,Sandhu，生物 技术重点评述12:437-462,1992)；如果它们太长，熵效应有可 能使三维折叠不稳定，也有可能使动力学上折叠不可能发生；如果它们 太短，它们就有可能因为扭力或空间张力而使分子不稳定。

本领域的技术人员在分析蛋白的结构信息时将会清楚地认识到用末 端之间的距离，即定义为c-α碳之间的距离能用于确定所用序列的长 度，或至少限定在经验选择接头时必须测定的可能的数目。他们也会清 楚地认识到有时会出现这样的情形，肽链末端的位置在来自X-射线衍 射或核磁共振色谱资料所做的结构模型中被错误解释，如果真有这种情 况，因而就需要考虑这种情况，以适当地估计所需接头的长度。从那些 其位置被准确确定的残基中能选出序列接近链末端的2个残基，而它们 的c～α碳之间的距离用于计算它们之间接头的大约长度。利用计算出 的长度做指导，那么就能选出具有一系列残基数目的接头(用每残基2～ 3.8计算)。这些接头可包括原始序列，根据需要缩短或延长。当需要 延长时，添加的残基可选自上述的柔性和亲水的种类；或者选择性地用 一系列接头替换原始序列，一个实施例是上面提到的Gly-Gly-Gly -Ser(SEQ ID NO:12)盒式方法；或者选择性地利用具有合适总长 度的原始序列和新序列的结合方式。

R1和R2氨基和羧基末端的确定

通过从原始多肽链中适当选择开始(氨基末端)和结尾(羧基末端) 的位置，而用上述的接头序列L2，就能制备出能折叠成生物学活性状态 的R1和R2序列。利用下述的指导原则，氨基和羧基端可从涉及断裂点 区共有的序列长度之中选出。在许多情况下，选择的新末端会是羧基末 端的原始位置直接位于氨基末端的位置之前。然而，本领域的技术人员 会清楚地认识到能起作用的区段中任何位置选择末端，选择末端将有效 地导致新序列的氨基或羧基部分缺失或添加。

蛋白的原最初的氨基酸序列支配折叠成表达其生物学功能必需的三 维结构。本领域的技术人员利用单一蛋白晶体的X射线衍射和蛋白溶液 的核磁共振色谱而获得和解释三维结构信息的方法已经熟知。与断裂点 区确认有关的结构信息的实施例包括蛋白二级结构的定位和类型(α和3 -10个螺旋，平行和反平行β-片层、链反转、转折和环；Kabsch & Scander，生物聚合体22:2577-2637,1983)，氨基酸残基可溶性 暴露的程度，残基和另一个残基相互作用的范围和类型(Chothia，生物 化学年评53:537-572,1984)以及沿多肽链构象的静态和动态分 布(Alber & Mathews，酶学方法154:511-533,1987)。在某些 情况下，已知有关残基可溶性暴露的附加信息；一个实施例是蛋白表面 必需的翻译后糖类附着位点。当实验性结构信息没有或不便得到时，可 用的方法是分析最初的氨基酸序列，以预测蛋白的三级和二级结构、溶 剂的可及度及转折和环的发生率。如果直接的结构方法不行时，有时亦 可用生物学的方法而经验性确定表面暴露；例如为推知表面暴露，利用 有限的蛋白水解鉴别链剪切的位点(Gentile & Salvators，欧洲生物化学 杂志218:603-621,1993)。因此，利用来自实验得到的结构信息 或预测方法(例如，Srinivisan & Rose蛋白：结构、功能和遗传学22: 81-99,1995)，根据它们是否整合到二级和三级结构的维持之中， 可检查亲代的氨基酸序列而划分区段。产生的序列其中区段已知涉及周 期性的二级结构(α和3-10螺旋、平行和反平行的β-片层)，应避 免这样的区段。相似地，所观察或预测的氨基酸序列区段具有低程度的 溶解暴露，很有可能这些区段是称为蛋白的疏水核心部分，也应避免选 作氨基和羧基的末端。比较而言，那些已知或预测位于表面转折或环上 的区段，尤其是那些已知对生物学活性并不需要的区段是定位多肽链末 端的优选位点。根据以上标准优选的氨基酸序列的继续片段归属于断裂 点区段。

非共价的多功能性造血生长因子

连接2种造血生长因子的替代方法是通过非共价的相互作用。上述 复合蛋白能由下面通式之一加以描述：

R1-C1+R2-C2；或C1-R1+C2-R2；C1-R1+R2 -C2；或C1-R1+R2-C2。

R1和R2的定义见上。结构域C1和C2要么相同要么不相同的化学 结构，典型的是蛋白性的，这些结构能形成非共价特异的连接。C1和 C2之间的复合体结果形成R1和R2之间针对每个复合体的一对一的化学 计量关系。连接的结构域实施例是转录因子的“亮氨酸拉链”结构域、 细菌转录抑制子的二聚化结构域和免疫球蛋白的恒定结构域。共价键分 别连接R1和C1以及R2和C2。正如通式中所示，结构域C1和C2能 位于它们相应的造血生成因子(R)的N-末端和C-末端。这些多聚 化的结构域(C1和C2)包括那些来自bZIP蛋白家族的成员(Abel等， 自然341:24-25,1989；Landshulz等，科学240:1759-1764, 1988；Pu等，核苷酸研究21:4348-4355,1993；Kozarides等， 自然336:646-651,1988)，以及螺旋-环-螺旋的蛋白家族的多 聚化结构域(Abel等，自然341:24-25,1989；Murre等，细胞 56:777-783,1989；Tapscott等，科学242:405-411,1988； Fisher等，遗传和发育5:2342-2352,1991)。本发明优选的多功 能性造血受体激动剂包括集落刺激因子，这些因子凭借翻译的多功能性 造血受体激动剂与bZIP家族蛋白Fos和Jun的亮氨酸拉链二聚体化结构 域而二聚体化。Jun的亮氨酸拉链结构域能与相同的结构域相互作用。 另一方面，Fos的亮氨酸拉链结构域能和Jun的亮氨酸拉链结构域相互 作用，但不能和其他的Fos亮氨酸拉链结构域相互作用。Fos和Jun的混 合物优先地形成Fos-Jun异二聚体。所以，当与集落刺激因子连接时， Jun结构域能用于指导同源或异源二聚体的形成。如果集落刺激因子偶联 体之一作工程化处理拥有Jun亮氨酸拉链结构域，而另一个作工程化处 理拥有Fos拉链，就能得到异二聚体的优选形成。

亦可添加另外的肽序列以便于多功能性造血受体激动剂蛋白的纯化 或鉴别(如，聚组氨酸)。也可添加高抗原性的肽段，以通过特异的单 克隆抗体对多功能性造血受体激动剂蛋白快速分析和方便纯化。

“突变氨基酸序列”、“突变蛋白”、“变异蛋白”、“突变蛋白” 或“突变多肽”指的是，由于氨基酸缺失、替换或二者兼而有之，或者 故意制取与原序列不同的核苷酸序列编码的，具有与原序列不同的氨基 酸序列的一种多肽。“原序列”指的是氨基酸或核苷酸序列与基因或蛋 白的野生型或原始形式相一致。

通过它们刺激来自人造血祖细胞的集落形成的能力而对造血生长因 子的进行特征描述。形成的集落包括红细胞系、粒细胞、巨核细胞、粒 细胞性巨噬细胞以及它们的混合物。起先在灵长目然后在人类中进行的 研究表明，许多造血生长因子具有恢复骨髓功能和外周血细胞群体到治 疗上有益水平的功能。造血生长因子的许多或全部的这些生物学活性涉 及信号转导和高亲和力受体的结合。当与单因子或改善半寿期或降低不 良副效应，或者这些特性的联合作用作比较时，本发明的多功能性造血 受体激动剂可显示出诸如相似或更大的生物学活性的有用特性。

很小或没有激动剂活性的多功能性造血受体激动剂或许可用作拮抗 剂，用作产生抗体的抗原以使用于免疫学或免疫治疗中，用作基因探针 或中间体而用于构建其他有用的hIL-3突变蛋白。

本发明的多功能性造血受体激动剂蛋白的生物学活性可由因子依赖 细胞系的DNA合成或在体外骨髓测定中统计集落形成单位加以测定。

与单独起作用的造血激动剂相比较，本发明的多功能性造血受体激 动剂可能具有改善的治疗特征。例如，相对于其他不具有相似或相应的 增加副作用的造血激动剂，本发明的一些多功能性造血受体激动剂可能 有相似或更强的生长因子活性。

本发明也包括编码多功能性造血受体激动剂蛋白的DNA序列，基本 上相似和基本上执行相同功能的DNA序列以及仅由于遗传密码的简并 性而与编码本发明的多功能性造血受体激动剂的DNA不同的DNA序 列。在本发明中也包括用于构建突变的DNA和由这些寡核苷酸编码的多 肽的寡核苷酸中间体。

本领域现今标准的遗传工程技术(美国专利号4,935,233和 Sambrook等，“分子克隆实验手册”，冷泉港实验室，1989)可用于 本发明的DNA序列的构建。上述的一种方法是盒式诱变(Wells等，基 因34:315-323,1985)，其中在质粒中的部分编码序列在2个限 制性位点之间部分基因中，被编码所需氨基酸替换的合成寡核苷酸取 代。

编码所需基因的互补合成寡核苷酸能相互配对，退火。寡核苷酸的 DNA序列除那些与序列替换和/或缺失的部分例外，能编码所需基因的氨 基酸的序列。

质粒DNA用所选的限制性内切酶处理，然后连接到退火的寡核苷酸 上。连接的混和物用于转化对合适的抗生素有抗性的感受态JM101细胞 中。挑取单菌落，通过限制性分析和/或DNA测序检查质粒DNA，以确 认质粒拥有所需的基因。

其中至少拥有其他集落刺激因子的DNA序列之一的新型多功能性 造血激动剂的DNA序列的克隆可通过使用中间载体完成。替代方法是可 将基因直接克隆到含其他基因的载体中。接头和衔接子用于连接DNA序 列，以及取代丢失的序列，其中限制性位点在感兴趣的区段内部。因此， 编码一条多肽、多肽接头和其他多肽的遗传材料(DNA)插入到适当的 表达载体中，用于转化细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳类细胞。培养转化 的机体，用标准技术分离蛋白。因此所得的产物是通过将一种集落刺激 因子由连接区连接到第二种集落刺激因子上而得到的新蛋白。

本发明的另一方面提供用于表达这些新型的多功能性造血受体激动 剂的质粒DNA载体。这些载体含有上述的编码本发明新型多肽的新型 DNA序列。能转化微生物，表达多功能性造血受体激动剂的合适载体包 括表达载体，这些表达载体包括编码根据所用的宿主细胞选择的转录和 翻译调节序列相连接的多功能性造血受体激动剂的核苷酸序列。

如上面所述的整合有修饰过的序列载体也包括在本发明中，用于产 生多功能性造血受体激动剂多肽。在方法中所用的载体也含有操作性地 和本发明的DNA编码序列相连接的选出的调节序列，该序列能指导在所 选的宿主细胞中复制和表达。

作为本发明的另一方面，提供一种方法以生产新型的多功能性造血 受体激动剂。本发明的方法涉及培养合适的细胞或细胞系，这些细胞已 用含编码表达的新型多功能性造血受体激动剂的DNA序列的载体转 化。合适的细胞或细胞系可能是细菌细胞。例如，在生物技术领域中， 不同的大肠杆菌菌株作为宿主细胞已众所周知。上述菌株的实施例包括 大肠杆菌JM101菌株(Yanish-Perron等，基因33:103-119, 1985)和MON105菌株(Obukowicz等，应用环境微生物学58:1511 -1523,1992)。在本发明中也包括根据细菌噬菌体Mu而利用针对 大肠杆菌的染色体表达载体表达多功能性造血受体激动剂蛋白 (Weinberg等，基因126:25-33,1993)。枯草芽孢杆菌的各种 菌株也可用在本方法中。本领域的技术人员熟知的许多酵母细胞株用作 宿主细胞表达本发明的多肽亦有效。当在大肠杆菌的细胞质中表达时， 编码本发明的多功能性造血受体激动剂基因也可这样构建，在基因密码 子的5′端添加编码位于蛋白N-末端的Met-2-Ala-1或Met-1的序列。 在大肠杆菌细胞质中产生的蛋白N-末端受翻译后修饰的影响，该修饰 由甲硫氨酸氨肽酶(Ben Bassat等，细菌杂志169:751-757, 1987)和可能由其他的肽端修饰，结果蛋白表达后，甲硫氨酸从N-末 端被切去。本发明的多功能性造血受体激动剂可包括在N-末端具有 Met-1,Ala-1或Met-2-Ala-1的多功能性造血受体激动剂多肽。这 些突变的多功能性造血受体激动剂通过把分泌信号肽融合到N-末端亦 可在大肠杆菌中表达。

也适用于本发明的是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)。在哺乳动物细胞中表达外源基因的一般方法见综述；Kaufman, R.J.1987)遗传工程，原理和方法，第9卷，J.K.Setlow编著，Plenum 出版社，纽约。构建表达载体，其中能在哺乳动物细胞中起作用的强启 动子驱动真核细胞分泌信号肽编码区的转录，从翻译水平来说，表达载 体与多功能性造血受体激动剂的编码区相连接。例如，能用诸如pcDNA I/Neo,pRc/RSV和pRc/CMV的质粒(从Invitrogen Corp.，圣地亚哥， 加利福尼亚州得到)。真核细胞分泌信号肽编码区可能来自基因本身或 来自另一个分泌性哺乳动物蛋白(Bayne,M.L.等，美国国家科学院院 报84:2638-2642,1987)。构建含基因的载体后，载体DNA被转 染进哺乳动物细胞中。例如，上述细胞可能是COS7、HeLa、BHK、 CHO、或小鼠L系细胞。例如，细胞能在DMEM培养基(JRH Scientific) 中培养。转染细胞后或接着进行抗生素抗性筛选建立稳定的细胞系后进 行24～72小时的瞬时表达，分泌到培养基中的多肽通过标准的生化方 法重新得到。挑选合适的哺乳动物宿主细胞和转化、培养、扩增、筛选 以及产物生产和纯化方法在本领域已众所周知。例如见Gething和 Sambrook，自然，293:620-625,1981)，或可供选择的文献， Kaufman等，分子细胞生物学，5(7):1750-1759,1985)或 Howley等，美国专利号4,419,446。另一种合适的哺乳动物细胞系是猴 COS-1细胞系。相似可用的哺乳动物细胞系是CV-1细胞系。

在本发明的方法中，如果需要，可利用昆虫细胞作为宿主细胞。例 如见Miller等，遗传工程，8:277-298(Plenum出版社1986)， 在此引用作为参考。此外，在昆虫细胞中应用杆状病毒载体表达外源基 因的一般方法见如下作者所述：Summer,M.D.和Smith,G.E.,1987) -杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序的方法手册，得克萨斯农业试验站 通报号1555。构建的表达载体包括杆状病毒转移载体，其中杆状病毒强 启动子(例如多角体启动子)驱动真核细胞分泌信号肽编码区转录，从 翻译水平来说，表达载体与多功能性造血受体激动剂多肽的编码区相连 接。例如，能用pVL1392质粒(从Invitrogen Corp，圣地亚哥，加利 福尼亚州得到)。构建携带编码多功能性造血受体激动剂多肽的基因的 载体后，该DNA2微克和杆状病毒DNA1微克(见Summers和Smith, 1897)共转染到昆虫SF9细胞株中。携带有多功能性造血受体激动剂的 纯重组杆状病毒用于转染如培养在Excell 401无血清培养基(JRH Biosciences,Lenexa,Kansas)中的细胞。分泌到培养基中的多功能性 造血受体激动剂可通过标准的生化方法重新得到。来自表达多功能性造 血受体激动剂蛋白的哺乳动物细胞或昆虫细胞的上清，用任一种系列的 商业浓缩部件首先进行浓缩。

本发明的多功能性造血受体激动剂可用于治疗其特征是造血系统的 髓样、红细胞样、淋巴样或巨核细胞的水平降低，或者其水平合并降低 的疾病。此外，它们可用于活化成熟的髓样或淋巴样的细胞。在这些情 况中，用本发明的多肽治疗敏感的是白细胞减少病，该病是在外周血中 循环的白细胞(白色细胞)数量减少。白细胞减少症可由接触某些病毒 或射线诱发。这通常是各种形式的癌症治疗如接触化疗药物、辐射以及 各种形式的感染或出血的副作用。用本发明的这些多功能性造血受体激 动剂治疗白细胞减少可避免用目前所用的药物治疗引起的不需要的副作 用。

本发明的多功能性造血受体激动剂可用于治疗中性白细胞减少，以 及如用于治疗下列情形的疾病；再生障碍性贫血、周期中性白细胞减少 症、自发性中性白细胞减少症、先天性白细胞颗粒异常综合征、系统性 红斑狼疮(SLE)、白血病、骨髓发育不良综合征和骨髓纤维变性。

本发明的多功能性造血受体激动剂可用于治疗或预防血小板减少 症。目前对血小板减少症唯一的疗法是血小板输血，该法费用昂贵、伴 有感染(HIV,HBV)和同种异体免疫的严重风险。多功能性造血受体 激动剂可减轻或减少对血小板输血的需求。严重的血小板减少症可由诸 如Fanconi′s贫血、Wiscott-Aldrich或May Hegglin综合征的遗传缺 陷引起。获得性血小板减少症可由如在免疫性血小板减少性紫癜、系统 性红斑狼疮、溶血性贫血或胎儿母体不相容性产生的自身或同种抗体引 起。此外，脾肿大、散发性血管凝固、血栓性血小板减少性紫癜、感染 或修复性心瓣也可引起血小板减少症。严重的血小板减少症也可由化疗 和/或放射治疗或癌引起。血小板减少症也可由癌、淋巴瘤、白血病或纤 维化所致的骨髓侵袭引起。

本发明的多功能性造血受体激动剂可用于在外周血中的造血祖细胞 和干细胞的动员。已表明来源于祖细胞的外周血在重新组成病人体中安 置自身骨髓移植中是有效的。包括G-CSF和GM-CSF的造血生长因 子已被表明能增强在外周血中循环的祖细胞和干细胞的数量。这简化了 收集外周干细胞的过程，通过减少所需的pheresis数量而显著地降低该 操作的费用。多功能性造血受体激动剂可用于干细胞的动员，进一步增 强外周干细胞移植的效能。

本发明的多功能性造血受体激动剂也可用于造血祖细胞和干细胞的 离体扩增。集落刺激因子(CSF)如hIL-3已被单独使用，和其他CSF 共同使用，或者骨髓移植继以高剂量化疗时联合使用，以治疗常是化疗 处理的结果而出现的中性白细胞减少症和血小板减少症。然而，严重的 中性白细胞减少和血小板减少的周期并不能完全消除。髓细胞谱系，包 括单核细胞(巨噬细胞)、粒细胞(包括嗜中性细胞)和巨核细胞，在 预防感染和对生命有危险的出血中是关键的。中性白细胞减少症和血小 板减少症也可能是疟疾、遗传紊乱、药物、毒素、辐射和许多如常规的 肿瘤治疗的治疗处理的结果。

骨髓移植已用于治疗这种病人群体。然而，涉及应用骨髓重新构成 遭到损害的造血系统的几个问题包括：1)在骨髓、脾或外周血中干细 胞的数量是有限的，2)移植物抗宿主疾病，3)移植排斥和4)可能 传染肿瘤细胞。在骨髓、脾和外周血中干细胞占有核细胞中非常小的百 分率。很明显存在的效量应答使较多数量的干细胞增强造血的恢复。因 此，体外干细胞的扩增会增强造血的恢复和病人的成活率。来自同种供 体的骨髓用于提供作移植的骨髓。不过，移植物抗宿主病和移植排斥限 制了骨髓移植，甚至在与同胞供体HLA配对的受体中也存在这些问题。 对同种骨髓移植的一种替代方法是自体骨髓移植。在自体骨髓移植中， 髓损毁疗法(myeloablative therapy)如高剂量化疗前收获一些病人自 身的骨髓，在疗法之后输回病人体内。自体移植消除了移植对宿主疾病 和移植排斥的危险。可是，自体骨髓移植仍存在骨髓中干细胞数量有限 和可能传染肿瘤细胞方面的问题。干细胞数量有限能被干细胞的离体扩 增克服。此外，为了减少骨髓移植的肿瘤细胞污染，可根据存在的如CD 34+的特异表面抗原，特异地分离干细胞。

关于分离干细胞、CD34+细胞，培养有造血因子的细胞，应用细 胞治疗造血紊乱的病人和应用造血因子作细胞扩增和基因治疗，下列的 专利含有更为详细的技术。

专利5,061,620叙述包含人造血干细胞的组合物，人造血干细胞通 过从献出的细胞中分离干细胞而供给。

专利5,199,942一种自体造血细胞移植的方法，该方法包括：(1) 从病人中获得造血祖细胞；(2)用选自IL-3、flt3配体、c-kit 配体、GM-CSF、IL-1、GM-CSF/IL-3融合蛋白以及其联合 使用的生长因子离体扩增细胞；(3)给病人使用细胞制品。

专利5,240,856叙述一种包括自动控制细胞分离过程装置的细胞分 离器。

专利WO91/16116描述从细胞混合物中选择性地分离和分开靶细胞 的装置和方法。

专利91/18972叙述体外培养骨髓细胞的方法，该方法用一种中空纤 维生物反应器培养悬浮的骨髓细胞。

专利WO92/18615叙述用于移植，在含有细胞因子特异混合物的培 养基中维持和扩增骨髓细胞的一种方法。

专利WO93/08266描述一种选择性地扩增干细胞的方法，该方法包 括(a)从其他细胞中分离CD34+干细胞和(b)在选择性培养基中 培养分离的细胞，这样干细胞能选择性地扩增等步骤。

专利WO93/18136描述一种体外维持来自外周血的哺乳动物细胞的 方法。

专利WO93/18648叙述一种包括人嗜中性前体细胞的组合物，该组 合物具有高含量的成髓细胞和早幼粒细胞，以用于治疗遗传或获得性中 性白细胞减少症。

专利WO94/08039描述一种通过选择表达c-kit蛋白的细胞而富集 人造血干细胞的方法。

专利WO94/11493描述一种CD34+、小体积的干细胞群体，这些细 胞用一种逆流(counterflow)流动淘洗方法分离。

专利WO94/27698叙述一种结合免疫亲和分离和连续流动离心分离 而从异源细胞混合物中选择性地分离有核异源细胞群体的方法。

专利WO94/25848描述一种收集和操作靶细胞的细胞分离装置。

在含IL-la、IL-3、IL-6或GM-CSF的培养物中，长期 培养从人骨髓高度富集的造血祖细胞的CD34+前体细胞的方法，在 Brandt等，J.Clin.Invest.86:932-941,1990)中已被讨论。

本发明的一个方面提供一种选择性地离体扩增干细胞的方法。措词 “干细胞”指的是全能造血干细胞以及从骨髓、脾或外周血分离的早期 前体细胞和祖细胞。措词“扩增”指的是细胞的分化和增殖。本发明提 供一种选择性地离体扩增干细胞的方法，该方法包括如下步骤：(a) 从其他细胞中分离干细胞，(b)用含多功能性造血受体激动剂蛋白的 选择性培养基培养所分离的干细胞以及(c)收获干细胞。干细胞以及 注定成为嗜中性细胞、红细胞、血小板等的定型祖细胞，依靠存在或缺 乏特殊的祖细胞标志抗原，如存在于这些细胞表面的CD34，和/或依靠 形态学特征可从大多数其他细胞中区分出来。已报道高度富集人干细胞 部分的表型为CD34+、Thy-1+和lin-，但可以理解本发明并不局 限于扩增这种干细胞群体。富集的人CD34+干细胞部分能通过许多已 报道的方法分离，这些方法包括利用直接针对表面抗原如CD34+的抗体 的亲和柱或珠、磁性珠或流式细胞术。此外，如逆流淘洗的物理分离方 法可用于富集造血祖细胞。CD34+祖细胞是异质的，可根据存在或缺 乏和细胞表面相关分子有关的不同谱系的共表面特征分为几种亚群。最 不成熟的祖细胞不表达任何已知的如HLA-DR或CD38的谱系相关标 志，但它们可表达CD90(thy-1)。其他表面抗原如CD33、CD38、 CD41、CD71、HLA-DR或c-kit也能用于选择性地分离造血祖 细胞。分离的细胞在培养瓶、无菌袋或中空纤维中用选择培养基培养。 为选择性地扩增细胞，可使用各种集落刺激因子。被用于离体扩增骨髓 细胞的代表性因子包括c-kit配体、IL-3、G-CSF、GM-CSF、 IL-1、IL-6、IL-11、flt-3配体或联合使用。干细胞的增殖在 培养前或后来的过程中通过统计干细胞和其他细胞的数量、通过标准技 术(如血细胞计数器、CFV、LTCTC)或通过流式细胞术加以监控。

已经报道离体扩增干细胞的几种方法是利用许多选择方法和应用各 种集落刺激因子的扩增方法。这些集落刺激因子包括c-kit配体 (Brandt等，血液83:1507-1514[1994],Mckenna等，血液86: 3413-3420[1995])、IL-3(Brandt等，血液83:1507-1514 [1994],Sato等，血液82:3600-3609[1993])、G-CSF(Sato 等，血液82:3600-3609[1993])、GM-CSF(Sato等，血液82: 3600-3609[1993])、IL-1(Muench等，血液81:3463-3473 [1993])、IL-6(Sato等，血液82:3600-3609[1993])、IL- 11(Lemoli等，实验血液学21:1668-1672[1993],Sato等，血液 82:3600-3609 [1993])、flt-3配体(Mckenna等，血液86:3413 -3420[1995])和/或这些因子的组合使用(Brandt等，血液83:1507 -1514[1994],Haylock等，血液80:1405-1412[1992]、Koller等， 生物技术11:358-363[1993],(Lemoli等，实验血液学21:1668 -1672[1993]),Mckenna等，血液86:3413-3420[1995],Muench 等，血液81:3463-3473[1993],Patchen等，生物治疗7:13-26 [1994],Sato等，血液82:3600-3609[1993],Smith等，实验血液 学21:870-877[1993],Steen等，干细胞12:214-224[1994], Tsujino等，实验血液学21:1379-1386[1993])。在单个集落刺激因 子中，已表明hIL-3是最有力的扩增外周血CD34+细胞的因子之一 (Sato等，血液82:3600-3609[1993],Kobayashi等，血液73: 1836-1841[1989])。然而，已表明单独因子没有像多种因子联合使用 一样有效。本发明提供利用比单一因子单独使用更有效的多功能性造血 受体激动剂离体扩增的方法。

本发明的另一方面提供维持和扩增造血前体细胞的方法，该方法包 括把细胞接种到含如下培养基的培养容器中，该培养基通过接触如HS -5基质细胞系处良好状态(专利号WO96/02662,Roecklein和Torok -Strob，血液85:997-1105,1995)，补加有本发明的多功能性 造血受体激动剂。

生长因子的另一个具体临床应用是体外激活造血祖细胞和干细胞而 用作基因治疗。由于造血祖细胞寿命长，而其子细胞遍布于整个人体中， 造血祖细胞是作离体基因转染的最佳候选者。为了使感兴趣的基因结合 进入造血祖细胞或干细胞的基因组中，人们需要刺激细胞分裂和DNA复 制。造血干细胞以非常低的效率循环，这意味着生长因子可能在促进基 因转导中是有用的，因而加强基因治疗的临床应用前景。基因治疗的潜 在应用(见综述Crystal，科学270:404-410[1995])包括：1)治疗 许多先天性的代谢紊乱和免疫缺损(Kay和Woo，遗传学进展10:253 -257[1994]),2)神经性紊乱(Friedmann，遗传学进展10:210 -214[1994]),3)癌(Culver和Blaese，遗传学进展10:174-178 [1994])和4)传染病(Gilboa和Smith，遗传学进展10:139-144 [1994])。

已有本领域技术人员熟知的种种方法，把遗传材料导入到宿主细胞 中。已出现许多病毒和非病毒的载体把治疗基因转移到原初细胞中。依 靠病毒的载体包括；1)复制缺陷的重组逆转录病毒(Boris-Lawrie 和Temin,Curr.Opin.Genet.Dev.3:102-109[1993],Boris-Lawrie 和Temin，纽约科学院年评716:59-71[1994],Miller,Current Top. Microbiol.Immunol.158:1-24[1992])，以及复制缺陷的重组腺病毒 (Berkner，生物技术6:616-629[1988],Berkner,Current Top. Microbiol.Immunol.158:39-66[1992],Brody和Crystal，组约科学 院年评716:90-103[1994])。基于非病毒的载体包括蛋白/DNA复 合体(Cristiano等，美国国家科学院院报90:2122-2126[1993]， Curiel等，美国国家科学院院报88:8850-8854[1991],Curiel，纽 约科学院年评716:36-58[1994])，电穿孔和脂质体介导的转移，如 阳离子脂质体(Farhood等，纽约科学院年评716:23-35[1994])。

本发明提供一种扩增造血细胞现存方法的改进方法，引入了新的遗 传材料，因为本发明提供的方法是利用具有改善的生物学活性的多功能 性造血受体激动剂蛋白，这些活性包括任何单一的集落刺激因子中未看 到过的活性。

许多药物可能引起骨髓抑制或造血缺损。上述药物的实施例为 AZT、DDI、用于化疗的烷化剂和抗代谢药、如氯霉素、青霉素、甘昔 洛韦柔红霉素的抗生素、磺胺药、酚噻嗪、镇静剂如氨甲丙二酯、镇痛 药如氨基比林和去甲氨基比林、抗惊厥药如二苯乙内酰胺或酰胺咪嗪、 抗甲状腺药如丙基硫氧嘧啶和甲巯咪唑以及利尿药。本发明的多功能性 造血受体激动剂可用于预防或治疗用以上药物治疗的病人中常发生的骨 髓抑制或造血缺损。

造血缺损也可能因病毒、微生物或寄生虫感染的结果以及治疗肾病 或肾衰竭如透析的结果而发生。本发明的多功能性造血受体激动剂可用 于治疗上述造血缺损。

治疗造血缺损可包括给病人施用含多功能性造血受体激动剂药用组 合物。本发明的多功能性造血受体激动剂可用于造血前体细胞的活化和 扩增，该法在把这些细胞注射到病人之前体外使用本发明的多功能性造 血受体激动剂蛋白处理那些细胞。

用本发明的多功能性造血受体激动剂治疗也可有效地影响各种如在 T和B细胞中的免疫缺损，或者如类风湿性关节炎的免疫紊乱。免疫缺 损可能是如HTLⅥ、HTLⅦ、HTLⅧ病毒感染。严重地接触辐射、 癌治疗的结果，或者是其他医学治疗的结果。本发明的多功能性造血受 体激动剂单独或和其他集落刺激因子联合也用于治疗其他的血液细胞缺 损，包括血小板减少症(血小板缺损)或贫血。这些新型多肽的其他用 途是体内或离体治疗骨髓移植恢复的病人和用标准方法产生的作诊断或 治疗用途的单克隆和多克隆抗体的开发。

本发明的其他方面是治疗参见上述疾病的方法和治疗组合物。上述 组合物在和药学上可接受的载体混合物中包含一种或多种本发明的多功 能性造血受体激动剂的治疗有效量。这种组合物可肠胃外、静脉内或皮 下施用。如果施用时，在本发明中所用的治疗组合物优选的是无致热原、 肠胃外可接受的水溶液形式。上述肠胃外可接受的蛋白溶液的制备，具 有适当的pH、等渗性、稳定性等，本领域的技术均能达到。

治疗上述疾病的方法中涉及的剂量方案由主治医师确定，要考虑各 种减轻药物作用的因素，如病人的病况、体重、性别和饮食，任一感染 的严重性，施用时间和其他临床因素。一般来说，一天的方案是每公斤 体重0.2-150μg/kg的多功能性造血受体激动剂蛋白。相对于给出的多 功能性造血受体激动剂蛋白的活性调整剂量，注意剂量方案包括每天每 公斤体重低至0.1微克及高至1毫克的剂量并不是不合理的。另外，可能 存在具体的情况，此时多功能性造血受体激动剂的剂量比每公斤体重0.2 -150微克的范围被调整到更高或更低。这些方案包括和其他集落刺激 因子或IL-3变异体或生长因子一起施用，和化疗药物和/或放射法一起 施用；使用糖基化的多功能性造血受体激动剂蛋白；以及本节中早些时 候提到的各种病人相关组织。同时或顺序和本发明的多肽共同施用的其 他适当的集落刺激因子(CSF)、细胞因子、淋巴因子、造血生长因子 和白介素，非排除性列出的以上因子包括GM-CSF、G-CSF、c- mpl配体(也称为TPO或MGDF)、M-CSF、红细胞生成素(EPO)、 IL-1、IL-4、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL -8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、 IL-16、LIF、flt3/flk2配体、B细胞生长因子、B细胞分化因子和嗜 酸性细胞分化因子，也称为青灰因子或c-kit配体的干细胞因子 (SCF)，或者这些因子的联合物。调整上述所用的剂量以补偿在治疗 组合物中的附加组分。被治疗病人的疗效进展通过血液学特征如分化细 胞计数等的周期性评估加以监控。

                  材料和方法

除非在他处注明，所有特殊的化学品从西格玛公司(圣·路易斯， MO)得到。限制性内切酶和T4 DNA连接酶从New England Biolabs (Beverly,MA)或Boehringer Mannheim(Indianapolis,IN)得到。

大肠杆菌菌株的转化

大肠杆菌菌株如DH5αTM(Life Technologies,Gaithersburg,MD) 和TGl(Amersham Corp.,Arlington Heights,IL)被用于连接反 应的转化，是转染哺乳动物细胞的质粒DNA的来源。大肠杆菌菌株如JM 101(Yahisch-Perron等，基因，33:103-119,1985)和MON105 (Obukowicz等，Appl.and Envir Micr.,58:1511-1523,1992)能 用于在细胞质或周质腔中表达本发明的多功能性造血受体激动剂。

MON105 ATCC#55204:F-,lambda-,IN(rrnD,rrF)1,rpoD+, rpoH358

DH5αTM:F-,phi80dlaczdeltaM15,δ(lacZYA-argF)U169,deoR, recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE441amda-,thi-1, gyrA96,relA1

TG1:δ(lac-pro),supE,thi-l,hsdD5/F′(traD36,proA+B+,lacIq, lacZdeltaM15)

JM101 ATCC#33876:δ(pro lac),supE,thi,F′(traD36,proA+B+, lacIq,lacZdeltaM15)

DH5αTM亚克隆用细胞购买时为感受态细胞，用厂家的操作步骤已 准备好可用于转化，而两种大肠杆菌菌株TG1和MON105要用氯化钙 法变为吸收DNA的感受态。典型的操作是，20～50mL的细胞生长在 LB培养基(1％细菌培养用蛋白胨，0.5％细菌培养用酵母浸出汁， 150mM氯化钠)中，长至用Baush & Lomb分光光度计(Rochester,NY) 测定600纳米(OD600)的光密度值大约为1.0的密度。通过离心收集 细胞，细胞悬浮在五分之一培养体积的氯化钙溶液中(50mM CaCl2, 10mM Tris-Cl,pH7.4)，放在4℃30分钟。细胞再次通过离心被 收集，重悬于十分之一培养体积的氯化钙溶液中。连接好的DNA加到 0.2mL这些细胞液中，样品放在4℃30～60分钟。样品移至42℃2分 钟，在37℃摇动样品1小时前加1.0mL的LB。来自这些样品的细胞分 散在平板上(LB培养基加1.5％bacto-琼脂)，若筛选抗氨苄霉素的 转化体，平板中含氨苄霉素(100微克/mL,μ/mL)；或者筛选抗壮 观霉素的转化体，平板中含壮观霉素(75μg/mL)。平板在37℃下培养 过夜。

挑取菌落，接种到添加了合适抗生素(100μg/mL氨苄霉素或 75μg/mL壮观霉素)的LB中，然后在37℃摇动生长。

创制具有新N-末端/C-末端基因的方法

方法Ⅰ.产生含接头区(L2)具有新N-末端/C-末端的基因

具有新的N-末端/C-末端含连接区(L2)与原始C-末端和N -末端不同的基因，基本上按在L.S.Mullins等，美国化学学会杂志116， 5529-5533,1994)所描述的方法制得。聚合酶链反应(PCR)扩增 的多种步骤用于重排编码蛋白原初氨基酸序列的DNA序列。这些步骤在 图2说明。

第一步，第一套引物(“新起点”和“连接起点”)用于从原始基 因序列中产生和扩增DNA片段(“片段起点”)，该DNA片段含编码 新蛋白的新N-末端部分后续是连接原始蛋白的N-末端和C-末端接 头(L2)的序列。第二步，第二套引物(“新终止点”和“接头终止点”) 用于从原始基因序列产生和扩增DNA片段(“片段终止点”)，该DNA 片段编码如上所用的相同接头，后续从新蛋白的新C-末端部分。设计 “新起点”和“新终止点”引物包括允许新基因克隆到表达质粒中的合 适的限制性位点。典型的PCR条件是95℃一个循环融解2分钟；94℃ 变性1分钟，50℃退火1分钟和72℃延伸1分钟共进行25个循环；加 72℃延伸7分钟的1个循环。用Perkin Elmer GeneAmp PCR Core 试剂盒。100μl反应液含每种引物100pmol和1μg模板DNA；1×PCR 缓冲液，200μM dGTP,200μM dATP,200μM dTTP,200μM dCTP,2.5单位AmpliTaq DNA聚合酶和2mM MgCl2。PCR反应在 型号480的DNA热循环仪中进行(Perkin Elmer Corporalion,Norwalk, CT)。

在接头区有互补序列和对位于接头的二边的2个氨基酸有编码序列 的“片段起点”和“片段终点”在第三步PCR反应中连接在一起，以形 成编码新蛋白的全长基因。“片段起点”和“片段终点”的DNA片段在 1％TAE凝胶中分离，用溴化乙锭染色和Qiaex凝胶抽提试剂盒 (Qiagen)分离。这些片段以等摩尔量结合，在70℃加热10分钟然后 缓慢冷却以通过它们在“接头起点”和“接头终点”的共有序列退火。 第三步PCR反应，“新起点”和“新终点”的引物加到退火的片段中， 以产生和扩增全长的新N-末端/C-末端的基因。典型的PCR条件是 95℃1个循环融解2分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72 ℃延伸1分钟共25个循环；加72℃延伸1分钟的1个循环。用Perkin Elmer GeneAmp PCR Core试剂盒。100μl反应液含每种引物100 pmol，大约0.5μg DNA和1×PCR缓冲液，200μM dGTP,200μM dATP,200μM dTTP,200μM dCTP,2.5单位AmpliTaq DNA聚 合酶和2mM MgCl2。用Wizard PCR Preps试剂盒(Promega)纯化 PCR反应液。

方法Ⅱ．产生具有新N-末端/C-末端没有连接区的基因

没有连接原始N-末端和C-末端接头的新N-末端/C-末端的基 因用PCR扩增的二步反应和1个平末端连接制成。反应步骤在图3说明。 第一步，引物(“新起点”和“P-bl起点”)用于从原始基因序列产 生和扩增DNA片段(“片段起点”)，该DNA片段含编码新蛋白的新 N-末端部分的序列。第二步，引物(“新终点”和“P-bl终点”)用 于从基因序列产生和扩增DNA片段(“片段终点”)，该DNA片段含 新蛋白的新C-末端部分的序列。设计“新起点”和“新终点”的引物 包括允许新基因克隆到表达载体中的限制性位点。典型的PCR条件是95 ℃1个循环融解2分钟；94℃变性1分钟，50℃退火45秒，72℃延 伸45秒，共25个循环。按厂家推荐的条件用Deep Vent聚合酶(New England biolabs)以降低突出的发生率。“P-bl起点”和“P-bl 终点”的引物在5′端被磷酸化，有助于下一步“片段起点”和“片段终 点”互相之间的平末端连接。100μl反应液含150pmol的每种引物和1μg 的模板DNA；1×Vent缓冲液(New England Biolabs),300μM dGTP,300μM dATP,300μM dTTP,300μM dCTP和1单位的 Deep Vent聚合酶。PCR反应在型号480的DNA热循环仪(Perkin Elmer Corporation,Norwalk,CT)中进行。PCR反应产物用Wizard PCR Preps试剂盒(Promega)纯化。

设计的引物包括允许克隆新基因到表达载体中的合适的限制性位 点。典型的“片段起点”被设计为产生NcoⅠ限制性位点，而“片段终点” 被设计为产生HindⅢ限制性位点。限制性消化反应液用Magic DNA Clean-up系统试剂盒(Promega)纯化。起点和终点片段在1％TAE 凝胶中分离，用溴化乙锭染色，用Qiaex凝胶提取试剂盒(Qiagen)分 离。这些片段和pMON3934的～3800碱基对NcoⅠ/HindⅢ载体片段的末 端结合和退火，反应在50℃加热10分钟然后使其缓慢冷却进行。三个 片段用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim)连接在一起。结果为 含全长新的N-末端/C-末端基因的质粒。部分连接反应液用于转化大 肠杆菌菌株DH5α细胞(Life Technologies,Gaithersburg,MD)。 纯化质粒DNA，按下列方法确认序列。

方法Ⅲ．用串联重复方法产生新N-末端/C-末端的基因

新N-末端/C-末端的基因可根据在R.A.Horlick等，蛋白质工程 5:427-431,1992)中所描述的方法制成。聚合酶链反应(PCR) 扩增新N-末端/C-末端的基因用串联式重复的模板DNA进行。其步 骤在图3说明。

串联重复模板DNA用克隆法产生，含有由编码连接2个拷贝基因的 原始N-和C-末端的接头的DNA序列隔开的2个拷贝基因。特殊的 引物对用于从串联重复模板DNA上产生和扩增全长新的N-末端/C- 末端的基因。设计这些引物包括允许新基因克隆到表达载体中的合适的 限制性位点。典型的PCR条件是95℃1个循环融解2分钟；94℃变性 1分钟，50℃退火1分钟和72℃延伸1分钟，共25个循环；加72℃延 伸7分钟的1个循环。用Perkin Elmer GeneAmp PCR Core试剂盒 (Perkin Elmer Corporation,Norwalk CT)。100μl反应液含100 pmol的每种引物和1μg模板DNA；1×PCR缓冲液，200μM dGTP, 200μM dATP,200μM dTTP,200μM dCTP,2.5单位AmpliTaq DNA聚合酶和2mM MgCl2。PCR反应在型号480的DNA热循环仪 (Perkin Elmer Corporation,Norwalk,CT)中进行。PCR反应液 用Wizard PCR Preps试剂盒(Promega)纯化。

把新N-末端/C-末端基因克隆到多功能受体激动剂表达载体中

新N-末端/C-末端基因用限制性内切酶消化，以产生适合插入到 含另一种集落刺激因子基因的表达载体中的末端。这种表达载体也同样 用限制性内切酶消化而形成相容末端。纯化后，基因和载体DNA用T4 DNA连接酶结合和连接。部分连接反应液用于转化大肠杆菌。纯化质粒 DNA，测序以证实正确的插入。培养正确的克隆以表达蛋白。

DNA分离和特性描述

本领域的技术人员熟知的许多不同方法和使用可购买到的商品化试 剂盒分离质粒DNA。在此说明少数上述方法。用Promega WizardTM Miniprep试剂盒(Madison,WI),Qiagen QIAwell质粒分离试剂盒 (Chatsworth,CA)或Qiagen Plasmid Midi试剂盒分离质粒DNA。 这些试剂盒遵循相同的一般程序分离质粒DNA。简言之，细胞用离心法 (5000×g)沉淀，用顺序的NaOH/酸处理释放质粒DNA，细胞碎片 用离心(1000×g)移去。上清(含质粒DNA)加到含结合DNA树脂 的柱上，洗柱，用TE洗脱质粒DNA。筛选含感兴趣的质粒菌落后，大 肠杆菌细胞接种到加适量抗生素50-100ml的LB中，在振荡的空气培 养箱中37℃下生长过夜。纯化的质粒DNA用于DNA测序，进一步的限 制性酶消化，另外的DNA片段亚克隆和转染到哺乳动物、大肠杆菌或其 他细胞中。

序列的确认

纯化的质粒DNA重新悬浮在dH2O中，用Bausch and lomb Spectronic601紫外分光光度计测定260/280nM的吸光值定量。DNA样 品用ABI PRISMTM DyeDeoxyTM终止测序化学法(Perkin Elmer Corporation的应用生物系统分公司，林肯市，CA)试剂盒(批号401388 或402078)测序，根据厂家的建议通常加5％DMSO到测序混合液中 而修改方法。按照建议的扩增条件，测序反应在型号480的DNA热循环 仪(Perkin Elmer Corporation,Norwalk,CT)中进行。样品用Centri -SepTM spin柱(Princeton Separations,Adelphia,NJ)移去过量 的染料终止剂而被纯化，然后冻干。标记上荧光染料的测序反应液重新 悬浮在去离子的甲酰胺中，用ABI型号373A的自动DNA测序仪在变性 的4.75％聚丙烯酰胺8M尿素凝胶上测序。重叠的DNA序列片段用 Sequencher v2.1DNA分析软件(基因密码公司，Ann Arbor,MI) 分析，组合成主DNA毗连序列群。

多功能性受体激动剂在哺乳动物细胞中表达

哺乳动物细胞转染/生产的条件培养基

BHK-21细胞系从ATCC(Rockville,MD)获得。细胞培养在 Dulbecco′s修改Eagle培养基(DMEM/高葡萄糖)中，补加2mM(mM) L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(FBS)。这种配方被命名为BHK生长 培养基。选择培养基是补加453单位/mL的潮霉素B(Calbiochem,San Dieqo,CA)的BHK生长培养基。BHK-21细胞系以前已用HSV转 活化蛋白VP16转染过。细胞转染特征稳定，能转活化在质粒pMON3359 中存在的IE110启动子(见Hippenmeyer等，生物技术pp1037-1041， 1993)。VP16蛋白驱使插入在IE110启动子之后的基因表达。表达转 活化的VP16蛋白的BHK-21细胞命名为BHK-VP16。质粒pMON 1118(见Highkin等，家禽科学，70:970-981,1991)表达从SV 40启动子表达潮霉素抗性基因。可从ATCC得到相似的质粒，pSV2- hph。

转染前BHK-VP16细胞以每皿3×105个细胞接种到60毫米 (mm)组织培养皿中，培养24小时。在含有感兴趣基因的质粒DNA 10μg，潮霉素抗性质粒pMON1118 3μg和每皿Gibco-BRL “LIPOFECTAMINE”80μg的3mL“OPTIMEM”TM(Gibco-BRL, Gaithersburg,MD)中，转染细胞16小时。接着吸去培养基，重加3mL 生长培养基。转染后48小时，从每皿中收集培养基，进行活性测定(瞬 时条件培养基)。用胰酶-EDTA使细胞从皿上脱离，细胞以1:10稀 释，转移到含10mL选择培养基的100mm组织培养皿中。在选择培养基 中约7天后，抗性细胞长成直径为几毫米的集落。集落用滤纸(剪成约 与克隆相同的体积，浸在胰酶/EDTA中)从皿上脱离，转移到24孔板的 各个孔中，每孔含1mL选择培养基。克隆长到汇合后，重新检测条件培 养基，阳性克隆到生长培养基中扩大。

多功能性受体激动剂在大肠杆菌中表达

在型号G25来自New Brunswick Scientfic(Edison,Neco Jersey) 的空气培养箱中，包含感兴趣质粒的大肠杆菌MON105或JM101菌株 在加酪蛋白氨基酸的M9培养基中37℃下振荡培养。OD600值监控生 长，直到其值达到1.0，此时加溶在0.1N NaOH中的萘啶酮酸(10mg/ mL)至终浓度50μg/mL。然后培养物在37℃下摇动另外的3至4个小 时。整个培养期间维持高度通气，以便获得大量产生所需的基因产物。 在光学显微镜下对细胞作包含体(IB)存在的检查。吸取1mL培养等 份物进行蛋白含量分析，该分析方法是煮沉淀的细胞，用还原缓冲液处 理，然后通过SDS-PAGE电泳(见Maniatis等，分子克隆：实验室手 册，1982)。离心培养物(5000×g)以沉淀细胞。

包含体的制备、提取、重新折叠、透析、DEAE层析以及在大肠杆 菌中作为包含体积累的多功能性造血受体激动剂的特征描述

分离包含体：

来自330mL的大肠杆菌培养物的细胞沉淀重浮在15mL的超声缓冲 液(10mM 2-氨基-2-(羟甲基)1,3-丙二醇盐酸pH8.0+1mM 乙二胺四乙酸(EDTA)中。这些重悬的细胞用超声细胞破碎器(型号 W-375，热系统超声公司，Farmingdale，纽约)的微点探头超声破碎。 在超声缓冲液中三轮超声接着离心用于破碎细胞，洗包含体(IB)。第 一轮超声是3分钟脉冲，后接1分钟脉冲，最后二轮的超声各为1分钟 的脉冲。

来自包含体沉淀的蛋白提取和重新折叠：

接着最后离心步骤，IB沉淀重悬在10mL的50mM Tris-HCl,pH 9.5,8M尿素和5mM二硫苏糖醇(DTT)中，室温下搅拌约45分钟 以使所表达蛋白变性。

提取液转移到含70mL的5mM Tris-HCl,pH9.5和2.3M尿素 的烧杯中，温和搅拌4℃暴露在空气中18～48小时，以使蛋白重新折 叠。重折叠在Vydac(Hesperia,Ca)C18反向高压液相层析(RP- HPLC)柱(0.46×25cm)上分析监测。含0.1％三氟乙酸(TPA)的 40％～65％乙腈的线性梯度用于监测重折叠过程。这种梯度在每分钟 1.5mL的流率下过30分钟后形成。一般情况下变性蛋白在梯度中比重新 折叠蛋白较晚洗脱下来。

纯化：

重折叠后，污染的大肠杆菌蛋白用酸沉淀法移去。重折叠溶液的pH 用15％(v/v)乙酸(HOAc)滴定在pH5.0～pH5.2。该溶液4℃搅 拌2小时，然后在12,000×g下离心20分钟以沉淀任何不可溶的蛋白。

来自酸沉淀步骤的上清用分子量截断(MWCO)为3,500道尔顿的 Spectra/Pro3膜透析。透析在4升(过量50倍)的10mM Tris-HCl, pH8.0液经2次替换的情况下进行，总时间为18小时。在DEAE层析前 透析降低样品的导电性，去除尿素。透析后接着离心样品(12,000×g 下20分钟)以沉淀任何不可溶的蛋白。

Bio-Rad Bio-Scale DEAE2柱(7×52mm)用作离子交换 层析。层析柱在含10mM Tris-HCl,pH 8.0和0～500mM氯化钠 (NaCl)梯度的缓冲液中平衡。在平衡缓冲液中，超过45倍柱体积用 于洗脱蛋白。整个过程用每分钟1.0mL的流率。收集整个梯度的柱级分 (每级分2.0mL)，在Vydac(Hesperia,Ca.)C18柱(0.46×25cm) 上用RP HPLC分析。用含0.1％三氟乙酸40％～65％乙腈的线性梯 度。该梯度在每分钟1.5mL的流速下过30分钟产生。然后混合的组分在 4升(过量50～500倍)的10mM乙酸铵(NH4Ac)pH 4.0液经2次 替换而被透析，总时间为18小时。透析用分子量截断值3,500道尔顿的 Spectra/Pro3膜进行。样品用0.22μM注射过滤器(μStar LB注射过滤 器，Costar,Cambridge,Ma.)过滤除菌，然后4℃下贮存。

在某些情况下，折叠的蛋白能用连接到合适基质上的亲和试剂如 mAb或受体亚单位亲和纯化。可供选择的方法(或此外)，纯化能用许 多层析方法的任一种完成，例如：离子交换、凝胶过滤或疏水层析或反 相HPLC。

这些和其他蛋白纯化方法的细节描述见酶学方法，182卷‘蛋白纯 化指南’Murray Deutscher编著，科学出版社，圣地亚哥，CA (1990)。

蛋白特性描述

纯化的蛋白用RP-HPLC、电子喷射质谱和SDS-PAGE分析。 蛋白定量用氨基酸组成法、RP-HPLC和Bradford蛋白测定法进行。在 某些情况下，作胰酶肽谱图，结合电子喷射质谱法确认蛋白的特性。

对生物活性的人白介素-3作AML增殖测定

因子依赖的AML193细胞系从美国典型培养收集保藏中心 (ATCC,Rockville,MD)得到。从患急性骨髓性白血病的一位病人 的细胞建立的这种细胞系是一种生长因子依赖的细胞系，在添加GM- CSF的培养基中表现为加速生长(Lange,B.等，血液70:192,1987； Valtieri M.等，免疫学杂志138:4042,1987)。AML193细胞能 在人IL-3存在下增殖也有文献报道(Santoli,D.等，免疫学杂志 139:348,1987)。使用细胞系的变异细胞AML193 1.3，该细胞 通过洗去生长因子，饥饿细胞因子依赖的AML193细胞不给生长因子24 小时而适应在IL-3中的长期生长。然后这些细胞在含100U/mL IL- 3的培养基中，以每孔1×105细胞重新植板在24孔板中。细胞在IL- 3中快速生长大约需要2个月。这些细胞通过添加组织培养基(见下)以 人IL-3维持，自此后称为AML1931.3。

用在250×g下离心细胞悬液10分钟，接着移去上清的方法，AML 193 1.3细胞在冷Hanks平衡盐溶液(HBSS,Gibco,Grand Island, NY)洗6次。沉淀的细胞重悬在HBSS中，重复该程序直到完成6次清 洗循环。用该程序洗6次的细胞重悬在组织培养基中，细胞浓度范围为2 ×105～5×105活细胞/mL。通过Iscove′s修改的Dulbecco′s培养基 (IMDM,Hazelton,Lenexa,KS)添加白蛋白、转铁蛋白、脂质和2 -巯基乙醇制备这种培养基。加牛白蛋白(Boehringer-Mannheim, Indianapolis,IN)为500μg/mL，加人转铁蛋白(Boehringer-Mannheim, Indianapolis,IN)为100μg/mL；加大豆脂质(Boehringer-Mannheim, Indianapolis,IN)为50μg/mL；以及加2-巯基乙醇(西格玛，圣路易 斯，MO)为5×105M。

在96孔Costar3596组织培养板中，用如上所述添加的组织培养基， 以一式三份地进行人白介素-3或多功能性造血受体激动剂蛋白的系列 稀释。如果系列稀释完成后，每孔含50μl含有白介素-3或多功能性造 血受体激动剂蛋白的培养基。对照板只含组织培养基(阴性对照)。按 上述方法制备的AML193 1.3细胞悬液加到每孔中，用吸头吸取50μl (2.5×104细胞)到每孔中。组织培养板在有5％CO2湿润的空气中37 ℃培养3天。第3天，加在50μl组织培养基中的0.5μCi 3H-胸腺嘧啶 (2Ci/mM,New England Nuclear,Boston,MA)。培养物在有 5％CO2的湿润空气中，37℃培养18～24小时。用TOMTEC细胞收获 仪(TOMTEC,Orange,CT)把细胞DNA收到玻璃滤膜垫上 (Pharmacia LKB,Gaithersburg,MD)，该细胞收获仪利用一次水 洗循环，接着一次70％乙醇循环工作。使滤膜垫空气干燥，然后放入样 品袋中，往样品袋加闪烁液(Scintiverse Ⅱ,Fisher Scienfific,St. Louis,MO或Betaqlate闪烁液，Pharmacia LKB,Gaithersburg, MD)。来自各个组织培养孔的样品的β发射在LKB BetaPlate型号1205 的闪烁计数仪(Pharmacia LKB,Gaithersburg,MD)中计数，数据 以每分钟掺入每个组织培养孔中的细胞的3H-胸腺嘧啶计数表示。靠测 定由梯度浓度的白介素-3或多功能性造血受体激动剂诱导细胞增殖 (3H-胸腺嘧啶掺入)定量每种人白介素-3制备物或多功能性造血受 体激动剂蛋白制备物的活性。从代表性来说，在这些测定中的定量浓度 范围为0.05pM～105pM。活性可由测定提供50％的最大增殖率的白 介素-3或多功能性造血受体激动剂蛋白的剂量确定(EC50=0.5×(在 所测的所有浓度白介素-3的三重复培养物中，每分钟3H-胸腺嘧啶掺 入每孔的最大平均计数值-在缺白介素-3的三重复培养物中观察到的 通过3H-胸腺嘧啶掺入测定的本底增殖值)。该EC50值也与1单位的 生物活性等价。进行每次测定以原白介素-3作参考标准，结果能确定 相对活性水平。

从代表性来说，以系列的2倍稀释液滴定，检测的多功能性造血受 体激动剂蛋白的浓度范围为2000pM～0.06pM。

由给出50％最大反应的浓度，用四参数逻辑模型拟合这些数据而确 定每个样品的活性。可观察到样品的上部平高线(最大反应)和标准比 较没有差别。因此，每个样品的相对效力计算可由样品和如上所示的标 准的EC50估计值确定。AML193.1.3细胞对hIL-3、hGM-CSF和 hG-CSF应答而增殖。因此对某些样品进行下列另外测定，以说明多功 能性造血受体激动剂蛋白的G-CSF受体激动剂部分有活性。增殖测定 用多功能性造血受体激动剂加和减去中和对hIL-3受体激动剂部分的 单克隆抗体进行。此外，有Xa因子裂解位点的融合分子被裂解然后纯 化，分子的半部分作增殖活性测定。这些实验表明多功能性造血受体激 动剂蛋白的2个组分均有活性。

TFl c-mpl配体依赖的增殖测定

c-mpl配体增殖活性用多能人细胞系TF1的亚克隆测定(Kitamura 等，细胞生理学杂志140:323-334[1989])。TF1细胞维持在h-IL3 (100U/mL)中。为建立对c-mpl配体应答的亚克隆，细胞维持在传 代培养基中，该传代培养基含来自用表达c-mpl配体(pMON26448) 1-153形式的基因转染的BHK细胞的10％上清。大部分细胞死亡，但 细胞的亚群存活下来。稀释克隆后，选出c-mpl配体应答克隆，在准 备测定之前，这些细胞以每天0.3×106细胞/mL的密度分散在传代培养 基中。用于这些细胞的传代培养基如下：RPMI1640(Gibco),10％ FBS(Harlan,Lot#91206)、来自转染BHK细胞的10％c-mpl配 体上清、1mM丙酮酸钠(Gibco)、2mM谷氨酰胺(Gibco)和100μg/ mL青霉素-链霉素(Gibco)。次日，收获细胞在RPMI或IMDM培养 基中洗二次，最后在ATL或测定培养基中洗一次。ATL培养基包括下列 成分：IMDM(Gibco)、500μg/mL牛血清白蛋白、100μg/mL人转铁 蛋白、50μg/mL大豆脂质、4×10～8M β-巯基乙醇以及每1000mL 的ATL 2mL的A9909(西格玛、抗生素溶液)。细胞用测定培养基在 96孔低蒸发板(Costar)中稀释成0.25×106细胞/mL的终密度，终体 积为50μl。以重复样品50μl的体积，50％终浓度加来自转染克隆的瞬 时上清(条件培养基)，稀释3倍最后稀释成1.8％。阳性对照包括IL -3变异体pMON13288剂量曲线的三重复样品，最初pMON13288为 1ng/mL，用三倍稀释液稀释成0.0014ng/mL。板在5％CO2 37℃下培 养。培养到第6天时，以含0.5Ci 3H/孔(NEN)体积为20μl/孔加入板 中，让板在5％CO2、37℃培养4小时。收集实验板，在β-plate计 数仪上计数。

以其他体外细胞为基础的增殖测定

依据包含分子的因子，按在AML193.1.3细胞增殖测定相似的方 式，本领域的技术人员熟知以其他体外细胞为基础的测定，可用于确定 多功能性造血受体激动剂的活性。下列是其他有用的测定法实施例。

TF1增殖测定：TF1是对hIL-3应答的多能人细胞系(Kitamura 等，细胞生理学杂志140:323-324[1989])。

32D增殖测定：32D是依赖于鼠IL-3的细胞系，它对人IL-3 不产生应答，但对没有物种限制的人G-CSF产生应答。

Baf/3增殖测定：Ba/3是依赖于鼠IL-3的细胞系，它对人IL- 3或人c-mpl配体不应答，但对没有物种限制的人G-CSF应答。

T1165增殖测定：T1165细胞是依赖IL-6的鼠细胞系(Nordan 等，1986)，对IL-6和IL-11应答。

人质膜凝块meg-CSF测定：用于分析巨核细胞集落形成活性 (Mazur等，1981)。

转染的细胞系：

如鼠Baf/3细胞系的细胞系能用细胞系不含有的集落刺激因子受体 转染，例如人G-CSF受体或人c-mpl受体。针对配体转染受体进入 细胞系中，这些转染细胞系就能用于确定配体的活性。

一种上述转染的Baf/3细胞系通过克隆编码c-mpl的cDNA产生， 该cDNA来自构成于c-mpl应答细胞系，克隆到质粒pcDNA3 (Invitrogen，圣地亚哥，Ca)的多克隆位点上的文库。Baf/3细胞用 电穿孔法被质粒转染。在存在鼠IL-3,Wehi条件培养基中，细胞在 G418选择下生长。经过有限稀释建立克隆。

应用相似的方法，人G-CSF受体能转染到Baf/3细胞系中，用于 确定多功能性造血受体激动剂活性。

c-mpl配体增殖活性分析

方法

1．骨髓增殖测定

a．CD34+细胞纯化：

告知同意后，骨髓抽取液(15-20mL)从正常同种骨髓供体中获 得。细胞在磷酸缓冲盐液(PBS,Gibco-BRL)中1∶3稀释，以30mL 铺展在15mL的Histopaque-1077(西格玛)上，然后以300RCF离心 30分钟。收集单核中间界面层，用PBS清洗。用亲和柱按厂家的说明 (CellPro,Inc,Bothell WA)，从单核细胞制备物中富集CD34+细 胞。富集后，用连接荧光素的抗CD34单克隆抗体和连接藻红蛋白的抗 -CD38抗体(Becton Dickinson,San Jose CA)，流式细胞术分 析确定CD34+细胞的纯度平均为70％。

细胞以40,000细胞/mL重悬在X-Vivo10培养基(Bio- Whittaker,Walkersville,MD)中，1mL植板在12孔组织培养板 (Costar)中。加生长因子rhIL-3为100ng/mL，对某些细胞加(pMON 5873)。hIL-3变异因子以10ng/mL～100ng/mL使用。由加100μl 上清到1mL培养液中(约10％稀释)，测定来自转染有编码c-mpl 配体或多功能性造血受体激动剂的BHK细胞的条件培养基。细胞在5％ CO2,37℃湿润培养箱中，37℃下培养8-14天。

b．细胞收获和分析：

在培养周期结束时获得每种条件的总细胞计数。作荧光分析和倍性 测定，细胞用巨核细胞缓冲液(MK缓冲液：13.6mM柠檬酸钠，1mM 1,3二甲基黄嘌呤、2.2μm PGE1、11mM葡萄糖、3％w/v BSA，用 PBS溶解pH7.4)(Tomer等，血液70:1735-1742,1987)中清 洗，重悬在500μl含抗-CD41a FITC抗体(1:200,AMAC,Westbrook, ME)的MK缓冲液中，然后用MK缓冲液清洗。作DNA分析，细胞在 含0.5％吐温20(Fisher,Fair Lawn NJ)的MK缓冲液中渗透20 分钟。在冰上用0.5％吐温20和1％多聚甲醛(Fisher化学公司)固定 30分钟，接着用含RNA酶(400U/mL)及碘化丙锭(Calbiochem,La Jolla Ca)(50μg/mL)在冰上温育1-2小时。细胞在FACScan或 Vantage流式细胞仪(Becton Dickinson,San Jose,CA)上分析。 沿直线收集绿色荧光(CD41a-FITC)，红色荧光(PI)的对数信号 确定DNA倍性。收集所有细胞，测定属CD41+细胞的百分数。数据分 析用LYSIS(Becton Dickinson,San Jose,CA)软件进行。根据流 式细胞术分析(百分数)获得表达CD41抗原的细胞的百分数。CD41+ 细胞/mL的绝对(Abs)数量按：(Abs)=(细胞计数)*(百分数)/100 计算。

2．巨核细胞纤维蛋白凝块测定

按上述方法分离富集CD34+的群体。细胞以25,000细胞/mL悬浮 在加或不加细胞因子的培养基中，该培养基由基础Iscoves IMDM培养 基添加0.3％BSA、0.4％mg/mL表转铁蛋白、6.67μM FeCl2、25μg/mL CaCl2、25μg/mL L-天冬酰胺、500yμg/mLε-氨基-n-己酸和青 霉素/链霉素组成。植到35mm板中前，加凝血酶(0.25单位/mL)以起 始凝块形成。细胞在5％CO2、37℃湿润培养箱中，37℃培养13天。

培养周期结束时，板用甲醇∶丙酮(1∶3)固定，空气干燥，直到 染色时贮存在-200℃。用过氧化酶免疫细胞化学染色方法(Zymed, Histostain-SP。San Franscisco,CA)，使用由抗CD41a、CD42 和CD61组成的第一单克隆抗体混合物。染色后统计集落，集落分为阴 性、CFU-MK(小集落，1-2集落点和细胞约少于25个)、BFU -MK(多于25个细胞，大和多集落点集落)或混合集落(阳性和阴性 细胞的混合物)。

甲基纤维素测定

该测定反映体外集落刺激因子刺激骨髓细胞产生不同类型的造血集 落的能力(Bradley等，Aust.Exp Biol.Sci.44:287-300,1966), Pluznik等，J.Cell Comp.Physio66:319-324,1965)。

方法

大约30mL新鲜、正常、健康的骨髓抽取液从告知同意后的个体中 获得。在无菌条件下，样品在50mL圆锥管(#25339-50Corning, Corning MD)中，用1×PBS(#14040.059生命技术公司， Gaithersburg,MD)溶液1:5稀释。Ficoll(Histopaque1077西格玛H -8889)铺层在稀释样品下，用300×g离心30分钟。移取单核细胞 带，用1×PBS洗2次和1％BSA PBS(CellPro Co.,Bothel,WA) 洗一次。计数单核细胞，用Ceprate LC(CD34)试剂盒(CellPro Co., Bothel,WA)柱选出CD34+细胞。进行这步分离是因为在骨髓中的所 有干细胞和祖细胞显示CD34表面抗原。

在35×10mm petri皿(Nunc#174926)中，终体积1.0mL一式 三份建立培养物。培养基购自Terry Fox labs(HCC-4230培养基) (Terry Fox Labs,Vancouver,B.C.，加拿大)，加红细胞生成素 (Amgen,Thousand Oaks,CA.)到培养基中。每皿加3,000～10,000 个CD34+细胞。重组IL-3和多功能性造血受体激动剂蛋白加至终浓 度为0.001nM～10nM。重组IL-3从哺乳动物细胞或大肠杆菌中纯化； 多功能性造血受体激动剂蛋白在来自转染哺乳动物细胞的条件培养基 中，或者从来自转染哺乳动物细胞或大肠杆菌的条件培养基中纯化。由 本机构自己提供重组hIL-3、GM-CSF、c-mpl配体和多功能性 造血受体激动剂。G-CSF(Neupogen)来自Amgen(Thousand Oaks Calf)。用3cc注射器重新悬浮培养物，每皿分加1.0mL。对照(基线 应答)培养没有集落刺激因子。阳性对照培养物加条件培养基(PHA激 活的人细胞：Terry Fox Lab.H2400)。培养物温育在37℃、5％CO2湿润空气中。到高峰应答日(第10-11天)，用带40×组合物镜的 Nikon倒置相差显微镜，统计确定多于50个细胞的造血集落。含有少于 50个细胞的细胞群称为簇。可供选择的方法是把集落分散在载玻片上， 染色；或者挑取集落，重新悬浮，甩到细胞甩片的载玻片上染色，也能 鉴别集落。

人脐带血造血生长因子测定

按惯例来说，骨髓细胞用于体外测定造血集落刺激因子(CSF)的 活性。然而，人骨髓并不总是容易得到，而且得考虑供体之间的变异性。 脐带血可与骨髓相比拟，作为造血干细胞和祖细胞的一个来源 (Broxmeyer等，美国国家科学院院报89:4109-113,1992；Mayani 等，血液81:3252-3258,1993)。与骨髓相比，脐带血作为常规 的主要成分更容易得到。这也有可能通过混和得自几个供体的新鲜细胞 而减少测定的变异性，或者为本目的建一个冷冻保存细胞库。经过修改 培养条件，和/或分析谱系特异标志，有可能特异地测定粒细胞/巨噬细胞 集落(CFU-GM)、巨核细胞CSF活性或高增殖潜能集落形成细胞 (HPP-CFC)活性。

方法

用标准密度梯度液(1.077g/mL Histopaque)，从脐带血中24小时 内收集分离单核细胞(MNC)。用几种方法，脐带血MNC被进一步作干 细胞和祖细胞富集。这些方法包括免疫磁性法选择CD14-、CD34+细 胞，用来自应用免疫科学公司(Santa Clara,CA)的包被盒遴选SBA-、 CD34+部分。用CellPro(Bothell,WA)亲和素柱选择CD34+。新 鲜分离或冷冻保存的CD34+细胞富集部分用于测定。制备每种样品系 列稀释(浓度范围1pM～1204pM)的重复培养，用1×104细胞在1ml 0.9％甲基纤维素含培养基的液中，没有另外的生长因子(Methocult H4230来自干细胞技术公司，Vancouver,BC.)。在一些实验中，用含 红细胞生成素(EPO)的Methocult H4330代替Methocult H4230, 或者加干细胞因子(SCF)50ng/mL(生物资源国际公司，Camarillo, CA)。培养7-9天后，计数含多于30个细胞的集落。为了排除计数 时的主观偏差，测定时盲法计数。

关于用于产生变异体，在细菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达重 组DNA的重组DNA方法；纯化和重新折叠所需蛋白的方法，以及测定 蛋白的生物活性的测定法的另外细节可在共同申请的专利WO95/ 00646、WO94/12639、WO94/12638、WO95/20976、WO95/ 21197、WO95/20977、WO95/21254和US08/383,035中找到，这些 专利作为一个整体在此仅列入参考。

本领域的技术人员熟知的进一步细节可在T.Maniatis等，分子克 隆，实验手册，冷泉港实验室，1982)中找到，在该书中引用了参考文 献，在此引入仅作参考；也可在J.Sambrook等，分子克隆，实验手册， 第二版，冷泉港实验室，1989)中找到，该书引用了参考文献，在此引 入仅作参考。

                     表1

                  寡核苷酸 c-mpiNcoI

ACGTCCATGGCNTCNCCNGCNCCNCCTGCTTGTGCACTCCGAGTC

(SEQ ID NO:13) N=A,C,G或T Ecompl           ATGCACGAATTCCCTGACGCAGAGGGTGGA

             (SEQ ID NO:14) c-mplHindⅢ      TGACAAGCTTACCTGACGCAGAGGGTGGACCCT

             (SEQ ID NO:15) 4L-5′           AATTCGGCAA (SEQ ID NO:16) 4L-3′           CATGTTGCCG (SEQ ID NO:17) 5L-5′           AATTCGGCGGCAA (SEQ ID NO:18) 5L-3′           CATGTTGCCGCCG (SEQ ID NO:19) 8L-5′           AATTCGGCGGCAACGGCGGCAA (SEQ ID NO:20) 8L-3′           CATGTTGCCGCCGTTGCCGCCG (SEQ ID NO:21) 31-5′           CGATCCATGGAGGTTCACCCTTTGCCT (SEQ ID NO:22) 31-3′           GATCAAGCTTATGGGCACTGGCTCAGTCT (SEQ ID NO:23) 35-5′           CGATACATGTTGCCTACACCTGTCCTG (SEQ ID NO:24) 35-3′           GATCAAGCTTAAGGGTGAACCTCTGGGCA (SEQ ID NO:25) 39-5′           CGATCCATGGTCCTGCTGCCTGCTGTG (SEQ ID NO:26) 39-3′           GATCAAGCTTAAGGTGTAGGCAAAGGGTG (SEQ ID NO:27) 43-5′           CGATCCATGGCTGTGGACTTTAGCTTGGGA

             (SEQ ID NO:28) 43-3′           GATCAAGCTTAAGGCAGCAGGACAGGTGT (SEQ ID NO:29) 45-5′           CGATCCATGGACTTTAGCTTGGGAGAA (SEQ ID NO:30) 45-3′           GATCAAGCTTACACAGCAGGCAGCAGGAC (SEQ ID NO:31) 49-5′           CGATCCATGGGAGAATGGAAAACCCAG (SEQ ID NO:32) 49-3′           GATCAAGCTTACAAGCTAAAGTCCACAGC (SEQ ID NO:33) 82-5′           CGATCCATGGGACCCACTTGCCTCTCA (SEQ ID NO:34) 82-3′           GATCAAGCTTACAGTTGTCCCCGTGCTGC (SEQ ID NO:35) 109-5′          CAGTCCATGGGAACCCAGCTTCCTCCA (SEQ ID NO:36) 109-3′          GATCAAGCTTAAAGGAGGCTCTGCAGGGC (SEQ ID NO:37) 116-5′          CGATCCATGGGCAGGACCACAGCTCAC (SEQ ID NO:38) 116-3′          GATCAAGCTTACTGTGGAGGAAGCTGGGTT

             (SEQ ID NO:39) 120-5′          CGATCCATGGCTCACAAGGATCCCAATGCC

             (SEQ ID NO:40) 120-3′          GATCAAGCTTATGTGGTCCTGCCCTGTGG (SEQ ID NO:41) 123-5′          CGATCCATGGATCCCAATGCCATCTTCCTG

             (SEQ ID NO:42) 123-3′          GATCAAGCTTACTTGTGAGCTGTGGTCCT (SEQ ID NO:43) 126-5′          CGATCCATGGCCATCTTCCTGAGCTTCCAA

             (SEQ ID NO:44) 126-3′          GATCAAGCTTAATTGGGATCCTTGTGAGCTGT

             (SEQ ID NO:45) SYNNOXA1.REQ     AATTCCGTCG TAAACTGACC TTCTATCTGA AAACCTTGGA

             GAACGCGCAG GCTCAACAGT ACGTAGAGGG CGGTGGAGGC

             TCC (SEQ ID NO:46) SYNNOXA2.REQ     CCGGGGAGCC TCCACCGCCC TCTACGTACT GTTGAGCCTG

             CGCGTTCTCC AAGGTTTTCA GATAGAAGGT CAGTTTACGA

             CGG (SEQ ID NO:47) L1syn.for        GTTACCCTTG AGCAAGCGCA GGAACAACAG GGTGGTGGCT

             CTAACTGCTC TATAATGAT (SEQ ID NO:48) L1syn.rev        CGATCATTAT AGAGCAGTTA GAGCCACCAC CCTGTTGTTC

             CTGCGCTTGC TCAAGG (SEQ ID NO:49) L3syn.for        GTTACCCTTG AGCAAGCGCA GGAACAACAG GGTGGTGGCT

             CTGGCGGTGG CAGCGGCGGC GGTTCTAACT GCTCTATAAT

             GAT (SEQ ID NO:50) L3syn.rev        CGATCATTAT AGAGCAGTTA GAACCGCCGC CGCTGCCACC

             GCCAGAGCCA CCACCCTGTT GTTCCTGCGC TTGCTCAAGG

             (SEQ ID NO:51) 35start.seq     GATCGACCAT GGCTCTGGAC CCGAACAACC TC

                           (SEQ ID NO:52) 34rev.seq       CTCGATTACG TACAAAGGTG CAGGTGGT

                           (SEQ ID NO:53) 70start.seq     GATCGACCAT GGCTAATGCA TCAGGTATTG AG

                           (SEQ ID NO:54) 69rev.seq       CTCGATTACG TATTCTAAGT TCTTGACA

                           (SEQ ID NO:55) 91start.seq     GATCGACCAT GGCTGCACCC TCTCGACATC CA

                           (SEQ ID NO:56) 90rev.seq       CTCGATTACG TAGGCCGTGG CAGAGGGC

                           (SEQ ID NO:57) 101start.seq    GATCGACCAT GGCTGCAGGT GACTGGCAAG AA

                           (SEQ ID NO:58) 100rev.seq      CTCGATTACG TACTTGATGA TGATTGGA

                           (SEQ ID NO:59) L-11start.seq   GCTCTGAGAG CCGCCAGAGC CGCCAGAGGG

            CTGCGCAAGG TGGCGTAGAA CGCG (SEQ ID NO:60) L-11stop.seq    CAGCCCTCTG GCGGCTCTGG CGGCTCTCAG

            AGCTTCCTGC TCAAGTCTTT AGAG (SEQ ID NO:61) P-blstart.seq   GGGCTGCGCA AGGTGGCG (SEQ ID NO:62) P-blstop.seq    ACACCATTGG GCCCTGCCAG C (SEQ ID NO:63) 39start.seq     GATCGACCAT GGCTTACAAG CTGTGCCACC CC

            (SEQ ID NO:64) 38stop. Seq     CGATCGAAGC TTATTAGGTG GCACACAGCT TCTCCT

            (SEQ ID NO:65) 97start.seq     GATCGACCAT GGCTCCCGAG TTGGGTCCCA CC

            (SEQ ID NO:66) 96stop.Seq      CGATCGAAGC TTATTAGGAT ATCCCTTCCA GGGCCT

            (SEQ ID NO:67) 126start.seq    GATCGACCAT GGCTATGGCC CCTGCCCTGC AG

            (SEQ ID NO:68) 125stop. Seq    CGATCGAAGC TTATTATCCC AGTTCTTCCA TCTGCT

            (SEQ ID NO:69) 133start.seq    GATCGACCAT GGCTACCCAG GGTGCCATGC CG

            (SEQ ID NO:70) 132stop.seq     CGATCGAAGC TTATTAGGGC TGCAGGGCAG GGGCCA

            (SEQ ID NO:71)

           142start.seq    GATCGACCAT GGCTTCTGCT TTCCAGCGCC GG

            (SEQ ID NO:72) 141stop.Seq     CGATCGAAGC TTATTAGGCG AAGGCCGGCA TGGCAC

            (SEQ ID NO:73) GLYXA1          GTAGAGGGCG GTGGAGGCTC C (SEQ ID NO:74) GLYXA2          CCGGGGAGCC TCCACCGCCC TCTAC (SEQ ID NO:75) 1GGGSfor        TTCTACGCCA CCTTGCGCAG CCCGGCGGCG GCTCTGACAT

            GTCTACACCA TTG (SEQ ID NO:76) 1GGGSrev        CAATGGTGTA GACATGTCAG AGCCGCCGCC GGGCTGCGCA

            AGGTGGCGTA GAA (SEQ ID NO:77) Synnoxal.req    AATTCCGTCG TAAACTGACC TTCTATCTGA AAACCTTGGA

            GAACGCGCAG GCTCAACAGT ACGTAGAGGG CGGTGGAGGC

            TCC (SEQ ID NO:240) Synnoxa2.req    CCGGGGAGCC TCCACCGCCC TCTACGTACT GTTGAGCCTG

            CGCGTTCTCC AAGGTTTTCA GATAGAAGGT CAGTTTACGA

            CGG  (SEQ ID NO:241)

                       表2

                     基因序列 pMON30304 GCTAACTGCTCTATAATGATCGATGAAATTATACATCACTTAAAGAGACCACCTGCACCT TTGCTGGACCCGAACAACCTCAATGACGAAGACGTCTCTATCCTGATGGACCGAAACCTT CGACTTCCAAACCTGGAGAGCTTCGTAAGGGCTGTCAAGAACTTAGAAAATGCATCAGGT ATTGAGGCAATTCTTCGTAATCTCCAACCATGTCTGCCCTCTGCCACGGCCGCACCCTCT CGACATCCAATCATCATCAAGGCAGGTGACTGGCAAGAATTCCGGGAAAAACTGACGTTC TATCTGGTTACCCTTGAGCAAGCGCAGGAACAACAGTACGTAGAGGGCGGTGGAGGCTCC CCGGGTGAACCGTCTGGTCCAATCTCTACTATCAACCCGTCTCCTCCGTCTAAAGAATCT CATAAATCTCCAAACATGT (SEQ ID NO:78) pMON26458 TCCCCAGCTCCACCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCAT GTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCA CAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAA CTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTC CTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCT CACAAGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGT TTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGGAATTC (SEQ ID NO:79) pMON28548 TCCCCAGCTCCACCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCAT GTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCA CAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAA CTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTC CTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCT CACAAGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGT TTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGGAATTCGGCGGCAACATGGCG TCTCCCGCTCCGCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCAT GTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCA CAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAA CTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTC CTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGATCCC AATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTT GTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGG (SEQ ID NO:80) pMON28500 TCCCCAGCTCCACCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCAT GTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCA CAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAA CTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTC CTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCT CACAAGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGT TTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGGAATTCGGCAACATGGCGTCT CCCGCTCCGCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCATGTC CTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTGCTG CCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAG GACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAACTG GGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTT GGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCAC AAGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTC CTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGG (SEQ ID NO:81) pMON28501 TCCCCAGCTCCACCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCAT GTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCA CAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAA CTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTC CTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCT CACAAGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGT TTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGGAATTCGGCGGCAACATGGCG TCTCCCGCTCCGCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCAT GTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCA CAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAA CTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTC CTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCT CACAAGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGT TTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGG (SEQ ID NO:82) pMON28502 TCCCCAGCGCCGCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCAT GTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCA CAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAA CTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTC CTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCT CACAAGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGT TTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGGAATTCGGCGGCAACGGCGGC AACATGGCGTCCCCAGCGCCGCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGT GACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACA CCTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAG ACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCA CGGGGACAACTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTC CGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGG ACCACAGCTCACAAGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGA AAGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGG (SEQ ID NO:83) Syntan1   1   CATGGCTAAC TGCTCTATAA TGATCGATGA AATTATACAT CACTTAAAGA  51   GACCACCTGC ACCTTTGCTG GACCCGAACA ACCTCAATGA CGAAGACGTC 101   TCTATCCTGA TGGACCGAAA CCTTCGACTT CCAAACCTGG AGAGCTTCGT 151   AAGGGCTGTC AAGAACTTAG AAAATGCATC AGGTATTGAG GCAATTCTTC 201   GTAATCTCCA ACCATGTCTG CCCTCTGCCA CGGCCGCACC CTCTCGACAT 251   CCAATCATCA TCAAGGCAGG TGACTGGCAA GAATTCCGGG AAAAACTGAC 301   GTTCTATCTG GTTACCCTTG AGCAAGCGCA GGAACAACAG GGTGGTGGCT 351   CTAACTGCTC TATAATGATC GATGAAATTA TACATCACTT AAAGAGACCA 401   CCTGCACCTT TGCTGGACCC GAACAACCTC AATGACGAAG ACGTCTCTAT 451   CCTGATGGAC CGAAACCTTC GACTTCCAAA CCTGGAGAGC TTCGTAAGGG 501   CTGTCAAGAA CTTAGAAAAT GCATCAGGTA TTGAGGCAAT TCTTCGTAAT 551   CTCCAACCAT GTCTGCCCTC TGCCACGGCC GCACCCTCTC GACATCCAAT 601   CATCATCAAG GCAGGTGACT GGCAAGAATT CCGGGAAAAA CTGACGTTCT 651   ATCTGGTTAC CCTTGAGCAA GCGCAGGAAC AACAGTAC

  (SEQ ID NO:84) Syntan3   1   CATGGCTAAC TGCTCTATAA TGATCGATGA AATTATACAT CACTTAAAGA  51   GACCACCTGC ACCTTTGCTG GACCCGAACA ACCTCAATGA CGAAGACGTC 101   TCTATCCTGA TGGACCGAAA CCTTCGACTT CCAAACCTGG AGAGCTTCGT 151   AAGGGCTGTC AAGAACTTAG AAAATGCATC AGGTATTGAG GCAATTCTTC 201   GTAATCTCCA ACCATGTCTG CCCTCTGCCA CGGCCGCACC CTCTCGACAT 251   CCAATCATCA TCAAGGCAGG TGACTGGCAA GAATTCCGGG AAAAACTGAC 301   GTTCTATCTG GTTACCCTTG AGCAAGCGCA GGAACAACAG GGTGGTGGCT 351   CTGGCGGTGG CAGCGGCGGC GGTTCTAACT GCTCTATAAT GATCGATGAA 401   ATTATACATC ACTTAAAGAG ACCACCTGCA CCTTTGCTGG ACCCGAACAA 451   CCTCAATGAC GAAGACGTCT CTATCCTGAT GGACCGAAAC CTTCGACTTC 501   CAAACCTGGA GAGCTTCGTA AGGGCTGTCA AGAACTTAGA AAATGCATCA 551   GGTATTGAGG CAATTCTTCG TAATCTCCAA CCATGTCTGC CCTCTGCCAC 601   GGCCGCACCC TCTCGACATC CAATCATCAT CAAGGCAGGT GACTGGCAAG 651   AATTCCGGGA AAAACTGACG TTCTATCTGG TTACCCTTGA GCAAGCGCAG 701   GAACAACAGT AC (SEQ ID NO:85) pMON31104   1   ATGGCTCTGG ACCCGAACAA CCTCAATGAC GAAGACGTCT CTATCCTGAT 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 (SEQ ID NO:91) pMON31110   1   ATGGCTGCAC CCTCTCGACA TCCAATCATC ATCAAGGCAG GTGACTGGCA  51   AGAATTCCGG GAAAAACTGA CGTTCTATCT GGTTACCCTT GAGCAAGCGC 101   AGGAACAACA GGGTGGTGGC TCTGGCGGTG GCAGCGGCGG CGGTTCTAAC 151   TGCTCTATAA TGATCGATGA AATTATACAT CACTTAAAGA GACCACCTGC 201   ACCTTTGCTG GACCCGAACA ACCTCAATGA CGAAGACGTC TCTATCCTGA 251   TGGACCGAAA CCTTCGACTT CCAAACCTGG AGAGCTTCGT AAGGGCTGTC 301   AAGAACTTAG AAAATGCATC AGGTATTGAG GCAATTCTTC GTAATCTCCA 351   ACCATGTCTG CCCTCTGCCA CGGCCTACGT AGAGGGCGGT GGAGGCTCCC 401   CGGGTGAACC GTCTGGTCCA ATCTCTACTA TCAACCCGTC TCCTCCGTCT 451   AAAGAATCTC ATAAATCTCC AAACATGGCT ACCCAGGGTG CCATGCCGGC 501   CTTCGCCTCT GCTTTCCAGC GCCGGGCAGG AGGGGTCCTG GTTGCTAGCC 551   ATCTGCAGAG CTTCCTGGAG GTGTCGTACC GCGTTCTACG CCACCTTGCG 601   CAGCCCTCTG GCGGCTCTGG CGGCTCTCAG AGCTTCCTGC TCAAGTCTTT 651   AGAGCAAGTG AGAAAGATCC AGGGCGATGG CGCAGCGCTC CAGGAGAAGC 701   TGTGTGCCAC CTACAAGCTG TGCCACCCCG AGGAGCTGGT GCTGCTCGGA 751   CACTCTCTGG GCATCCCCTG GGCTCCCCTG AGCTCCTGCC CCAGCCAGGC 801   CCTGCAGCTG GCAGGCTGCT TGAGCCAACT CCATAGCGGC CTTTTCCTCT 851   ACCAGGGGCT CCTGCAGGCC CTGGAAGGGA TATCCCCCGA GTTGGGTCCC 901   ACCTTGGACA CACTGCAGCT GGACGTCGCC GACTTTGCCA CCACCATCTG 951   GCAGCAGATG GAAGAACTGG GAATGGCCCC TGCCCTGCAG CCCTAATAA

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  (SEQ ID NO:93) pMON13182   1   ATGGCTAACT GCTCTATAAT GATCGATGAA ATTATACATC ACTTAAAGAG  51   ACCACCTGCA CCTTTGCTGG ACCCGAACAA CCTCAATGAC GAAGACGTCT 101   CTATCCTGAT GGACCGAAAC CTTCGACTTC CAAACCTGGA GAGCTTCGTA 151   AGGGCTGTCA AGAACTTAGA AAATGCATCA GGTATTGAGG CAATTCTTCG 201   TAATCTCCAA CCATGTCTGC CCTCTGCCAC GGCCGCACCC TCTCGACATC 251   CAATCATCAT CAAGGCAGGT GACTGGCAAG AATTCCGGGA AAAACTGACG 301   TTCTATCTGG TTACCCTTGA GCAAGCGCAG GAACAACAGT ACGTAGAGGG 351   CGGTGGAGGC TCCCCGGGTG GTGGTTCTGG CGGCGGCTCC AACATGGCTT 401   ACAAGCTGTG CCACCCCGAG GAGCTGGTGC TGCTCGGACA CTCTCTGGGC 451   ATCCCCTGGG CTCCCCTGAG CTCCTGCCCC AGCCAGGCCC TGCAGCTGGC 501   AGGCTGCTTG AGCCAACTCC ATAGCGGCCT TTTCCTCTAC CAGGGGCTCC 551   TGCAGGCCCT GGAAGGGATA TCCCCCGAGT TGGGTCCCAC CTTGGACACA 601   CTGCAGCTGG ACGTCGCCGA CTTTGCCACC ACCATCTGGC AGCAGATGGA 651   AGAACTGGGA ATGGCCCCTG CCCTGCAGCC CACCCAGGGT GCCATGCCGG 701   CCTTCGCCTC TGCTTTCCAG CGCCGGGCAG GAGGGGTCCT GGTTGCTAGC 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GGCAACATGGCGTCCCCAGCGCCGCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTT CGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCT ACACCTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAG GAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCA GCACGGGGACAACTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAG GTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGC AGGACCACAGCTCACAAGGATCCCAAT (SEQ ID NO:153) pMON28545 GCTAACTGCTCTATAATGATCGATGAAATTATACATCACTTAAAGAGACCACCTGCACCT TTGCTGGACCCGAACAACCTCAATGACGAAGACGTCTCTATCCTGATGGACCGAAACCTT CGACTTCCAAACCTGGAGAGCTTCGTAAGGGCTGTCAAGAACTTAGAAAATGCATCAGGT ATTGAGGCAATTCTTCGTAATCTCCAACCATGTCTGCCCTCTGCCACGGCCGCACCCTCT CGACATCCAATCATCATCAAGGCAGGTGACTGGCAAGAATTCCGGGAAAAACTGACGTTC TATCTGGTTACCCTTGAGCAAGCGCAGGAACAACAGTACGTAGAGGGCGGTGGAGGCTCC CCGGGTGAACCGTCTGGTCCAATCTCTACTATCAACCCGTCTCCTCCGTCTAAAGAATCT CATAAATCTCCAAACATGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGA GGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGGAATTCGGC GGCAACATGGCGTCTCCCGCTCCGCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTT CGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCT ACACCTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAG GAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCA GCACGGGGACAACTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAG GTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGGGCAGGACCACAGCT CACAAG (SEQ ID NO:154) pMON15981   1   ATGGCTAACT GCTCTATAAT GATCGATGAA ATTATACATC ACTTAAAGAG  51   ACCACCTGCA CCTTTGCTGG ACCCGAACAA CCTCAATGAC GAAGACGTCT 101   CTATCCTGAT GGATCGAAAC CTTCGACTTC CAAACCTGGA GAGCTTCGTA 151   AGGGCTGTCA AGAACTTAGA AAATGCATCA GGTATTGAGG CAATTCTTCG 201   TAATCTCCAA CCATGTCTGC CCTCTGCCAC GGCCGCACCC TCTCGACATC 251   CAATCATCAT CAAGGCAGGT GACTGGCAAG AATTCCGGGA AAAACTGACG 301   TTCTATCTGG TTACCCTTGA GCAAGCGCAG GAACAACAGT ACGTAGAGGG 351   CGGTGGAGGC TCCCCGGGTG AACCGTCTGG TCCAATCTCT ACTATCAACC 401   CGTCTCCTCC GTCTAAAGAA TCTCATAAAT CTCCAAACAT GTCTTACAAG 451   CTGTGCCACC CCGAGGAGCT GGTGCTGCTC GGACACTCTC TGGGCATCCC 501   CTGGGCTCCC CTGAGCTCCT GCCCCAGCCA GGCCCTGCAG CTGGCAGGCT 551   GCTTGAGCCA ACTCCATAGC GGCCTTTTCC TCTACCAGGG GCTCCTGCAG 601   GCCCTGGAAG GGATATCCCC CGAGTTGGGT CCCACCTTGG ACACACTGCA 651   GCTGGACGTC GCCGACTTTG CCACCACCAT CTGGCAGCAG ATGGAAGAAC 701   TGGGAATGGC CCCTGCCCTG CAGCCCACCC AGGGTGCCAT GCCGGCCTTC 751   GCCTCTGCTT TCCAGCGCCG GGCAGGAGGG GTCCTGGTTG CTAGCCATCT 801   GCAGAGCTTC CTGGAGGTGT CGTACCGCGT TCTACGCCAC CTTGCGCAGC 851   CCGGCGGCGG CTCTGACATG GCTACACCAT TAGGCCCTGC CAGCTCCCTG 901   CCCCAGAGCT TCCTGCTCAA GTCTTTAGAG CAAGTGAGGA AGATCCAGGG 951   CGATGGCGCA GCGCTCCAGG AGAAGCTGTG TGCCACCTAA TAA；

  (SEQ ID NO:155) pMON15982   1   ATGGCTAACT GCTCTATAAT GATCGATGAA ATTATACATC ACTTAAAGAG  51   ACCACCTGCA CCTTTGCTGG ACCCGAACAA CCTCAATGAC GAAGACGTCT 101   CTATCCTGAT GGATCGAAAC CTTCGACTTC CAAACCTGGA GAGCTTCGTA 151   AGGGCTGTCA AGAACTTAGA AAATGCATCA GGTATTGAGG CAATTCTTCG 201   TAATCTCCAA CCATGTCTGC CCTCTGCCAC GGCCGCACCC TCTCGACATC 251   CAATCATCAT CAAGGCAGGT GACTGGCAAG AATTCCGGGA AAAACTGACG 301   TTCTATCTGG TTACCCTTGA GCAAGCGCAG GAACAACAGT ACGTAGAGGG 351   CGGTGGAGGC TCCCCGGGTG AACCGTCTGG TCCAATCTCT ACTATCAACC 401   CGTCTCCTCC GTCTAAAGAA TCTCATAAAT CTCCAAACAT GTCTCCCGAG 451   TTGGGTCCCA CCTTGGACAC ACTGCAGCTG GACGTCGCCG ACTTTGCCAC 501   CACCATCTGG CAGCAGATGG AAGAACTGGG AATGGCCCCT GCCCTGCAGC 551   CCACCCAGGG TGCCATGCCG GCCTTCGCCT CTGCTTTCCA GCGCCGGGCA 601   GGAGGGGTCC TGGTTGCTAG CCATCTGCAG AGCTTCCTGG AGGTGTCGTA 651   CCGCGTTCTA CGCCACCTTG CGCAGCCCGG CGGCGGCTCT GACATGGCTA 701   CACCATTAGG CCCTGCCAGC TCCCTGCCCC AGAGCTTCCT GCTCAAGTCT 751   TTAGAGCAAG TGAGGAAGAT CCAGGGCGAT GGCGCAGCGC TCCAGGAGAA 801   GCTGTGTGCC ACCTACAAGC TGTGCCACCC CGAGGAGCTG GTGCTGCTCG 851   GACACTCTCT GGGCATCCCC TGGGCTCCCC TGAGCTCCTG CCCCAGCCAG 901   GCCCTGCAGC TGGCAGGCTG CTTGAGCCAA CTCCATAGCG GCCTTTTCCT 951   CTACCAGGGG CTCCTGCAGG CCCTGGAAGG GATATCCTAA TAA；

  (SEQ ID NO:156) pMON15965   1   ATGGCTAACT GCTCTATAAT GATCGATGAA ATTATACATC ACTTAAAGAG  51   ACCACCTGCA CCTTTGCTGG ACCCGAACAA CCTCAATGAC GAAGACGTCT 101   CTATCCTGAT GGATCGAAAC CTTCGACTTC CAAACCTGGA GAGCTTCGTA 151   AGGGCTGTCA AGAACTTAGA AAATGCATCA GGTATTGAGG CAATTCTTCG 201   TAATCTCCAA CCATGTCTGC CCTCTGCCAC GGCCGCACCC TCTCGACATC 251   CAATCATCAT CAAGGCAGGT GACTGGCAAG AATTCCGGGA AAAACTGACG 301   TTCTATCTGG TTACCCTTGA GCAAGCGCAG GAACAACAGT ACGTAGAGGG 351   CGGTGGAGGC TCCCCGGGTG AACCGTCTGG TCCAATCTCT ACTATCAACC 401   CGTCTCCTCC GTCTAAAGAA TCTCATAAAT CTCCAAACAT GTCTTCTGCT 451   TTCCAGCGCC GGGCAGGAGG GGTCCTGGTT GCTAGCCATC TGCAGAGCTT 501   CCTGGAGGTG TCGTACCGCG TTCTACGCCA CCTTGCGCAG CCCGGCGGCG 551   GCTCTGACAT GGCTACACCA TTAGGCCCTG CCAGCTCCCT GCCCCAGAGC 601   TTCCTGCTCA AGTCTTTAGA GCAAGTGAGG AAGATCCAGG GCGATGGCGC 651   AGCGCTCCAG GAGAAGCTGT GTGCCACCTA CAAGCTGTGC CACCCCGAGG 701   AGCTGGTGCT GCTCGGACAC TCTCTGGGCA TCCCCTGGGC TCCCCTGAGC 751   TCCTGCCCCA GCCAGGCCCT GCAGCTGGCA GGCTGCTTGA GCCAACTCCA 801   TAGCGGCCTT TTCCTCTACC AGGGGCTCCT GCAGGCCCTG GAAGGGATAT 851   CCCCCGAGTT GGGTCCCACC TTGGACACAC TGCAGCTGGA CGTCGCCGAC 901   TTTGCCACCA CCATCTGGCA GCAGATGGAA GAACTGGGAA TGGCCCCTGC 951   CCTGCAGCCC ACCCAGGGTG CCATGCCGGC CTTCGCCTAA TAA

  (SEQ ID NO:157) pMON15966   1   ATGGCTAACT GCTCTATAAT GATCGATGAA ATTATACATC ACTTAAAGAG  51   ACCACCTGCA CCTTTGCTGG ACCCGAACAA CCTCAATGAC GAAGACGTCT 101   CTATCCTGAT GGATCGAAAC CTTCGACTTC CAAACCTGGA GAGCTTCGTA 151   AGGGCTGTCA AGAACTTAGA AAATGCATCA GGTATTGAGG CAATTCTTCG 201   TAATCTCCAA CCATGTCTGC CCTCTGCCAC GGCCGCACCC TCTCGACATC 251   CAATCATCAT CAAGGCAGGT GACTGGCAAG AATTCCGGGA AAAACTGACG 301   TTCTATCTGG TTACCCTTGA GCAAGCGCAG GAACAACAGT ACGTAGAGGG 351   CGGTGGAGGC TCCCCGGGTG AACCGTCTGG TCCAATCTCT ACTATCAACC 401   CGTCTCCTCC GTCTAAAGAA TCTCATAAAT CTCCAAACAT GTCTATGGCC 451   CCTGCCCTGC AGCCCACCCA GGGTGCCATG CCGGCCTTCG CCTCTGCTTT 501   CCAGCGCCGG GCAGGAGGGG TCCTGGTTGC TAGCCATCTG CAGAGCTTCC 551   TGGAGGTGTC GTACCGCGTT CTACGCCACC TTGCGCAGCC CGGCGGCGGC 601   TCTGACATGG CTACACCATT AGGCCCTGCC AGCTCCCTGC CCCAGAGCTT 651   CCTGCTCAAG TCTTTAGAGC AAGTGAGGAA GATCCAGGGC GATGGCGCAG 701   CGCTCCAGGA GAAGCTGTGT GCCACCTACA AGCTGTGCCA CCCCGAGGAG 751   CTGGTGCTGC TCGGACACTC TCTGGGCATC CCCTGGGCTC CCCTGAGCTC 801   CTGCCCCAGC CAGGCCCTGC AGCTGGCAGG CTGCTTGAGC CAACTCCATA 851   GCGGCCTTTT CCTCTACCAG GGGCTCCTGC AGGCCCTGGA AGGGATATCC 901   CCCGAGTTGG GTCCCACCTT GGACACACTG CAGCTGGACG TCGCCGACTT 951   TGCCACCACC ATCTGGCAGC AGATGGAAGA ACTGGGATAA TAA

         (SEQ ID NO:158) pMON15967   1   ATGGCTAACT GCTCTATAAT GATCGATGAA ATTATACATC ACTTAAAGAG  51   ACCACCTGCA CCTTTGCTGG ACCCGAACAA CCTCAATGAC GAAGACGTCT 101   CTATCCTGAT GGATCGAAAC CTTCGACTTC CAAACCTGGA GAGCTTCGTA 151   AGGGCTGTCA AGAACTTAGA AAATGCATCA GGTATTGAGG CAATTCTTCG 201   TAATCTCCAA CCATGTCTGC CCTCTGCCAC GGCCGCACCC TCTCGACATC 251   CAATCATCAT CAAGGCAGGT GACTGGCAAG AATTCCGGGA AAAACTGACG 301   TTCTATCTGG TTACCCTTGA GCAAGCGCAG GAACAACAGT ACGTAGAGGG 351   CGGTGGAGGC TCCCCGGGTG AACCGTCTGG TCCAATCTCT ACTATCAACC 401   CGTCTCCTCC GTCTAAAGAA TCTCATAAAT CTCCAAACAT GTCTACCCAG 451   GGTGCCATGC CGGCCTTCGC CTCTGCTTTC CAGCGCCGGG CAGGAGGGGT 501   CCTGGTTGCT AGCCATCTGC AGAGCTTCCT GGAGGTGTCG TACCGCGTTC 551   TACGCCACCT TGCGCAGCCC GGCGGCGGCT CTGACATGGC TACACCATTA 601   GGCCCTGCCA GCTCCCTGCC CCAGAGCTTC CTGCTCAAGT CTTTAGAGCA 651   AGTGAGGAAG ATCCAGGGCG ATGGCGCAGC GCTCCAGGAG AAGCTGTGTG 701   CCACCTACAA GCTGTGCCAC CCCGAGGAGC TGGTGCTGCT CGGACACTCT 751   CTGGGCATCC CCTGGGCTCC CCTGAGCTCC TGCCCCAGCC AGGCCCTGCA 801   GCTGGCAGGC TGCTTGAGCC AACTCCATAG CGGCCTTTTC CTCTACCAGG 851   GGCTCCTGCA GGCCCTGGAA GGGATATCCC CCGAGTTGGG TCCCACCTTG 901   GACACACTGC AGCTGGACGT CGCCGACTTT GCCACCACCA TCTGGCAGCA 951   GATGGAAGAA CTGGGAATGG CCCCTGCCCT GCAGCCCTAA TAA

  (SEQ ID NO:159) pMON15960   1   ATGGCTACAC CATTGGGCCC TGCCAGCTCC CTGCCCCAGA GCTTCCTGCT  51   CAAGTCTTTA GAGCAAGTGA GGAAGATCCA GGGCGATGGC GCAGCGCTCC 101   AGGAGAAGCT GTGTGCCACC TACAAGCTGT GCCACCCCGA GGAGCTGGTG 151   CTGCTCGGAC ACTCTCTGGG CATCCCCTGG GCTCCCCTGA GCTCCTGCCC 201   CAGCCAGGCC CTGCAGCTGG CAGGCTGCTT GAGCCAACTC CATAGCGGCC 251   TTTTCCTCTA CCAGGGGCTC CTGCAGGCCC TGGAAGGGAT ATCCCCCGAG 301   TTGGGTCCCA CCTTGGACAC ACTGCAGCTG GACGTCGCCG ACTTTGCCAC 351   CACCATCTGG CAGCAGATGG AAGAACTGGG AATGGCCCCT GCCCTGCAGC 401   CCACCCAGGG TGCCATGCCG GCCTTCGCCT CTGCTTTCCA GCGCCGGGCA 451   GGAGGGGTCC TGGTTGCTAG CCATCTGCAG AGCTTCCTGG AGGTGTCGTA 501   CCGCGTTCTA CGCCACCTTG CGCAGCCCGG CGGCGGCTCT GACATGGCTA 551   CACCATTGGG CCCTGCCAGC TCCCTGCCCC AGAGCTTCCT GCTCAAGTCT 601   TTAGAGCAAG TGAGGAAGAT CCAGGGCGAT GGCGCAGCGC TCCAGGAGAA 651   GCTGTGTGCC ACCTACAAGC TGTGCCACCC CGAGGAGCTG GTGCTGCTCG 701   GACACTCTCT GGGCATCCCC TGGGCTCCCC TGAGCTCCTG CCCCAGCCAG 751   GCCCTGCAGC TGGCAGGCTG CTTGAGCCAA CTCCATAGCG GCCTTTTCCT 801   CTACCAGGGG CTCCTGCAGG CCCTGGAAGG GATATCCCCC GAGTTGGGTC 851   CCACCTTGGA CACACTGCAG CTGGACGTCG CCGACTTTGC CACCACCATC 901   TGGCAGCAGA TGGAAGAACT GGGAATGGCC CCTGCCCTGC AGCCCACCCA 1001  TCCTGGTTGC TAGCCATCTG CAGAGCTTCC TGGAGGTGTC GTACCGCGTT 1051  CTACGCCACC TTGCGCAGCC CTGATAA (SEQ ID NO:160) PMON32132 TCTCCCGCTCCGCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCAT GTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCA CAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAA CTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTC CTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCT CACAAGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGT TTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGG (SEQ ID NO:249) PMON32133 TCTCCCGCTCCGCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCAT GTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCA CAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAA CTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTC CTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGATCCC AATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTT GTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGG (SEQ ID NO:250) pMON32134 TCCCCAGCGCCGCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCAT GTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCA CAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAA CTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTC CTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCT CACAAGGATCCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGT TTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGG (SEO ID NO:251) Pmon13181   1   CCATGGCTAA CTGCTCTATA ATGATCGATG AAATTATACA TCACTTAAAG  51   AGACCACCTG CACCTTTGCT GGACCCGAAC AACCTCAATG ACGAAGACGT 101   CTCTATCCTG ATGGATCGAA ACCTTCGACT TCCAAACCTG GAGAGCTTCG 151   TAAGGGCTGT CAAGAACTTA GAAAATGCAT CAGGTATTGA GGCAATTCTT 201   CGTAATCTCC AACCATGTCT GCCCTCTGCC ACGGCCGCAC CCTCTCGACA 251   TCCAATCATC ATCAAGGCAG GTGACTGGCA AGAATTCCGG GAAAAACTGA 301   CGTTCTATCT GGTTACCCTT GAGCAAGCGC AGGAACAACA GTACGTAgag 351   ggcggtggag gctcCCCGGG TGAACCGTCT GGTCCAATCT CTACTATCAA 401   CCCGTCTCCT CCGTCTAAAG AATCTCATAA ATCTCCAAAC ATGTAAGGTA 451   CCGCATGCAA GCTT (SEQ ID NO:257) Pmon13180.Seg   1   CCATGGCTAA CTGCTCTATA ATGATCGATG AAATTATACA TCACTTAAAG  51   AGACCACCTG CACCTTTGCT GGACCCGAAC AACCTCAATG ACGAAGACGT 101   CTCTATCCTG ATGGATCGAA ACCTTCGACT TCCAAACCTG GAGAGCTTCG 151   TAAGGGCTGT CAAGAACTTA GAAAATGCAT CAGGTATTGA GGCAATTCTT 201   CGTAATCTCC AACCATGTCT GCCCTCTGCC ACGGCCGCAC CCTCTCGACA 251   TCCAATCATC ATCAAGGCAG GTGACTGGCA AGAATTCCGG GAAAAACTGA 301   CGTTCTATCT GGTTACCCTT GAGCAAGCGC AGGAACAACA GTACGTAgag 351   ggcggtggag gctcCCCGGG TGGTGGTTCT GGCGGCGGCT CCAACATGTA 401   AGGTACCGCA TGCAAGCTT (SEQ ID NO:258)

                     表3

                   蛋白序列 pMON26458pep SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHis ValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeu LeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAla GlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeu LeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAla HisLysAspProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArg PheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgGluPhe  (SEQ ID NO:161) pMON28548pep SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHis ValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeu LeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAla GlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeu LeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAla HisLysAspProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArg PheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgGluPheGlyGlyAsnMetAla SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHis ValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeu LeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAla GlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeu LeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspPro AsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeuMetLeu ValGlyGlySerThrLeuCysValArg (SEQ ID NO:162) pMON28500 SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHis ValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeu LeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAla GlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeu LeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAla HisLysAspProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArg 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PheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgGluPheGlyGlyAsnMetAla SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHis ValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeu LeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAla GlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeu LeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAla HisLysAspProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArg PheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArg (SEQ ID NO:164) pMON28502 SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHis ValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeu LeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAla GlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeu LeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAla HisLysAspProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArg 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Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala (SEQ ID NO:175) 13192.Pept Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr (SEQ ID NO:176) 13193.Pept Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr  (SEQ ID NO:177) 25190.Pept Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser (SEQ ID NO:178) pMON25191.Pep Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser (SEQ ID NO:179) 13194.Pept Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly (SEQ ID NO:180) 13195.Pept Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly (SEQ ID NO:181) 13196.Pept Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:182) 13197.Pept Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro  (SEQ ID NO:183) 13198.Pept Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala (SEQ ID NO:184) 13199.Pept Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala (SEQ ID NO:185) 31104.Pep Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn ASp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:186) 31105.Pep Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:187) 31106.Pep Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg Mis Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:188) 31107.Pep Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:189) 31108.Pep Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:190) 31109.Pep Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:191) 31110.Pep Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:192) 31111.Pep Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:193) pMON15981 MetAlaAsnCysSerIleMetIleAspGluIleIleHisHisLeuLysArgProProAla ProLeuLeuAspProAsnAsnLeuAsnAspGluAspValSerIleLeuMetAspArgAsn LeuArgLeuProAsnLeuGluSerPheValArgAlaValLysAsnLeuGluAsnAlaSer GlyIleGluAlaIleLeuArgAsnLeuGlnProCysLeuProSerAlaThrAlaAlaPro SerArgHisProIleIleIleLysAlaGlyAspTrpGlnGluPheArgGluLysLeuThr PheTyrLeuValThrLeuGluGlnAlaGlnGluGlnGlnTyrValGluGlyGlyGlyGly 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ValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnGlyArgThrThrAla HisLys (SEQ ID NO:239) pMON32132 SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHis ValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeu LeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAla GlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeu LeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAla HisLysAspProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArg PheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArg (SEQ ID NO:252) PMON32133 SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHis ValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeu LeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAla GlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeu LeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspPro AsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeuMetLeu ValGlyGlySerThrLeuCysValArg (SEQ ID NO:253) PMON32134 SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHis ValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeu LeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAla GlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeu LeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAla HisLysAspProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArg PheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArg (SEQ ID NO:254)

下列实施例更为详细地说明本发明，尽管可以理解本发明并不局限 于这些具体的实施例。

                      实施例1

亲本BHK表达载体的构建

A．从哺乳动物表达质粒中移去AflⅢ位点

构建新的哺乳动物表达载体，以接受NcoⅠ-HindⅢ或AflⅢ- HindⅢ基因片段在框内，其3′端为hIL-3受体激动剂pMON 13146 (WO 94/12638)基因和小鼠IgG2b接头片段。首先，单一的AflⅢ位 点从pMON 3934中移去，pMON 3934是pMON 3359的衍生体。pMON 3359是基于pUC18，含有哺乳动物表达盒的载体。该盒包括单纯性疱疹 病毒启动子IE 110(-800～+120)后续以修饰过的人IL-3信号肽 序列和SV40晚期聚腺苷化(poly-A)信号，被亚克隆到pUC18多接 头中(见Hippenmeyer等，生物技术，1993,pp.1037-1041)。便于基 因产物分泌到细胞外而修饰过的人IL-3信号序列，其侧翼5′端为 BamHⅠ位点，3′端为唯一的NcoⅠ位点。唯一的HindⅢ位点，其3′端向 NcoⅠ位点而5′端向poly-A序列。编码信号肽的DNA序列显示见下(限 制性酶位点显示如上)。在NcoⅠ位点中的ATG(甲硫氨酸)密码子在 框内，具信号肽的起始子ATG(下划线)； BamHⅠ                                                        NcoⅠ 5′GGATCCACCATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCCCGCCATGG (SEQ ID NO:255)

用AflⅢ消化，然后加DNA聚合酶和核苷酸补齐突出端的方法，从 pMON 3934移去单一的AflⅢ位点。消化的DNA片段经Magic PCR Clean up试剂盒(Promega)纯化，用T4 DNA连接酶连接。连接反应液转化 到DH5αTM中，细胞涂皿于加氨苄青霉素的LB-琼脂上。用AflⅢ和 HindⅢ限制性分析筛选失去AflⅢ位点的各个集落，如果AflⅢ位点被移 去，酶切的结果为单一片段。得到的质粒命名为pMON 30275。

B．转移hIL-3受体激动剂pMON 13416/IgG2b盒到pMON 30275 中。

来自pMON 30245的NcoⅠ-HindⅢ片段(大约425bp)连接到pMON 30275的NcoⅠ-HindⅢ片段(大约3800bp)上。pMON 30245(专利 号WO 94/12638)含有编码连有小鼠IgG2b铰链片段的hIL-3受体激 动剂pMON 13416的基因。AflⅢ位点3′端紧邻IgG2b铰链片段，其5′ 端向HindⅢ位点。作为NcoⅠ-HindⅢ或AflⅢ-HindⅢ片段在框内具 有hIL-3变异体pMON 13416/IgG2b铰链，基因能被克隆到AflⅢ- HindⅢ位点中，以产生新嵌合片段。NcoⅠ位点和AflⅢ位点有匹配的突 出端，能连接但两个识别位点会失去。这种克隆法的反应产物质粒pMON 30304，该质粒含有编码连有小鼠IgG2b铰链区的hIL-3变异体pMON 13416(SEQ ID NO:78)的DNA序列。

                           实施例2

含二聚体模板的c-mpl配体(1-153)基因一个拷贝的中介质 粒的构建

为产生具有c-mpl(1-153)配体的编码序列后连有单独的EcoRⅠ 限制性位点的质粒DNA，通过反向转录酶/聚合酶链反应(RT/PCR) 分离基因。人胎儿(lot#38130)和成人肝(lot#46018)A+RNA 从Clontech(Palo Alto,CA)得到，用作c-mpl配体信使RNA (mRNA)的来源。第一链cDNA反应用从Invitrogen(San Diego, CA)获得的cDNA循环TM试剂盒进行。在RT反应中，随机引物和寡 dT引物用于从人和胎儿肝mRNA合并物中产生cDNA。为扩增编码1 -153氨基酸的c-mpl配体基因片段，RT产物用作PCR的模板，合 并使用的引物，正向引物为c-mplNcoⅠ(SEQ ID NO:13)和反 向引物为Ecompl。c-mplNcoⅠ引物与c-mpl配体基因退火(碱基# 279-311，依据来自基因库登记号#L33410或de Sauvage等，自然 369:533-538(1994)的c-mpl配体序列)，编码的NcoⅠ限制 酶位点其5′端紧接着c-mpl配体的第1个密码子(Ser+1)。NcoⅠ 限制性内切酶位点在Ser+1前编码甲硫氨酸和丙氨酸密码子，包括对c -mpl配体的Ala密码子和最先的4个密码子(Ser、Pro、Ala、和 Pro)的密码简并性。Ecompl引物与c-mpl配体的碱基#720-737 退火，编码EcoRⅠ位点(GAATTC)，在框内具有紧接Arg-153之后 的c-mpl配体基因。在Arg-153之后，EcoRⅠ位点产生了谷氨酸和 苯丙氨酸密码子。大约480bp的PCR产物被纯化，用NcoⅠ和EcoRⅠ消 化，然后连接到pMON 3993的NcoⅠ-EcoRⅠ载体片段上(大约4550bp)。 pMON 3993是pMON 3359的衍生体(在实施例1所述)。作为BamHⅠ 片段亚克隆到位于IE 110启动子和poly-A信号之间单独BamHⅠ位点 中的人IL-3信号肽序列，在其3′端含NcoⅠ位点，其后为单独的EcoRⅠ 位点。本克隆法的反应产物是pMON 26458质粒，该质粒含有编码c- mpl配体氨基酸1-153(SEQ ID NO:161)的(SEQ ID NO:79) DNA序列。

                     实施例3

含二聚体模板第2个基因的亲本质粒的构建

为扩增起点在1位氨基酸(Ser)和在153位(Arg)氨基酸之后 为终止密码子的c-mpl配体基因，来自实施例2的RT反应液用作PCR 模板，合并使用下列引物；c-mplNcoⅠ(SEQ ID NO:13)(正向 引物)和c-mplHindⅢ(SEQ ID NO:15)(反向引物)。c-mplNcoⅠ (SEQ ID NO:13)引物已在实施例2描述。c-mplHindⅢ(SEQ ID NO:15)引物与c-mpl配体的碱基#716-737退火，在紧接最终 密码子，Arg153之后加上终止密码子和HindⅢ限制性内切酶位点。

从RT cDNA样品中产生两种类型的PCR产物，一种缺失相应于氨 基酸112-115位的密码子，而一种没有这些密码子的缺失。c-mpl 配体pCR产物(约480bp)用NcoⅠ和HindⅢ限制性内切酶消化，以转 移到哺乳动物表达载体pMON 3934中。pMON 3934用NcoⅠ和HindⅢ 消化(约3800bp)，可接受PCR产物。编码c-mpl配体氨基酸1- 153(SEQ ID NO:252)的质粒pMON 32132(SEQ ID NO:249) 是这种克隆法的反应产物。这种克隆法的反应产物是编码c-mpl配体 氨基酸1-153(SEQ ID NO:253)的质粒pMON 32134(SEQ ID NO:250)。质粒pMON 32133(SEQ ID NO:251)也是这种克隆 法的反应产物，该质粒编码具有缺乏密码子112-115(Δ112-115) 的c-mpl配体氨基酸1-153(SEQ ID NO:254)。

                     实施例4

在第2个c-mpl配体基因中产生具Δ112-115缺失的PCR二聚体 模板5L

构建产生新形式c-mpl配体的PCR模板，和EcoRⅠ/AflⅢ5L合成 寡核苷酸接头5L-5′(SEQ ID NO:18)和5L-3′(SEQ ID NO: 19)一起，通过把3.7kbp的pMON 26458的BstⅪ/EcoRⅠ片段连接到来 自pMON 32133(含缺失的氨基酸112-115)的1kbp NcoⅠ/BstⅪ片 段上而成。

接头的EcoRⅠ端将连接到pMON 26458的EcoRⅠ端上。接头的AflⅢ 端将连接到pMON 32133的NcoⅠ位点上，连接后它们的任一限制性位点 将不再保留。pMON 26458和pMON 32133的BstⅪ位点也连接在一起。 质粒pMON 28548是本克隆法的反应产物，含有编码经 GluPheGlyGlyAsnMetAla(SEQ ID NO:222)接头融合到缺失氨基 酸112-115的氨基酸1-153c-mpl配体(SEQ ID NO:162)的 氨基酸c-mpl配体的(SEQ ID NO:80)DNA序列。

                   实施例5

PCR二聚体模板4L的产生

构建产生新型c-mpl配体的PCR模板，和EcoRⅠ/AflⅢ 4L合成寡 核苷酸接头4L-5′(SEQ ID NO:16)和4L-3′(SEQ ID NO:17) 一起，通过把3.7kbp的pMON 26458 BstⅪ/EcoRⅠ片段连接到来自pMON 32132的1kpb NcoⅠ/BstⅪ片段。

接头的EcoRⅠ端将连接到pMON 26458的EcoRⅠ端。接头的AflⅢ 端将连接到pMON 32132的NcoⅠ位点上，连接后它们的任一个限制性位 点将不再保留。pMON 26458和pMON 32132的BstⅪ位点也连接在一 起。质粒pMON 26458是本克隆法的反应产物，含有编码经 GluPheGlyAsnMetAla(SEQ ID NO:223)接头(4L)融合到氨基酸 1-153c-mpl配体(SEQ ID NO:163)的氨基酸1-153c-mpl 配体的(SEQ ID NO:82)DNA序列。

                     实施例6

PCR二聚体模板5L的产生

构建产生c-mpl配体新形式的PCR模板，和EcoRⅠ/AflⅢ5L合成 寡核苷酸接头5L-5′(SEQ ID NO:18)和5L-3′(SEQ ID NO: 19)一起，通过把3.7kbp的pMON 26458的BstⅪ/EcoRⅠ片段连接到来 自pMON 32132的1kbp NcoⅠ/BstⅪ片段上而成。

接头的EcoRⅠ端将连接到pMON 26458的EcoRⅠ端上。接头AflⅢ 端将连接到pMON 32132的NcoⅠ位点上，连接后，它们的任一个限制性 位点将不再保留。pMON 26458和pMON 32132的BstⅪ位点也将连接 在一起。质粒pMON 28501是本克隆法的反应产物，含有经 GluPheGlyGlyAsnMetAla(SEQ ID NO:222)接头(5L)融合到氨基 酸1-153c-mpl配体(SEQ ID NO:164)上的氨基酸1-153c -mpl配体的(SEQ ID NO:82)DNA序列。

                      实施例7

PCR二聚体模板8L的产生

构建产生新型c-mpl配体的PCR模板，和EcoRⅠ/AflⅢ 8L合成寡 核苷酸接头8L-5′(SEQ ID NO:20)和8L-3′(SEQ ID NO:21) 一起，通过把pMON 26458的3.7kbp BsxⅠ/EcoRⅠ片段连接到来自pMON 32134的1kbp NcoⅠ/BstⅪ片段而成。

接头的EcoRⅠ端将连接到pMON 26458的EcoRⅠ端上。接头的AflⅢ 端将连接到pMON 32134的NcoⅠ位点上，连接后，它们的任一个限制性 位点将不再保留。pMON 26458和pMON 32134的BstⅪ位点也将连接 在一起。质粒pMON 28502是本克隆法的反应产物，含有经 GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMetAla(SEQ ID NO:224)接头(8L) 融合到氨基酸1-153c-mpl配体(SEQ ID NO:165)上的氨基酸1 -153c-mpl配体的(SEQ ID NO:83)DNA序列。

                    实施例8-44

具有新N-末端和C-末端的新型c-mpl配体基因的产生

A．通过PCR产生编码新型c-mpl配体受体激动剂的基因。

编码新型c-mpl配体受体激动剂基因用方法Ⅲ产生(Horlick等， 蛋白质工程5:427-433,1992)。PCR反应使用二聚体模板pMONs 28500、28501、28502或28548和如下合成引物组的一对之一进行(第 一位数指在原始序列中第一个氨基酸的位置。例如，31-5′和31-3′ 分别指5′和3′端寡核苷酸引物，其序列在密码子上的起点与原始序列31 位残基相对应)。

31-5′(SEQ ID NO:22)和31-3′(SEQ ID NO:23),35 -5′(SEQ ID NO:24)和35-3′(SEQ ID NO:25),39-5′ (SEQ ID NO:26)和39-3′(SEQ ID NO:27),43-5′(SEQ ID NO:28)和43-3′(SEQ ID NO:29),45-5′(SEQ ID NO: 30)和45-3′(SEQ ID NO:31),49-5′(SEQ ID NO:32) 和49-3′(SEQ ID NO:33),82-5′(SEQ ID NO:34)和82 -3′(SEQ ID NO:35),109-5′(SEQ ID NO:36)和109-3′ (SEQ ID NO:37),115-5′(SEQ ID NO:38)和115-3′(SEQ ID NO:39),120-5′(SEQ ID NO:40)和120-3′(SEQ ID NO: 41),123-5′(SEQ ID NO:42)和123-3′(SEQ ID NO:43), 126-5′(SEQ ID NO:44)和126-3′(SEQ ID NO:45)。

用于PCR反应的模板和寡核苷酸对如表4所示。产生的产物大约为 480bp，通过Magic PCR Clean up试剂盒(Promega)纯化。

B．为产生嵌合体，把新型c-mpl受体激动剂基因产物亚克隆到 哺乳动物表达载体中。

c-mpl受体激动剂基因PCR产物用NcoⅠ和HindⅢ或AflⅢ和 HindⅢ限制性内切酶(大约470bp)消化，以便转移到哺乳动物表达载 体中。表达载体pMON 30304用NcoⅠ和HindⅢ(大约4200bp)消化， 作为NcoⅠ-HindⅢ或AflⅢ-HindⅢ片段而接受PCR产物。PCR产 物的限制性消化和所得到的质粒如表4所示。

                           表4

                PCR 产物 PCR   产物                         在c-mpl配体 实施例序号 PCR  模板 引物组  限制性消化     接头   产生的质粒   中的断裂点

                                               pMON 实施例8   pMON28501    31    NcoⅠ/HindⅢ    5L    28505        30-31 实施例9   pMON28501    35    AflⅢ/HindⅢ    5L    28506        34-35 实施例10  pMON28501    39    NcoⅠ/HindⅢ    5L    28507        38-39 实施例11  pMON28501    43    NcoⅠ/HindⅢ    5L    28508        42-43 实施例12  pMON28501    45    NcoⅠ/HindⅢ    5L    28509        44-45 实施例13  pMON28501    49    NcoⅠ/HindⅢ    5L    28510        48-49 实施例14  pMON28501    82    NcoⅠ/HindⅢ    5L    28511        81-82 实施例15  pMON28501    109   NcoⅠ/HindⅢ    5L    28512        108-109 实施例16  pMON28501    116   NcoⅠ/HindⅢ    5L    28513        115-116 实施例17  pMON28501    120   NcoⅠ/HindⅢ    5L    28514        119-120 实施例18  pMON28501    123   NcoⅠ/HindⅢ    5L    28515        122-123 实施例19  pMON28501    126   NcoⅠ/HindⅢ    5L    28516        125-126 实施例20  pMON28500    31    NcoⅠ/HindⅢ    4L    28519        30-31 实施例21  pMON28500    35    AflⅢ/HindⅢ    4L    28520        34-35 实施例22  pMON28500    39    NcoⅠ/HindⅢ    4L    28521        38-39 实施例23  pMON28500    43    NcoⅠ/HindⅢ    4L    28522        42-43 实施例24  pMON28500    45    NcoⅠ/HindⅢ    4L    28523        44-45 实施例25  pMON28500    49    NcoⅠ/HindⅢ    4L    28524        48-49 实施例26  pMON28500    82    NcoⅠ/HindⅢ    4L    28525        81-83 实施例27  pMON28500    109   NcoⅠ/HindⅢ    4L    28526        108-109 实施例28  pMON28500    116   NcoⅠ/HindⅢ    4L    28527        115-116 实施例29  pMON28500    120   NcoⅠ/HindⅢ    4L    28528        119-120 实施例30  pMON28500    123   NcoⅠ/HindⅢ    4L    28529        122-123 实施例31  pMON28500    126   NcoⅠ/HindⅢ    4L    28530        125-126 实施例32  pMON28502    31    NcoⅠ/HindⅢ    8L    28533        30-31 实施例33  pMON28502    35    AflⅢ/HindⅢ    8L    28534        34-35 实施例34  pMON28502    39    NcoⅠ/HindⅢ    8L    28535        38-39 实施例35  pMON28502    43    NcoⅠ/HindⅢ    8L    28536        42-43

                                   表4续

                     PCR 产物    PCR  产物                          在c-mpl配体

实施例序号 PCR 模板   引物组     限制性消化     接头   产生的质粒   中的断裂点

                                                       pMON

实施例36  pMON28502    45        NcoⅠ/HindⅢ    8L    28537        44-45

实施例37  pMON28502    49        NcoⅠ/HindⅢ    8L    28538        48-49

实施例38  pMON28502    82        NcoⅠ/HindⅢ    8L    28539        81-82

实施例39  pMON28502    109       NcoⅠ/HindⅢ    8L    28540        108-109

实施例40  pMON28502    116       NcoⅠ/HindⅢ    8L    28541        115-116

实施例41  pMON28502    120       NcoⅠ/HindⅢ    8L    28542        119-120

实施例42  pMON28502    123       NcoⅠ/HindⅢ    8L    28543        122-123

实施例43  pMON28502    126       NcoⅠ/HindⅢ    8L    28544        125-126

实施例44  pMON28548    123       NcoⅠ/HindⅢ    5L    28545        122-123

                         实施例45

pMON 15960的构建

构建中介质粒用于构建含编码具有新N-末端和C-末端的G- CSF Ser17的DNA序列。质粒pACYC 177(Chang,A.C.Y.和Cohen,S. N.细菌学杂志134:1141-1156,1978)的DNA用限制性内切酶 HindⅢ和BamHⅠ消化，结果产生一条3092碱基对的HindⅢ、BamHⅠ 片段。质粒pMON 13037(WO 95/21254)的DNA用BglⅡ和FspⅠ消化， 结果产生一条616碱基对的BglⅡ、FspⅠ片段。第二个样品质粒pMON 13037的DNA用NcoⅠ和HindⅢ消化，结果产生一条556碱基对的NcoⅠ、 HindⅢ片段。合成的DNA寡核苷酸1GGGSfor(SEQ ID NO:76)和 1GGGSrev(SEQ ID NO:77)相互退火，然后用AflⅢ和FspⅠ消化， 结果产生一条21碱基对的AflⅢ、FspⅠ片段。连接限制性片段，连接反 应混合液用于转化大肠杆菌k-12 JM 101菌株。在含氨苄青霉素的平 皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA，用限制性分析证实正确插入。

                     实施例46

pMON 15981的构建

所构建的pMON 15981是一种含编码多功能性造血受体激动剂的 DNA序列的质粒。质粒pMON 15960的DNA用限制性内切酶SmaⅠ消化， 用作PCR反应的模板，PCR反应的引物用合成的DNA寡核苷酸38终 止引物(SEQ ID NO:65)和39起始引物(SEQ ID NO:64)，结 果扩增出一条576碱基对的DNA片段。扩增片段用限制性内切酶HindⅢ 和NcoⅠ消化，结果产生一条558碱基对的HindⅢ、NcoⅠ片段。质粒 pMON 13181的DNA用HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4068碱基 对的HindⅢ、AlfⅢ片段。连接限制性片段，连接反应混合液用于转化 大肠杆菌k-12 JM 101菌株。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的 细菌。分离质粒DNA，用限制性分析及测序以证实正确插入。质粒pMON 15981含编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:155)DNA序列。 MetAlaAsnCysSerIleMetIleAspGluIleIleHisHisLeuLysArgProProAla ProLeuLeuAspProAsnAsnLeuAsnAspGluAspValSerIleLeuMetAspArgAsn LeuArgLeuProAsnLeuGluSerPheValArgAlaValLysAsnLeuGluAsnAlaSer GlyIleGluAlaIleLeuArgAsnLeuGlnProCysLeuProSerAlaThrAlaAlaPro SerArgHisProIleIleIleLysAlaGlyAspTrpGlnGluPheArgGluLysLeuThr PheTyrLeuValThrLeuGluGlnAlaGlnGluGlnGlnTyrValGluGlyGlyGlyGly SerProGlyGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLysGlu SerHisLysSerProAsnMetAlaTyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeu GlyHisSerLeuGlyIleProTrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnAlaLeuGln LeuAlaGlyCysLeuSerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyLeuLeuGln AlaLeuGluGlyIleSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspVal AlaAspPheAlaThrThrIleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeu GlnProThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPheGlnArgArgAlaGlyGly ValLeuValAlaSerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSerTyrArgValLeuArgHis LeuAlaGlnProGlyGlyGlySerAspMetAlaThrProLeuGlyProAlaSerSerLeu ProGlnSerPheLeuLeuLysSerLeuGluGlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAla AlaLeuGlnGluLysLeuCysAlaThr (SEQ ID NO:195)

                     实施例47

pMON 15982的构建

所构建的pMON 15982是一种含有编码多功能性造血受体激动剂的 DNA序列的质粒。质粒pMON 15960的DNA用限制性内切酶SmaⅠ消化， 用作PCR反应的模板，PCR反应的引物用合成的DNA寡核苷酸96终 止引物(SEQ ID NO:67)和97起始引物(SEQ ID NO:66)，结 果扩增出一条576碱基对的DNA片段。扩增片段用限制性内切酶HindⅢ 和NcoⅠ消化，结果产生一条558碱基对的HindⅢ、NcoⅠ片段。质粒 pMON 13181的DNA用HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4068碱基 对的HindⅢ、AflⅢ片段。连接限制性片段，连接反应混合液用于转化 大肠杆菌k-12 JM 101菌株。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的 细菌。分离质粒DNA，用限制性分析及测序以证实正确插入。质粒pMON 15982含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:157)DNA序列： MetAlaAsnCysSerIleMetIleAspGluIleIleHisHisLeuLysArgProProAla ProLeuLeuAspProAsnAsnLeuAsnAspGluAspValSerIleLeuMetAspArgAsn LeuArgLeuProAsnLeuGluSerPheValArgAlaValLysAsnLeuGluAsnAlaSer GlyIleGluAlaIleLeuArgAsnLeuGlnProCysLeuProSerAlaThrAlaAlaPro SerArgHisProIleIleIleLysAlaGlyAspTrpGlnGluPheArgGluLysLeuThr PheTyrLeuValThrLeuGluGlnAlaGlnGluGlnGlnTyrValGluGlyGlyGlyGly SerProGlyGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLysGlu SerHisLysSerProAsnMetAlaProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeu AspValAlaAspPheAlaThrThrIleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaPro AlaLeuGlnProThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPheGlnArgArgAla GlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSerTyrArgValLeu ArgHisLeuAlaGlnProGlyGlyGlySerAspMetAlaThrProLeuGlyProAlaSer SerLeuProGlnSerPheLeuLeuLysSerLeuGluGlnValArgLysIleGlnGlyAsp GlyAlaAlaLeuGlnGluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeu ValLeuLeuGlyHisSerLeuGlyIleProTrpAlaProLeuSerSerCysProSerGln AlaLeuGlnLeuAlaGlyCysLeuSerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGly LeuLeuGlnAlaLeuGluGlyIleSer (SEQ ID NO:196)

                         实施例48

pMON 15965的构建

所构建的pMON 15965是一种含编码多功能性造血受体激动剂的 DNA序列的质粒。质粒pMON 15960的DNA用限制性内切酶SmaⅠ消化， 用作PCR反应的模板，PCR反应的引物用合成的DNA寡核苷酸142终 止引物(SEQ ID NO:73)和141起始引物(SEQ ID NO:72)，结 果扩增出一条576碱基对的DNA片段。扩增片段用限制性内切酶HindⅢ 和NcoⅠ消化，结果产生一条558碱基对的HindⅢ、NcoⅠ片段。质粒 pMON 13181的DNA用HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4068碱基 对的HindⅢ、AflⅢ片段。连接限制性片段，连接反应混合液用于转化 大肠杆菌k-12 JM 101菌株。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的 细菌。分离质粒DNA，用限制性分析及测序证实正确插入。质粒pMON 15965含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:157)DNA序列： MetAlaAsnCysSerIleMetIleAspGluIleIleHisHisLeuLysArgProProAla ProLeuLeuAspProAsnAsnLeuAsnAspGluAspValSerIleLeuMetAspArgAsn LeuArgLeuProAsnLeuGluSerPheValArgAlaValLysAsnLeuGluAsnAlaSer GlyIleGluAlaIleLeuArgAsnLeuGlnProCysLeuProSerAlaThrAlaAlaPro SerArgHisProIleIleIleLysAlaGlyAspTrpGlnGluPheArgGluLysLeuThr PheTyrLeuValThrLeuGluGlnAlaGlnGluGlnGlnTyrValGluGlyGlyGlyGly SerProGlyGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLysGlu SerHisLysSerProAsnMetAlaSerAlaPheGlnArgArgAlaGlyGlyValLeuVal AlaSerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGln ProGlyGlyGlySerAspMetAlaThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGlnSer PheLeuLeuLysSerLeuGluGlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGln GluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeuGlyHis SerLeuGlyIleProTrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnAlaLeuGlnLeuAla GlyCysLeuSerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyLeuLeuGlnAlaLeu GluGlyIleSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspValAlaAsp PheAlaThrThrIleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeuGlnPro ThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAla (SEQ ID NO:196)

                          实施例49

pMON 15966的构建

所构建的pMON 15966是一种含编码多功能性造血受体激动剂的 DNA序列的质粒。质粒pMON 15960的DNA用限制性内切酶SmaⅠ消化， 用作PCR反应的模板，PCR反应用合成的DNA寡核苷酸126终止片段 (SEQ ID NO:68)和125起始片段(SEQ ID NO:69)作引物，结 果扩增出一条576碱基对的DNA片段。扩增片段用限制性内切酶HindⅢ 和NcoⅠ消化，结果产生一条558碱基对的HindⅢ、NcoⅠ片段。质粒 pMON 13181的DNA用HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4068碱基 对的HindⅢ、AflⅢ片段。连接限制性片段，连接反应混合液用于转化 大肠杆菌k-12 JM 101菌株。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的 细菌。分离质粒DNA，用限制性分析及测序证实正确插入。质粒pMON 15966含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:158)DNA序列： MetAlaAsnCysSerIleMetIleAspGluIleIleHisHisLeuLysArgProProAla ProLeuLeuAspProAsnAsnLeuAsnAspGluAspValSerIleLeuMetAspArgAsn LeuArgLeuProAsnLeuGluSerPheValArgAlaValLysAsnLeuGluAsnAlaSer GlyIleGluAlaIleLeuArgAsnLeuGlnProCysLeuProSerAlaThrAlaAlaPro SerArgHisProIleIleIleLysAlaGlyAspTrpGlnGluPheArgGluLysLeuThr PheTyrLeuValThrLeuGluGlnAlaGlnGluGlnGlnTyrValGluGlyGlyGlyGly SerProGlyGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLysGlu SerHisLysSerProAsnMetAlaMetAlaProAlaLeuGlnProThrGlnGlyAlaMet ProAlaPheAlaSerAlaPheGlnArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeu GlnSerPheLeuGluValSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGlnProGlyGlyGly SerAspMetAlaThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGlnSerPheLeuLeuLys SerLeuGluGlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGlnGluLysLeuCys AlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeuGlyHisSerLeuGlyIle ProTrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnAlaLeuGlnLeuAlaGlyCysLeuSer GlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyLeuLeuGlnAlaLeuGluGlyIleSer ProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspValAlaAspPheAlaThrThr IleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGly (SEQ ID NO:198)

                      实施例50

pMON 15967的构建

所构建的pMON 15967是一种含编码多功能性造血受体激动剂的 DNA序列的质粒。质粒pMON 15960的DNA用限制性内切酶SmaⅠ消化， 用作PCR反应的模板，PCR反应的引物用合成的DNA寡核苷酸132终 止引物(SEQ ID NO:71)和133起始引物(SEQ ID NO:70)，结 果扩增出一条576碱基对的DNA片段。扩增片段用限制性内切酶HindⅢ 和NcoⅠ消化，结果产生一条558碱基对的HindⅢ、NcoⅠ片段。质粒 pMON 13181的DNA用HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4068碱基 对的HindⅢ、AflⅢ片段。连接限制性片段，连接反应混合液用于转化 大肠杆菌k-12 JM101菌株。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的 细菌。分离质粒DNA，用限制性分析及测序证实正确插入。质粒pMON 15967含有编码下列氨基酸序列的(DEQ ID NO:159)DNA序列： MetAlaAsnCysSerIleMetIleAspGluIleIleHisHisLeuLysArgProProAla ProLeuLeuAspProAsnAsnLeuAsnAspGluAspValSerIleLeuMetAspArgAsn LeuArgLeuProAsnLeuGluSerPheValArgAlaValLysAsnLeuGluAsnAlaSer GlyIleGluAlaIleLeuArgAsnLeuGlnProCysLeuProSerAlaThrAlaAlaPro SerArgHisProIleIleIleLysAlaGlyAspTrpGlnGluPheArgGluLysLeuThr PheTyrLeuValThrLeuGluGlnAlaGlnGluGlnGlnTyrValGluGlyGlyGlyGly SerProGlyGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLysGlu SerHisLysSerProAsnMetAlaThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPhe GlnArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSer TyrArgValLeuArgHisLeuAlaGlnProGlyGlyGlySerAspMetAlaThrProLeu GlyProAlaSerSerLeuProGlnSerPheLeuLeuLysSerLeuGluGlnValArgLys IleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGlnGluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHis ProGluGluLeuValLeuLeuGlyHisSerLeuGlyIleProTrpAlaProLeuSerSer CysProSerGlnAlaLeuGlnLeuAlaGlyCysLeuSerGlnLeuHisSerGlyLeuPhe LeuTyrGlnGlyLeuLeuGlnAlaLeuGluGlyIleSerProGluLeuGlyProThrLeu AspThrLeuGlnLeuAspValAlaAspPheAlaThrThrIleTrpGlnGlnMetGluGlu LeuGlyMetAlaProAlaLeuGlnPro

                        实施例51

pMON 13180，一种用于构建含有编码多功能造血受体激动剂的 DNA序列的质粒的中介质粒的构建。

质粒pMON 13046(WO 95/21254)的DNA用限制性核酸内切酶 XmaⅠ和SnaBⅠ消化，结果产生一条4018碱基对的载体片段。4018碱基 对的XmaⅠ-SnaBⅠ片段用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega, Madison,WI)纯化，其中25碱基对的XmaⅠ-SnaBⅠ插入片段没有保 留。设计合成寡核苷酸的互补对glyxa1(SEQ ID NO:74)和glyxa2 (SEQ ID NO:75)以移去编码Xa因子裂解位点的序列。当合适装配 时，这些寡核苷酸也产生XmaⅠ和SnaBⅠ末端。经70℃加热10分钟，然 后缓慢冷却，引物Glyxa1和Glyxa2在退火缓冲液(20mM Tris-HClpH7.5,10mM MgCl2,50mM NaCl)中退火。用T4 DNA连接酶 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，连接来自pMON 13046 的4018碱基对的XmaⅠ-SnaBⅠ片段和装配的寡核苷酸部分连接反应液 用于转化大肠杆菌DH5α菌株细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含有氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌从转化体中分离 质粒DNA，用基于PCR的方法分析。来自选出的转化体的质粒DNA被 测序以证实寡核苷酸的正确插入。产生的质粒称为pMON 3180，含有 (SEQ ID NO:**)的DNA序列。

                    实施例52

pMON 3181，一种用于构建含有编码多功能性造血受体激动剂的 DNA序列的质粒的中介质粒的构建

质粒pMON 13047(WO 95/21254)的DNA用限制性核酸内切酶 XmaⅠ和SnaBⅠ消化，结果产生一条4063碱基对的载体片段。4063碱基 对的XmaⅠ-SnaBⅠ片段用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega, Madison,WI)纯化，其中25碱基对的XmaⅠ-SnaBⅠ插入片段没有保 留。设计合成的寡核苷酸互补对glyxa1(SEQ ID NO:74)和glyxa2 (SEQ ID NO:75)，以移去编码Xa因子裂解位点的序列。当适当装 配时，这些寡核苷酸也产生XmaⅠ和SnaBⅠ末端。经70℃加热10分钟， 然后缓慢冷却，Glyxa1和Glyxa2在退火缓冲液中退火。用T4 DNA连接 酶，连接来自pMON 13047的4063碱基对的XmaⅠ-SnaBⅠ片段和装配 的寡核苷酸。部分连接反应液用于转化大肠杆菌DH5α菌株细胞(生命 技术公司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化 的细菌。从转化体中分离质粒DNA，用基于PCR的方法分析。来自选 出的转化体的质粒DNA被测序，以证实寡核苷酸的正确插入。产生的质 粒称为pMON 13181，含有(SEQ ID NO:**)的DNA序列。

                     实施例53

pMON 13182的构建

用材料和方法中所述的方法Ⅰ，产生在pMON 13182中的新N-末 端/C-末端基因。用引物组39起始引物(SEQ ID NO:64)和L-11 起始引物(SEQ ID NO:60)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17 序列而产生起始片段。用引物组38终止引物(SEQ ID NO:65)和L -11终止引物(SEQ ID NO:61)，扩增在pMON 13037中的G- CSF Ser17序列而产生终止片段。用39起始引物和38终止引物，扩增退 火的起始和终止片段而产生全长新N-末端/C-末端G-CSF Ser17基 因。

产生的含有新基因的DNA片段经限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ 消化，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega,Madison, WI)纯化。中介质粒pMON 13180被限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ 消化，结果产生一条4023碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up 方法试剂盒(Promega,Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段， 用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。 部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司， Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分 离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为pMON 13182。

用pMON 13182转化大肠杆菌JM 101菌株，以表达蛋白和从包含体 中分离蛋白。

质粒pMON 13182含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:94) DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr (SEQ ID NO:166)

                        实施例54

pMON 13183的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅰ，产生在pMON 13183中的新N- 末端/C-末端的基因。用引物组39起始引物(SEQ ID NO:64)和L -11起始引物(SEQ ID NO:60)，扩增在pMON 13037中的G- CSF Ser17序列而产生“起始片段”。用引物组38终止引物(SEQ ID NO: 65)和L-11终止引物(SEQ ID NO:61)，扩增在pMON 13037中 的G-CSF Ser17序列而产生终止片段。用39起始引物和38终止引物扩 增退火的起始和终止片段，而产生全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17。

产生的含有新基因的DNA片段经限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ 消化，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega,Madison, WI)纯化。中介质粒pMON 13181被限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ 消化，结果产生一条4068碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up 方法试剂盒(Promega,Madison,WI)纯化片段。合并纯化的限制性 片段，用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN) 连接。部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公 司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细 菌。分离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为pMON 13183。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13183转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13183含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:95) DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr (SEQ ID NO:167)

                        实施例55

pMON 13184的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅰ，产生在pMON 13184中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组97起始引物(SEQ ID NO:66)和L- 11起始引物(SEQ ID NO:60)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组96终止引物(SEQ ID NO:67) 和L-11终止引物(SEQ ID NO:61)，扩增在pMON 13037中的G -CSF Ser17序列而产生终止片段。用97起始引物和96终止引物扩增退 火的起始和终止片段，而产生全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17 基因。

产生的含有新基因的DNA片段经限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ 消化，用Magic DNA Clean up试剂盒(Promega,Madison,WI)纯化。 中介质粒pMON 13180被限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果 产生一条4023碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂 盒(Promega,Madison,WI)纯化片段。合并纯化的限制性片段，用 T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部 分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司， Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分 离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为pMON 13184。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13184转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13184含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:96) DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser (SEQ ID NO:168)

                     实施例56

pMON 13185的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅰ，产生在pMON 13185中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组97起始引物(SEQ ID NO:66)和L- 11起始引物(SEQ ID NO:60)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组96终止引物(SEQ ID NO:67) 和L-11终止引物(SEQ ID NO:61)，扩增在pMON 13037中的G -CSF Ser17序列而产生终止片段。用97起始引物和96终止引物扩增退 火的起始和终止片段，而产生全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17 基因。

产生的含有新基因的DNA片段经限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ 消化，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega,Madison, WI)纯化。中介质粒pMON 13181经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ 消化，结果产生一条4068碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up 方法试剂盒(Promega,Madison,WI)纯化片段。合并纯化的限制性 片段，用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN) 连接。部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公 司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细 菌。分离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为pMON 13185。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13185转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13185含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:67) DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser (SEQ ID NO:169)

                      实施例57

pMON 13186的构建

用材料和方法中所述的方法Ⅰ产生在pMON 13186中的新N-末端 /C-末端基因。用引物组126起始引物(SEQ ID NO:68)和L-11 起始引物(SEQ ID NO:60)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17 序列而产生起始片段。用引物组125终止引物(SEQ ID NO:69)和L -11终止引物(SEQ ID NO:61)，扩增在pMON 13037中的G- CSF Ser17序列而产生终止片段。用126起始引物和125终止引物扩增退 火的起始和终止片段，而产生全长新的N-末端/C-末端G CSF Ser17 基因。

产生的含有新基因的DNA片段经限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ 消化，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega,Madison, WI)纯化。中介质粒pMON 13180经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ 消化，结果产生一条4023碱基对载体片段，用Magic DNA Clean-up 方法试剂盒(Promega,Madison,WI)纯化片段。合并纯化的限制性 片段，用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN) 连接。部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公 司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细 菌。分离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为pMON 13186。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13186转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13186含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:98) DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly (SEQ ID NO:170)

                 实施例58

pMON 13187的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅰ，产生在pMON 13187中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组126起始引物(SEQ ID NO:68)和L -11起始引物(SEQ ID NO:60)，扩增在pMON 13037中的G- CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组125终止引物(SEQ ID NO: 69)和L-11终止引物(SEQ ID NO:61)，扩增在pMON 13037中 的G-CSF Ser17序列而产生终止片段。用126起始引物和125终止引物 扩增退火的起始和终止片段，而产生全长新的N-末端/C-末端G- CSF Ser17基因。

产生的含有新基因的DNA片段经限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ 消化，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega,Madison, WI)纯化。中介质粒pMON 13181经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ 消化，结果产生一条4068碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up 方法试剂盒(Promega,Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段， 用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。 部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司， Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分 离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为pMON 13187。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13187转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13187含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:99) DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly (SEQ ID NO:171)

                 实施例59

pMON 13188的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅰ，产生在pMON 13188中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组133起始引物(SEQ ID NO:70)和L -11起始引物(SEQ ID NO:60)，扩增在pMON 13037中的G- CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组132终止引物(SEQ ID NO: 71)和L-11终止引物(SEQ ID NO:61)，扩增在pMON 13037中 的G-CSF Ser17序列而产生终止片段。用133起始引物和132终止引物 扩增退火的起始和终止片段，而产生全长新的N-末端/C-末端G- CSF Ser17基因。

产生的含有新基因的DNA片段经限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ 消化，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega,Madison, WI)纯化。质粒pMON 13180经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化， 结果产生一条4023碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法 试剂盒(Promega,Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用 T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部 分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司， Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分 离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为pMON 13188。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13188转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13188含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 100)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:172)

                     实施例60

pMON 13189的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅰ，产生在pMON 13189中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组133起始引物(SEQ ID NO:70)和L -11起始引物(SEQ ID NO:60)，扩增在pMON 13037中的G- CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组132终止引物(SEQ ID NO: 71)和L-11终止引物(SEQ ID NO:61)，扩增在pMON 13037中 的G-CSF Ser17序列。用133起始引物和132终止引物扩增退火的起始 和终止片段，而产生全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。

产生的含有新基因的DNA片段经限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ 消化，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega,Madison, WI)纯化。中介质粒pMON 13181经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ 消化，结果产生一条4068碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up 方法试剂盒(Promega,Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段， 用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。 部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司， Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分 离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为pMON 13189。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13189转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13189含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 101)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:173)

                        实施例61

pMON 13190的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅰ，产生在pMON 13190中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组142起始引物(SEQ ID NO:72)和L -11起始引物(SEQ ID NO:60)，扩增在pMON 13037中的G- CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组141终止引物(SEQ ID NO: 73)和L-11终止引物(SEQ ID NO:61)，扩增在pMON 13037中 的G-CSF Ser17序列。用142起始引物和141终止引物扩增退火的起始 和终止片段，而产生全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。

产生的含有新基因的DNA片段经限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ 消化，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega,Madison, WI)纯化。中介质粒pMON 13180经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ 消化，结果产生一条4023碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up 方法试剂盒(Promega,Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段， 用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。 部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司， Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分 离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为pMON 13190。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13190转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13190含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 102)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ila Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala (SEQ ID NO:174)

                      实施例62

pMON 13191的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅰ，产生在pMON 13191中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组142起始引物(SEQ ID NO:72)和L -11起始引物(SEQ ID NO:60)，扩增在pMON 13037中的G- CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组141终止引物(SEQ ID NO: 73)和L-11终止引物(SEQ ID NO:61)，扩增在pMON 13037中 的G-CSF Ser17序列而产生终止片段。用142起始引物和141终止引物 扩增退火的起始和终止片段，而产生全长新的N-末端/C-末端G- CSF Ser17基因。

产生的含有新基因的DNA片段经限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ 消化，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega,Madison, WI)纯化。中介质粒pMON 13181经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ 消化，结果产生一条4068碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up 方法试剂盒(Promega,Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段， 用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。 部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司， Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分 离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为pMON 13191。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13191转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13191含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 103)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Als Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala (SEQ ID NO:175)

                    实施例63

pMON 13192的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅱ，产生在pMON 13192的新N-末 端/C-末端的基因。用引物组39起始引物(SEQ ID NO:64)和P- bl起始引物(SEQ ID NO:62)，扩增在pMON 13037中的G-CSF 序列而产生起始片段。用引物组38终止引物(SEQ ID NO:65)和P -bl终止引物(SEQ ID NO:63)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生终止片段。起始片段被限制性核酸内切酶NcoⅠ消化，而 终止片段被限制性核酸内切酶HindⅢ消化。纯化后，消化过的起始和终 止片段合并在一起，连接到pMON 3934约3800碱基对的NcoⅠ-HindⅢ 载体片段上。    

上述的中介质粒含有全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基 因，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，消化过的DNA在1％ TAE凝胶上分离，用溴化乙锭染色，用Geneclean(Bio101,Vista, CA)分离全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。中介质粒 pMON 13180经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条 4023碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒 (Promega,Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用T4 DNA 连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部分连接 反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA， 测序以证实新基因的正常插入。产生的质粒称为pMON 13192。

为表达蛋白和从内含体中分离蛋白，用pMON 13192转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13192含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 104)DNA序列： 13192.Pept Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr (SEQ ID NO:176)

                        实施例64 pMON 13192的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅱ，产生在pMON 13193中的新N- 末端/C-末端的基因。用引物组39起始引物(SEQ ID NO:64)和P -bl起始引物(SEQ ID NO:62)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组38终止引物(SEQ ID NO:65) 和P-bl终止引物(SEQ ID NO:63)，扩增在pMON 13037中的G -CSF Ser17序列而产生终止片段。起始片段被限制性核酸内切酶NcoⅠ 消化，而终止片段被限制性核酸内切酶HindⅢ消化。纯化后，消化过的 起始和终止片段合并在一起，连接到pMON 3934的约3800碱基对的NcoⅠ -HindⅢ载体片段上。

上述的中介质粒含有全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基 因，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，消化过的DNA在1％ TAE凝胶上分离，用溴化乙锭染色，用Geneclean(Bio101,Vista, CA)分离全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。中介质粒 pMON 13181经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条 4068碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒 (Promega,Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用T4 DNA 连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部分连接 反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA， 测序以证实新基因的正确插入。产生的质粒称为pMON 13193。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13193转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13193含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 105)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr (SEQ ID NO:177)

                  实施例65

pMON 25190的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅱ，产生在pMON 25190中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组97起始引物(SEQ ID NO:66)和P- bl起始引物(SEQ ID NO:62)，扩增在pMON 13037中的G-CSF序 列而产生起始片段。用引物组96终止引物(SEQ ID NO:67)和P- bl终止引物(SEQ ID NO:63)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17 序列而产生终止片段。起始片段被限制性核酸内切酶NcoⅠ消化，而终止 片段被限制性核酸内切酶HindⅢ消化。纯化后，消化过的起始和终止片 段合并在一起，连接到pMON 3934的约3800碱基对的NcoⅠ-HindⅢ 载体片段上。

上述的中介质粒含全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因， 用限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，消化过的DNA在1％TAE 凝胶上分离，用溴化乙锭染色，用Geneclean(Bio101,Vista,CA) 分离全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。中介质粒pMON 13180经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4023碱 基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega, Madisor,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用T4 DNA连接酶 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部分连接反应液 用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA， 测序以证实新基因的正常插入。产生的质粒称为pMON 25190。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 25190转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 25190含有编码如下氨基酸序列的(SEQ ID NO: 106)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser (SEQ ID NO:178)

                    实施例66

pMON 25191的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅱ，产生在pMON 25191中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组97起始引物(SEQ ID NO:66)和P- bl起始引物(SEQ ID NO:62)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17 序列而产生起始片段。用引物组96终止引物(SEQ ID NO:98)和P -bl终止引物(SEQ ID NO:63)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生终止片段。起始片段被限制性核酸内切酶NcoⅠ消化，而 终止片段被限制性核酸内切酶HindⅢ消化。纯化后，消化过的起始和终 止片段合并在一起，被连接到pMON 3934的约3800碱基对的NcoⅠ- HindⅢ载体片段上。

上述的中介质粒含全长新的N-末端/C末端G-CSF Ser17基因， 用限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，消化过的DNA在1％TAE 凝胶上分离，用溴化乙锭染色，用Geneclean(Bio101,Vista,CA) 分离全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。中介质粒pMON 13181经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4068碱 基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega, Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用T4 DNA连接酶 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部分连接反应液 用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA， 测序以证实新基因的正确插入。产生的质粒称为pMON 25191。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 25191转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 25191含编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:107) DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser (SEQ ID NO:179)

                     实施例67

pMON13194的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅱ，产生在pMON13194中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组126起始引物(SEQ ID NO:68)和P -bl起始引物(SEQ ID NO:62)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组125终止引物(SEQ ID NO:67) 和P-bl终止引物(SEQ ID NO:63)，扩增在pMON 13037中的G -CSF Ser17序列而产生终止片段。起始片段被限制性核酸内切酶NcoⅠ 消化，而终止片段被限制性核酸内切酶HindⅢ消化。纯化后，消化过的 起始和终止片段合并在一起，连接到pMON 3934的约3800碱基对的 NcoⅠ-HindⅢ载体片段上。   

上述的中介质粒含全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因， 用限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，消化过的DNA在1％TAE 凝胶上分离，用溴化乙锭染色，用Geneclean(Bio101,Vista,CA) 分离全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。中介质粒pMON 13180被限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4023碱 基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega, Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用T4 DNA连接酶 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部分连接反应液 用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA， 测序以证实新基因的正确插入。产生的质粒称为pMON 13194。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13194转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13194含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 108)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly (SEQ ID NO:180)

               实施例68

pMON 13195的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅱ，产生在pMON 13195中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组126起始引物(SEQ ID NO:68)和P -bl起始引物(SEQ ID NO:62)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组125终止引物(SEQ ID NO:69) 和P-bl终止引物(SEQ ID NO:63)，扩增在pMON 13037中的G -CSF Ser17序列而产生终止片段。起始片段被限制性核酸内切酶NcoⅠ 消化，而终止片段被限制性核酸内切酶HindⅢ消化。纯化后，消化过的 起始和终止片段合并在一起，连接到pMON 3934的约3800碱基对的NcoⅠ -HindⅢ载体片段上。

上述的中介质粒含有全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基 因，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，消化过的DNA在1％ TAE凝胶上分离，用溴化乙锭染色，用Geneclean(Bio101,Vista, CA)分离全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。中介质粒 pMON 13181经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条 4068碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒 (Promega,Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用T4 DNA 连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部分连接 反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA， 测序以证实新基因的正确插入。产生的质粒称为pMON 13195。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13195转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13195含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 109)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly (SEQ ID NO:181)

                    实施例69

pMON 13196的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅱ，产生在pMON 13196中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组133起始引物(SEQ ID NO:70)和P -bl起始引物(SEQ ID NO:62)，扩增在pMON 13037中的G-CSF 序列而产生起始片段。用引物组132终止引物(SEQ ID NO:71)和P -bl终止引物(SEQ ID NO:63)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生终止片段。起始片段被限制性核酸内切酶NcoⅠ消化，而 终止片段被限制性核酸内切酶HindⅢ消化。纯化后，消化过的起始和终 止片段合并在一起，连接到pMON 3934的约3800碱基对的NcoⅠ- HindⅢ载体片段上。

上述的中介质粒含有全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基 因，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，消化过的DNA在1％ TAE凝胶上分离，用溴化乙锭染色，用Geneclean(Bio101,Vista, CA)分离全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。中介质粒 pMON 13180经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条 4023碱基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒 (Promega,Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用T4 DNA 连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部分连接 反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA， 测序以证实新基因的正确插入。产生的质粒称为pMON 13196。

为表达蛋白和从包含体中纯化蛋白，用pMON 13196转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13196含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 110)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:182)

                    实施例70

PMON 13197的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅱ，产生在pMON 13197中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组133起始引物(SEQ ID NO:70)和P -bl起始引物(SEQ ID NO:62)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组132终止引物(SEQ ID NO:71) 和P-bl终止引物(SEQ ID NO:63)，扩增在pMON 13037中的G -CSF Ser17序列而产生终止片段。起始片段被限制性核酸内切酶NcoⅠ 消化，而终止片段被限制性核酸内切酶HindⅢ消化。纯化后，消化过的 起始和终止片段合并在一起，连接到pMON 3934的约3800碱基对的NcoⅠ -HindⅢ载体片段上。

上述的中介质粒含有全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基 因，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，消化过的DNA在1％ TAE凝胶上分离，用溴化乙锭染色，用Geneclean(Bio101,Vista,CA) 分离全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。中介质粒pMON 13181经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4068碱 基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega, Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用T4 DNA连接酶 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部分连接反应液 用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA， 测序以证实新基因的正确插入。产生的质粒称为pMON 13197。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13197转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13197含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 111)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr (SEQ ID NO:183)

                    实施例71

pMON 13198的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅱ，产生在pMON 13198中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组142起始引物(SEQ ID NO:72)和P -bl起始引物(SEQ ID NO:62)，扩增在pMON 13037中的G-CSF 序列而产生起始片段。用引物组141终止引物(SEQ ID NO:73)和P -bl终止引物(SEQ ID NO:63)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生终止片段。起始片段被限制性核酸内切酶NcoⅠ消化，而 终止片段被限制性核酸内切酶HindⅢ消化。纯化后，消化过的起始和终 止片段合并在一起，连接到pMON 3934的约3800碱基对的NcoⅠ- HindⅢ载体片段上。

上述的中介质粒含全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因， 用限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，消化过的DNA在1％TAE 凝胶上分离，用溴化乙锭染色，用Geneclean(Bio101,Vista,CA) 分离全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。中介质粒pMON 13180经限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4023碱 基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega, Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用T4 DNA连接酶 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部分连接反应液 用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA， 测序以证实新基因的正确插入。产生的质粒称为pMON 13198。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13198转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13198含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 112)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala (SEO ID NO:184)

                   实施例72

PMON 13199的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅱ，产生在pMON 13199中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组142起始引物(SEQ ID NO:72)和P -bl起始引物(SEQ ID NO:62)，扩增在pMON 13037中的G-CSF Ser17序列而产生起始片段。用引物组141终止引物(SEQ ID NO:73) 和P-bl终止引物(SEQ ID NO:63)，扩增在pMON 13037中的G -CSF Ser17序列而产生终止片段。起始片段用限制性核酸内切酶NcoⅠ 消化，而终止片段用限制性核酸内切酶HindⅢ消化。纯化后，消化过的 起始和终止片段合并在一起，连接到pMON 3934的约3800碱基对的NcoⅠ -HindⅢ载体片段上。

上述的中介质粒含全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因， 用限制性核酸内切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，消化过的DNA在1％TAE 凝胶上分离，用溴化乙锭染色，用Geneclean(Bio101,Vista,CA) 分离全长新的N-末端/C-末端G-CSF Ser17基因。中介质粒pMON 13181用限制性核酸内切酶HindⅢ和AflⅢ消化，结果产生一条4068碱 基对的载体片段，用Magic DNA Clean-up方法试剂盒(Promega, Madison,WI)纯化。合并纯化的限制性片段，用T4 DNA连接酶 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)连接。部分连接反应液 用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg, MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA， 测序以证实新基因的正确插入。产生的质粒称为pMON 13199。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 13199转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 13199含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 113)DNA序列： Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala (SEQ ID NO:185)

                       实施例73

构建串联重复质粒模板，Syntan1

为产生串联重复的hIL-3受体激动剂pMON 13416模板， Syntan1，用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim)连接的方法， 连接三种DNAs。这三种DNAs是：1)pMON 13046，含有hIL-3 受体激动剂pMON 13416，用BstEⅡ和SnaBⅠ消化；2)合成寡核苷酸 的退火互补对，Llsyn.for(SEQ ID NO:48)和Llsyn.rev(SEQ ID NO:49)，该互补对含有编码连接原始蛋白的C-末端和N-末端和 pMON 13416周围序列的小部分的接头的序列，当合适装配时会产生 BstEⅡ和CbaⅠ端；3)用ClaⅠ(DNA在dam-细胞中生长，DM1(生 命技术公司))和SnaBⅠ从pMON 13046消化而来的hIL-3受体激动 剂pMON 13416部分。消化过的DNAs在0.9％TAE凝胶上分离，用溴 化乙锭染色，用Geneclean(Bio101)分离。

部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司， Gaithersburg,MD)。从转化体中分离制取微量DNA，用基于PCR的 方法筛选转化体。来自选出的转化体中的质粒DNA被测序以得到正确的 模板。产生的质粒称为Syntan1，含有(SEQ ID NO:84)的DNA序 列。

                       实施例74

构建串联重复模板，Syntan3

为产生串联重复的hIL-3受体激动剂pMON 13416模板Syntan3， 用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim)连接的方法连接三种 DNAs。这三种DNA是：1)pMON 13046，含有hIL-3受体激动剂 pMON 13416，用BstEⅡ和SnaBⅠ消化；2)合成寡核苷酸的退火互补 对，L3syn.for(SEQ ID NO:50)和L3syn.rev(SEQ ID NO:51)， 这些互补对含有编码接头的序列，该接头连接原始蛋白的C-末端和N -末端及pMON 13416周围序列的小部分。当互补对适当装配时产生 BstEⅡ和SnaBⅠ端；3)用ClaⅠ(DNA在dam-细胞中生长，DM1(生 命技术公司))和SnaBⅠ从pMON 13046消化而来的hIL-3受体激动 剂pMON 13416部分。消化过的DNA在0.9％TAE凝胶上分离，用溴 化乙锭染色，用Geneclean(Bio101)分离。

部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司， Gaithersburg,MD)。从转化体中分离制取微量DNA，用基于PCR的 方法筛选转化体。从选出的转化体中来的质粒DNA被测序，以获得正确 模板。产生的质粒称为Syntan3，含有(SEQ ID NO:85)的DNA序 列。

                         实施例75

pMON 31104的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅲ，产生在pMON 31104中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组35起始引物(SEQ ID NO:52)和34 反向引物(SEQ ID NO:53)从中介质粒Syntan1扩增，而产生hIL- 3受体激动剂pMON 13416的全长新的N-末端/C-末端基因。

产生的含有新基因的DNA片段，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和SnaBⅠ 消化，消化过的DNA片段在1％TAE凝胶上分离，用溴化乙锭染色， 用Geneclean(Bio101,Vista,CA)分离。用T4 DNA连接酶 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，把纯化的消化DNA片 段连接到表达载体pMON 13189上。pMON 13189 DNA预先已用NcoⅠ 和SnaBⅠ消化移去hIL 3受体激动剂pMON 13416编码序列，4254碱基 对的载体片段经0.8％TAE凝胶分离和溴化乙锭染色后，用Geneclean (Bio101,Vista,CA)分离。部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌 株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素 的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA，测序以证实正确插入。产 生的质粒称为pMON 31104。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 31104转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 31104含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:86) DNA序列： Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:186)

               实施例76

PMON 31105的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅲ，产生在pMON 31105中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组70起始引物(SEQ ID NO:54)和69 反向引物(SEQ ID NO:55)从中介质粒Syntan1上扩增，而产生hIL 3 受体激动剂pMON 13416的全长新的N-末端/C-末端基因。

产生的含有新基因的DNA片段，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和SnaBⅠ 消化，消化过的DNA片段在1％TAE凝胶上分离，用溴化乙锭染色， 用Geneclean(Bio101,Vista,CA)分离。用T4 DNA连接酶 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，把纯化的消化DNA片 段连接到表达载体pMON 13189上。pMON 13189 DNA预先已用NcoⅠ 和SnaBⅠ消化，移去hIL 3受体激动剂pMON 13416编码序列，4254碱 基对的载体片段经0.8％TAE凝胶分离和溴化乙锭染色后，用Geneclean (Bio101,Vista,CA)分离。部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌 株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素 的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA，测序以证实正确插入。产 生的质粒称为pMON 31105。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 31105转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 31105含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:87) DNA序列： Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg ASn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:187)

                   实施例77

pMON 31106的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅲ，产生在pMON 31106中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组91起始引物(SEQ ID NO:56)和90 反向引物(SEQ ID NO:57)从中介质粒Syntan1中扩增，而产生hIL 3 受体激动剂pMON 13416的全长新的N-末端/C-末端基因。

产生的含有新基因的DNA片段，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和SnaBⅠ 消化。消化过的DNA片段在1％TAE凝胶分离，用溴化乙锭染色，用 Geneclean(Bio101,Vista,CA)分离。用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，把纯化的消化DNA片段连接到表达载 体pMON 13189上。pMON 13189 DNA预先已用NcoⅠ和SnaBⅠ消化， 以移去hIL 3受体激动剂pMON 13416编码序列，4254碱基对的载体片 段经0.8％TAE凝胶分离和溴化乙锭染色后，用Geneclean(Bio101, Vista,CA)分离。部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞 (生命技术公司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选 出转化的细菌。分离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为 pMON 31106。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 31106转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 31106含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:80) DNA序列： Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:188)

                     实施例78

pMON 31107的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅲ，产生在pMON 31107中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组101起始引物(SEQ ID NO:58)和100 反向引物(SEQ ID NO:59)从中介质粒Syntan1中扩增，而产生hIL -3受体激动剂pMON 13416的全长新的N-末端/C-末端基因。

产生的含新基因的DNA片段，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和SnaBⅠ 消化，消化过的DNA片段在1％TAE凝胶上分离，用溴化乙锭染色， 用Geneclean(Bio101,Vista,CA)分离。用T4 DNA连接酶 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，把纯化的消化DNA片 段连接到表达载体pMON 13189上。pMON 13189 DNA预先已用NcoⅠ 和SnaBⅠ消化，以移去hIL 3受体激动剂pMON 13416编码序列，4254 碱基对的载体片段经在0.8％TAE凝胶上分离和溴化乙锭染色后，用 Geneclean(Bio101,Vista,CA)分离。部分连接反应液用于转化大 肠杆菌菌株DH5α细胞(生命技术公司，Gaithersburg,MD)。在含氨 苄青霉素的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA，测序以证实正确 插入。产生的质粒称为pMON 31107。

为表达蛋白和从包含体中纯化蛋白，用pMON 31107转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 31107含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:89) DNA序列： Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Aru Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ils Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:189)

                  实施例79

pMON 31108的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅲ，产生在pMON 31108中的新N -末端/C-末端基因。用引物组35起始引物(SEQ ID NO:52)和34 反向引物(SEQ ID NO:53)从中介质粒Syntan3中扩增，而产生hIL -3受体激动剂pMON 13416的全长新的N-末端/C-末端基因。

产生的含有新基因的DNA片段，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和SnaBⅠ 消化，消化过的DNA片段在1％TAE凝胶上分离，经溴化乙锭染色， 用Geneclean(Bio101,Vista,CA)分离。用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，把纯化的消化DNA片段连接到表达载 体pMON 13189上。pMON 13189 DNA预先已用NcoⅠ和SnaBⅠ消化， 以移去hIL 3受体激动剂pMON 13416编码序列，4254碱基对的载体片 段经0.8％TAE凝胶分离和溴化乙锭染色后，用Geneclean(Bio101, Vista,CA)分离。部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞 (生命技术公司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选 出转化的细菌。分离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为 pMON 31108。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 31108转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 31108含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:90) DNA序列： Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:190)

                           实施例80

pMON 31109的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅲ，产生在pMON 31109中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组70起始引物(SEQ ID NO:54)和69 反向引物(SEQ ID NO:55)从中介质粒Syntan3中扩增，而产生hIL -3受体激动剂pMON 13416的全长新的N-末端/C-末端基因。

产生的含有新基因的DNA片段，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和SnaBⅠ 消化，消化过的DNA片段在1％TAE凝胶上分离，用溴化乙锭染色， 用Geneclean(Bio101,Vista,CA)分离。用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，把纯化的消化DNA片段连接到表达载 体pMON 13189上。pMON 13189 DNA预先已用NcoⅠ和SnaBⅠ消化， 以移去hIL 3受体激动剂pMON 13416编码序列，4254碱基对的载体片 段经0.8％TAE凝胶分离和溴化乙锭染色后，用Geneclean(Bio101, Vista,CA)分离。部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞 (生命技术公司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选 出转化的细菌。分离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为 pMON 31109。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 31109转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 31109含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:91) DNA序列： Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:191)

                  实施例81

pMON 31110的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅲ，产生在pMON 31110中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组91起始引物(SEQ ID NO:56)和96 反向引物(SEQ ID NO:57)从中介质粒Syntan3中扩增，而产生hIL -3受体激动剂pMON 13416的全长新的N-末端/C-末端基因。

产生的含有新基因的DNA片段，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和SnaBⅠ 消化，消化过的DNA片段在1％TAE凝胶上分离，用溴化乙锭染色， 用Geneclean(Bio101,Vista,CA)分离。用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，把纯化的消化DNA片段连接到表达载 体pMON 13189上。pMON 13189 DNA预先已用NcoⅠ和SnaBⅠ消化， 以移去hIL 3受体激动剂pMON 13416编码序列，4254碱基对的载体片 段经0.8％TAE凝胶分离和溴化乙锭染色后，用Geneclean(Bio101, Vista,CA)分离。部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞 (生命技术公司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选 出转化的细菌。分离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为 pMON 31110。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 31110转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 31110含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:92) DNA序列： Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:192)

                    实施例82

pMON 31111的构建

用在材料和方法中所述的方法Ⅲ，产生在pMON 31111中的新N- 末端/C-末端基因。用引物组101起始引物(SEQ ID NO:58)和100 反向引物(SEQ ID NO:59)从中介质粒Syntan3中扩增，而产生hIL -3受体激动剂pMON 13416的全长新的N-末端/C-末端基因。

产生的含有新基因的DNA片段，用限制性核酸内切酶NcoⅠ和SnaBⅠ 消化，消化过的DNA片段在1％TAE凝胶上分离，经溴化乙锭染色， 用Geneclean(Bio101,Vista,CA)分离。用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，把纯化的消化DNA片段连接到表达载 体pMON 13189上。pMON 13189 DNA预先已用NcoⅠ和SnaBⅠ消化， 以移去hIL 3受体激动剂pMON 13416编码序列，4254碱基对的载体片 段经0.8％TAE凝胶分离和溴化乙锭染色后，用Geneclean(Bio101, Vista,CA)分离。部分连接反应液用于转化大肠杆菌菌株DH5α细胞 (生命技术公司，Gaithersburg,MD)。在含氨苄青霉素的平皿上挑选 出转化的细菌。分离质粒DNA，测序以证实正确插入。产生的质粒称为 pMON 31111。

为表达蛋白和从包含体中分离蛋白，用pMON 31111转化大肠杆菌 JM 101菌株。

质粒pMON 31111含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO:93) DNA序列： Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro (SEQ ID NO:193)

                         实施例83

pMON 31112的构建

所构建的pMON 31112是一种含有编码多功能性造血受体激动剂的 DNA序列的质粒，该激动剂活化hIL-3受体和G-CSF受体。质粒 pMON 13189 DNA用限制性内切酶NcoⅠ和XmaⅠ消化，从0.8％琼脂糖 凝胶中分离和纯化，结果产生一条NcoⅠ,XmaⅠ载体片段。来自第二种 质粒pMON 13222(WO 94/12639，美国专利系列号#08/411,796)的 DNA，用NcoⅠ和EcoRⅠ消化，结果产生一条281碱基对的NcoⅠ,EcoRⅠ 片段。该片段从1.0％琼脂糖凝胶中分离和纯化。二种寡核苷酸 SYNNOXA1.REQ(SEQ ID NO:240)和SYNNOXA2.REQ(SEQ ID NO:241)退火，和来自pMON 13222的281碱基对的DNA片段一起 连接到来自pMON 13189的DNA载体片段上。然后，部分连接反应混合 液转化到k-12大肠杆菌JM 101菌株中。在含氨苄青霉素的平皿上挑 选出转化的细菌。分离质粒DNA，由限制性分析显示存在EcoRⅤ片段， 测序以证实正确插入。

质粒pMON 31112含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 114)DNA序列： MetAlaAsnCysSerAsnMetIleAspGluIleIleThrHisLeuLysGlnProProLeu ProLeuLeuAspPheAsnAsnLeuAsnGlyGluAspGlnAspIleLeuMetAspAsnAsn LeuArgArgProAsnLeuGluAlaPheAsnArgAlaValLysSerLeuGlnAsnAlaSer AlaIleGluSerIleLeuLysAsnLeuLeuProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaPro ThrArgHisProIleHisIleLysAspGlyAspTrpAsnGluPheArgArgLysLeuThr PheTyrLeuLysThrLeuGluAsnAlaGlnAlaGlnGlnTyrValGluGlyGlyGlyGly SerProGlyGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLysGlu SerHisLysSerProAsnMetAlaThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPhe GlnArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSer TyrArgValLeuArgHisLeuAlaGlnProSerGlyGlySerGlyGlySerGlnSerPhe LeuLeuLysSerLeuGluGlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGlnGlu LysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeuGlyHisSer LeuGlyIleProTrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnAlaLeuGlnLeuAlaGly CysLeuSerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyLeuLeuGlnAlaLeuGlu GlyIleSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspValAlaAspPhe AlaThrThrIleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeuGlnPro (SEQ ID NO:199)

                    实施例84

pMON 31113的构建

所构建的pMON 31113是一种含有编码多功能性造血受体激动剂的 DNA序列的质粒，该激动剂活化hIL-3受体和G-CSF受体。质粒 pMON 13197的DNA用限制性内切酶NcoⅠ和XmaⅠ消化，从0.8％琼脂 糖凝胶中分离和纯化，结果产生一条NcoⅠ,XmaⅠ载体片段。来自第二 种质粒pMON 13239(WO 94/12639，美国专利系列号#08/411,796) 的DNA，用NcoⅠ和EcoRⅠ消化，结果产生一条281碱基对的NcoⅠ， EcoRⅠ片段。该片段从1.0％琼脂糖凝胶中分离和纯化。二种寡核苷酸 SYNNOXA1.REQ(SEQ ID NO:240)和SYNNOXA2.REQ(SEQ ID NO:241)退火，和来自pMON 13239的281碱基对的DNA片段一起 连接到来自pMON 13197的DNA载体片段上。然后，部分连接反应混合 液转化到k-12大肠杆菌JM 101菌株中。在含氨苄青霉素的平皿上挑 选出转化的细菌。分离质粒DNA，由限制性分析显示存在EcoRⅤ片段， 测序以证实正确插入。

质粒pMON 31113含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 115)DNA序列： MetAlaAsnCysSerAsnMetIleAspGluIleIleThrHisLeuLysGlnProProLeu ProLeuLeuAspPheAsnAsnLeuAsnGlyGluAspGlnAspIleLeuMetGluAsnAsn LeuArgArgProAsnLeuGluAlaPheAsnArgAlaValLysSerLeuGlnAsnAlaSer AlaIleGluSerIleLeuLysAsnLeuLeuProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaPro ThrArgHisProIleIleIleArgAspGlyAspTrpAsnGluPheArgArgLysLeuThr PheTyrLeuLysThrLeuGluAsnAlaGlnAlaGlnGlnTyrValGluGlyGlyGlyGly SerProGlyGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLysGlu SerHisLysSerProAsnMetAlaThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPhe GlnArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSer TyrArgValLeuArgHisLeuAlaGlnProThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuPro GlnSerPheLeuLeuLysSerLeuGluGlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAla LeuGlnGluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeu GlyHisSerLeuGlyIleProTrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnAlaLeuGln LeuAlaGlyCysLeuSerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyLeuLeuGln AlaLeuGluGlyIleSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspVal AlaAspPheAlaThrThrIleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeu GlnPro (SEQ ID NO:200)

                    实施例85

pMON 31114的构建

所构建的pMON 31114是一种含有编码多功能性造血受体激动剂的 DNA序列的质粒，该激动剂活化hIL-3受体和G-CSF受体。质粒 pMON 13189的DNA用限制性内切酶NcoⅠ和XmaⅠ消化，从0.8％琼脂 糖凝胶中分离和纯化，结果产生一条NcoⅠ,XmaⅠ载体片段。来自第二 种质粒pMON 13239(WO 94/12639，美国专利系列号#08/411,796) 的DNA，用NcoⅠ和EcoRⅠ消化，结果产生一条281碱基对的NcoⅠ， EcoRⅠ片段。该片段从1.0％琼脂糖凝胶中分离和纯化。二种寡核苷酸 SYNNOXA1.REQ(SEQ ID NO:240)和SYNNOXA2.REQ(SEQ ID NO:241)退火，和来自pMON 13239的281碱基对的DNA片段一起 连接到来自pMON 13189的DNA载体片段上。然后，部分连接反应混合 液转化到k-12大肠杆菌JM 101菌株中。在含氨苄青霉素的平皿上挑 选出转化的细菌。分离质粒DNA，由限制性分析显示存在EcoRⅤ片段， 测序以证实正确插入。

质粒pMON 31114含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 116)DNA序列： MetAlaAsnCysSerAsnMetIleAspGluIleIleThrHisLeuLysGlnProProLeu ProLeuLeuAspPheAsnAsnLeuAsnGlyGluAspGlnAspIleLeuMetGluAsnAsn LeuArgArgProAsnLeuGluAlaPheAsnArgAlaValLysSerLeuGlnAsnAlaSer AlaIleGluSerIleLeuLysAsnLeuLeuProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaPro ThrArgHisProIleIleIleArgAspGlyAspTrpAsnGluPheArgArgLysLeuThr PheTyrLeuLysThrLeuGluAsnAlaGlnAlaGlnGlnTyrValGluGlyGlyGlyGly SerProGlyGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLysGlu SerHisLysSerProAsnMetAlaThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPhe GlnArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSer TyrArgValLeuArgHisLeuAlaGlnProSerGlyGlySerGlyGlySerGlnSerPhe LeuLeuLysSerLeuGluGlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGlnGlu LysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeuGlyHisSer LeuGlyIleProTrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnAlaLeuGlnLeuAlaGly CysLeuSerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyLeuLeuGlnAlaLeuGlu GlyIleSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspValAlaAspPhe AlaThrThrIleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeuGlnPro (SEQ ID NO:201)

                  实施例86

pMON 31115的构建

所构建的pMON 31115是一种含有编码多功能性造血受体激动剂的 DNA序列的质粒，该激动剂活化hIL-3受体和G-CSF受体。质粒 pMON 13197的DNA用限制性内切酶NcoⅠ和XmaⅠ消化，从0.8％琼脂 糖凝胶中分离和纯化，结果产生一条NcoⅠ,XmaⅠ载体片段。来自第二 种质粒pMON 13222的DNA用NcoⅠ和EcoRⅠ消化，结果产生一条281 碱基对的NcoⅠ,EcoRⅠ片段。该片段从1.0％琼脂糖凝胶中分离和纯化。 二种寡核苷酸SYNNOXA1.REQ(SEQ ID NO:240)和SYNNOXA2. REQ(SEQ ID NO:241)退火，和来自pMON 13222的281碱基对的 DNA片段一起连接到来自pMON 13197的DNA载体片段上。然后，部 分连接反应混合液转化k-12大肠杆菌JM 101菌株。在含氨苄青霉素 的平皿上挑选出转化的细菌。分离质粒DNA，由限制性分析显示存在 EcoRⅤ片段，测序以证实正确插入。

质粒pMON 31115含有编码下列氨基酸序列的(SEQ ID NO: 117)DNA序列： MetAlaAsnCysSerAsnMetIleAspGluIleIleThrHisLeuLysGlnProProLeu ProLeuLeuAspPheAsnAsnLeuAsnGlyGluAspGlnAspIleLeuMetAspAsnAsn LeuArgArgProAsnLeuGluAlaPheAsnArgAlaValLysSerLeuGlnAsnAlaSer AlaIleGluSerIleLeuLysAsnLeuLeuProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaPro ThrArgHisProIleHisIleLysAspGlyAspTrpAsnGluPheArgArgLysLeuThr PheTyrLeuLysThrLeuGluAsnAlaGlnAlaGlnGlnTyrValGluGlyGlyGlyGly SerProGlyGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLysGlu SerHisLysSerProAsnMetAlaThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPhe GlnArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSer TyrArgValLeuArgHisLeuAlaGlnProThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuPro GlnSerPheLeuLeuLysSerLeuGluGlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAla LeuGlnGluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeu GlyHisSerLeuGlyIleProTrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnAlaLeuGln LeuAlaGlyCysLeuSerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyLeuLeuGln AlaLeuGluGlyIleSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspVal AlaAspPheAlaThrThrIleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeu GlnPro (SEQ ID NO:202)

               实施例87

体外测定多功能性造血受体激动剂蛋白的活性

用基于亲和纯化的多克隆抗体的三明治ELISA法，能测定多功能性 造血受体激动剂蛋白的蛋白浓度。替代的方法是蛋白浓度也能通过氨基 酸组成分析测定。多功能性造血受体激动剂的生物活性能用许多体外测 定法确定。例如，结合hIL-3受体和G-CSF受体的多功能性造血受 体激动剂能用表达hIL-3和/或G-CSF受体的细胞系及细胞增殖测定 法加以鉴定。一种上述的测定法是AML-193细胞增殖测定法。AML -193细胞对IL-3和G-CSF应答而顾及被测的IL-3/G-CSF多 功能性造血受体激动剂的结合生物活性。另一种上述测定法是TF1细胞 增殖测定法。

此外，可用其他依赖因子的细胞系，如依赖于鼠IL-3的细胞系M -NFS-60(ATCC,CRL 1838)或32D。IL-3的活性有物种特 异性而G-CSF没有，因此，IL-3/G-CSF多功能性造血受体激动 剂的G-CSF组分的生物活性能分别地测定。不表达针对特定配体的受 体的细胞系如BHK或鼠Baf/3，能用含有编码所需受体的基因的质粒转 染。上述细胞系的一个实施例是用hG-CSF受体转染过的BaF3(BaF3/ hG-CSF)。在这些细胞系中，多功能性造血受体激动剂的活性能与 hIL-3或G-CSF单独或一起使用做比较。用BaF3/hG-CSF细胞增 殖测定法和TF1细胞增殖测定法测定本发明的多功能造血细胞受体激动 剂的实施例，在表5和表6显示。多功能性造血细胞受体激动剂的生物 活性，以与标准蛋白pMON 13056(WO 95/21254)相比的相对活性表 示。用BaF3/c-mpl细胞增殖测定法和TF1细胞增殖测定法测定本发明 的多功能性造血受体激动剂生物活性的实施例，在表7和表8显示。

                                 表5                 双重IL-3/G-CSF受体激动剂的细胞增殖活性     pMON  BaF3/hG-CSF受体细胞     增殖测定法     相对活性*     TF1细胞增殖测定法     相对活性*     13182     0.015     1.1     13183     0.02     nd     13184     0.01     0.3     13185     0.023     0.36     13186     0.36     0.45     13187     0.07     0.26     13188     0.64     1.3     13189     0.58     1.37     13190     0.045     1.2     13191     0.14     2.7     13192     0.09     2.2     13193     0.06     3.0     25190     nd     nd     25191     0.43     1.2     13194     nd     nd     13195     1.3     4.3     13196     0.66     0.5     13197     0.6     0.77     13198     0.6     0.5     13199     nd     nd     15982     0.7     1.9     15981     0.068     1.2     15965     0.7     0.82     15966     0.36     1.48     15967     0.62     1.37

nd=未测定

*多功能性造血受体激动剂的生物活性，以与标准蛋白pMON 13056 比较的相对活性表示。n=3或更多

                                 表6                  双重IL-3/G-CSF受体激动剂的细胞增殖活性     pMON  BaF3/hG-CSF受体细胞     增殖测定法     相对活性     TF1细胞增殖测定法     相对活性     31104     +     +     31105     +     +     31106     +     +     31107     nd     nd     31108     +     +     31109     +     +     31110     nd     nd     31111     nd     nd     31112     +     +     31113     +     +     31114     +     +     31115     +     +     31116     nd     nd     31117     nd     nd

nd=未测定

+多功能性造血受体激动剂的生物活性(n=1或2)，以与标准 蛋白pMON 13056比较的相对活性表示。

“+”显示该分子与pMON 13056相类似。

                                 表7                               细胞增殖活性     pMON  Baf3/c-mpl受体细胞增殖     测定活性*  TF1细胞增殖测定活性     28505     -     +     28506     -     +     28507     -     +     28508     -     +     28509     -     +     28510     -     +     28511     +     +     28512     +     +     28513     +     +     28514     +     -     28519     -     +     28520     -     +     28521     -     +     28522     -     -     28523     -     +     28524     -     +     28525     +     -     28526     +     -     2853 3     -     -     28534     -     -     28535     -     -     28536     -     -     28537     -     +     28538     -     +     28539     +     +     28540     +     +     28541     +     +     28542     +     +     28543     +     +     28544     +     -     28545     +     +

*相对于c-mpl配体(1-153)，在Baf3细胞系用c-mpl受 体转染测定的活性

+相对于pMON 13056测定的活性

用相似的方法，本领域的技术人员熟知的其他依赖因子的细胞系能 用于测定需测的多功能性造血受体激动剂的生物活性。能用甲基纤维素 测定法测定多功能性造血受体激动剂体外对造血祖细胞和不同类型的造 血细胞集落的模式的影响。甲基纤维素测定法能提供前体细胞发生率的 估计值，因为该法测定每100,000个输入细胞的祖细胞发生率。长期、 基质依赖的培养法已用于描斜原始造血祖细胞和干细胞。该测定法能用 于测定多功能性造血受体激动剂是否刺激非常原始祖细胞和/或干细胞 的扩增。此外，能进行有限稀释培养法，该法由多功能性造血受体激动 剂刺激的原始祖细胞发生率。

                                  表8     pMON#     IL-3激动剂活性     (AML细胞     增殖测定法) c-mpl受体激动剂活性 (Baf/3-c-mpl细胞     增殖测定法)     28505        +          -     28506        +          -     28507        +          -     28508        +          -     28509        +          -     28510        +          -     28511        +          +     28512        +          +     28513        +          +     28514        +          +     28515        +          +     28519        +          -     28520        +          -     28521        -          -     28522        +          -     28523        +          -     28524        +          -     28525        +          +     28526        -          +     28527        +          +     28528        +          +     28529        +          +

                                  表8(续)     28535 + -     28539 + +     28540 + +     28541 + +     28542 + +     28545 + +     28551 + +     28571 + +

                     实施例88

用在WO 94/12369和WO 94/12638所述的PCR诱变技术，制取含单 一或多种氨基酸替换的G-CSF变异体。用种种其他方法包括合成基因 装配或定点诱发(见Taylor等，核苷酸研究13:7864-8785[1985]； Kunkel等，美国国家科学院院报82:488-492[1985]；Sambrook等， 分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY [1989],(WO 94/12639)和(WO 94/12638))，本领域的技术人员 也能制取这些和其他变异体(即氨基酸替换，插入或缺失，以及N-末 端或C-末端延伸)。这些替换一次做一个，或和其他氨基酸替换和/ 或缺失、和/或插入、和/或延伸联合进行。证实序列的变化后，为产生变 异体，质粒DNA可转染到合适的哺乳动物细胞、昆虫细胞或诸如大肠杆 菌的细菌菌株中。有活性的已知的G-CSF变异体包括在1位(Thr变 为Ser、Arg或Gly )、2位(Pro变为Leu)、3位(Leu变为Arg或 Ser)和17位(Cys变为Ser)的替换，以及氨基酸1-11的缺失(Kuga 等，生物化学和生物物理研究通讯159:103-111(1989))。这些 G-CSF氨基酸变异体能用作模板以产生G-CSF受体激动剂，其中产 生了新N-末端和新C-末端。G-CSF氨基酸替换变异体的实施例在 表9显示。

                   实施例89

G-CSF氨基酸替换变异体的生物活性测定

利用人G-CSF受体转染的Baf/3细胞系，G-CSF氨基酸替换变 异体能被进行细胞增殖活性测定。相对于原始人G-CSF,G-CSF 氨基酸替换变异体的生物活性的实施例在表9显示。“+”表示与原始 G-CSF相似的活性，而“-”表示明显降低或没有测定到活性。

                表9

在用人G-CSF受体转染的BAF3细胞系中，

      G-CSF变异体的细胞增殖活性 氨基酸位置    原始氨基酸    突变氨基酸    活性*     13           Phe            Ser        +     13           Phe            His        +     13           Phe            Thr        +     13           Phe            Pro        +     16           Lys            Pro        +     16           Lys            Ser        +     16           Lys            Thr        +     16           Lys            His        +     18           Leu            Pro        +     18           Leu            Thr        +     18           Leu            His        +     18           Leu            Cys        +     18           Leu            Ile        +     19           Glu            Ala        -     19           Glu            Thr        -     19           Glu            Arg        -     19           Glu            Pro        -     19           Glu            Leu        -     19           Glu            Ser        -     22           Arg            Tyr        +     22           Arg            Ser        +     22           Arg            Ala        +     22           Arg            Thr        +     24           Ile            Pro        +     24           Ile            Leu        +     24           Ile            Tyr        +

                                  表9续 氨基酸位置    原始氨基酸    突变氨基酸    活性     27           Asp           Gly         +     30           Ala           Ile         +     30           Ala           Leu         +     34           Lys           Ser         +     43           His           Gly         +     43           His           Thr         +     43           His           Val         +     43           His           Lys         +     43           His           Trp         +     43           His           Ala         -     43           His           Arg         +     43           His           Cys         +     43           His           Leu         +     44           Pro           Arg         +     44           Pro           Asp         +     44           Pro           Val         +     44           Pro           Ala         +     44           Pro           His         +     44           Pro           Gln         +     44           Pro           Trp         +     44           Pro           Gly         +     44           Pro           Thr         +     46           Glu           Ala         -     46           Glu           Arg         +     47           Leu           Thr         +     49           Leu           Phe         +     49           Leu           Arg         +     49           Leu           Ser         +     50           Leu           His         +     54           Leu           His         +

                                  表8续 氨基酸位置    原始氨基酸    突变氨基酸    活性     67           Gln           Lys         +     67           Gln           Leu         +     67           Gln           Cys         +     70           Gln           Pro         +     70           Gln           Leu         +     70           Gln           Arg         +     70           Gln           Ser         +     104          Asp           Gly         +     104          Asp           Val         +     108          Leu           Ala         +     108          Leu           Val         +     108          Leu           Arg         +     108          Leu           Gly         +     108          Leu           Trp         +     108          Leu           Gln         +     115          Thr           His         +     115          Thr           Leu         +     115          Thr           Ala         +     144          Phe           His         +     144          Phe           Arg         +     144          Phe           Pro         +     144          Phe           Leu         -     144          Phe           Glu         +     146          Arg           Gln         +     147          Arg           Gln         +     156          His           Asp         -     156          Mis           Ser         +     156          His           Gly         +

                                  表8续 氨基酸位置    原始氨基酸    突变氨基酸    活性     159          Ser           Arg         +     159          Ser           Thr         +     159          Ser           Tyr         +     159          Ser           Val         +     159          Ser           Gly         +     162          Glu           Gly         -     162          Glu           Trp         +     162          Glu           Leu         +     163          Val           Arg         +     163          Val           Ala         +     163          Val           Gly         +     165          Tyr           Cys         nd     169          Ser           Leu         +     169          Ser           Cys         +     169          Ser           Arg         +     170          His           Arg         +     170          His           Ser         +

*相对于原始hG-CSF的活性

nd=未测定

不用进一步详述，可以认为本领域的技术人员能用先前的描述，最 大程度地利用本发明。因此，下列优选的具体实施例仅看作是说明性的， 而不是以任何方式限制本公开内容的未涉及部分。

有关分子生物学技术、蛋白纯化和生物测定方法的更多细节可在WO 94/12639,WO 94/12638,WO 95/20976,WO 95/21197,WO 95/20977,WO 95/21254中找到，作为一个整体在此引入仅作参考。

如果在此已写出，在此引用的所有参考文献、专利或申请，作为一 个整体引入仅作参考。

对本领域的技术人员来说，阅读本公开内容后并不违反本发明的精 神和范围，将会明了各种其他实施例。可以预期所有上述其他实施例将 包括在所附的权利要求范围之内。

               序列表 (1)一般信息：

(ⅰ)申请人：

(A)姓名：G.D.Searle & Co.

(B)街道：P.O.Box 5110

(C)城市：芝加哥

(D)州名：伊利诺斯

(E)国家：美国

(F)邮政编码(ZIP):60680

(G)电话：(708)470-6501

(H)电传：(708)470 6881

(A)姓名：Monsanto公司

(B)街道：800 North Lindbergh Boulevard

(C)城市：圣·路易斯

(D)州名：密苏里

(E)国家：美国

(F)邮政编码(ZIP):63167

(G)电话：(314)647-3131

(H)电传：(314)694 5435

(ⅱ)发明题目：多功能性造血受体激动剂

(ⅲ)序列数目：258

(ⅳ)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release # 1.0,Version # 1.30(EPO)

(ⅴ)当前申请资料：

申请号：US 2910

(ⅵ)在先申请资料：

(A)申请号：US 60/004,834

(B)申请日期：1995年10月5日 (2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：174氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：末知

(D)拓扑结构：末知

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：1

(D)其他信息：/注释=“在第1位的Xaa是Thr、Ser、Arg、

             Tyr或Gly；”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：2

(D)其他信息：/注释=“在第2位的Xaa是Pro或Leu；”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：3

(D)其他信息：/注释=“在第3位的Xaa是Leu、Arg、

             Tyr或Ser；”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：13

(D)其他信息：/注释=“在第13位的Xaa是Phe、Ser、

             His、Thr或Pro；”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：16

(D)其他信息：/注释=“在第16位的Xaa是Lys、Pro、

              Ser、Thr或His；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：17

(D)其他信息：/注释=“在第17位的Xaa是Cys、Ser、

              Gly、Ala、Ile、Tyr或Arg；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：18

(D)其他信息：/注释=“在第18位的Xaa是Leu、Thr、

              Pro、His、Ile或Cys；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：22

(D)其他信息：/注释=“在第22位的Xaa是Arg、Tyr、

              Ser、Thr或Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：24

(D)其他信息：/注释=“在第24位的Xaa是Ile、Pro、

              Tyr或Leu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：27

(D)其他信息：/注释=“在第27位的Xaa是Asp或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：30

(D)其他信息：/注释=“在第30位的Xaa是Ala、Ile、

             Leu或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：34

(D)其他信息：/注释=“在第34位的Xaa是Lys或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：36

(D)其他信息：/注释=“在第36位的Xaa是Cys或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：42

(D)其他信息：/注释=“在第42位的Xaa是Cys或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：43

(D)其他信息：/注释=“在第43位的Xaa是His、Thr、

              Gly、Val、Lys、Trp、Ala、Arg、Cys

              或Leu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：44

(D)其他信息：/注释=“在第44位的Xaa是Pro、Gly、

             Arg、Asp、Val、Ala、His、Trp、Gln

             或Thr；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：46

(D)其他信息：/注释=“在第46位的Xaa是Glu、Arg、

             Phe、Arg,Ile或Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：47

(D)其他信息：/注释=“在47位的Xaa是Leu或Thr；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：49

(D)其他信息：/注释=“在第49位的Xaa是Leu、Phe、

             Arg或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：50

(D)其他信息：/注释=“在第50位的Xaa是Leu、Ile、

              His、Pro或Tyr；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：54

(D)其他信息：/注释=“在第54位的Xaa是Leu或His；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：64

(D)其他信息：/注释=“在第64位的Xaa是Cys或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：67

(D)其他信息：/注释=“在第67位的Xaa是Gln、Lys、

             Leu或Cys；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：70

(D)其他信息：/注释=“在第70位的Xaa是Gln、Pro、

              Leu、Arg或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：74

(D)其他信息：/注释=“在第1位的Xaa是Cys或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：104

(D)其他信息：/注释=“在第104位的Xaa是Asp、Gly或

             Val；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：108

(D)其他信息：/注释=“在第108位的Xaa是Leu、Ala、

              Val、Arg、Trp、Gln或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：115

(D)其他信息：/注释=“在第115位的Xaa是Thr、His、

              Leu或Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：120

(D)其他信息：/注释=“在第120位的Xaa是Gln、Gly、

              Arg、Lys或His；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：123

(D)其他信息：/注释=“在第123位的Xaa是Glu、Arg、

             Phe或Thr；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：144

(D)其他信息：/注释=“在第144位的Xaa是Phe、His、

              Arg、Pro、Leu、Gln或Glu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：146

(D)其他信息：/注释=“在第146位的Xaa是Arg或Gln；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：147

(D)其他信息：/注释=“在第147位的Xaa是Arg或Gln；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：156

(D)其他信息：/注释=“在第156位的Xaa是His、Gly或

             Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：159

(D)其他信息：/注释=“在第159位的Xaa是Ser、Arg、

              Thr、Tyr、Val或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：162

(D)其他信息：/注释=“在第162位的Xaa是Glu、Leu、

              Gly或Trp；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：163

(D)其他信息：/注释=“在第163位的Xaa是Val、Gly、

              Arg或Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：169

(D)其他信息：/注释=“在第169位的Xaa是Arg、Ser、

              Leu、Arg或Cys；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：170

(D)其他信息：/注释=“在第170位的Xaa是His、Arg或

              Ser；” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1: Xaa Xaa Xaa Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Xaa Leu Leu Xaa 1               5                   10                  15 Xaa Xaa Glu Gln Val Xaa Lys Xaa Gln Gly Xaa Gly Ala Xaa Leu Gln

        20                  25                  30 Glu Xaa Leu Xaa Ala Thr Tyr Lys Leu Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Val

    35                  40                  45 Xaa Xaa Gly His Ser Xaa Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Xaa

50                  55                  60 Pro Ser Xaa Ala Leu Xaa Leu Ala Gly Xaa Leu Ser Gln Leu His Ser 65                  70                  75                  80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser

            85                  90                  95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Xaa Thr Leu Gln Xaa Asp Val Ala Asp

        100                 105                 110 Phe Ala Xaa Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Xaa Xaa Gly Met Ala Pro

    115                 120                 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Xaa

130                 135                 140 Gln Xaa Xaa Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser Xaa Leu Gln Xaa Phe 145                 150                 155                 160 Leu Xaa Xaa Ser Tyr Arg Val Leu Xaa Xaa Leu Ala Gln Pro

            165                 170 (2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：133个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：17

(D)其他信息：/注释=“在第17位的Xaa是Ser、Lys、

              Gly、Asp、Met、Gln或Arg；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：18

(D)其他信息：/注释=“在第18位的Xaa是Asn、His、

              Leu、Ile、Phe、Arg或Gln；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：19

(D)其他信息：/注释=“在第19位的Xaa是Met、Phe、

              Ile、Arg、Gly、Ala或Cys；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：20

(D)其他信息：/注释=“在第20位的Xaa是Ile、Cys、

              Gln、Glu、Arg、Pro或Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：21

(D)其他信息：/注释=“在第21位的Xaa是Asp、Phe、

              Lys、Arg、Ala、Gly、Glu、Gln、Asn、

              Thr、Ser或Val；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：22

(D)其他信息：/注释=“在第22位的Xaa是Glu、Trp、

              Pro、Ser、Ala、His、Asp、Asn、Gln、

              Leu、Val或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：23

(D)其他信息：/注释=“在第23位的Xaa是Ile、Val、

              Ala、Gly、Trp、Lys、Phe、Leu、Ser

              或Arg；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：24

(D)其他信息：/注释=“在第24位的Xaa是Ile、Gly、

              Val、Arg、Ser、Phe或Leu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：25

(D)其他信息：/注释=“在第25位的Xaa是Thr、His、

              Gly、Gln、Arg、Pro或Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：26

(D)其他信息：/注释=“在第26位的Xaa是His、Thr、

              Phe、Gly、Arg、Ala或Trp；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：27

(D)其他信息：/注释=“在第27位的Xaa是Leu、Gly、

              Arg、Thr、Ser或Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：28

(D)其他信息：/注释=“在第28位的Xaa是Lys、Arg、

              Leu、Gln、Gly、Pro、Val或Trp；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：29

(D)其他信息：/注释=“在第29位的Xaa是Gln、Asn、

              Leu、Pro、Arg或Val；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：30

(D)其他信息：/注释=“在第30位的Xaa是Pro、His、

              Thr、Gly、Asp、Gln、Ser、Leu或L...” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：31

(D)其他信息：/注释=“在第31位的Xaa是Pro、Asp、

              Gly、Ala、Arg、Leu或Gln；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：32

(D)其他信息：/注释=“在第32位的Xaa是Leu、Val、

              Arg、Gln、Asn、Gly、Ala或Glu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：33

(D)其他信息：/注释=“在第33位的Xaa是Pro、Leu、

              Gln、Ala、Thr或Glu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：34

(D)其他信息：/注释=“在第34位的Xaa是Leu、Val、

              Gly、Ser、Lys、Glu、Gln、Thr、Arg、

              Ala、Phe、Ile或Met；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：35

(D)其他信息：/注释=“在第35位的Xaa是Leu、Ala、

              Gly、Asn、Pro、Gln或Val；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：36

(D)其他信息：/注释=“在第36位的Xaa是Asp、Leu或

              Val；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：37

(D)其他信息：/注释=“在第37位的Xaa是Phe、Ser、

              Pro、Trp或Ile；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：38

(D)其他信息：/注释=“在第38位的Xaa是Asn或Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：40

(D)其他信息：/注释=“在第40位的Xaa是Leu、Trp或

             Arg；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：41

(D)其他信息：/注释=“在第41位的Xaa是Asn、Cys、

              Arg、Leu、His、Met或Pro；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：42

(D)其他信息：/注释=“在第42位的Xaa是Gly、Asp、

              Ser、Cys、Asn、Lys、Thr、Leu、Val、

              Glu、Phe、Tyr、Ile、Met或Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：43

(D)其他信息：/注释=“在第43位的Xaa是Glu、Asn、

              Tyr、Leu、Phe、Asp、Ala、Cys、Gln、

              Arg、Thr、Gly或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：44

(D)其他信息：/注释=“在第44位的Xaa是Asp、Ser、

              Leu、Arg、Lys、Thr、Met、Trp、Glu、

              Asn、Gln、Ala或Pro；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：46

(D)其他信息：/注释=“在第46位的Xaa是Asp、Phe、

              Ser、Thr、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、

              His、Ala、Tyr、Ile、Val或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：47

(D)其他信息：/注释=“在第47位的Xaa是Ile、Gly、

              Val、Ser、Arg、Pro或His；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：48

(D)其他信息：/注释=“在第48位的Xaa是Leu、Ser、

              Cys、Arg、Ile、His、Phe、Glu、Lys、

              Thr、Ala、Met、Val或Asn；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：49

(D)其他信息：/注释=“在第49位的Xaa是Met、Arg、

              Ala、Gly、Pro、Asn、His或Asp；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：50

(D)其他信息：/注释=“在第50位的Xaa是Glu、Leu、

              Thr、Asp、Tyr、Lys、Asn、Ser、Ala、

              Ile、Val、His、Phe、Met或Gln；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：51

(D)其他信息：/注释=“在第51位的Xaa是Asn、Arg、

              Met、Pro、Ser、Thr或His；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：52

(D)其他信息：/注释=“在第52位的Xaa是Asn、His、

              Arg、Leu、Gly、Ser或Thr；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：53

(D)其他信息：/注释=“在第53位的Xaa是Leu、Thr、

              Ala、Gly、Glu、Pro、Lys、Ser或M...” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：54

(D)其他信息：/注释=“在第54位的Xaa是Arg、Asp、

              Ile、Ser、Val、Thr、Gln、Asn、Lys、

              His、Ala或Leu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：55

(D)其他信息：/注释=“在第55位的Xaa是Arg、Thr、

              Val、Ser、Leu或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：56

(D)其他信息：/注释=“在第56位的Xaa是Pro、Gly、

              Cys、Ser、Gln、Glu、Arg、His、Thr、

              Ala、Tyr、Phe、Leu、Val或Lys；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：57

(D)其他信息：/注释=“在第57位的Xaa是Asn或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：58

(D)其他信息：/注释=“在第58位的Xaa是Leu、Ser、

              Asp、Arg、Gln、Val或Cys；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：59

(D)其他信息：/注释=“在第59位的Xaa是Glu、Tyr、

              His、Leu、Pro或Arg；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：60

(D)其他信息：/注释=“在第60位的Xaa是Ala、Ser、

              Pro、Tyr、Asn或Thr；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：61

(D)其他信息：/注释=“在第61位的Xaa是Phe、Asn、

              Glu、Pro、Lys、Arg或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：62

(D)其他信息：/注释=“在第62位的Xaa是Asn、His、

              Val、Arg、Pro、Thr、Asp或Ile；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：63

(D)其他信息：/注释=“在第63位的Xaa是Arg、Tyr、

              Trp、Lys、Ser、His、Pro或Val；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：64

(D)其他信息：/注释=“在第64位的Xaa是Ala、Asn、

              Pro、Ser或Lys；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：65

(D)其他信息：/注释=“在第65位的Xaa是Val、Thr、

              Pro、His、Leu、Phe或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：66

(D)其他信息：/注释=“在第66位的Xaa是Lys、Ile、

              Arg、Val、Asn、Glu或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：67

(D)其他信息：/注释=“在第67位的Xaa是Ser、Ala、

              Phe、Val、Gly、Asn、Ile、Pro或His；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：68

(D)其他信息：/注释=“在第68位的Xaa是Leu、Val、

              Trp、Ser、Ile、Phe、Thr或His；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：69

(D)其他信息：/注释=“在第69位的Xaa是Gln、Ala、

              Pro、Thr、Glu、Arg、Trp、Gly或L...” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：70

(D)其他信息：/注释=“在第70位的Xaa是Asn、Leu、

              Val、Trp、Pro或Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：71

(D)其他信息：/注释=“在第71位的Xaa是Ala、Met、

              Leu、Pro、Arg、Glu、Thr、Trp或

              Asn；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：72

(D)其他信息：/注释=“在第72位的Xaa是Ser、Glu、

              Met、Ala、His、Asn、Arg或Asp；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：73

(D)其他信息：/注释=“在第73位的Xaa是Ala、Glu、

              Asp、Leu、Ser、Gly、Thr或Arg；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：74

(D)其他信息：/注释=“在第74位的Xaa是Ile、Met、

              Thr、Pro、Arg、Gly、Ala；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：75

(D)其他信息：/注释=“在第75位的Xaa是Glu、Lys、

               Gly、Asp、Pro、Trp、Arg、Ser、Gln

               或Leu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：76

(D)其他信息：/注释=“在第76位的Xaa是Ser、Val、

              Ala、Asn、Trp、Glu、Pro、Gly或A...” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：77

(D)其他信息：/注释=“在第77位的Xaa是Ile、Ser、

              Arg、Thr或Leu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：78

(D)其他信息：/注释=“在第78位的Xaa是Leu、Ala、

              Ser、Glu、Phe、Gly或Arg；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：79

(D)其他信息：/注释=“在第79位的Xaa是Lys、Thr、

              Asn、Met、Arg、Ile、Gly或Asp；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：80

(D)其他信息：/注释=“在第80位的Xaa是Asn、Trp、

              Val、Gly、Thr、Leu、Glu或Arg；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：81

(D)其他信息：/注释=“在第81位的Xaa是Leu、Gln、

              Gly、Ala、Trp、Arg、Val或Lys；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：82

(D)其他信息：/注释=“在第82位的Xaa是Leu、Gln、

              Lys、Trp、Asp、Glu、Asn、His、Thr、

              Ser、Ala、Tyr、Phe、Ile、Met或Val；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：83

(D)其他信息：/注释=“在第83位的Xaa是Pro、Ala、

              Thr、Trp、Arg或Met；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：84

(D)其他信息：/注释=“在第84位的Xaa是Cys、Glu、

              Gly、Arg、Met或Val；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：85

(D)其他信息：/注释=“在第85位的Xaa是Leu、Asn、

              Val或Gln；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：86

(D)其他信息：/注释=“在第86位的Xaa是Pro、Cys、

              Arg、Ala或Lys；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：87

(D)其他信息：/注释=“在第87位的Xaa是Leu、Ser、

              Trp或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：88

(D)其他信息：/注释=“在第88位的Xaa是Ala、Lys、

              Arg、Val或Trp；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：89

(D)其他信息：/注释=“在第89位的Xaa是Thr、Asp、

              Cys、Leu、Val、Glu、His、Asn或S...” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：90

(D)其他信息：/注释=“在第90位的Xaa是Ala、Pro、

              Ser、Thr、Gly、Asp、Ile或Met；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：91

(D)其他信息：/注释=“在第91位的Xaa是Ala、Pro、

              Ser、Thr、Phe、Leu、Asp或His；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：92

(D)其他信息：/注释=“在第92位的Xaa是Pro、Phe、

              Arg、Ser、Lys、His、Ala、Gly、Ile

              或Leu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：93

(D)其他信息：/注释=“在第93位的Xaa是Thr、Asp、

              Ser、Asn、Pro、Ala、Leu或Arg；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：94

(D)其他信息：/注释=“在第94位的Xaa是Arg、Ile、

              Ser、Glu、Leu、Val、Gln、LVs、His、

              Ala或Pro；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：95

(D)其他信息：/注释=“在第95位的Xaa是His、Gln、

              Pro、Arg、Val、Leu、Gly、Thr、Asn、

              Lys、Ser、Ala、Trp、Phe、Ile或Tyr；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：96

(D)其他信息：/注释=“在第96位的Xaa是Pro、Lys、

              Tyr、Gly、Ile或Thr；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：97

(D)其他信息：/注释=“在第97位的Xaa是Ile、Val、

              Lys、Ala或Asn；”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：98

(D)其他信息：/注释=“在第98位的Xaa是His、Ile、

              Asn、Leu、Asp、Ala、Thr、Glu、Gln、

              Ser、Phe、Met、Val、Lys、Arg、Tyr

              或Pro；”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：99

(D)其他信息：/注释=“在第99位的Xaa是Ile、Leu、

              Arg、Asp、Val、Pro、Gln、Gly、Ser、

              Phe或His；”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：100

(D)其他信息：/注释=“在第100位的Xaa是Lys、Tyr、

              Leu、His、Arg、Ile、Ser、Gln或...” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：101

(D)其他信息：/注释=“在第101位的Xaa是Asp、Pro、

              Met、Lys、His、Thr、Val、Tyr、Glu、

              Asn、Ser、Ala、Gly、Ile、Leu或Gln；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：102

(D)其他信息：/注释=“在第102位的Xaa是Gly、Leu、

              Glu、Lys、Ser、Tyr或Pro；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：103

(D)其他信息：/注释=“在第103位的Xaa是Asp或Ser；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：104

(D)其他信息：/注释=“在第104位的Xaa是Trp、Val、

              Cys、Tyr、Thr、Met、Pro、Leu、Gln、

              Lys、Ala、Phe或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：105

(D)其他信息：/注释=“在第105位的Xaa是Asn、Pro、

              Ala、Phe、Ser、Trp、Gln、Tyr、Leu、

              Lys、Ile、Asp或His；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：106

(D)其他信息：/注释=“在第106位的Xaa是Glu、Ser、

              Ala、Lys、Thr、Ile、Gly或Pro；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：108

(D)其他信息：/注释=“在第108位的Xaa是Arg、Lys、

              Asp、Leu、Thr、Ile、Gln、His、Ser、

              Ala或Pro；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：109

(D)其他信息：/注释=“在第109位的Xaa是Arg、Thr、

              Pro、Glu、Tyr、Leu、Ser或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：110

(D)其他信息：/注释=“在第110位的Xaa是Lys、Ala、

              Asn、Thr、Leu、Arg、Gln、His、Glu、

              Ser或Trp；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：111

(D)其他信息：/注释=“在第111位的Xaa是Leu、Ile、

              Arg、Asp或Met；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：112

(D)其他信息：/注释=“在第112位的Xaa是Thr、Val、 

              Gln、Tyr、Glu、His、Ser或Phe；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：113

(D)其他信息：/注释=“在第113位的Xaa是Phe、Ser、

              Cys、His、Gly、Trp、Tyr、Asp、Lys、

              Leu、Ile、Val或Asn；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：114

(D)其他信息：/注释=“在第114位的Xaa是Tyr、Cys、

              His、Ser、Trp、Arg或Leu；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：115

(D)其他信息：/注释=“在第115位的Xaa是Leu、Asn、

              Val、Pro、Arg、Ala、His、Thr、Trp

              或Met；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：116

(D)其他信息：/注释=“在第116位的Xaa是Lys、Leu、

              Pro、Thr、Met、Asp、Val、Glu、Arg、

              Trp、Ser、Asn、His、Ala、Tyr、Phe、

               Gln或Ile；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：117

(D)其他信息：/注释=“在第117位的Xaa是Thr、Ser、

              Asn、Ile、Trp、Lys或Pro；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：118

(D)其他信息：/注释=“在第118位的Xaa是Leu、Ser、

              Pro、Ala、Glu、Cys、Asp或Tyr；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：119

(D)其他信息：/注释=“在第119位的Xaa是Glu、Ser、

              Lys、Pro、Leu、Thr、Tyr或Arg；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：120

(D)其他信息：/注释=“在第120位的Xaa是Asn、Ala、

              Pro、Leu、His、Val或Gln；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：121

(D)其他信息：/注释=“在第121位的Xaa是Ala、Ser、

              Ile、Asn、Pro、Lys、Asp或Gly；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：122

(D)其他信息：/注释=“在第122位的Xaa是Gln、Ser、

              Met、Trp、Arg、Phe、Pro、His、Ile、

              Tyr或Cys；” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：123

(D)其他信息：/注释=“在第123位的Xaa是Ala、Met、

              Glu、His、Ser、Pro、Tyr或Leu；” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2: Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys 1               5                   10                  15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

        20                  25                  30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

    35                  40                  45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

50                  55                  60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65                  70                  75                  80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

            85                  90                  95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

        100                 105                 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Gln Thr Thr Leu

    115                 120                 125 Ser Leu Ala Ile Phe

130 (2)SEQ ID NO:3的信息： (ⅰ)序列特性：

(A)长度：332个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑结构：未知

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：112

(D)其他信息：/注释=“在112位缺失或是Leu、Ala、

              Val、Ile、Pro、Phe、Trp或M...”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：113

(D)其他信息：/注释=“在113位缺失或是Pro、Phe、

              Ala、Leu、Ile、Trp或Met；”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：114

(D)其他信息：/注释=“在114位缺失或是Pro、Phe、

              Ala、Val、Leu、Ile、Trp或Met；”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：115

(D)其他信息：/注释=“在115位缺失或是Gln、Gly、

              Ser、Thr、Tyr或Asn；” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

            85                  90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Xaa

        100                 105                 110 Xaa Xaa Xaa Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145                 150                 155                 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn

            165                 170                 175 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr

        180                 185                 190 Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile

    195                 200                 205 Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly

210                 215                 220 Tyr Leu Ash Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 225                 230                 235                 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly

            245                 250                 255 Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser

        260                 265                 270 Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu

    275                 280                 285 Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro

290                 295                 300 Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 305                 310                 315                 320 Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly

            325                 330 (2)SEQ ID NO:4的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：1个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅸ)特征

(A)名称/关键词：蛋白

(B)位置：1

(D)其他信息：/注释=“其中x=(glyglyglyser)n和其中n

              是整数”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:

      Xaa

      1 (2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：1个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅸ)特征

(A)名称/关键词：肽

(B)位置：1

(D)其他信息：/注释=“其中x=(glyglyglyglyser)n和n是

              整数”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:

      Xaa

      1 (2)SEQ ID NO:6的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：1个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅸ)特征

(A)名称/关键词：蛋白

(B)位置：1

(D)其他信息：/注释=“其中x=(glyglyglyglyglyser)n和n

             是整数”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:

      Xaa

      1 (2)SEQ ID NO:7的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：1个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅸ)特征

(A)名称/关键词：蛋白

(B)位置：1

(D)其他信息：/注释=“其中x=(glynser)n和n是整数”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:

      Xaa

      1 (2)SEQ ID NO:8的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：1个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅸ)特征

(A)名称/关键词：蛋白

(B)位置：1

(D)其他信息：/注释=“其中x=(alaglyser)n和n是整数”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:

      Xaa

      1 (2)SEQ ID NO:9的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：35个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9: Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ser 1               5                   10                  15 Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly

        20                  25                  30 Gly Gly Ser

    35 (2)SEQ ID NO:10的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10: Ile Ser Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Thr 1               5                   10                  15 Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro

        20 (2)SEQ ID NO:11的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：28个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11: Ile Glu Gly Arg Ile Ser Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn 1               5                   10                  15 Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro

        20                  25 (2)SEQ ID NO:12的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：4个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:

Gly Gly Gly Ser

1 (2)SEQ ID NO:13的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13: ACGTCCATGG CNTCNCCNGC NCCNCCTGCT TGTGCACTCC GAGTC 45 (2)SEQ ID NO:14的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14: ATGCACGAAT TCCCTGACGC AGAGGGTGGA 30 (2)SEQ ID NO:15的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15: TGACAAGCTT ACCTGACGCA GAGGGTGGAC CCT 33 (2)SEQ ID NO:16的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：10个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16: AATTCGGCAA 10 (2)SEQ ID NO:17的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：10个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17: CATGTTGCCG 10 (2)SEQ ID NO:18的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：13个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18: AATTCGGCGG CAA 13 (2)SEQ ID NO:19的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：13个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19: CATGTTGCCG CCG 13 (2)SEQ ID NO:20的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20: AATTCGGCGG CAACGGCGGC AA 22 (2)SEQ ID NO:21的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21: CATGTTGCCG CCGTTGCCGC CG 22 (2)SEQ ID NO:22的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22: CGATCCATGG AGGTTCACCC TTTGCCT 27 (2)SEQ ID NO:23的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23: GATCAAGCTT ATGGGCACTG GCTCAGTCT 29 (2)SEQ ID NO:24的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24: CGATACATGT TGCCTACACC TGTCCTG 27 (2)SEQ ID NO:25的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25: GATCAAGCTT AAGGGTGAAC CTCTGGGCA 29 (2)SEQ ID NO:26的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26: CGATCCATGG TCCTGCTGCC TGCTGTG 27 (2)SEQ ID NO:27的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27: GATCAAGCTT AAGGTGTAGG CAAAGGGTG 29 (2)SEQ ID NO:28的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:28: CGATCCATGG CTGTGGACTT TAGCTTGGGA 30 (2)SEQ ID NO:29的信息： (ⅰ)序列特性：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:29: GATCAAGCTT AAGGCAGCAG GACAGGTGT 29 (2)SEQ ID NO:30的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:30: CGATCCATGG ACTTTAGCTT GGGAGAA 27 (2)SEQ ID NO:31的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:31: GATCAAGCTT ACACAGCAGG CAGCAGGAC 29 (2)SEQ ID NO:32的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:32: CGATCCATGG GAGAATGGAA AACCCAG 27 (2)SEQ ID NO:33的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:33: GATCAAGCTT ACAAGCTAAA GTCCACAGC 29 (2)SEQ ID NO:34的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:34: CGATCCATGG GACCCACTTG CCTCTCA 27 (2)SEQ ID NO:35的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:35: GATCAAGCTT ACAGTTGTCC CCGTGCTGC 29 (2)SEQ ID NO:36的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:36: CAGTCCATGG GAACCCAGCT TCCTCCA 27 (2)SEQ ID NO:37的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:37: GATCAAGCTT AAAGGAGGCT CTGCAGGGC 29 (2)SEQ ID NO:38的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:38: CGATCCATGG GCAGGACCAC AGCTCAC 27 (2)SEQ ID NO:39的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:39: GATCAAGCTT ACTGTGGAGG AAGCTGGGTT 30 (2)SEQ ID NO:40的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

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(ⅰ)序列特性：

(A)长度：936个碱基对

(B)类型：核苷酸

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(ⅰ)序列特性：

(A)长度：939个碱基对

(B)类型：核苷酸

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(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

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(ⅰ)序列特性：

(A)长度：948个碱基对

(B)类型：核苷酸

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：993个碱基对

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    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

    (A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：993个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

    (A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：993个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：993个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

    (A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：1027个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

    (A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：1 55个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:161: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

            85                  90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

        100                 105                 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Glu Phe 145                 150                 155 (2)SEQ ID NO:162的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:162: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

            85                  90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

        100                 105                 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Glu Phe Gly Gly Asn Met Ala 145                 150                 155                 160 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu

            165                 170                 175 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        180                 185                 190 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    195                 200                 205 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

210                 215                 220 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 225                 230                 235                 240 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

            245                 250                 255 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Gly

        260                265                  270 Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Ash Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln

    275                 280                 285 His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser

290                 295                 300 Thr Leu Cys Val Arg 305 (2)SEQ ID NO:163的信息：

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：312个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:163: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

            85                  90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

        100                 105                 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Glu Phe Gly Asn Met Ala Ser 145                 150                155                  160 Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg

            165                 170                 175 Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His

        180                 185                 190 Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly

    195                 200                 205 Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly

210                 215                 220 Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu 225                 230                 235                 240 Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val

            245                 250                 255 Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro

        260                 265                 270 Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu

    275                 280                 285 Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val

290                 295                 300 Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 305                 310 (2)SEQ ID NO:164的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：313个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:164: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

           85                   90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

    100                     105                 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Glu Phe Gly Gly ASn Met Ala 145                 150                 155                 160 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu

            165                 170                 175 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        180                 185                 190 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    195                 200                 205 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

210                 215                 220 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 225                 230                 235                 240 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

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 290                 295                300 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 305                 310 (2)SEQ ID NO:165的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：316个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:165: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

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    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：302个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:166: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               3                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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    35                  40                  45 Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu

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290                 295                 300 (2)SEQ ID NO:167的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：317个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:167: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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            245                 250                 255 Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：302个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:168: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：317个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:169: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：302个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:170: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：317个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:171: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：302个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：317个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

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(ⅰ)序列特性：

(A)长度：302个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：317个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:175: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

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290                 295                 300 Thr 305 (2)SEQ ID NO:177的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：320个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:177: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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    275                 280                 285 Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg

290                 295                 300 Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr 305                 310                 315                 320 (2)SEQ ID NO:178的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

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290                 295                 300 Ser 305 (2)SEQ ID NO:179的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：320个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:179: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:180: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：320个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:181: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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(ⅰ)序列特性：

(A)长度：305个氨基酸

(B)类型：氨基酸

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：320个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:183: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:184: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

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290                 295                 300 Ala 305 (2)SEQ ID NO:185的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：320个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:185: Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser

        20                  25                  30 Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val

    35                  40                  45 Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu

50                  55                  60 Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg 65                  70                  75                  80 His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys

            85                  90                  95 Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Tyr

        100                 105                 110 Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser

    115                 120                 125 Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn

130                 135                 140 Met Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser 145                 150                 155                 160 His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu

            165                 170                 175 Ala Gln Pro Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe

        180                 185                 190 Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala

    195                 200                 205 Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu

210                 215                 220 Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu 225                 230                 235                 240 Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln

            245                 250                 255 Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu

        260                 265                 270 Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp

    275                 280                 285 Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly

290                 295                 300 Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala 305                 310                 315                 320 (2)SEQ ID NO:186的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：321个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:186: Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp 1               5                   10                  15 Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys

        20                  25                  30 Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln

    35                  40                  45 Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile

50                  55                  60 Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn

            85                  90                  95 Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro

        100                 105                 110 Ala Pro Leu Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser

    115                 120                 125 Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His

130                 135                 140 Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser 145                 150                 155                 160 Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln

            165                 170                 175 Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

        180                 185                 190 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu

    195                 200                 205 Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu

210                 215                 220 Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly 225                 230                 235                 240 His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln

            245                 250                 255 Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe

        260                 265                 270 Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu

    275                 280                 285 Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr

290                 295                 300 Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln 305                 310                 315                 320 Pro (2)SEQ ID NO:187的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：321个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:187: Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu 1               5                   10                  15 Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala

        20                  25                  30 Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr

    35                  40                  45 Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile

50                  55                  60 Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu 65                  70                  75                  80 Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp

            85                  90                  95 Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys

        100                 105                 110 Asn Leu Glu Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser

    115                 120                 125 Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His

130                135                  140 Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser 145                 150                 155                 160 Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln

            165                 170                 175 Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

        180                 185                 190 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu

    195                 200                 205 Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu

210                 215                 220 Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly 225                 230                 235                 240 His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln

            245                 250                 255 Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe

        260                 265                 270 Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu

    275                 280                 285 Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr

290                 295                 300 Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln 305                 310                 315                 320 Pro (2)SEQ ID NO:188的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：321个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:188: Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu 1               5                   10                  15 Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln

        20                  25                  30 Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile

    35                  40                  45 Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn

50                  55                  60 Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu 65                  70                  75                  80 Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala

            85                  90                  95 Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser

        100                 105                 110 Ala Thr Ala Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser

    115                 120                 125 Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His

130                  135                 140 Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser 145                 150                 155                 160 Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln

            165                 170                 175 Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

        180                 185                 190 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu

    195                 200                 205 Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu

210                 215                 220 Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly 225                 230                 235                 240 His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln

            245                 250                 255 Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe

        260                 265                 270 Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu

    275                 280                 285 Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr

290                 295                 300 Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln 305                 310                 315                 320 Pro (2)SEQ ID NO:189的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：321个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:189: Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val 1               5                   10                  15 Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser

        20                  25                  30 Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro

    35                  40                  45 Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met

50                  55                   60 Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val 65                  70                  75                  80 Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu

            85                  90                  95 Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile

        100                 105                 110 Ile Ile Lys Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser

    115                 120                 125 Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His

130                 135                 140 Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser 145                 150                 155                 160 Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln

            165                 170                 175 Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

        180                 185                 190 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu

    195                 200                 205 Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu

210                 215                 220 Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly 225                 230                 235                 240 His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln

            245                 250                 255 Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe

        260                 265                 270 Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu

    275                 280                 285 Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr

290                 295                 300 Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln 305                 310                 315                 320 Pro (2)SEQ ID NO:190的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：329个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:190: Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp  1              5                   10                  15 Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys

        20                  25                  30 Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln

    35                  40                  45 Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Sar Arg His Pro Ile Ile

50                  55                  60 Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Gly

            85                  90                  95 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ash Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile

        100                 105                 110 Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Tyr Val Glu Gly Gly

    115                 120                 125 Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro

130                 135                 140 Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln 145                 150                 155                 160 Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly

            165                 170                 175 Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg

        180                185                  190 Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly G1y Ser Gln

    195                 200                 205 Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp

210                 215                 220 Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His 225                 230                 235                 240 Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala

            245                 250                 255 Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu

        260                 265                 270 Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala

    275                 280                 285 Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln

290                 295                 300 Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu 305                 310                 315                 320 Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro

            325 (2)SEQ ID NO:191的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：329个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:191: Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu 1               5                   10                  15 Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala

        20                  25                  30 Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr

    35                  40                  45 Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

50                  55                  60 Gly Gly Gly Ser Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His 65                  70                  75                  80 Leu Lys Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp

            85                  90                  95 Glu Asp Val Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu

        100                 105                 110 Glu Ser Phe Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Tyr Val Glu Gly Gly

    115                 120                 125 Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro

130                 135                 140 Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr Gln 145                 150                 155                 160 Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly

            165                 170                 175 Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg

        180                 185                 190 Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln

    195                 200                 205 Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：329个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:195: Met Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys 1               5                   10                  15 Arg Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：329个氨基酸

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：329个氨基酸

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    (D)拓扑结构：线性

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50                  55                  60 Ile Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro 65                  70                  75                   80 Ser Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg

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    195                 200                 205                                                        Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp

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            325 (2)SEQ ID NO:199的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：319个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:199: Met Ala Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys 1               5                   10                  15 Gln Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp

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    35                  40                  45 Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser

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210                 215                 220 Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser 225                 230                 235                 240 Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：322个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:200: Met Ala Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys 1               5                   10                  15 Gln Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp

        20                  25                  30 Gln Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala

    35                  40                  45 Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser

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    115                 120                 125 Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser

130                 135                 140 Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 145                 150                 155                 160 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：319个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:201: Met Ala Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys 1               5                   10                  15 Gln Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp

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    35                  40                  45 Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser

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            85                  90                  95 Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln

        100                 105                 110 Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro

    115                 120                 125 Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser

130                 135                 140 Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 145                 150                 155                 160 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe

            165                 170                 175 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Ser Gly

        180                 185                 190 Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val

    195                 200                 205 Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala

210                 215                 220 Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser 225                 230                 235                 240 Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu

            245                 250                 255 Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr

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290                 295                 300 Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro 305                 310                 315 (2)SEQ ID NO:202的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：322个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:202: Met Ala Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys 1               5                   10                  15 Gln Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp

        20                  25                  30 Gln Asp Ile Leu Met Asp Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala

    35                  40                  45 Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser

50                  55                  60 Ile Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro 65                  70                  75                  80 Thr Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg

            85                  90                  95 Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln

        100                 105                 110 Gln Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro

    115                 120                 125 Ile Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser

130                 135                 140 Pro Asn Met Ala Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 145                 150                 155                 160 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe

            165                 170                 175 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Thr Pro

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    195                 200                 205 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys

210                 215                 220 Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu 225                 230                 235                 240 Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser

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        260                 265                 270 Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu

    275                 280                 285 Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala

290                 295                 300 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 305                 310                 315                 320 Gln Pro (2)SEQ ID NO:203的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:203: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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        100                 105                 110 Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile

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290                 295                 300 Cys Pro 305 (2)SEQ ID NO:204的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:204: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                      15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

        20                  25                      30 Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe

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50                  55                      60 Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser 65                  70                      75              80 Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu

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    115                     120             125 Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro

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        180                 185                 190 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

    195                 200                 205 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

210                 215                 220 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 225                 230                 235                 240 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

            245                 250                 255 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Glu Phe Gly Gly Asn Met Ala

        260                 265                 270 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu

    275                 280                 285 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

290                 295                 300 His Pro 305 2)SEQ ID NO:205的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:205: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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50                  55                  60 Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser 65                  70                  75                  80 Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu

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            245                 250                 255 Thr Leu Cys Val Arg Glu Phe Gly Gly Asn Met Ala Ser Pro Ala Pro

        260                 265                 270 Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His

    275                 280                 285 Val Leu His Ser Ar g Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro

290                  295                 300 Thr Pro 305 (2)SEQ ID NO:206的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:206: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

        20                  25                  30 Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe

    35                  40                  45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

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130                 135                 140 Asn Met Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu 145                 150                 155                 160 Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu

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    195                 200                 205 Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala

210                 215                 220 His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg 225                 230                 235                 240 Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val

            245                 250                 255 Arg Glu Phe Gly Gly Asn Met Ala Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp

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290                 295                 300 Leu Pro 305 (2)SEQ ID NO:207的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:207: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

        20                  25                  30 Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe

    35                  40                  45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

50                   55                 60 Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser 65                 70                   75                  80 Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu

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    115                 120                 125 Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro

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290                 295                 300 Ala Val 305 (2)SEQ ID NO:208的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:208: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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    35                  40                  45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

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        180                 185                 190 Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr

    195                 200                 205 Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala

210                 215                 220 Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu 225                 230                 235                 240 Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Glu Phe Gly Gly Asn

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290                 295                 300 Ser Leu 305 (2)SEQ ID NO:209的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:209: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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    35                  40                  45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

50                  55                  60 Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser 65                  70                  75                  80 Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu

            85                  90                  95 Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln

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290                 295                 300 Gln Leu 305 (2)SEQ ID NO:210的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:210: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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50                  55                  60 Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser 65                  70                  75                  80 Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu

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210                 215                 220 Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro 225                 230                 235                 240 Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr

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290                 295                 300 Leu Leu 305 (2)SEQ ID NO:211的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:211: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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            85                  90                  95 Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln

        100                 105                 110 Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile

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    195                 200                 205 Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His

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    275                 280                 285 Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro

290                 295                 300 Pro Gln 305 (2)SEQ ID NO:212的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:212: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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            245                 250                 255 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys

        260                 265                 270 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu

    275                 280                 285 Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg

290                 295                 300 Thr Thr 305 (2)SEQ ID NO:213的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:213: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

        20                  25                   30 Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe

    35                  40                  45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

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210                 215                  220 Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu 225                 230                 235                 240 Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu

            245                 250                 255 Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser

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    275                 280                 285 Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala

290                 295                 300 His Lys 305 (2)SEQ ID NO:214的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：306个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:214: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                       10              15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

        20                      25              30 Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe

    35                      40              45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

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210                 215                 220 Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys 225                 230                 235                 240 Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met

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290                 295                 300 Pro Asn 305 (2)SEQ ID NO:215的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:215: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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    195                 200                 205 Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu

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    275                 280                  285 Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys

290                 295                 300 Pro 305 (2)SEQ ID NO:216的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:216: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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    35                  40                  45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

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210                 215                 220 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 225                 230                 235                 240 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

            245                 250                 255 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Glu Phe Gly Asn Met Ala Ser

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290                 295                 300 Pro 305 (2)SEQ ID NO:217的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:217: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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210                 215                 220 Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln 225                 230                 235                 240 His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser

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290                 295                 300 Pro 305 (2)SEQ ID NO:218的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:218: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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    195                 200                 205 Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala

210                 215                 220 His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg 225                 230                 235                 240 Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val

            245                 250                 255 Arg Glu Phe Gly Asn Met Ala Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu

        260                 265                 270 Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg

    275                 280                 285 Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu

290                 295                 300 Pro 305 (2)SEQ ID NO:219的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:219: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               3                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

        20                  25                  30 Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe

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50                  55                  60 Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser 65                  70                  75                  80 Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu

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    195                 200                 205 Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys

210                 215                 220 Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys 225                 230                 235                 240 Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Glu

            245                 250                 255 Phe Gly Asn Met Ala Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

        260                 265                 270 Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser

    275                 280                 285 Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala

290                 295                 300 Val 305 (2)SEQ ID NO:220的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:220: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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    35                  40                  45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

50                  55                  60 Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser 65                  70                  75                  80 Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu

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    195                 200                 205 Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala

210                 215                 220 Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu 225                 230                 235                 240 Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Glu Phe Gly Asn Met

            245                 250                 255 Ala Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu

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    275                 280                 285 Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser

290                 295                 300 Leu 305 (2)SEQ ID NO:221的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:221: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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210                 215                 220 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 225                 230                 235                 240 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

            245                 250                 255 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

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    275                 280                 285 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln

290                 295                 300 Leu 305 (2)SEQ ID N0:222的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:222: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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    35                  40                  45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

50                  55                  60 Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser 65                  70                  75                  80 Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu

            85                  90                  95 Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln

        100                 105                 110 Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile

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        180                 185                 190 Phe Gly Asn Met Ala Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

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            245                 250                 255 Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met

        260                 265                 270 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

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290                 295                300 Leu 305 (2)SEQ ID NO:223的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:223: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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210                 215                 220 Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu 225                 230                 235                 240 Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala

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290                 295                 300 Gln 305 (2)SEQ ID NO:224的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:224: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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    35                  40                  45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

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290                 295                 300 Gln 305 (2)SEQ ID NO:225的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:225: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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210                 215                 220 Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu 225                 230                235                  240 Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：305个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:226: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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290                 295                 300 Asn 305 (2)SEQ ID NO:227的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:227: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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290                 295                 300 Pro Glu Val His Pro 305 (2)SEQ ID NO:228的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:228: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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290                 295                 300 Pro Glu Val His Pro 305 (2)SEQ ID NO:229的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:229: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:230: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:231: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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290                 295                 300 Leu Leu Pro Ala Val 305 (2)SEQ ID NO:232的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:232: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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290                 295                 300 Val Asp Phe Ser Leu 305 (2)SEQ ID NO:233的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:233: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                       10              15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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    275                 280                 285 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala

290                 295                 300 Ala Arg Gly Gln Leu 305 (2)SEQ ID NO:234的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:234: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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210                 215                 220 Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val 225                 230                 235                 240 Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met

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290                 295                 300 Leu Gln Ser Leu Leu 305 (2)SEQ ID NO:235的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:235: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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290                 295                 300 Gln Leu Pro Pro Gln 305 (2)SEQ ID NO:236的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:236: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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290                 295                 300 Gln Gly Arg Thr Thr 305 (2)SEQ ID NO:237的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:237: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  I5 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:238: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

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    195                 200                 205 Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu

210                 215                 220 Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu 225                 230                 235                 240 Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu

            245                 250                 255 Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser

        260                 265                 270 Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu

    275                 280                 285 Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala

290                 295                 300 His Lys Asp Pro Asn 305 (2)SEQ ID NO:239的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：302个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:239: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                      15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

        20                  25                      30 Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe

    35                  40                      45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

50                  55                      60 Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser 65                  70                      75              80 Arg His Pro Ile Ile Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu

            85                      90              95 Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln

        100                     105             110 Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile

    115                     120             125 Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro

130                     135             140 Asn Met Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg 145                     150             155                 160 Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val

                165             170                 175 Arg Glu Phe Gly Gly Asn Met Ala Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp

            180             185                 190 Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser

        195             200                 205 Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu

    210             215                 220 Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu 225                 230                 235                 240 Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu

            245                 250                 255 Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser

        260                 265                 270 Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu

    275                 280                 285 Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys

290                 295                 300 (2)SEQ ID NO:240的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：83个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:240: AATTCCGTCG TAAACTGACC TTCTATCTGA AAACCTTGGA GAACGCGCAG GCTCAACAGT 60 ACGTAGAGGG CGGTGGAGGC TCC 83 (2)SEQ ID NO:241的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：82个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

    (A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:241: CCGGGGAGCC TCCACCGCCC TCTACGTACT GTTGAGCCTG CGCGTTCTCC AAGTTTTCAG 60 ATAGAAGGTC AGTTTACGAC GG 82 (2)SEQ ID NO:242的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：8个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:242:

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1               5 (2)SEQ ID NO:243的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：12个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:243:

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1               5                   10 (2)SEQ ID NO:244的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：7个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:244:

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1               5 (2)SEQ ID NO:245的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：6个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:245:

Glu Phe Gly Asn Met Ala

1               5 (2)SEQ ID NO:246的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：7个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:246:

Glu Phe Gly Gly Asn Asn Ala

1               5 (2)SEQ ID NO:247的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：10个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:247:

Glu Phe Gly Gly Asn Gly Gly Asn Met Ala

1               5                   10 (2)SEQ ID NO:248的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：309个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:248: Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg 1               5                   10                  15 Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val

        20                  25                  30 Ser Ile Leu Met Asp Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe

    35                  40                  45 Val Arg Ala Val Lys Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile

50                  55                  60 Leu Arg Asn Leu Gln Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser 65                  70                  75                  80 Arg His Pro Ile Ile Leu Lys Ala Gly Asp Trp Gln Glu Phe Arg Glu

            85                  90                  95 Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Val Thr Leu Glu Gln Ala Gln Glu Gln Gln

        100                 105                 110 Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile

    115                 120                 125 Ser Thr Ile Asn Pro Ser Pro Pro Ser Lys Glu Ser His Lys Ser Pro

130                 135                 140 Asn Met Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 145                 150                 155                 160 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Asn Asp Ile Leu

            165                 170                 175 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln

        180                 185                  190 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

    195                 200                 205 Val Arg Leu LeuLeu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

210                215                 220 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 225                 230                 235                 240 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

            245                 250                 255 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Glu Phe Gly Gly Asn Gly Gly

        260                 265                 270 Asn Met Ala Ser Pro Ala Pro Pro Ala Ser Asp Leu Arg Val Leu Ser

    275                 280                 285 Lys Leu Leu Lys Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys

290                 295                 300 Pro Glu Val His Pro 305 (2)SEQ ID NO:249的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：459个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

    (A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:249: TCTCCCGCTC CGCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA AACTGCTTCG TGACTCCCAT 60 GTCCTTCACA GCAGACTGAG CCAGTGCCCA GAGGTTCACC CTTTGCCTAC ACCTGTCCTG 120 CTGCCTGCTG TGGACTTTAG CTTGGGAGAA TGGAAAACCC AGATGGAGGA GACCAAGGCA 180 CAGGACATTC TGGGAGCAGT GACCCTTCTG CTGGAGGGAG TGATGGCAGC ACGGGGACAA 240 CTGGGACCCA CTTGCCTCTC ATCCCTCCTG GGGCAGCTTT CTGGACAGGT CCGTCTCCTC 300 CTTGGGGCCC TGCAGAGCCT CCTTGGAACC CAGCTTCCTC CACAGGGCAG GACCACAGCT 360 CACAAGGATC CCAATGCCAT CTTCCTGAGC TTCCAACACC TGCTCCGAGG AAAGGTGCGT 420 TTCCTGATGC TTGTAGGAGG GTCCACCCTC TGCGTCAGG 459 (2)SEQ ID NO:250的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：447个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

    (A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:250: TCTCCCGCTC CGCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA AACTGCTTCG TGACTCCCAT 60 GTCCTTCACA GCAGACTGAG CCAGTGCCCA GAGGTTCACC CTTTGCCTAC ACCTGTCCTG 120 CTGCCTGCTG TGGACTTTAG CTTGGGAGAA TGGAAAACCC AGATGGAGGA GACCAAGGCA 180 CAGGACATTC TGGGAGCAGT GACCCTTCTG CTGGAGGGAG TGATGGCAGC ACGGGGACAA 240 CTGGGACCCA CTTGCCTCTC ATCCCTCCTG GGGCAGCTTT CTGGACAGGT CCGTCTCCTC 300 CTTGGGGCCC TGCAGAGCCT CCTTGGAACC CAGGGCAGGA CCACAGCTCA CAAGGATCCC 360 AATGCCATCT TCCTGAGCTT CCAACACCTG CTCCGAGGAA AGGTGCGTTT CCTGATGCTT 420 GTAGGAGGGT CCACCCTCTG CGTCAGG 447 (2)SEQ ID NO:251的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：459个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:251: TCCCCAGCGC CGCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA AACTGCTTCG TGACTCCCAT 60 GTCCTTCACA GCAGACTGAG CCAGTGCCCA GAGGTTCACC CTTTGCCTAC ACCTGTCCTG 120 CTGCCTGCTG TGGACTTTAG CTTGGGAGAA TGGAAAACCC AGATGGAGGA GACCAAGGCA 180 CAGGACATTC TGGGAGCAGT GACCCTTCTG CTGGAGGGAG TGATGGCAGC ACGGGGACAA 240 CTGGGACCCA CTTGCCTCTC ATCCCTCCTG GGGCAGCTTT CTGGACAGGT CCGTCTCCTC 300 CTTGGGGCCC TGCAGAGCCT CCTTGGAACC CAGCTTCCTC CACAGGGCAG GACCACAGCT 360 CACAAGGATC CCAATGCCAT CTTCCTGAGC TTCCAACACC TGCTCCGAGG AAAGGTGCGT 420 TTCCTGATGC TTGTAGGAGG GTCCACCCTC TGCGTCAGG 459 (2)SEQ ID NO:252的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：153个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:252: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

            85                  90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

        100                 105                 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 145                 150 (2)SEQ ID NO:253的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：149个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:253: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

            85                  90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Gly

        100                 105                 110 Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln

    115                 120                 125 His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser

130                 135                 140 Thr Leu Cys Val Arg 145 (2)SEQ ID NO:254的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：153个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO:254: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

            85                  90                  95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu

        100                 105                 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 145                 150 (2)SEQ ID NO:255的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：64个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

    (A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:255: GGATCCACCA TGAGCCGCCT GCCCGTCCTG CTCCTGCTCC AACTCCTGGT CCGCCCCGCC 60 ATGG 64 (2)SEQ ID NO:256的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：153个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：未知

    (D)拓扑结构：未知

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：修饰位点

    (B)位置：112

    (D)其他信息：/注释=“在第112位缺失或是Leu、Ala、

                   Val、Ile、Pro、Phe、Trp或Met”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：113

(D)其他信息：/注释=“在第113位缺失或是Pro、Phe、

              Ala、Val、Leu、Ile、Trp或Met” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：114

(D)其他信息：/注释=“在第114位缺失或是Pro、Phe、

              Ala、Val、Leu、Ile、Trp或Met” (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：115

(D)其他信息：/注释=“在第115位缺失或是Gln、Gly、

              Ser、Thr、Tyr或Asn” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:256: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val

        20                  25                  30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

    35                  40                  45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu

50                  55                  60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65                  70                  75                  80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln

            85                  90                   95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Xaa

        100                 105                 110 Xaa Xaa Xaa Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe

    115                 120                 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

130                 135                 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 145                 150 (2)SEQ ID NO:257的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：464个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核苷酸

    (A)描述：/desc=“DNA(合成物)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:257: CCATGGCTAA CTGCTCTATA ATGATCGATG AAATTATACA TCACTTAAAG AGACCACCTG 60 CACCTTTGCT GGACCCGAAC AACCTCAATG ACGAAGACGT CTCTATCCTG ATGGATCGAA 120 ACCTTCGACT TCCAAACCTG GAGAGCTTCG TAAGGGCTGT CAAGAACTTA GAAAATGCAT 180 CAGGTATTGA GGCAATTCTT CGTAATCTCC AACCATGTCT GCCCTCTGCC ACGGCCGCAC 240 CCTCTCGACA TCCAATCATC ATCAAGGCAG GTGACTGGCA AGAATTCCGG GAAAAACTGA 300 CGTTCTATCT GGTTACCCTT GAGCAAGCGC AGGAACAACA GTACGTAGAG GGCGGTGGAG 360 GCTCCCCGGG TGAACCGTCT GGTCCAATCT CTACTATCAA CCCGTCTCCT CCGTCTAAAG  420 AATCTCATAA ATCTCCAAAC ATGTAAGGTA CCGCATGCAA GCTT 464 (2)SEQ ID NO:258的信息：

(ⅰ)序列特性：

    (A)长度：419个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：其他核苷酸

(A)描述：/desc=“DNA(合成物)” (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:258: CCATGGCTAA CTGCTCTATA ATGATCGATG AAATTATACA TCACTTAAAG AGACCACCTG 60 CACCTTTGCT GGACCCGAAC AACCTCAATG ACGAAGACGT CTCTATCCTG ATGGATCGAA 120 ACCTTCGACT TCCAAACCTG GAGAGCTTCG TAAGGGCTGT CAAGAACTTA GAAAATGCAT 180 CAGGTATTGA GGCAATTCTT CGTAATCTCC AACCATGTCT GCCCTCTGCC ACGGCCGCAC 240 CCTCTCGACA TCCAATCATC ATCAAGGCAG GTGACTGGCA AGAATTCCGG GAAAAACTGA 300 CGTTCTATCT GGTTACCCTT GAGCAAGCGC AGGAACAACA GTACGTAGAG GGCGGTGGAG 360 GCTCCCCGGG TGGTGGTTCT GGCGGCGGCT CCAACATGTA AGGTACCGCA TGCAAGCTT 419