一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体
阅读：195发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，包含RNAi转基因载体，在RNAi转基因载体上连接前胰岛素原启动子，在前胰岛素原启动子下游插入miR接入位点，在miR接入位点连接针对下调ndrg2基因的miRNA序列。本发明所构建的RNAi转基因载体采用RNA聚合酶II依赖的前胰岛素原启动子，由前胰岛素原启动子特异性的在胰岛β细胞启动下游的miRNA序列，特异性的在胰岛β细胞启动针对ndrg2基因的RNA干涉，下调其表达；用于动物模型的构建及胰岛β细胞ndrg2基因功能的研究。，下面是一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体专利的具体信息内容。
1. 一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，包含RNAi转基因载体， 其特征在于，在RNAi转基因载体上连接前胰岛素原启动子，在前胰岛素原 启动子下游插入miR接入位点，在miR接入位点连接针对下调ndrg2基因的 miRNA序列。
2. 如权利要求1所述的细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，其特征 在于，所述的前胰岛素原启动子是前胰岛素原II启动子，其序列如 SEQ.ID.NO. 1所示。
3. 如权利要求l所述的细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，其特征 在于，所述的miRNA序列包括转录后形成茎环结构的正意序列和反意序列。
4、 如权利要求l所述的细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，其特征 在于，所述的miRNA序列其核苷酸序列为SEQ.ID.N0.2所示的序列。
5. 如权利要求l所述的细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，其特征 在于，前胰岛素原启动子和miR接入位点之间还连接有标记基因或筛选基 因。
6. 如权利要求1所述的细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，其特征 在于，连接前胰岛素原启动子的RNAi转基因载体是 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-miR，利用前胰岛素原II启动子置换 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体中的CMV启动子。
一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体
技术领域
本发明属于II型糖尿病相关基因功能技术领域，涉及II型糖尿病相关基因ndrg2的基因功能研究，特别涉及一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体。
背景技术
ndrg2及其在组织细胞特异性的表达人的ndrg2基因（N-Myc Downsteam-Regulated Gene)是邓燕春等发现并克隆到的一个在肿瘤细胞中低表达的新基因（邓燕春，药立波，刘新平等. 一种含有ACP样结构域新基因的发现生物化学与生物物理进展.2001, 28(1):72-76)，由于该基因在结构上与己经发现的N-myc下游调节基因 ndrgl(N-myc down-stream regulated gene l)具有较高的同源性，故将其命名为 ndrg2。该基因cDNA全长2024bp，编码357个氨基酸，染色体定位于14ql2.1， 具有16个外显子15个内含子，其GenBank登录号为AF159092。
刘新平等用免疫组化的方法对小鼠胚胎组织和成体组织以及人体的某些组织进行了系统性的研究，以明确ndrg2基因的表达谱（Hn XL, Liu XP, Deng YCh，et al. Expression analysis of NDRG2 gene in mouse embryonic and adult tissues. Cell Tissue Res. 2006， 325(l):67-76)，发现ndrg2是小鼠胚胎组织分化相关基因，随着胚胎发育ndrg2的表达水平逐渐增高，特别表现在骨骼肌、 心肌、脑、肾和胰腺组织，在成体动物中ndrg2的表达仍然表现出这些组织的特异性。特别引人注意的是：ndrg2表达在胰腺的胰岛p细胞，而胰岛的ot 细胞和PP细胞不表达。这种在胰岛(3细胞的特异性表达提示ndrg2与胰岛p 细胞中的特殊功能有关。
ndrg2可能是胰岛素受体介导的信号转导通路中的新分子胰岛p细胞功能障碍和外周组织胰岛素抵抗是n型糖尿病发病的重要特征，经典理论认为在n型糖尿病中胰岛素作用障碍主要是由于骨骼肌、脂肪、 肝脏等组织的胰岛素依赖性葡萄糖摄取及利用障碍，即所谓的胰岛素外周抵抗；而胰岛p细胞功能障碍是由于葡萄糖感知和胰岛素分泌之间的联系受损所致(Kitamura T， Kido Y， Nef S， Mere腿ies J， Parada LF， Accili D. Preserved Pancreatic Beta-cell development and function in mice lacking the insulin receptor related receptor. Mol cell Biol 2001 Aug:21(16):5624画30)，而目前对胰岛素外周组织胰岛素抵抗和胰岛P细胞功能缺陷之间的关系所知甚少。近年来的研究已证实，胰岛p细胞上也存在胰岛素受体以及胰岛素受体底物，即胰岛P细胞中也存在胰岛素刺激的信号转导通路。Kitamum T发现胰岛P细胞胰岛素受体基因敲除的小鼠出现P细胞对葡萄糖刺激的第一相胰岛素分泌减少80%，糖耐量受损等II型糖尿病的某些特征，直接证明了p细胞胰岛素受体在维持血糖稳定方面的重要作用（Nadeeja W^jesekara， Daniel Konrad, Mohamed Eweida, Muscle-Specific Pten Deletion Protects against Insulin Resistance and Diabetes. Molecular and Cellular Biology, February 2005， Vol. 25，No. 3,1135-1145)。
但是除了(3细胞胰岛素受体缺陷外，由(3细胞胰岛素受体介导的信号转导通路的障碍有可能导致(3细胞自身胰岛素抵抗而又加重了胰岛素分泌减少， 进而造成恶性循环。外周组织中胰岛素受体介导的信号转导途径的研究表明， 胰岛素首先结合酪氨酸激酶受体，使其B亚基磷酸化被激活之后，再激活胰岛素受体底物IRS-1或IRS-2，然后激活PI3K， PI3K再激活PDK、 Akt/PKC, 促进Glut4的转位和葡萄糖的转运。但只有PI3K、 Akt的激活还不足以引起 Glut4转位达到最高水平，提示其中还有未知的分子在起作用。
James证实大鼠肌肉组织中ndrg2是Akt下游的磷酸化蛋白（James G.
Burchfield, Alecia J. Lennard， Sakura Narasimhan， William E. Akt mediates Insulin-stimulated Phosphorylation of Ndrg2. The Journal of Biological Chamistry 2004,279(18), 18623-18632)，这表明ndrg2参与了外周组织中胰岛素受体介导的信号转导。这虽然为外周组织中胰岛素的信号转导途径的认识增加了新内容，但是不知道ndrg2被磷酸化后，它的功能发生了什么变化， 以及这种变化对GSK-3和GS (糖原合成酶）以及GLUT4 (葡萄糖转运蛋白） 的作用有无影响。因为已知GSK-3和GS以及GLUT4是胰岛素信号转导途径中的三个重要的效应分子，它们的活性直接反映了胰岛素对糖代谢的结果。 搞清这些问题是理解ndrg2是否参与胰岛素受体介导的信号转导途径过程的关键，也是阐明ndrg2与p细胞自身胰岛素抵抗有无关系的关键。
上述对ndrg2的研究，虽然得到了一些有意义的信息，但是这些结果是采用体外细胞培养得到的，难免具有一定局限性。当进一步研究ndrg2在胰岛中的作用以及其与II型糖尿病的关系时，必须调整研究策略。因为糖尿病是一种全身多组织器官相互关联的胰岛素功能受损性疾病，如果还只停留在细胞水平上进行研究，就只能在离体条件下，了解ndrg2对胰岛功能的影响， 而不可能了解由此而产生的对外周组织的影响，而这一点恰恰是在研究II型糖尿病最不该忽视的；所以需要采用转基因动物从整体水平上研究ndrg2基因在小鼠胰岛细胞中的功能和其与II型糖尿病的关系。
RNAi转基因技术是研究ndrg2基因功能的有效手段传统的制作转基因动物是利用DNA同源重组的原理将目的基因敲除 (Knockout),这是一种研究基因功能的有效技术，但是有些目的基因完全敲除后会引起胚胎致死而达不到预期的目标。上述的研究发现ndrg2基因是小鼠胚胎发育的重要基因，因此传统的基因敲除制作转基因动物可能不适合研究ndrg2基因的功能。
RNA干涉（RNAi)是由外源或内源性的双链RNA(doub le2starand RNA ， dsRNA)导入细胞而引起的与dsRNA同源的目的mRNA降解，进而抑制或下调其相应的基因表达（Guiliang Tang. siRNA and miRNA: an insight into RISCs. TRENDS in Biochemical Sciences. 2005， Vol.30,No.2， pl06國114)，可用于基因功能的研究。利用RNAi技术在RNA水平抑制基因的表达制备转基因动物，有别于传统的转基因动物制作方法在于使某个目的基因表达下调 (Knockdown)而不是敲除（Knockout),避免发生目的基因被敲除后引起胚胎致死的问题，适合于ndrg2基因功能的研究。
目前用于RNAi转基因动物的使目的基因表达下调的RNAi转基因载体， 其miRNA连接位点（miR flanking region)上游采用的是聚合酶III依赖的启动子（CMV),由于该启动子在广泛的组织细胞内启动下游miRNA连接位点接入的干涉序列，因此目的基因的表达下调不具有组织细胞特异性。
而对于ndrg2基因的研究需要建立一个胰岛细胞特异性的RNAi-ndrg2转基因动物，所得到的转基因动物只在胰岛组织ndrg2基因表达被下调，而其他胰岛素依赖的靶组织，比如肌肉、脂肪、肝等ndrg2基因表达正常，以便从整体水平上研究ndrg2在转基因动物细胞中的基因功能和其与II型糖尿病的关系。
刘新平等用免疫组化的方法对小鼠胚胎组织和成体组织以及人体的某些组织进行了系统性的研究，以明确ndrg2基因的表达谱（Hn XL, Liu XP, Deng YCh，et al. Expression analysis of NDRG2 gene in mouse embryonic and adult tissues. Cell Tissue Res. 2006， 325(l):67-76)，发现ndrg2是小鼠胚胎组织分化相关基因，随着胚胎发育ndrg2的表达水平逐渐增高，特别表现在骨骼肌、 心肌、脑、肾和胰腺组织，在成体动物中ndrg2的表达仍然表现出这些组织的特异性。特别引人注意的是：ndrg2表达在胰腺的胰岛p细胞，而胰岛的ot 细胞和PP细胞不表达。这种在胰岛(3细胞的特异性表达提示ndrg2与胰岛p 细胞中的特殊功能有关。
ndrg2可能是胰岛素受体介导的信号转导通路中的新分子胰岛p细胞功能障碍和外周组织胰岛素抵抗是n型糖尿病发病的重要特征，经典理论认为在n型糖尿病中胰岛素作用障碍主要是由于骨骼肌、脂肪、 肝脏等组织的胰岛素依赖性葡萄糖摄取及利用障碍，即所谓的胰岛素外周抵抗；而胰岛p细胞功能障碍是由于葡萄糖感知和胰岛素分泌之间的联系受损所致(Kitamura T， Kido Y， Nef S， Mere腿ies J， Parada LF， Accili D. Preserved Pancreatic Beta-cell development and function in mice lacking the insulin receptor related receptor. Mol cell Biol 2001 Aug:21(16):5624画30)，而目前对胰岛素外周组织胰岛素抵抗和胰岛P细胞功能缺陷之间的关系所知甚少。近年来的研究已证实，胰岛p细胞上也存在胰岛素受体以及胰岛素受体底物，即胰岛P细胞中也存在胰岛素刺激的信号转导通路。Kitamum T发现胰岛P细胞胰岛素受体基因敲除的小鼠出现P细胞对葡萄糖刺激的第一相胰岛素分泌减少80%，糖耐量受损等II型糖尿病的某些特征，直接证明了p细胞胰岛素受体在维持血糖稳定方面的重要作用（Nadeeja W^jesekara， Daniel Konrad, Mohamed Eweida, Muscle-Specific Pten Deletion Protects against Insulin Resistance and Diabetes. Molecular and Cellular Biology, February 2005， Vol. 25，No. 3,1135-1145)。
但是除了(3细胞胰岛素受体缺陷外，由(3细胞胰岛素受体介导的信号转导通路的障碍有可能导致(3细胞自身胰岛素抵抗而又加重了胰岛素分泌减少， 进而造成恶性循环。外周组织中胰岛素受体介导的信号转导途径的研究表明， 胰岛素首先结合酪氨酸激酶受体，使其B亚基磷酸化被激活之后，再激活胰岛素受体底物IRS-1或IRS-2，然后激活PI3K， PI3K再激活PDK、 Akt/PKC, 促进Glut4的转位和葡萄糖的转运。但只有PI3K、 Akt的激活还不足以引起 Glut4转位达到最高水平，提示其中还有未知的分子在起作用。
James证实大鼠肌肉组织中ndrg2是Akt下游的磷酸化蛋白（James G.
Burchfield, Alecia J. Lennard， Sakura Narasimhan， William E. Akt mediates Insulin-stimulated Phosphorylation of Ndrg2. The Journal of Biological Chamistry 2004,279(18), 18623-18632)，这表明ndrg2参与了外周组织中胰岛素受体介导的信号转导。这虽然为外周组织中胰岛素的信号转导途径的认识增加了新内容，但是不知道ndrg2被磷酸化后，它的功能发生了什么变化， 以及这种变化对GSK-3和GS (糖原合成酶）以及GLUT4 (葡萄糖转运蛋白） 的作用有无影响。因为已知GSK-3和GS以及GLUT4是胰岛素信号转导途径中的三个重要的效应分子，它们的活性直接反映了胰岛素对糖代谢的结果。 搞清这些问题是理解ndrg2是否参与胰岛素受体介导的信号转导途径过程的关键，也是阐明ndrg2与p细胞自身胰岛素抵抗有无关系的关键。
上述对ndrg2的研究，虽然得到了一些有意义的信息，但是这些结果是采用体外细胞培养得到的，难免具有一定局限性。当进一步研究ndrg2在胰岛中的作用以及其与II型糖尿病的关系时，必须调整研究策略。因为糖尿病是一种全身多组织器官相互关联的胰岛素功能受损性疾病，如果还只停留在细胞水平上进行研究，就只能在离体条件下，了解ndrg2对胰岛功能的影响， 而不可能了解由此而产生的对外周组织的影响，而这一点恰恰是在研究II型糖尿病最不该忽视的；所以需要采用转基因动物从整体水平上研究ndrg2基因在小鼠胰岛细胞中的功能和其与II型糖尿病的关系。
RNAi转基因技术是研究ndrg2基因功能的有效手段传统的制作转基因动物是利用DNA同源重组的原理将目的基因敲除 (Knockout),这是一种研究基因功能的有效技术，但是有些目的基因完全敲除后会引起胚胎致死而达不到预期的目标。上述的研究发现ndrg2基因是小鼠胚胎发育的重要基因，因此传统的基因敲除制作转基因动物可能不适合研究ndrg2基因的功能。
RNA干涉（RNAi)是由外源或内源性的双链RNA(doub le2starand RNA ， dsRNA)导入细胞而引起的与dsRNA同源的目的mRNA降解，进而抑制或下调其相应的基因表达（Guiliang Tang. siRNA and miRNA: an insight into RISCs. TRENDS in Biochemical Sciences. 2005， Vol.30,No.2， pl06國114)，可用于基因功能的研究。利用RNAi技术在RNA水平抑制基因的表达制备转基因动物，有别于传统的转基因动物制作方法在于使某个目的基因表达下调 (Knockdown)而不是敲除（Knockout),避免发生目的基因被敲除后引起胚胎致死的问题，适合于ndrg2基因功能的研究。
目前用于RNAi转基因动物的使目的基因表达下调的RNAi转基因载体， 其miRNA连接位点（miR flanking region)上游采用的是聚合酶III依赖的启动子（CMV),由于该启动子在广泛的组织细胞内启动下游miRNA连接位点接入的干涉序列，因此目的基因的表达下调不具有组织细胞特异性。
而对于ndrg2基因的研究需要建立一个胰岛细胞特异性的RNAi-ndrg2转基因动物，所得到的转基因动物只在胰岛组织ndrg2基因表达被下调，而其他胰岛素依赖的靶组织，比如肌肉、脂肪、肝等ndrg2基因表达正常，以便从整体水平上研究ndrg2在转基因动物细胞中的基因功能和其与II型糖尿病的关系。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体及其应用于ndrg2基因功能研究，进一步阐明ndrg2与II型糖尿病的关系， 为制备新一代的抗II型糖尿病的药物奠定基础。
本发明是通过以下技术方案来实现：一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，包含RNAi转基因载体， 其特征在于，在RNAi转基因载体上连接前胰岛素原启动子，在前胰岛素原启动子下游插入miR接入位点，在miR接入位点连接针对下调ndrg2基因的 miRNA序列。
所述的前胰岛素原启动子是前胰岛素原II启动子，其序列如 SEQ.ID.NO. 1所示。
所述的下调ndrg2基因的miRNA序列包括转录后形成茎环结构的正意序列和反意序列。
所述的下调ndrg2基因的miRNA序列其核苷酸序列为SEQ.ID.N0.2所示的序列。
所述的前胰岛素原启动子和miR接入位点之间还连接有标记基因或筛选基因。
所述的连接前胰岛素原启动子的RNAi转基因载体是pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-InsPII- ndrg2miR，利用胰岛素启动子置换pcDNATM6.2-GW/EmGFP -miR载体中的CMV启动子。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：1、 本发明所构建的RNAi转基因载体采用RNA聚合酶n依赖的前胰岛素原启动子，由前胰岛素原启动子特异性的在胰岛P细胞启动下游的miRNA 序列，特异性的在胰岛P细胞启动针对ndrg2基因的RNA干涉，下调其表达。
2、 本发明所构建的RNAi转基因载体针对目标基因ndrg2的3'-UTR编码部位设计miRNA序列，其在转录成熟之后能够与ndrg2特异性的结合，形成RISC复合体，下调ndrg2的表达，经实验证实其下调效果明显。
3、 本发明在前胰岛素原启动子和miR接入位点之间还连接有标记基因或筛选基因便于对载体的表达、RNA干涉结果的观察。
4、 本发明利用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体为基础，成功构建了针对小鼠ndrg2的转基因载体，能特异性的在小鼠胰岛卩细胞中下调ndrg2 基因的表达，用于动物模型的构建及胰岛P细胞ndrg2基因功能的研究。
5、本发明所提供的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR转基因载体转入小鼠卵细胞后生出来的子代小鼠，只有胰岛P细胞中的ndrg2基因被下调，而其他胰岛靶组织例如肝、肌肉和脂肪细胞中的ndrg2表达正常，是研究从整体水平上研究ndrg2在转基因动物细胞中的基因功能和其与II型糖尿病的关系的理想模型。
附图说明
图1是PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体的质粒图谱；图2是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2 miR载体的双酶切鉴定图；图3是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2 miR载体的测序结果图；图4是小鼠基因组前胰岛素原II启动子扩增电泳图；图5是pcDNATM6,2-GW/EmGFP-ndrg2 miR载体切除壮观霉素抗性基因和CMV启动子之后的电泳鉴定结果图；图6是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII △ spe -miR载体的双酶切鉴定图； 图7是包含前胰岛素原II启动子的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII A spe-ndrg2 miR载体的测序结果；图8是含有壮观霉素抗性基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR载体的双酶切鉴定图；图9是ndrg2基因在不同细胞中表达的WestemBlot鉴定图；图10是荧光显微镜下观察pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR载体在不同细胞中的表达；图11是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPn-ndrg2 miR载体干涉效果及细胞特异性的Western Blot检测图；图12是转然pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR载体的卩TC3细胞的NDRG2蛋白表达的Western Blot检测。
下面结合附图和实验对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明解释的而不是限定。
本发明是通过以下技术方案来实现：一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，包含RNAi转基因载体， 其特征在于，在RNAi转基因载体上连接前胰岛素原启动子，在前胰岛素原启动子下游插入miR接入位点，在miR接入位点连接针对下调ndrg2基因的 miRNA序列。
所述的前胰岛素原启动子是前胰岛素原II启动子，其序列如 SEQ.ID.NO. 1所示。
所述的下调ndrg2基因的miRNA序列包括转录后形成茎环结构的正意序列和反意序列。
所述的下调ndrg2基因的miRNA序列其核苷酸序列为SEQ.ID.N0.2所示的序列。
所述的前胰岛素原启动子和miR接入位点之间还连接有标记基因或筛选基因。
所述的连接前胰岛素原启动子的RNAi转基因载体是pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-InsPII- ndrg2miR，利用胰岛素启动子置换pcDNATM6.2-GW/EmGFP -miR载体中的CMV启动子。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：1、 本发明所构建的RNAi转基因载体采用RNA聚合酶n依赖的前胰岛素原启动子，由前胰岛素原启动子特异性的在胰岛P细胞启动下游的miRNA 序列，特异性的在胰岛P细胞启动针对ndrg2基因的RNA干涉，下调其表达。
2、 本发明所构建的RNAi转基因载体针对目标基因ndrg2的3'-UTR编码部位设计miRNA序列，其在转录成熟之后能够与ndrg2特异性的结合，形成RISC复合体，下调ndrg2的表达，经实验证实其下调效果明显。
3、 本发明在前胰岛素原启动子和miR接入位点之间还连接有标记基因或筛选基因便于对载体的表达、RNA干涉结果的观察。
4、 本发明利用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体为基础，成功构建了针对小鼠ndrg2的转基因载体，能特异性的在小鼠胰岛卩细胞中下调ndrg2 基因的表达，用于动物模型的构建及胰岛P细胞ndrg2基因功能的研究。
5、本发明所提供的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR转基因载体转入小鼠卵细胞后生出来的子代小鼠，只有胰岛P细胞中的ndrg2基因被下调，而其他胰岛靶组织例如肝、肌肉和脂肪细胞中的ndrg2表达正常，是研究从整体水平上研究ndrg2在转基因动物细胞中的基因功能和其与II型糖尿病的关系的理想模型。
附图说明
图1是PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体的质粒图谱；图2是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2 miR载体的双酶切鉴定图；图3是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2 miR载体的测序结果图；图4是小鼠基因组前胰岛素原II启动子扩增电泳图；图5是pcDNATM6,2-GW/EmGFP-ndrg2 miR载体切除壮观霉素抗性基因和CMV启动子之后的电泳鉴定结果图；图6是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII △ spe -miR载体的双酶切鉴定图； 图7是包含前胰岛素原II启动子的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII A spe-ndrg2 miR载体的测序结果；图8是含有壮观霉素抗性基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR载体的双酶切鉴定图；图9是ndrg2基因在不同细胞中表达的WestemBlot鉴定图；图10是荧光显微镜下观察pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR载体在不同细胞中的表达；图11是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPn-ndrg2 miR载体干涉效果及细胞特异性的Western Blot检测图；图12是转然pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR载体的卩TC3细胞的NDRG2蛋白表达的Western Blot检测。
下面结合附图和实验对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明解释的而不是限定。
具体实施方式
MicroRNA (miRNA)是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常为18〜25bp长，能够通过与耙mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控，是RNA干涉中一种重要的分子工具。近几年来，在动物细胞和植物组织中，上百种miRNA被陆续发现，这些小分子调控RNA是从60〜200 bp的具有发夹状结构的前体中被切割出来而成熟的。
在动物细胞中，miRNA基因的转录初产物（pri-miRMA)很快被核糖核酸酶III Drosha (RNaselll Drosha)加工成为miRNA前体（pre-miRNA),然后由细胞核转运至细胞质中，经另一种RNaselll Dicer识别剪切为成熟 miRNA 。这些成熟的miRNA其他蛋白质一起组成RISC复合体 (RNA-inducedsilencing complex),与靶mRNA特异性的碱基配对识别，从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。（李伟，金由辛，生物化学与生物物理进展，2005; (32) 8， 709-711)本发明构建的细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，转染宿主细胞后， 只有在胰岛J3细胞特异性的下调ndrg2基因的表达。
在所构建的载体中，以RNA聚合酶II依赖的启动子驱动下游序列转录出一个茎环结构的RNA，它可被细胞核中的RNaselll Drosha切成短的 pre-miRNA,这种pre-miRNA进到细胞浆后再被RNaselll Dicer剪切成成熟的miRNA，然后生成不同的RNA-蛋白质复合物，使目的基因ndrg2在转录后被表达下调（Knock down)。
构建的载体中所包含以下所述的各元件：a、在RNAi转基因载体上连接胰岛素基因启动子；RNAi转基因载体以PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (购于美国invitrogen公司）为例说明，将其中的CMV启动子替换成胰岛素基因启动子一前胰岛素原II启动子。胰岛素启动子属于RNA聚合酶n依赖的启动子，只在胰岛P 细胞启动胰岛素基因的表达作用，将其连接入所构建载体，实现其在胰岛P 细胞特异性表达。
5699bp的PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体的质粒图谱如图1所示，在 PcDNA6.2-GW的CMV启动子之后连接EmGFP-miR多克隆位点，miR接入位点（miR flanking region)在标记基因绿色荧光蛋白EmGFP之后，其连接的黏性末端为：5，-acga， 3'-cagg，其5'端多克隆位点包括Dral、 sall、 BamH I， 3'端多克隆位点包括BglII和Xho1，该载体还包含两个抗性筛选基因：壮观霉素抗性基因（spectinomycinR)和灭稻瘟素抗性基因（Blasticidin R)。
b、在胰岛素基因启动子下游的miR接入位点连接miRNA序列；miRNA序列针对耙基因设计，其转录之后能够特异性的结合ndrg2进行 RNA干涉，下调ndrg2的基因表达。
在miRNA序列的两端设计粘性连接末端，在连接末端之间连接干涉序列，干涉序列的设计针对靶基因特定位点的，包括正意序列（sense target) 和反意序列（antisense target),以在转录之后形成茎环结构。具体为：在5'-miR flanking的-acga和3'-miR flanking的粘性末端-cagg之间插入针对干涉ndrg2 基因的miRNA序列，该miRNA序列被转录之后形成茎环结构的RNA，经细胞RNaseIII Drosha加工成为pre-miRNA，其序列中带有针对目的基因 ndrg2的干涉序列，在成熟之后与细胞内源性ndrg2的mRNA特异性结合， 形成miRNA干涉，下调ndrg2的表达。
连接上述元件的RNAi载体构建完成之后，转染E.coli ToplO克隆筛选后经测序鉴定，与预期设计序列一致的载体命名为Ins-RNAi-ndrg2。
下面以小鼠为例，详细说明针对ndrg2为耙基因Ins-RNAi-ndrg2载体的构建方法：
1、 miRNA序列是载体构建的关键，设计以ndrg2为靶基因的miRNA序列在于选择特定的位点，以便干涉序列与ndrg2的mRNA结合后能够下调其表达，具体如下：a、 针对ndrg2基因1270-1290 bp编码区碱基部位设计的miRNA引物， 该编码区位于ndrg2基因的3'-UTR编码部位；针对ndrg的21270-1290 bp编码区碱基部位设计的双链形式的miRNA 序列为：tgctgtaaag atcaaggtca tctcccgttt tggccactga ctgacgggag atgcttgatc ttta 64 cctgtaaaga tcaagcatct cccgtcagtc agtggccaaa acgggagatg accttgatct ttac 64 上述64bp的miRNA引物，其中正链的l-4bp为与RNAi转基因载体 PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (购于美国invitrogen公司）粘性末端acga的互补序列，划线部分6-26bp的序列为所针对的ndrg2碱基部位，转录后为反意序列（antisense target) ， 46誦64bp为转录后的正意序歹lj (sense target)，正链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；负链的2-60bp为正链的互补序列， 61-64bp为粘性末端aatg的互补序列。
b、 上述DNA双链序列人工合成双链形式的寡聚核苷酸链；上海生工测序公司合成，退火条件是：从温度95X:降到55t:， l分钟。
退火后形成具有与PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR的miR接入位点相适应的粘性末端的双链形式寡聚核苷酸链（dsOligo)。
c、 再将所形成的ds01igo用T4DNA连接酶连入用BamHI和BglII双酶切的，含壮观霉素抗性基因的RNAi载体PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR; 构建包含上述miRNA序列的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg miR载体，并转化大肠杆菌ToplO，挑选阳性菌落，摇菌并提取质粒。
质粒用BamHI和Bgl II酶切鉴定，能切下约138bp大小的片段（此片段中包括双链寡核苷酸大小为64bp，其余为酶切位点的片段）。dsOligo连入载体后酶切鉴定结果如图2所示，中泳道M为marker,泳道1〜6分别为 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-ndrg2 miR的6个转染细胞后提取质粒的克隆，其中，较暗的小片段138bp为插入的miRNA干涉片段，较明亮的大片段为切除了干涉ds Oligo之后的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR片段。
经酶切鉴定正确的质粒，送上海生工测序公司测序，与预先设计的 miRNA序列一致，pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2miR载体构建成功。以其测序结果见图3所示。
2、置换前胰岛素原启动子，构建具有细胞特异性表达的载体；以上载体均在pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体的基础上构建，启动子为CMV，为构建在胰岛P细胞中特异性表达miRNA的载体，需要把载体中的CMV启动子置换为小鼠前胰岛素原启动子。
启动子的置换是利用Mlu I和Sac I双酶切pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR 载体，但同时也把载体中克隆筛选基因壮观霉素抗性基因（spectinomycinR) 切除了，仅留下灭稻瘟素抗性基因（BlasticidinR)。启动子的置换具体如下-a、克隆小鼠胰岛素原启动子；从GeneBank中发现小鼠存在两种前胰岛素原基因，分别为前胰岛素原I 和前胰岛素原II，根据基因库检索，前胰岛素原I的基因编号是X04725，前胰岛素原II的基因编号是X04724。小鼠主要转录的是前胰岛素原II，因此克隆了前胰岛素原II转录起始上游长度为579 bp的序列，包括前胰岛素原II 转录的核心启动子，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.l所示；前胰岛素原II启动子引物：Ins2P: gcacgcgtac cacagggctt cagct 25Ins2R: gagagctctg attgtagcgg atcactt 27其中，Ins2P为MluI的酶切识别位点，Ins2R为SacI的酶切识别位点。 以小鼠基因组DNA为模板的PCR扩增条件：95°C变性5min; 94。C变性30s, 56。C退火15s， 72。C延伸2min， 30个循环;72°C延伸5min; 50^L 反应体系。如图4所示的小鼠基因组前胰岛素原II启动子扩增电泳，其中泳道M为DNA分子量marker,泳道1为621bp的前胰岛素原I启动子，泳道 2为579bp的前胰岛素原II启动子，说明启动子克隆成功。
b、利用扩增出来的前胰岛素原II启动子序列置换CMV启动子，构建 GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR载体；用Mlu I和Sac I对pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2 miR双酶切，切除壮观霉素抗性基因和CMV启动子，酶切之后的电泳鉴定结果如图5所示，泳道M为DNA分子量marker,泳道1〜6为pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2 miR 的Mlu I和Sac I双酶切后的6个克隆的条带，电泳中的中间条带（lOllbp 条带）为壮观霉素抗性基因片段，电泳中的小条带（5S8bp条带）为CMV 启动子片段。电泳中的大条带（4164bp条带）中含有ndrg2miRNA干涉片段的切除壮观霉素的pcDNATM6.2-GW/EmGFP △ spe-ndrg2 miR载体。
将4164bp和568bp的前胰岛素原II启动子片段回收并在T4 DNA连接酶反应体系中进行连接。然后转化ToplO大肠杆菌，用灭稻瘟素抗性进行筛选。 挑取4个阳性克隆，提取质粒后电泳鉴定结果如图6所示，泳道M为marker, 泳道1〜6为pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII A spe -miR的6个双酶切克隆， 其中570bp大小DNA片段为前胰岛素原II启动子片段，另外的大的DNA 片段为含miRNA的载体片段。确认前胰岛素原II启动子克隆入载体后进行测序，测序结果如图7所示，与预先设定的序列一致。并命名为 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII △ spe画ndrg2 miR。
c、在pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII △ spe —ndrg2 miRl载体中插入壮观霉素抗性基因（spectinomyeinR)用Mlu I酶切质粒pcDNA™6.2-GW/EmGFP-InsPII A spe-ndrg2 miR，并回收该质粒，与上一步回收的lOllbp条带（壮观霉素抗性基因）在T4DNA连13
接酶反应体系中进行连接。
然后转化ToplO大肠杆菌，用壮观霉素抗性基因进行筛选。挑取阳性克隆，提取质粒后并用MluI和EcoRI进行双酶切，能切下1357bp大小DNA 片段的为阳性克隆，电泳鉴定如图8所示，泳道M为marker,泳道1〜6是含有壮观霉素抗性基因的1357bp大小的DNA片段。该质粒为 PcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR，到此完成了全部的载体构建工作。
3、在不同细胞中pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII- ndrg2 miR载体的活性实验a、 应用8个细胞株：小鼠白血病L1210、小鼠前列腺癌RM-1、小鼠骨髓瘤SP20、小鼠肉瘤S37、小鼠肝癌H22、小鼠乳腺EMT6、小鼠肌肉C2C12、 小鼠胰岛瘤I3TC3、小鼠成纤维细胞NIH3T3。
以上细胞培养并裂解后经WestemBlot (Western Blot检测试剂购自 Thermo公司SuperSignal West Pico Stable Peroxide Solution, NDRG2抗体购自ABNOVA公司），观察细胞中NDRG2蛋白的表达，结果如图9所示，以 a-tubulin蛋白作为内参照，表明8个细胞株中均有NDRG2的表达，但表达水平不同。
b、 荧光显微镜观察pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR在不同细胞中的表达小鼠NIH3T3细胞、HEK293细胞、小鼠C2C12细胞、Hela细胞、Hepal-6 细胞和小鼠PTC3 细胞培养至对数期时，加入 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR质粒和转染试剂（Invitrogen公司 Lipofectamine2000 Reagent, l微克质粒/2.5微升）继续培养，48小时后在荧光显微镜下观察。结果如图10所示。在6个细胞株中只有小鼠(3TC3细胞发出标记基因 EmGFP 表达后的荧光，说明转染的
PcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR质粒只在小鼠的胰腺P细胞表达，说明胰岛素原启动子具有细胞特异性。
以上细胞培养经过荧光检测后裂解，进行Western Blot检测（Western Blot 检测试剂购自Thermo公司SuperSignal West Pico Stable Peroxide Solution, NDRG2抗体购自ABNOVA公司），观察细胞中NDRG2蛋白的表达，结果如图11所示，以oc-tubulin蛋白作为内参照，6个检测细胞株中除pTC3细胞夕卜，其他细胞经上述载体（pcDNATM6-2-GW/EmGFP-InsPn-ndrg2 miR质粒） 转染前后的NDRG2的表达没有明显变化，而|3TC3细胞在转染miRNA载体后不仅在荧光显微镜下观察到标记基因EmGFP表达后的荧光，而且以 a-tubulin蛋白作为内参照可见pTC3细胞中的NDRG2蛋白的表达明显降低， 而其他细胞中的NDRG2的表达没有受到影响，证明此载体在胰岛细胞特异性下调NDRG2的表达。
c、进一步检测pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR载体对卩TC3细胞中的NDRG2表达的干涉效果卩TC3细胞培养并裂解后经Western Blot观察细胞中NDRG2蛋白的表达， 结果如图12所示，以a-tubulin蛋白作为内参照，泳道negative是Invitrogen 公司的基础载体（图1提供的载体），泳道1、泳道2和泳道3分别是 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR载体转化卩TC3细胞的三个克隆的 NDRG2的表达结果，可以看出与对照相比，NDRG2蛋白的表达明显下调， miRNA干涉效果明显。
经上述实验证明以下结果：1、 本发明构建的RNAi转基因载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR能特异性的在小鼠胰岛p细胞中下调ndrg2基因的表达，用于胰岛 P细胞ndrg2基因功能的研究。
2、 携带有Ins- RNAi-ndrg2元件的RNAi转基因载体，能够特异性的有效的下调ndrg2基因表达水平，用于胰岛p细胞ndrg2基因功能的研究，便于筛选新的抗II型糖尿病的药物。
而本发明所提供的pCDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR转基因载体转入小鼠卵细胞后生出来的子代小鼠，只有胰岛P细胞中的ndrg2基因被下调，而其他胰岛靶组织例如肝、肌肉和脂肪细胞中的ndrg2表达正常，是从动物整体水平上研究ndrg2在转基因动物胰岛细胞中的功能和其与II型糖尿病关系的新模型。
核苷酸序列表中国人民解放军第四军医大学—种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体21579前胰岛素原II启动子1acgcgtacca cagggcttca gctcagctga cccccaagtg ggatatgg犯 卿g鄉tag 60accattetagt gccttgctgc ctgaattctg ctttccttct acctctgaga 120g鄉gctggg gactcggctg agtt幼g犯c ccagctatca 3ttgg犯Ctg tg肌ac3gtc 180caaggg3c犯 agatactagg tccccaactg caacttcctg ggg犯tgatg tggaaaaatg 240CtC3gCC犯g gcatcaccca ctctggaaca atgtcccctg Ctgtg33Ctg 300gttcatcagg ccatcagggc cccttgttaa gactctaatt accctaggac t卿t卿gg 360tgttgacgtc caatgagcgc tttctgcaga cctagcacca ggg犯gtgtt tgga犯ctgc 420agcttcagcc cctctggcca tctgctgacc taccccacct ggagccctta 3tgggtca犯 ■c解caaagtc c鄉gggcag ctttggtcta t幼aggtagt ggggacccag 540taaccaccag ccctaagtga tccgctacaa tcagagctc 579〈210〉 2 〈211〉 642 tgctgatttc cagaaagctc ttcctggttt tggCC3Ctg3 CtgeiCC6lgg£t agatttctgg 60ai犯t 64
在动物细胞中，miRNA基因的转录初产物（pri-miRMA)很快被核糖核酸酶III Drosha (RNaselll Drosha)加工成为miRNA前体（pre-miRNA),然后由细胞核转运至细胞质中，经另一种RNaselll Dicer识别剪切为成熟 miRNA 。这些成熟的miRNA其他蛋白质一起组成RISC复合体 (RNA-inducedsilencing complex),与靶mRNA特异性的碱基配对识别，从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。（李伟，金由辛，生物化学与生物物理进展，2005; (32) 8， 709-711)本发明构建的细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体，转染宿主细胞后， 只有在胰岛J3细胞特异性的下调ndrg2基因的表达。
在所构建的载体中，以RNA聚合酶II依赖的启动子驱动下游序列转录出一个茎环结构的RNA，它可被细胞核中的RNaselll Drosha切成短的 pre-miRNA,这种pre-miRNA进到细胞浆后再被RNaselll Dicer剪切成成熟的miRNA，然后生成不同的RNA-蛋白质复合物，使目的基因ndrg2在转录后被表达下调（Knock down)。
构建的载体中所包含以下所述的各元件：a、在RNAi转基因载体上连接胰岛素基因启动子；RNAi转基因载体以PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (购于美国invitrogen公司）为例说明，将其中的CMV启动子替换成胰岛素基因启动子一前胰岛素原II启动子。胰岛素启动子属于RNA聚合酶n依赖的启动子，只在胰岛P 细胞启动胰岛素基因的表达作用，将其连接入所构建载体，实现其在胰岛P 细胞特异性表达。
5699bp的PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体的质粒图谱如图1所示，在 PcDNA6.2-GW的CMV启动子之后连接EmGFP-miR多克隆位点，miR接入位点（miR flanking region)在标记基因绿色荧光蛋白EmGFP之后，其连接的黏性末端为：5，-acga， 3'-cagg，其5'端多克隆位点包括Dral、 sall、 BamH I， 3'端多克隆位点包括BglII和Xho1，该载体还包含两个抗性筛选基因：壮观霉素抗性基因（spectinomycinR)和灭稻瘟素抗性基因（Blasticidin R)。
b、在胰岛素基因启动子下游的miR接入位点连接miRNA序列；miRNA序列针对耙基因设计，其转录之后能够特异性的结合ndrg2进行 RNA干涉，下调ndrg2的基因表达。
在miRNA序列的两端设计粘性连接末端，在连接末端之间连接干涉序列，干涉序列的设计针对靶基因特定位点的，包括正意序列（sense target) 和反意序列（antisense target),以在转录之后形成茎环结构。具体为：在5'-miR flanking的-acga和3'-miR flanking的粘性末端-cagg之间插入针对干涉ndrg2 基因的miRNA序列，该miRNA序列被转录之后形成茎环结构的RNA，经细胞RNaseIII Drosha加工成为pre-miRNA，其序列中带有针对目的基因 ndrg2的干涉序列，在成熟之后与细胞内源性ndrg2的mRNA特异性结合， 形成miRNA干涉，下调ndrg2的表达。
连接上述元件的RNAi载体构建完成之后，转染E.coli ToplO克隆筛选后经测序鉴定，与预期设计序列一致的载体命名为Ins-RNAi-ndrg2。
下面以小鼠为例，详细说明针对ndrg2为耙基因Ins-RNAi-ndrg2载体的构建方法：
1、 miRNA序列是载体构建的关键，设计以ndrg2为靶基因的miRNA序列在于选择特定的位点，以便干涉序列与ndrg2的mRNA结合后能够下调其表达，具体如下：a、 针对ndrg2基因1270-1290 bp编码区碱基部位设计的miRNA引物， 该编码区位于ndrg2基因的3'-UTR编码部位；针对ndrg的21270-1290 bp编码区碱基部位设计的双链形式的miRNA 序列为：tgctgtaaag atcaaggtca tctcccgttt tggccactga ctgacgggag atgcttgatc ttta 64 cctgtaaaga tcaagcatct cccgtcagtc agtggccaaa acgggagatg accttgatct ttac 64 上述64bp的miRNA引物，其中正链的l-4bp为与RNAi转基因载体 PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (购于美国invitrogen公司）粘性末端acga的互补序列，划线部分6-26bp的序列为所针对的ndrg2碱基部位，转录后为反意序列（antisense target) ， 46誦64bp为转录后的正意序歹lj (sense target)，正链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；负链的2-60bp为正链的互补序列， 61-64bp为粘性末端aatg的互补序列。
b、 上述DNA双链序列人工合成双链形式的寡聚核苷酸链；上海生工测序公司合成，退火条件是：从温度95X:降到55t:， l分钟。
退火后形成具有与PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR的miR接入位点相适应的粘性末端的双链形式寡聚核苷酸链（dsOligo)。
c、 再将所形成的ds01igo用T4DNA连接酶连入用BamHI和BglII双酶切的，含壮观霉素抗性基因的RNAi载体PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR; 构建包含上述miRNA序列的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg miR载体，并转化大肠杆菌ToplO，挑选阳性菌落，摇菌并提取质粒。
质粒用BamHI和Bgl II酶切鉴定，能切下约138bp大小的片段（此片段中包括双链寡核苷酸大小为64bp，其余为酶切位点的片段）。dsOligo连入载体后酶切鉴定结果如图2所示，中泳道M为marker,泳道1〜6分别为 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-ndrg2 miR的6个转染细胞后提取质粒的克隆，其中，较暗的小片段138bp为插入的miRNA干涉片段，较明亮的大片段为切除了干涉ds Oligo之后的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR片段。
经酶切鉴定正确的质粒，送上海生工测序公司测序，与预先设计的 miRNA序列一致，pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2miR载体构建成功。以其测序结果见图3所示。
2、置换前胰岛素原启动子，构建具有细胞特异性表达的载体；以上载体均在pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体的基础上构建，启动子为CMV，为构建在胰岛P细胞中特异性表达miRNA的载体，需要把载体中的CMV启动子置换为小鼠前胰岛素原启动子。
启动子的置换是利用Mlu I和Sac I双酶切pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR 载体，但同时也把载体中克隆筛选基因壮观霉素抗性基因（spectinomycinR) 切除了，仅留下灭稻瘟素抗性基因（BlasticidinR)。启动子的置换具体如下-a、克隆小鼠胰岛素原启动子；从GeneBank中发现小鼠存在两种前胰岛素原基因，分别为前胰岛素原I 和前胰岛素原II，根据基因库检索，前胰岛素原I的基因编号是X04725，前胰岛素原II的基因编号是X04724。小鼠主要转录的是前胰岛素原II，因此克隆了前胰岛素原II转录起始上游长度为579 bp的序列，包括前胰岛素原II 转录的核心启动子，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.l所示；前胰岛素原II启动子引物：Ins2P: gcacgcgtac cacagggctt cagct 25Ins2R: gagagctctg attgtagcgg atcactt 27其中，Ins2P为MluI的酶切识别位点，Ins2R为SacI的酶切识别位点。 以小鼠基因组DNA为模板的PCR扩增条件：95°C变性5min; 94。C变性30s, 56。C退火15s， 72。C延伸2min， 30个循环;72°C延伸5min; 50^L 反应体系。如图4所示的小鼠基因组前胰岛素原II启动子扩增电泳，其中泳道M为DNA分子量marker,泳道1为621bp的前胰岛素原I启动子，泳道 2为579bp的前胰岛素原II启动子，说明启动子克隆成功。
b、利用扩增出来的前胰岛素原II启动子序列置换CMV启动子，构建 GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR载体；用Mlu I和Sac I对pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2 miR双酶切，切除壮观霉素抗性基因和CMV启动子，酶切之后的电泳鉴定结果如图5所示，泳道M为DNA分子量marker,泳道1〜6为pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2 miR 的Mlu I和Sac I双酶切后的6个克隆的条带，电泳中的中间条带（lOllbp 条带）为壮观霉素抗性基因片段，电泳中的小条带（5S8bp条带）为CMV 启动子片段。电泳中的大条带（4164bp条带）中含有ndrg2miRNA干涉片段的切除壮观霉素的pcDNATM6.2-GW/EmGFP △ spe-ndrg2 miR载体。
将4164bp和568bp的前胰岛素原II启动子片段回收并在T4 DNA连接酶反应体系中进行连接。然后转化ToplO大肠杆菌，用灭稻瘟素抗性进行筛选。 挑取4个阳性克隆，提取质粒后电泳鉴定结果如图6所示，泳道M为marker, 泳道1〜6为pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII A spe -miR的6个双酶切克隆， 其中570bp大小DNA片段为前胰岛素原II启动子片段，另外的大的DNA 片段为含miRNA的载体片段。确认前胰岛素原II启动子克隆入载体后进行测序，测序结果如图7所示，与预先设定的序列一致。并命名为 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII △ spe画ndrg2 miR。
c、在pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII △ spe —ndrg2 miRl载体中插入壮观霉素抗性基因（spectinomyeinR)用Mlu I酶切质粒pcDNA™6.2-GW/EmGFP-InsPII A spe-ndrg2 miR，并回收该质粒，与上一步回收的lOllbp条带（壮观霉素抗性基因）在T4DNA连13
接酶反应体系中进行连接。
然后转化ToplO大肠杆菌，用壮观霉素抗性基因进行筛选。挑取阳性克隆，提取质粒后并用MluI和EcoRI进行双酶切，能切下1357bp大小DNA 片段的为阳性克隆，电泳鉴定如图8所示，泳道M为marker,泳道1〜6是含有壮观霉素抗性基因的1357bp大小的DNA片段。该质粒为 PcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR，到此完成了全部的载体构建工作。
3、在不同细胞中pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII- ndrg2 miR载体的活性实验a、 应用8个细胞株：小鼠白血病L1210、小鼠前列腺癌RM-1、小鼠骨髓瘤SP20、小鼠肉瘤S37、小鼠肝癌H22、小鼠乳腺EMT6、小鼠肌肉C2C12、 小鼠胰岛瘤I3TC3、小鼠成纤维细胞NIH3T3。
以上细胞培养并裂解后经WestemBlot (Western Blot检测试剂购自 Thermo公司SuperSignal West Pico Stable Peroxide Solution, NDRG2抗体购自ABNOVA公司），观察细胞中NDRG2蛋白的表达，结果如图9所示，以 a-tubulin蛋白作为内参照，表明8个细胞株中均有NDRG2的表达，但表达水平不同。
b、 荧光显微镜观察pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR在不同细胞中的表达小鼠NIH3T3细胞、HEK293细胞、小鼠C2C12细胞、Hela细胞、Hepal-6 细胞和小鼠PTC3 细胞培养至对数期时，加入 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR质粒和转染试剂（Invitrogen公司 Lipofectamine2000 Reagent, l微克质粒/2.5微升）继续培养，48小时后在荧光显微镜下观察。结果如图10所示。在6个细胞株中只有小鼠(3TC3细胞发出标记基因 EmGFP 表达后的荧光，说明转染的
PcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR质粒只在小鼠的胰腺P细胞表达，说明胰岛素原启动子具有细胞特异性。
以上细胞培养经过荧光检测后裂解，进行Western Blot检测（Western Blot 检测试剂购自Thermo公司SuperSignal West Pico Stable Peroxide Solution, NDRG2抗体购自ABNOVA公司），观察细胞中NDRG2蛋白的表达，结果如图11所示，以oc-tubulin蛋白作为内参照，6个检测细胞株中除pTC3细胞夕卜，其他细胞经上述载体（pcDNATM6-2-GW/EmGFP-InsPn-ndrg2 miR质粒） 转染前后的NDRG2的表达没有明显变化，而|3TC3细胞在转染miRNA载体后不仅在荧光显微镜下观察到标记基因EmGFP表达后的荧光，而且以 a-tubulin蛋白作为内参照可见pTC3细胞中的NDRG2蛋白的表达明显降低， 而其他细胞中的NDRG2的表达没有受到影响，证明此载体在胰岛细胞特异性下调NDRG2的表达。
c、进一步检测pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR载体对卩TC3细胞中的NDRG2表达的干涉效果卩TC3细胞培养并裂解后经Western Blot观察细胞中NDRG2蛋白的表达， 结果如图12所示，以a-tubulin蛋白作为内参照，泳道negative是Invitrogen 公司的基础载体（图1提供的载体），泳道1、泳道2和泳道3分别是 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR载体转化卩TC3细胞的三个克隆的 NDRG2的表达结果，可以看出与对照相比，NDRG2蛋白的表达明显下调， miRNA干涉效果明显。
经上述实验证明以下结果：1、 本发明构建的RNAi转基因载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR能特异性的在小鼠胰岛p细胞中下调ndrg2基因的表达，用于胰岛 P细胞ndrg2基因功能的研究。
2、 携带有Ins- RNAi-ndrg2元件的RNAi转基因载体，能够特异性的有效的下调ndrg2基因表达水平，用于胰岛p细胞ndrg2基因功能的研究，便于筛选新的抗II型糖尿病的药物。
而本发明所提供的pCDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2 miR转基因载体转入小鼠卵细胞后生出来的子代小鼠，只有胰岛P细胞中的ndrg2基因被下调，而其他胰岛靶组织例如肝、肌肉和脂肪细胞中的ndrg2表达正常，是从动物整体水平上研究ndrg2在转基因动物胰岛细胞中的功能和其与II型糖尿病关系的新模型。
核苷酸序列表中国人民解放军第四军医大学—种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体21579前胰岛素原II启动子1acgcgtacca cagggcttca gctcagctga cccccaagtg ggatatgg犯 卿g鄉tag 60accattetagt gccttgctgc ctgaattctg ctttccttct acctctgaga 120g鄉gctggg gactcggctg agtt幼g犯c ccagctatca 3ttgg犯Ctg tg肌ac3gtc 180caaggg3c犯 agatactagg tccccaactg caacttcctg ggg犯tgatg tggaaaaatg 240CtC3gCC犯g gcatcaccca ctctggaaca atgtcccctg Ctgtg33Ctg 300gttcatcagg ccatcagggc cccttgttaa gactctaatt accctaggac t卿t卿gg 360tgttgacgtc caatgagcgc tttctgcaga cctagcacca ggg犯gtgtt tgga犯ctgc 420agcttcagcc cctctggcca tctgctgacc taccccacct ggagccctta 3tgggtca犯 ■c解caaagtc c鄉gggcag ctttggtcta t幼aggtagt ggggacccag 540taaccaccag ccctaagtga tccgctacaa tcagagctc 579〈210〉 2 〈211〉 642 tgctgatttc cagaaagctc ttcctggttt tggCC3Ctg3 CtgeiCC6lgg£t agatttctgg 60ai犯t 64
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