本发明涉及一种用于将分子和大分子跨生物膜递送到细胞中、可选地随后发生胞内截留的新型递送系统和方法。

蛋白质病理学是许多医学病症的病因学或发病机制中的共同点，范围从突变蛋白质的功能障碍到功能的病理性获得，其中特定蛋白质获得使其具有毒性的新特性。从概念上讲，通过基因治疗抑制这些蛋白质的合成可能对患有这种蛋白质异常的患者具有希望。
近年来的重要科学进展之一是使用小干扰核糖核酸(siRNA)使RNA(核糖核酸)干扰沉
默特定基因的表达的概念。RNA干扰基于短的(约19-27个碱基对)、双链RNA序列(命名为siRNA)，能够与细胞生物系统协同发挥作用[其中包括Dicer蛋白复合物和RNA诱导的沉默复合物(RISC)，所述Dicer蛋白复合物裂解更长的双链RNA产生siRNA]，以抑制翻译并标记降解特定的mRNA(信使核糖核酸)序列，从而在翻译阶段抑制基因表达。作为与特定信使RNA(mRNA)互补的、未改性或化学改性的DNA分子的短序列(通常为13-25个核苷酸)的反义寡核苷酸(ASO)也已经用于抑制特定的靶蛋白的表达并其生成。然而，尽管这些方法在医疗保健方面具有巨大的潜在益处，但由于寡核苷酸的相对较大且高度带电的结构(例如，siRNA的平均分子量为13kDa并且它携带约40个带负电的磷酸基团)，将这种大分子递送入细胞仍然是实质性挑战。事实上，跨膜传递寡核苷酸需要克服非常大的能量屏障。
膜偶极势是存在于任何磷脂膜内部水/膜界面和膜中心(内部为正)之间的电位。它被认为是由磷脂甘油酯键的高度有序的羰基产生的，其振幅约为220-280mV(毫伏)。由于膜偶极势存在于介电常数为2-4的高度疏水性环境中，因此产生108-109V/m(伏/米)的非常强的电场，称为膜内电场(IMEF)。可以想象，膜偶极势和相关的膜内电场具有重要的生理功能：
它们可能通过确定它们的构象和活性来影响膜蛋白的功能。然而，据我们所知，迄今为止，偶极势尚未用于任何工业、生物或医学应用。
已经开发了各种方法用于跨生物膜递送诸如寡核苷酸或蛋白质的大分子。这些方法包括病毒载体以及非病毒递送系统，如阳离子脂质或脂质体。然而迄今为止，这些方法的使用主要限于离体应用或活体局部施用，例如通过直接注射到眼内或直接施用到肺中。也已经实现了对肝脏的有效的递送。毒性是这些递送方法中的一些主要限制因素，例如与阳离子脂质相关的那些递送方法。在非病毒递送系统中，已知电穿孔是离体递送大分子的有效和广泛使用的方法。根据该方法，将外部电场施加于细胞悬液，导致带电的目标分子与细胞膜碰撞，随后暂时性和局部膜不稳定化，并随后使大分子进入细胞。然而，如上所述，电穿孔主要在离体使用，试图将其用于体内应用的尝试有有限的成功，并且仅对于可以插入外部电极的特定器官(例如，肌肉、肺)是实用的。
总之，通过细胞膜或通过诸如血脑屏障、血眼屏障或血-胎儿屏障等其他生物屏障递送诸如寡核苷酸或蛋白质的大分子仍然存在大量未满足的需求，并且系统性递送治疗性大分子仍然是一个巨大的、未解决的挑战。

本发明集中于最近发现的与膜偶极势有关的膜内电场(IMEF)的新颖和创新的利用，以用于各种领域(例如医学、生物学或农业)中的应用。
在本发明的一个方面，它提出了作为化学基团的IMEF-基质，其潜在地与药物缀合，因此导致药物跨生物磷脂膜递送到细胞中的增强和改善的递送，取决于IMEF/膜偶极势。
因此，本发明的一个方面提供了跨生物膜递送药物的方法，其包括提供与IMEF-基质缀合的药物，并使所述生物膜与缀合至IMEF的药物接触。
在一个实施例中，该方法可以进一步包括将药物缀合至IMEF-基质。
本发明的另一个方面提供了一种将药物跨生物膜递送的方法，该方法包括将一种或多个基团缀合至药物，每个基团具有>1的辛醇/水分配系数；一选自至少一个以下基序的负极：羰基、醚或氟原子；和一包含至少一个二碳长度、直链或支链脂族烃链的正极；并使生物膜与所述缀合药物接触。在一个实施例中，这些基团可以具有如本文所定义的结构E、E'或E”。
本发明的又一方面提供了用于递送药物穿过生物膜的缀合物，其中所述缀合物包含与一个或多个基团缀合的药物，每个基团具有>1的辛醇/水分配系数；一选自至少一个以下基序的负极：羰基、醚或氟原子；和一包含至少一个二碳长度、直链或支链脂族烃链的正极。在一个实施例中，这些基团可以具有如本文所定义的结构E、E'或E”。
根皮素是一种用于降低IMEF的化合物，因此它可以评估特定化合物的运动对膜偶极
势/IMEF的依赖性。因此，就本发明的实际目的而言，IMEF-基质是一种可选地附着于药物的化合物，其在根皮素存在下表现出跨细胞膜递送减少超过50％。
在本发明的一个实施例中，IMEF-基质是新的合理设计的“分子纳米马达(MNM)”，其可以利用IMEF跨生物膜递送药物。为此，MNM可以将IMEF的静电能转化为动能，并利用它来克服通常非常大的能量屏障，该能量屏障存在于跨越包含磷脂膜的生物屏障递送化合物例如大分子药物。
又一方面，本发明基于发明人的发现，可以通过药理学关闭显著抑制或增强(例如，根皮素，100-1,000μM)或开启(例如，通过6-酮胆甾烷醇10-100μM)穿过生物膜摄取包含根据式(I)-(XId)的基团的缀合物。这显示根据式(I)-(XId)的本发明的缀合物的摄取在膜内电场作用下对膜偶极势的直接依赖性，因此将所有这些根据式(I)-(XId)的化合物定义为IMEF-基质。
根据本发明实施例的MNM包含如下式(II)中所示结构的基团E、E'或E”。由MNM递送的药物可以是小分子药物或大分子，例如肽、蛋白质或寡核苷酸(例如天然的或改性的，单链或双链的RNA或DNA)。在本发明的一个实施例中，要递送的大分子包括用于基因沉默的RNA链，即siRNA(小干扰RNA)或设计用作反义寡核苷酸(ASO)的DNA序列。
药物(例如小分子药物或大分子)与根据本发明的实施例的MNM的缀合物可用于基础研究、农业、化学或非临床或临床医学实践。其中，它们可用于治疗异常蛋白质或蛋白质功能障碍起作用的医学疾病，并且编码这些蛋白质的基因表达的沉默可能是有益的。这种医疗应用可以是治疗例如退行性疾病、癌症、毒性或缺血性损伤、感染或免疫介导疾病的工具。
在本发明的一个实施例中，提供了一种用于跨生物膜递送药物的方法，所述方法包括利用具有如式(I)中所述结构的缀合物：
或由式(I)中所示结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂合物和水合物，其中：
D是要跨生物膜递送的药物，其选自小分子药物、肽、蛋白质和天然或改性的单链或双链DNA或RNA、siRNA或ASO；y、z和w每一个是独立地选自0、1、2、3、4、5或6的整数，其中无论何时整数为0，这意味着相应的E基团为空；y、z或w中的至少一个不同于0；
E、E'或E”可以相同或不同，每一个具有如通式(II)所示的结构：
(A)a-B-L1-Q1-L2-Q2-L3
式(II)
其中每个A基团独立地选自式(III)、(IV)、(V)和(VI)所述的结构：
M选自空值、-O-或-CH2-并且g、h和k每一个独立地为选自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15和16组成的组中的整数；*是-H，或与B的连接点，或与另一个A基团的连接点；a是选自1、2、3或4的整数；Q是氧或胺；
其中B选自一个或多个由以下组成的组：
直链、环状或支链的C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14烷基或杂烷基，其中每个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基、胺或硫醇取代；或可选地连接至醚、酯或酰胺基团；
直链、环状或支链的C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14亚烷基或杂亚烷基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇取代；或可选地连接至醚、酯或酰胺基团；
C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14芳基或杂芳基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇取代；或可选地连接至醚、酯或酰胺基团；
一种或多种选自胆固醇、胆汁酸、雌激素、雌二醇、雌三醇、石胆酸或其任何类似物的类固醇基团；其中每个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基、胺或硫醇取代；或者每一个可选地连接至醚、酯、胺或酰胺基团；
及其任何组合；
Q1和Q2每一个是可裂解的基团并独立地选自空值、酯、硫代酯、酰胺[例如-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-]、氨基甲酸酯[例如–(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-O-]、脲[-NH-C(＝O)-NH-]、二硫化物[-(SS)-]-O-]、胺、咪唑、三唑、双内酯；选自BAPTA和EGTA的金属螯合剂，包括其螯合的金属离子；及其任何组合；
L1、L2和L3每一个独立地选自空和由以下组成的组：
直链的、环状或支链的C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14烷基或杂烷基，其中每个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇取代；或与醚基连接；
直链的、环状或支链的C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14亚烷基或杂亚烷基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺、硫醇取代；或与醚基连接；
C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14芳基或杂芳基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺、硫醇取代；或与醚基连接；
-(O-CH2-CH2)u-，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基、胺或硫醇取代；
核苷、核苷酸；咪唑、叠氮化物、乙炔；及其任何组合，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基、胺、硫醇取代；或与醚基连接；并且其中u是为1、2、3、4或5的整数；及其任何组合；
其中Q1、Q2、L1、L2和L3中的至少一个不是空值，并且其中Q1、Q2、L1、L2和L3中的每一个可选地包含T基团；其中T是选自C4、C5、C6-1,2-二硫代环烷基(1,2-二硫代环丁烷；1,2-二硫代环戊烷；1,2-二硫代环己烷；1,2-二硫代环庚烷)的引发剂基团；γ-内酰胺(5个原子酰胺环)，δ-内酰胺(6个原子酰胺环)或ε-内酰胺(7个原子酰胺环)；γ-丁内酯(5个原子酯环)、δ-戊内酯(6个原子酯环)或ε-己内酯(7个原子酯环)；其中每个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基、胺或硫醇取代；
其中B、Q1、Q2、L1、L2和L3中的至少一个与式(I)中定义的药物缀合。
在本发明的一些实施例中，y＝1，z＝0且w＝0；或y＝1，z＝1和w＝0。
根据本发明实施例的缀合物具有通式(I)并且可以跨生物膜递送到细胞中：
包括由式(I)中所示结构表示的化合物的药学上可接受的盐，水合物，溶剂合物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂合物和水合物，其中：
D是一种跨生物膜递送的药物。D可以是小分子药物、肽、蛋白质或天然或改性的单链或双链DNA或RNA，例如反义寡核苷酸(ASO)或siRNA；
y、z和w每一个为独立地选自为0、1、2、3、4、5、6的整数，其中在所述整数为0时，表示相应的E部分为空；y，z或w中的至少一个不同于0。在一个实施例中，y＝1，z＝0且w＝0；在另一个实施例中，y＝1，z＝1和w＝0。
E、E'或E”可以相同或不同，每一个具有如通式(II)所示的结构：
(A)a-B-L1-Q1-L2-Q2-L3
式(II)
其中每个A基团独立地选自式(III)、(IV)、(V)和(VI)中所述的结构：
M选自-O-或-CH2-并且g、h和k每一个独立地为选自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15和16组成的组中的整数；*是-H，或与B的连接点，或与另一个A基团的连接点；a是选自1、2、3或4的整数；Q是氧或胺；
B选自由以下组成的组中的一个或多个：
直链、环状或支链的C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9，C10、C11、C12、C13或C14烷基或杂烷基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基、胺或硫醇取代；或者可选地与醚、酯或酰胺基团连接；
直链、环状或支链的C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14亚烷基或杂亚烷基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基、胺或硫醇取代；或者可选地与醚、酯或酰胺基团连接；
C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14芳基或杂芳基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇取代；或者可选地与醚、酯或酰胺基团连接；
一种或多种类固醇部分(如胆固醇，胆汁酸，雌二醇，雌三醇)，雌激素，核苷，核苷酸；及其任何组合，其中每一个可选地被一个或多个卤素，羟基，甲氧基，碳氟基，胺或硫醇取代；
或者每一个可选地连接至醚，酯，胺或酰胺基团；
或其任何组合；
Q1和Q2每一个独立地选自空值、酯、硫代酯、酰胺[例如-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-]、氨基甲酸酯[例如–(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-O-]、脲[-NH-C(＝O)-NH-]、二硫化物[-(SS)-]-O-]、胺、咪唑、三唑、双内酯、pH敏感基团、氧化还原敏感基团；金属螯合剂，包括其螯合的金属离子；及其任何组合；
L1、L2和L3每一个独立地选自空和由以下组成的组：
直链的、环状或支链的C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14烷基或杂烷基，其中每个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇取代；或与醚基连接；
直链、环状或支链的C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14亚烷基或杂亚烷基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺、硫醇取代；或与醚基连接；
C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14芳基或杂芳基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺、硫醇取代；或与醚基连接；
-(O-CH2-CH2)u-，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基、胺或硫醇取代；
核苷、核苷酸；咪唑、叠氮化物、乙炔；及其任何组合，其中每一个可选地被一个或多个卤素；羟基；甲氧基；碳氟基；胺；硫醇取代；或与醚基连接；并且其中u是为1、2、3、4或5的整数；及其任何组合；
其中Q1、Q2、L1、L2和L3中的至少一个不为零；并且其中Q1、Q2、L1、L2和L3中的每一个可选地被T取代；其中T为选自C5、C6、C7-1,2-二硫代环烷基(1,2-二硫代环戊烷、1,2-二硫代环己烷、1,2-二硫代环庚烷)γ-内酰胺(5个原子酰胺环)，δ-内酰胺(6个原子酰胺环)或ε-内酰胺(7个原子酰胺环)；γ-丁内酯(5个原子酯环)，δ-戊内酯(6个原子酯环)或ε-己内酯(7个原子酯环)的引发剂基团；其中每个引发剂基团可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基、胺或硫醇取代；其中B、Q1、Q2、L1、L2和L3中的至少一个与式(I)中定义的药物缀合。
在本发明的一个实施例中，Q1、Q2、L1、L2和L3中的至少两个不为空值；
在本发明的一个实施例中，Q1、Q2、L1、L2和L3中的至少三个不为空值；
在本发明的一个实施例中，其提供了根据通式(I)的缀合物，其中E、E'或E”中的至少一个具有如式(VIIIg)或式(IXC)的结构：
其中L3和D每一个具有与式(I)中相同的含义；
包括由式(VIIIg)或式(XIc)和式(IXc)所示结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂合物和水合物；其中D是式(I)中定义的药物；且L3选自空值和C1、C2、C3、C4、C5或C6亚烷基。
本发明的一些实施例涉及一种在离体或活体将药物递送穿过生物膜进入细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与在此所述的缀合物接触。
另一个实施例涉及用于治疗有需要的患者的医学病症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的包含如在此所述的缀合物的药物组合物。
本发明的另一个实施例涉及在此所述的缀合物，其用于药物中，例如人类药物或兽医药物中。
本发明的另一个实施例涉及使用MNM和药物在制备在此所述的缀合物的应用，所述MNM例如包含如式(II)所述的基团E、E'或E”的结构，用于治疗有需要的患者的医学病症。本发明的另一个实施例涉及在此所述的缀合物在制备用于治疗有需要的患者的医学病症的药物中的用途。
在本发明的一些实施例中，所述医学病症是癌症。
一种从化合物库中选择IMEF-基质的方法；所述方法包括：
(i)在根皮素(100-1000μM)和/或6-KC(10-100μM)存在下，将细胞或脂质体与候选化合物一起温育，所述候选化合物被疑为是来自化合物库的IMEF-基质；
(ii)在根皮素和/或6-KC存在下，测量所述候选化合物穿过细胞膜或脂质体的摄取水平；
(iii)在没有根皮素和/或6-KC(10-100μM)的情况下，将细胞或脂质体与所述候选化合物一起温育；
(iv)在根皮素和/或6-KC不存在的情况下，测量所述候选化合物穿过细胞或脂质体的膜的摄取水平；和
(v)比较根皮素和/或6-KC的存在和不存在下所述候选化合物的摄取水平；其中在根皮素存在下吸收降低超过50％；或在6-KC存在下摄取超过两倍的增加，表明所述候选化合物是IMEF-基质。
附图说明
专利或申请文件至少包含一张彩图。带彩图的本专利或专利申请出版物的副本将由办公室根据要求提供并支付必要的费用。
现在参考以下说明性附图，以非限制性方式结合某些实施例和实施例来描述本发明，从而可以更全面地理解本发明。附图中：
图1A是根据本发明实施例的化合物的推定作用机制(MOA)的不对称极性原理的示意
图；该分子具有一负极和一正极，所述负极带有一个或多个负电性原子例如氟原子，所述正极包含烃链，所述烃链通过与磷脂分子的相邻链的疏水相互作用进行相互作用。因此，该分子虽然总体疏水且不带电荷，但具有聚焦的离散的部分负电荷，而相反的是，部分正电荷被分散和掩蔽。这导致分子从膜表面移动到膜中心。
图1B示意性地描述了本发明的分子的结构基序，如式(IXb)的化合物所示，其中Q1为-S-S-；Q2为空值；a＝6；b＝8；而所述类固醇基团是石胆酸的残基。
图2示意性说明根据本发明实施例的缀合物的推定的MOA：图2示出了由膜内电场激发的“分子纳米马达(MNM)”，其涉及膜偶极势；图2B示出了由MNM诱导的大分子向膜表面的强制内收，从而扰乱了磷脂水合壳，并且迫使磷脂头基团的横向移动；图2C显示缀合物和内吞作用随着所述缀合物向核内体移动而产生的缀合物诱发和内吞作用；最终存在于内体膜小叶之间缀合物诱发，以产生小叶间浓度平衡；随后，如在此所述，通过浓度梯度和性能增强基团(PEM)，有所述缀合物从内体膜进入细胞质内的运动。
图3示意性示出了利用Dicer酶将siRNA截留在细胞质内以裂解并去除MNM的机制；图3A显示与Dicer蛋白上的两个Apo-Si MNM连接的siRNA的对接；图3B显示了通过酶介导的RNA裂解去除一个运动。随后，Helicase/Agronaute起到分离RNA链的作用，释放指导/有义链以与RNA诱导型沉默复合物(RISC)相互作用，以便实施基因沉默，而第二个MNM仍然附着的过客链注定要退化。
图4显示了本发明的缀合物的如式(I)所述的示例性结构，其包含一的蛋白质(例如但不限于Cas9)和E、E'、E”基团。
图5A-F、6A-C和7-9举例说明根据本发明的实施例的缀合物的离体生物学性能，其包含本发明的MNM，其具有式(VII)或式(VIIa)所述的结构；分别为Apo-Si-11或Apo-Si-C4。
图5A-F：3T3细胞：
图5A示出了跨3T3细胞的生物膜离体递送表达EGFP蛋白(3T3-EGFP细胞)的包含29-mer(单体单元)的单链DNA(ssDNA)的缀合物的荧光显微检测；
图5B示出了通过流式细胞术分析(FACS)在图5A中描述的递送量化，以点图表示；
图5C示出了如图5A所述的递送在温育24小时时使用ELISA读数器定量；
图5D示出了在离体表达EGFP蛋白(3T3-EGFP细胞)的包含跨越3T3细胞的生物膜的58-
mer双链DNA(dsDNA)的缀合物的荧光显微检测；
图5E示出了通过流式细胞术分析(FACS)如图5D中所描述的递送量化：(i).代表事件百分比的点图；(ii).代表剂量反应的直方图；
图5F代表共聚焦显微检测，示出如图5D所述的递送根据根据本发明的作用机制进入内体腔室。
图6A-C：鼠黑素瘤B16细胞：
图6A示出了离体递送本发明缀合物的荧光显微检测，其包含跨B16黑色素瘤细胞的生物膜标记有Cy 3荧光团(红色)的58-mer双链DNA：(I).(II).明亮的领域，划定细胞轮廓；
(III).来自没有MNM的DNA的荧光信号；(IV).来自包含MNM的缀合物的荧光信号；
图6B示出了通过流式细胞分析(剂量-反应)显示如图6A所述的递送的量化；
图6C示出了如图6A所述的通过共聚焦显微镜检测的递送，证明包含58-mer双链DNA的缀合物的递送进入B16细胞的内体室。
图7：鼠科C26结肠癌细胞：
包含58-mer双链DNA的本发明的缀合物在离体递送穿过C26细胞的生物膜的流式细胞
术分析。
图8：海拉(HeLa)细胞：
本发明的缀合物的递送的流式细胞术分析，其包括离体跨海拉细胞的生物膜的58-mer双链DNA；剂量-反应。
图9示出了通过本发明的缀合物离体在人类的HeLa细胞中表达的基因沉默(EGFP基
因)，所述缀合物是专门设计用于沉默EGFP基因的相应的siRNA，其连接至两个MNM，每个MNM具有式(VIIIb)所示的结构；即Apo-Si-W(平均值±SEM(标准偏差)。
图10A-H举例说明根据式(XVI)的化合物的作用机制(MOA)，其中：图10A示出细胞外空间中的完整缀合物；图10B示出还原性细胞质环境中二硫键的裂解；图10C示出在pKa-依赖性过程中硫醇到硫醇盐的去质子化；图10D示出硫醇盐在酰胺基团的羰基部分上的亲核攻击；图10E示出四面体中间体的生成；图10F示出所述缀合物的随后裂解，产生硫酯；图10G示出随后的水解；图10H示出在体内排出期间在细胞外空间的氧化环境中闭环和二硫化物形成。
图11A-H举例说明根据式XVI的化合物的作用机制(MOA)，其中：图11A示出细胞外空间中的完整缀合物；图11B示出还原性细胞质环境中二硫键的裂解；图11C示出在依赖于pka的过程将硫醇去质子化成硫醇盐；图11D示出硫醇盐在酰胺基团的羰基部分上的亲核攻击；图
11E示出四面体中间体的生成；图11F示出所述缀合物的随后裂解，产生硫酯；图11G代表随后的水解；图11H示出在体内排泄期间在细胞外空间的氧化环境中闭环和二硫化物形成。
图12描述了通过本发明的缀合物在表达EGFP基因的转基因小鼠的肝细胞的原代培养
物中施加的基因沉默，所述缀合物是专门设计用于沉默EGFP基因的相应的siRNA，其与两种Apo-Si-C4MNM连接，在组蛋白H2A非共价复合物中(平均值±SEM)。
图13A-H举例说明了式(VII)化合物的作用机制(MOA)，称为Apo-Si-X-1；其中：图13A示出细胞外空间中的完整缀合物；图13B示出还原性细胞质环境中二硫键的裂解；图13C示出在pKa-依赖性过程中将硫醇去质子化成硫醇盐；图13D示出硫醇盐在酰胺基团的羰基部分上的亲核攻击；图13E示出四面体中间体的生成；图13F示出缀合物的随后裂解，产生硫酯；
图13G示出随后的水解，也释放CO2；并且图13H示出在从体内排出MNM期间在细胞外空间的氧化环境中遇到的环闭合，形成二硫化物基团。
图14A-C展示了本发明的E基团与磷脂膜在分子动力学(MD)研究中的相互作用；图14A是称为Apo-Si-X-1的根据式(VII)的化合物；图14B是称为Apo-Si-X-2的根据式(VII)的化合物；并且图14C是称为Apo-Si-S-S的根据式IXb的化合物。
图15通过计算机化的分子模拟研究示出了动态质子化的原理。在MNM的叔胺的质子化状态之前，提供分子的水溶性形式，其中叔氮质子化(带正电荷)，因此能够在血浆或细胞质内移动；和水不溶性形式，其中氮处于不带电荷的状态，因此能够在细胞膜环境内移动。这两种形式在活体的协同分布可能导致所述缀合物在体内的大量分布。图15A示出了从膜中排除的本发明分子的质子化的带正电形式；图15B示出所述分子的疏水未质子化形式，其分隔并移动到磷脂膜的核心中。
图16示出了凝胶电泳，提供了本发明的根据式(VIIIb，Apo-Si-W)的缀合物在离体裂解的证据，其由Dicer酶执行，去除了其中一个MNM。
图17显示了本发明的缀合物在S16细胞中使PMP22基因沉默，所述缀合物包含每一个的siRNA双链体，所述缀合物各链的5’-端与本发明的E，E'或E”缀合，每一个具有如式(IXb)所示的结构，其中a＝3，b＝0，k＝1。该基团被称为Apo-Si-S-S。未处理的细胞和用针对EGFP的siRNA(而不是针对PMP22)处理的细胞用作对照。如图所示，Apo-Si-SS MNM缀合物以剂量依赖性方式有效地敲低(沉默)了PMP22基因的表达水平，与未处理的细胞相比在400nM的剂量下观察到57％的沉默，在600nM剂量中上升到66％。
图18显示根据式(VIIa)(其中a＝2，并且k＝1，称为Apo-Si-C4)的本发明的缀合物的跨膜递送和膜偶极势/膜内电场(IMEF)之间的直接连接；(A).根皮素；流式细胞术分析：细胞与根皮素预温育，降低膜偶极势，导致细胞摄取Apo-Si-C4缀合物显著减少；(B).6-酮胆甾烷醇(6-KC)；荧光显微镜检查：细胞与6-KC预温育，增加膜偶极势，导致细胞对Apo-Si-C4缀合物的摄取显著增加，通过Cy3荧光评估。计算每个场的细胞数量排除了观察到的效应是由于各个细胞数量的差异造成的。

本发明尤其侧重于新近发现的与膜偶极势相关的最近发现的膜内电场(IMEF)的新颖
性和创新性应用，用于各种领域如医学、生物学或农业中的应用。
在一个重要的方面，本发明提出了一种IMEF-基质，它是一种化学基团，当其与药物缀合时，以依赖于IMEF/膜偶极子势的方式增强和改善药物跨生物磷脂膜递送到细胞中。
根皮素是一种用于降低IMEF的化合物，因此它可以评估特定化合物的运动对膜偶极
势/IMEF的依赖性。因此，出于本发明的实际目的，IMEF-基质是一种化合物，其在根皮素存在下在跨细胞膜递送时与没有根皮素的递送相比较表现出超过50％、60％、70％、80％或
90％的递送减少。
在本发明的一个实施例中，IMEF-基质是新颖的、合理设计的“分子纳米马达(MNM)”，其可以利用IMEF跨越生物膜递送药物。为此，MNM可以将IMEF的静电能转换成动能，并利用它克服通常巨大的能量屏障，该能量屏障存在于跨越包含磷脂膜的生物屏障递送化合物诸如大分子药物。
另一方面，本发明基于发明人的发现，通过生物膜摄取包含根据式(I)-(XId)的基团的缀合物可以分别通过药理学关闭显著抑制或增强(例如，根皮素100-1000μM)或开启(例如，通过6-酮胆甾烷醇10-100μM)膜内电场。这显示根据式(I)-(XId)的本发明的缀合物对膜内电场的摄取与膜偶极势有关的直接依赖性，因此将所有这些化合物定义为根据式(I)-(XId)作为IMEF-基质。
由MNM递送的药物可以是小分子药物或大分子，例如肽、蛋白质或寡核苷酸(例如，单链或双链，RNA或DNA)。在本发明的一个实施例中，待递送的大分子包括用于基因沉默的RNA链，即siRNA(小干扰RNA)，或设计用作反义寡核苷酸(ASO)的DNA序列。
本发明的实施例涉及新的缀合物，其包含用于将药物穿过生物膜进入细胞质的递送系统，或者通过生物屏障，例如血脑屏障(BBB)，血眼屏障(BOB)或血-胎儿屏障(胎盘-血屏障)。
根据本发明实施例的化合物包含合理设计以将与膜偶极势相关的静电能转换成动能
的新型“分子纳米马达(MNM)”，并利用它来克服常常巨大的能量障碍，所述能量障碍跨越生物屏障如磷脂膜递送化合物，例如大分子药物。其中，利用由膜偶极势产生的膜内电场(IMEF)，这种利用可能涉及将与货物药物(cargo drug)连接的MNM在磷脂膜内从膜/水界面移动到膜中心。当与药物连接时，所述递送系统将药物移向膜中心，从而有助于其跨膜运动。其中，该递送系统设计用于递送治疗性大分子：蛋白质或寡核苷酸，后者是单链或双链DNA或RNA。其中，所述递送系统设计用于递送反义寡核苷酸(ASO)、siRNA或治疗性蛋白质，例如但不限于Cas9蛋白质或抗体。
以非限制性方式提出，根据本发明实施例的MNM结构的主要原理之一是“不对称极性”的原理。该原理由本发明的发明人开发，作为使磷脂膜核心内的潜在大且带电分子从膜表面到膜中心运动的工具；为了克服相关的能量障碍，运动正是由膜内电场激励。本发明涉及将这种“不对称极性”原理翻译成特定的分子结构。因此，这些分子结构旨在将与膜偶极势有关的静电势能转换成在膜芯内移动的分子的动能。在结构上，这些分子由发明人合理设计为疏水且不带电的，根据它们的logP能够分配到生物膜中[例如但不限于logP值>1(参见图1A)]。然而，“不对称极性”原理的一个重要组成部分是这些分子是极性的，其部分电荷分布不均匀：部分负电荷高度聚焦和局部化，而部分正电荷沿烃链分散在分子内。在与磷脂膜相互作用后，这些部分正电荷也通过伦敦型疏水相互作用而被屏蔽，该相互作用发生在分子的烃链和磷脂环境的相邻烃链之间(伦敦色散力)。“不对称极性”的这些特征表明，分子是疏水的但是极性的，具有聚焦的部分负电荷，而相应的部分正电荷被分散和掩蔽，产生分子在疏水膜环境内的移动，就好像它带有正式的负电荷，如图1A所示。由于膜内电场在膜/水界面处具有负极并且在膜中心处具有正极，因此本发明的分子朝膜中心移动，并且当附着于货物药物(例如药物，诸如siRNA、ASO、治疗性蛋白质、抗体或另一种药物)，货物药物也在这个方向上被拉到膜核心。因此，这种运动可以以几种方式促进货物分子的跨膜运动。其中，它可以强制带电荷的大分子向磷脂基团(PLHG)加合，扰动PLHG周围的水合壳，并因此迫使PLHG的横向运动。这种局部的膜不稳定性可能会引发膜磷脂的内吞和翻转，导致货物药物进入细胞(见图2)。
本发明的缀合物还可以包含性能增强基团(PEM)。这样的基团是化学基团或机制，其可以用来增强药物或其相关活性基团在其细胞内的靶位点的浓度。
一种这样的性能增强方案(PEM)涉及并入本发明的缀合物[式(I)中定义的Q1和Q2基
团]的结构内的可裂解基团。在本发明上下文中，术语“可裂解基团”涉及化学基团，其能够在某些生理条件下经历自发或酶介导的裂解，例如细胞内pH值的变化、红氧状态的变化或其他条件的变化。可裂解基团的实例是二硫化物、双内酯、酯、硫代酯、酰胺、氨基甲酸酯、pH敏感性基团或氧化还原敏感性基团。本发明的缀合物在这些位点的裂解可起到将货物药物(例如高度负电荷的siRNA或ASO或其他药物)捕获在靶细胞的细胞质中的作用。另外，由于其裂解，所述缀合物的连续消耗也可以帮助维持所述缀合物在血浆或跨内体膜的浓度梯度。在本发明范围内的基于可裂解基团的PEM中，非限制性地为二硫化物、氨基甲酸酯和双内酯。
本发明范围内的另一性能增强部分(PEM)涉及施用缀合物，其中D是双链RNA，其是
Dicer酶的基质。此类缀合物通常包含根据遗传密码选择并适用于沉默特定靶基因的23-
30mer dsRNA。Dicer是一种独特的核酸酶，能够在特定位点裂解双链RNA，产生21-23-mer双链RNA片段，随时可与RISC复合物相互作用进行基因沉默。根据该方法，优选地，一个或多个MNM在有义(“信使”)链的3'-端和/或5'-端和/或在反义(“指导”)链的5'端的可以与这种寡核苷酸药物连接。在施用缀合物后，MNM将使得所述大分子药物能够跨膜递送。随后通过细胞质中的Dicer酶裂解dsRNA，然后除去指导链5'端的MNM，从而从递送系统释放siRNA。由于其多种负电荷，siRNA因此最终被截留在细胞质中，在那里它与RISC复合物相互作用，导致靶基因沉默。在图3中示意性地示出了Dicer介导的细胞内俘获机制。
重要的是，本发明还涉及基于“动态质子化”概念的另一种创新性能增强方法。这一概念是基于分子结构中碱性基团(例如胺)的安装，其pKa值在7.0-8.5之间。该方法利用了这样的事实，即对于基本分子，已知界面pH值比本体低约1个pH单位，并且考虑到Henderson-Hasselbalch方程，该特征产生两个分子群：一个是质子化的，并且因此亲水且可溶于水性环境中，例如血浆或细胞质；和疏水未质子化分子的第二分子群，导致分子与细胞和内体膜的相互作用。因此，用于本发明缀合物的动态质子化原理使本发明的缀合物具有“两栖”特征，并且能够通过亲水性和疏水性环境运动，因此最终导致所述缀合物在整个身体的大量分布，通过细胞膜进入细胞质，并从内体区室逸出到细胞质中，这对用于系统性基因递送(实施例17，图15)的有效系统是理想的。分别地，本发明包括E、E'或E”基团，其包含“动态质子化基团”，其包含(i).一位于MNM的负极和正极之间的胺基；和(ii).位于所述胺基团的侧翼的电子吸引基团，起到将其pKa值设定在7.0-8.5pH单位范围的作用。这种侧接吸电子基团的实例是羰基、醚、酯或氟碳基团。
在本发明的上下文中，术语“引发剂基团”涉及化学基团，当其经历自发的或酶介导的化学反应时，它引发相邻化学键的裂解。在本发明的更具体的实施例中，引发剂基团选自C4、C5、C6-1,2-二硫代环烷基(1,2-二硫代环丁烷；1,2-二硫代环戊烷；1,2-二硫代环己烷；
1,2-二硫代环庚烷)；γ-内酰胺(5个原子酰胺环)，δ-内酰胺(6个原子酰胺环)或ε-内酰胺(7个原子酰胺环)；γ-丁内酯(5个原子酯环)，δ-戊内酯(6个原子酯环)或ε-己内酯(7个原子酯环)。
本发明上下文中的术语“活化酯”涉及具有良好离去基团并因此能够与胺相互作用以形成酰胺的羧酸衍生物。这种用于羧酸的活化剂的例子是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
本发明上下文中的术语“金属螯合剂”涉及通过配位捕获金属离子的化学基团，其中配位原子选自氮、硫或氧原子。在一个优选的实施例中，螯合离子是钙(Ca+2)，其与氮和氧原子配位。在另一个优选的实施例中，金属螯合剂是BAPTA[1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,+2 +2
N',N'-四乙酸]、EGTA(乙二醇四乙酸)或其类似物；呈现对Ca 相对其他离子如Mg 的有益的选择性。这种螯合剂可以利用细胞外间隙和胞质溶胶之间的Ca+2的实质浓度梯度，用于MNM与货物药物的潜在脱离，并捕获和积聚目标药物在细胞质内。
本发明上下文中的术语“杂烷基、杂亚烷基或杂芳基”涉及相应的烃结构，其中至少一个原子已被氮、氧或硫原子替代，或其任何组合。
根据本发明的一个实施例，“货物”或“货物药物”是siRNA、ASO、治疗性蛋白质或任何其它药物，其会穿过细胞膜递送并进入细胞。所述细胞可以在活体动物或人类受试者体内的细胞培养物中，其中所述递送可以旨在施加有益的治疗效果。
本发明上下文中的术语“前体”涉及用于合成根据本发明实施例的缀合物的化学基团。
在合成的各个阶段，例如但不限于，在将大分子如寡核苷酸连接到本发明的MNM期间，前体包含在缀合物合成过程中预定除去的化学基团。
细胞内靶蛋白药物(PDIT)领域是一个相当新的领域，其部分来源于人类基因组测序项目的完成，通过给予蛋白质药物、基因沉默、RNA或DNA编辑、或蛋白质替代疗法，其允许识别大量新的细胞内靶以用于潜在的医疗干预。从概念上讲，这种治疗策略对于治疗几乎任何医学疾病都是有用的。特别地，PDIT领域中具有高度吸引人的候选蛋白是CRISPR(成簇规则间隔短螺旋对称重复序列)相关蛋白，特别是Cas9蛋白。实际上，Cas9可以被任何RNA序列加载，这需要特异性地将蛋白质导向基因组内的任何基因座，根据其与突变的缺陷基因的潜在关系进行合理选择。然后Cas9诱导DNA的准确双链裂解。随后可以采用天然存在的DNA修复机制，以修复失效基因内的所述DNA基因座。因此，Cas9和相关蛋白质能够对整个生命树中的物种进行高效的基因编辑(添加、破坏或改变特定基因的序列)和基因调控和修复。通过将Cas9蛋白和适当的引导RNA递送到细胞中，可以在任何希望的位置裂解生物体的基因组，并进行编辑和修复。
如下所示(实施例4)，本发明的一个实施例包括与Cas9蛋白质连接的一个或多个“分子纳米马达(MNM)”，其在DNA或RNA编辑中具有潜在作用。本发明的另一个实施例涉及作为替代疗法施用的治疗性蛋白质。由于其缺陷或突变，这种替代疗法可能需要治疗与生理重要蛋白水平降低有关的疾病。在这种情况下，相应的蛋白质可以作为药物外源性递送。由于蛋白质是带电荷的大分子，很多时候它不能跨膜递送，除非缀合于递送系统，例如本发明的MNM。
根据本发明实施例的MNM通常是疏水的[例如但不限于具有根据极性不对称原理设计
的辛醇与水的分配系数(logP)>1]、偶极的、不带电荷的化学基团(如上所述)。如所讨论的，MNM有独特的一组特征(即疏水的、总体电中性、但是是极性的、具有聚焦的部分负电荷和分散的部分正电荷、当置于膜内电场中时产生独特的矢量系统、导致分子在磷脂环境中从膜/水界面移动到膜中心)。当附着到药物时，该分子分别将药物拉到膜核心。
如图1B示意性示出，根据本发明的实施例的缀合物通常包括如上所述的“分子纳米马达(MNM)”，其为E、E'或E”基团[例如，由根据式(VII-XIa)中的之一的基团]。“分子纳米马达(MNM)”是包含以下结构基序的疏水部分(辛醇/水分配系数>1)：
(i)一负极(E，E'或E”部分的A基团)，其通常包含至少一个选自卤素[例如氟原子]或氧的电负性原子，可以作为聚焦球形(或接近球形)设置在空间中排列。由于这些原子的吸电子性质及其在空间中的结构排列，所述缀合物的负极是富电子的焦点。在一个优选的实施例中，A是九氟叔丁醇的残基。
(ii)一正极(E、E'或E”部分的B基团)，其包含选自碳、硅、硼、磷和硫的相对正电性的原子，其设置成在处于磷脂膜中时与相邻烃链有最大交互，优选通过排列为直链、支链或环状链的脂肪族或芳香族结构或其组合。在本发明的一个实施例中，正极包含直链饱和烃链或类固醇基团，如胆固醇、胆汁酸、雌二醇、雌三醇或其衍生物或组合。可选地，本发明的缀合物可以包含几个负极和/或几个正极结构基元，例如，通过烃链分隔的顺序排列的全氟和氧基序，由任何式(I-XId)例示。
除了“分子纳米马达(MNM)”和药物D之外，根据本发明实施例的缀合物还可以包含一个或多个链接(L)和可裂解基团(Q)，如在本发明的具体式中进一步描述的那样。药物D与分子纳米马达E，E'或E”的直接连接可以或通过L或Q基团连接；所述连接可以通过共价键或非共价键，例如静电键或配位键。
除上述以外，本发明的MNM除了活性药物之外还可以用作药物组合物的一部分。由于MNM提供的膜相互作用的增强，活性药物的性能可以通过纳入MNM而在功效或安全性等方面得到改善。
本发明的实施例还涉及根据本发明的缀合物在治疗有需要的患者中用于治疗医学病
症的用途，所述缀合物包含治疗上有用的药物例如蛋白质或寡核苷酸(例如，siRNA或ASO)。
医学病症可以是(但不限于)退化性疾病、癌症、创伤、毒性或缺血性损伤、感染或免疫介导的病症，其中特定蛋白质在疾病病因学或发病机制中起作用，以及通过siRNA或反义机制调节相应基因的表达或通过治疗性蛋白质或抗体或通过蛋白质替代疗法调节相应蛋白质的活性可在抑制疾病相关的过程或治疗潜在的疾病方面具有有益作用。
例如，根据本发明的实施例的缀合物可以用作反义疗法，其是包括施用单链或双链核酸链(DNA、RNA或化学类似物)的医学治疗形式，其结合编码特定蛋白质的DNA序列，或结合到相应的信使RNA(mRNA)，其中发生翻译成蛋白质。这种处理可以起到抑制相应基因表达的作用，从而阻止相应蛋白质的产生。或者，本发明的缀合物可以包含治疗性蛋白质，例如Cas9蛋白质。
在本发明的上下文中，术语“药物”或“药物”涉及化学物质，其在向患有疾病的患者施用时能够对患者施加有益效果。所述有益效果可以是改善症状，或抵消在疾病过程中起作用的药剂或物质的作用。所述药物可以包含施用以抑制基因表达的小分子或大分子，例如蛋白质，或单链或双链RNA或DNA。其中，药物可以包含siRNA或ASO。在一些实施例中，药物旨在治疗退行性病症、癌症、缺血性、传染性、毒性损伤或免疫介导的病症。
根据本发明的术语“生物膜”是指与生物系统有关的任何磷脂膜。这种磷脂膜的例子是细胞质膜、胞间膜或生物屏障，如血脑屏障(BBB)，血-眼屏障(BOB)或血-胎儿屏障。
本发明的实施例提供了包含根据本发明实施例的MNM和药物的缀合物。本发明的实施例进一步提供了药物组合物，其包含在此所述的缀合物和药学上可接受的载体或盐。
本发明的其它实施例包括本发明的缀合物或包含本发明缀合物的药物组合物，用于治疗有需要的患者的医学病症。本发明进一步的实施例包括使用本发明的缀合物在制备用于治疗有需要的患者的医学病症的药物组合物中的应用。在一些实施例中，所述医学病症是癌症。
根据一些实施例，本发明的缀合物和药物组合物可以用于实现替代性蛋白疗法或基因疗法[例如但不限于siRNA或反义疗法(ASO)]的在活体、在临床上有效递送和有效执行。
根据本发明的实施例的缀合物可以有利于改善siRNA、ASO、治疗性蛋白质或抗体通过细胞膜或通过生物屏障如血脑屏障(BBB)的递送，因此在一个或多个方面例如功效、毒性或药代动力学上改善大分子药物的性能。
在本发明的一个实施方案中，它提供了药物是选自siRNA、ASO和治疗性蛋白质组成的组的大分子。
在本发明的一个实施例中，它提供了本发明的缀合物和药学上可接受的盐或载体。
在本发明的一个实施例中，提供了将药物递送到生物细胞中的方法，其中所述细胞在培养中，或在活的动物或人类受试者中；该方法包括使细胞与本发明的缀合物接触。
在本发明的一个实施例中，提供了一种方法，其中生物膜选自细胞膜和生物屏障，其中所述生物屏障选自血脑屏障、血眼屏障或血-胎儿屏障。
如以上在非限制性潜在作用机制(MOA)中所述，根据本发明的实施例(包含缀合于MNM的药物例如siRNA或治疗性蛋白质)的缀合物在与磷脂膜相互作用时经历跨膜递送。这种作用机制在图2中示意性地总结。由于极性不对称的原理，最初，MNM从膜表面移动到膜芯，由膜内电场激励(见图2A)。作为第二阶段，见图2B，连接到MNM的大分子被迫接近膜表面，从而扰乱货物大分子药物和磷脂头部基团的水合壳。因此，有磷脂头部基团的横向运动和瞬时膜孔的形成，大分子药物通过该孔递送到细胞中。然后随着膜愈合在能量上受到青睐发生瞬时孔的闭合，见图2C。
根据本发明实施例的缀合物具有如通式(I)中所述的结构：
包括由式(I)中所示结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂合物和水合物；其中D是要穿过生物膜递送的药物。D可以是小分子药物、肽、蛋白质或天然或改性的单链或双链DNA或RNA，例如siRNA或ASO；y、z和w每一个为独立地选自为0、1、2、3、4、5、6的整数，其中当整数a为0时，表示相应的E基团为空；y、z或w中的至少一个不同于0。在一个实施例中，y＝1，z＝0且w＝0；在另一个实施例中，y＝1，z＝1且w＝0。
E、E'或E”可以相同或不同，每一个具有如通式(II)所示的结构：
(A)a-B-L1-Q1-L2-Q2-L3
式(II)
其中每个A基团独立地选自式(III)、(IV)、(V)和(VI)中所述的结构：
M选自空值、-O-或-CH2-；并且g、h和k每一个独立地为选自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15和16组成的组中的整数；*是-H，或与B的一个连接点，或与另一个A基团的连接点；a是选自1、2、3或4的整数；Q是氧或胺。
其中B选自一个或多个由以下组成的组：
C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14烷基或杂烷基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇取代；或者可选地与醚，酯或酰胺基团连接；
直链、环状或支链的C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14亚烷基或杂亚烷基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇；或者可选地与醚、酯或酰胺基团连接；
C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14芳基或杂芳基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇取代；或者可选地与醚、酯或酰胺基团连接；
一种或多种类固醇基团(如胆固醇、胆汁酸、雌激素、雌二醇、雌三醇、石胆酸或其任何类似物)；其中每个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基团、胺或硫醇取代；或者每一个可选地连接至醚、酯、胺或酰胺基团；及其任何组合；
Q1和Q2每一个为可裂解的基团，其独立地选自空值、酯、硫代酯、酰胺[例如-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-]、氨基甲酸酯[(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-O-]、脲[-NH-C(＝O)-NH-]、二硫化物[-(SS)-]、酯[-O-]、胺、咪唑、三唑、双内酯、pH敏感基团、氧化还原敏感基团；金属螯合剂，包括其螯合的金属离子；及其任何组合；
L1、L2和L3每一个独立地选自空值和由以下组成的组：
直链的、环状或支链的C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14烷基或杂烷基，其中每个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇取代；或与醚基连接；
直链、环状或支链的C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14亚烷基或杂亚烷基，其中每个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇取代；或与醚基连接；
C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14芳基或杂芳基，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、氟碳基团、胺或硫醇取代；或与醚基连接；
-(O-CH2-CH2)u-，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基团、胺或硫醇取代；
核苷、核苷酸；咪唑、叠氮化物、乙炔；及其任何组合，其中每一个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基团、胺、硫醇取代；或与醚基连接；并且其中u是为1、2、3、4或5的整数；及其任何组合；
其中Q1、Q2、L1、L2和L3中的至少一个不是空值，并且其中Q1、Q2、L1、L2和L3中的每一个可选地包含T基团；其中T是选自C4、C5、C6-1,2-二硫代环烷基(1,2-二硫代环丁烷；1,2-二硫代环戊烷；1,2-二硫代环己烷；1,2-二硫代环庚烷)的引发剂基团；γ-内酰胺(5个原子酰胺环)，δ-内酰胺(6个原子酰胺环)或ε-内酰胺(7个原子酰胺环)；γ-丁内酯(5个原子酯环)，δ-戊内酯(6个原子酯环)或ε-己内酯(7个原子酯环)。其中每个可选地被一个或多个卤素、羟基、甲氧基、碳氟基团、胺或硫醇取代；或与醚基连接；
其中B、Q1、Q2、L1、L2和L3中的至少一个与式(I)中定义的药物(D)缀合。
在本发明的一个实施例中，Q1、Q2、L1、L2和L3中的至少两个不为空值；
在本发明的一个实施例中，Q1、Q2、L1、L2和L3中的至少三个不为空值；
D与分子其他基团的连接可以通过共价键、静电键或配位键。在键是共价键的情况下，连接可以通过Q1或Q2基团，每个基团选自醚、酯、酰胺、硫酯、硫醚和氨基甲酸酯基团。在键是配位键的情况下，其涉及作为金属螯合剂的Q1或Q2基团，并且连接优选涉及钙离子的配位。
静电连接的实例可以是E、E'或E”的基团L1、L2或L3的胺基与D的带负电荷的磷酸酯基团之间的盐桥。在D是寡核苷酸的情况下，连接可以是核碱基到核糖部分(例如，通过核糖的2'、3'或5'位置)或到核苷酸的磷酸基团；连接可以是寡核苷酸链的末端或非末端核苷酸；连接可以通过天然或通过改性的核苷酸。在D是蛋白质的情况下，其与所述分子其他基团的连接可以通过与蛋白质的氨基酸(例如赖氨酸，半胱氨酸，谷氨酸或天冬氨酸)的侧链连接。
在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”可以包括DNA或RNA分子，每个分子是一个或多个核苷酸的单链或双链序列。每个核苷酸包含含氮碱基(核碱基)、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和磷酸基团。所述核碱基选自嘌呤(腺嘌呤，鸟嘌呤)和嘧啶(胸腺嘧啶，胞嘧啶，尿嘧啶)。此外，该术语还可以指核苷酸的改性形式，其中改性可以位于分子的骨架(例如硫代磷酸酯、肽核酸)或核碱基处(例如RNA中核糖基团2'位置的甲基化或该位点处的氟原子的连接)。这些改性可以实现诸如体液中寡核苷酸的改善的稳定性或改善的药代动力学的性质。
因此这种改性的寡核苷酸的使用也在本发明的范围内。
在一个实施例中，公开了可用于离体或活体的基因表达的特定抑制的方法。该方法包括利用本发明的缀合物或包含所述缀合物的药物组合物，其中D是siRNA或ASO，其被设计用于沉默编码致病蛋白的特定基因的表达，所述致病蛋白在疾病的病因或发病中起作用。
因此，根据本发明的实施例的缀合物可以用于治疗医学病症。因此，本发明的实施例公开了一种用于医学治疗的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据本发明实施例的药物组合物。在一个实施例中，所施用的药物组合物可以包含siRNA或反义寡核苷酸，其在抑制编码疾病相关蛋白的特定基因的表达中有活性。
在本发明的一个实施例中，提供了根据通式(I)的缀合物，其中E，E'或E”基团具有如式(VII)中所述的结构和相关结构：
U选自空值、-O-、酯、酰胺和胺(仲胺或叔胺)；L1、L2、L3、Q1、Q2具有与式(I)中所述相同的含义，R和R'每一个独立地选自氢、卤素、羟基、甲氧基和氟碳基团；W和G每一个独立地选自空值、氧、酯、酰胺或胺(仲或叔胺)基团；k和d每一个独立地代表选自空值、为0、1、2、3、4、
5或6的整数；并且E、E'或E”基团与D缀合，其中D是式(I)中定义的药物；包括由式(VII)中所示结构表示的化合物药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物和金属螯合物，或其相关类似物，以及所述盐的溶剂合物和水合物。
在本发明的一个实施例中，R或R'每一个独立地选自氢和氟原子。
在本发明的一个实施例中，所述雌二醇基团被另一类固醇残基取代。所述类固醇残基可以是胆固醇、石胆酸或相关的类似物。
在本发明的一个实施例中，L1、L2和L3每一个独立地选自空链和直链，环状或支链的C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8烃链、醚或胺；L1，L2和L3可以相同或不同。
在本发明的一个实施例中，Q1或Q2是选自酰胺、酯、醚、氨基甲酸酯或二硫化物的基团。
在本发明的另一个实施例中，L1、L2或L3包含T基团，其中T是1,2-二硫代环丁烷，其可选地被卤素、羟基、甲氧基、碳氟基团、胺或硫醇取代。
在更具体的实施例中，本发明提供了根据通式(I)或式(VII)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VIIa)中所示的结构：
其中a和k每一个独立地代表为0、1、2、3、4、5或6的整数；包括式(VIIa)所示结构所代表的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物和金属螯合物，或相关类似物，以及所述盐的溶剂合物和水合物。
在其他实施例中，本发明提供以下缀合物：
A类：根据式(I)、(VII)的缀合物，其中E、E'或E”包含“动态质子化基团”：
本发明提供了包含MNM的根据通式(I)或式(VII)的缀合物，其中E、E'或E”基团可以包含如上所述的“动态质子化基团”，其由(i).位于MNM的负极和正极之间的胺基；和(ii).在胺基侧翼的吸电子基团，将胺的pKa值设定在7.0-8.5pH单位范围内。这种侧翼吸电子基团的例子是羰基、醚、酯或碳氟基团/组。这些E、E'或E”基团中的每一个可以独立地具有如式(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)，(VIIIg)、(IXh)或(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)、(IXh)所示的结构，包括相关的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂合物和水合物；其中D是式(I)中定义的药物；L3具有与式(I)中相同的含义；a、k、d在适用时每一个独立地代表为0、1、2、3、4、5或6的整数；且R”'选自氢、甲基和乙基：
B类：根据式(I)、(VII)的缀合物，其中E、E'或E”包含一可裂解的二硫基团：
本发明还提供了根据通式(I)或式(VII)的缀合物，其中E、E'或E”可以包含一可裂解基团，其为二硫基团。这些E、E'或E”基团每一个可以具有式(IX)中所述的结构，和根据式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(IXd)、式(Xe)、式(IXf)、式(IXg)和式(IXh)的相关结构：
其中U选自空值、-O-、酯、酰胺和胺(仲胺或叔胺)；L1、L2和L3具有与上述相同的含义；R和R'每一个独立地选自氢、卤素、羟基、甲氧基和氟碳基团；W和G每一个独立地选自空值、氧、酯、酰胺或胺(仲或叔胺)基团；a、b、k和d每一个独立地代表选自空值、为0、1、2、3、4、5或
6的整数；并且E、E'或E”基团与D缀合，其中D是式(I)中定义的药物；包括式(IX)所示结构所代表的化合物或者具有式(IXa)、式(IXb)、式(IXb)、(IXc)、式(IXd)、式(Xe)、式(IXf)、式(IXg)和式(IXh)所示结构的相关类似物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂合物和水合物：
C类：根据式(I)、(VII)、(IX)的、包含一可裂解二硫基团和一动态质子化基团的结构：
其中L3具有与上述相同的含义；b、d每一个独立地代表选自空值、为0、1、2、3、4、5或6的整数；R”'选自氢、甲基和乙基；并且E、E'或E”基团与D缀合，其中D是式(I)中定义的药物；
D类：根据式(I)、(VII)、(X)的缀合物，其中E、E'或E”包含一环状二硫基团和一氨基甲酸酯基团：
本发明还提供根据通式(X)的缀合物，其中E、E'或E”可以包含一氨基甲酸酯基团，并且所述可裂解的二硫化物基团在根据式(X)、(Xa)、(Xb)或(Xc)的一环状结构内；和相关结构，其中二硫化物可以是其氧化或还原(开环)形式：

其中a、d、k、d每一个独立地代表选自以下的整数：0、1、2、3、4、5、6；h是为1、2、3或4的整数；Z选自氢、氟、羟基和胺基；R和R'每一个独立地选自氢、卤素、羟基、甲氧基和氟碳基团；
L3具有与式(I)中相同的含义；G选自氢、卤素、羟基、甲氧基和氟碳基团；W选自氧、酰胺、酯和胺(仲或叔胺)；D是式(I)中定义的药物；包括式(X)所示结构表示的化合物或具有式(IXa)、式(IXb)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)所示结构的相关类似物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物和金属螯合物，和所示盐的溶剂合物和水合物。
在本发明的一个实施例中，k＝1，并且h＝1。在本发明的一个实施例中，至少R'上的R是氟原子，另一个是氢原子。
包含环状二硫部分且因此涉及式(X)的本发明的结构是：
包括式(X)中所示结构所代表的化合物或具有式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)所示结构的相关类似物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂合物和水合物。
E类：根据式(I)、(VII)、(XI)的缀合物，其中E、E'或E”包含一可裂解的氨基甲酸酯基团和一动态质子化基团：
其中L3或L2每一个具有根据式(I)的含义，U选自空值、-O-、酯、酰胺和胺(仲胺或叔胺)，b和d每一个代表为0、1、2、3、4、5或6的整数；R'、R”和R”'每一个独立地代表氢、甲基或乙基；D是如式(I)中定义的药物，包括由式(XI)中所示结构表示的化合物或具有如式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)或式(IXd)所述结构的相关类似物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物和金属螯合物或，以及所述盐的溶剂合物和水合物：
其中L3具有根据式(I)的含义，a、b和d每一个代表为0、1、2、3、4、5或6的整数；R”，R”'，IV
R 每一个独立地为氢、甲基或乙基；D是式(I)中定义的药物；
其中L3具有根据式(I)的含义；a、b和d每一个代表为0、1、2、3、4、5或6的整数；R”，R”'，RIV每一个独立地为氢、甲基或乙基；D是式(I)中定义的药物；
其中L3和D每一个具有与式(I)中相同的含义；
其中L3和D每一个具有与式(I)中相同的含义。
在本发明的一个实施例中，它提供了一种缀合物，其中E、E'或E”每一个独立地具有如式(I)、(II)；(VII)、(VIIa)；(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；(IX)、(IXa)(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)、(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)之一的结构；并附在一药物上。
还在本发明的范围内的是称为“前体”的分子。本发明上下文中的“前体”是用于合成根据本发明的实施例缀合物的化学部分。通常，前体包含化学基团，所述化学基团在合成缀合物期间注定要被移除或改性，分阶段如将治疗性蛋白质、寡核苷酸或另一大分子连接至本发明的MNM。这些化学基团的实例是亚磷酰胺、叠氮化物、乙炔或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团。因此，本发明因此也分别公开了这样的前体，其为式(I)、(II)；(VII)、(VIIa)；(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；(IXb)、(IXa)、(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)，(IXf)，(IXg)，(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)中之一所列结构的化合物；包含或连接至一化学基团，预定在合成所述缀合物期间被去除或改性。
在本发明的一个实施例中，其提供了一种前体，其中预定要除去或改性的化学基团选自磷酰胺酯、活化酯、叠氮化物或乙炔组成的组。
在一个实施例中，所述前体具有如式(XII)中所述的结构：
其中W是选自E、E'或E”的基团，所述E、E'或E”如式(I)、式(II)；(VII)、(VIIa)；
(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；(IX)、(IXa)，(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)，(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)之一所述。该前体可用于(但不限于)连接至寡核苷酸的5'-端。
本发明的另一种前体具有根据式(XIII)的结构：
其中G是一选自E、E'或E”的基团，所述E、E'或E”如式(I)、(II)；(VII)、(VIIa)；
(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；(IX)、(IXa)、(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)、(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)之一所述的。其中，该前体可用于连接寡核苷酸的3'-端。DMT是二甲氧基三苯甲基双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基；CPG＝受控有孔玻璃。
又一种前体用于在寡核苷酸序列内的内部位置处连接作为寡核苷酸的D。为此，所述前体具有式(XIV)的结构：

其中W是选自E、E'或E”的基团，所述E、E'或E”如式(I)、(II)；(VII)、(VIIa)；(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；(IX)、(IXa)、(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)、(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)之一所述；并且其中PRG是适于保护羟基的任何保护基团。这些基团的实例是：
二甲氧基三苯甲基双-4-甲氧基苯基)苯基甲基(DMT)；乙酰基；甲氧基甲基醚(MOM)；
Y选自1、2、3、4、5、6、7或8烃连接基，其可选地被氧或氮原子取代并可选地连接到任何天然的或改性的RNA或DNA碱基。在一个优选的实施例中，所述碱是胸腺嘧啶或尿嘧啶。
又一种前体用于将E、E'或E”附着到作为蛋白质药物的D上。所述前体具有选自A和B的结构的以下结构：
所述前体旨在与D的胺基团结合，其中W选自E、E'或E”，所述E、E'或E”如式(I)、(II)；
(VII)、(VIIa)；(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；
(IX)、(IXa)、(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)、(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)之一所述。在本发明的其他实施例中，所述前体具有如式(I)、(II)；(VII)、(VIIa)；(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；(IX)、(IXa)、(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)、(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)之一所述的结构；其中在连接到D的点处存在与选自亚磷酰胺、活化酯、叠氮化物或乙炔的基团的连接。后两个基团可用于通过“点击化学”连接到D，例如但不限于通过叠氮炔烃Huisgen环加成反应。
本发明的实施例可以进一步包括药物组合物，其包含根据式(I)、(II)；(VII)、(VIIa)；
(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；(IX)、(IXa)、(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)、(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)之一的缀合物；和药学上可接受的盐或载体。
本发明还包括在离体或活体特异性抑制基因表达的方法。在一个实施例中，该方法可以包括利用根据式(I)、(II)；(VII)、(VIIa)；(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；(IX)、(IXa)、(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)、(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)中之一的缀合物；或相应的药物组合物，其中D是siRNA或ASO，其被设计成沉默特定基因的表达。在一些实施例中，该基因编码致病性蛋白质，所述致病性蛋白质在疾病的病因学或发病机理中起作用。在一些实施例中，D是治疗性蛋白质。
根据本发明实施例的缀合物可以用于治疗医学病症。本发明的实施例包括用于治疗的方法，其包括向需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含根据式(I)、(II)；(VII)、(VIIa)；(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；(IX)、(IXa)、(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)、(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)之一的缀合物；其中D是可用于治疗各种医学病症的药物。
在一个实施例中，所述方法用于用siRNA或ASO进行基因治疗，所述方法包括向需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的缀合物，即根据式(I)、(II)；(VII)、(VIIa)；(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)、(VIIId)、(VIIIe)、(VIIIf)、(VIIIg)、(VIIIh)；(IX)、(IXa)、(IXb)、(IXc)、(IXd)、(IXe)、(IXf)、(IXg)、(IXh)；(X)、(Xa)、(Xb)、(Xc)；(XI)、(XIa)、(XIb)、(XIc)、(XId)之一；其中D是siRNA、ASO或治疗性蛋白质，可用于抑制在特定患者的疾病中起作用的基因的表达。
在本发明的另一实施例中，本发明包括通过治疗蛋白质对疾病进行医学治疗的方法，其中D是跨生物磷脂膜或通过生物屏障递送到细胞中的蛋白质，所述生物屏障例如是血液-脑障碍。所述细胞或者在离体细胞培养中，或者在活体动物或者人类患者体内。在一些实施例中，所述细胞是赘生性细胞。在一些实施例中，所述赘生性细胞是肿瘤细胞。在一些实施例中，所述赘生性细胞是转移瘤内的细胞。所述细胞可以是真核细胞、由致癌剂转染的真核细胞、人类细胞、为癌前期细胞的细胞或其任何组合。所述细胞可以是细胞培养物内的细胞，或活动物或人体内的细胞。
在本发明的又一实施例中，D是作为替代疗法施用的蛋白质，例如用于置换突变的、功能失常的蛋白质，由此解决生理需要。在另一实施例中，D是在基因调控中起作用的蛋白质，其中包括在DNA或RNA编辑(添加、破坏或改变特定基因的序列)中起作用的蛋白质等等。在一个实施例中，所述蛋白质可以是CRISPR(成簇的规则间隔短螺旋对称的重复序列)相关蛋白的成员。具体而言，所述蛋白质可以是或可以包含Cas9蛋白(CRISPR相关蛋白9)、RNA引导的DNA核酸酶或其类似物。
在本发明的一个实施例中，描述了用于基因治疗医学病症的方法，所述方法包括向需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含根据式(I)的缀合物，其中D是与合适的引导寡核苷酸一起施用的CRISPR蛋白质，例如Cas9，从而实现将装载有相应引导寡核苷酸的蛋白质递送到细胞中，其中所述CRISPR蛋白质可以发挥其基因组编辑活性。
本文中的引导寡核苷酸是将Cas9蛋白质引导至DNA上的特定基因座(位置)的RNA或DNA序列，以便在该位点诱导双链DNA裂解，从而能够修复局部的遗传物质的缺陷。在Cas9的情形，所述引导寡核苷酸是RNA的短片段，其序列与靶DNA基因座的序列互补。
因此，根据本发明的实施例的缀合物以及相应的药物组合物和方法尤其可以有益于治疗从癌症、毒性损伤、缺血性疾病、感染性疾病、蛋白质储存疾病、外伤、免疫介导的疾病或退行性疾病等中选择的医学病症。
根据一些实施例，所述医学病症是癌症。如本文所用，术语“癌症”是指存在具有典型的致癌细胞特征的细胞，例如不受控制的增殖、专门功能的丧失、不朽、显著的转移潜能、抗凋亡活性的显著增加、快速的生长和增殖速率或某些特征性形态和细胞标记。典型地，癌细胞呈肿瘤形式，局部存在于动物体内，或作为独立细胞在血流中循环，例如白血病细胞。
在神经疾病领域中，根据本发明实施例的缀合物尤其可用于治疗神经退变性疾病，例如阿尔茨海默氏病、运动神经元疾病、帕金森氏病、亨廷顿病、多发性硬化症和克雅氏病(Creutzfeldt-Jacob disease)。
在其它实施例中，本发明涉及利用本发明化合物来增强化学化合物跨磷脂膜递送到细胞中。取决于所附的化合物和期望的指示，这种递送可以具有各种有用的用途。例如，在植物中，这种递送可以帮助改善作物质量和数量；其中通过改善植物遗传学，或根除各种昆虫、细菌或真菌。
在又一个实施例中，本发明涉及用于从化合物库中选择IMEF-基质的方法A方法；所述方法包括：
(i)在根皮素(100-1000μM)和/或6-KC(10-100μM)存在下，将细胞或脂质体与来自化合物库的疑似为IMEF-基质的候选化合物一起温育；
(ii)在根皮素和/或6-KC存在下，测量所述候选化合物穿过细胞膜或脂质体的摄取水平；
(iii)在根皮素(100-1000μM)和/或6-KC(10-100μM)不存在的情况下，用候选化合物温育细胞或脂质体；
(iv)在根皮素和/或6-KC不存在的情况下，测量候选化合物穿过细胞或脂质体的膜的摄取水平；和
(v)比较根皮素和/或6-KC的存在和不存在下候选化合物的摄取水平；其中在根皮素存在下吸收降低超过50％；或在6-KC存在下摄取超过2倍的增加，表明所述候选化合物是IMEF-基质。
实例
现在将描述一些实例，以便进一步说明本发明，并且为了阐释如何在实践中执行本发明的实施例。
在以下实例中，描述了包含本发明的MNM的缀合物，其连接至单链或双链寡核苷酸。对于本发明的各种缀合物，这些实例阐释了本发明的整个范围，即本发明的MNM是：(i).成功合成；(ii).成功地与大分子药物(例如，单链或双链DNA或RNA)缀合；(iii).能够高效递送带有大量电荷的大分子(跨疏水性磷脂膜进入细胞)；(iv).使这些大分子一旦进入细胞内，就能够到达其作用位点并发挥有用的生物活性(例如，基因沉默，发生在细胞质中)。
实例1：用于合成根据本发明的实施例的缀合物的一般方法，包括寡核苷酸：
最初，基于其在疾病病因学或发病机制中的作用来选择要沉默的基因。然后，基于本领域已知的生物信息学方法，确定核苷酸序列(对于RISC基质通常为19-21个碱基对的双链RNA，或者对于Dicer基质来说通常为25-29个碱基对的双链RNA)。
合成在3'至5'方向进行。使用亚磷酰胺结构单元应用固相合成，所述亚磷酰胺结构单元衍生自受保护的2'-脱氧核苷(dA、dC、dG和T)、核糖核苷(A、C、G和U)或化学改性的核苷，所述化学改性的核苷例如是LNA(锁核酸)或BNA(桥连核酸)。按照由所需siRNA的序列确定的顺序将构件依次缀合至生长中的寡核苷酸链。
在构建寡核苷酸之后，添加本发明的E基团作为寡核苷酸的结构单元之一。如上所述，E基团以其前体形式加入。为了将化合物连接至寡核苷酸的5'-端，使用了包含亚磷酰胺基团的根据式(XII)的前体。为了连接寡核苷酸3'-端的化合物，使用式(XIII)的前体。为了沿着寡核苷酸一内部位置连接化合物，使用根据式(XIV)的前体。其中，该前体可以包含乙炔或叠氮化物基团以介导E基团与寡核苷酸链的连接。该过程是完全自动化的。完成链组装后，将产品从固体支持物释放到溶液中，解除保护并收集。然后通过高效液相色谱(HPLC)分离所需的缀合物，以获得高纯度的所需缀合寡核苷酸。在siRNA的情形，分别合成互补的RNA链中的每一条，然后在本领域已知的标准条件下进行两条链的退火，以产生期望的双链siRNA。
实例2：本发明E基团的化学合成(E、E'或E”)。
起始材料全氟叔丁醇是可商购的。在该实例中，E基团被设计为与寡核苷酸的5'-端连接，因此，在合成的最后一步添加亚磷酰胺基团以与寡核苷酸链缀合。
实例2a：用于合成根据式(VII)的E基团的方法：
示例性的是根据式(VIIa)合成本发明E部分的前体的方法，称为Apo-Si-C4。该前体被设计用于连接到寡核苷酸的5'-端，并具有以下结构：
合成从雌二醇开始。
方案1
根据方案1进行合成。例如，雌二醇被苄基保护以提供化合物11。在优化的反应条件下(烯丙基溴，NaH，催化剂四正丁基溴化铵(TBAI)，四氢呋喃(THF)，回流16小时)，醇11(25.6g)烯丙基化得到白色固体状的烯丙基醚24(21.85g，77％)(通过在庚烷和甲醇中连续研磨纯化)。在标准氧化处理(NaOH/H2O2)下，用9-硼杂双环[3.3.1]壬烷(9-BBN)对末端烯烃
24(21.8g)进行区部选择性硼氢化反应，得到醇22。在优化的反应条件下[偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD)，PPh3(三苯基磷)，4A分子筛(MS)，THF，RT(室温)，16h(小时)]醇22(13.6g)与过量的全氟叔丁醇的Mitsunobu反应反应得到所需的醚21。使化合物21经催化氢化(10％钯/碳，室温)，使用THF和2,2,2-三氟乙醇的混合物(1：1)作为溶剂(5巴，Parr反应器)，得到(在约18小时后)灰白色固体的酚26。然后进行去苄基化，然后使用四氢巴马汀(THP)保护的溴丁醇进行烷基化。然后除去保护基团，接着作为最后步骤将亚磷酰胺基团连接到所需化合物上。然后通过亚磷酰胺基团将该产物与寡核苷酸链缀合，作为寡核苷酸链在5'-端合成的最终构建单元。
实例2b：用于合成根据式(VII)的E基团的方法：
示例性的是根据式(VII)合成本发明E基团的前体的方法，其中雌激素骨架已被交换成石胆酸的残基；R和R'每一个为氢原子；L1、L2、Q1、Q2全部为空，并且L3为14碳烃连接体；该化合物被称为Apo-Si-11，下面示为前体，连接至亚磷酰胺基团，由此设计用于连接至寡核苷酸的5'-端：
合成开始于石胆酸，一种市售的胆汁酸。合成遵循合成方案2：
方案2
例如，将25g材料1以定量收率转化为相应的甲基酯。将25g材料2与29g(87％，NMR)的叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBDMSCl)反应。得到纯化合物3。用NaBH4的THF/MeOH(四氢呋喃/甲醇)溶液将化合物3(29g)还原至4，在处理和纯化后，根据NMR得到化合物4(85％)，仍有痕量的化合物3。材料4与全氟叔丁醇的Mitsunobu反应在后处理柱层析并从MeOH中研制后，得到
33.5g(92％)化合物5，化合物5随后被去保护的，得到类固醇6。然后将类固醇6(2.5g)缀合到THP保护的溴十四烷醇上。缀合需要3天，并且需要4当量的THP保护的溴代十四烷醇才能完成转化。产物通过柱色谱纯化。用MeOH/1,4-二恶烷(HCl，4N)/THF除去保护基团(THP)后，通过柱色谱法纯化产物7以除去杂质。获得产物7(1.5g，约48％)，为白色固体。然后通过连接亚磷酰胺基团将产物7转化为所需的化合物8。然后将该产物在寡核苷酸链上作为寡核苷酸链合成的最终构建单元在5'-端附接至寡核苷酸链。
实例2c：用于合成根据式(Xc)的E基团的方法：
示例性的是合成根据式(Xc)的本发明E基团的前体的方法，其具有以下结构。该前体被设计用于连接到寡核苷酸的5'-端，并具有以下结构：
中间体4根据以下方案3合成。
方案3
二硫醇-丁胺(0.5g)与碘在碱性条件下反应，得到1,2-二噻烷10(3.13g，90％)，为结晶的白色固体。对应于中间体11的醇是可商购的，并且用二甲氧基三苯甲基(DMT)保护。在NaBH(OAc)3存在下用胺10(258mg)进行还原性胺化，得到作为主要产物的仲胺4(330mg，
91％)。如本领域已知的，根据实例2a的中间体26随后通过氨甲酰化连接至中间体4。然后除去DMT，并连接亚磷酰胺基团，得到前体化合物。然后将该前体在链的5'-端与寡核苷酸链缀合，作为其最终构建单元。连接通过氧原子进行。所述缀合产生了包含根据式(Xc)的E基团的所需缀合物。
实例2d：用于合成本发明化合物的关键构建单元的方法
(类固醇1)：
类固醇1是本发明许多结构的主要构建单元。合成类固醇1的原料是雌二醇。为本发明化合物开发的化学反应包括在保护芳族羟基之后利用Mitsunobu反应连接全氟叔丁醇。根据以下合成方案进行合成，其中Bn是指苄基保护基；BnBr＝苄基溴；TBAI＝四丁基碘化铵；
THF＝四氢呋喃；9-BBN＝9-硼杂双环[3.3.1]壬烷；DIAD＝偶氮二羧酸二异丙酯
实例2e：用于合成根据式(IXb)的E基团的方法
该实例描述了根据式(IXb)的E基团的前体的合成，其中a＝3；b＝0，k＝1，并具有以下结构。该化合物被称为Apo-Si-S-S的前体：
如实例2d中所述，根据以下方案从关键中间体1开始进行合成：
将化合物1(5g)烷基化至53，得到4.95g分离的物质。使用LiAlH4将其还原，然后用甲磺酰氯(MsCl)(4.56克甲磺酸酯)保护。利用硫代乙酸钾(KSAc)向乙酸酯32转化是成功的，纯化后分离出4.35g的32。使用吡咯烷去保护以提供化合物33，随后转化为35，得到9.88g粗物质，随后进行纯化。主要含有过量亚氨酸酯试剂的APO-Si-SS粗品用戊烷和MeOH纯化，以提供两相体系。然后倾析出上清液，并将白油从其溶剂中除去以提供用于APO-Si-SS(1.33克)的纯前体。
实例2h：用于合成根据式(VIIIb)的E基团的方法：
根据式(VIIIb)的E基团具有以下结构，并被命名为Apo-Si-W。该实例描述了在其5'-端包含用于连接寡核苷酸药物的亚磷酰胺基团的前体的合成：
根据以下方案进行合成，从雌二醇开始：
其中Bn＝苄基
W-2的所有材料都是烯丙基化的。经过大量处理后，分离出高纯度的化合物W-3(66.4克)。平行地，根据以下合成方案合成化合物W-6:
其中Alloc＝烯丙氧基羰基；用于固相合成的试剂；Mitsunobu反应将醇转化成各种官能团。
然后进行还原胺化以提供W-7。然后对W-7进行以下反应，得到具有亚磷酰胺基团的所需化合物，其是到D的一个连接点：
实例2i：合成根据式(VIIIh)的E基团的方法：
该实例描述了具有以下结构的根据式(VIIIh)的E基团的前体的合成：
根据以下流程进行合成。首先，合成以下流程中描述的B3-1。容易获得的起始原料的烷基化提供了高纯度和量的B3-2。然后进行Mitsunobu反应，得到8.5克分离的B3-3。
然后根据以下方案从雌酮进行合成，以提供期望的化合物
其中Bz-Cl＝苄基氯；BN＝苄基；TsOH＝甲苯磺酸；TBS＝叔丁基二甲基甲硅烷基醚；
TBAF＝氟化四正丁基铵
实例2j：根据合成式(IXh)的E基团的方法：
该实例描述了根据式(IXh)的具有以下结构的E基团的前体的合成：
如下所示，从羟基脯氨酸衍生的构建单元开始合成。
用NaBH4还原脯氨酸甲酯([CAS#(化学文摘号)40216-83-9])得到相应的二醇，随后用三氟乙酸乙酯处理，得到乙酰胺3。伯醇与甲磺酰氯的选择性反应，得到化合物4。随后与硫代乙酸酯反应得到化合物5，然后除去乙酸酯基团。下面描述合成的以下步骤，以提供根据式(IXh)的化合物的目标前体分子。
实例3：MNM与寡核苷酸链缀合的实例：
当与寡核苷酸链缀合时，前体和各个化合物的结构的实例。
a.寡核苷酸5'-端的连接：
前体：
附着于寡核苷酸：
b.寡核苷酸3'-端的连接：
前体：
其中DMT＝二甲氧基三苯甲基；和CPG＝受控有孔玻璃作为合成寡核苷酸的固体支持
物；
附着于寡核苷酸：
c.在寡核苷酸链上的内部位点处的连接：
在这种情形，核苷酸(例如胸腺嘧啶)与E连接，起到将其锚定到寡核苷酸链的作用。这种改性可以用于在寡核苷酸链内而不是在末端位置处连接E基团。现在用具有式(VIIa)的结构的E来举例说明：
前体：
附在寡核苷酸上：
实例4：本发明缀合物的示例性结构，其包含与本发明的E基团缀合的蛋白质(例如但不限于Cas9)：
如以下示意性说明的，根据本发明实施例的MNM E、E'或E'通过连接基团与蛋白质连接。通过氨基甲酸酯或酰胺键连接到蛋白质表面上的赖氨酸侧链。为了附着，使用活性酯。
为此，将醇基团转化为活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺，NHS)。这种基团优先通过氧(水)与蛋白质赖氨酸侧链的氮反应。反应根据以下流程进行：
可能的衍生剂是：
a)光气：连接通过氯甲酸酯进行。
b)二琥珀酰亚胺基碳酸酯(X＝N-羟基琥珀酰亚胺)：连接通过琥珀酰亚胺基碳酸酯进行。
c)羰基二咪唑(CDI，X＝咪唑)：连接通过咪唑基氨基甲酸酯进行。
用任何这些组进行的蛋白质标记在不含胺的微碱性缓冲液(pH＝8-9)中进行。连接点是疏水的，因此需要共溶剂[通常为DMF(二甲基甲酰胺)或二甲基亚砜(DMSO)]与蛋白质发生反应。在以上三种选择中，羰基二咪唑是优选的，这是由于其对氮的选择性最高，并且由于相应的合成简单性。每个蛋白质分子的E、E'或E”基团的数量通过预先设定所需的摩尔比来校准和确定。
实例5：缀合于本发明的一个或两个分子纳米马达的缀合物(包含DNA寡核苷酸)的细胞摄取：
图5-9举例说明了根据本发明实施例的包含本发明的MNM的缀合物离体递送到各种细
胞类型的生物学性能。所述缀合物包含根据式(VIIa)的MNM，其中a＝2且k＝1(称为Apo-Si-C4)；或Apo-Si-11，如以上实例2b中所述。将这些MNM连接到Cy3标记(红色荧光标记)的单链
29聚体DNA序列(携带29个负电荷)或连接到双链58聚体DNA序列(携带58个负电荷)，其中每个序列由红色荧光团Cy3标记。DNA寡核苷酸的序列为5'-MNM-TT-iCy3-CGGTGGTGCA 
GATGAACTTCAGGGTCA(序列识别编号1)；和5'-MNM-TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACC GAA。iCy3(序列识别编2)；意指在序列的内部位置处的荧光团Cy3。这些序列(例如但不限于由美国的爱荷华州的IDT公司合成的)是随机选择的，旨在用作跨膜递送到细胞中的实例。掺入荧光团用作检测被检查的缀合物的定位的工具。为了证明Apo-Si MNM跨膜递送大分子是普遍的，并且它不限于特定的细胞类型，提供了在各种细胞系中的性能。同样值得注意的是，通常，所有以下本发明的缀合物：Apo-Si-C4、Apo-Si-11、Apo-Si-S-S、Apo-Si-G和Apo-Si-W表现出类似的性能曲线。
实例5a：3T3细胞：
为了评估本发明的MNM将29-mer单链DNA(ssDNA)寡核苷酸递送到细胞中的能力，进行离体测定。在实验前一天，将在指数生长期用EGFP蛋白稳定转染的NIH-3T3细胞(3T3-EGFP细胞)铺在24孔板中，密度为4.5×104个细胞/孔，在DMEM(培养基)+补充生长中培养基(500μl(微升)/孔)，不含抗生素。最初，测试了Cy3标记的29聚体ssDNA寡核苷酸，其序列为5'-Apo-si-11-TT-iCy3-CGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCA(序列号编码3)。将该缀合物在细胞内的摄取与对照化合物摄取相比较，所述对照化合物由与带Cy3的DNA链组成，但没有Apo-Si-
11MNM。将每种缀合物以100μl/孔的Opti-Mem(美国生命技术生产，编号31985062)稀释，在室温下温育10分钟，并以100nM的最终浓度加入到细胞中。当用韩氏缓冲盐溶液(HBSS缓冲液；以色列生物工业公司)洗涤细胞并进行分析，评估温育8小时后细胞对比对照对缀合物的摄取。利用来自汞灯的UV(紫外线)照射(x20量级)使用Olympus荧光显微镜(BX51TF；英国的Olympus Optical出品))使细胞可视化。Cy3-荧光团用470-495nm(纳米)的激发波长和
590nm的发射显现，而EGFP荧光团用530-550nm的激发波长和510-550nm的发射显现。如图5A中的荧光显微镜所示，包含连接到29-mer DNA链的Apo-si-11的Apo-Si-11表现出跨细胞膜有效递送到3T3-EGFP细胞中，而不具有MNM的对照寡核苷酸中没有观察到显著的摄取。
Apo-Si MNM将29-mer ssDNA寡核苷酸递送至3T3-EGFP细胞的能力也使用ELISA阅读器定量(图5C)。为此，处于指数生长期的细胞在实验前一天在24孔板中以4.5x104个细胞/孔的密度培养在DMEM，加上不含抗生素的补充生长培养基(500μl/孔)。每个Cy3标记的寡核苷酸在100μl/孔的Opti-Mem中稀释)，并添加到细胞中，最终浓度为40nM至100nM。在温育24小时时评估Apo-Si MNM-缀合物在细胞内相对于没有MNM的对照化合物的积累。为此目的，细胞用HBSS缓冲液洗涤并进行分析。使用Tecan Infinite PRO多模读取器(激发波长
548±4.5nm和发射580±10nm)进行Cy3阳性群体的检测和定量。将Apo-Si MNM缀合物的摄取与相同浓度下对照DNA寡核苷酸的摄取进行比较，结果以与对照相比的百分比表示。如图
5C所示，与对照相比，观察到所述缀合物显著摄入细胞中。
还通过流式细胞术分析(FACS)评估与29-mer DNA寡核苷酸连接的Apo-Si MNM的细胞
摄取。如上所述，在实验前一天，将处于指数生长期的3T3-EGFP细胞以1.5×105个细胞/孔的密度培养在6孔板中，使用不含抗生素的DMEM完全培养基。将每种Cy3标记的寡核苷酸以
500μl/孔的Opti-Mem稀释，并以最终浓度从1nM至40nM变化的方式加入到细胞中。在转染后
24-72小时评估缀合物的递送。在温育期后，将细胞胰蛋白酶消化，补充有韩氏缓冲盐溶液(HBSS缓冲液；以色列生物工业公司)并以1100rpm(转每分钟)离心5分钟。然后用韩氏缓冲盐溶液重悬细胞，并使用Cell Diva软件使用FACSAria III细胞分选仪(美国加州圣何塞的BD Biosciences公司生产)进行分析。对于每个样本，共收集了104个事件。Cy3阳性细胞群的检测和定量通过使用相对于用对照寡核苷酸温育的细胞的Apo-Si-11缀合物培养的细胞中的荧光强度的测量来进行，所述对照寡核苷酸具有相同的序列但缺乏的MNM。
FACS分析证实Apo-Si MNM能够将29-单链ssDNA寡核苷酸有效递送到3T3-EGFP细胞中。
图5B提供点图分析，显示在与Apo-Si-11缀合物一起温育的细胞群中，与不发生摄取的对照相比，实际上所有细胞都表现出对缀合物的摄取。
然后评估Apo-Si-11跨细胞膜递送双链寡核苷酸(dsDNA)的能力。为此目的，连接两个Apo-Si-11MNM，一个位于29碱基对双链DNA寡核苷酸的每个5'-端，由cy3荧光团标记，并退火以产生双链寡核苷酸。
dsDNA的序列如上所述：
5'-Apo-si-11-TT-iCy3-CGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCA(序列识别编码3)；和5'-Apo-si-11-TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGAA(序列识别编码4)。
如以上实例3中所举例说明，将MNM附接至寡核苷酸。将3T3-EGFP细胞与40nM缀合物一起温育，通过荧光显微镜在温育24小时时评估细胞摄取，并与用相同序列但缺乏MNM的对照寡核苷酸温育的细胞摄取进行比较。如图5D中所述，两个Apo-Si-11MNM能够有效地将58-mer双链dsDNA寡核苷酸递送到3T3-EGFP细胞中。
FACS进一步证明了这种递送。为此目的，将3T3-EGFP细胞铺在6孔板中，并如图5C所述进行处理。将每一Cy3标记的寡核苷酸(含有或不含有MNM)以500μl/孔的Opti-Mem稀释，以
40nM、10nM和1nM的最终浓度添加到细胞中。在24h温育期后，通过FACS-Aria III Cell Sorter(美国圣何塞BD Biosciences公司生产)评估寡核苷酸的递送并通过Cell Diva软件分析。每个样本共收集104个事件。Cy3阳性群体的检测和定量通过使用Apo-Si-11MNMs缀合物温育的细胞中的荧光强度的测量来进行，所述测量相对于缺少MNM的暴露于对照寡核苷酸的细胞的荧光强度。如图5E和图5F所示，FACS分析证实两个Apo-Si MNM能够有效地将58-mer双链DNA寡核苷酸递送到3T3-EGFP细胞中：图5E(左和右)显示点图分析，示出只有与Apo-Si-11缀合物一起温育的细胞表现出DNA摄取进入细胞，实际上所有细胞中有缀合物积累；图5F。与用没有Apo-Si-11的对照寡核苷酸处理的细胞中的低背景水平相反，直方图几何分析显示Apo-Si MNM-缀合物处理的细胞中有显著的信号。在所检测的浓度(40nM，10nM和1nM)中观察到明显的剂量响应。
使用共聚焦显微镜术，以进一步确认附着于两个Apo-Si-11MNM的缀合物的摄取。如上所述准备细胞。还使用Hoechst 33258染料(美国Sigma Aldrich生产，1；1000，在HBSS中1小时)进行核染色。如图5G所示，Apo-Si缀合物表现出通过细胞膜的有效摄取和细胞内的积聚。
实例5b：鼠B16黑素瘤细胞：
该组实验的目的是确定包含两个Apo-Si-11MNM(每个连接在链的5'-端)的缀合物在培养的B16鼠皮肤黑素瘤细胞中的摄取的能力。为此目的，B16细胞如实例5A所述生长并维持。
简言之，细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)、2mM L-谷氨酰胺和1％Pen-Strep(青霉素-链霉素)的DMEM(美国Sigma Aldrich公司生产)中于37℃在含有5％CO2的潮湿培养箱中生长。转染前一天，将2×104个B16细胞铺在标准的24孔板室中。在完全生长培养基存在下，与40nM两个Apo-si-11MNM缀合的、Cy3标记的58-mer双链DNA与细胞温育24小时。使用没有Apo-Si MNM的相同的Cy-3标记的寡核苷酸作为对照，并与细胞一起温育相同的时间段。在定量荧光分析之前，每个孔用HBSS洗涤两次。如上所述，用奥林巴斯BX51显微镜拍摄显微镜图。
B16细胞也进行FACS分析。为此目的，在转染前一天，将16×104个B16细胞种在标准6孔板中。将与两个Apo-si-11MNM缀合的10nM和40nM的Cy3标记的58-mer dsDNA与完全生长培养基温育24小时。使用没有MNM的Cy3标记的58-mer DNA作为对照。细胞用HBSS洗涤，并如上所述用BD公司的FACSAriaTM III分析荧光强度。
此外，使用共聚焦显微镜术，以进一步确认包含两个MNM的Apo-Si MNM缀合物的摄取和细胞内定位。如上所述制备细胞。还使用Hoechst 33258染料(美国Sigma Aldrich公司生产，1：1000在HBSS中约1小时)进行核染色。
在用包含58-mer双链DNA的Apo-Si-11缀合物处理的细胞中检测到标记摄取，但在暴露于相同的Cy3标记的寡核苷酸但没有MNM的细胞中没有检测到标记摄取。这在荧光显微镜(图6A)以及FACS分析(图6B)中是明显的。在40nM时，Apo-Si MNM缀合物表现出被98％的细胞摄取。比较40nM与10nM时的信号强度，观察到明显的剂量响应。共聚焦显微镜(图6C)进一步显示通过细胞膜有效摄取Apo-Si缀合物进入细胞。
因此，Apo-Si MNM能够以剂量依赖性方式实现58-mer ds-DNA寡核苷酸向B16黑素瘤细胞的有效递送。
实例5c：C26鼠结肠腺癌细胞。
为了证明Apo-Si MNM能够将强电荷的58-mer dsDNA递送到C26结肠腺癌细胞中，如上所述培养和维持细胞。简言之，将细胞在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1％Pen-Strep的DMEM中于37℃在含有5％CO2的湿润培养箱中生长。
细胞进行FACS分析。出于这个目的，转染前一天，将16×104个C26细胞种在标准6孔板中。将缀合至两个Apo-Si-11MNM(其每一个在寡核苷酸的5'-端)并与Cy3荧光团连接的40nM的58-mer双链DNA在完全生长的情况下温育24小时中。没有Apo-Si MNM的相同构建体用作对照。细胞用HBSS洗涤，并如上所述用BD公司的FACSAriaTM III分析荧光强度。
如图7所示，在用Apo-Si-11缀合物处理的细胞的98％中检测到明显的Cy3荧光。在暴露于对照寡核苷酸的细胞中没有检测到这种摄取。因此，Apo-Si-11MNM能够有效地跨膜递送寡核苷酸。
实例5d：人类的HeLa细胞系
目的是证明Apo-Si-11MNM能够将重荷电的58-mer双链DNA输送到HeLa人宫颈上皮癌细胞系中。为此目的，细胞如上所述生长和维持。简言之，将细胞在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1％Pen-Strep的DMEM中在含有5％CO2的37℃潮湿培养箱中生长。
为了FACS分析，转染前一天，将16×104HeLa细胞种在标准6孔板中。与完全生长培养基一起温育24小时，将缀合两个Apo-Si-11MNM的40nM Cy3标记的58-聚体双链DNA温育24小时。使用Cy3标记的58-mer DNA作为对照。如上所述，用HBSS洗涤细胞，并通过BD公司的FACSAriaTM III系统分析荧光强度。用58-mer双链DNA处理的细胞与两个Apo-Si MNM结合，显示出在培养物中几乎所有细胞的显著摄取(图8)。相反，在对照寡核苷酸处理的细胞中没有观察到这种摄取。因此，总之，携带58个负电荷且缀合于两个Apo-Si-11MNM的Cy3标记的
58-mer双链DNA表现出在离体有效递送到人类的HeLa细胞系中。
综上所述，实例5中提供的这些结果来自四种不同的细胞类型：3T3鼠成纤维细胞，鼠黑素瘤B16细胞，鼠C26结肠癌细胞和人类的HeLa子宫颈癌细胞，证明了与一个或两个Apo-Si-
11MNM连接时有效的跨膜递送和高电荷大分子的摄取。在没有MNM的对照寡核苷酸中没有观察到这种摄取。这些数据支持本发明的MNM在实现寡核苷酸的跨膜递送方面的表现是普遍的并且不限于特定细胞类型的观点。
实例6：演示包含Dicer基质的性能增强部分(PEM)
在本发明的一个实例中，其公开了一种基于酶Dicer(一种能够加工双链RNA的核酸内切酶)的活性用于去除MNM以进行有效基因沉默的方法，其通过裂解大小为19-21碱基对，适合与RISC(RNA诱导沉默复合物)进行基因沉默相互作用。所述方法包括：(i).施用本发明的缀合物，其中所述寡核苷酸是Dicer基质，由长度为25-30个核苷酸的双链RNA组成，其中所述序列根据用于沉默的期望的靶基因进行选择；并与本发明的1-2个MNM缀合，其连接在有义(信使)链的3'-端或5'-端和/或反义(引导)链的5'-端；(ii).由MNM实现的跨膜递送siRNA；(iii).通过Dicer酶裂解dsRNA，从而从复式(Duplex)中除去一个MNM；(iv).为了沉默特定的靶基因(图3)，生理学随后分离双螺旋(例如通过Argonaute/解旋酶)，导致完整的反义链释放，以与RISC相互作用。
为了在离体证明这种机制，将25-27个核苷酸的siRNA双链体(100pmol(皮摩尔))与每个链在5'-端缀合至根据式(VIIIb)的一个Apo-Si-W MNM；作为对照的相同的dsRNA(缺少MNM)在20ml 20mM pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷、200mM NaCl、2.5mM MgCl2中，与1单位重组人类切丁酶(Stratagene)一起温育24小时。然后在15％非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离每个反应(15pmol RNA)的3-ml等分试样，用GelStar(Ambrex公司生产)染色并使用UV激发显现。如图16所示，包含两个MNM的缀合物被Dicer有效裂解，产生较短的ds-RNA片段，去除了一个MNM。重要的是，与没有Apo-Si-W改性的25-27dsRNA的裂解相比较，附着的MNM不会对Dicer介导的裂解的功效产生任何显著的干扰。在图16中：条#1：21个核苷酸的dsRNA适合RISC；条#2：缀合物的裂解，由DICER携带Apo-Si-W MNM，除去了一个MNM。第二个MNM仍然附着，因此凝胶中的缀合物运动稍微减慢；条#3：25-27dsiRNA，在一些核苷酸上甲基化，是DICER酶的基质；条#4：含有两个Apo-Si-W MNM的dsiRNA缀合物，携带两个Apo-Si-W MNM。泳道#5：25-27dsiRNA，不含DICER。
在隔离的酶体系中的这些研究进一步得到了观察到的EFGP基因的有效沉默的支持，所述基因沉默在离体(实例7a、7b)由包含Apo-Si-W的siRNA的缀合物在活细胞系统中施加。
实例7a：在体外HeLa细胞中通过Apo-Si-W缀合物沉默EGFP基因
用于这种证明的生物系统是人类的HeLa细胞，其稳定地表达增强型绿色荧光蛋白
(EGFP)基因(NIH-HeLa EGFP细胞)。施用的本发明缀合物包含siRNA，其设计用于沉默EGFP基因的表达。通常，除非使用转染试剂，否则这种RNA构建体不能穿过细胞膜进入细胞质，在细胞质中它可以发挥其基因沉默活性。由于该siRNA与本发明的MNM缀合[例如但不限于具有式(VIIIb)所示结构E基团(其中a＝2，且L3为空值，称为为Apo-Si-W)]，观察到基因沉默活性，而不需要转染试剂。
为此目的，将细胞与包含设计为用于沉默EGFP蛋白质(美国爱荷华州IDT公司生产)的siRNA的本发明缀合物一起温育，所述缀合物与根据式(VIIIb)的两个MNM连接。双链RNA的序列为：正义序列5'-端至3'-端：ACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCG(序列识别编号5)；反义序列
5'-端至3'-端：CGGUGGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCA(序列识别编号6)。与MNM基团连接的相应的双链DNA序列用作对照，因为这样的DNA构建体不能发挥基因沉默活性。具体而言，在实验前一天，将处于指数生长期的NIH-HeLa EGFP细胞以4.5×104个细胞/孔的密度铺在24孔板中，用DMEM和补充生长培养基(500μl/孔)且无抗生素。将siRNA-Apo-Si-MNM缀合物以100μl/孔的Opti-Mem(生命技术公司生产)稀释，并以40nM的最终浓度加入到细胞中。
温育72小时后评估基因沉默。在该时间点，用韩氏缓冲盐溶液(HBSS缓冲液；以色列生物工业公司生产)洗涤细胞并进行分析。使用Tecan 200PRO多模读取器(激发波长
488±4.5nm和发射535±10nm)通过ELISA读取器进行EGFP相关荧光信号的检测和定量。如图9A所示，使用与Apo-Si-W MNM连接的siRNA的缀合物观察到有效且显著的基因沉默。基因沉默以剂量依赖性方式发生，缀合物在40nM处平均沉默22％，在缀合物浓度分别为300nM和
600nM时分别上升至51％和68％(p<0.001)。
实例7b：在体外3T3-EGFP细胞中通过Apo-Si-W沉默EGFP基因
方法：为了评估Apo-Si-W有效递送和沉默EGFP基因表达的能力，将两个Apo-Si-W MNM缀合至相应的siRNA(在每条链的5'-端)并将缀合物与3T3-EGFP细胞温育。将细胞种在24孔板(25,000个细胞/孔)中，不含抗生素的完全培养基中。在这些条件下将细胞与Apo-Si-W-dsi-RNA温育72小时，仅仅在第一个24小时使用无血清培养基。转染72小时后，吸出培养基，并将细胞在裂解缓冲液[50mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)(pH值8)、0.75％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、150mM NaCl、1mM MgCl2，10％甘油和完全蛋白酶抑制剂(Roche公司生产)])中裂解。然后用无限M200Pro多模读取器(Tecan公司生产)定量EGFP荧光强度；激发波长为488nm，发射波长为535nm。暴露于相同siRNA序列但未与Apo-Si-W MNM缀合的细胞用作对照。
结果：如图9B所示，Apo-Si-W-siRNA缀合物在缀合物的600nM处观察到65％的抑制作用(p<0.001)，在基因表达中发挥显著的剂量依赖性降低。
结论：Apo-Si-W缀合物有效介导EGFP-siRNA向细胞质递送并对在离体EGFP-3T3细胞中的相应基因有效地沉默。
实例7c：在离体通过包含Apo-Si-S-S MNM(式IXb)的缀合物在HeLa细胞中对EGFP基因进行基因沉默
所述缀合物包含两个根据式(IXb)的Apo-Si-S-S MNM，其中
因此缀合物具有以下结构：
方法：为了评估本发明缀合物沉默EGFP基因的能力，将HeLa-GFP细胞种到设计用于基于荧光分析(40,000个细胞/孔)的24孔板中，并与包含用以沉默EGFP基因的siRNA缀合物温育，其序列为：
反义序列：
5’-Apo-Si-S-S-CGGUGGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCA-3’(序列编码号7)；
意义序列：5’-Apo-Si-S-S-ACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCG-3’(SEQ ID.No.8).
第二天，用韩氏平衡盐溶液(HBSS)洗涤细胞，并将培养基换成无血清Opti-MEM(Thermo Fosher科技公司生产)24小时，接着在完全培养基中温育48小时。转染72小时后，吸出培养基，并用HBSS洗涤细胞。用无限M200 Pro多模读取器(Tecan公司生产)定量EGFP荧光强度，激发波长488nm，发射波长535nm。
结果：图9c中显示了Apo-Si-S-MNM缀合物对EGFP基因的沉默。如所示，观察到EGFP基因的有效的剂量依赖性沉默。与对照未处理的细胞相比，用10nM的包含两个Apo-S-S MNM的siRNA缀合物平均观察到62％的基因沉默。将缀合物浓度增加至40nM p<0.001时，沉默增加至80％(图9C)
结论：与两个Apo-Si-S-MNM连接的包含siRNA的缀合物在HeLa细胞中表现出报道基因EGFP的强烈沉默。
实例7d：通过本发明的根据式(IXb)；Apo-Si-S-S的缀合物在离体3T3细胞中表达EGFP基因的基因沉默；
方法：如上述实例7c中所述进行实验，并进行以下修改：表达EGFP蛋白质的NIH-3T3小鼠成纤维细胞系生长并保持在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1％Pen-Strep于37℃，加湿培养箱中，含5％CO2。然后将细胞与上述缀合物以40nM、150nM和300nM的浓度温育72小时。随后，利用ELISA阅读器定量EGFP蛋白荧光的强度。平行地，作为对照，服务的细胞未暴露于任何处理(未处理)。
结果：在由Apo-Si-S-S缀合物处理的细胞中观察到基因表达的巨幅沉默。在用40nM、
150nM和300nM缀合物处理的细胞中观察到的EGFP基因沉默的程度分别为90.0％、91.5％和
92.0％(±0.1％)。
结论：因此该实例证明“分子纳米马达(MNM)”能够：(i).跨膜递送其他情形膜不可渗透的siRNA。(ii).将E-RNA-E'缀合物导入细胞质中，(iii).发挥包含本发明缀合物的基因沉默蛋白复合物的期望性能。值得注意的是，该缀合物包含与可裂解基团(二硫键基团)连接的MNM，因此表明掺入本发明缀合物内的可裂解基团的性能。
实例7e：包含Apo-Si-G MNM的缀合物在离体沉默EGFP报道基因
方法：为了评估Apo-Si-G MNM缀合物沉默3T3-GFP细胞中的EGFP基因的能力，将细胞种到设计用于基于荧光的测定(40,000个细胞/孔)的24孔板中，并与包含Apo-Si-S-S的缀合物温育。第二天，用韩氏平衡盐溶液(HBSS)洗涤细胞，并将培养基换成无血清Opti-MEM(Thermo Fisher科技公司生产)24小时，然后在完全培养基中温育48小时。转染72小时后，吸出培养基，并用HBSS洗涤细胞。用无限M200Pro多模读取器(Tecan公司生产)定量EGFP荧光强度；激发波长488nm；发射波长535nm。
结果：Apo-Si-G MNM缀合物的EGFP基因沉默显示在图9d中。如所示，包含Apo-Si-G的缀合物表现出平均66％的沉默，缀合物浓度为10nM，在40nM处增加至84％沉默(p<0.001)。
结论：与两个Apo-Si-G MNM连接的包含siRNA的缀合物在HeLa细胞中表现出有效沉默报告基因EGFP。用3T3-EGFP和293T-EGFP细胞系也获得了类似的结果。
综上所述，实例7呈现了本发明的几种独特的缀合物，其具有不同的结构，但都共享根据式(I)和式(VII)的核心结构基序，并且所有都表现出siRNA非常有效地递送到细胞中和相应的基因沉默。
实例8：本发明的缀合物跨细胞膜的递送，其中E具有根据式(VIIa)的结构：
图(VIIa)：其中在a＝2且k＝1的情况下，被称为Apo-Si-C4
如以上实例5所述生长和制备3T3细胞和C26细胞。将细胞与包含与Cy3荧光团连接的、并与两个Apo-Si-C4基团连接的58-mer双链(ds)DNA的缀合物一起温育1、2和24小时。测试两种浓度的缀合物：40nM和100nM。如上文实例5中所述，分析包括荧光显微镜检查和通过ELISA阅读器的信号定量。未连接E基团的同样的58-mer dsDNA用作对照。
1小时后可能已经可以进行细胞内缀合物的荧光检测。理想的是，在细胞质中获得信号。2小时后信号强度显著增加，并且通过温育24小时进一步增强。通过ELISA读数器非常清楚地测量摄取：对于C26细胞，缀合物对相应没有MNM的对照dsDNA的信号强度比率：80和72倍；而对于3T3，对于40nM和100nM的浓度，比率分别为104倍和101倍。因此，对于两种细胞类型，与缺少MNM基团的对照相比，本发明的缀合物能够高效递送高电荷的58-merds-DNA。
实例9a：本发明的缀合物的氧化还原敏感的裂解机制，其中E，E'或E”包含环状二硫基团和酰胺基团：
该机制以非限制性方式阐释。所述缀合物具有一在六元环内的二硫键部分。由于细胞外空间中占主导地位的氧化条件，该环在血浆和细胞外空间中表现出稳定性。相反，在细胞内，所述缀合物受到由细胞质中高谷胱甘肽水平提供的还原性环境。相应地，二硫键发生裂解，产生游离硫醇基团。基于类似于其他环状二硫键分子，游离硫醇基团的pKa值约为8和9。
考虑到生理细胞内pH值约为7，裂解二硫键时产生的绝大多数硫醇基团在任何时候是游离巯基(-SH)，而不是被认为是更亲核的相应硫醇盐(-S-)。在策略上，酰胺羰基位于离硫醇基团五个和六个原子处。与其在半胱氨酸蛋白酶中的蛋白水解催化作用中的作用相似，发生对酰胺基团的羰基碳原子的亲核攻击，导致雌二醇基团的裂解。因此，该作用选择性释放货物药物(D)在细胞质中。在D是例如siRNA的情况下，这导致高度带负电荷的寡核苷酸被截留在细胞质中，准备与RNA诱导型沉默复合物(RISC)原位相互作用，以便发挥其基因沉默活性。
图10描述了该机制，其中A示出在细胞外间隙中完整的缀合物；B示出还原性细胞质环境中二硫键的裂解；C示出在依赖于pka的过程中硫醇的去质子化以提供硫醇盐；D示出硫醇盐对酰胺基团的羰基部分的亲核攻击；E示出四面体中间体的生成；F示出缀合物的随后裂解，并产生硫酯；G示出随后的水解；H示出在体内MNM排出期间在细胞外空间的氧化环境中形成二硫化物基团的环闭合。
实例9b：其中E具有根据式(Xc)的结构的本发明缀合物的氧化还原敏感裂解机制及其用于将货物药物(D)靶向细胞质的用途：
上述用于裂解包括酰胺键的、式(IX)化合物的相同机制，也适用于裂解包含氨基甲酸酯基团的式(Xc)化合物。如图11所示：A示出在细胞外空间中完整的缀合物；B示出还原性细胞质环境中二硫键的裂解；C示出依赖于pka的过程中硫醇去质子化变成硫醇盐；D示出硫醇盐对酰胺基团的羰基部分的亲核攻击；E示出四面体中间体的生成；F示出缀合物的随后裂解，产生硫酯；G.示出随后的水解，也释放CO2；H示出在体内MNM排出期间在细胞外空间的氧化环境中形成二硫化物基团的环闭合。