用于过继细胞疗法的工程化细胞的产生
阅读：231发布：2020-09-27
专利汇可以提供用于过继细胞疗法的工程化细胞的产生专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于基因工程化细胞的方法，包括用于与基因工程化结合使用的细胞。在一些实施方案中，所提供的方法包括通过与逆转录病毒载体粒子例如慢病毒载体一起孵育来转导细胞，其中在孵育之前，细胞未与激活剂或刺激剂一起孵育，例如未与抗CD3/抗CD28 抗体 和/或一种或多种重组细胞因子一起孵育。在一些实施方案中，此类方法产生与缩短或改进基因工程化细胞的过程相关的特征。还提供了用重组或异源基因转导的所得细胞及其组合物，所述重组或异源基因例如是编码嵌合受体(例如嵌合 抗原 受体)或其他重组抗原受体(例如转基因T细胞受体)的基因。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物可用于过继免疫疗法的方法中。，下面是用于过继细胞疗法的工程化细胞的产生专利的具体信息内容。
1.一种转导T细胞的方法，所述方法包括孵育包含重组核酸的病毒载体粒子和包含多个T细胞的输入组合物，所述多个T细胞已经从受试者的样品获得，其中：
所述孵育是在从所述受试者获得所述样品后不超过24小时开始；和/或在从所述受试者获得所述样品后，在所述孵育之前，所述T细胞未经历高于或高于约15℃、约18℃、约22℃或约25℃的温度持续超过1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时的时间；和/或
在从所述受试者获得所述样品后，在所述孵育之前，所述T细胞未经历为、为约、高于或高于约37°±2.0℃的温度持续超过15分钟、30分钟、1小时或2小时的时间。
2.权利要求1的方法，其中所述孵育是在从所述受试者获得所述样品后不超过或不超过约1小时、3小时、6小时、12小时或18小时开始。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中，在所述孵育之前，所述方法不包括在促进细胞激活的条件下刺激所述T细胞。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中，在所述孵育之前，所述输入组合物未经历离体刺激，所述离体刺激包括在高于或高于约37°±2.0℃下孵育，和/或在能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一种或多种药剂的存在下孵育，在能够通过TCR复合物诱导信号的一种或多种药剂的存在下孵育，和/或在能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的一种或多种药剂的存在下孵育；CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中，在所述孵育之前，不超过5％、10％、20％、30％或40％的所述T细胞是激活细胞，表达选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的表面标记；包含选自IL-2、IFN-γ、TNF-α的细胞因子的细胞内表达，处于细胞周期的G1期或较后期，和/或能够增殖。
6.一种转导T细胞的方法，所述方法包括孵育包含重组核酸的病毒载体粒子和包含T细胞的输入组合物，所述T细胞已经从受试者的样品获得，其中，在所述孵育之前，所述T细胞或输入组合物未经历离体刺激，所述离体刺激包括在高于或高于约37°±2.0℃下孵育，和/或在能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一种或多种药剂的存在下孵育，在能够通过TCR复合物诱导信号的一种或多种药剂的存在下孵育，和/或在能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的一种或多种药剂的存在下孵育；CD3结合分子；CD28结合分子；
重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7。
7.权利要求4或权利要求6的方法，其中所述一种或多种药剂包含抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。
8.一种转导T细胞的方法，所述方法包括孵育包含重组核酸的病毒载体粒子和包含T细胞的输入组合物，所述T细胞已经从受试者的样品获得，其中，在所述孵育之前，不超过5％、
10％、20％、30％或40％的所述T细胞是激活细胞，表达选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的表面标记；包含选自IL-2、IFN-γ、TNF-α的细胞因子的细胞内表达，和/或处于细胞周期的G1期或较后期。
9.权利要求5或权利要求8的方法，其中在即将进行所述孵育之前，所述输入组合物中不超过10％的T细胞包含选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的T细胞激活标记。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中，在所述孵育之前，大于5％、10％、20％、30％或
40％的所述T细胞表达低密度脂质受体(LDL-R)。
11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述受试者是人。
12.权利要求1-8中任一项的方法，其中在所述孵育之前，T细胞尚未和/或没有被维持在2℃至8℃的温度下持续超过48小时。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述样品是血液样品。
14.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述样品是白细胞分离术样品。
15.权利要求1-14的方法，其中所述T细胞是未分级的T细胞，是富集或分离的CD3+T细胞，是富集或分离的CD4+T细胞或者是富集或分离的CD8+T细胞。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中已经从来自所述受试者的所述样品选择或富集所述T细胞。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其还包括，在所述孵育之前，从所述受试者获得所述样品，并且任选地，从所述样品选择或富集所述T细胞，从而任选地产生富集的组合物和/或产生所述输入组合物。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述输入组合物中T细胞的百分比是大于或大于约75％、80％、85％、90％、95％T细胞。
19.权利要求3-18中任一项的方法，其中所述T细胞包含CD4+或CD8+细胞。
20.权利要求3-18中任一项的方法，其中所述T细胞包含CD4+和CD8+细胞。
21.权利要求20的方法，其中所述CD4+细胞与所述CD8+细胞的比率为或为约1:1、1:2、
2:1、1:3或3:1。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中：
所述样品包含血清或血浆，所述血清或血浆的浓度为至少或至少约10％(v/v)、至少或至少约15％(v/v)、至少或至少约20％(v/v)、至少或至少约25％(v/v)、至少或至少约30％(v/v)、至少或至少约33％(v/v)、至少或至少约35％(v/v)、或至少或至少约40％(v/v)；和/或
在所述孵育之前，所述样品已经与血清或血浆离体接触，所述血清或血浆的浓度为至少或至少约10％(v/v)、至少或至少约15％(v/v)、至少或至少约20％(v/v)、至少或至少约
25％(v/v)、至少或至少约30％(v/v)、至少约或至少约33％(v/v)、至少或至少约35％(v/v)、或至少或至少约40％(v/v)。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中：
所述样品包含血清或血浆，所述血清或血浆的浓度为至少或至少约30％(v/v)；和/或在所述孵育之前，所述样品已经与血清或血浆离体接触，所述血清或血浆的浓度为至少或至少约30％(v/v)。
24.权利要求22或权利要求23的方法，其中所述血清或血浆是人血清或血浆。
25.权利要求22-24中任一项的方法，其中所述血清或血浆对于所述受试者是自体的。
26.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述样品包含抗凝血剂。
27.权利要求26的方法，其中所述抗凝血剂包含游离柠檬酸根离子。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中，在所述孵育之前，所述方法包括在冷冻保护剂的存在下冷冻保存所述T细胞，任选所述样品或所述富集的组合物中的T细胞，从而产生冷冻保存的组合物。
29.权利要求28的方法，其中，在所述孵育之前，在减少或去除所述冷冻保护剂和/或产生所述输入组合物的条件下洗涤所述冷冻保存的组合物。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述输入组合物包含N-乙酰半胱氨酸(NAC)；
血清，任选人血清；重组白细胞介素-2(IL-2)、重组白细胞介素-15(IL-15)和/或重组白细胞介素-7(IL-7)。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中：
所述输入组合物包含N-乙酰半胱氨酸，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为或为约0.4mg/mL至4mg/mL、0.8mg/mL至3.6mg/mL或1.6mg/mL至2.4mg/mL，每个都包含端值；或者所述输入组合物包含N-乙酰半胱氨酸，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为至少或至少约或约0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8g/mL、3.2mg/mL、
3.6mg/mL或4.0mg/mL。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中：
所述输入组合物包含血清，任选人血清，所述血清的浓度为或为约0.5％至25％(v/v)、
1.0％至10％(v/v)或2.5％至5.0％(v/v)，每个都包含端值；或者
所述输入组合物包含血清，任选人血清，所述血清的浓度为至少或至少约或约0.5％、
1％、2.5％、5％(v/v)或10％。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中：
所述输入组合物包含重组IL-2，任选重组人IL-2，所述重组IL-2的浓度为或为约10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL或500IU/mL；和/或所述输入组合物包含重组IL-15，任选重组人IL-15，所述重组IL-15的浓度为或为约
1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL或5IU/mL至10IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL或50IU/mL；和/或
所述输入组合物包含重组IL-7，任选重组人IL-7，所述重组IL-7的浓度为或为约50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL至200IU/mL至600IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、
700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL或1000IU/mL。
34.权利要求1-33中任一项的方法，其中所述孵育包括将所述病毒载体粒子与所述输入组合物一起旋转接种的步骤。
35.权利要求34的方法，其中旋转接种包括在离心室的内腔中旋转所述病毒载体粒子和所述输入组合物，其中所述旋转是在所述空腔的侧壁内表面处按以下相对离心力进行：
在或在约500g与2500g之间、500g与2000g之间、500g与1600g之间、500g与1000g之间、
600g与1600g之间、600g与1000g之间、1000g与2000g之间或1000g与1600g之间，每个都包含端值；或者
至少或至少约600g、800g、1000g、1200g、1600g或2000g。
36.权利要求34或权利要求35的方法，其中旋转接种进行以下时间：
大于或约5分钟、大于或约10分钟、大于或约15分钟、大于或约20分钟、大于或约30分钟、大于或约45分钟、大于或约60分钟、大于或约90分钟或大于或约120分钟；或者在或在约5分钟与60分钟之间、10分钟与60分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与
45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值。
37.权利要求1-36中任一项的方法，其还包括使所述输入组合物和/或所述病毒载体粒子与转导佐剂接触。
38.权利要求37的方法，其中所述接触是在将所述病毒载体粒子与所述输入组合物一起旋转接种之前、同时或之后进行。
39.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述孵育的至少一部分是在或在约37℃±2℃下进行。
40.权利要求34-39中任一项的方法，其中所述孵育的至少一部分是在所述旋转接种后进行。
41.权利要求39或权利要求40的方法，其中所述孵育的至少一部分进行不超过或不超过约2小时、4小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时或72小时。
42.权利要求39-41中任一项的方法，其中所述孵育的至少一部分进行24小时或约24小时。
43.权利要求1-42中任一项的方法，其中所述孵育的总持续时间不超过12小时、24小时、36小时、48小时或72小时。
44.权利要求1-43中任一项的方法，其中所述病毒载体粒子是慢病毒载体粒子。
45.权利要求44的方法，其中所述慢病毒载体粒子源自HIV-1。
46.权利要求1-45中任一项的方法，其中将所述病毒载体粒子用病毒包膜糖蛋白假型化。
47.权利要求46的方法，其中所述病毒包膜糖蛋白是VSV-G。
48.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述病毒载体粒子包含展现SAMHD1抑制活性的慢病毒蛋白，所述蛋白质包装在所述病毒粒子中。
49.权利要求48的方法，其中所述SAMHD1抑制蛋白是野生型Vpx蛋白、野生型Vpr蛋白、或野生型Vpx或Vpr蛋白的展现SAMHD1抑制活性的变体或部分。
50.权利要求48或权利要求49的方法，其中所述SAMHD1抑制蛋白对于所述逆转录病毒载体粒子是异源的。
51.权利要求48-50中任一项的方法，其中所述SAMHD1抑制蛋白是野生型Vpx蛋白或者是野生型Vpx蛋白的展现SAMHD1抑制活性的变体或部分。
52.权利要求1-51中任一项的方法，其中将所述病毒载体粒子在小于或小于约20.0或者小于或小于约10.0的感染复数下孵育。
53.权利要求1-52中任一项的方法，其中：
将所述病毒载体粒子在为或为约1.0IU/细胞至10IU/细胞或2.0U/细胞至5.0IU/细胞的感染复数下孵育；或者
将所述病毒载体粒子在至少或至少约1.6IU/细胞、1.8IU/细胞、2.0IU/细胞、2.4IU/细胞、2.8IU/细胞、3.2IU/细胞或3.6IU/细胞、4.0IU/细胞、5.0IU/细胞、6.0IU/细胞、7.0IU/细胞、8.0IU/细胞、9.0IU/细胞或10.0IU/细胞的感染复数下孵育。
54.权利要求1-53中任一项的方法，其中所述输入组合物包含至少为或约至少或约50x
106个细胞、100x 106个细胞或200x 106个细胞。
55.权利要求1-54中任一项的方法，其中所述重组核酸编码抗原受体。
56.权利要求55的方法，其中所述抗原受体是转基因T细胞受体(TCR)。
57.权利要求55或权利要求56的方法，其中所述抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
58.权利要求57的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至靶抗原的细胞外抗原识别结构域和包含ITAM的细胞内信号传导结构域。
59.权利要求58的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内结构域。
60.权利要求58或权利要求59的方法，其还包括连接所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
61.权利要求60的方法，其中所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分。
62.权利要求58-61中任一项的方法，其中所述细胞内信号传导结构域还包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域。
63.权利要求62的方法，其中所述T细胞共刺激分子选自CD28和41BB。
64.权利要求55-63中任一项的方法，其中所述抗原受体特异性地结合至与疾病或病症相关的抗原或特异性地结合至通用标签。
65.权利要求64的方法，其中所述疾病或病症是癌症、和自身免疫性疾病或障碍、或感染性疾病。
66.权利要求1-65中任一项的方法，其中所述方法产生输出组合物，所述输出组合物包含用所述重组核酸转导的T细胞。
67.权利要求66的方法，其中所述输出组合物中至少30％、或至少40％、至少50％、至少
60％、至少70％或至少80％的所述T细胞是用所述重组核酸转导。
68.权利要求66或权利要求67的方法，其还包括从所述输出组合物回收或分离通过所述方法产生的转导的T细胞。
69.权利要求66或权利要求68的方法，其还包括激活或扩增所述输出组合物的所述细胞或通过所述方法转导的所述细胞。
70.权利要求69的方法，其中激活和/或扩增是离体进行的。
71.权利要求69或权利要求70的方法，其中，在所述孵育后，将所述输出组合物中的所述细胞在能够激活T细胞、通过TCR复合物诱导信号和/或诱导T细胞增殖的一种或多种刺激剂的存在下进一步孵育。
72.权利要求71的方法，其中所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；
重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7。
73.权利要求71或权利要求72的方法，其中所述一种或多种刺激剂包含抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。
74.权利要求69的方法，其中激活和/或扩增是在体内进行的。
75.权利要求69或权利要求74的方法，其中激活和/或扩增是在由所述抗原受体特异性结合的抗原的存在下进行和/或是转基因特异性的。
76.权利要求72或权利要求75的方法，其中，在所述孵育之后，所述输出组合物中的所述细胞未在一种或多种刺激剂的存在下进一步离体孵育，所述一种或多种刺激剂任选地由以下组成：CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7，和/或所述输出组合物中的所述细胞未在高于30℃的温度下进一步孵育超过24小时。
77.一种通过权利要求1-76中任一项的方法产生的基因工程化T细胞。
78.一种组合物，其包含权利要求77的基因工程化T细胞和药学上可接受的载体。
79.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予权利要求78的组合物。
80.权利要求79的方法，其中在从所述受试者获得所述样品后不超过5天，将所述组合物给予至所述受试者。
81.权利要求80的方法，其中在从所述受试者获得所述样品后不超过1天、2天、3天或4天，将所述组合物给予至所述受试者。
82.一种用于过继细胞疗法的方法，其包括：
(a)从获自患有疾病或病症的受试者的样品富集或分离T细胞；
(b)通过权利要求1-71中任一项的方法用病毒载体粒子转导包含所述T细胞的输入组合物，从而产生包含转导的细胞的输出组合物，其中所述病毒载体粒子包含编码抗原受体的重组核酸，所述抗原受体特异性地结合至与所述疾病或障碍相关的抗原；
(c)将包含所述转导的细胞的所述输出组合物给予至所述受试者以治疗所述疾病或病症，其中在从所述受试者获得所述样品后不超过9天，将所述输出组合物给予至所述受试者。
83.一种过继细胞疗法的方法，其包括将包含用重组核酸转导的T细胞的输出组合物给予至受试者以治疗疾病或病症，其中所述输出组合物是通过权利要求1-71中任一项的方法产生的。
84.权利要求82或权利要求83的方法，其中在从所述受试者获得所述样品后不超过1天、2天、3天、4天或5天，将所述输出组合物给予至所述受试者。
85.权利要求82-84中任一项的方法，其中在给予所述组合物之前，将所述转导的细胞或所述输出组合物的所述细胞配制于药学上可接受的缓冲液中。
86.权利要求82-85中任一项的方法，其中，在所述转导后，在给予包含转导的细胞的所述输出组合物之前，将所述细胞离体培养长达24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或9天，所述培养在高于30℃的温度下进行。
87.权利要求82-86中任一项的方法，其中，在所述转导后，将所述输出组合物或包含所述转导的细胞的细胞在能够激活T细胞、通过TCR复合物诱导信号和/或诱导T细胞增殖的一种或多种刺激剂的存在下培养，从而产生包含所述转导的细胞的组合物。
88.权利要求82-85中任一项的方法，其中，在给予所述转导的细胞之前，所述输出组合物或包含所述转导的细胞的细胞未在一种或多种刺激剂的存在下进一步离体孵育，和/或未在高于30℃的温度下进一步孵育超过24小时。
89.权利要求87或权利要求88的方法，其中所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；
CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7，包含由所述抗原受体特异性识别的抗原的疫苗，和特异性地结合所述抗原受体的抗独特型抗体。
90.权利要求89的方法，其中所述一种或多种刺激剂包含抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。
91.权利要求82-90中任一项的方法，其中所述输出组合物的所述细胞或所述转导的细胞是以次最佳剂量给予。
92.权利要求82-91中任一项的方法，其还包括向所述受试者给予用以在体内诱导或增强所述转导的T细胞的刺激和/或扩增的一种或多种药剂。
93.权利要求92的方法，其中所述一种或多种药剂是转基因特异性的和/或通过所表达的转基因刺激或激活所述细胞，所述所表达的转基因任选地是或包含抗原受体。
94.权利要求92或权利要求93的方法，其中所述一种或多种药剂选自包含由所述抗原受体特异性识别的抗原的疫苗、特异性地结合所述抗原受体的抗独特型抗体或能够化学诱导所述抗原受体的二聚化的药剂。
95.权利要求92的方法，其中所述一种或多种药剂是免疫调节剂；免疫检查点抑制剂；
细胞外腺苷或腺苷受体、任选A2aR受体的抑制剂；犬尿氨酸途径调节剂和信号传导途径的调节剂，例如激酶抑制剂。
96.一种组合物，其包含原代人T细胞群，所述原代人T细胞群被基因工程化以表达特异性地结合至靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)或转基因TCR，其中：
所述群体包含多个静息T细胞；和
所述多个静息T细胞占所述组合物中所述基因工程化细胞的至少7.5％。
97.权利要求96的组合物，其中所述基因工程化静息T细胞占所述组合物中所述基因工程化细胞的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少
80％或至少90％。
98.权利要求96或权利要求97的组合物，其中所述静息T细胞针对选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L(CD154)和4-1BB(CD137)的T细胞激活标记是表面阴性的；缺乏选自IL-2、IFN-γ和TNF-α的细胞因子的细胞内表达；处于细胞周期的G0或G0G1a期；和/或含有活性SAMHD1。
99.权利要求98的组合物，其中所述静息T细胞针对CD25和CD69是表面阴性的(CD25-/CD69-)。
100.权利要求96-99中任一项的组合物，其中所述静息T细胞包含CD4+和/或CD8+T细胞。
101.权利要求96-100中任一项的组合物，其中所述靶抗原与疾病或障碍相关。
102.权利要求100的组合物，其中所述疾病或障碍是感染性疾病或病症、自身免疫性疾病、炎性疾病或癌症。
103.权利要求96-102中任一项的组合物，其中所述靶抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-
13R-α2、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
104.权利要求96-103中任一项的组合物，其中所述原代人T细胞被基因工程化以表达CAR，所述CAR包含特异性地结合至靶抗原的细胞外抗原识别结构域和包含ITAM的细胞内信号传导结构域。
105.权利要求104的组合物，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内结构域。
106.权利要求104或权利要求105的组合物，其中所述CAR还包含连接所述细胞外结构域和所述细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
107.权利要求106的组合物，其中所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分。
108.权利要求104-107中任一项的组合物，其中所述CAR的所述细胞内信号传导结构域还包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域。
109.权利要求108的组合物，其中所述T细胞共刺激分子选自CD28和41BB。
110.权利要求96-108中任一项的组合物，其包含药学上可接受的载体。
用于过继细胞疗法的工程化细胞的产生
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2016年12月5日提交的标题为“用于过继细胞疗法的工程化细胞的产生(Production of Engineered Cells for Adoptive Cell Therapy)”的美国临时申请号62/430,349的优先权，将其内容通过引用以其全文并入。
[0004] 将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其全文并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：735042005040SeqList.txt，创建日期：2017年11月28日，大小：50,233字节)。
技术领域
[0005] 本公开文本提供了基因工程化细胞的方法，包括与过继细胞疗法结合使用的细胞。在一些实施方案中，所提供的方法包括通过与逆转录病毒载体粒子例如慢病毒载体一起孵育来转导细胞，其中在孵育之前，细胞未与激活剂或刺激剂一起孵育，例如未与抗CD3/抗CD28抗体和/或一种或多种重组细胞因子一起孵育。在一些实施方案中，此类方法产生与缩短或改进基因工程化细胞的过程相关的特征。还提供了用重组或异源基因转导的所得细胞及其组合物，所述重组或异源基因例如是编码嵌合受体(例如嵌合抗原受体)或其他重组抗原受体(例如转基因T细胞受体)的基因。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物可用于过继免疫疗法的方法中。
背景技术
[0006] 有多种策略可用于体外转导T细胞群，包括用于体外转导抗原特异性T细胞以用于过继细胞免疫疗法或癌症疗法。在体外转导细胞群需要改进的策略，包括用于研究、诊断和治疗目的。提供了满足此类需求的试剂、方法、制品和试剂盒。发明内容
[0007] 本文提供了转导T细胞的方法，其包括孵育含有重组核酸的病毒载体粒子和含有多个T细胞的输入组合物，所述多个T细胞是从含有源自受试者的细胞的样品获得的，其中所述孵育是在从受试者获得样品后不超过24小时开始；和/或在从受试者获得样品后，在孵育之前，T细胞未经历高于或高于约15℃、约18℃、约22℃或约25℃的温度持续超过1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时的时间；和/或在从受试者获得样品后，在孵育之前，T细胞未经历约、大于或大于约37°±2.0℃的温度持续超过15分钟、30分钟、1小时或2小时的时间。在一些实施方案中，在从受试者获得样品后不超过或不超过约1小时、3小时、6小时、12小时或18小时，开始孵育。
[0008] 在一些任何此类实施方案中，在所述孵育之前，所述方法不包括在促进细胞激活的条件下刺激T细胞。在一些任何此类实施方案中，在所述孵育之前，输入组合物未进行离体刺激，所述离体刺激包括在高于或高于约37°±2.0℃下孵育和/或在能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一种或多种药剂的存在下孵育，在能够通过TCR复合物诱导信号的一种或多种药剂的存在下孵育和/或在能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的一种或多种药剂的存在下孵育；CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7。
[0009] 在一些任何此类实施方案中，在所述孵育之前，不超过5％、10％、20％、30％或40％的T细胞是激活细胞，表达选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的表面标记；包括选自IL-2、IFN-γ、TNF-α的细胞因子的细胞内表达，处于细胞周期的G1期或较后期，和/或能够增殖。
[0010] 在一些任何此类实施方案中，所述方法包括孵育含有重组核酸的病毒载体粒子和含有T细胞的输入组合物，所述T细胞已经从受试者的样品获得，其中，在所述孵育之前，T细胞或输入组合物未进行离体刺激，包括在高于或高于约37°±2.0℃下孵育和/或在能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一种或多种药剂的存在下孵育，在能够通过TCR复合物诱导信号的一种或多种药剂的存在下孵育和/或在能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的一种或多种药剂的存在下孵育；CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7。
[0011] 在一些任何此类实施方案中，一种或多种药剂含有抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。
[0012] 还提供了转导T细胞的方法，包括孵育含有重组核酸的病毒载体粒子和含有T细胞的输入组合物，所述T细胞是从受试者的样品获得的，其中，在孵育之前，不超过5％、10％、20％、30％或40％的T细胞是激活细胞，表达选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的表面标记；包括选自IL-2、IFN-γ、TNF-α的细胞因子的细胞内表达，和/或处于细胞周期的G1期或较后期。
[0013] 在一些任何此类实施方案中，在即将孵育之前，输入组合物中不超过10％的T细胞含有选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的T细胞激活标记。在一些任何此类实施方案中，在所述孵育之前，大于5％、10％、20％、30％或40％的T细胞表达低密度脂质受体(LDL-R)。
[0014] 在一些任何此类实施方案中，受试者是人。
[0015] 在一些任何此类实施方案中，T细胞在孵育前超过48小时内未经过和/或未被维持在2℃至8℃的温度下。
[0016] 在一些任何此类实施方案中，样品是血液样品。在一些任何此类实施方案中，样品是白细胞分离术样品。
[0017] 在一些任何此类实施方案中，T细胞是未分级的T细胞，是富集或分离的CD3+T细胞，是富集或分离的CD4+T细胞，或是富集或分离的CD8+T细胞。在一些任何此类实施方案中，已从来自受试者的样品选择或富集T细胞，这在一些方面产生富集的组合物和/或产生输入组合物。
[0018] 在一些任何此类实施方案中，所述方法还包括在孵育之前，从受试者获得样品，并任选地从样品选择或富集T细胞，这在一些方面产生富集的组合物和/或产生输入组合物。在一些情况下，输入组合物中T细胞的百分比大于或大于约75％、80％、85％、90％、95％T细胞。
[0019] 在一些任何此类实施方案中，T细胞含有CD4+或CD8+细胞。在一些实施方案中，T细胞含有CD4+和CD8+细胞。在一些情况下，CD4+细胞与CD8+细胞的比率是或是约1:1、1:2、2:1、1:3或3:1。
[0020] 在一些任何此类实施方案中，样品含有血清或血浆，所述血清或血浆的浓度为至少或至少约10％(v/v)、至少或至少约15％(v/v)、至少或至少约20％(v/v)、至少或至少约25％(v/v)、至少或至少约30％(v/v)、至少或至少约33％(v/v)、至少或至少约35％(v/v)、或至少或至少约40％(v/v)；和/或在孵育之前，样品已经与血清或血浆离体接触，所述血清或血浆的浓度为至少或至少约10％(v/v)、至少或至少约为15％(v/v)、至少或至少约20％(v/v)、至少或至少约25％(v/v)、至少或至少约30％(v/v)、至少或至少约33％(v/v)、至少或至少约35％(v/v)、或至少或至少约40％(v/v)。
[0021] 在一些任何此类实施方案中，样品含有浓度为至少或至少约30％(v/v)的血清或血浆；和/或在孵育之前，样品已经与浓度为至少或至少约30％(v/v)的血清或血浆离体接触。在一些方面，血清或血浆是人血清或血浆。在一些情况下，血清或血浆对受试者是自体的。
[0022] 在一些任何此类实施方案中，样品含有抗凝血剂和/或在孵育前，样品中添加了抗凝血剂。在一些情况下，抗凝血剂含有游离柠檬酸根离子。
[0023] 在一些任何此类实施方案中，在孵育之前，所述方法包括在冷冻保护剂的存在下冷冻保存T细胞，任选样品或富集的组合物中的T细胞，从而产生冷冻保存的组合物。在一些方面，在孵育之前，所述方法包括在减少或去除冷冻保护剂和/或产生输入组合物的条件下洗涤冷冻保存的组合物。
[0024] 在一些任何此类实施方案中，输入组合物含有N-乙酰半胱氨酸(NAC)；血清，任选人血清；重组白细胞介素-2(IL-2)、重组白细胞介素-15(IL-15)和/或重组白细胞介素-7(IL-7)。
[0025] 在一些任何此类实施方案中，输入组合物含有N-乙酰半胱氨酸，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为或为约0.4mg/mL至4mg/mL、0.8mg/mL至3.6mg/mL或1.6mg/mL至2.4mg/mL，每个都包含端值；或输入组合物含有N-乙酰半胱氨酸，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为至少或至少约0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL或4.0mg/mL。在一些任何此类实施方案中，输入组合物含有血清，任选人血清，所述血清的浓度为或为约0.5％至25％(v/v)、1.0％至10％(v/v)或2.5％至5.0％(v/v)，每个都包含端值；或者输入组合物含有血清，任选人血清，所述血清的浓度为至少或至少约0.5％、1％、2.5％、5％(v/v)或10％。
[0026] 在一些任何此类实施方案中，输入组合物含有重组IL-2，任选重组人IL-2，所述重组IL-2的浓度为或为约10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL或500IU/mL；和/或输入组合物含有重组IL-15，任选重组人IL-15，所述重组IL-15的浓度为或为约1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL或5IU/mL至10IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL或50IU/mL的浓度；和/或输入组合物含有重组IL-7，任选重组人IL-7，所述重组IL-7的浓度为或为约50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL至200IU/mL至600IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL或1000IU/mL。
[0027] 在一些任何此类实施方案中，孵育包括将病毒载体粒子与输入组合物一起旋转接种的步骤。在一些情况下，旋转接种包括在离心室的内腔中旋转病毒载体粒子和输入组合物，其中旋转在空腔侧壁的内表面处的相对离心力下，所述相对离心力在或在约500g与2500g之间、500g与2000g之间、500g与1600g之间、500g与1000g之间、600g与1600g之间、
600g与1000g之间、1000g与2000g或1000g与1600g之间，每个都包含端值；或为至少或至少约600g、800g、1000g、1200g、1600g或2000g。
600g与1000g之间、1000g与2000g或1000g与1600g之间，每个都包含端值；或为至少或至少约600g、800g、1000g、1200g、1600g或2000g。
[0028] 在一些实施方案中，旋转接种的时间大于或为约5分钟、大于或为约10分钟、大于或为约15分钟、大于或为约20分钟、大于或为约30分钟、大于或为约45分钟、大于或为约60分钟、大于或为约90分钟或大于或为约120分钟；或者在或在约5分钟与60分钟之间、10分钟与60分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值。
[0029] 在一些任何此类实施方案中，所述方法还包括使输入组合物和/或病毒载体粒子与转导佐剂接触。在一些情况下，接触是在将病毒载体粒子与输入组合物一起旋转接种之前、同时或之后进行。
[0030] 在一些任何此类实施方案中，至少一部分孵育是在或在约37℃±2℃下进行。在一些方面，至少一部分孵育是在旋转接种后进行。在一些情况下，至少一部分孵育进行不超过或不超过约2小时、4小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时或72小时。在一些实施方案中，至少一部分孵育进行24小时或约24小时。在一些任何此类实施方案中，孵育的总持续时间不超过12小时、24小时、36小时、48小时或72小时。
[0031] 在一些任何此类实施方案中，病毒载体粒子是慢病毒载体粒子。在一些情况下，慢病毒载体粒子源自HIV-1。在一些任何此类实施方案中，病毒载体粒子用病毒包膜糖蛋白假型化。在一些情况下，病毒包膜糖蛋白是VSV-G。
[0032] 在一些任何此类实施方案中，病毒载体粒子含有展现SAMHD1抑制活性的慢病毒蛋白，所述蛋白包装在所述病毒粒子中。在一些情况下，SAMHD1抑制蛋白是野生型Vpx蛋白、野生型Vpr蛋白，或者是野生型Vpx或Vpr蛋白的展现SAMHD1抑制活性的变体或部分。在一些情况下，SAMHD1抑制蛋白对于逆转录病毒载体粒子是异源的。在一些实施方案中，SAMHD1抑制蛋白是野生型Vpx蛋白或是野生型Vpx蛋白的展现SAMHD1抑制活性的变体或部分。
[0033] 在一些任何此类实施方案中，将病毒载体粒子在小于或小于约20.0或小于或小于约10.0的感染复数下孵育。在一些任何此类实施方案中，将病毒载体粒子在某一感染复数下孵育，所述感染复数为或为约1.0IU/细胞至10IU/细胞或2.0IU/细胞至5.0IU/细胞；或者将病毒载体粒子在某一感染复数下孵育，所述感染复数为至少或至少约1.6IU/细胞、1.8IU/细胞、2.0IU/细胞、2.4IU/细胞、2.8IU/细胞、3.2IU/细胞或3.6IU/细胞、4.0IU/细胞、5.0IU/细胞、6.0IU/细胞、7.0IU/细胞、8.0IU/细胞、9.0IU/细胞或10.0IU/细胞。
[0034] 在一些任何此类实施方案中，输入组合物含有至少为或约至少或约50x106个细胞、100x106个细胞或200x106个细胞。
[0035] 在一些任何此类实施方案中，重组核酸编码抗原受体。在一些情况下，抗原受体是转基因T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些情况下，嵌合抗原受体(CAR)含有特异性地结合至靶抗原的细胞外抗原识别结构域和含有ITAM的细胞内信号传导结构域。在一些方面，细胞内信号传导结构域含有CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内结构域。在一些任何此类实施方案中，CAR还含有连接细胞外结构域与细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。
[0036] 在一些任何此类实施方案中，细胞内信号传导结构域还含有T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域。在一些情况下，T细胞共刺激分子选自CD28和41BB。
[0038] 在一些任何此类实施方案中，所述方法产生含有用重组核酸转导的T细胞的输出组合物。在一些情况下，用重组核酸转导输出组合物中至少30％、或至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的T细胞。在一些方面，所述方法还包括从输出组合物中回收或分离通过所述方法产生的转导的T细胞。在一些情况下，所述方法还包括激活或扩增输出组合物的细胞或通过所述方法转导的细胞。在一些情况下，激活和/或扩增是离体进行。
[0039] 在一些任何此类实施方案中，在孵育之后，将输出组合物中的细胞在能够激活T细胞、通过TCR复合物诱导信号和/或诱导T细胞的增殖的一种或多种刺激剂的存在下进一步孵育。在一些方面，一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7。在一些实施方案中，一种或多种刺激剂含有抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。
[0040] 在一些情况下，激活和/或扩增是在体内进行。在一些实施方案中，激活和/或扩增在由抗原受体特异性结合的抗原的存在下进行和/或是转基因特异性的。
[0041] 在一些任何此类实施方案中，在所述孵育之后，所述输出组合物中的所述细胞未在一种或多种刺激剂的存在下进一步离体孵育，所述一种或多种刺激剂任选地由以下组成：CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7，和/或所述输出组合物中的所述细胞未在高于30℃的温度下进一步孵育超过24小时。
[0042] 还提供了通过如本文所述的任何方法产生的基因工程化T细胞。还提供了组合物，其含有如本文所述的基因工程化T细胞和药学上可接受的载体。
[0043] 还提供了一种治疗方法，包括向患有疾病或病症的受试者给予如上所述的组合物。在一些情况下，在从受试者获得样品后不超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天或不超过5天时，将组合物给予至受试者或准备好给予至受试者，和/或释放以供测试。在一些情况下，在从受试者获得样品后不超过1天、2天、3天或4天，将组合物给予至受试者或准备好给予至受试者和/或释放以供测试。在一些情况下，在从受试者获得样品后不超过21天、不超过20天、不超过19天、不超过15天、不超过14天、不超过13天、不超过12天、不超过10天、不超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天或不超过5天时，将组合物准备好给予至受试者。
[0044] 还提供了过继细胞疗法的方法，包括从获自患有疾病或病症的受试者的样品中富集或分离T细胞；通过上述任何方法用病毒载体粒子转导含有富集或分离的T细胞的输入组合物，从而产生含有转导的细胞的输出组合物，其中病毒载体粒子含有编码抗原受体的重组核酸，所述抗原受体特异性地结合至与疾病或障碍相关的抗原；以及将含有转导的细胞的输出组合物给予至受试者以治疗疾病或病症。
[0045] 还提供了一种治疗方法，其包括将包含用重组核酸转导的T细胞的输出组合物给予至受试者以治疗疾病或病症，其中输出组合物是通过所提供的任何转导细胞的方法来产生的。
[0046] 在任何此类方法的实施方案中，在从受试者获得样品后不超过11天、不超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天或不超过5天时，将组合物给予至受试者或准备好给予至受试者，或释放以供测试。在一些实施方案中，在从受试者获得样品后不超过1天、2天、3天、4天或5天时，将组合物给予至受试者或准备好给予至受试者。在一些情况下，在给予组合物之前，将转导的细胞或输出组合物的细胞配制在药学上可接受的缓冲液中。
[0047] 在一些任何此类实施方案中，在转导后，在给予含有转导的细胞的输出组合物之前，将细胞离体培养长达24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天，所述培养在高于30℃的温度下进行。在一些实施方案中，在转导后，将输出组合物或含有转导的细胞的细胞在一种或多种刺激剂的存在下培养，所述刺激剂能够激活T细胞、通过TCR复合物诱导信号和/或诱导T细胞增殖，从而产生含有转导的细胞的组合物。
[0048] 在一些任何此类实施方案中，在给予转导的细胞之前，输出组合物或含有转导的细胞的细胞未在一种或多种刺激剂的存在下进一步离体孵育和/或未在高于30℃的温度下进一步孵育超过24小时。
[0049] 在一些任何此类实施方案中，一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7，包含由抗原受体特异性识别的抗原的疫苗，和特异性地结合抗原受体的抗独特型抗体。
[0050] 在一些情况下，一种或多种刺激剂含有抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。在一些实施方案中，输出组合物的细胞或转导的细胞是以次最佳剂量给予。
[0051] 在一些任何此类实施方案中，所述方法还包括向受试者给予用以在体内诱导或增强对转导的T细胞的刺激和/或扩增的一种或多种药剂。在一些情况下，一种或多种药剂是转基因特异性的和/或通过所表达的转基因刺激或激活细胞，所述转基因任选地是或含有抗原受体。在一些方面，一种或多种药剂选自含有由抗原受体特异性识别的抗原的疫苗、特异性结合抗原受体的抗独特型抗体或能够化学诱导抗原受体的二聚化的药剂。在一些实施方案中，一种或多种药剂是免疫调节剂；免疫检查点抑制剂；细胞外腺苷或腺苷受体、任选A2aR受体的抑制剂；犬尿氨酸途径调节剂和信号传导途径的调节剂(例如激酶抑制剂)。
[0052] 还提供了含有原代人T细胞群的组合物，所述原代人T细胞群经基因工程化以表达特异性地结合至靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)或转基因TCR，其中所述群含有多个静息T细胞；并且多个静息T细胞占组合物中基因工程化细胞的至少7.5％。在一些情况下，基因工程化静息T细胞占组合物中基因工程化细胞的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
[0053] 在一些实施方案中，静息T细胞针对选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L(CD154)和4-1BB(CD137)的T细胞激活标记是表面阴性的；缺乏选自IL-2、IFN-γ和TNF-α的细胞因子的细胞内表达；处于细胞周期的G0或G0G1a期；和/或含有活性SAMHD1。在一些情况下，静息T细胞针对CD25和CD69是表面阴性的(CD25-/CD69-)。在一些方面，静息T细胞含有CD4+和/或CD8+T细胞。
[0054] 在一些任何此类实施方案中，靶抗原与疾病或障碍相关。在一些情况下，疾病或障碍是感染性疾病或病症、自身免疫性疾病、炎性疾病或癌症。
[0055] 在一些任何此类实施方案中，靶抗原选自ROR1、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGEA3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)和细胞周期蛋白A1(CCNA1)。在本文所述组合物的一些实施方案中，原代人T细胞经基因工程化以表达CAR，所述CAR含有特异性地结合至靶抗原的细胞外抗原识别结构域和含有ITAM的细胞内信号传导结构域。在一些情况下，细胞内信号传导结构域含有CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内结构域。在一些情况下，CAR还含有连接细胞外结构域与细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。
[0056] 在一些任何此类实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域还含有T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域。在一些情况中，T细胞共刺激分子选自CD28和41BB。
[0058] 图1A-1B显示在用表达转基因的慢病毒载体粒子转导之前，在激活或未激活的情况下T细胞的侧向散射(SSC；y轴)和EGFRt表面标记表达(x轴)(转基因表达的指示物)的点图。图1A显示在CD4+和CD8+T细胞中用慢病毒载体粒子转导后EGFRt表达的点图，在转导前所述T细胞用抗CD3/抗CD28珠试剂1或抗CD3/抗CD28珠试剂2激活。图1B显示在CD4+和CD8+T细胞中用慢病毒载体粒子以各种病毒浓度(从初始浓度两倍连续稀释)转导后EGFRt表达的点图，所述T细胞在转导前未激活。EGFRt+细胞的百分比也显示在框中。
[0059] 图2描绘在各种条件下转导和处理后，在选择后的所指示天数，CD4+和CD8+T细胞的替代标记表面表达的频率(指示转导频率)。
具体实施方式
[0060] I.概述
[0061] 本发明提供了将病毒载体转移到细胞(例如T细胞)中的方法，所述方法涉及细胞(例如免疫细胞，例如T细胞)的转导，其中事先不激活细胞，和/或在从受试者获得细胞后不超过24小时开始的时间段内转导，和/或其中在从受试者获得细胞之后且在转导之前，细胞未经历高于15℃至25℃(例如高于或高于约37°±2.0℃)的温度超过几小时(并且不超过24小时)。在一些实施方案中，所提供的方法涉及将逆转录病毒载体粒子(例如慢病毒载体)与细胞(例如免疫细胞，例如T细胞)群与逆转录病毒载体粒子(例如慢病毒粒子)一起孵育和/或接触，在将细胞与病毒粒子接触或孵育之前和/或同时，未首先(即在转导之前)用离体刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28试剂)激活和/或刺激T细胞。
[0062] 在一些实施方案中，所提供的方法用于用异源分子基因工程化此类细胞，所述异源分子例如重组受体，例如抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR)。所得的基因工程化细胞可用于过继免疫疗法。在一些此类实施方案中，所提供的方法可用于制备用于过继疗法的免疫细胞，例如T细胞，所述方法不包括激活和/或刺激T细胞的步骤。在一些方面，通过消除对激活或刺激细胞的需要，所提供的方法缩短了工程化和/或制备用于过继细胞疗法的细胞的过程。
[0063] 通常，基于逆转录病毒的载体可用于将目标基因稳定整合到细胞中。尽管水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-g)假型化慢病毒载体可以转导非分裂细胞，但已报道静息T细胞的转导不良。因此，对于现有的逆转录病毒载体，可能不总是能够有效并稳定地基因工程化静止和/或静息细胞，例如非循环骨髓细胞或静息T细胞，其中逆转录病毒载体的量足以供下游使用，例如，用于细胞疗法。在一些情况下，对于在T细胞中发生的转导，可能需要通过T细胞受体(TCR)的接合或通过细胞因子刺激来激活T细胞。在一些情况下，一个观察结果是在静息T细胞中发生LDL受体(即VSV-G的结合配偶体)的低水平表达。已显示激活在一些情况下增加LDL受体表达，从而增强慢病毒载体的摄取。通常，在转导之前将T细胞激活至少一天(有时长达3天或更长时间)以用于过继T细胞疗法。例如，T细胞的慢病毒转导方案通常需要在转导前至少24小时激活(Amirache等人(2014)Blood,123:1422-1424)。
[0064] 在一些情况下，可用于制备用于过继免疫疗法的基因工程化T细胞的程序可能需要选择、激活、转导和扩增的依次离体步骤。然而，对于某些过继免疫治疗方法，制备细胞可能并不总是需要离体刺激或激活免疫细胞，例如T细胞。举例来说，例如在转导之前包括一个或多个激活和/或刺激步骤，可能增加制备用于过继细胞疗法的细胞的时间、成本、试剂和/或用户处理。这样的结果可能增加不同过程和/或使用来自不同受试者的细胞之间的变异性风险。因此，在一些实施方案中，与其他方法相比，所提供的方法通过消除在暴露于逆转录病毒载体粒子之前的激活和/或刺激步骤而是有利的。
[0065] 另外，在一些情况下，过继T细胞疗法后T细胞持久性和/或消耗可能与给予之前(例如，在基因工程化(例如，引入核酸，所述核酸编码基因工程化分子，例如受体，例如抗原受体，例如CAR)之前或期间)对T细胞的刺激和/或激活有关。例如，激活T细胞以促进转导可导致T细胞的分化或激活状态的变化，其可导致和/或引起在将基因工程化细胞给予至受试者时，体内持久性降低。在一些情况下，可能发生的分化状态的变化包括幼稚表型的丧失，记忆T细胞表型的丧失，和/或具有消耗的T细胞表型的效应细胞的产生。T细胞的消耗可能导致T细胞功能的逐渐丧失和/或细胞耗尽(Yi等人(2010)Immunology,129:474-481)。
[0066] 所提供的方法基于以下观察结果：从受试者获得的原代细胞的充分转导可以通过以下方式来实现：在从受试者选择和/或富集细胞后，立即将细胞群(例如T细胞群)与逆转录病毒载体粒子(例如慢病毒载体粒子)一起孵育和/或接触。在一些实施方案中，发现根据所提供的方法进行转导的过程似乎不受以下需要的限制：通过CD3和/或CD28蛋白的接合向细胞提供刺激和/或通过首先激活细胞来上调LDL受体。不希望受理论束缚，本文设想，所选择的和/或富集的细胞的上游处理，包括单采术收集以及T细胞选择和/或富集中的过程，可能已经上调LDL受体表达和/或以其他方式使T细胞易于进入病毒。因此，发现可以在选择后立即转导T细胞，不需要将细胞激活至少24小时，从而能够实现更短的过程。在所提供的方法的一些情况下，可以在转导之前将富集和/或选择的细胞冷冻保存，只要在孵育和/或接触之前不用一种或多种刺激剂对富集的和/或选择的细胞进行离体刺激即可。
[0067] 在一些实施方案中，所提供的方法包括孵育和/或接触含有待转导的细胞的输入组合物，其中在孵育之前，输入组合物的细胞未经历离体刺激，所述离体刺激包括与在T细胞(例如CD4+T细胞或CD8+T细胞)中启动或开始TCR/CD3细胞内信号传导级联的药剂一起孵育。此类药剂包括例如与固体支持物(例如珠)结合的结合分子或抗体，例如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些(例如抗CD3、抗CD28)；和/或一种或多种细胞因子，例如重组细胞因子，例如IL-2和/或IL-15和/或IL-7。在一些实施方案中，在引入所提供的逆转录病毒载体之前，所提供的方法不包括用一种或多种抗CD3抗体、抗CD28抗体和/或重组IL-2、IL-15或IL-7细胞因子激活和/或刺激含有T细胞的细胞群。在一些实施方案中，对重组的提及是指通常不是从受试者获得的样品中获得的细胞因子，而是使用重组DNA技术产生的那些细胞因子，所述重组DNA技术例如涉及在细胞中从DNA表达，其中编码蛋白质的基因序列已经以人工或外源方式引入所述细胞中。因此，对重组细胞因子的提及不包括可能存在于来自受试者的样品(例如单采术样品)中和/或存在于从受试者获得的血清中的细胞因子。在一些实施方案中，输入组合物包含原代细胞群，所述原代细胞群已从受试者的样品获得和/或针对特定的细胞子集(例如T细胞)富集。
[0068] 在一些实施方案中，细胞群(例如输入组合物)可以是先前已经进行冷冻保存的细胞群。在一些此类实施方案中，在冷冻保存细胞之前，细胞群未经历任何促进细胞激活或刺激(例如T细胞的细胞激活或刺激)的条件和/或暴露于所述条件和/或在所述条件的存在下孵育。在一些实施方案中，在冷冻保存细胞之前，细胞群未经历一种或多种能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂和/或暴露于所述药剂和/或在所述药剂的存在下孵育，所述药剂例如抗CD3和/或抗CD28抗体和/或一种或多种细胞因子，例如IL-2和/或IL-15和/或IL-7。
[0069] 在一些实施方案中，与所提供的逆转录病毒载体一起孵育的细胞群(例如输入组合物)是在与逆转录病毒载体粒子一起孵育之前未暴露于和/或经历高于0℃(例如高于4℃、15℃、20℃或高于25℃)的温度超过约1小时、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时或72小时的细胞群。
[0070] 在一些实施方案中，在从受试者获得含有原代细胞的样品(例如单采术样品)后不超过或不超过约1小时、3小时、6小时、12小时、18小时或24小时开始孵育和/或接触。在一些实施方案中，在从受试者获得样品后，在孵育之前，T细胞未经历高于或高于约15℃、18℃、22℃或25℃的温度持续超过1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时的时间，例如在从受试者获得样品后未经历高于或高于约37°±2.0℃的温度持续超过15分钟、30分钟、1小时或2小时的时间。
[0071] 在一些实施方案中，所提供的方法产生含有转导的细胞的输出组合物，其中在转导之前不进行细胞的这种激活。在一些实施方案中，所述方法可用于转导T细胞群，其中所述群中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的T细胞是静息T细胞，例如缺乏T细胞激活标记(例如表面标记或细胞内细胞因子或其他标记)的T细胞，和/或处于细胞周期的G0或G0G1a期的T细胞。
[0072] 在一些实施方案中，所述方法产生输出组合物，其中输出组合物中至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的总细胞(或特定靶细胞类型，例如T细胞)用所述病毒载体转导和/或表达由其编码的重组基因产物。
[0073] 在一些实施方案中，所提供的方法导致免疫细胞的相对高的转导，所述免疫细胞例如非循环和/或静息细胞，例如未激活或未刺激的免疫细胞，例如静息T细胞。在一些实施方案中，细胞群(例如输出组合物)中至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的非循环或静息细胞(例如静息T细胞)是根据所提供的方法用逆转录病毒载体粒子转导。
65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的非循环或静息细胞(例如静息T细胞)是根据所提供的方法用逆转录病毒载体粒子转导。
[0074] 在一些实施方案中，输入组合物和/或输出组合物中不超过5％、10％、20％、30％或40％的T细胞是激活细胞，表达选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的表面标记；包含选自IL-2、IFN-γ、TNF-α的细胞因子的细胞内表达，处于细胞周期的G1期或较后期和/或能够增殖。例如，在一些方面，输入组合物和/或输出组合物的细胞群是其中至少40％、
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％对CD25和/或CD69是表面阴性(例如CD25-和CD69-)的细胞群。
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％对CD25和/或CD69是表面阴性(例如CD25-和CD69-)的细胞群。
[0075] 用于评估和/或评价细胞(例如静息T细胞)的循环状态的方法和技术是已知的(Tumeh等人(2010)J Immunother.,33:759-768)。在一些实施方案中，静息T细胞展现小于增殖T细胞(例如激活的T细胞)的大小。因此，在一些方面，可以采用细胞大小，例如使用具有或不具有生存力染料(例如台盼蓝)的自动细胞计数器测定的细胞大小。在一些实施方案中，群中的大多数细胞和/或基本上所有T细胞是直径小于4μm的细胞，例如通常小于3μm，例如为或为约1μm至3μm，例如通常约或大约2μm。在一些实施方案中，可以评估代谢底物的摄3 3 3
取，例如氚( H)标记的2'-脱氧-D-葡萄糖([ H]-2'DDG)、H标记的3'-脱氧-3'-氟胸苷([3H]-3'FLT)和/或3H标记的-2'-脱氧-2'-氟阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶([3H]-FAC)，它们各自是由激活或刺激的细胞摄取的标记。在一些实施方案中，群中的大多数细胞和/或基本上所有T细胞不能摄取和/或不积累代谢底物的标记。在一些实施方案中，可以直接评价或监测细胞周期，例如通过定量DNA含量，例如，使用碘化丙啶(PI)、7-氨基放线菌素-D(7-AAD)、Hoechst 33342、33258和S769121、TO-PRO-3、4'6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、DRAQ5TM或DRAQ7TM。
取，例如氚( H)标记的2'-脱氧-D-葡萄糖([ H]-2'DDG)、H标记的3'-脱氧-3'-氟胸苷([3H]-3'FLT)和/或3H标记的-2'-脱氧-2'-氟阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶([3H]-FAC)，它们各自是由激活或刺激的细胞摄取的标记。在一些实施方案中，群中的大多数细胞和/或基本上所有T细胞不能摄取和/或不积累代谢底物的标记。在一些实施方案中，可以直接评价或监测细胞周期，例如通过定量DNA含量，例如，使用碘化丙啶(PI)、7-氨基放线菌素-D(7-AAD)、Hoechst 33342、33258和S769121、TO-PRO-3、4'6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、DRAQ5TM或DRAQ7TM。
[0076] 用于评价T细胞激活标记的表达和/或水平的方法和技术是本领域已知的。用于检测此类标记的抗体和试剂是本领域熟知的，并且容易获得。用于检测此类标记的测定和方法包括但不限于流式细胞术(包括细胞内流式细胞术)、ELISA、ELISPOT、细胞计数珠阵列或其他多重方法、蛋白质印迹和其他基于免疫亲和力的方法。
[0077] 在一些实施方案中，所述方法能够在某些条件下实现至少特定的转导效率。例如，在一些实施方案中，如果输入组合物按以下比率包括病毒和细胞：为或为约每个细胞1个感染单位(IU)至每个细胞10个IU，例如至少或为或为约每个细胞1个感染单位(IU)，或至少或为或为约每个细胞2个IU，至少或为或为约每个细胞5个IU，或者至少或为或为约每个细胞10个IU，那么所述方法能够产生输出组合物，其中通过所述方法产生的组合物中至少10％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的细胞例如已经用重组病毒载体转导。
[0078] 在一些此类实施方案中，可以在转导或以其他形式将载体转移到细胞(例如非循环宿主细胞，例如静息T细胞或其细胞群)中后，通过测量由逆转录病毒载体基因组中所含核酸编码的重组分子或蛋白质(例如异源分子或蛋白质)的表达水平，来监测和/或观察用逆转录病毒载体粒子转导细胞的效率。可以使用多种熟知方法来评价重组分子的表达水平，例如在细胞表面蛋白的情况下，例如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)来检测，例如通过流式细胞术进行。在一些例子中，通过检测转导标记和/或报道基因构建体来测量表达。在一些实施方案中，编码截短的表面蛋白的核酸包括在载体内并用作其表达和/或增强的标记。
[0079] 在一些实施方案中，所提供的方法可以包括在用病毒粒子孵育(例如转导)细胞之前或之后的冷冻保存步骤。在一些实施方案中，这个步骤可以在过程中提供中断步骤，以允许运送材料，对材料取样或在患者的病症期间“保持”治疗。
[0080] 在一些方面，虽然所提供的方法不包括预先激活和/或刺激细胞的步骤，但所述方法可以包括在转导的同时和/或在转导后激活或刺激细胞。激活或刺激可以离体进行或在体内进行。在一些实施方案中，在用病毒粒子孵育(例如转导)细胞后，可以将细胞输注到患者体内以进行体内激活和扩增。
[0081] 在一些实施方案中，在孵育期间或之后，所提供的方法可以还包括离体培养输入组合物、输出组合物和/或转导的细胞，例如在刺激细胞的条件下培养，以例如诱导其增殖和/或激活。在一些实施方案中，培养在高于30℃(例如高于或高于约32℃、35℃或37℃)的温度下进行超过24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。在一些实施方案中，刺激是在一种或多种刺激剂的存在下进行。在一些实施方案中，一种或多种刺激剂是CD3结合分子、CD28结合分子，或是细胞因子，例如重组IL-2、重组IL-15或重组IL-7。在一些实施方案中，结合分子是抗体或抗原结合片段，例如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。在一些实施方案中，进一步培养是在实现细胞扩增的条件下进行，以例如产生治疗有效剂量的细胞用于通过过继细胞疗法给予至受试者。
[0082] 在一些实施方案中，输出组合物或转导的细胞未在高于30℃的温度下进一步离体培养和/或不在一种或多种刺激剂的存在下进一步培养。
[0083] 在一些实施方案中，所提供的方法避免在用编码重组受体(例如CAR)的核酸引入、转移和/或转导T细胞的过程中离体地显著改变T细胞的分化状态和/或使T细胞分化状态的变化最小化。在一些实施方案中，根据所提供的方法产生的所给予细胞展现较少消耗的表型。
[0084] 在一些实施方案中，例如包含T细胞的输入组合物和/或输出组合物包括的效应细胞(例如具有消耗的T细胞表型的效应细胞)的比例或百分比低于其中输入组合物的细胞在孵育之前已经激活和/或刺激(例如用抗CD3/抗CD28抗体激活和/或刺激至少或约至少24小时)的组合物中的细胞。在一些实施方案中，输入组合物和/或输出组合物中的T细胞含有的T效应物记忆(TEM)细胞或T效应细胞(TEFF)细胞(如CD45RO+CD62L-CCR7-细胞)的比例或百分比低于其中输入组合物的细胞在孵育之前已经激活和/或刺激(例如用抗CD3/抗CD28抗体激活和/或刺激至少或约至少24小时)的组合物。在一些实施方案中，所述比例或百分比低至少或约至少1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
[0085] 在一些实施方案中，例如包含T细胞的输入组合物和/或输出组合物展现的具有记忆T细胞表型的T细胞的比例或百分比高于其中输入组合物的细胞在孵育之前已经激活和/或刺激(例如用抗CD3/抗CD28抗体激活和/或刺激至少或约至少24小时)的组合物中的细胞。例如，在一些实施方案中，记忆T细胞是具有T中枢细胞记忆(TCM)表型的细胞，例如+ + + + + + + +CD45ROCCR7CD62L T细胞和/或CD45ROCCR7 CD27CD28CD62LT细胞。在一些实施方案中，所述比例或百分比低至少或至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
[0086] 在一些实施方案中，进行所提供的方法，使得用于临床用途(例如过继细胞疗法中)的细胞的制备中的一个、多个或所有步骤是在未将细胞暴露于非无菌条件下和不需要使用无菌室或无菌柜的情况下进行。在这种方法的一些实施方案中，细胞被隔离、分离或选择、转导、洗涤、任选地激活或刺激和配制，都在封闭系统内进行。在一些实施方案中，封闭系统是或包括包含离心室的装置。在一些实施方案中，所述方法是以自动方式进行的。在一些实施方案中，一个或多个步骤是在封闭的系统或装置之外进行的，例如在离心室系统之外进行。
[0087] 在一些实施方案中，所提供的方法提供优化或改进的过程，其中将细胞离体处理较短的时间，从而节省时间，允许降低成本。在一些方面，所提供的方法还可以产生转导的细胞用于以更好或更期望的表型给予至受试者，例如，比效应物记忆细胞更少的消耗的细胞和/或较强的中枢记忆。
[0088] 在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物给予至受试者以治疗疾病或病症。
[0089] 在一些实施方案中，所提供的方法包括向受试者给予次最佳剂量的细胞。在一些实施方案中，细胞的所述剂量比用于治疗疾病或病症的细胞的治疗有效剂量低小于或小于约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在这种例子中，扩增细胞以产生治疗有效量的细胞可以在将细胞给予至受试者之后在体内发生。
[0090] 在一些实施方案中，所提供的方法包括细胞的体内扩增。在一些方面，细胞的体内扩增可以通过所给予细胞的转基因特异性激活或刺激在体内发生。在一些实施方案中，抗原受体(例如CAR)在识别抗原后被刺激，例如被激活或扩增。在一些实施方案中，向受试者给予一种或多种药剂以加强、扩大或增加受试者体内细胞的刺激、激活或扩增。
[0091] 在一些实施方案中，所提供的方法产生基因工程化T细胞，在将其给予至受试者时，展现增加的持久性和/或减少的T细胞消耗。在一些实施方案中，具有增加的持久性和/或减少的消耗的基因工程化细胞在给予其的受试者中展现更好的效力。在一些实施方案中，所提供的逆转录病毒载体粒子和方法降低了过继免疫治疗方法中治疗结果的变异性，例如，通过最小化和/或减少给予至受试者之前对T细胞的离体操作。在一些实施方案中，消除T细胞的离体激活通过减少离体操作所需的时间和试剂，改善了产生或制备用于过继免疫疗法的基因工程化T细胞的过程。
[0092] 在一些实施方案中，针对转导或工程化细胞的选择是在基因工程化之后进行。在一些实施方案中，可以将工程化的非循环和/或静息或静止细胞(如静息T细胞)富集用于过继免疫疗法。
[0093] 在所提供的实施方案中还包括所得的基因工程化细胞，例如表达基因工程化受体(例如重组抗原受体，如CAR和/或其他重组受体)的细胞，以及此类基因工程化细胞用于过继免疫疗法的方法和用途。
[0094] II.转导方法
[0095] 本文提供了一种将输入组合物的细胞与逆转录病毒载体粒子(例如，慢病毒载体粒子)一起孵育或接触的方法。在一些方面，输入组合物是从受试者获得的原代细胞的组合物，其中，在一些情况下，细胞的亚群或子集已经被选择和/或富集。提供输入组合物的特征。
[0096] 在一些实施方案中，细胞包括根据所提供的方法通过基因工程化引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或这种细胞所来源的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
[0097] 所述方法的处理步骤可包括多个细胞处理步骤中单独的或组合的任何一个或多个步骤。在特定实施方案中，处理步骤包括用含有逆转录病毒载体的病毒载体粒子转导细胞，例如编码用于在细胞中表达的重组产物的载体。所述方法可以进一步和/或可替代地包括其他处理步骤，例如细胞的隔离、分离、选择、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制的步骤。在一些情况下，所述方法还可以包括离体培养步骤(例如，刺激细胞以例如诱导其增殖和/或激活)。在其他情况下，刺激或激活细胞的步骤是在将细胞给予至受试者后在体内进行，通过抗原识别进行和/或在给予一种或多种药剂以加强或扩大细胞在受试者体内的扩增、激活和/或增殖后进行。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。
[0098] 在一些实施方案中，所述方法包括按以下顺序进行的处理步骤，其中：首先从生物样品中隔离(例如选择或分离)原代细胞；将所选择细胞与病毒载体粒子一起孵育以供转导；和将转导的细胞配制于组合物中。在一些情况下，例如通过在刺激试剂的存在下的刺激对转导的细胞进行离体激活、扩增或增殖。在一些实施方案中，所述方法可以包括来自洗涤、悬浮、稀释和/或浓缩细胞中的一个或多个处理步骤，其可以在隔离(例如分离或选择)、转导、刺激和/或配制步骤之前、期间或同时或之后进行。
[0099] 在一些实施方案中，一个或多个或所有处理步骤(例如隔离、选择和/或富集、处理、与转导和工程化结合的孵育)和配制步骤是使用集成或自含式系统中的系统、装置或设备进行和/或以自动化或可编程方式进行。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO 2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
[0100] 在一些实施方案中，与结合所提供的转导方法的制备、处理和/或孵育细胞结合的一个或多个细胞处理步骤可以在离心室的内腔中进行，所述离心室例如基本上刚性的室，其通常为圆柱形并且可围绕旋转轴旋转，这与其他可用的方法相比可以提供某些优点。在一些实施方案中，所有处理步骤都在同一个离心室中进行。在一些实施方案中，一个或多个处理步骤在不同的离心室中进行，例如相同类型的多个离心室。所述方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的任何方法。
[0101] 示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于 和2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号
6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其全文并入本文。根据具体的工艺(例如稀释、洗涤、转导、配制)，技术人员可熟练选择适合于所述工艺的特定试剂盒。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-
900.2销售的一次性试剂盒。
6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其全文并入本文。根据具体的工艺(例如稀释、洗涤、转导、配制)，技术人员可熟练选择适合于所述工艺的特定试剂盒。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-
900.2销售的一次性试剂盒。
[0102] 在一些实施方案中，所述系统与其他仪器一起被包括和/或被放置与其他仪器联合，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监控所述系统中进行的各个处理步骤的各个方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，所述仪器包括机柜，其包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
[0103] 在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋子、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，容器(例如袋子)包括一个或多个容器(例如袋子)，其在同一容器或单独容器(例如同一袋子或单独袋子)中含有待转导的细胞和病毒载体粒子。在一些实施方案中，所述系统还包括一个或多个容器(例如袋子)，所述容器含有介质，例如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
[0104] 在一些实施方案中，所述系统(例如封闭的系统)是无菌的。在一些实施方案中，使系统部件的所有连接(例如管路管线与容器通过连接器的连接)都处于无菌条件下。在一些实施方案中，使连接处于层流下。在一些实施方案中，在管路与容器之间使用产生无菌连接的无菌连接装置(例如无菌焊接)进行连接。在一些实施方案中，无菌连接装置在足够高以维持无菌的热学条件下，例如在至少200℃、例如至少260℃或300℃的温度下实现连接。
[0105] 在一些实施方案中，所述系统可以是可弃式的，例如一次性试剂盒。在一些实施方案中，一次性试剂盒可以用于一个或多个过程的多个循环中，例如至少2、3、4、5或更多次，例如，在以连续或半连续方式进行的过程中。在一些实施方案中，所述系统(例如一次性试剂盒)用于处理来自单一患者的细胞。
[0106] 离心室通常可围绕旋转轴旋转，并且空腔通常与室同轴。在一些实施方案中，离心室还包括可移动构件，例如活塞，其通常能够在室内移动(例如，轴向移动)，以改变空腔的容积。因此，在特定实施方案中，内腔以室的侧壁和端壁以及可移动构件为边界，并且具有可通过移动可移动构件来调节的可变容积。可移动构件可由刚性、基本上或大体上刚性、柔性材料或其组合制成。
[0107] 所述室通常还包括一个或多个开口，例如一个或多个入口、一个或多个出口和/或一个或多个入口/出口，其可以允许将液体和/或气体摄入空腔中或从空腔压出。在一些情况下，开口可以是入口/出口，其中发生液体和/或气体的摄入和压出。在一些情况下，一个或多个入口可以与一个或多个出口分开或不同。一个或多个开口可以位于一个端壁中。在一些实施方案中，通过移动可移动构件来增加和/或减小空腔的容积，以将液体和/或气体摄入空腔中和/或从空腔压出。在其他实施方案中，可以通过管路管线或其他通道将液体和/或气体摄入空腔中和/或从空腔压出，所述管路管线或其他通道与开口连接或被放置与开口连接，例如，通过放置管线或通道连接或控制泵、注射器或其他可以自动化方式控制的机构。
[0108] 在一些实施方案中，所述室是封闭系统(例如无菌系统)的一部分，所述室具有多种另外的部件，例如管路管线和连接器和盖，在所述室内进行处理步骤。因此，在一些实施方案中，所提供的方法和/或其步骤是在完全封闭或半封闭的环境中进行，例如封闭或半封闭的无菌系统，从而促进用于治疗性给予至受试者的细胞的产生，无需单独的无菌环境，如生物安全柜或房间。一些实施方案中的方法以自动化或部分自动化方式进行。
[0109] 在一些实施方案中，所述室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。在一个或多个处理步骤中，旋转可发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
[0110] 在所述方法的各方面，所述过程不需要在同一封闭系统中(例如在同一离心室中)进行，而是可以在不同的封闭系统下(例如在不同的离心室中)进行；在一些实施方案中，此类不同的离心室位于方法中的各个点处，所述点被放置与同一系统相关联，例如被放置与同一离心机相关联。在一些实施方案中，所有处理步骤都是在封闭系统中进行，其中每一个或多个处理步骤的全部或一部分在相同或不同的离心室中进行。
[0111] A.样品和细胞制备
[0112] 细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。
[0113] 细胞通常是原代细胞如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些原代细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现有技术，所述细胞是多能和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。
[0114] 在T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群中，有幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)，效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助细胞T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
[0115] 在一些实施方案中，所述细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
[0116] 在一些实施方案中，细胞源自于细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方案中，细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
[0117] 在一些实施方案中，细胞可以从样品中分离，例如生物样品，例如从受试者获得或源自受试者的样品。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其给予细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。
[0118] 因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
[0119] 在一些方面，细胞从其中衍生或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或源自单采术或白细胞分离术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
[0120] 在一些例子中，来自受试者的循环血液的细胞例如通过单采术或白细胞分离术获得。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
[0121] 在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将所述细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。
[0122] 在一些实施方案中，在富集和/或选择细胞之前，使样品与血清或血浆(例如人血清或血浆)接触和/或含有所述血清或血浆。在一些实施方案中，血清或血浆对于从其获得细胞的受试者是自体的。在一些实施方案中，血清或血浆在样品中按以下浓度存在：至少或至少约10％(v/v)、至少或至少约15％(v/v)、至少或至少约20％(v/v)、至少或至少约25％(v/v)、至少或至少约30％(v/v)、至少或至少约35％(v/v)或至少或至少约40％(v/v)。在一些实施方案中，在选择和/或转导细胞之前，使含有原代细胞的样品与抗凝血剂接触或含有抗凝血剂。在一些实施方案中，抗凝血剂是或含有游离柠檬酸根离子，例如，抗凝血剂柠檬酸盐右旋糖溶液，溶液A(ACD-A)。
[0123] 在一些实施方案中，在富集和/或选择细胞之前，将来自样品的细胞转移或悬浮于无血清培养基中。在一些实施方案中，无血清培养基是定义的和/或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，无血清培养基可含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。在一些实施方案中，无血清培养基含有蛋白质，例如白蛋白，例如牛血清白蛋白、人血清白蛋白和/或重组白蛋白。在一些实施方案中，无血清培养基含有基础培养基，例如DMEM或RPMI 1640，其含有氨基酸、维生素、无机盐、缓冲剂、抗氧化剂和能量来源。在一些实施方案中，无血清培养基补充有例如但不限于白蛋白、化学上定义的脂质、生长因子、胰岛素、细胞因子和/或抗氧化剂。在一些实施方案中，配制无血清培养基以支持某种细胞类型(例如免疫细胞、T细胞和/或CD4+和CD8+T细胞)的细胞的生长、增殖、健康、稳态。
[0124] 在一些实施方案中，在选择和/或富集细胞之前，在进一步处理步骤之前，可以静息或保持样品或样品中的细胞。在一些实施方案中，将样品维持在或保持在为或为约2℃至8℃的温度下长达48小时，例如长达12小时、24小时或36小时。
[0125] 在一些实施方案中，制备方法在分离、选择和/或富集和/或用于转导和工程化的孵育之前或之后包括冷冻(例如冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除所述细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将所述细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
[0126] 在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。
[0127] 在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
[0128] 在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(如表面标记，例如表面蛋白、细胞内标记或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的用于分离的方法。在一些实施方案中，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于所述细胞的一种或多种标记(通常为细胞表面标记)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过和与此类标记特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞。
[0129] 此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记进行分离。
[0130] 所述分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样地，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
[0131] 在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具特异性)一起孵育。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。
[0132] 例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。
[0133] 例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如， M-450CD3/CD28T Cell Expander)阳性选择CD3+,CD28+T细胞。
[0134] 在一些实施方案中，通过阳性选择针对特定细胞群富集或者通过阴性选择针对特定细胞群耗尽来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达或以相对较高水平(标记高)(标记+)的一种或多种表面标记特异性结合。
[0135] 在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
[0136] 在一些实施方案中，如通过基于与相应子群体相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善给予后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人。(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
[0137] 在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
[0138] 在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面这种选择是同时进行的，而在其他方面以任何顺序依次进行。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
[0139] 在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后所述阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。
[0140] 通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
[0141] 在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分开技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑 Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
[0142] 在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像Dynalbeads或MACS珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性结合。
[0143] 在一些实施方案中，所述磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和在欧洲专利说明书EP 452342B(将其通过引用特此并入)中描述的那些。胶体大小的颗粒，如在Owen美国专利号4,795,698以及Liberti等人,美国专利号5,200,084中描述的那些是其他例子。
[0144] 所述孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁性颗粒或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。
[0145] 在一些方面，将所述样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加工或经受另外的分离步骤。
[0146] 在某些实施方案中，所述磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标记具特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
[0147] 在一些实施方案中，所述磁响应颗粒保持附着于所述细胞，所述细胞随后被孵育，培养和/或工程化；在一些方面，所述颗粒保持附着于所述细胞以用于给予患者。在一些实施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争的非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
[0148] 在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活的细胞分选(MACS)(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)进行的。磁激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择附着有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，所述非靶细胞被标记并从异质细胞群中耗尽。
[0149] 在某些实施方案中，使用这样的系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、加工、孵育、培养和/或制备步骤中的一种或多种。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO 2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
[0150] 在一些实施方案中，所述方法包括选择细胞，其中全部或部分选择是在离心室的内腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(例如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。
[0151] 例如，基于免疫亲和力的选择可取决于所分离细胞与特异性地结合至细胞上的标记的分子(例如固体(例如颗粒)上的抗体或其他结合配偶体)之间的有利的能量相互作用。在某些用于使用颗粒(例如珠)的基于亲和力的分离的可用方法中，将颗粒和细胞在容器(例如管或袋)中孵育，同时振荡或混合，且细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能量上有利的相互作用。此类途径对于用于大规模生产可能不是理想的，例如，因为其可能需要使用大体积以维持最佳或所需的细胞与颗粒的比率，同时维持所需的细胞数量。因此，此类途径可能需要以分批模式或形式进行处理，这可能需要增加时间、步骤数和操作，从而增加成本和用户错误的风险。
[0152] 在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中实施此类选择步骤或其部分(例如，与抗体涂覆的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，例如各种溶液的体积、在处理期间溶液的添加及其定时，与其他可用方法相比，这可以提供多种优势。例如，在孵育期间减少空腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数。这又可以增强正在处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤，允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
[0153] 在一些实施方案中，至少一部分选择步骤是在离心室中进行，其包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类工艺的一些方面，将一定体积的细胞与一定量所需的基于亲和力的选择试剂混合，所述体积和所述量显著少于在管或容器中根据制造商的说明书进行类似选择以选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常所用的体积和量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量为根据制造商的说明针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞在基于管或容器的孵育中用于选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
[0154] 例如作为可以在室空腔中进行的选择方法的部分的与一种或多种选择试剂一起孵育包括使用一种或多种选择试剂，基于一种或多种特定分子(例如表面标记，例如表面蛋白、细胞内标记或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在，选择一种或多种不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的方法，使用一种或多种选择试剂，基于此类标记进行分离。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合至抗体或结合配偶体的那些细胞。
[0155] 在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有具有选择试剂的选择缓冲液，所述选择试剂例如特异性地结合至希望富集和/或耗尽的细胞上(而不是组合物中其他细胞上)的表面标记的分子，例如抗体，其任选地偶联到支架(例如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，例如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠)。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，实现相同数量的细胞或相同体积的细胞的大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如
10mL至200mL试剂的孵育的目标体积，例如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、
60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
10mL至200mL试剂的孵育的目标体积，例如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、
60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
[0156] 在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间为或为约5分钟至6小时，例如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
[0157] 在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在样品或室壁或其他容器壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或为约或至少80g、
85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
[0158] 在一些实施方案中，这个过程是在集成有所述室的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如预先洗涤步骤洗涤含有细胞的样品，例如单采术样品)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入和推出所述室并进行离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
[0159] 在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，将所孵育的细胞进行分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在离心室外部进行进一步选择。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，其中存在离心室并且其中将细胞与选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与选择试剂一起孵育后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细胞)从离心室压出，例如从离心室转移到系统中，用于基于免疫亲和力来分离细胞。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。在一些实施方案中，在分离之前，可以在室中进行一个或多个其他处理步骤，例如洗涤。
[0160] 在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotic)进行分离和/或其他步骤，例如用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上的细胞的自动化分离。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，所述集成计算机控制所述仪器的所有部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，所述磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。所述蠕动泵控制整个管组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。
[0161] 在一些方面，所述CliniMACS系统使用抗体偶联的可磁化颗粒，其在无菌，无热原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤所述细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，所述系统自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群在去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收集袋内。
[0162] 在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞加工联合体，其允许通过离心自动化洗涤和分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成细胞养殖室，其实现细胞培养方案例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见，例如，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660,Terakura等人(2012)Blood.1:72-82，以及Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
[0163] 在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群，其中针对多种细胞表面标记染色的细胞在流体流中载携。在一些实施方案中，通过制备规模(FACS)分类收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群(参见例如，WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376)。在两种情况下，细胞可以用多种标记来标记，允许以高纯度分离明确定义的T细胞子集。
[0164] 在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记来标记抗体或结合配偶体，以促进分离供阳性和/或阴性选择。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞在流体流中载携，如通过荧光激活细胞分选(FACS)，包括制备规模(FACS)和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和阴性选择。
[0165] 在一些实施方案中，用于通过所提供的逆转录病毒载体粒子进行转导的细胞包括例如单核细胞、单核细胞源巨噬细胞、单核细胞源树突细胞或静息T细胞。在特定实施方案中，所提供的逆转录病毒粒子可以转导静息T细胞。在一些实施方案中，输入组合物包含多个细胞，例如免疫细胞，例如T细胞，所述细胞是非循环的和/或静止的和/或静息的，和/或其中如此转导的群体中大多数细胞(例如大于50％、60％、70％、80％、80％或更多的细胞)是非循环和/或静止和/或静息的。在一些实施方案中，输入组合物包含T细胞群，其中所述群体中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的T细胞是静息T细胞，例如缺乏T细胞激活标记(例如表面标记或细胞内细胞因子或其他标记)的T细胞和/或处于细胞周期的G0或G0G1a期的T细胞。在一些实施方案中，细胞含有活性SAMHD1，例如未磷酸化的SAMHD1。在一些实施方案中，细胞处于细胞周期的G0、G0/G1a或G1期。
[0166] 在一些实施方案中，所述方法涉及T细胞的转导，其中不超过5％、10％、20％、30％或40％的T细胞表达T细胞激活标记。在一些实施方案中，不超过5％、10％、20％、30％或40％的T细胞针对一种或多种T细胞激活标记HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L(CD154)和/或
4-1BB(CD137)是表面阳性的。在一些实施方案中，不超过5％、10％、20％、30％或40％的T细胞具有细胞因子的细胞内表达，所述细胞因子是IL-2、IFN-γ和/或TNF-α。
4-1BB(CD137)是表面阳性的。在一些实施方案中，不超过5％、10％、20％、30％或40％的T细胞具有细胞因子的细胞内表达，所述细胞因子是IL-2、IFN-γ和/或TNF-α。
[0167] B.病毒载体粒子
[0168] 在一些实施方案中，病毒载体粒子是逆转录病毒载体粒子，例如慢病毒粒子，其在病毒载体的基因组中含有编码重组和/或异源分子(例如重组或异源蛋白，例如重组和/或异源受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或其他抗原受体)的核酸。病毒载体粒子的基因组通常包括除了编码重组分子的核酸以外的序列。此类序列可包括允许将基因组包装到病毒粒子中的序列和/或促进编码重组受体(例如CAR)的核酸表达的序列。
[0169] 1.病毒载体
[0170] 在一些实施方案中，病毒载体粒子含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的异源核酸含于和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
[0171] 在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，例如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因产生慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人，(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998，美国专利号6,013,516和5,994,136。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801University Blvd.，Manassas，Va.20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
[0172] 慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人，(1996和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998，美国专利号6,013,
516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801University Blvd.，Manassas，Va.20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801University Blvd.，Manassas，Va.20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
[0173] 在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(例如慢病毒)的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
[0174] 在一些实施方案中，病毒载体(例如HIV病毒载体)的核酸缺乏额外的转录单元。载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol 72：9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的U3区中的缺失可用于产生自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将这种缺失转移至原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有来自3'长末端重复序列(LTR)的增强子和启动子序列的缺失，其在载体整合期间被复制到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在转导的细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录后产生的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。自失活3'LTR可以通过本领域已知的任何方法构建。在一些实施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
[0175] 任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以在病毒构建体中用启动子序列(例如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系回收的病毒的滴度。还可以包括增强子序列。可以使用增加包装细胞系中病毒RNA基因组表达的任何增强子/启动子组合。在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
[0176] 在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合的载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身以通过例如使一个或两个附着位点突变或缺失来防止整合，或通过缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤束(PPT)无功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传途径；这些途径包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些途径并不相互排斥；也就是说，可以一次使用多于一种所述途径。例如，整合酶和附着位点二者可以都没有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附着位点和PPT位点可以没有功能，或者其都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参见Philpott和Thrasher,Human Gene Therapy 18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人J Virol 73:9011(1999)；
WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin J Virol 70:
5288,1996)。
WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin J Virol 70:
5288,1996)。
[0177] 在一些实施方案中，载体含有用于在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有一个或多个复制起点，用于在原核细胞(例如细菌细胞)中繁殖。在一些实施方案中，包括原核复制起点的载体也可含有一种如下基因，所述基因的表达赋予可检测或可选择的标记，例如抗药性。
[0178] 2.SAMHD1抑制辅助蛋白
[0179] 所提供的实施方案包括逆转录病毒载体粒子，其含有包封在其病毒粒子中的SAMHD1抑制辅助蛋白。在一些方面，此类粒子允许对非循环细胞(例如非循环免疫细胞，例如静息T细胞)的有效转导。在一些方面，此类粒子允许对单核细胞、单核细胞源巨噬细胞或单核细胞源树突细胞的有效转导。在一些方面，所提供的逆转录病毒载体粒子最小化和/或降低对用于转导的细胞的离体操作的需要，例如用于激活和/或刺激细胞的那些。
[0180] SAMHD1是存在于一些非循环和/或静止免疫细胞中的蛋白质，其具有dGTP依赖性脱氧核苷酸三磷酸水解酶活性，并且可以使细胞脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)去磷酸化。细胞中具有抗病毒活性的活性SAMHD1(例如未磷酸化的SAMHD1)的存在可以减小核苷酸库。因此，这种减小可以通过防止病毒载体遇到足够数量的核苷酸以促进例如病毒基因组的病毒RNA的充分逆转录来限制逆转录病毒转导。虽然在一些情况下，循环细胞(如激活的或增殖的T细胞)可以表达SAMHD1，但SAMHD1的抗病毒活性在一些方面受SAMHD1的细胞周期依赖性磷酸化调节(Cribier等人(2013)Cell Reports,3:1036-1043)。例如，在循环细胞中，SAMHD1通常与细胞周期相关蛋白相互作用，并且在一些方面，SAMHD1由细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)磷酸化。人SAMHD1的示例性序列陈述于SEQ ID NO:19中(参见例如UniProt号Q9Y3Z3)。例如，在一些实施方案中，SAMHD1可以在对应于SEQ ID NO:19中所述SAMHD1的示例性序列的位置T592的位置被磷酸化。磷酸化的SAMHD1具有降低的和/或最小的活性，从而解释对循环T细胞中的转导缺乏病毒限制。
[0181] 通过将SAMHD1抑制性辅助蛋白掺入病毒粒子中，在所提供的载体粒子和方法的一些实施方案中，SAMHD1在用所提供的逆转录病毒载体粒子引入的细胞中被抑制，例如被降解。这增加了核苷酸池，从而允许在表达SAMHD1的静止和/或非循环细胞中发生转导。在一些实施方案中，所提供的逆转录病毒粒子含有SAMHD1抑制蛋白，并且可以转导含有活性SAMHD1(例如未磷酸化的SAMHD1蛋白)的细胞。在一些实施方案中，通过所提供的逆转录病毒载体粒子进行的转导发生在其中SAMHD1在对应于SEQ ID NO:19中所示SAMHD1的示例性序列中的位置T592的位置处未被磷酸化的细胞中。评价SAMHD1的表达和/或磷酸化的方法可以使用已知技术来评价，例如，通过蛋白质印迹使用SAMHD1特异性抗体，使用Phos标签丙烯酰胺技术或其他类似方法进行SDS-PAGE和/或磷酸盐亲和SDS-PAGE(参见例如Cribier等人)。
[0182] 在特定实施方案中，经修饰以在其病毒粒子中含有SAMHD1抑制辅助蛋白的所提供的逆转录病毒载体粒子是依赖于宿主核苷酸进行转导的任何病毒载体。此类病毒载体粒子可以包括逆转录病毒载体粒子，例如慢病毒或γ逆转录病毒载体粒子，其利用细胞dNTP通过病毒逆转录酶从病毒RNA合成病毒cDNA。
[0183] 在一些实施方案中，SAMHD1抑制蛋白是展现SAMHD1抑制活性的病毒宿主细胞蛋白。在一些实施方案中，SAMHD1抑制蛋白是慢病毒蛋白，例如慢病毒Vpx或Vpr蛋白，或其展现SAMHD1抑制活性的变体或部分。在不同的慢病毒中表达的Vpx和Vpr共享序列和结构同源性，并且是在装配时包装至病毒粒子中的病毒粒子相关蛋白。在引入细胞中后，Vpx和(在一些方面)Vpr可以通过细胞中由CUL4A-DDB1-DCAF1宿主细胞蛋白形成的泛素连接酶复合物干扰SAMHD1的泛素化，从而靶向SAMHD1用于蛋白酶体降解(Schwefel等人(2014)Nature 505:234-238)。在一些实施方案中，通过Vpr或Vpx蛋白抑制(例如降解)SAMHD1是通过Vpx或Vpr慢病毒蛋白与SAMHD1和/或泛素连接酶复合物中的DDB1或DCAF1的一个或多个的结合来介导的。
[0184] 在一些实施方案中，SAMHD1抑制蛋白是特异性结合和/或抑制SAMHD1的抗体或其片段。
[0185] 在一些实施方案中，所提供的逆转录病毒载体粒子展现降解宿主细胞(例如静息T细胞)中的SAMHD1的活性，已经将病毒载体粒子引入所述细胞中。在一些方面，与未用逆转录病毒载体粒子引入的相同细胞中SAMHD1的表达或水平相比，SAMHD1可以2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更多地降解。在一些此类实施方案中，可以在将所提供的含有SAMHD1抑制蛋白的逆转录病毒载体粒子转导或以其他形式转移到非循环宿主细胞(例如静息T细胞)中之后，监测或观察SAMHD1的降解。可以通过确定如与在未用逆转录病毒载体粒子引入的相同细胞中SAMHD1的表达相比，SAMHD1表达的相对程度来测量降解。可以使用多种用于评价蛋白质表达水平的公知方法。在一些实施方案中，SAMHD1可以通过免疫印迹利用SAMHD1特异性抗体例如在来自裂解细胞的样品中检测。表达的程度或水平也可以通过标准程序(例如通过光密度测定)来量化和/或定量。在一些实施方案中，SAMHD1水平和/或表达可以随时间来监测，和/或可以通过改变病毒输入来监测。
[0186] 在一些方面，所提供的含有SAMHD1抑制蛋白(例如Vpx或Vpr蛋白)的逆转录病毒载体粒子使非循环和/或静止或静息免疫细胞更易于转导和引入由这种载体编码的基因工程化分子，所述载体例如为编码基因工程化受体(例如重组抗原受体(如CAR)和/或其他重组受体)的那些，所述其他重组受体例如为含有细胞外配体结合或识别结构域和细胞内信号传导结构域或能够增强至T细胞的刺激性信号的结构域(例如含有ITAM的结构域和/或T细胞共刺激结构域)的那些。在一些实施方案中，提供了使用所提供的含有SAMHD1抑制蛋白(例如Vpx蛋白或Vpr蛋白)的逆转录病毒载体粒子将基因工程化受体(例如重组抗原受体(如CAR)和/或其他重组受体)转导和/或引入至单核细胞源巨噬细胞、单核细胞源树突细胞或静息T细胞中的方法。
[0187] 在一些实施方案中，SAMHD1抑制剂是Vpx蛋白、Vpr蛋白，或是Vpx或Vpr蛋白的展现SAMHD1抑制活性的功能变体或部分。在一些实施方案中，Vpx是在灵长类动物慢病毒中发现的112个氨基酸(aa)的18kDa蛋白质。来自SIV和HIV-2的Vpx在氨基酸水平上是83％一致的(Goujon等人，J Virol,82:12335-12345(2008))，并展现结合和降解SAMHD1的活性(Laguette等人,Nature,474:654-657(2011))。Vpx仅存在于一些慢病毒中；在HIV-1中没有发现Vpx。密切相关的基因Vpr与Vpx共享高度结构和序列同源性，由所有灵长类动物慢病毒编码，并且在一些情况下，已经进化为也展现SAMHD1活性。Vpx和Vpr都通过其与p55gag前体的p6区域的相互作用包装于病毒粒子中。
[0188] 在所提供的颗粒、组合物和方法中，可以使用展现SAMHD1抑制活性的任何合适的Vpx和/或Vpr蛋白。如果蛋白质能够抑制(例如降解)细胞中的SAMHD1，那么所述蛋白质展现SAMHD1抑制活性。在一些情况下，可以例如使用本领域已知或如所述的方法，在引入含有这种蛋白质的病毒载体粒子后，与使用不含有这种蛋白质的病毒载体相比，通过评价非循环细胞(例如静息T细胞)中的SAMHD1降解来监测抑制。在一些实施方案中，根据多种已知方法中的一种或多种测试Vpx、Vpr及其变体抑制SAMHDl活性的能力。参见Lim等人,Cell Host&Microbe,11,194-204(2012)和Lahouassa等人,Nature Immunol,13:3,223-229(2012)。在一些情况下，可以例如使用本领域已知或如所述的方法，与可比较或相同但不含Vpx或Vpr蛋白的病毒载体相比，在引入含有这种蛋白质的病毒载体粒子之后，通过评价非循环细胞(例如静息T细胞)中的转导效率来监测抑制。
[0189] 在一些实施方案中，提供Vpx和/或Vpr或变体或部分用于包装和掺入病毒粒子中。在一些实施方案中，将编码Vpx蛋白、Vpr蛋白或者Vpx或Vpr蛋白的变体或部分的基因包括于慢病毒基因组中，并且在病毒粒子感染靶细胞时表达。
[0190] 在一些实施方案中，SAMHD1抑制蛋白是由野生型慢病毒(例如野生型灵长类慢病毒)编码的Vpx蛋白，或者是所述Vpx蛋白展现SAMHD1抑制活性的变体或部分(参见例如Fregoso(2013)PLoS Pathogens,9:e1003496)。编码Vpx的灵长类动物慢病毒包括HIV-2/SIVsmc相关的和SIVrcm/SIVmnd2相关的谱系病毒(Lim等人(2012)Cell Host&Microbe,11:194-204)，如HIV-2、SIV乌色白眉猴(SIVsm)、SIV红帽白眉猴(SIVrcm)和SIV短尾猿(SIVmac)、SIV山魈(SIVmnd2)、SIV鬼狒(SIVdrl)、SIV豚尾猕猴(SIVmne)。
[0191] 在一些实施方案中，逆转录病毒载体粒子(如慢病毒载体粒子)含有由HIV-2、SIVsm、SIVrcm、SIVmac、SIVmnd2、SIVdr1、SIVmne编码的野生型Vpx蛋白，或者是所述蛋白展现SAMHD1抑制活性的变体或部分。在一些实施方案中，Vpx蛋白具有与SEQ ID NO:1(SIVmac Vpx)至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是这种蛋白质的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpx蛋白质具有与SEQ ID NO:2(SIVsm Vpx)至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是这种蛋白质的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpx蛋白质具有与SEQ ID NO:3(SIVrcm Vpx)至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是这种蛋白质的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpx蛋白具有与SEQ ID NO:4(HIV-2)至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是这种蛋白质的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpx蛋白质具有与SEQ ID NO:16(SIVmnd2)至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是这种蛋白质的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpx蛋白具有与SEQ ID NO:17(SIVdr1)至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是这种蛋白质的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpx蛋白质具有与SEQ ID NO:18(SIVmne)至少
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是这种蛋白质的功能片段或部分。
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是这种蛋白质的功能片段或部分。
[0192] 在一些实施方案中，SAMHD1抑制蛋白是展现SAMHD1抑制活性的Vpr蛋白。Vpr通常由天然慢病毒编码。并非所有Vpr蛋白都展现SAMHD1抑制活性。例如，已经报道来自SIVdeb、SIVmus、SIVagm、SIVden、SIVtal、SIVgsn、SIVmon和SIVsyk的Vpr展现SAMHD1抑制活性(Lim等人(2012)Cell Host&Microbe,11:194-204)。
[0193] 在一些实施方案中，SAMHD1抑制蛋白是SIVdeb Vpr、SIVmus Vpr、SIVagm Vpr、SIVden Vpr、SIVtal Vpr、SIVgsn Vpr、SIVmon Vpr或SIVsyk Vpr，或者是它们展现SAMHD1抑制活性的变体或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:5(SIVdeb)至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:6(SIVmus)至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:7(SIVagm Vpr)至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:8(SIVagm Vpr)至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:9(SIVdeb Vpr)至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:10(SIVden Vpr)至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，变体具有与SEQ ID NO:11(SIVtal Vpr)至少75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述变体的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:12(SIVgsn Vpr)至少75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:13(SIVgsn Vpr)至少75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:14(SIVmon Vpr)至少75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:15(SIVsyk Vpr)至少75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:7(SIVagm Vpr)至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:8(SIVagm Vpr)至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:9(SIVdeb Vpr)至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:10(SIVden Vpr)至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，变体具有与SEQ ID NO:11(SIVtal Vpr)至少75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述变体的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:12(SIVgsn Vpr)至少75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:13(SIVgsn Vpr)至少75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:14(SIVmon Vpr)至少75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:15(SIVsyk Vpr)至少75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的功能片段或部分。
[0194] 在一些实施方案中，SAMHD1抑制蛋白(例如Vpx或Vpr蛋白)对于所述病毒是异源的。在这种情况下，异源意味着，与掺入蛋白质的病毒科、纲或种相比，所述蛋白质源自不同的病毒科、纲或种。例如，在一些方面，可以将来自SIVmac的Vpx蛋白掺入HIV-1载体粒子中。在其他方面，可以将来自任何慢病毒(例如来自SIVmac)的Vpx蛋白掺入γ逆转录病毒(例如MLV)中。
[0195] 在一些实施方案中，SAMHD1抑制蛋白(例如Vpx或Vpr蛋白)抑制(例如降解)例如SEQ ID NO:19中所示的人SAMHD1(Lim等人(2012)Cell Host&Microbe,11:194-204)。在一些实施方案中，降解人SAMHD1的Vpx蛋白是由HIV-2或SIVmac编码，或者是所述蛋白的降解人SAMHD1的变体或功能片段或部分。例如，在一些实施方案中，Vpx蛋白具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的降解人SAMHD1的功能片段或部分。在一些实施方案中，降解人SAMHD1的Vpr蛋白可以由SIVdeb或SIVmus编码，或者是所述蛋白的降解人SAMHD1的变体或功能片段或部分。例如，在一些实施方案中，Vpr蛋白具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，或者是所述蛋白的降解人SAMHD1的功能片段或部分。
[0196] 在一些实施方案中，与野生型或参考Vpx或Vpr蛋白的序列相比，变体包括含有一个或多个氨基酸缺失、插入和/或取代的蛋白质。在一些情况下，变体包括非保守或保守取代。在一些情况下，来自Vpx蛋白和/或Vpr蛋白的序列比对的信息可用于产生Vpx或Vpr的功能变体和功能片段变体。例如，可以在编码Vpx或Vpr蛋白的病毒之间不同的位置引入一个或多个保守或非保守取代。
[0197] 例如，在一些实施方案中，在SIV和HIV-2编码的两种Vpx蛋白之间和更多种Vpx蛋白之间共享同一性的残基在本文提供的Vpx蛋白的变体中没有变化或改变。例如，已显示以下突变降低或消除Vpx活性：富含脯氨酸的C末端11个残基的缺失、Ser13Ala、Lys84Ala/Lys85Ala、Thr17Ala、Thr28Ala、Gly86Ala/Cys87Ala、Ser13Ala/Thr17Ala/Thr28Ala、His39Ala、Tyr66Ala/Tyr69Ala/Tyr71Ala、Trp49Ala/Trp53Ala/Trp56Ala、Lys68Ala/Lys77Ala、Gln76Ala、Pro9Gly、Asn12Ala、Glu15Ala、Glu16Ala、Phe80Ala，各自关于SEQ ID NO:1中所示的残基显示。参见Goujon等人，Gramberg等人(2010)Journal of Virology,84:1387-1396.，Laguette等人(2011)。因此，在一些实施方案中，Vpx蛋白的变体在与显示为活性所需的SEQ ID NO:1中的任何上述残基对应的残基处不含有取代。在一些实施方案中，Vpx蛋白的变体在与SEQ ID NO:1中的任何上述残基对应的残基处含有保守取代，但不含非保守取代。
[0198] 在一些实施方案中，Vpx或Vpr蛋白的变体可包括已知不影响SAMHD1抑制活性的突变(参见Goujon等，J Virol,82:12335-12345(2008))。例如，在一些实施方案中，例如与SEQ ID NO:1中的Asn26Ala、Ser52Ala和Ser63Ala/Ser65Ala突变中的一个或多个对应的氨基酸取代的突变不影响Vpx功能。
[0199] 在一些实施方案中，SAMHD1的抑制和/或降解需要SAMHD1抑制蛋白(例如Vpx蛋白、Vpr蛋白或其变体或部分)的核定位。Vpx在核中诱导SAMHD1泛素化和降解，使得SAMHD1和Vpx二者都必须定位于细胞核。因此，在一些实施方案中，Vpx蛋白、Vpr蛋白或其变体或部分含有核定位信号。在一些实施方案中，Vpx蛋白或其变体或部分含有对应于关于SEQ ID NO:4的残基62-80或65-72的核定位信号。
[0200] 在一些实施方案中，SAMHD1的抑制和/或降解涉及与DCAF的结合和/或相互作用。因此，在一些实施方案中，Vpx蛋白、Vpr蛋白或其变体或部分结合至DCAF。在一些实施方案中，Vpx蛋白、Vpr蛋白或其变体或部分含有Wx4Φx2Φx3AΦxH基序(陈述于SEQ ID NO:26中；Wei等人(2012)CellMicrobiol.,14:1745-56)。例如，在一些实施方案中，Vpx蛋白、Vpr蛋白或其变体或部分在对应于关于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的残基24-39的残基处含有Wx4Φx2Φx3AΦxH基序。在一些实施方案中，Vpx蛋白、Vpr蛋白或其变体或部分在对应于SEQ ID NO:1的位置76的位置含有Gln(Q)。
[0201] 在一些实施方案中，Vpx蛋白、Vpr蛋白或其变体或部分含有与蛋白质的N-末端部分、螺旋1、螺旋2和/或螺旋3的残基对应的残基(Gramberg等人(2010)Journal of Virology,84:1387-1396)。例如，在一些实施方案中，Vpx蛋白、Vpr蛋白或其变体或部分含有对应于SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的残基1-86的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:1的残基1至86是至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的，并展现SAMHD1抑制活性的氨基酸取代的变体。
[0202] 在一些实施方案中，将Vpx或Vpr蛋白或其功能部分或变体包装到病毒粒子中，这允许蛋白质在感染宿主细胞后在原病毒整合之前抑制(例如降解)SAMHD1。在一些实施方案中，逆转录病毒载体粒子含有Gag蛋白的p6结构域，所述p6结构域促进将SAMHD1抑制性慢病毒蛋白包装到逆转录病毒载体中。Vpx和Vpr是通过与Gag前体多肽的p6区(p6gag)中的氨基酸包装基序相互作用来包装。在一些实施方案中，使用内源性病毒p6Gag实现充分掺入。在一些实施方案中，通过使用含有促进包装的包装基序的嵌合p6Gag来实现和/或增加掺入。
[0203] 在一些实施方案中，包装基序对应于P6的N末端区域中包含与SEQ ID NO:21的氨基酸残基17至23对应的氨基酸的基序(Accola等人(1999)J.Virol.,73:9992-9)。例如，在一些实施方案中，包装基序包含含亮氨酸的基序DXAXXLL(SEQ ID NO:22)。
[0204] 在一些实施方案中，通过引入包装基序来修饰逆转录病毒载体粒子，所述包装基序介导和/或促进将Vpx或Vpr包装到病毒粒子中。在一些实施方案中，将包装基序插入内源病毒p6区的相应位置中。在一些实施方案中，包装基序包含氨基酸序列DPAVDLL(SEQ ID NO:23)或DPAVDLLKNY(SEQ ID NO:24)，其分别对应于SEQ ID NO:21中所述SIVmac p6的氨基酸17至23或氨基酸17至26。在一些实施方案中，包装基序是美国公开申请号US2013/0183334中所述的任何包装基序。在一些实施方案中，将基序转移到SEQ ID NO:20中所示的HIV-1p6的相应位置中产生包装Vpx的HIV-1病毒粒子。
[0205] 在一些实施方案中，在不修饰Gag蛋白的p6区的情况下包装Vpx或Vpr蛋白或其变体或部分。在一些此类实施方案中，逆转录病毒载体源自HIV-1，并且使用HIV-1p6Gag实现充分掺入。在一些此类实施方案中，SAMHD1抑制蛋白是SIVmac Vpx或者是其展现SAMHD1抑制活性的变体或部分。
[0206] 在一些实施方案中，逆转录病毒载体源自HIV-1，并且包含嵌合或杂合p6结构域，所述结构域包含HIV-1p6，其中插入了SIVmac p6包装基序。例如，在一些实施方案中，逆转录病毒载体包含嵌合或杂合p6结构域，所述结构域以连续顺序包含对应于SEQ ID NO:20中所示的HIV-P6的氨基酸1-14的氨基酸残基、与如SEQ ID NO:21的残基17至26所示的SIVmac包装基序对应的氨基酸，以及与SEQ ID NO:20的氨基酸残基21至52对应的HIV-1p6的C末端部分(命名为SIV 17-23b；参见US 2013/0183334；Sunseri等人(2011)J.Virol.,85:6263-6274)。例如，在一些实施方案中，杂合或嵌合p6结构域包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。
[0207] 3.编码异源蛋白质的核酸
[0208] 在一些实施方案中，病毒载体含有编码异源重组蛋白的核酸。在一些实施方案中，异源重组分子是或包括重组受体(例如，抗原受体)、SB转座子(例如用于基因沉默)、衣壳包封的转座子、同源双链核酸(例如，用于基因组重组)或报告基因(例如荧光蛋白，例如GFP)或萤光素酶)。
[0209] 在一些实施方案中，病毒载体含有编码重组受体和/或嵌合受体(例如异源受体蛋白)的核酸。重组受体(例如异源受体)可以包括抗原受体，例如功能性非TCR抗原受体，包括嵌合抗原受体(CAR)和其他抗原结合受体，例如转基因T细胞受体(TCR)。受体还可以包括其他受体，例如其他嵌合受体，例如与特定配体结合并具有与CAR中存在的那些类似的跨膜和/或细胞内信号传导结构域的受体。
[0210] 在任何此类例子中，将核酸插入或定位于病毒载体的区域中，例如通常在病毒基因组的非必需区域中。在一些实施方案中，将核酸插入病毒基因组的某些病毒序列的位置中以产生具有复制缺陷的病毒。
[0211] 在一些实施方案中，所编码的重组抗原受体(例如CAR)是能够特异性地结合至要靶向的细胞或疾病上的一种或多种配体的受体，所述疾病例如为癌症、感染性疾病、炎症或自身免疫性疾病或其他疾病或病症，包括本文所述用于以所提供的方法和组合物靶向的那些。
[0212] 在一些实施方案中，示例性抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体
5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富含亮氨酸的重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称作5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化的分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富含亮氨酸的重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称作5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化的分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
[0213] 在一些实施方案中，示例性抗原是孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2和MAGE A3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白(例如细胞周期蛋白A1(CCNA1))，和/或生物素化的分子，和/或由HIV、HCV、HBV、HPV和/或其他病原体表达的分子和/或具有HIV、HCV、HBV、HPV和/或其他病原体的特征的分子或对HIV、HCV、HBV、HPV和/或其他病原体具有特异性的分子，和/或其致癌形式。
[0214] 在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
[0215] 在一些实施方案中，抗原受体(包括CAR和重组TCR)及其产生和引入包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,
762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):
633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18日(2):160-75。
762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):
633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18日(2):160-75。
[0216] a.嵌合抗原受体
[0217] 在一些实施方案中，病毒载体基因组中所含的核酸编码嵌合抗原受体(CAR)。CAR通常是基因工程化受体，其具有细胞外配体结合结构域，例如含有抗体或其片段的细胞外部分，所述细胞外配体结合结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域和/或细胞内结构域。此类分子通常模拟或接近通过天然抗原受体发出的信号和/或通过这种受体与共刺激受体的组合发出的信号。
[0218] 在一些实施方案中，CAR被构建具有对特定标记的特异性，例如在过继疗法所靶向的特定细胞类型中表达的标记，例如癌症标记和/或任何所述抗原。因此，CAR通常包括抗体的一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变结构域和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如可变重链(VH)或其抗原结合部分，或源自可变重链(VH)的单链抗体片段(scFv)和单克隆抗体(mAb)的可变轻链(VL)。
[0219] 在一些实施方案中，提供了工程化细胞，例如T细胞，其表达对特定抗原(或标记或配体)具有特异性的CAR，所述特定抗原例如为在特定细胞类型的表面上表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞例如肿瘤细胞或致病细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
[0220] 在特定实施方案中，重组受体(如嵌合受体)含有细胞内信号传导区域，所述细胞内信号传导区域包括细胞质信号传导结构域或区域(也可互换地称为细胞内信号传导结构域或区域)，例如能够在T细胞中诱导初级激活信号的细胞质(细胞内)区域，例如，T细胞受体(TCR)组分的细胞质信号传导结构域或区域(例如，CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号传导部分的ζ链的细胞质信号传导结构域或区域)；和/或所述细胞内信号传导区域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的细胞质信号传导结构域或区域。
[0221] 在一些实施方案中，嵌合受体还含有特异性地结合至配体(例如抗原)抗原的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，嵌合受体是CAR，其含有特异性地结合至抗原的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，配体(如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
[0222] 示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,
190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,
354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):
633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18日(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。
CAR的实例包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US 8,
339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；
Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号：7,446,190和美国专利号：8,389,282。
190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,
354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):
633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18日(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。
CAR的实例包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US 8,
339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；
Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号：7,446,190和美国专利号：8,389,282。
[0223] 在一些实施方案中，CAR被构建为具有对特定抗原(或标记或配体)的特异性，所述特定抗原例如为在过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如癌症标记)和/或旨在诱导衰减应答的抗原(例如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，所述CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
[0224] 在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分作为重组受体(例如抗原受体)的部分在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物表现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域通过接头和/或一个或多个跨膜结构域与一个或多个细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以通过天然抗原受体(如TCR)模拟或接近信号，并且任选地通过这种受体与共刺激受体组合模拟或接近信号。
[0225] 在一些实施方案中，重组受体(例如嵌合受体，例如CAR)包括与抗原(或配体)结合(例如特异性结合)的配体结合结构域。嵌合受体靶向的抗原包括在通过过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的情况下表达的抗原。所述疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
[0226] 在一些实施方案中，抗原(或配体)是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，如与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原(或配体)在疾病或病症的细胞(例如肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
[0227] 在一些实施方案中，CAR含有抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性识别在细胞表面上表达的抗原，例如完整抗原。
[0228] 在一些实施方案中，抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，抗原(或配体)抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富含亮氨酸的重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原，和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
[0229] 在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，例如抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性识别作为MHC-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(例如肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体的部分(例如抗原受体)在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物表现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。
[0230] 提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机构处理的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈现具有T细胞上的抗原受体(例如TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是异二聚体，其具有跨越α链的膜，在一些情况下具有三个α结构域和非共价缔合的β2微球蛋白。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β组成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，其含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体识别所需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，其中MHC-肽复合物由T细胞(例如通常CD8+T细胞，但在一些情况下是CD4+T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，其中所述肽通常由CD4+T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，其在小鼠中统称为H-2并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也以可称为人白细胞抗原(HLA)。
[0231] 术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，MHC-肽复合物可由抗原受体(例如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性地识别。
[0232] 在一些实施方案中，多肽的肽(例如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，例如用于由抗原受体识别。通常，所述肽源自或基于较长生物分子(例如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，所述肽的长度通常为约8至约24个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度为或为约9至22个氨基酸，用于在MHC II类复合物中识别。在一些实施方案中，肽的长度为或为约8至13个氨基酸，用于在MHC I类复合物中识别。在一些实施方案中，在识别MHC分子(例如MHC-肽复合物)背景中的肽后，抗原受体(例如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
[0233] 在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或可通过已知方法产生(参见例如美国公开申请号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/0191260；US 2006/0034850；US 2007/00992530；US 20090226474；US 20090304679；和国际PCT公开号WO
03/068201)。
03/068201)。
[0234] 在一些实施方案中，特异性地结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，MHC-肽复合物的肽是能够结合至MHC的抗原的表位，例如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主给予有效量的免疫原以用于引发免疫应答，其中所述免疫原保持其三维形式持续一段足以引发针对所述肽在所述MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫应答的时间。然后测定从宿主收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈现的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目标肽以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所需的抗体。
[0235] 在一些实施方案中，特异性地结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(例如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以产生突变体Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中所述文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如美国公开申请号US 20020150914、US 2014/0294841；和Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
[0236] 本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体(peptibody)、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体(heteroconjugate antibody)、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
[0237] 在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
[0238] 所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单一结构域VH单一抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在具体实施方案中，所述抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
[0239] 术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
[0240] 单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。
[0241] 抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那些)，和/或可不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些实施方案中，抗体片段是scFv。
[0242] “人源化”抗体是这样的抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基源自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指所述非人抗体的变体，其经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生出CDR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
[0243] 因此，在一些实施方案中，嵌合抗原受体(包括TCR样CAR)包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含主要信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
[0244] 在一些实施方案中，CAR的细胞外部分(例如其抗体部分)还包括间隔子，例如抗原识别组分(例如scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区域。间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰形式的至少一部分，例如铰链区，例如IgG4铰链区，和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG如IgG4或IgG1的。在一些方面，所述恒定区的部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:27中所示的序列，并且由SEQ ID NO:28中所示的序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:29中所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:30中列出的序列。
[0245] 在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:31中列出的序列。在一些实施方案中，间隔子具有展现与SEQ ID NO:27、29、30和31中的任一序列至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0246] 在一些实施方案中，间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰形式的至少一部分，例如铰链区(例如IgG4铰链区)、和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG如IgG4或IgG1的。在一些方面，所述恒定区的部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后增强的细胞反应性。在一些例子中，所述间隔子的长度为或约12个氨基酸或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于在Hudecek等人(2013)Cancer Res.,19:3153或国际专利申请公开号WO 2014/031687中描述的那些。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:27中所示的序列，并且由SEQ ID NO:28中所示的序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:29中所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:30中列出的序列。
[0247] 在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:31中列出的序列。在一些实施方案中，间隔子具有展现与SEQ ID NO:27、29、30和31中的任一序列至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0248] 细胞外配体结合结构域(例如抗原识别结构域)通常与一个或多个细胞内信号传导组分连接，所述一个或多个细胞内信号传导组分例如为在CAR的情况下通过抗原受体复合物(例如TCR复合物)模拟激活的信号传导组分和/或通过另一细胞表面受体传导的信号。在一些实施方案中，跨膜结构域连接细胞外配体结合结构域与细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号传导区域连接。在一些实施方案中，CAR包括与细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用天然地与受体(例如CAR)中的结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成员的相互作用。
[0249] 在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下项的那些跨膜区(即，包括以下项的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137或CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域。
[0250] 在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个之间的氨基酸的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)存在并形成CAR的跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间的连接。
[0251] 重组受体(例如CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如，CD3ζ链。因此，在一些方面，所述抗原结合部分与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如CAR)还包括一种或多种另外的分子(例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
[0252] 在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体后，受体的细胞质结构域和/或区域或细胞内信号传导结构域和/或区域激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情况下，CAR诱导T细胞的功能，例如细胞溶解活性或T辅助活性，例如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分(例如如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域(例如包含一个或多个细胞内信号传导结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体并行起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
[0253] 在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分也被包括在所述CAR中。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。
[0254] T细胞激活在一些方面被描述为由至少如下两类细胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
[0255] 在一些方面，所述CAR包括调节所述TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的例子包括源自以下项的那些：TCR或CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD8、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在某些实施方案中，含有初级细胞质信号传导序列的ITAM包括源自TCR或CD3ζ、FcRγ或FcRβ的那些。在一些实施方案中，所述CAR中的胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
[0256] 在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40、CD27、DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，相同的CAR包括激活或信号传导区域和共刺激组分。
[0257] 在一些实施方案中，激活结构域包括于一个CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，所述CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，CAR是刺激性或激活性CAR；在其他方面，其是共刺激性CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，例如识别不同抗原的CAR，其中通过识别第一抗原的CAR递送的激活信号通过抑制性CAR与其配体的结合而被减少或抑制，例如，以减少脱靶效应。
[0258] 在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137共刺激结构域。
[0259] 在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号传导结构域与CD4+辅助性T细胞的细胞内信号传导结构域相同。在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号传导结构域不同于CD4+辅助性T细胞的细胞内信号传导结构域。
[0260] 在一些实施方案中，CAR在细胞质部分中涵盖一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域以及激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包含CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
[0261] 在一些实施方案中，由所提供的病毒载体内的一个或多个核酸编码的一种或多种重组受体(例如CAR)还包括一种或多种标记，例如，用于确认要表达受体的细胞的转导或工程化和/或对表达由多核苷酸编码的一种或多种分子的细胞的选择和/或靶向的目的。在一些方面，这种标记可以由不同的核酸或多核苷酸编码，所述核酸或多核苷酸也可以在基因工程化过程期间被引入，通常通过相同的方法(例如通过本文所提供的任何方法转导，例如通过相同的载体或相同类型的载体转导)被引入。
[0262] 在一些方面，所述标记(例如转导标记)是蛋白质和/或是细胞表面分子。示例性标记是天然存在的(例如内源性)标记(例如天然存在的细胞表面分子)的截短的变体。在一些方面，与天然或内源细胞表面分子相比，变体具有降低的免疫原性、降低的运输功能和/或降低的信号传导功能。在一些实施方案中，所述标记是细胞表面受体的截短形式，例如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面，所述标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如截短形式)(例如tEGFR)。在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(例如可切割的接头序列，例如T2A P2A、E2A和/或F2A)的多核苷酸可操作地连接。参见，例如，WO 2014/031687。
[0263] 在一些实施方案中，标记是并非在T细胞上天然发现或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如细胞表面蛋白)或其部分。
[0264] 在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白质，即并非被将细胞过继转移至其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。
[0265] 在一些实施方案中，标记不提供治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，标记可以是治疗性分子或原本发挥一定所需作用的分子，如在体内所遇到的细胞的配体，如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或减弱细胞在过继转移和遇到配体后的反应。
[0266] 在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，例如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR在一些方面是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
[0267] 在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括细胞外配体结合部分(例如抗原结合部分，例如抗体或其片段)和细胞内结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单一结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，所述细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接和/或设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区域或结构域之间的跨膜结构域。
[0268] 在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。所述细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文描述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，如在所述跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
[0269] 在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如抗体片段)、是或含有CD28或其功能变体的跨膜部分的跨膜结构域，以及含有CD28或其功能变体的信号传导部分和CD3ζ或其功能变体的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体例如抗体片段，跨膜结构域(其是CD28的跨膜部分或其功能变体或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体进一步包括含有Ig分子(如人Ig分子，如Ig铰链，例如IgG4铰链)的一部分的间隔子如仅含铰链的间隔子。
[0270] 在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28或其变体的跨膜结构域，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域，或者是包含SEQ ID NO:34中所示氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:34至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，含有重组受体的部分的跨膜结构域包含SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0271] 在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
[0272] 在一些实施方案中，细胞内结构域包含人CD28或其功能变体或部分的细胞内共刺激信号传导结构域，例如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域和/或结构域可以包含SEQ ID NO:36或37中所示的氨基酸序列，或者展现与SEQ ID NO:36或37至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内区域和/或结构域包含4-1BB或其功能变体的细胞内共刺激信号传导结构域，例如人4-1BB(登录号Q07011.1)或其功能变体或部分的42个氨基酸的细胞质结构域，例如SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:38至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0273] 在一些实施方案中，细胞内信号传导区域和/或结构域包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激性信号传导结构域或其功能变体，例如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同种型3的112个AA的细胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含SEQ ID NO:39、40或41中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:39、40或41至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0274] 在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，例如仅IgG4或IgG1的铰链，例如仅SEQ ID NO:27中所示的铰链间隔子。在其他实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:29中所示。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:30中所示。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
[0275] 例如，在一些实施方案中，CAR包括：细胞外配体结合部分，例如抗原结合部分，例如抗体或其片段，包括sdAb和scFv，其特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔子，例如任何含有Ig铰链的间隔子；跨膜结构域，其是CD28或其变体的一部分；细胞内信号传导结构域，其含有CD28或其功能变体的信号传导部分；以及CD3ζ信号传导结构域或其功能变体的信号传导部分。在一些实施方案中，CAR包括：细胞外配体结合部分，例如抗原结合部分，例如抗体或其片段，包括sdAb和scFv，其特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔子，例如任何含有Ig铰链的间隔子；跨膜结构域，其是CD28或其变体的一部分；细胞内信号传导结构域，其含有4-1BB或其功能变体的信号传导部分；以及CD3ζ信号传导结构域或其功能变体的信号传导部分。在一些实施方案中，此类CAR构建体还包括例如CAR下游的T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列。
[0276] b.T细胞受体(TCR)
[0277] 在一些实施方案中，由一种或多种核酸编码的一种或多种重组分子是或包括重组T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，重组TCR对抗原具有特异性，所述抗原通常是存在于靶细胞上的抗原，例如肿瘤特异性抗原，在与自身免疫或炎性疾病相关的特定细胞类型上表达的抗原，或源自病毒病原体或细菌病原体的抗原。在一些实施方案中，提供了工程化细胞，例如T细胞，其表达识别靶多肽(例如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的TCR或其抗原结合部分。
[0278] 在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合部分，并且其能够特异性结合至与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，所述TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，发现TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。
[0279] 除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，所述TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合(如与MHC-肽复合物结合)。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
[0280] 在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见，例如，Jores等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者是在给定TCR可变区的用于所述肽-MHC复合物的加工肽部分的抗原识别和/或用于与其相互作用的三个CDR中最重要的CDR。在一些情境下，所述α链的CDR1可以与某些抗原肽的N-末端部分相互作用。在一些情境下，所述β链的CDR1可以与所述肽的C-末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2对与所述MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，所述β-链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)Clinical Microbiology Reviews,8:411-426)。
[0281] 在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾(参见，例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短细胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
[0282] 在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链的细胞外部分(例如，α链或β链)可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，例如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,Public Health Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α-链恒定域或Cα，通常基于Kabat编号的位置117至259，或β链恒定结构域或Cβ，通常基于Kabat的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，其中可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，由此连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可在每条α和β链中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
[0283] 在一些实施方案中，所述TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，所述TCR链含有胞质尾。在一些情况下，结构允许TCR与其他分子(如CD3和其亚基)缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将所述蛋白质锚定在细胞膜中并与所述CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
[0284] 在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者其可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体，所述链是通过例如一个或多个二硫键连接。
[0285] 在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα,β链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是易于获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。
[0286] 在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞，例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据对TCR序列的了解以合成方式产生。
[0287] 在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来产生，所述T细胞是从受试者分离，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，可以从CD4+或CD8+细胞产生TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如通过在从人获得的样品(如T细胞)中进行RT-PCR。在一些实施方案中，scTv文库可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中扩增的产物被克隆或组装以通过接头分开。取决于受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化产生。在一些方面，所述TCR经受定向进化，如通过诱变例如所述α或β链。在一些方面，所述TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰选择的TCR。在一些实施方案中，可以选择抗原特异性T细胞，如通过筛选以评估针对所述肽的CTL活性。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过结合活性，例如对所述抗原的特定亲和力或亲合力。
[0288] 在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体包括从天然存在的T细胞克隆的重组T细胞受体(TCR)和/或TCR。在一些实施方案中，TCR是从天然存在的T细胞克隆的TCR。在一些实施方案中，从患者鉴定并分离靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生针对靶抗原的TCR克隆。参见，例如，肿瘤抗原(参见，例如，Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180and Cohen等人(2005)JImmunol.175:5799-5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349-
354。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已经修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性如具有较高的对特定MHC-肽复合物的亲和力的TCR。在一些实施方案中，定向进化是通过展示方法实现的，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad Sci U S A,97,5387-92)、噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途径涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
354。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已经修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性如具有较高的对特定MHC-肽复合物的亲和力的TCR。在一些实施方案中，定向进化是通过展示方法实现的，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad Sci U S A,97,5387-92)、噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途径涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
[0289] 在一些实施方案中，用于产生或生成目标TCR的靶多肽的肽是已知的或可以由熟练技术人员容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于目标靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17(12):1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的约39％-46％中表达，并因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
[0290] 已知使用计算机预测模型的HLA-A0201结合基序和蛋白酶体和免疫蛋白酶体的切割位点。用于预测MHC I类结合位点的此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001)和SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHI,Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction.，Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,第409(1)卷:75-93 2007)中。
[0291] 在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白质或其突变形式(其中一种或多种特性(如结合特征)已经被改变)。在一些实施方案中，TCR可以来源于各种动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，所述TCR呈在细胞的表面上表达的细胞结合形式。
[0292] 在一些实施方案中，所述TCR是全长TCR。在一些实施方案中，所述TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，所述TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，所述TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO 2011/044186中所述的结构。
[0293] 在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，所述TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，所述TCR能够与CD3形成TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与在T细胞的表面上产生活性TCR的信号传导结构域连接。在一些实施方案中，所述TCR在细胞的表面上表达。
[0294] 在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键。在一些实施方案中，所述TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
[0295] 在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链(含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序)和TCRβ链(包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序)，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
[0296] 在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，可以使用已知的方法产生scTCR，参见例如Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)903830(1993)；国际公开PCT号WO
96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO 2011/044186；和Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见，例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C-末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有经由肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公开的PCT号WO 99/
18129)。
96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO 2011/044186；和Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见，例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C-末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有经由肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公开的PCT号WO 99/
18129)。
[0297] 在一些实施方案中，scTCR含有由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段、由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段(融合至对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端)和将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端的接头序列。
[0298] 在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至所述第二区段的N末端)。
[0299] 在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至所述第二区段的N末端)。
[0300] 在一些实施方案中，scTCR的连接所述第一和第二TCR区段的接头可以是能够形成单多肽链同时保留TCR结合特异性的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中所述氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，所述第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，所述接头具有足够的长度以跨越所述第一区段的C末端与所述第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长以阻断或减少所述scTCR与所述靶配体的结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有为或为约10至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:48)。在一些实施方案中，所述接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:49)
[0301] 在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键。
[0302] 在含有引入的链间二硫键的dTCR或scTCR的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，用形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸取代另一残基，如取代丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于已公开的国际PCT号WO2006/000830中。
[0303] 在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段对靶抗原以平衡结合常数展现出亲和力，所述平衡结合常数是在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
[0304] 在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克隆或其他合适的方法扩增，并且克隆到合适的表达载体中。所述表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
[0305] 在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
[0306] 在一些实施方案中，可以使用标准重组DNA技术来制备所述重组表达载体。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对引入载体的宿主(例如，细菌、真菌，植物或动物)的类型具特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其可操作地连接至编码TCR或抗原结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还设想其他已知的启动子。
[0307] 在一些实施方案中，在获得T细胞克隆后，将TCRα和β链分离并克隆到基因表达载体中。在一些实施方案中，TCRα和β基因经由小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽连接，使得两条链共表达。在一些实施方案中，编码TCR的核酸还包括标记以确认细胞经转导或工程化而表达受体。在一些实施方案中，TCR的遗传转移是通过逆转录病毒或慢病毒载体或通过转座子完成(参见例如Baum等人(2006)Molecular Therapy:The Journal of the American Society of Gene Therapy.13:1050-1063；Frecha等人(2010)Molecular Therapy:The Journal of the American Society of Gene Therapy.18:1748-1757；和Hackett等人(2010)Molecular Therapy:The Journal of the American Society of Gene Therapy.18:674-683。
[0308] 在一些实施方案中，为了产生编码TCR的载体，将α和β链从表达目标TCR的T细胞克隆分离的总cDNA进行PCR扩增，并将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将所述α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将所述α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如慢病毒)载体中。
[0309] c.嵌合自身抗体受体(CAAR)
[0310] 在一些实施方案中，重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR对自身抗体具有特异性。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞(例如工程化以表达CAAR的T细胞)可以用于特异性地结合至并杀伤表达自身抗体的细胞，而不是表达正常抗体的细胞。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于治疗与自身抗原的表达相关的自身免疫性疾病，例如自身免疫性疾病。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以靶向最终产生自身抗体并在其细胞表面上展示所述自身抗体的B细胞，将这些B细胞标记为治疗干预的疾病特异性靶标。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向和杀伤自身免疫性疾病中的致病性B细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAAR，例如美国专利申请公开号US 2017/0051035中所述的任何一种。
[0311] 在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含主要信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含次级或共刺激信号传导区域(次级细胞内信号传导区域)。
[0312] 在一些实施方案中，自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，所述自身抗原的选择可能是由于其识别与特定疾病状态(例如自身免疫性疾病，例如自身抗体介导的自身免疫性疾病)相关的靶细胞(例如B细胞)上的自身抗体。在一些实施方案中，自身免疫性疾病包括寻常型天疱疮(PV)。示例性自身抗原包括桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)和Dsg3。
[0313] d.多靶向
[0314] c.在一些实施方案中，细胞和方法包括多靶向策略，例如在细胞上表达两种或更多种基因工程化受体，每种受体识别相同或不同的抗原，并且通常各自包括不同的细胞内信号传导组分。此类多靶向策略描述于例如以下文献中：国际专利申请公开号WO 2014055668A1(描述激活和共刺激CAR的组合，例如，靶向单独存在于脱靶(例如正常细胞)上，但仅一起存在于待治疗疾病或病症的细胞上的两种不同抗原)和Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine，5(215)(2013年12月)(描述表达激活和抑制性CAR的细胞，例如其中激活CAR结合至同时在正常或非患病细胞和待治疗疾病或病症的细胞上表达的一种抗原，并且抑制性CAR结合至仅在正常细胞或不希望治疗的细胞上表达的另一种抗原的那些细胞)。
[0315] 例如，在一些实施方案中，所述细胞包括表达第一基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)的受体，其通常在特异性结合至由第一受体识别的抗原(例如第一抗原)后，能够诱导激活或刺激信号至所述细胞。在一些实施方案中，细胞还包括第二基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)，例如嵌合共刺激受体，所述受体通常在特异性结合至由第二受体识别的第二抗原后，能够将共刺激信号诱导至免疫细胞。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是相同的。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是不同的。
[0316] 在一些实施方案中，第一和/或第二基因工程化抗原受体(例如CAR或TCR)能够诱导激活或刺激信号至所述细胞。在一些实施方案中，受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，由第一受体诱导的激活涉及信号转导或细胞中蛋白质表达的变化，导致启动免疫应答(例如ITAM磷酸化)和/或启动ITAM介导的信号转导级联、形成免疫突触和/或所结合受体(例如CD4或CD8等)附近的分子的聚簇、激活一种或多种转录因子(例如NF-κB和/或AP-1)、和/或诱导因子(例如细胞因子)的基因表达、增殖和/或存活。
[0317] 在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括共刺激受体的细胞内信号传导结构域，所述共刺激受体例如CD28、CD137(4-1BB)、OX40和/或ICOS。在一些实施方案中，第一和第二受体包括不同的共刺激受体的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，第一受体含有CD28共刺激信号传导区域，并且第二受体含有4-1BB共刺激信号传导区域，或反之亦然。
[0318] 在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域和共刺激受体的细胞内信号传导结构域。
[0319] 在一些实施方案中，第一受体含有包含ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域，并且第二受体含有共刺激受体的细胞内信号传导结构域。与在相同细胞中诱导的激活或刺激信号组合的共刺激信号是导致免疫应答的共刺激信号，所述免疫应答例如为稳健且持续的免疫应答，例如增加的基因表达，细胞因子和其他因子的分泌，以及T细胞介导的效应子功能(如细胞杀伤)。
[0320] 在一些实施方案中，单独的第一受体的连接和单独的第二受体的连接都不会诱导稳健的免疫应答。在一些方面，如果仅连接一个受体，则细胞变得耐受抗原或对抗原无应答，或被抑制，和/或不被诱导增殖或分泌因子或实现效应子功能。然而，在一些此类实施方案中，在连接多个受体时，如在遇到表达第一和第二抗原的细胞时，实现所需应答，如完全免疫激活或刺激，例如如通过一种或多种细胞因子的分泌、增殖、持久性和/或执行免疫效应子功能(如靶细胞的细胞毒性杀伤)所指示的。
[0321] 在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的结合激活细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的结合诱导了抑制或减弱所述应答的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR或iCAR的组合。例如，可以使用这种策略，其中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合至在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
[0322] 在一些实施方案中，多靶向策略用于以下情况：其中与特定疾病或病症相关的抗原在未患病细胞上表达和/或在工程化细胞本身上表达，所述表达为瞬时表达(例如，在与基因工程化相关的刺激后)或永久表达。在此类情况下，通过需要连接两个分开的和单独特异性抗原受体，可以改善特异性、选择性和/或功效。
[0323] 在一些实施方案中，多种抗原(例如第一和第二抗原)在所靶向的细胞、组织或疾病或病症上(例如在癌细胞上)表达。在一些方面，细胞、组织、疾病或病症是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，多种抗原中的一种或多种通常也在不需要用细胞疗法靶向的细胞(例如正常或未患病细胞或组织，和/或工程化细胞本身)上表达。在此类实施方案中，通过需要连接多个受体以实现细胞的应答，实现特异性和/或功效。
[0324] e.其他调节元件
[0325] 在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，病毒载体基因组中所含的编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的核酸序列与其他遗传元件(例如转录调节序列，包括启动子或增强子)以功能关系可操作地连接，以特定方式调节目标序列的表达。在某些情况下，此类转录调节序列是在活性方面在时间上和/或空间上受调节的那些。可用于调节组分表达的表达控制元件是已知的，并且包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号、增强子和其他调节元件。在一些实施方案中，病毒载体基因组中所含的核酸序列含有多个表达控制元件，其控制所编码的不同组分，例如不同的受体组分和/或信号传导组分，使得重组受体和/或工程化细胞(例如表达工程化受体的细胞)的表达、功能和/或活性可以被调节，例如是可诱导的、可抑制的、可调节的和/或用户控制的。在一些实施方案中，一种或多种载体可含有一种或多种核酸序列，所述核酸序列含有一种或多种表达控制元件和/或一种或多种所编码组分，使得核酸序列一起可调节所编码组分(例如重组受体)或工程化细胞的表达、活性和/或功能。
[0326] 在一些实施方案中，编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的核酸序列与内部启动子/增强子调节序列可操作地连接。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在适当条件下可用于引导所引入DNA区段的高水平表达。启动子可以是异源的或内源的。在一些实施方案中，启动子和/或增强子是以合成方式产生。在一些实施方案中，启动子和/或增强子是使用重组克隆和/或核酸扩增技术产生。
[0327] 在一些情况下，编码重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，信号序列可以编码异源或非天然信号肽，例如SEQ ID NO:51中所示并且由SEQ ID NO:50中所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。在一些情况下，编码重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性实例包括例如SEQ ID NO:51中所示并且由SEQ ID NO:50中所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽，或SEQ ID NO:52中所示的CD8α信号肽。
[0328] 在一些实施方案中，编码重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作连接以控制重组受体的表达。在一些例子中，多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组受体的表达。
[0329] 在核酸分子编码两种或更多种不同多肽链(例如重组受体和标记)的某些情况下，每条多肽链可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两个单独的核酸，并且每一个可以单独转移到或引入细胞中以在细胞中表达。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸和编码标记的核酸与相同的启动子可操作地连接，并且任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(其任选地是T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸分开。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸可操作地连接至两个不同的启动子。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸存在或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码重组受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
[0330] 在一些实施方案中，例如在多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码每种不同多肽链的编码序列可以与启动子可操作地连接，所述启动子可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，所述核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基因产物(例如编码标记和编码重组受体)。可替代地，在一些情况下，单一启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码标记和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A序列)的序列或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶(furin))彼此分开。因此，所述ORF编码单个多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或翻译后被加工成单个蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与相邻下游肽之间分开(参见，例如，de Felipe,Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。各种2A元件是已知的。可以用于本文所公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如，SEQ ID NO:47)、马鼻炎A病毒(E2A，例如，SEQ ID NO:46)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如，SEQ ID NO:32或43)和猪捷申病毒-1(P2A，例如，SEQ ID NO:44或45)，如美国专利公开号20070116690中所述。
[0331] 本文所述的任何重组受体可以由呈任何组合或排列的含有编码重组受体的一种或多种核酸序列的多核苷酸编码。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码标记的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸与两种不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码标记的核酸的下游。
[0332] 在一些实施方案中，载体骨架含有编码一种或多种标记的核酸序列。在一些实施方案中，一种或多种标记是转导标记、替代标记和/或选择标记。
[0333] 在一些实施方案中，标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可用于检测已经引入多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记是经制备在细胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，替代标记是由编码重组受体的相同多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或引起核糖体跳跃的肽(例如2A序列，例如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸分开。在一些情况下，外在标记基因可以结合工程化细胞用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还可以用于促进细胞自杀。
[0334] 示例性替代标记可以包括截短的细胞表面多肽，例如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(EGFRt，SEQ ID NO:33或42中所示的示例性EGFRt序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其经修饰形式。EGFRt可含有由抗体西妥昔单抗或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已
经用EGFRt构建体和重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；
34(4):430-434)。在一些方面，标记例如替代标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)的全部或部分(例如，截短形式)。在一些实施方案中，编码标记的核酸可操作地连接至编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO 2014031687中所公开的任一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:33或42中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:33或42至少
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
经用EGFRt构建体和重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；
34(4):430-434)。在一些方面，标记例如替代标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)的全部或部分(例如，截短形式)。在一些实施方案中，编码标记的核酸可操作地连接至编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO 2014031687中所公开的任一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:33或42中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:33或42至少
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0335] 在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP)、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的荧光蛋白变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
[0336] 在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
[0337] 另外的用于引入的核酸(例如基因)包括如通过促进所转移细胞的活力和/或功能改善疗法功效的那些；提供用于选择和/或评估细胞的遗传标记如以在体内评价存活或定位的基因；例如通过使细胞对体内阴性选择易感来提高安全性的基因，如以下文献中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US 91/08442和PCT/US 94/05601的公开案，所述公开案描述了使用源自融合显性的阳性选择标记与阴性选择标记的双功能可选融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177,第14-17栏。
[0338] 在一些实施方案中，启动子和/或增强子可以是与核酸序列天然相关的启动子和/或增强子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列而获得。可替代地，在一些实施方案中，编码核酸区段可以位于重组和/或异源启动子和/或增强子的控制下，所述启动子和/或增强子通常不与天然环境中的编码核酸序列相关。例如，用于重组DNA构建的示例性启动子包括但不限于β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖、色氨酸(trp)、RNA聚合酶(pol)III启动子(包括人和鼠类U6pol III启动子以及人和鼠类H1RNA pol III启动子)；RNA聚合酶(pol)II启动子；巨细胞病毒即时早期启动子(pCMV)、延伸因子-1α(EF-1α)和劳氏肉瘤病毒长末端重复序列启动子(pRSV)启动子系统。在一些实施方案中，启动子可以例如从病毒基因组获得，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。启动子也可以是，例如，异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、热激启动子或通常与天然序列相关的启动子，条件是此类启动子与靶细胞相容。在一个实施方案中，启动子是病毒表达系统中天然存在的病毒启动子。
[0339] 在一些实施方案中，启动子可以是组成型活性的。可以使用的组成型启动子的非限制性例子包括用于以下各项的启动子：泛素(美国专利号5,510,474；WO 98/32869)、CMV(Thomsen等人,PNAS 81:659,1984；美国专利号5,168,062)、β肌动蛋白(Gunning等人1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4831-4835)和pgk(参见，例如，Adra等人1987Gene 60:
65-74；Singer-Sam等人1984Gene 32:409-417；和Dobson等人1982Nucleic Acids Res.10:
2635-2637)。
65-74；Singer-Sam等人1984Gene 32:409-417；和Dobson等人1982Nucleic Acids Res.10:
2635-2637)。
[0340] 在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子和/或靶细胞特异性启动子。在一些实施方案中，可以选择启动子以允许目标序列的诱导型表达。许多用于诱导型表达的系统是已知的，包括四环素反应系统、lac操纵基因-阻遏物系统，以及响应各种环境或生理变化的启动子，所述环境或生理变化包括热休克、金属离子(如金属硫蛋白启动子)、干扰素、缺氧、类固醇(如孕酮或糖皮质激素受体启动子)、辐射，如VEGF启动子。在一些实施方案中，基于大肠杆菌(Escherichia coli)的tet抑制(tetr)对tet操纵基因序列(TECO)的抑制作用的四环素-(tet)可调节系统可以被修饰用于哺乳动物系统并用作表达盒的可调节元件。这些系统是熟知的。(参见Goshen和Badgered，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-51(1992)；Shockett等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6522-26(1996)；Lindemann等人,Mol.Med.3:466-76(1997))。
[0341] 还可使用启动子组合来获得目标基因的所需表达。普通技术人员将能够基于目标生物体或靶细胞中基因的所需表达模式选择启动子。
[0342] 在一些实施方案中，增强子也可以存在于病毒构建体中以增加目标基因的表达。增强子通常是顺式作用核酸元件，通常长约10至300个by，其作用于启动子以增加其转录。
已知病毒基因组(例如HIV或CMV)中的许多增强子。例如，可以使用CMV增强子(Boshart等人Cell，41:521,1985)。其他例子包括，例如，复制起点(bp 100-270)后侧上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。在一些情况下，增强子来自哺乳动物基因，例如来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白或胰岛素的增强子。增强子可以与异源启动子组合使用。可以将增强子剪接到载体中，在编码目标基因的多核苷酸序列的5'或3'位置，但通常位于启动子的5'位点。本领域普通技术人员将能够基于所需的表达模式选择合适的增强子。
已知病毒基因组(例如HIV或CMV)中的许多增强子。例如，可以使用CMV增强子(Boshart等人Cell，41:521,1985)。其他例子包括，例如，复制起点(bp 100-270)后侧上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。在一些情况下，增强子来自哺乳动物基因，例如来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白或胰岛素的增强子。增强子可以与异源启动子组合使用。可以将增强子剪接到载体中，在编码目标基因的多核苷酸序列的5'或3'位置，但通常位于启动子的5'位点。本领域普通技术人员将能够基于所需的表达模式选择合适的增强子。
[0343] 病毒载体基因组还可含有另外的遗传元件。可以包括在构建体中的元件类型不以任何方式受限制，并且可以由本领域技术人员来选择。
[0344] 例如，可以包括促进靶细胞中病毒基因组的核进入的信号。这种信号的例子是HIV-1拍动信号(flap signal)(在一些情况下称为拍动序列)。另外，载体基因组可含有一种或多种设计用于增强目标基因表达的遗传元件。在一些实施方案中，基因组含有转录后调节元件(PRE)或其展现转录后活性的经修饰形式。例如，在一些实施方案中，可以将土拨鼠肝炎病毒转录后响应元件(WPRE)置入构建体中(Zufferey等人1999.J.Virol.74:3668-3681；Deglon等人2000.Hum.Gene Ther.11:179-190)。在一些实施方案中，载体基因组缺乏拍动序列和/或缺乏WPRE。在一些实施方案中，载体基因组含有突变或缺陷的拍动序列和/或WPRE。
[0345] 在一些情况下，可以包括编码分开的异源蛋白质的多于一个开放阅读框。例如，在一些实施方案中，如果表达构建体中包括报道基因和/或可检测和/或可选择的基因，那么可以包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。通常，另外的遗传元件与独立的启动子/增强子可操作地连接并受其控制。另外的遗传元件可以是报道基因、可选择标记或其他所需基因。
[0346] 在一些实施方案中，其他各种调节元件可以包括转录起始区和/或终止区。表达载体还可含有用于终止转录和用于稳定mRNA的序列。此类序列是已知的并且通常天然存在于真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区中。转录终止区的例子包括但不限于聚腺苷酸化信号序列。聚腺苷酸化信号序列的例子包括但不限于牛生长激素(BGH)聚(A)、SV40晚期聚(A)、兔β球蛋白(RBG)聚(A)、胸苷激酶(TK)聚(A)序列及其任何变体。
[0347] 在一些实施方案中，调节元件可以包括允许重组受体(例如CAR)的可调节表达和/或活性的调节元件和/或系统。在一些实施方案中，可调节的表达和/或活性是通过将重组受体配置成含有特定调节元件和/或系统或受所述调节元件和/或系统控制来实现。在一些实施方案中，一种或多种另外的受体可以用于表达调节系统中。在一些实施方案中，表达调节系统可以包括需要暴露于特定配体或结合特定配体的系统，所述配体可以调节重组受体的表达和/或活性。在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)的受调节表达是通过可调节的转录因子释放系统(例如，经修饰的Notch信号传导系统)来实现(参见，例如，Roybal等人,Cell(2016)164:770-779；Morsut等人,Cell(2016)164:780-791)。在一些实施方案中，对重组受体活性的调节是通过给予另外的药剂来实现，所述另外的药剂可以诱导多肽(例如重组受体)的构象变化和/或多聚化。在一些实施方案中，另外的药剂是化学诱导剂(参见，例如，美国专利公开号2016/0046700；Clackson等人(1998)Proc Natl Acad Sci U S A.95(18):10437-42；Spencer等人(1993)Science 262(5136):1019-24；Farrar等人(1996)Nature 383(6596):178-81；Miyamoto等人(2012)Nature Chemical Biology 8(5):465-70；Erhart等人(2013)Chemistry and Biology 20(4):549-57)。
[0348] 4.病毒载体粒子的制备
[0349] 病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒粒子，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因传递系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及产生病毒载体粒子所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分中的一个或两个时引入生物安全保护措施。
[0350] 在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef)和/或Tat(HIV的主要反式激活因子)。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含三种亲本病毒的基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
[0351] 在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒粒子中所需的所有组分。可替代地，除了一种或多种目标序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并在包装细胞系中单独提供。
[0352] 在一些实施方案中，用一种或多种含有产生所述粒子所需组分的质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目标序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离产生逆转录病毒载体粒子的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能产生有复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单一质粒载体。
[0353] 在一些实施方案中，将逆转录病毒载体粒子(例如慢病毒载体粒子)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体粒子(例如慢病毒载体粒子)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性，多嗜性或双嗜性包膜，例如辛德毕斯病毒(Sindbis virus)包膜、GALV或VSV-G。
[0354] 在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体粒子中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体粒子的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
[0355] 在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
[0356] 在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体粒子。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
[0357] 在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许待包装至病毒粒子中的重组质粒的RNA转录，然后所述病毒粒子可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体粒子，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。
[0358] 在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒粒子，而在包装细胞系(例如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有可以回收并滴定的重组慢病毒载体。
[0359] 所回收和/或产生的逆转录病毒载体粒子可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，例如CAR)的表达。
[0360] C.孵育
[0361] 在一些实施方案中，所提供的方法涉及通过使包含多个细胞的细胞组合物(下文中也称为“输入组合物”)与(1)病毒粒子接触(例如孵育)来转导细胞的方法。在一些实施方案中，输入组合物是或包含从受试者获得的原代细胞，例如从受试者富集和/或选择的细胞。
[0362] 在一些实施方案中，输入组合物包含从受试者获得的原代细胞。在一些方面，样品是全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞分离术产物。
[0363] 在一些实施方案中，在细胞的选择和/或转导之前，使含有原代细胞的样品与以下浓度的血清或血浆离体接触或含有所述血清或血浆：至少或至少约10％(v/v)、至少或至少约15％(v/v)、至少或至少约20％(v/v)、至少或至少约25％(v/v)、至少或至少约30％(v/v)、至少或至少约35％(v/v)、至少或至少约40％(v/v)、或者至少或至少约50％。在一些实施方案中，样品含有血清或血浆，所述血清或血浆的浓度为或大致为约或至少约25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％(v/v)。在一些实施方案中，血清或血浆是人的。在一些实施方案中，血清或血浆对于受试者是自体的。在一些实施方案中，在选择和/或转导细胞之前，使含有原代细胞的样品与抗凝血剂接触或含有抗凝血剂。在一些实施方案中，抗凝血剂是或含有游离柠檬酸根离子，例如，抗凝血剂柠檬酸盐右旋糖溶液，溶液A(ACD-A)。
[0364] 在一些实施方案中，在细胞的选择和/或转导之前，将样品维持在为或为约2℃至8℃的温度下长达48小时，例如长达12小时、24小时或36小时。
[0365] 在一些实施方案中，输入组合物包含和/或富含T细胞，所述T细胞包括CD4+和/或CD8+T细胞。在一些方面，富集可以通过基于亲和力的选择，通过将原代细胞与一种或多种选择或亲和试剂一起孵育来进行，所述选择或亲和试剂特异性地结合至原代细胞亚群上表达的细胞表面分子，从而基于与选择试剂的结合来富集原代细胞。在一些实施方案中，富集可以通过将细胞与抗体包被的颗粒(例如磁珠)一起孵育来进行。
[0366] 在一些实施方案中，输入组合物包含大于或大于约75％、80％、85％、90％、95％或更多的从受试者的样品获得的T细胞。在一些方面，在孵育之前，输入组合物中不超过5％、10％、20％、30％或40％的T细胞是激活细胞，表达选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-
1BB的表面标记；包含选自IL-2、IFN-γ、TNF-α的细胞因子的细胞内表达，处于细胞周期的G1期或较后期，和/或能够增殖。
1BB的表面标记；包含选自IL-2、IFN-γ、TNF-α的细胞因子的细胞内表达，处于细胞周期的G1期或较后期，和/或能够增殖。
[0367] 在一些实施方案中，含有此类细胞(例如在孵育和/或接触之前未经历用一种或多种刺激剂离体刺激的细胞)的输入组合物是其中大于20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多的细胞表达低密度脂质受体(LDL-R)的输入组合物。在一些实施方案中，将输入组合物针对T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)进行富集和/或选择，并且在所述孵育之前，大于20％、30％、40％、50％，60％、70％或更多的T细胞表达低密度脂质受体(LDL-R)。
[0368] 在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物可以包含一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子选自IL-2、IL-7或IL-15。在一些实施方案中，所述细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，输入组合物中细胞因子的浓度独立地为或为约1IU/mL至1500IU/mL，例如为或为约1IU/mL至
100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL、5IU/mL至10IU/mL、10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL、50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL或200IU/mL至600IU/mL。在一些实施方案中，输入组合物中细胞因子的浓度独立地为至少或至少约1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL或1500IU/mL。在一些方面，也可以在孵育期间或在孵育的至少一部分期间或在孵育之后，包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂(例如抗CD3和/或抗CD28抗体)。
100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL、5IU/mL至10IU/mL、10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL、50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL或200IU/mL至600IU/mL。在一些实施方案中，输入组合物中细胞因子的浓度独立地为至少或至少约1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL或1500IU/mL。在一些方面，也可以在孵育期间或在孵育的至少一部分期间或在孵育之后，包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂(例如抗CD3和/或抗CD28抗体)。
[0369] 在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物可以包含血清。在一些实施方案中，所述血清是胎牛血清。在一些实施方案中，所述血清是人血清。在一些实施方案中，所述血清是以为或为约0.5％至25％(v/v)、1.0％至10％(v/v)或2.5％至5.0％(v/v)的浓度存于输入组合物中，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述血清是以至少或至少约0.5％(v/v)、1.0％(v/v)、2.5％(v/v)、5％(v/v)或10％(v/v)的浓度存于输入组合物中。
[0370] 在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物不含和/或基本上不含血清。在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物是在血清不存在下进行孵育和/或接触。在特定实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物是在无血清培养基中进行孵育和/或接触。在一些实施方案中，无血清培养基是定义的和/或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，无血清培养基可含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。在一些实施方案中，无血清培养基含有蛋白质，例如白蛋白，例如牛血清白蛋白、人血清白蛋白和/或重组白蛋白。在一些实施方案中，无血清培养基含有基础培养基，例如DMEM或RPMI 1640，其含有氨基酸、维生素、无机盐、缓冲剂、抗氧化剂和能量来源。在一些实施方案中，无血清培养基补充有例如但不限于白蛋白、化学上定义的脂质、生长因子、胰岛素、细胞因子和/或抗氧化剂。在一些实施方案中，配制无血清培养基以支持某种细胞类型(例如免疫细胞、T细胞和/或CD4+和CD8+T细胞)的细胞的生长、增殖、健康、稳态。
[0371] 在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物包含N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，输入组合物中的N-乙酰半胱氨酸的浓度为或为约0.4mg/mL至4mg/mL、0.8mg/mL至3.6mg/mL或1.6mg/mL至2.4mg/mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，输入组合物中的N-乙酰半胱氨酸的浓度为至少或至少约或约0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL或4.0mg/mL。
[0372] 在一些实施方案中，输入组合物的细胞浓度为或为约1.0x105个细胞/mL至1.0x108个细胞/mL，例如至少或约至少或约1.0x105个细胞/mL、5x105个细胞/mL、1x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、1x107个细胞/mL、5x107个细胞/mL或1x108个细胞/mL。
[0373] 在一些实施方案中，病毒粒子是以病毒载体粒子拷贝或其感染单位(IU)与输入组合物中的细胞总数(IU/细胞)或待转导的细胞总数的某一比率来提供。例如，在一些实施方案中，病毒粒子在接触期间是以为或为约或至少为或为约每个细胞0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60IU的病毒载体粒子存在。
[0374] 在一些实施方案中，病毒载体粒子的滴度在或在约1x106IU/mL与1x108IU/mL之间，6 7 6 6 6
例如在或在约5x10IU/mL与5x10IU/mL之间，例如至少6x10 IU/mL、7x10IU/mL、8x10IU/mL、9x106IU/mL、1x107IU/mL、2x107IU/mL、3x107IU/mL、4x107IU/mL或5x107IU/mL。
例如在或在约5x10IU/mL与5x10IU/mL之间，例如至少6x10 IU/mL、7x10IU/mL、8x10IU/mL、9x106IU/mL、1x107IU/mL、2x107IU/mL、3x107IU/mL、4x107IU/mL或5x107IU/mL。
[0375] 在一些实施方案中，转导可以按小于100、例如通常小于60、50、40、30、20、10、5或更小的感染复数(MOI)实现。
[0376] 在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒粒子接触或孵育，例如混合。在一些实施方案中，接触进行30分钟至72小时，例如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，例如至少或约至少30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时或更长时间。
[0377] 在一些实施方案中，接触是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒粒子以为或为约0.5mL至500mL的体积接触，所述体积例如为或为约0.5mL至200mL、0.5mL至100mL、0.5mL至50mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、5mL至500mL、5mL至200mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、
50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL。
50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL。
[0378] 在一些实施方案中，接触可以通过离心、例如旋转接种(例如离心接种)来实现。在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒粒子和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，例如速度低于用于沉淀细胞的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以为或为约100g至3200g(例如，为或为约或至少为或为约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、
2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。
2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。
[0379] 在一些实施方案中，细胞与病毒载体粒子的孵育导致或产生包含用病毒载体粒子转导的细胞的输出组合物。
[0380] D.其他处理步骤
[0381] 在一些实施方案中，用于转导(例如与细胞工程化结合)的处理步骤可以另外包括细胞的培养、培育、刺激、激活、繁殖和/或配制。在一些实施方案中，将输出组合物或细胞在刺激条件或刺激剂的存在下孵育。此类条件包括设计用于诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活和/或模拟抗原暴露的条件。刺激可以在给予至受试者后离体或在体内进行。
[0382] 1.细胞的转导后激活和/或扩增
[0383] 在一些实施方案中，结合基因工程化，将细胞(例如输出组合物)进一步孵育和/或进一步培养。所述孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。在一些此类实施方案中，进一步孵育是在一定条件下实现，以使病毒载体整合到一个或多个细胞的宿主基因组中。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育所述组合物或细胞。这些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进行基因工程化，如以引入重组抗原受体。
[0384] 在一些实施方案中，进一步孵育是在高于室温的温度下进行，所述温度为例如高于或高于约25℃，例如通常高于或高于约32℃、35℃或37℃。在一些实施方案中，进一步孵育是在为或为约37℃±2℃的温度下，例如在为或为约37℃的温度下实现。
[0385] 在一些实施方案中，进一步孵育是在用于细胞的刺激和/或激活的条件下进行，所述条件可以包括以下各项中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如营养素)、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(例如细胞因子、趋化因子)、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他设计为激活细胞的药剂。
[0386] 在一些实施方案中，刺激条件或药剂包括一种或多种能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂(例如刺激性和/或辅助性药剂)，例如配体。在一些方面，所述药剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联，例如是适于递送初级信号以例如启动ITAM诱导的信号(例如对TCR组分具有特异性的那些)的激活的药剂，和/或促进共刺激信号(例如对T细胞共刺激受体具有特异性的共刺激信号)的药剂，例如抗CD3、抗CD28或抗41-BB(例如，其任选地结合至固体支持物(例如珠))和/或一种或多种细胞因子。所述刺激剂包括抗CD3/抗CD28珠(例如， M-450CD3/CD28T细胞扩增剂和/或珠)。任选地，扩增方法可以还包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步
骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
[0387] 在一些实施方案中，刺激条件或药剂包括一种或多种药剂(例如配体)，其能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括例如结合至固体支持物(如珠)的抗体，如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的抗体(例如抗CD3、抗CD28)；和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL、至少约50单位/mL、至少约100单位/mL或至少约200单位/mL。
[0388] 条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
[0389] 在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651-660,Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):
689-701。
689-701。
[0390] 在一些实施方案中，进一步孵育是在进行接触的相同容器或设备中进行。在一些实施方案中，进一步孵育是在没有旋转或离心的情况下进行，这通常是在旋转下进行的孵育的至少一部分之后进行，例如与离心或旋转接种结合。在一些实施方案中，进一步孵育是在固定相之外进行，例如在色谱基质之外、例如在溶液中进行。
[0391] 在一些实施方案中，进一步孵育是在与进行接触的容器或设备不同的容器或设备中进行，例如通过将细胞组合物在与病毒粒子和试剂接触之后转移(例如自动转移)至不同的容器或装置中。
[0392] 在一些实施方案中，通过以下方法扩增T细胞：向培养起始组合物中加入饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得所得细胞群含有至少约5、10、20或40种或更多种PBMC饲养细胞，以使初始群体中的每种T淋巴细胞进行扩增)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可包含γ辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线照射PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞加入到培养基中。
[0393] 在一些实施方案中，所述刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或约在37摄氏度。任选地，孵育可以还包括添加非分裂的病毒转化的成淋巴细胞样细胞(LCL)作为饲养细胞，例如，病毒可以是EBV、CMV或流感，并且任选地在MHC情况下，所转化的LCL在其表面上呈递病毒源抗原。在一些实施方案中，T细胞表达识别病毒抗原的TCR。在一些实施方案中，病毒抗原可以来自EBV、CMV或流感。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线照射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
[0394] 在一些实施方案中，进一步培养或孵育例如以促进离体扩增进行大于或大于约24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，进一步培养或孵育进行不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天或不超过24小时。
[0395] 在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，例如至少或约至少6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，包含端值。
[0396] 在一些实施方案中，本文所提供的方法不包括进一步培养或孵育，例如，不包括离体扩增步骤，或者包括显著更短的离体扩增步骤。
[0397] 在一些实施方案中，使细胞工程化的整个过程(例如选择和/或富集、孵育与转导相结合和/或进一步培养或培育)是在从受试者获得样品后的以下时间段内进行：超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天或不超过1天。应理解，这种定时不包括使细胞经历低温保存的任何时间段。
[0398] 在本文所提供的方法的一些实施方案中，将工程化细胞(例如输出组合物或配制组合物)在转导后在不进行显著的离体扩增的情况下立即或不久给予至受试者。在一些实施方案中，工程化细胞可以在转导步骤后立即给予。在一些实施方案中，工程化细胞可以在转导步骤后不久在例如与常规方法(这可能需要显著的体外激活、扩增和/或富集)相比不进行显著的离体扩增或进行显著更短的离体扩增的情况下给予。例如，在本文所提供的方法的一些实施方案中，工程化细胞可以在转导的三天、两天或一天内给予。在一些实施方案中，工程化细胞可以在转导步骤的48小时、36小时、24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时或更短时间内给予。在一些实施方案中，与常规方法相比，使工程化细胞经历显著更短的体外扩增，例如48小时、36小时、24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、
4小时、2小时、1小时或更短时间。
4小时、2小时、1小时或更短时间。
[0399] 在任何此类实施方案中，细胞的扩增和/或激活可以在暴露于抗原后在体内进行，例如，在给予细胞后在受试者体内进行工程化细胞的扩增。在一些实施方案中，体内扩增的范围、程度或量值可以通过多种方法来扩大、加强或增强，所述方法能够调节(例如增加)所给予细胞(例如表达重组受体的细胞)的扩增、增殖、存活和/或功效。
[0400] 在一些实施方案中，此类方法包括涉及给予工程化细胞的那些方法，将所述细胞用药剂(例如核酸)进一步修饰，以改变(例如增加或减少)分子的表达或活性，其中这种改变的表达或活性扩大、加强或增强所给予细胞的扩增、增殖、存活和/或功效。在一些实施方案中，药剂(例如核酸)的表达例如通过给予诱导物或其他调节分子是可诱导的、可抑制的、可调节的和/或用户控制的。
[0401] 在一些实施方案中，此类方法包括涉及与药物或药剂的组合给予(例如同时或依次给予)的方法，所述药物或药剂能够扩大、加强或增强所给予细胞(例如表达重组受体的细胞)的扩增、增殖、存活和/或功效。此类药物和药剂的例子描述于第III章节中。
[0402] 2.配制
[0403] 在一些实施方案中，在进一步孵育之后，制备细胞的过程可以还包括洗涤或配制细胞。因此，处理步骤中可包括配制此类组合物。
[0404] 还提供了用于此类方法中的药物组合物或配制品，其在一些实施方案中结合所提供的处理方法一起配制，例如在进行其他处理步骤的封闭系统中进行，例如以自动化或部分自动化方式进行。
[0405] 在一些实施方案中，将细胞和组合物以药物组合物或配制品的形式(例如包含细胞或细胞群和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物)给予至受试者。
[0406] 术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对给予配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
[0407] 在一些实施方案中，药物组合物另外包含其他药学活性药剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，所述药剂是以盐形式例如药学上可接受的盐给予。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸的那些，所述无机酸是如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，以及源自有机酸的那些，所述有机酸是如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸(例如，对甲苯磺酸)。
[0408] “药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0409] 在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
[0410] 在一些方面，缓冲剂被包括在所述组合物中。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
[0411] 配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包括其他药物活性药剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
[0412] 在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。所需剂量可以通过细胞的单次推注给予、通过细胞的多次推注给予或通过细胞的连续输注给予来递送。
[0413] 配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂给予的那些。在一些实施方案中，肠胃外给予所述细胞群。如本文所用术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方案中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射给予外周全身递送将细胞给予至受试者。
[0414] 在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至所选pH)提供。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方便给予，特别是通过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
[0415] 无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。所述组合物可以含有辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
[0416] 可以添加各种增强所述组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保防止微生物的作用。通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。
[0417] 用于体内给予的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
[0418] III.用于给予的治疗方法和组合物
[0419] 在一些方面，所述方法的产物用于治疗方法，例如，治疗性方法，例如用于在过继细胞疗法中将细胞和组合物给予至受试者。还提供了此类方法和通过所述方法处理和产生的细胞的用途，以及用于其中的药物组合物和配制品。所提供的方法通常涉及将细胞或组合物(例如输出组合物和/或配制的组合物)给予至受试者。
[0420] 在一些实施方案中，所述细胞表达重组受体(例如CAR)或其他抗原受体(例如转基因TCR，例如在本文所提供的转导方法中转移的那些)。通常将此类细胞给予至患有与由所述受体特异性识别的配体相关的疾病或病症的受试者。在一个实施方案中，所述细胞表达重组受体或嵌合受体(例如抗原受体，例如CAR或TCR)，所述受体特异性地结合至与疾病或病症相关或由其细胞或组织表达的配体。例如，在一些实施方案中，所述受体是抗原受体，并且所述配体是疾病或病症特有的和/或与所述疾病或病症相关的抗原。给予通常实现疾病或病症的一种或多种症状的改善和/或治疗或预防疾病或病症或其症状。
[0421] 疾病、病症和障碍包括肿瘤，包括实体瘤、血液学恶性肿瘤和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV和寄生虫病；以及自身免疫和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、ALL、非霍奇金淋巴瘤、急性髓样白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤)、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。
[0422] 在一些实施方案中，此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，疾病或病症是选自以下各项的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、NOS(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。
[0423] 在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
[0424] 在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富含亮氨酸的重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达抗原黑色素瘤(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶像孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为
5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体
2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体
2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
[0425] 在一些实施方案中，与细胞或组合物所靶向的疾病或障碍相关的抗原选自孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2和MAGEA3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白A1(CCNA1))和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV表达的分子或其他病原体。
[0426] 在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
[0427] 如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结果或表型的完全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的影响。
[0428] 如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(例如癌症)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。
[0429] 如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
[0430] 如本文所用，“抑制”功能或活性是当与除了感兴趣的条件或参数以外的原本相同的条件相比时，或者与另一种条件相比时，减少功能或活性。例如，与不存在所述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
[0431] 用于过继细胞疗法的细胞的给予方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；
Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
[0432] 所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病状况或障碍的病因学相关和/或参与其中，例如导致、加剧这种疾病、病症或障碍或以其他方式参与其中。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。上文描述了示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在具体实施方案中，所述嵌合抗原受体或转基因TCR与和所述疾病或病症相关的抗原特异性结合。
[0433] 细胞和组合物可以使用标准给予技术、配制品和/或装置来给予。细胞给予可以是自体的或异源的，例如同种异体的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且给予至同一受试者或不同的相容受试者。外周血源免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射给予，包括导管给予、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给予。在给予治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
[0434] 在一些实施方案中，细胞疗法(例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法)是通过自体转移来进行，其中从要接受细胞疗法的受试者或从源自这个受试者的样品分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗的受试者(例如，患者)和细胞，并且在分离和处理后，将细胞给予至同一受试者。
[0435] 在一些实施方案中，细胞疗法(例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法)是通过同种异体转移来进行，其中从并非接受或最终接受所述细胞疗法的受试者的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞给予至相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，所述第二受试者与所述第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。
[0436] 所述细胞可以通过任何合适的方式给予，例如通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球后注射、球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给予以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给予。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过细胞的单次推注给予、通过细胞的多次推注给予(例如，在不超过3天的时间段内)、或通过细胞的连续输注给予来给予。
[0437] A.剂量和给药
[0438] 细胞或组合物是以一定剂量给予，以在体内产生治疗有效量的表达重组受体(例如CAR)的细胞，用于治疗疾病或病症。对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可能取决于待治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、组合中其他药物或药剂的给予(如加强、扩大或增强细胞扩增的那些)、疾病的严重程度和病程、给予细胞用于预防性目的还是或治疗性目的、先前的治疗、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，所述组合物和细胞适合一次或在一系列治疗中给予受试者。
[0439] 在给药的情况下，药剂(例如药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(例如治疗或预防结果)的量。
[0440] 药剂(例如药物配制品或细胞)的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动力学或药效动力学作用的量。治疗有效量可以根据多种因素而变，所述因素例如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所给予的细胞群，和组合(例如同时)给予的其他药物或药剂。
[0441] “预防有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需预防结果的量。通常但不是必要地，因为在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量将小于治疗有效量。
[0442] 在一些实施方案中，细胞或组合物是以有效治疗或预防疾病或病症的量例如治疗有效量或预防有效量来给予。因此，在一些实施方案中，给予方法包括以有效量给予细胞和组合物。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给予，取决于病症，重复所述治疗直至出现所需疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。
[0443] 在一些实施方案中，将治疗有效量的细胞给予至受试者。在一些实施方案中，例如在其中在用于细胞的体内扩增的条件下给予细胞的某些情况下，将次最佳剂量的细胞给予至受试者。
[0444] 在某些实施方案中，细胞或单独细胞亚型群体是以约10万至约1000亿个细胞和/或每公斤受试者体重所述细胞量的范围给予至受试者，例如，10万至约500亿个细胞(例如，少于50万个细胞、少于1百万个细胞、约10万个细胞、约20万个细胞、约30万个细胞、约40万个细胞、约50万个细胞、约1百万个细胞、约5百万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞，或由任两个前述值定义的范围)、100万至约500亿个细胞(例如，约5百万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞，或由任两个前述值定义的范围)，例如约1000万到约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约
9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞，或由任两个前述值定义的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或这些范围之间的任何值和/或每公斤受试者体重。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，这些值是指重组受体表达细胞的数量；在其他实施方案中，它们是指给予的T细胞或PBMC或总细胞的数量。
9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞，或由任两个前述值定义的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或这些范围之间的任何值和/或每公斤受试者体重。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，这些值是指重组受体表达细胞的数量；在其他实施方案中，它们是指给予的T细胞或PBMC或总细胞的数量。
[0445] 在一些实施方案中，细胞疗法包括给予包含许多细胞的剂量，所述剂量为至少或至少约0.1x106个细胞/kg受试者体重、0.2x106个细胞/kg、0.3x106个细胞/kg、0.4x106个细胞/kg、0.5x106个细胞/kg、1x106个细胞/kg、2.0x106个细胞/kg、3x106个细胞/kg或5x106个细胞/kg或至少约0.1x106个细胞/kg、0.2x106个细胞/kg、0.3x106个细胞/kg、0.4x106个细胞/kg、0.5x106个细胞/kg、1x106个细胞/kg、2.0x106个细胞/kg、3x106个细胞/kg或5x106个细胞/kg，或者为0.1x106个细胞/kg、0.2x106个细胞/kg、0.3x106个细胞/kg、0.4x106个细胞/kg、0.5x106个细胞/kg、1x106个细胞/kg、2.0x106个细胞/kg、3x106个细胞/kg或5x106个细胞/kg或约0.1x106个细胞/kg、0.2x106个细胞/kg、0.3x106个细胞/kg、0.4x106个细胞/kg、0.5x106个细胞/kg、1x106个细胞/kg、2.0x106个细胞/kg、3x106个细胞/kg或5x106个细胞/kg。
[0446] 在一些实施方案中，细胞疗法包括给予包含许多细胞的剂量，所述剂量在或在约0.1x106个细胞/kg受试者体重和1.0x107个细胞/kg之间、在或在约0.5x106个细胞/kg和
5x106个细胞/kg之间、在或在约0.5x106个细胞/kg和3x106个细胞/kg之间、在或在约
6 6 6 6
0.5x10个细胞/kg和2x10个细胞/kg之间、在或在约0.5x10个细胞/kg和1x10 个细胞/kg之间、在或在约1.0x106个细胞/kg受试者体重和5x106个细胞/kg之间、在或在约1.0x106个细胞/kg和3x106个细胞/kg之间、在或在约1.0x106个细胞/kg和2x106个细胞/kg之间、在或在约2.0x106个细胞/kg受试者体重和5x106个细胞/kg之间、在或在约2.0x106个细胞/kg和
6 6 6
3x10 个细胞/kg之间或者在或在约3.0x10个细胞/kg受试者体重和5x10个细胞/kg之间，每个都包含端值。
5x106个细胞/kg之间、在或在约0.5x106个细胞/kg和3x106个细胞/kg之间、在或在约
6 6 6 6
0.5x10个细胞/kg和2x10个细胞/kg之间、在或在约0.5x10个细胞/kg和1x10 个细胞/kg之间、在或在约1.0x106个细胞/kg受试者体重和5x106个细胞/kg之间、在或在约1.0x106个细胞/kg和3x106个细胞/kg之间、在或在约1.0x106个细胞/kg和2x106个细胞/kg之间、在或在约2.0x106个细胞/kg受试者体重和5x106个细胞/kg之间、在或在约2.0x106个细胞/kg和
6 6 6
3x10 个细胞/kg之间或者在或在约3.0x10个细胞/kg受试者体重和5x10个细胞/kg之间，每个都包含端值。
[0447] 在一些实施方案中，细胞剂量包含在2x105或约2x105个细胞/kg和2x106或约2x106个细胞/kg之间，如在4x105或约4x105个细胞/kg和1x106或约1x106个细胞/kg之间或在6x105或约6x105个细胞/kg和8x105或约8x105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的剂量包含不超过2x105个细胞(例如表达抗原的细胞，例如表达CAR的细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，例如不超过或不超过约3x105个细胞/kg、不超过或不超过约4x105个细胞/kg、不超过或不超过约5x105个细胞/kg、不超过或不超过约6x105个细胞/kg、不超过或不超过约7x105个细胞/kg、不超过或不超过约8x105个细胞/kg、不超过或不超过约9x105个细胞/kg、不超过或不超过约1x106个细胞/kg或不超过或不超过约2x106个细胞/kg。
[0448] 在一些实施方案中，细胞剂量包含至少2x105个细胞或至少约2x105个细胞或2x105个细胞或约2x105个细胞(例如表达抗原的细胞，如表达CAR的细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少3x105个细胞/kg或至少约3x105个细胞/kg或3x105个细胞/kg或约3x105个细胞/kg、至少4x105个细胞/kg或至少约4x105个细胞/kg或4x105个细胞/kg或约4x105个细胞/5 5 5 5
kg、至少5x10 个细胞/kg或至少约5x10个细胞/kg或5x10个细胞/kg或约5x10个细胞/kg、至少6x105个细胞/kg或至少约6x105个细胞/kg或6x105个细胞/kg或约6x105个细胞/kg、至少7x105个细胞/kg或至少约7x105个细胞/kg或7x105个细胞/kg或约7x105个细胞/kg、至少
8x105个细胞/kg或至少约8x105个细胞/kg或8x105个细胞/kg或约8x105个细胞/kg、至少
5 5 5 5
9x10 个细胞/kg或至少约9x10 个细胞/kg或9x10 个细胞/kg或约9x10 个细胞/kg、至少
1x106个细胞/kg或至少约1x106个细胞/kg或1x106个细胞/kg或约1x106个细胞/kg或者至少
2x106个细胞/kg或至少约2x106个细胞/kg或2x106个细胞/kg或约2x106个细胞/kg。
kg、至少5x10 个细胞/kg或至少约5x10个细胞/kg或5x10个细胞/kg或约5x10个细胞/kg、至少6x105个细胞/kg或至少约6x105个细胞/kg或6x105个细胞/kg或约6x105个细胞/kg、至少7x105个细胞/kg或至少约7x105个细胞/kg或7x105个细胞/kg或约7x105个细胞/kg、至少
8x105个细胞/kg或至少约8x105个细胞/kg或8x105个细胞/kg或约8x105个细胞/kg、至少
5 5 5 5
9x10 个细胞/kg或至少约9x10 个细胞/kg或9x10 个细胞/kg或约9x10 个细胞/kg、至少
1x106个细胞/kg或至少约1x106个细胞/kg或1x106个细胞/kg或约1x106个细胞/kg或者至少
2x106个细胞/kg或至少约2x106个细胞/kg或2x106个细胞/kg或约2x106个细胞/kg。
[0449] 在一些实施方案中，细胞剂量是细胞的平剂量或细胞的固定剂量，使得细胞剂量不依赖于或基于受试者的体表面积或体重。
[0450] 在某些实施方案中，所述细胞或单独的细胞亚型群体以约100万至约1000亿个细胞和/或按每公斤体重所述细胞量的范围给予受试者，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞或在这些范围之间的任何值)和/或每公斤体重的范围。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
[0451] 例如，在一些实施方案中，如果受试者是人，那么剂量包括少于约5x108个总重组6 8
受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如，在约1x10 到5x10个此类细胞的范围内，例如2x106、5x106、1x107、5x107、1x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。
受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如，在约1x10 到5x10个此类细胞的范围内，例如2x106、5x106、1x107、5x107、1x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。
[0452] 在一些实施方案中，细胞疗法包含给予一定剂量，所述剂量包含以下细胞数量：为5 8
或为约1x10至5x10 个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)、为或为约5x105至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)、或为或为约
1x106至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量的细胞，所述剂量包含以下细胞数量：
至少或至少约1x105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，如至少或至少1x106、至少或至少约1x107、至少或至少约1x108个此类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于重组受体表达(例如CAR+)细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法包含给予一定剂量，所述剂量包含以下细胞数量：为或为约
1x105至5x108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、为或为约5x105至
1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、或为或为约1x106至1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包含给予一定剂量，所述剂量包含以下细胞数量：为或为约1x105至5x108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、为或为约5x105至1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或为或为约1x106至1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
或为约1x10至5x10 个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)、为或为约5x105至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)、或为或为约
1x106至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量的细胞，所述剂量包含以下细胞数量：
至少或至少约1x105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，如至少或至少1x106、至少或至少约1x107、至少或至少约1x108个此类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于重组受体表达(例如CAR+)细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法包含给予一定剂量，所述剂量包含以下细胞数量：为或为约
1x105至5x108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、为或为约5x105至
1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、或为或为约1x106至1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包含给予一定剂量，所述剂量包含以下细胞数量：为或为约1x105至5x108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、为或为约5x105至1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或为或为约1x106至1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
[0453] 在一些实施方案中，剂量的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
[0454] 在一些实施方案中，例如，如果受试者是人，那么所述剂量的CD8+T细胞(包括在剂量中包括CD4+和CD8+T细胞)包括在约1x106与5x108个之间的总重组受体(例如CAR)表达CD8+细胞，例如，在约5x106至1x108个此类细胞的范围内，例如1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、8 8
1x10或5x10个总此类细胞，或在任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞剂量包括给予为或为约1x107至0.75x108个表达重组受体的总CD8+T细胞、1x107至2.5x107个表达重组受体的总CD8+T细胞、为或为约1x107至0.75x108个表达重组受体的总CD8+T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的剂量包含给予或给予约1x107、2.5x107、5x107、
7.5x107、1x108或5x108个总重组受体表达CD8+T细胞。
1x10或5x10个总此类细胞，或在任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞剂量包括给予为或为约1x107至0.75x108个表达重组受体的总CD8+T细胞、1x107至2.5x107个表达重组受体的总CD8+T细胞、为或为约1x107至0.75x108个表达重组受体的总CD8+T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的剂量包含给予或给予约1x107、2.5x107、5x107、
7.5x107、1x108或5x108个总重组受体表达CD8+T细胞。
[0455] 在一些实施方案中，细胞(例如，表达重组受体的T细胞)的剂量作为单一剂量给予受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅给予一次。
[0456] 在过继细胞疗法的背景下，给定“剂量”的细胞的给予包括以单一组合物和/或单次不间断给药的方式(例如以单次注射或连续输注的方式)给予给定量或数量的细胞，并且还包括在例如不超过3天的指定时间段内以在多个单独组合物或输注中提供的分割剂量或多个组合物的方式给予给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，剂量是指定数量的细胞的单次或连续给药，在单个时间点给予或开始。然而，在一些情况下，剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注的方式给予，如每天一次持续三天或两天或者通过在一天的时间内多次输注。
[0457] 因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物给予。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物给予。
[0458] 术语“分割剂量”是指分割的剂量，使其在超过一天的时间内给予。这种类型的给药包括在本方法中并且被认为是单一剂量。在一些实施方案中，分割剂量的细胞在不超过三天的时间段内以共同包含剂量的细胞的多种组合物来给予。
[0459] 因此，细胞的剂量可以作为分割剂量给予，例如随时间给予的分割剂量。例如，在一些实施方案中，剂量可以在2天或3天内给予受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天给予25％的剂量并在第二天给予剩余的75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天给予33％的剂量，并且在第二天给予剩余的67％。在一些方面，在第一天给予10％的剂量，在第二天给予30％的剂量，并且在第三天给予60％的剂量。在一些实施方案中，分割剂量不超过3天。
[0460] 在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过给予多个组合物或溶液(例如第一和第二，任选地更多)来给予，各自含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在一定时间段内，分开地或独立地给予多个组合物，每个组合物含有不同细胞群和/或细胞亚型。例如，细胞群或细胞亚型可以分别包括CD8+和CD4+T细胞，和/或分别包含富集CD8+和CD4+的群体，例如CD4+和/或CD8+T细胞，其各自单独地包括基因工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予第一组合物，其包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞，以及给予第二组合物，其包含另一剂量的CD4+T细胞和CD8+T细胞。
[0461] 在一些实施方案中，组合物或剂量的给予(例如多个细胞组合物的给予)涉及分开给予所述细胞组合物。在一些方面，分开给予是同时或以任何顺序依次进行。在一些实施方案中，所述剂量包括第一组合物和第二组合物，并且所述第一组合物和第二组合物的给予相隔0至12小时，相隔0至6小时或相隔0至2小时。在一些实施方案中，第一组合物的给予的启动和第二组合物的给予的启动相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟。在一些实施方案中，第一组合物的给予的启动和/或完成以及第二组合物的给予的完成和/或启动相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟。
[0462] 在一些组合物中，第一组合物(例如所述剂量的第一组合物)包含CD4+T细胞。在一些组合物中，第一组合物(例如所述剂量的第一组合物)包含CD8+T细胞。在一些实施方案中，第一组合物是在第二组合物之前给予。
[0463] 在一些实施方案中，细胞的剂量或组合物包括表达重组受体的CD4+细胞与表达重组受体的CD8+细胞和/或CD4+细胞与CD8+细胞的定义的或目标比率，所述比率任选地为约1:1，或者在大约1:3与大约3:1之间，例如大约1:1。在一些方面，具有目标或所需比率的不同细胞群(例如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如1:1)的组合物或剂量的给予涉及给予含有一个所述群体的细胞组合物，和随后给予包含另一所述群体的单独细胞组合物，其中所述给予是以或大约以目标或所需比率来进行。在一些方面，定义比率的细胞的剂量或组合物的给予导致改善T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。
[0464] 在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，向受试者给予两个剂量。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，第二剂量是在第一剂量后约4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天给予。在一些实施方案中，在第一剂量后给予多个连续剂量，使得在给予所述连续剂量后给予另外一个或多个剂量。在一些方面，在另外的剂量中给予至受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，另外一个或多个剂量大于先前剂量。
[0465] 在一些方面，第一和/或连续剂量的大小是基于一个或多个标准来确定，例如受试者对先前治疗(例如，化疗)的反应、受试者的疾病负担(例如肿瘤负担、主体、大小或程度)、转移的程度或类型、阶段和/或受试者发生毒性结果(例如CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
[0466] 在一些方面，使用第一剂量与使用连续剂量之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，给予连续剂量是在使用第一剂量后大于约14天且小于约28天的时间点。在一些方面，第一剂量与连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在给予连续剂量后给予另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在给予先前剂量后至少约14天且小于约28天给予另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后少于约14天(例如在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)给予另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天不给予剂量，和/或在先前剂量后超过约
28天不给予剂量。
28天不给予剂量。
[0467] 在一些实施方案中，细胞(例如重组受体表达细胞)的剂量包含两个剂量(例如，双倍剂量)，包含T细胞的第一剂量和T细胞的连续剂量，其中第一剂量和第二剂量中的一个或两个包含给予T细胞的分割剂量。
[0468] 在一些实施方案中，所述剂细胞通常足够大以有效减轻疾病负荷。
[0469] 在一些实施方案中，细胞以所需剂量给予，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，在一些实施方案中，细胞剂量基于细胞总数(或每kg体重的细胞数量)和所需的单独群体或亚型的比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞剂量基于所需的单独群体中的细胞或单独细胞类型的总数(或每kg体重的细胞数量)。在一些实施方案中，剂量基于这种特征的组合，如所需的总细胞数量、所需比率和所需的单独群体中的细胞总数。
[0470] 在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(如期望剂量的T细胞)的耐受差异或在所述耐受差异之内给予细胞的群体或亚型如CD8+和CD4+T细胞。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被给予所述细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量(例如，细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于或高于最小细胞数量或每单位体重的最小细胞数量。在一些方面，在以所需剂量给予的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+比率)存在，例如在这种比率的一定耐受差异或误差内。
[0471] 在一些实施方案中，细胞以所需剂量的一种或多种单独细胞群体或亚型的耐受差异或在所述耐受差异之内给予，如所需剂量的CD4+细胞和/或所需剂量的CD8+细胞。在一些方面，所需剂量是所需的亚型或群体的细胞数量或所需的被给予所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞数量(例如，细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于或高于最小的群体或亚型的细胞数量或每单位体重的最小的群体或亚型的细胞数量。
[0472] 因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的总细胞的固定剂量和所需比率，和/或基于所需的一种或多种单独亚型或亚群(例如，各自)的固定剂量。因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的T细胞的固定或最小剂量和所需的CD4+与CD8+细胞的比率，和/或基于所+ +需的CD4和/或CD8细胞的固定或最小剂量。
[0473] 在一些实施方案中，细胞在多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率的耐受范围下或耐受范围内给予。在一些方面，所需比率可以是特定比率或可以是一系列比率。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)在1:5或约1:5和5:1或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在1:3或约1:3和3:1或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在2:1或约2:1和1:5或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1，如5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、
1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、
1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5或者约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、
1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、
1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5)。在一些方面，耐受差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约
20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％，包括这些范围之间的任何值。
1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、
1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5或者约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、
1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、
1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5)。在一些方面，耐受差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约
20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％，包括这些范围之间的任何值。
[0474] 在具体实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指表达重组受体(例如，CAR)的细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指给予的所有细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量或浓度。
[0475] 在一些方面，剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对现有治疗例如化学疗法的反应、受试者的疾病负荷如肿瘤负担、体积、尺寸或程度、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果的可能性或发生率，例如CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答。
[0476] 在一些实施方案中，所述方法还包括给予一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量不同于初始剂量，例如更高如比初始剂量高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者更低如比初始剂量低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，一个或多个另外的剂量的给予基于以下各项来确定，如受试者对初始治疗或任何现有治疗的反应、受试者的疾病负荷如肿瘤负担、体积、尺寸或程度、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果的可能性或发生率，例如CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答。
[0477] 在一些实施方案中，可以给予相对较低剂量的细胞，例如次最佳剂量的细胞或低于治疗有效量的剂量的细胞，其在体内刺激(例如通过内源性抗原或外源性药剂)时可以导致受试者中存在的工程化细胞的数量的加强(例如增加或扩增)。在任何此类实施方案中，细胞的扩增和/或激活可以与在体内暴露于抗原一起发生，例如，在给予细胞后，受试者体内工程化细胞的扩增。在一些实施方案中，体内扩增的范围、程度或量值可以通过多种方法来扩大、加强或增强，所述方法能够调节(例如增加)所给予细胞(例如表达重组受体的细胞)的扩增、增殖、存活和/或功效。
[0478] 一旦将细胞给予至受试者(例如人)，在一些方面通过许多已知方法中的任何一种来测量细胞群的生物活性。要评价的参数包括细胞与抗原的特异性结合，在体内例如通过成像来评价，或离体例如通过ELISA或流式细胞术来评价。在某些实施方案中，细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，还可以通过测定某些细胞因子如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面，通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。在一些方面，评估毒性结果、细胞的持久性和/或扩增和/或宿主免疫应答的存在或不存在。
[0479] B.组合物和配制品
[0480] 在一些实施方案中，以组合物或配制品例如药物组合物或配制品的方式提供包含用重组抗原受体例如CAR或TCR工程化的细胞的所述剂细胞。此类组合物可以根据所提供的方法和/或与所提供的制品或组合物一起使用，例如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法。
[0481] 术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对给予配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
[0482] “药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0483] 在一些方面，载体的选择部分地由特定细胞或药剂和/或通过给药方法确定。因此，存在多种合适的配制品。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；
间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
[0484] 在一些方面，缓冲剂被包括在所述组合物中。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
[0485] 配制品或组合物还可含有多于一种活性成分，其可用于用细胞或药剂预防或治疗的特定适应症、疾病或病症，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物进一步包含其他药物活性剂或药物如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，所述药剂或细胞以盐(例如药学上可接受的盐)的形式给予。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些盐。
[0486] 在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)的药剂或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给予，取决于病症，重复所述治疗直至出现所需疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注给予所述组合物、通过多次推注给予所述组合物或通过连续输注给予所述组合物来递送。
[0487] 所述药剂或细胞可以通过任何合适的方式给予，例如通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球后注射、球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给予以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给予。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞或药剂的单次推注给药来给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过例如在不超过3天的时间段内对细胞或药剂的多次推注给予或通过细胞或药剂的连续输注给予来给予。
[0488] 对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于待治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、给予药剂或细胞用于预防性目的还是治疗性目的、先前疗法、受试者的临床病史和对药剂或细胞的反应、以及主治医师的决断。在一些实施方案中，所述组合物适合一次或在一系列治疗中给予受试者。
[0489] 可以使用标准给药技术、配制品和/或设备给予细胞或药剂。提供了用于储存和给予所述组合物的配制品和装置(如注射器和小瓶)。关于细胞，给药可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且给予至同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射给予，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当给予治疗性组合物(例如，含有基因修饰的免疫应答细胞或治疗或改善神经毒性症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
[0490] 配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂给予的那些。在一些实施方案中，肠胃外给予药剂或细胞群。如本文所用术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送向受试者给予药剂或细胞群。
[0491] 在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的pH。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方便给予，特别是通过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
[0492] 无菌可注射溶液可以通过将所述药剂或细胞掺入溶剂中来制备，如具有合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物中。
[0493] 用于体内给予的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
[0494] C.用于调节细胞扩增和活性的组合疗法，例如药剂
[0495] 在一些实施方案中，将所述细胞作为组合治疗的部分给予，例如与另一药剂(例如治疗剂，例如药物)同时或以任何顺序依次给予。在一些实施方案中，另一药剂(例如药物)可以是治疗性干预，例如抗体或工程化细胞或受体或药剂，例如细胞毒性剂或治疗剂。在一些实施方案中，另一药剂(例如药物)可以是增强、扩大或加强细胞的扩增、增殖、存活和/或功效的药剂。在一些情境下，将所述细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同给予，使得所述细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，所述细胞在一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一些实施方案中，所述细胞在一种或多种另外的治疗剂之后给予。
[0496] 在一些实施方案中，所述方法包括涉及与能够扩大、加强或增强所给予细胞(例如重组受体表达细胞)的扩增、增殖、存活和/或功效的药物或药剂组合给予(例如同时或依次给予)的方法。在一些实施方案中，此类药剂是与另一药剂(例如药物)同时或以任何顺序依次给予。在一些实施方案中，所述药剂是在给予细胞(例如表达重组受体(例如CAR)的细胞)之前、期间、在过程中或之后给予。在一些实施方案中，此类药剂包括由于特异性调节转基因(例如编码重组受体的转基因)而特异性扩大、加强或增强工程化细胞的扩增、增殖、存活和/或功效的药剂。在一些实施方案中，此类药剂包括调节所给予细胞(例如免疫细胞，例如T细胞)的细胞扩增和/或活性的药剂。
[0497] 在一些实施方案中，所给予的细胞(例如工程化以表达重组受体的细胞)被修饰以扩大、加强或增强所给予细胞的扩增、增殖、存活和/或功效。在一些实施方案中，所给予的细胞(例如，工程化以表达重组受体的细胞)被修饰，使得可以例如通过给予药剂来调节和/或控制工程化细胞的扩增、增殖、存活和/或功效。
[0498] 在一些实施方案中，所述方法包括减少、抑制和/或最小化抑制因子在体内抑制工程化细胞的增殖、扩增和/或存活的效应的体内步骤。在一些实施方案中，所述方法包括促进、支持和/或增强工程化细胞在体内的增殖、扩增和/或存活的体内步骤。
[0499] 在一些实施方案中，另外的药剂是小分子、肽、多肽、抗体或其抗原结合片段、抗体模拟物、适体或核酸分子(例如siRNA)、脂质、多糖或其任一组合。在一些实施方案中，另外的药剂是特定因子、分子、受体、功能和/或酶的抑制剂或激活剂。在一些实施方案中，另外的药剂是特定因子、分子、受体、功能和/或酶的激动剂或拮抗剂。在一些实施方案中，另外的药剂是一种或多种因子和/或代谢物的类似物或衍生物。在一些实施方案中，另外的药剂是蛋白质或多肽。在一些实施方案中，另外的药剂是细胞，例如工程化细胞。
[0500] 1.用于转基因特异性扩增的药剂
[0501] 在一些实施方案中，所述方法包括例如在组合疗法中给予除了所给予细胞(例如工程化以表达重组受体的细胞)以外的药剂。在一些实施方案中，所述药剂由于特异性调节转基因(例如编码重组受体的转基因)而特异性扩大、加强或增强工程化细胞的扩增、增殖、存活和/或功效。在一些实施方案中，所述药剂特异性靶向转基因，例如重组受体。在一些实施方案中，所述药剂特异性结合、激活和/或增强重组受体的活性和/或由转基因编码的全部或部分重组分子的其他功能。在一些实施方案中，将药剂与重组细胞组合给予可以增强、加强或扩大所给予细胞的增殖、扩增和/或存活，例如，增强细胞的体内扩增。
[0502] 在一些实施方案中，用于转基因特异性扩增的示例性方法或药剂包括内源性抗原暴露、疫苗接种、抗独特型抗体或其抗原结合片段和/或可调节的重组受体。例如，在一些实施方案中，用于转基因特异性扩增的方法包括疫苗接种方法。在一些实施方案中，所述药剂是肽疫苗或基于细胞的疫苗，例如，工程化以表达由重组受体识别的特定抗原的细胞(参见，例如，WO 2016/069647、WO 2011/066048、US 2016/0304624、美国专利号9,476,028以及Hailemichael和Overwijk，Int J Biochem Cell Biol.(2014)53:46-50)。在一些实施方案中，用于转基因特异性扩增的方法包括给予抗独特型抗体。抗独特型抗体(包括其抗原结合片段)特异性地识别、特异性地靶向和/或特异性地结合至抗体或其抗原结合片段(例如重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))的抗原结合结构域)的独特位。独特位是抗体可变部分内的任何单一抗原决定簇或表位。在一些实施方案中，抗独特型抗体或其抗原结合片段是激动剂和/或展现刺激细胞表达特定抗体的特异性活性，所述特定抗体包括含有所述抗体或其抗原结合片段的缀合物或重组受体(参见，例如，美国专利公开号US 2016/0096902；US 2016/0068601；US 2014/0322183；US 2015/0175711；US 2015/283178；美国专利号9,102,
760；Jena等人PloS one(2013)8(3):e57838；Long等人,Nature Medicine(2015)21(6):
581-590；Lee等人,The Lancet(2015)385(9967):517-528；Zhao等人,PloS One(2014)9(5):e96697；Leung等人,MAbs.(2015)7(1):66-76)。
760；Jena等人PloS one(2013)8(3):e57838；Long等人,Nature Medicine(2015)21(6):
581-590；Lee等人,The Lancet(2015)385(9967):517-528；Zhao等人,PloS One(2014)9(5):e96697；Leung等人,MAbs.(2015)7(1):66-76)。
[0503] 2.调节细胞扩增或活性的药剂
[0504] 在一些实施方案中，所述方法包括对免疫细胞或免疫功能(通常包括所给予的工程化细胞)的扩增、增殖、存活和/或活性的调节。在一些实施方案中，所述方法包括通常是免疫刺激性或通常促进、增强、扩大和/或加强免疫细胞(包括所给予的细胞)在体内(例如在受试者体内)的扩增、增殖、存活和/或活性的步骤。在一些实施方案中，所述药剂可以减少、抑制和/或最小化抑制因子在体内抑制免疫细胞(例如所给予细胞)的增殖、扩增和/或存活的效应。
[0505] a.负调节物的抑制
[0506] 在一些实施方案中，所述方法包括调节工程化细胞的扩增，例如，通过抑制所给予细胞(例如工程化免疫细胞)的增殖、扩增和/或激活的负调节物。在受试者体内的特定环境中，所给予的表达重组受体的细胞可能遇到压抑或抑制细胞生长、增殖、扩增和/或存活的环境，例如免疫抑制环境。例如，免疫抑制环境可以含有免疫抑制性细胞因子、调节性调节剂和共抑制受体。在一些实施方案中，另外的药剂可以用于调节所给予细胞的扩增，例如克服抑制环境。
[0507] 在一些实施方案中，另外的药剂包括免疫调节剂、免疫检查点抑制剂、代谢途径调节剂、腺苷途径或腺苷受体拮抗剂或激动剂以及信号传导途径的调节剂(例如激酶抑制剂)。
[0508] 在一些实施方案中，另外的药剂是免疫调节剂，例如免疫检查点抑制剂。在一些实例中，另外的药剂增加、增强或扩大所给予细胞的扩增和/或增殖，从而通过阻断免疫检查点蛋白(即免疫检查点抑制剂)来增加、增强或扩大免疫应答。在一些实施方案中，另外的药剂是增强工程化细胞(例如重组受体表达细胞)的活性的药剂，是抑制免疫抑制分子或免疫检查点分子的分子。免疫抑制分子的例子包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TEVI3、CEACAM(例如、CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂可以是针对免疫检查点蛋白的抗体，例如针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4或CD152)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡蛋白1配体1(PD-L1)的抗体(参见，例如，Pardoll,Nat Rev Cancer.2012年3月22日；12(4):
252-264)。
252-264)。
[0509] 在一些实施方案中，所述方法包括使表达重组受体的细胞与抑制抑制性细胞表面受体(例如转化生长因子β受体(TGFβR))的药剂接触。在一些实施方案中，所给予的细胞(例如重组受体表达细胞)可以被工程化以抵抗可以抑制其效应子功能的免疫抑制性细胞因子的效应(参见，例如，Foster等人,J Immunother.(2008)31:500-505；Bollard等人,Molecular Therapy.(2012)20:S22；Bendle等人,J.Immunol.(2013)191(6):3232-3239)。在一些实施方案中，另外的药剂是抗TGFβ抗体或抗TGFβR抗体(参见，例如，WO 2011/
109789)。
109789)。
[0510] 在一些实施方案中，另外的药剂调节免疫抑制因子(例如腺苷)的代谢、信号传导和/或转运。在一些实施方案中，另外的药剂是细胞外腺苷或腺苷受体的抑制剂，或引起细胞外腺苷水平降低或减小的药剂，例如防止细胞外腺苷形成、降解细胞外腺苷，使细胞外腺苷失活和/或减少细胞外腺苷的药剂。在一些实施方案中，另外的药剂是腺苷受体拮抗剂，例如A2a、A2b和/或A3受体。
[0511] 在一些实施方案中，另外的药剂是腺苷水平和/或腺苷途径组分的调节剂。腺苷可以在体内起免疫调节剂的功能。例如，腺苷和一些非选择性激活腺苷受体亚型的腺苷类似物减少炎症氧化产物的嗜中性粒细胞产生(Cronstein等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.451:291,1985；Roberts等人,Biochem.J.,227:669,1985；Schrier等人,J.Immunol.137:3284,1986；
Cronstein等人,Clinical Immunol.Immunopath.42:76,1987)。在一些情况下，细胞外腺苷或腺苷类似物的浓度可以在特定环境(例如肿瘤微环境(TME))中增加。在一些情况下，腺苷或腺苷类似物信号传导取决于缺氧或在缺氧或其调节中所涉及的因子，例如缺氧诱导型因子(HIF)。在一些实施方案中，腺苷信号传导的增加可以增加细胞内cAMP和cAMP依赖性蛋白激酶，其导致抑制促炎性细胞因子产生，并且可以导致免疫抑制分子的合成和Treg的发展(Sitkovsky等人,Cancer Immunol Res(2014)2(7):598-605)。在一些实施方案中，另外的药剂可以降低或逆转腺苷、腺苷类似物和/或腺苷信号传导的免疫抑制效应。在一些实施方案中，另外的药剂可以减少或逆转缺氧驱动的A2-腺苷酸能T细胞免疫抑制。在一些实施方案中，另外的药剂选自腺苷受体的拮抗剂、细胞外腺苷降解剂、CD39/CD73胞外酶产生腺苷的抑制剂和缺氧-HIF-1α信号传导的抑制剂。在一些实施方案中，另外的药剂是腺苷受体拮抗剂或激动剂。
Cronstein等人,Clinical Immunol.Immunopath.42:76,1987)。在一些情况下，细胞外腺苷或腺苷类似物的浓度可以在特定环境(例如肿瘤微环境(TME))中增加。在一些情况下，腺苷或腺苷类似物信号传导取决于缺氧或在缺氧或其调节中所涉及的因子，例如缺氧诱导型因子(HIF)。在一些实施方案中，腺苷信号传导的增加可以增加细胞内cAMP和cAMP依赖性蛋白激酶，其导致抑制促炎性细胞因子产生，并且可以导致免疫抑制分子的合成和Treg的发展(Sitkovsky等人,Cancer Immunol Res(2014)2(7):598-605)。在一些实施方案中，另外的药剂可以降低或逆转腺苷、腺苷类似物和/或腺苷信号传导的免疫抑制效应。在一些实施方案中，另外的药剂可以减少或逆转缺氧驱动的A2-腺苷酸能T细胞免疫抑制。在一些实施方案中，另外的药剂选自腺苷受体的拮抗剂、细胞外腺苷降解剂、CD39/CD73胞外酶产生腺苷的抑制剂和缺氧-HIF-1α信号传导的抑制剂。在一些实施方案中，另外的药剂是腺苷受体拮抗剂或激动剂。
[0512] 通过细胞外腺苷的抑制剂(例如防止细胞外腺苷形成、降解细胞外腺苷、使细胞外腺苷失活和/或减少细胞外腺苷的药剂)和/或腺苷受体抑制剂(例如腺苷受体拮抗剂)可以增强免疫应答，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、树突细胞，T细胞和/或B细胞介导的应答。此外，Gs蛋白介导的cAMP依赖性细胞内途径的抑制剂和腺苷受体触发的Gi蛋白介导的细胞内途径的抑制剂也可以增加急性和慢性炎症。
[0513] 在一些实施方案中，另外的药剂是腺苷受体拮抗剂或激动剂，例如腺苷受体A2a、A2b、A1和A3中的一种或多种的拮抗剂或激动剂。分别地，A1和A3抑制腺苷酸环化酶活性，并且A2a和A2b刺激腺苷酸环化酶活性。某些腺苷受体(如A2a、A2b和A3)可以在炎症期间抑制或降低免疫应答。因此，拮抗免疫抑制性腺苷受体可以扩大、加强或增强免疫应答，例如来自所给予细胞(例如表达CAR的T细胞)的免疫应答。在一些实施方案中，另外的药剂抑制细胞外腺苷的产生和腺苷通过腺苷受体触发的信号传导。例如，通过抑制或减少产生腺苷的局部组织缺氧；通过降解(或使其失活)所积累的细胞外腺苷；通过防止或减少免疫细胞上腺苷受体的表达；和/或通过抑制/拮抗腺苷配体通过腺苷受体的信号传导，可以增强免疫应答、局部组织炎症和靶向组织破坏的增强。
[0514] 拮抗剂是倾向于消除另一种物质的作用的任何物质，其作为结合至细胞受体而不引发生物学反应的药剂。在一些实施方案中，拮抗剂是化学化合物，其是腺苷受体(如A2a、A2b或A3受体)的拮抗剂。在一些实施方案中，拮抗剂是肽或拟肽，其结合腺苷受体，但不会触发G1蛋白依赖性细胞内途径。示例性腺苷受体拮抗剂描述于以下文献中：美国专利号5,565,566；5,545,627、5,981,524；5861405；6066642；6326390；5670501；6117998；6,232,
297；5786360；5424297；6,313,131；5,504,090；和6,322,771；以及Jacobson和Gao,Nat Rev Drug Discov.(2006)5(3):247-264。
297；5786360；5424297；6,313,131；5,504,090；和6,322,771；以及Jacobson和Gao,Nat Rev Drug Discov.(2006)5(3):247-264。
[0515] b.免疫刺激的促进
[0516] 在一些实施方案中，所述方法包括给予具有免疫刺激性的另外的药剂。在一些实施方案中，另外的药剂通常可以促进免疫细胞的增殖、扩增、存活和/或功效。在一些实施方案中，另外的药剂可以特异性地促进所给予细胞，例如重组受体表达细胞。在一些实施方案中，另外的药剂是细胞因子。在一些实施方案中，另外的药剂是配体。
[0517] 在一些实施方案中，另外的药剂是免疫刺激性配体，例如CD40L。在一些实施方案中，另外的药剂是细胞因子，例如IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、α、β或γ干扰素(IFN)和促红细胞生成素(EPO)。
[0518] 3.淋巴细胞清除疗法
[0519] 在一些方面，所提供的方法可以还包括，例如在启动细胞(例如重组受体表达细胞)的给予之前或同时，给予一种或多种淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法包括给予磷酰胺，如环磷酰胺。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法可以包括给予氟达拉滨。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法中不包括氟达拉滨。在一些实施方案中，不给予淋巴细胞清除疗法。
[0520] 用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预处理受试者可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。用淋巴细胞清除剂(包括环孢霉素和氟达拉滨的组合)预处理已经有效地改善转移的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在细胞疗法中的功效，包括改善转移细胞的应答和/或持久性。参见例如Dudley等人,Science,298,850-54(2002)；Rosenberg等人,Clin Cancer Res,17(13):4550-4557(2011)。同样，在CAR+T细胞的背景下，若干研究已经结合淋巴细胞清除剂，最常见地为环磷酰胺、氟达拉滨、苯达莫司汀、或其组合，有时伴有低剂量放射。参见Han等人Journal of Hematology&Oncology,6:47(2013)；Kochenderfer等人,Blood,119:2709-2720(2012)；Kalos等人,Sci Transl Med,3(95):95ra73(2011)；临床试验研究记录号：NCT02315612；NCT01822652。
[0521] 可以进行这种预处理，目的是降低可能抑制所述疗法的功效的各种结果中的一种或多种的风险。这些结果包括被称为“细胞因子吸收”的现象，通过所述现象，T细胞、B细胞、NK细胞与TIL竞争稳态的和激活的细胞因子，如IL-2、IL-7和/或IL-15；通过调节性T细胞、NK细胞或免疫系统的其他细胞抑制TIL；负调节物对肿瘤微环境的影响。Muranski等人,Nat Clin Pract Oncol.12月；3(12):668-681(2006)。
[0522] 因此，在一些实施方案中，提供的方法还涉及向受试者给予淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，所述方法涉及在给予细胞剂量之前，向受试者给予淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法含有化学治疗剂，如氟达拉滨和/或环磷酰胺。在一些实施方案中，所述细胞和/或淋巴细胞清除疗法的给予经由门诊递送进行。
[0523] 在一些实施方案中，所述方法包括在给予细胞剂量之前向受试者给予预处理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在第一或后续剂量之前至少2天如至少3、4、5、6或7天向所述受试者给予预处理剂。在一些实施方案中，在给予细胞剂量之前不超过7天如不超过6天、5天、4天、3天或2天向受试者给予预处理剂。
[0524] 在一些实施方案中，将所述受试者用在或在约20mg/kg与100mg/kg之间、如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量的环磷酰胺进行预处理。在一些方面，将所述受试者用60mg/kg或约60mg/kg的环磷酰胺进行预处理。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺以单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，环磷酰胺每天给予一次，持续一天或两天。在一些实施方案中，如果淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺，那么按以下剂量向受试者给予环磷酰胺：在或在约100mg/m2与500mg/m2之
2 2 2 2
间，例如在或在约200mg/m与400mg/m之间，或者250mg/m与350mg/m之间，包含端值。在一些情况下，向所述受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺以单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前每天向所述受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
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间，例如在或在约200mg/m与400mg/m之间，或者250mg/m与350mg/m之间，包含端值。在一些情况下，向所述受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺以单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前每天向所述受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
[0525] 在一些实施方案中，氟达拉滨可以按单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前每天向所述受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。在一些实施方案中，环磷酰胺每天给予一次，持续一天或两天。
[0526] 在一些实施方案中，当淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨时，向所述受试者给予剂量在或在约1mg/m2与100mg/m2之间、如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与30mg/m2之间、或24mg/m2与26mg/m2之间的氟达拉滨。在一些情况下，向所述受试者给予25mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉滨可以按单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。
[0527] 在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺和氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可包括任何剂量或给药时间表(如上述那些剂量或给药时间表)下的环磷酰胺以及任何剂量或给药时间表(如上述那些剂量或给药时间表)下的氟达拉滨。例如，在一些方面，在给予所述细胞剂量之前向所述受试者给予60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5剂量的25mg/m2氟达拉滨。
[0528] 在一个示例性剂量方案中，在接受第一剂量之前，受试者接受环磷酰胺和氟达拉滨(cy/flu)的淋巴细胞清除预处理化疗，其是在第一剂量的表达CAR的细胞之前至少两天且通常在给予细胞之前不超过7天给予。在预处理治疗后，对受试者给予如上所述的表达CAR的T细胞的剂量。
[0529] 在一些实施方案中，在输注细胞剂量之前给予预处理剂改进了治疗的结果。例如，在一些方面，预处理改进了用剂量治疗的功效或增加了表达重组受体的细胞(例如表达CAR的细胞，如表达CAR的T细胞)在受试者中的持久性。在一些实施方案中，预处理治疗增加了无病生存率，例如存活的受试者的百分比，并在细胞剂量之后的给定时间段后未展现出最小残留的或分子可检测的疾病。在一些实施方案中，增加了到中值无病生存率的时间。
[0530] 在将所述细胞给予受试者(例如人)后，在一些方面工程化细胞群的生物活性通过许多已知方法中的任何一种来测量。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，可以使用本领域中已知的任何适宜方法测量工程化细胞破坏靶细胞的能力，所述方法如以下文献中所述的细胞毒性测定：例如，Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，还可以通过测定某些细胞因子如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面，通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。在一些方面，评估毒性结果、细胞的持久性和/或扩增和/或宿主免疫应答的存在或不存在。
[0531] 在一些实施方案中，在输注细胞剂量之前给予预处理剂改进了治疗的结果(例如通过改进用剂量治疗的功效)，或增加了表达重组受体的细胞(例如表达CAR的细胞，如表达CAR的T细胞)在受试者中的持久性。
[0532] D.细胞的修饰
[0533] 在某些实施方案中，细胞以任何数量的方式被修饰，使得增加其治疗或预防功效和/或可以调节扩增、增殖、存活和/或功效。在一些实施方案中，细胞被修饰使得在给予至受试者后可以在调节(例如增强、加强和/或扩大)扩增、增殖、存活和/或功效。在一些实施方案中，细胞被修饰使得可以调节和/或控制转基因和/或免疫调节因子的表达。在一些实施方案中，细胞被修饰以调节重组受体的特定组分的表达和/或活性。在一些实施方案中，细胞被修饰以增加或减少药剂(例如，核酸，例如抑制性核酸)的表达。在一些实施方案中，细胞被修饰以表达和/或分泌药剂。
[0534] 在一些实施方案中，工程化细胞表达的工程化重组受体(例如CAR)可以直接或者通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物如重组受体缀合至靶向部分的实践是本领域中已知的。参见例如Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:111(1995)、和美国专利5,087,616。
[0535] 1.抑制性核酸和基因改变
[0536] 在一些实施方案中，所述方法包括通过使细胞与药剂接触来调节所给予的细胞，所述药剂减少所给予细胞(例如表达重组受体的工程化T细胞)的负调节物的表达或能够实现所述表达减少。细胞的负调节物包括本文所述的任一种，例如免疫检查点抑制剂、抑制性受体和/或腺苷调节剂。在一些实施方案中，减少负调节物的表达或能够实现所述表达减少的药剂包括是或包含抑制性核酸分子(例如与编码负调节物的基因或核酸互补、靶向、抑制和/或结合所述基因或核酸的核酸分子)的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是或包含复合物，所述复合物包含核糖核蛋白(RNP)复合物，所述核糖核蛋白(RNP)复合物包括Cas9(例如在一些情况下酶促失活的Cas9)和靶向编码负调节物的基因的gRNA。
[0537] 在一些任何此类实施方案中，抑制性核酸分子包括RNA干扰剂。在一些任何此类实施方案中，抑制性核酸是或含有或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应的shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、前体微小RNA(前miRNA)或微小RNA(miRNA)。设计抑制性核酸和修饰细胞以表达抑制性核酸的方法是本领域已知的(参见例如WO 2004/0455543和WO 2004/048566)。
[0538] 在一些实施方案中，使工程化细胞经历基因改变或基因编辑，其靶向编码参与免疫调节、免疫细胞的负调节和/或免疫抑制的基因的基因座。在一些实施方案中，基因编辑导致所靶向基因座处的插入或缺失，或所靶向基因座的“敲除”以及所编码蛋白质的表达的消除。在一些实施方案中，基因编辑是通过使用CRISPR/Cas9系统进行非同源末端接合(NHEJ)来实现的。在一些实施方案中，一种或多种引导RNA(gRNA)分子可以与一种或多种Cas9核酸酶、Cas9切口酶、酶促失活的Cas9或其变体或工程化的锌指或TALE系统一起使用。基因改变的方法是本领域已知的(参见，例如，WO 2015/161276；美国专利号6,140,081号；
6,453,242；和6,534,261；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536；WO 03/
016496和美国公开号2011/0301073)。
6,453,242；和6,534,261；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536；WO 03/
016496和美国公开号2011/0301073)。
[0539] 2.修饰以表达另外的药剂
[0540] 在一些实施方案中，所述细胞(例如，重组受体表达细胞)被进一步修饰以表达和/或分泌另外的药剂，所述另外的药剂促进、增强、加强和/或扩大所给予的细胞的增殖、扩增、存活和/或功效。例如，重组受体表达细胞(例如表达CAR的细胞)可以进一步工程化以表达和/或分泌另外的药剂，所述另外的药剂克服免疫抑制效应和/或增强T细胞和重组受体的扩增和/或功能。在一些实施方案中，所述细胞可以工程化以表达促进所给予细胞的扩增的细胞因子。在一些实施方案中，此类另外的药剂可以与诱导型表达系统(例如诱导型启动子)可操作地连接。
[0541] 在一些实施方案中，所给予的细胞可以被修饰以表达和/或分泌药剂，所述药剂抑制免疫抑制因子(例如本文所述的任一种)和/或刺激免疫刺激因子。在一些实施方案中，由给予的细胞表达的另外的药剂减少或防止所述细胞在肿瘤微环境中的免疫抑制(参见，例如，美国专利公开号US 2016/0045551)。在一些实施方案中，由所给予的细胞编码和/或分泌的另外的药剂可以包括本文所述的任何另外的药剂。
[0542] 在一些实施方案中，由所给予的细胞编码的另外的药剂是可溶的并且被分泌。在一些实施方案中，另外的药剂是可溶性scFv。在一些实施方案中，另外的药剂是细胞因子。
[0543] 3.重组受体的表达和/或活性的调节
[0544] 在一些实施方案中，所述方法包括修饰细胞以允许重组受体(例如CAR)的可调节的表达和/或活性，从而通过重组受体调节信号。在一些实施方案中，可调节的表达和/或活性是通过将重组受体配置成含有特定调节元件和/或系统(例如本文所述的任一种)或受其控制来实现。在一些实施方案中，将工程化细胞给予至受试者体内和/或暴露于特定配体可以调节重组受体(例如CAR)的表达和/或活性。在一些实施方案中，重组受体的表达和/或活性的调节是通过给予可以调节重组受体(例如CAR)的表达的另外的药剂来实现。在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)的受调节的表达是通过可调节的转录因子释放系统，或通过给予另外的药剂来实现，所述另外的药剂可以诱导多肽(例如重组受体)的构象变化和/或多聚化。在一些实施方案中，另外的药剂是化学诱导剂。
[0545] IV.定义
[0546] 除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
[0547] 如本文所用的，单数形式“一种/个(a/an)”和“所述(the)”包括复数种/个指示物，除非上下文另外明确说明。例如，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。
[0548] 贯穿本公开内容，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，在提供一系列值的情况下，应当理解，在所述范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在所要求保护的主题内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包括在更小范围之内，并且也被涵盖在所要求保护地主题之内，服从于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述的范围包括一个或两个限制时，排除了那些被包括的限制的任一个或两者的范围也被包括在所要求保护的主题之内。无论范围的广度如何，这都适用。
[0550] 如本文所用，受试者包括任何活的生物体，如人和其他哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人和非人动物，包括农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。
[0551] 如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群时，“耗尽”是指例如与组合物中的细胞总数或组合物体积相比或者相对于其他细胞类型，如通过基于所述群体或细胞表达的标记的阴性选择，或通过基于不存在于待耗尽的所述细胞群或细胞上的标记的阳性选择来降低所述细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不要求从组合物完全去除细胞、细胞类型或群体。
[0552] 如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群时，“富集”是指例如与组合物中的细胞总数或组合物体积相比或者相对于其他细胞类型，如通过基于所述群体或细胞表达的标记的阳性选择，或通过基于不存在于待耗尽的所述细胞群或细胞上的标记的阴性选择来增加所述细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不需要从组合物中完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在富集的组合物中以等于或甚至接近100％存在。
[0553] 如本文所用，细胞或细胞群针对特定标记是“阳性”或“+”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如在一些实施方案中通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
[0554] 如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指在一些实施方案中，如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记的抗体染色并检测所述抗体)检测到的表面表达的不存在，其中所述染色未通过流式细胞术按以下水平检测到：显著高于在其他方面都相同的条件下用同种型匹配的对照进行相同程序检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或如与已知对所述标记呈阴性的细胞相比基本上类似的水平。
[0555] 如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，Vpx或Vpr蛋白)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。
[0556] 氨基酸取代可以包括用另一种氨基酸替代多肽中的一个氨基酸。氨基酸通常可以根据以下常见的侧链特性进行分组：
[0557] (1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
[0558] (2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
[0559] (3)酸性：Asp、Glu；
[0560] (4)碱性：His、Lys、Arg；
[0561] (5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
[0562] (6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
[0563] 非保守氨基酸取代将涉及将这些类别之一的成员与另一个类别交换。
[0564] 如本文所用，“在对应于……的位置”或叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(例如序列表中所述)是指，在使用标准比对算法(例如GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。在一些实施方案中，Vpx或Vpr蛋白的示例性对应残基可以通过将序列与SEQ ID NO:1中所示的示例性Vpx序列或如本文所述的其他Vpx或Vpr序列比对来鉴定。在一些实施方案中，SAMHD1的示例性对应残基可以通过将序列与SEQ ID NO:19中所示的示例性SAMHD1序列比对来鉴定。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应的残基。通常，为了鉴定对应位置，比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M Stockton Press,New York,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
[0565] 如本文所用的术语“载体”是指能传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如慢病毒或γ逆转录病毒载体，其具有携带另一种核酸并且能够插入宿主基因组中以供其繁殖的基因组。
[0566] 如本文所用的，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
[0567] 如本文所用，术语“治疗(treatment、treat和treating)”是指疾病或病症或障碍，或与其相关的症状、不良反应或结果、或表型的完全或部分减轻或减少。在某些实施方案中，效果是治疗性的，使得其部分或完全治愈疾病或病症或归因于其的不良症状。
[0568] 如本文所用，化合物或组合物或组合的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动力学或药效动力学作用的量。所述治疗有效量可以根据诸如疾病状态、受试者的年龄、性别和体重以及给予的细胞群等因素而变化。
[0569] 本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，在程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
[0570] 本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
[0571] V.示例性实施方案
[0572] 所提供的实施方案为：
[0573] 1.一种转导T细胞的方法，所述方法包括孵育包含重组核酸的病毒载体粒子和包含多个T细胞的输入组合物，所述多个T细胞已经从受试者的样品获得，其中：
[0574] 所述孵育是在从所述受试者获得所述样品后不超过24小时开始；和/或
[0575] 在从所述受试者获得所述样品后，在所述孵育之前，所述T细胞未经历高于或高于约15℃、约18℃、约22℃或约25℃的温度持续超过1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时的时间；和/或
[0576] 在从所述受试者获得所述样品后，在所述孵育之前，所述T细胞未经历为、为约、高于或高于约37°±2.0℃的温度持续超过15分钟、30分钟、1小时或2小时的时间。
[0577] 2.实施方案1的方法，其中在从所述受试者获得所述样品后不超过或不超过约1小时、3小时、6小时、12小时或18小时，开始孵育。
[0578] 3.实施方案1或实施方案2的方法，其中，在所述孵育之前，所述方法不包括在促进细胞激活的条件下刺激所述T细胞。
[0579] 4.实施方案1-3中任一项的方法，其中，在所述孵育之前，所述输入组合物未经历离体刺激，所述离体刺激包括在高于或高于约37°±2.0℃下孵育，和/或在能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一种或多种药剂的存在下孵育，在能够通过TCR复合物诱导信号的一种或多种药剂的存在下孵育，和/或在能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的一种或多种药剂的存在下孵育；CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7。
[0580] 5.实施方案1-4中任一项的方法，其中，在所述孵育之前，不超过5％、10％、20％、30％或40％的所述T细胞是激活细胞，表达选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的表面标记；包含选自IL-2、IFN-γ、TNF-α的细胞因子的细胞内表达，处于细胞周期的G1期或较后期，和/或能够增殖。
[0581] 6.一种转导T细胞的方法，所述方法包括孵育包含重组核酸的病毒载体粒子和包含T细胞的输入组合物，所述T细胞已经从受试者的样品获得，其中，在所述孵育之前，所述T细胞或输入组合物未经历离体刺激，所述离体刺激包括在高于或高于约37°±2.0℃下孵育，和/或在能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一种或多种药剂的存在下孵育，在能够通过TCR复合物诱导信号的一种或多种药剂的存在下孵育，和/或在能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的一种或多种药剂的存在下孵育；CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7。
[0582] 7.实施方案4或实施方案6的方法，其中所述一种或多种药剂包含抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。
[0583] 8.一种转导T细胞的方法，所述方法包括孵育包含重组核酸的病毒载体粒子和包含T细胞的输入组合物，所述T细胞已经从受试者的样品获得，其中，在所述孵育之前，不超过5％、10％、20％、30％或40％的所述T细胞是激活细胞，表达选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的表面标记；包含选自IL-2、IFN-γ、TNF-α的细胞因子的细胞内表达，和/或处于细胞周期的G1期或较后期。
[0584] 9.实施方案5或实施方案8的方法，其中在即将进行所述孵育之前，所述输入组合物中不超过10％的T细胞包含选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L和4-1BB的T细胞激活标记。
[0585] 10.实施方案1-9中任一项的方法，其中，在所述孵育之前，大于5％、10％、20％、30％或40％的所述T细胞表达低密度脂质受体(LDL-R)。
[0586] 11.实施方案1-9中任一项的方法，其中所述受试者是人。
[0587] 12.实施方案1-8中任一项的方法，其中在所述孵育之前，所述T细胞未经历和/或未被维持在2℃至8℃的温度下超过48小时。
[0588] 13.实施方案1-12中任一项的方法，其中所述样品是血液样品。
[0589] 14.实施方案1-12中任一项的方法，其中所述样品是白细胞分离术样品。
[0590] 15.实施方案1-14的方法，其中所述T细胞是未分级的T细胞，是富集或分离的CD3+T细胞，是富集或分离的CD4+T细胞或者是富集或分离的CD8+T细胞。
[0591] 16.实施方案1-15中任一项的方法，其中所述T细胞已经从来自所述受试者的所述样品选择或富集。
[0592] 17.实施方案1-16中任一项的方法，其还包括，在所述孵育之前，从所述受试者获得所述样品，并且任选地，从所述样品选择或富集所述T细胞，从而任选地是富集的组合物和/或产生所述输入组合物。
[0593] 18.实施方案1-17中任一项的方法，其中所述输入组合物中T细胞的百分比是大于或大于约75％、80％、85％、90％、95％的T细胞。
[0594] 19.实施方案3-18中任一项的方法，其中所述T细胞包含CD4+或CD8+细胞。
[0595] 20.实施方案3-18中任一项的方法，其中所述T细胞包含CD4+和CD8+细胞。
[0596] 21.实施方案20的方法，其中所述CD4+细胞与所述CD8+细胞的比率为或为约1:1、1:2、2:1、1:3或3:1。
[0597] 22.实施方案1-21中任一项的方法，其中：
[0598] 所述样品包含血清或血浆，所述血清或血浆的浓度为至少或至少约10％(v/v)、至少或至少约15％(v/v)、至少或至少约20％(v/v)、至少或至少约25％(v/v)、至少或至少约30％(v/v)、至少或至少约33％(v/v)、至少或至少约35％(v/v)、或至少或至少约40％(v/v)；和/或
[0599] 在所述孵育之前，所述样品已经与血清或血浆离体接触，所述血清或血浆的浓度为至少或至少约10％(v/v)、至少或至少约15％(v/v)、至少或至少约20％(v/v)、至少或至少约25％(v/v)、至少或至少约30％(v/v)、至少约或至少约33％(v/v)、至少或至少约35％(v/v)、或至少或至少约40％(v/v)。
[0600] 23.实施方案1-22中任一项的方法，其中：
[0601] 所述样品包含血清或血浆，所述血清或血浆的浓度为至少或至少约30％(v/v)；和/或
[0602] 在所述孵育之前，所述样品已经与血清或血浆离体接触，所述血清或血浆的浓度为至少或至少约30％(v/v)。
[0603] 24.实施方案22或实施方案23的方法，其中所述血清或血浆是人血清或血浆。
[0604] 25.实施方案22-24中任一项的方法，其中所述血清或血浆对于所述受试者是自体的。
[0605] 26.实施方案1-22中任一项的方法，其中所述样品包含抗凝血剂。
[0606] 27.实施方案26的方法，其中所述抗凝血剂包含游离柠檬酸根离子。
[0607] 28.实施方案1-27中任一项的方法，其中，在所述孵育之前，所述方法包括在冷冻保护剂的存在下冷冻保存所述T细胞，任选在所述样品或所述富集的组合物中的T细胞，从而产生冷冻保存的组合物。
[0608] 29.实施方案28的方法，其中，在所述孵育之前，在减少或去除所述冷冻保护剂和/或产生所述输入组合物的条件下洗涤所述冷冻保存的组合物。
[0609] 30.实施方案1-29中任一项的方法，其中所述输入组合物包含N-乙酰半胱氨酸(NAC)；血清，任选人血清；重组白细胞介素-2(IL-2)、重组白细胞介素-15(IL-15)和/或重组白细胞介素-7(IL-7)。
[0610] 31.实施方案1-30中任一项的方法，其中：
[0611] 所述输入组合物包含N-乙酰半胱氨酸，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为或为约0.4mg/mL至4mg/mL、0.8mg/mL至3.6mg/mL或1.6mg/mL至2.4mg/mL，每个都包含端值；或者[0612] 所述输入组合物包含N-乙酰半胱氨酸，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为至少或至少约或约0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8g/mL、3.2mg/mL、
3.6mg/mL或4.0mg/mL。
3.6mg/mL或4.0mg/mL。
[0613] 32.实施方案1-31中任一项的方法，其中：
[0614] 所述输入组合物包含血清，任选人血清，所述血清的浓度为或为约0.5％至25％(v/v)、1.0％至10％(v/v)或2.5％至5.0％(v/v)，每个都包含端值；或者
[0615] 所述输入组合物包含血清，任选人血清，所述血清的浓度为至少或至少约或约0.5％、1％、2.5％、5％(v/v)或10％。
[0616] 33.实施方案1-32中任一项的方法，其中：
[0617] 所述输入组合物包含重组IL-2，任选重组人IL-2，所述重组IL-2的浓度为或为约10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL或500IU/mL；
和/或
和/或
[0618] 所述输入组合物包含重组IL-15，任选重组人IL-15，所述重组IL-15的浓度为或为约1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL或5IU/mL至10IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL或50IU/mL；和/或
[0619] 所述输入组合物包含重组IL-7，任选重组人IL-7，所述重组IL-7的浓度为或为约50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL至200IU/mL至600IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL或1000IU/mL。
[0620] 34.实施方案1至33中任一项的方法，其中所述孵育包括将所述病毒载体粒子与所述输入组合物一起旋转接种的步骤。
[0621] 35.实施方案34的方法，其中旋转接种包括在离心室的内腔中旋转所述病毒载体粒子和所述输入组合物，其中所述旋转是在所述空腔的侧壁内表面处按以下相对离心力进行：
[0622] 在或在约500g与2500g之间、500g与2000g之间、500g与1600g之间、500g与1000g之间、600g与1600g之间、600g与1000g之间、1000g与2000g之间或1000g与1600g之间，每个都包含端值；或者
[0623] 至少或至少约600g、800g、1000g、1200g、1600g或2000g。
[0624] 36.实施方案34或实施方案35的方法，其中旋转接种进行以下时间：
[0625] 大于或约5分钟、大于或约10分钟、大于或约15分钟、大于或约20分钟、大于或约30分钟、大于或约45分钟、大于或约60分钟、大于或约90分钟或大于或约120分钟；或者[0626] 在或在约5分钟与60分钟之间、10分钟与60分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值。
[0627] 37.实施方案1-36中任一项的方法，还包括使所述输入组合物和/或所述病毒载体粒子与转导佐剂接触。
[0628] 38.实施方案37的方法，其中所述接触是在将所述病毒载体粒子与所述输入组合物一起旋转接种之前、同时或之后进行。
[0629] 39.实施方案1-38中任一项的方法，其中所述孵育的至少一部分是在或在约37℃±2℃下进行。
[0630] 40.实施方案34-39中任一项的方法，其中所述孵育的至少一部分是在所述旋转接种后进行。
[0631] 41.实施方案39或实施方案40的方法，其中所述孵育的至少一部分进行不超过或不超过约2小时、4小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时或72小时。
[0632] 42.实施方案39-41中任一项的方法，其中所述孵育的至少一部分进行24小时或约24小时。
[0633] 43.实施方案1-42中任一项的方法，其中所述孵育的总持续时间不超过12小时、24小时、36小时、48小时或72小时。
[0634] 44.实施方案1-43中任一项的方法，其中所述病毒载体粒子是慢病毒载体粒子。
[0635] 45.实施方案44的方法，其中所述慢病毒载体粒子源自HIV-1。
[0636] 46.实施方案1-45中任一项的方法，其中将所述病毒载体粒子用病毒包膜糖蛋白假型化。
[0637] 47.实施方案46的方法，其中所述病毒包膜糖蛋白是VSV-G。
[0638] 48.实施方案1-47中任一项的方法，其中所述病毒载体粒子包含展现SAMHD1抑制活性的慢病毒蛋白，所述蛋白质包装在所述病毒粒子中。
[0639] 49.实施方案48的方法，其中所述SAMHD1抑制蛋白是野生型Vpx蛋白、野生型Vpr蛋白或野生型Vpx或Vpr蛋白的展现SAMHD1抑制活性的变体或部分。
[0640] 50.实施方案48或实施方案49的方法，其中所述SAMHD1抑制蛋白对于所述逆转录病毒载体粒子是异源的。
[0641] 51.实施方案48至50中任一项的方法，其中所述SAMHD1抑制蛋白是野生型Vpx蛋白或者是野生型Vpx蛋白的展现SAMHD1抑制活性的变体或部分。
[0642] 52.实施方案1-51中任一项的方法，其中将所述病毒载体粒子在小于或小于约20.0或者小于或小于约10.0的感染复数下孵育。
[0643] 53.实施方案1-52中任一项的方法，其中：
[0644] 将所述病毒载体粒子在为或为约1.0IU/细胞至10IU/细胞或2.0U/细胞至5.0IU/细胞的感染复数下孵育；或者
[0645] 将所述病毒载体粒子在至少或至少约1.6IU/细胞、1.8IU/细胞、2.0IU/细胞、2.4IU/细胞、2.8IU/细胞、3.2IU/细胞或3.6IU/细胞、4.0IU/细胞、5.0IU/细胞、6.0IU/细胞、7.0IU/细胞、8.0IU/细胞、9.0IU/细胞或10.0IU/细胞的感染复数下孵育。
[0646] 54.实施方案1-53中任一项的方法，其中所述输入组合物包含
[0647] 至少为或约至少或约50x106个细胞、100x106个细胞或200x106个细胞。
[0648] 55.实施方案1-54中任一项的方法，其中所述重组核酸编码抗原受体。
[0649] 56.实施方案55的方法，其中所述抗原受体是转基因T细胞受体(TCR)。
[0650] 57.实施方案55或实施方案56的方法，其中所述抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
[0651] 58.实施方案57的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至靶抗原的细胞外抗原识别结构域和包含ITAM的细胞内信号传导结构域。
[0652] 59.实施方案58的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内结构域。
[0653] 60.实施方案58或实施方案59的方法，其还包括连接所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
[0654] 61.实施方案60的方法，其中所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分。
[0655] 62.实施方案58至61中任一项的方法，其中所述细胞内信号传导结构域还包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域。
[0656] 63.实施方案62的方法，其中所述T细胞共刺激分子选自CD28和41BB。
[0657] 64.实施方案55-63中任一项的方法，其中所述抗原受体特异性地结合至与疾病或病症相关的抗原或者特异性地结合至通用标签。
[0658] 65.实施方案64的方法，其中所述疾病或病症是癌症、和自身免疫性疾病或障碍、或感染性疾病。
[0659] 66.实施方案1-65中任一项的方法，其中所述方法产生包含用所述重组核酸转导的T细胞的输出组合物。
[0660] 67.实施方案66的方法，其中所述输出组合物中至少30％、或至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的所述T细胞是用所述重组核酸转导。
[0661] 68.实施方案66或实施方案67的方法，其还包括从所述输出组合物回收或分离通过所述方法产生的转导的T细胞。
[0662] 69.实施方案66或实施方案68的方法，其还包括激活或扩增所述输出组合物的细胞或通过所述方法转导的细胞。
[0663] 70.实施方案69的方法，其中激活和/或扩增是离体进行的。
[0664] 71.实施方案69或实施方案70的方法，其中，在所述孵育之后，将所述输出组合物中的细胞在能够激活T细胞、通过TCR复合物诱导信号和/或诱导T细胞增殖的一种或多种刺激剂的存在下进一步孵育。
[0665] 72.实施方案71的方法，其中所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7。
[0666] 73.实施方案71或实施方案72的方法，其中所述一种或多种刺激剂包含抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。
[0667] 74.实施方案69的方法，其中激活和/或扩增是在体内进行。
[0668] 75.实施方案69或实施方案74的方法，其中激活和/或扩增在由所述抗原受体特异性结合的抗原的存在下进行和/或是转基因特异性的。
[0669] 76.实施方案72或实施方案75的方法，其中，在所述孵育之后，所述输出组合物中的细胞未在一种或多种刺激剂的存在下进一步离体孵育，所述刺激剂任选地由以下组成：CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7，和/或所述输出组合物中的细胞不在高于30℃的温度下进一步孵育超过24小时。
[0670] 77.一种通过实施方案1-76中任一项的方法产生的基因工程化T细胞。
[0671] 78.一种组合物，其包含实施方案77的基因工程化T细胞和药学上可接受的载体。
[0672] 79.一种治疗方法，所述方法包括向患有疾病或病症的受试者给予实施方案78的组合物。
[0673] 80.实施方案79的方法，其中在从所述受试者获得样品后不超过5天，将所述组合物给予至所述受试者。
[0674] 81.实施方案80的方法，其中在从所述受试者获得所述样品后不超过1天、2天、3天或4天，将所述组合物给予至所述受试者。
[0675] 82.一种用于过继细胞疗法的方法，其包括：
[0676] (a)从获自患有疾病或病症的受试者的样品富集或分离T细胞；
[0677] (b)通过实施方案1至71中任一项的方法用病毒载体粒子转导包含所述T细胞的输入组合物，从而产生包含转导的细胞的输出组合物，其中所述病毒载体粒子包含编码特异性地结合至与疾病或障碍相关的抗原的抗原受体的重组核酸；
[0678] (c)将包含所述转导的细胞的所述输出组合物给予至所述受试者以治疗所述疾病或病症，其中在从所述受试者获得所述样品后不超过9天，将所述输出组合物给予至所述受试者。
[0679] 83.一种过继细胞疗法的方法，其包括将包含用重组核酸转导的T细胞的输出组合物给予至受试者以治疗疾病或病症，其中所述输出组合物是通过实施方案1-71中任一项的方法产生的。
[0680] 84.实施方案82或实施方案83的方法，其中在从所述受试者获得所述样品后不超过1天、2天、3天、4天或5天，将所述输出组合物给予至所述受试者。
[0681] 85.实施方案82-84中任一项的方法，其中在给予所述组合物之前，将所述转导的细胞或所述输出组合物的细胞配制于药学上可接受的缓冲液中。
[0682] 86.实施方案82-85中任一项的方法，其中，在所述转导后，在给予包含转导的细胞的所述输出组合物之前，将所述细胞离体培养长达24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或9天，所述培养是在高于30℃的温度下进行。
[0683] 87.实施方案82至86中任一项的方法，其中，在所述转导后，将所述输出组合物或包含所述转导的细胞的细胞在能够激活T细胞、通过TCR复合物诱导信号和/或诱导T细胞增殖的一种或多种刺激剂的存在下培养，从而产生包含所述转导的细胞的组合物。
[0684] 88.实施方案82-85中任一项的方法，其中在给予所述转导的细胞之前，所述输出组合物或包含所述转导的细胞的细胞未在一种或多种刺激剂的存在下进一步离体孵育，和/或未在高于30℃的温度下进一步孵育超过24小时。
[0685] 89.实施方案87或实施方案88的方法，其中所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7，包含由所述抗原受体特异性识别的抗原的疫苗和特异性地结合所述抗原受体的抗独特型抗体。
[0686] 90.实施方案89的方法，其中所述一种或多种刺激剂包含抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。
[0687] 91.实施方案82-90中任一项的方法，其中所述输出组合物的细胞或所述转导的细胞是以次最佳剂量给予。
[0688] 92.实施方案82-91中任一项的方法，其还包括向所述受试者给予用以在体内诱导或增强所述转导的T细胞的刺激和/或扩增的一种或多种药剂。
[0689] 93.实施方案92的方法，其中所述一种或多种药剂是转基因特异性的和/或通过所表达的转基因刺激或激活所述细胞，所述所表达的转基因任选地是或包含抗原受体。
[0690] 94.实施方案92或实施方案93的方法，其中所述一种或多种药剂选自包含由所述抗原受体特异性识别的抗原的疫苗、特异性地结合所述抗原受体的抗独特型抗体或能够化学诱导所述抗原受体的二聚化的药剂。
[0691] 95.实施方案92的方法，其中所述一种或多种药剂是免疫调节剂；免疫检查点抑制剂；细胞外腺苷或腺苷受体、任选A2aR受体的抑制剂；犬尿氨酸途径调节剂，和信号传导途径的调节剂，例如激酶抑制剂。
[0692] 96.一种组合物，其包含原代人T细胞群，所述原代人T细胞群被基因工程化以表达特异性地结合至靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)或转基因TCR，其中：
[0693] 所述群体包含多个静息T细胞；和
[0694] 所述多个静息T细胞占所述组合物中所述基因工程化细胞的至少7.5％。
[0695] 97.实施方案96的组合物，其中所述基因工程化静息T细胞占所述组合物中所述基因工程化细胞的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
[0696] 98.实施方案96或实施方案97的组合物，其中所述静息T细胞针对选自HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L(CD154)和4-1BB(CD137)的T细胞激活标记是表面阴性的；缺乏选自IL-2、IFN-γ和TNF-α的细胞因子的细胞内表达；处于细胞周期的G0或G0G1a期；和/或含有活性SAMHD1。
[0697] 99.实施方案98的组合物，其中所述静息T细胞针对CD25和CD69是表面阴性的- -(CD25/CD69)。
[0698] 100.实施方案96-99中任一项的组合物，其中所述静息T细胞包含CD4+和/或CD8+T细胞。
[0699] 101.实施方案96-100中任一项的组合物，其中所述靶抗原与疾病或障碍相关。
[0700] 102.实施方案100的组合物，其中所述疾病或障碍是感染性疾病或病症、自身免疫性疾病、炎性疾病或癌症。
[0701] 103.实施方案96-102中任一项的组合物，其中所述靶抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、
5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
[0702] 104.实施方案96-103中任一项的组合物，其中所述原代人T细胞被基因工程化以表达CAR，所述CAR包含特异性地结合至靶抗原的细胞外抗原识别结构域和包含ITAM的细胞内信号传导结构域。
[0703] 105.实施方案104的组合物，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内结构域。
[0704] 106.实施方案104或实施方案105的组合物，其中所述CAR还包含连接所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
[0705] 107.实施方案106的组合物，其中所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分。
[0706] 108.实施方案104-107中任一项的组合物，其中所述CAR的细胞内信号传导结构域还包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域。
[0707] 109.实施方案108的组合物，其中所述T细胞共刺激分子选自CD28和41BB。
[0708] 110.实施方案96-108中任一项的组合物，其包含药学上可接受的载体。
[0709] VI.实施例
[0710] 以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
[0711] 实施例1：对在不进行预先细胞激活的情况下对原代人T细胞进行慢病毒转导的评价
[0712] 从人白细胞分离术样品富集的原代CD4+和CD8+T细胞的慢病毒转导是在不首先在转导之前使细胞经历离体T细胞激活步骤的情况下进行的。
[0713] 使用白细胞分离术收集系统从来自受试者的全血样品获得在单核细胞中富集的人白细胞分离术样品。处理血液以产生含有单核细胞、自体血浆和抗凝血剂ACD-A(抗凝血剂柠檬酸盐右旋糖A)的白细胞分离术样品。
[0714] 洗涤白细胞分离术样品的细胞并重悬于缓冲液中，用于基于亲和力的选择，所述缓冲液含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)、EDTA和人血清白蛋白。对于基于免疫亲和力的T细胞选择，将选择缓冲液中的经洗涤细胞与偶联至单克隆抗体的磁珠一起在室温下孵育30分钟以供选择，并经历使用磁分离柱进行的选择。将富集的T细胞重悬于冷冻保存培养基中，并将细胞冷冻保存并储存在液氮中直至进一步使用为止。将冷冻保存的CD4+和CD8+T细胞解冻，洗涤并重悬于转导用培养基中。
[0715] 然后在细胞与T细胞激活剂未一起孵育(例如细胞与抗CD3和抗CD28试剂未一起孵育)的情况下，使T细胞与慢病毒载体粒子接触。对于转导，将T细胞以200μL体积添加至24孔板的单独孔中。将已经与聚阳离子转导佐剂预混合的含有编码转基因(在这种情况下编码示例性嵌合抗原受体(CAR)和通过自切割T2A序列从CAR序列分离的用作转导标记的截短EGFR(EGFRt)序列)的核酸的慢病毒载体粒子以2倍连续稀释添加至孔中。将每孔的最终体积调节至1.1mL。使组合物经历在37℃下离心约1小时，然后在37℃下孵育24小时。
[0716] 作为对照，还如上所述使用从冷冻保存的组合物解冻的CD4+和CD8+T细胞进行转导，但是在转导之前通过与两种不同的激活试剂之一一起在37℃下培养约24小时来激活T细胞，所述激活试剂各自含有涂布有抗CD3和抗CD28抗体片段的磁珠(称为试剂1或试剂2)。
[0717] 在上述每种条件下转导后，将每种组合物的细胞在37℃下在培养基和IL-2的存在下培养48小时。
[0718] 作为转导效率的量度，使用基于流式细胞术的测定来确定对CAR的表面表达呈阳性的细胞的百分比(在这种情况下使用识别替代标记EGFRt的抗EGFR抗体来检测)。如图1A-1B中所示，在这项研究中，不进行激活的转导效率(如通过EGFRt表面表达所反映)与在转导前用抗CD3/抗CD28试剂激活的细胞中的转导效率相当。结果显示，在预先不与药剂一起孵育以对T细胞进行离体激活的情况下，使用慢病毒载体可以实现相当的T细胞转导。
[0719] 实施例2：在不进行预先细胞激活的情况下对原代人T细胞进行慢病毒转导的大规模工艺
[0720] 这个实施例描述了通过大规模工艺对来自健康供体单采术的CD4+和CD8+选择的T细胞的转导，其中获得细胞，对其进行亲和力选择，转导(进行或不进行预先激活)并在各种条件下培养或孵育。洗涤、基于亲和力的选择和转导在基本上竖直的离心处理室中进行，例如，如国际公开号WO 2016/073602中所述。
[0721] 1.样品收集和白细胞分离术
[0722] 使用白细胞分离术收集系统从患者收集自体外周血单核细胞(PBMC)。处理血液以产生含有单核细胞和约1/3体积自体血浆和抗凝血剂ACD-A(抗凝血剂柠檬酸盐右旋糖A)的样品。将白细胞分离术样品密封储存在2-8℃下约24小时。
[0723] 2.白细胞分离术洗涤
[0724] 将白细胞分离术样品无菌转移到转移包中。洗涤白细胞分离术样品的细胞并重悬于选择缓冲液中用于基于亲和力的选择，所述缓冲液含有PBS、EDTA和人血清白蛋白。洗涤是在Biosafe SA销售的用于再生医学的无菌一次性可弃式试剂盒中进行，所述试剂盒包括离心处理室(A-200F)。将含有细胞的转移包和含有缓冲液的袋子无菌连接到试剂盒，将所述试剂盒放置与 2处理单元相连。进行两(2)次洗涤循环，每次在空腔内壁处以约200g的RCF进行180秒，然后将细胞最终重悬于20mL中。在方案结束时将细胞保留在离心室的处理空腔中，以供随后与试剂一起孵育用于基于亲和力的选择。
[0725] 3.基于亲和力的选择
[0726] 使用偶联至单克隆抗体的磁珠，通过基于免疫亲和力的选择富集CD4和CD8T细胞，将其添加至离心室内的经洗涤白细胞分离术中。将珠混合于上述选择缓冲液中，然后将其与设备无菌连接。在 2单元上运行程序，使得将珠混合物和选择缓冲液吸入含有经洗涤细胞的室中，并将所述室的内容物混合30分钟。
[0727] 在程序结束时， 2单元引起细胞沉淀并排出多余的缓冲液/珠，洗涤沉淀的细胞，并重悬于选择缓冲液中。所述程序将经洗涤细胞收集至转移包中。
[0728] 然后使用标准方法在磁场的存在下使细胞从转移包通过封闭的管路管线和分离柱的无菌系统，以分离结合至CD4特异性试剂和/或CD8特异性试剂的细胞。然后将这些磁性标记的细胞收集于转移包中用于进一步处理。
[0729] 4.转导
[0730] 使用慢病毒载体的转导是在与试剂盒一体的离心室中进行，所述试剂盒被放置与处理单元相连。将所选择的细胞转导(在t＝0转导)或使用一种或多种抗CD3/CD28试剂激活(在t＝0激活并在t＝24h转导)。
[0731] 对于首先被激活的细胞，使用 2系统洗涤所选择的细胞并重悬于完全培养基中，然后将其与一种或多种抗CD3/28试剂在所述室的空腔中在室温下组合。在孵育后，将所孵育的材料通过 2单元转移到细胞培养袋中，然后将其在37℃下孵育24小时。
[0732] 为了启动转导，进行以下步骤。
[0733] 制备转导试剂溶液，其含有完全培养基(含有5％(v/v)人血清、1.6mg/mLN-乙酰半胱氨酸(NAC)和100IU/mL IL-2的X-VIVO-15)和聚阳离子(其量对于转导开始期间10μg/mL的最终浓度是足够的)、病毒载体粒子(约3.2IU/细胞)和(适用时)空气。将转导试剂溶液无菌转移到离心袋中。
[0734] 将含有具有约200x106个所选择细胞或200x106个激活细胞的组合物的产物袋无菌连接至一次性可弃式试剂盒，所述试剂盒被放置与 2处理单元相连。在 2上运行自动化循环，便于将含有细胞的组合物吸入所述室的空腔中，在 2上旋转组合物以使细胞沉淀，并去除实现所期望体积所需的适当体积例如10mL的液体。然后将转导试剂溶液的内容物吸入具有细胞的所述室的空腔中。然后将所得200mL体积(含有细胞和病毒)转移到离心袋中。
[0735] 为了启动转导，取出含有病毒和细胞的离心袋并将其无菌连接于试剂盒的输入位置处，并转移到所述室的空腔中。将病毒和细胞在所述室的空腔中在空腔内壁处以1600g的近似RCF旋转。以指定的速度旋转1小时。然后将所转导的材料转移到输出袋中。将完全培养基转移至室中，混合60秒，然后从处理空腔转移至输出袋，在含有所转导材料的输出袋中产生200mL总体积。
[0736] 然后将在不进行预先激活步骤的情况下在选择后转导的细胞(1)立即在补充有FBS、100IU/mL IL-2和10IU/mL IL-15的培养基中用抗CD3/抗CD28试剂激活，并在第9天收获；(2)在37℃，5％CO2下孵育24小时，然后在培养基中用抗CD3/抗CD28激活，并在第9天收获；(3)通过在37℃，5％CO2下培养3天维持不激活；(4)在37℃，5％CO2下孵育24小时，冷冻保存，解冻并在培养基中用抗CD3/抗CD28试剂激活，并在第14天收获。对于在转导之前进行激活然后在24小时后转导的对照细胞，将细胞在培养基的存在下扩增(未激活)并在第9天收获。对于每种条件，在37℃，5％CO2下培养细胞。
[0737] 表1概括了测试组和转导后的孵育条件。
[0738] 表1：转导组
[0739]
[0740] 如实施例1中所述测量在来自白细胞分离术的细胞的选择后不同天数的转导频率。如图2中所示，与在转导前首先激活24h的T细胞相比，在首先转导T细胞，然后立即激活时，观察到相当的转导频率(如通过表面标记表达来测量)(在选择后9天收获的冷冻保存产物中分别为68％和63％)。这种结果表明，在转导前不激活T细胞的情况下可以获得相对高的转导效率。
[0741] 尽管转导(基因整合)不需要预先激活T细胞，但结果表明，在这项研究中，观察到将细胞与激活剂一起孵育对于重组蛋白的持续表面表达是重要的。在未被激活的细胞中，表面EGFRt表达(CAR表达的表面替代标记)是短暂的；所检测的EGFRt的表面表达频率(指示转导)在转导后24小时达到峰值29％，并截至转导后第3天下降至<1％。
[0742] 另外，图2显示，即使将与激活试剂一起孵育延迟24小时(与转导前激活的细胞相比)，也产生43％的显著较高的标记频率(指示转导频率)。与将激活延迟24小时时相比，在转导后立即与激活试剂(具有抗CD3/CD28的磁珠)一起孵育导致较高的展示转导标记表面表达的细胞频率(在选择后9天收获的冷冻保存产物中测量到43％与63％的相应频率)。将转导的细胞冷冻保存(转导后24h)，随后解冻并与激活试剂一起孵育，导致与经转导并与激活试剂一起孵育但不进行冷冻保存的细胞相比，转导标记频率有所降低(在冷冻保存的产物中测量到16％与43％的相应转导频率)。
[0743] 本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。
[0744] 序列
[0745]
[0746]
[0747]
[0748]
[0749]
[0750]
[0751] 本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。
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