技术领域

本发明涉及异源基因在细菌中的表达领域。

                    背景技术

遗传工程通过重组表达系统，特别是通过在原核生物(如大肠杆菌(E. coli))中的表达使在细菌细胞中产生大量的异源蛋白或多肽成为可能。

表达的异源兴趣蛋白质可以是哺乳动物、其它真核生物、病毒、细 菌、蓝细菌、原细菌或者合成源的。

与天然细菌蛋白不同(其可以在细菌细胞内有效地积累，甚至在由单 拷贝的染色体基因编码时)，目前没有报道说明当由单一染色体基因位 点编码时异源蛋白可以在细菌细胞中成功地积累超过总细胞蛋白水平 的0.1％。

选择总细胞蛋白的0.1％作为蛋白成功积累的实践测量指标是因 为：(a)此数值大约是由现代重组细菌产生标准确定的所需要的蛋白有 经济价值的明显积累的下限，和(b)此数值大约是考马斯染色的全部细 菌细胞抽提物的聚丙烯酰胺凝胶分析中的可见蛋白带的下限。

当非细菌基因在细菌细胞中表达时甚至在已知最强的细菌启动子 控制之下表达时，其表现不好一般归因于非细菌mRNA转录不良和新 合成的细菌蛋白的迅速降解。广泛接收的观点是为了使非细菌或者异 源蛋白在细菌细胞中成功地积累，必须将编码异源蛋白的基因定位在 多拷贝的质粒载体中。

一个多拷贝的质粒携带的用于在大肠杆菌中克隆和表达编码异源 蛋白的基因的拷贝数通常是每个细胞20个拷贝。甚至低拷贝数的质粒 (如pACYC177和pLG339)以每个细胞6-10个拷贝存在。质粒基因剂 量的不利一点是甚至一些外源蛋白少量的表达可能杀死宿主细胞(参见 酶学方法，185：63-65，D.Goeddel编辑，1990)。因此，在每个细胞的一 个或少数几个拷贝上，例如通过将所说的基因整合到细菌染色体上确 实限制编码这种有毒基因产物之基因的拷贝数将是有利的。例如，如 果所说的文库中高拷贝表达的一个或多个cDNA可能杀死细菌宿主或 使之生长不良时，此系统可以使技术人员在细菌宿主中产生多个代表 性的cDNA表达文库。

编码异源多肽之基因的染色体整合作为在细菌宿主细胞中表达异 源蛋白的方法也是有利的。多拷贝的载体一般是不稳定的，需要在生 长培养基中使用抗生素来保持。目前使用的将外源基因整合到细菌染 色体上的方法效率低、不能控制外源基因的整合位点和/或不能控制整 合的基因的拷贝数。最重要的是，目前所有在细菌染色体上创造重组 DNA构建体(其中将细菌启动子融合到异源基因时上)的尝试都和创造 携带此构建体的病毒或质粒中间体有关。因为这些中间体以高拷贝数 复制，在所说的外源基因产物对这些细菌细胞有毒时它们很难或者不 可能恢复。由于这些中间体的高拷贝数(它们使基因的表达水平成倍地 增加)，所以编码的基因的表达，甚至在很低的水平时，对宿主细胞也 可能是有害的。

以前的把异源基因整合到细菌宿主的染色体上的方法包括使用噬 菌体λ载体。在噬菌体附着位点(attP，240个碱基长)和细菌附着位点 (attB，仅有25个碱基长)之间通过单一位点的特异重组将环形的噬菌 体DNA线性插入到细菌染色体中。这两个位点共有15个碱基对。此 位点专一的重组由特殊的整合酶催化，此酶由噬菌体基因INT所限定 (病毒学pp.56-57(Lippincott，第二版，R.Dulbecco和H.Ginsberg，编 辑，Philadelphia，PA，1985))。

只要在转化过程中提供整合酶，就可以以正常的融合方式，例如通 过INT+辅助噬菌体将噬菌体载体INT整合到所说的染色体中(参见， 例如Borck等(1976)分子基因遗传学146：199-207)。

同样可以把噬菌体载体att-和INT-作为双溶素原通过使用 att+INT+辅助噬菌体整合到细菌染色体上。通过在细菌附着位点上连 接原噬菌体形成双溶素原，并通过在缺陷噬菌体和辅助噬菌体的同源 序列间的正常细菌重组将其整合到所说的染色体上(例如参见Struhl等 (1976)美国科学院学报21：1471-1475)。同样，通过宿主染色体和质粒 载体携带的同源序列间的重组也可能将非复制的colE1复制子整合到 大肠杆菌PolA菌株的基因组上(Greener和Hill(1980)细菌学杂志144： 312-321)。

最近，已经特异构建了由于将外源基因整合到细菌宿主染色体上的 系统。例如，美国专利5,395,763(Weinberg等)公开了由于表达异源基 因的染色体表达载体。通过使用多拷贝数的中间体(已经将所说的兴趣 基因整合在此中间体中)，并通过将此基因可操作地连接到噬菌体中间 启动子(Pm)上而创造了此载体。将包含缺陷Mu基因组(缺乏形成噬菌 体颗粒的必要基因)的此质粒中间体引入到包装菌株中，以便产生传染 性的Mu颗粒，然后使用此颗粒将所说的载体引入到宿主细胞中并将 此载体整合到宿主细胞的基因组中。此载体系统一旦整合到宿主细胞 基因组中，其就可以扩增，但是由于复制噬菌体整合到必要的宿主细 胞基因中，这种扩增机制(复制转座作用)通常对宿主细胞是有害的 (Neidhardt等，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)： 分子和细胞生物学(美国微生物学会，Neidhardt等编辑，Washington， D.C.，1987)。由于整合的原噬菌体的扩增通常是有毒的，所以很难获得 和繁殖携带扩增的整合DNA的宿主细胞株。如果需要生产蛋白质，则 需要扩增所说的基因。

Diederich等((1992)″用于整合到大肠杆菌染色体1附着位点attB 新质粒载体″，质粒28：14-24)也公开了将基因引入到细菌宿主细胞的 染色体室上的系统。此系统使用一套经噬菌体λ附着位点能整合到细菌 染色体上的多拷贝质粒载体。将编码可操作地与兴趣基因连接的启动 子的DNA序列克隆到所描述的多拷贝数的质粒载体中，通过限制性内 切酶除去质粒的复制起点，将所得的DNA重新环化，并转移到宿主细 胞中，在此DNA序列整合到所说的染色体中。

这些新的基因转移系统与早期的系统具有相同的缺点。USP 5,395,763(Weinberg等)和Diedench等都要求在构建所说的转化DNA 期间，当多拷贝数的质粒处于可操作的构型时将所说的兴趣基因克隆 到多拷贝数的质粒中。所说的多拷贝数的质粒构型使毒性基因的表达 困难(如果可能的化)，这是因为将表达成为多拷贝数质粒的毒性兴趣基 因得到了繁殖。

因此，需要一种产生异源蛋白的方法，这种方法能产生大量的蛋白 质且在产生菌株的构建期间使异源蛋白对宿主细胞的毒性最小。如图2 所示，申请人已惊人地显示经编码异源蛋白的低拷贝(大约2个)基因的 表达能产生极高的蛋白积累(大约为总细胞蛋白的20％)。

                     发明概述

本发明提供了用于通过将染色体转化DNA(环形的非自我复制的 DNA)整合到宿主细胞的染色体中以在宿主细胞(如大肠杆菌)中产生异 源蛋白的组合体和方法。所说的转化DNA包含编码异源兴趣蛋白质的 基因的一个或多个拷贝。

因此，本发明提供了产生异源兴趣蛋白质的方法，该方法包括：

将染色体转化DNA整合到细菌宿主细胞的染色体中，这有利于整 合的DNA的扩增，其中所说的染色体转化DNA包含至少编码异源兴 趣蛋白质的基因的一个拷贝和选择标记；和

表达编码异源兴趣蛋白质的基因，在多拷贝质粒载体中构建转化 DNA的过程中，其中所说的基因决不可操作地连接到在宿主细胞有功 能的启动子上，和

其中所说的异源兴趣蛋白质的积累水平超过总细胞蛋白的0.1％。

染色体转化DNA可以包含可以不包含可操作连接到编码异源兴趣 蛋白质的基因上的启动子，其中所说的可操作连接由染色体转化DNA 的环化产生。

所说的染色体转化DNA还可以包含或不包含侧翼于选择标记的重 复DNA。所说的重复DNA可以包含或不包含编码异源兴趣蛋白质的 可操作地连接到启动子上的基因的拷贝。

所说的表达异源蛋白的方法可以包括或不包括选择染色体扩增的 步骤。

本发明也提供了产生染色体转化DNA的方法，该方法包括将第一 和第二质粒载体的片段连接在一起。

第一质粒载体包含第一复制起点和第一编码异源兴趣蛋白质的基 因，其中所说的基因没有可操作地连接到启动子和第一拷贝的复制 DNA上。

第二质粒载体包含第二复制起点和第一启动子和第二复制DNA的 拷贝。

其中所说的复制起点、所说的宿主细胞的功能启动子以及其中所说 的第一质粒或所说的第二质粒都包含选择标记。

第一质粒还可以包含或不包含没有可操作地连接到编码异源兴趣 蛋白质之第一基因上的第二启动子，并且第二质粒还可以包含或不包 含没有可操作地连接到第一启动子上的第二编码异源兴趣蛋白质的基 因的拷贝。

本发明也提供了用于产生异源兴趣蛋白质的染色体转化DNA，该 DNA包含：

可操作地连接到在宿主细胞中有功能的启动子上的非细菌兴趣基 因；和

侧翼于重复DNA的选择标记，

在多拷贝质粒载体中构建转化DNA的过程中，其中所说的基因决 不可操作地连接到在宿主细胞有功能的启动子上。

染色体转化DNA还可以包含或不包含编码非细菌兴趣蛋白质的基 因的两个或多个拷贝，其中所说的基因的拷贝侧翼于选择标记。

                   附图的简短说明

图1显示出体外形成染色体转化DNA的步骤，其中的DNA环缺乏 复制起点(这样没有自我复制的能力)并且用于将外源基因整合到细菌 染色体上是合适的。直到所说的染色体转化DNA形成时，待表达的外 源基因(这里是IGF-I融合基因)与功能细菌启动子(这里是T7启动子) 是分开的。

图2显示出经两个DNA片段连接形成的染色体转化DNA。其中的 一个片段包含融合基因，这种融合基因含有编码大肠杆菌DsbA、酵母 遍在蛋白(以蛋氨酸开始)和人类胰岛素样生长因子I(″dsbA-ubi-IGF″) 的序列，这一点在共有(co-owed)未决美国专利申请08/100,744(1993年 8月2日申请)中讨论了。另一个DNA片段包含T7启动子。染色体转 化DNA和细菌染色体都包含噬菌体λattP的重组位点。将染色体转化 DNA转化到大肠杆菌菌株B1384中，这样整合酶(INT)就在trp启动 子(P-trp)的控制下。整合酶催化所说的染色体转化DNA在细菌染色体 的att位点上进行位点专一的整合。在转化过程中通过向培养基中加入 1mM吲哚-3-乙酸(IAA)可以诱导trp启动子。带有整合的染色体转化 DNA序列的细胞对氯霉素(CAM-γ，10Tg/ml)具有抗性。

图3显示由图2描述的方法产生的B1384染色体整合体。由通过 多套引物(例如UBUF×IGFR，1243(T7REV，或者TRPPF×1239)的 PCR扩增宿主染色体DNA、用合适的限制性内切酶(分别为SacII， HinCII或者BamHI)消化扩增片段、并通过凝胶电泳测定产物的大小 来确认整合的发生。

图4显示出对氯霉素具有抗性的W3110DE3转导体的总细胞裂解 物的Western印迹。也包含蛋白质大小的标记物(最左端道)和IGF融 合蛋白(对照)。

图5显示出对卡那霉素具有抗性的转导体的总细胞裂解物的 Western印迹。

图6-9以图解的形式表示构建染色体转化DNA的一般策略。图6 显示出染色体转化DNA包含编码异源兴趣蛋白质的基因的单一拷贝和 侧翼于选择标记的第二基因的两个拷贝，所说的选择标记在染色体转化 DNA整合后有利于染色体的扩增。图7显示出在实施例2-6和实施例8 中用于异源蛋白表达的“双盒”系统。染色体转化DNA的实施方案包含 侧翼于选择标记的编码异源兴趣蛋白质的基因的两个拷贝，所说的选 择标记有利于整合的DNA的染色体扩增。图8和9显示出另外的“缺 少启动子”的染色体转化DNAs的实施方案。这些实施方案使用了与宿 主细胞染色体片段同源的DNA序列。缺少启动子的染色体转化DNAs 的整合导致宿主细胞启动子和编码异源兴趣蛋白质之基因之间的可操 作的连接的形成，及产生侧翼于所说的选择标记的重复DNA序列。

图10-13显示出染色体转化DNA的质粒系谱。

图14显示出构建用于双盒系统的两个DNA源的策略。

图15和16显示出构建用于整合和表达酵母遍在蛋白水解酶基因的 染色体转化DNA的策略。

图17显示出构建用于整合和表达编码DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合 蛋白之基因的染色体转化DNA的策略。

图18显示出构建用于整合和表达编码DsbA∷2A∷IGFBP-3融合蛋 白之基因的染色体转化DNA的策略。

图19和20显示出构建用于整合和表达编码DsbA∷2A∷IGF-I(图19) 和DsbA∷3C∷IGF-I(图20)融合蛋白之基因的染色体转化DNA的策 略。

图21显示出构建用于整合和表达编码DsbA∷遍在蛋白∷TGF-β2融 合蛋白之基因的染色体转化DNA的策略。

图22显示出构建用于整合和表达编码DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋 白之基因的染色体转化DNA的策略。

图23显示出考马斯蓝染色的表达IGF-I融合蛋白的总细胞裂解物 的分离物的SDS-PAGE凝胶。c49222、c49258#46和c53063表达 DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合蛋白(左箭头表示)，只是一条很容易染色 的带。令人惊奇的是，在没有扩增的c49222和c49258#46处(即没有对 整合的DNA的染色体扩增抗性选择)有高水平的表达。c57264#5和 c57264#28表达DsbA∷3C∷IGF-I融合蛋白，而c57265#44和 c57265#54表达DsbA∷2A∷IGF-I融合蛋白。另外，表达的融合蛋白很 容易显色。光密度分析表明所有的分离物的蛋白的积累超过总细胞蛋 白的19％(平均蛋白积累是总细胞蛋白的25.7％)。

图24显示从c49222，c49258#46，c53063，c57264#5，c57264#28， c57265#44，c57265#54分离的染色体DNA的Southern印迹。用编码 融合到IGF-I上的遍在蛋白的DNA片段检测印迹。在每一个分离物 中，每道中较高分子量的带代表整合的IGF-I融合蛋白基因的单一拷 贝。较低分子量的带也代表整合的IGF-I融合蛋白基因，但此片段可 以通过染色体扩增来扩增。分离物c53063，c57264#5，c57264#28， c57265#44，c57265#54已经明显地扩增，大约扩增了3-5倍。

图25显示出考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶，表明在携带编码 IGFBP-3融合蛋白之整合的基因的分离物中有蛋白的积累。A)表示在 表达DsbA∷2A∷IGFBP-3融合蛋白的分离物中的蛋白积累。右边的带 表示在T7 RNA聚合酶诱导后(通过向培养基中加入IPTG)蛋白的表 达。B)表示在表达DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白的分离物中的蛋白积 累。如图23所示，这些代表融合蛋白的带很容易显色。这些凝胶的光 密度扫描发现在A凝胶板上积累的蛋白为总细胞蛋白的22.6％，在B 凝胶板上的两种分离物的积累为总细胞蛋白的33.％和28.2％(从左到 右)。

图26显示出考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶，显示出表达编码 DsbA∷遍在蛋白∷TGF-β2之基因的宿主细胞的蛋白的积累。M为分 子量标记，C为阳性对照。两个质粒道(1道和2道)用作标准物，右边 比较多拷贝数质粒载体的蛋白积累和整合到染色体上的基因的蛋白积 累。3道和4道是总细胞裂解物的分离物，当其与噬菌体4107划线培 养(streak)时，对T7 RNA聚合酶表现出阴性。该凝胶的光密度分析表 明质粒菌株积累的蛋白达总细胞蛋白的26.4％。测量了分离物48，56， 59，65和66的蛋白积累，表明蛋白积累分别为36.7％，33.3％，32.1％， 29.5％，26.7％。

                   实施发明的方法

本发明有两点：(a)产生在启动子和编码异源兴趣蛋白质的基因间的 可操作连接，这种连接在染色体转化DNA的构建过程中或在其整合到 宿主细胞的染色体后形成，和(b)同时产生一种用于整合的兴趣基因的 合适染色体扩增的方法。

在优选的实施方案中，染色体转化DNA的产生同时产生两种结 果：(1)启动子和兴趣基因的可操作连接，和(2)侧翼于选择标记(其是有 利于染色体转化DNA扩增的一种手段)的重复DNA序列的位点。另一 种实施方案是在产生染色体转化DNA期间在所说的基因和启动子之间 产生了可操作的连接，而整合的结果产生了染色体扩增的手段(重复 DNA序列侧翼于染色体转化DNA)。

通过将染色体转化DNA整合到合适的染色体位点上，也可以产生 这两种结果或其中之一。例如，可以用在细菌染色体的启动子附近的 基因整合来产生可操作的连接(如通过将染色体转化DNA整合到宿主 细胞染色体的操纵子上)。整合的位点或整合位点邻近的序列可以有利 于扩增(例如，在此位点所在的转座因子处，通过提供重复DNA序列 或甚至提供与部分染色体转化DNA同源的DNA序列区，来提供重复 DNA序列)。

本发明使用″染色体转化DNA″，使用它可以简单、有效和可靠地 将异源基因的拷贝插入到宿主细胞(例如大肠杆菌)的染色体中。染色体 转化DNA是环形DNA，其包含一个或多个编码异源兴趣蛋白质的基 因、选择标记(如抗生素抗性基因)、重组位点(例如位点专一性的重组 位点(如λattP或者ttB)或与宿主细胞染色体上的片断同源的DNA序 列)、重组在宿主染色体上之后及在缺乏复制起点或自我复制序列(ARS) 时有利于染色体转化DNA扩增的手段。因此，当染色体转化DNA导 入到宿主细胞中时，其不能独立复制。染色体转化DNA可以任意携带 可操作地连接到兴趣基因上的启动子。

当将携带位点专一性的重组位点的染色体转化DNA导入到染色体 上含有第二相似的重组位点(例如另一个attP或者attB位点)的宿主细 胞中时，在宿主细胞中能够催化重组位点的位点专一重组的酶(如整合 酶)的表达使所说的载体在此重组位点上整合到宿主细胞的染色体上。 这种位点专一重组过程与一般的在同源载体和宿主染色体序列上起作 用的重组系统相比，具有更高的有效性，形成具有更高稳定性的整合 序列，特别是在整合酶的合成得到控制时。也可以通过在染色体转化 DNA导入时暂时或稳定存在于宿主细胞中的质粒或其它DNA分子来 提供整合酶。

本领域技术人员熟悉的还有其它各种方法，所说的方法不同于使用 attP、attB和INT(使用它可以将染色体转化DNA整合到宿主细胞的 染色体上)的优选的方法。例如，可以使用非复制的colEl复制子，转 座因子、或者甚至携带与宿主染色体的序列同源的序列的裸露的DNA 将染色体转化DNA插入到宿主染色体中。多拷贝的大肠杆菌素质粒 ColE1，CloDF13，ColK和ColA都包含位点专一的重组系统(包含顺式- 反式-作用元件)。为了在本发明中使用，从这些质粒的其中一个获得的 顺式-作用元件可以包含在染色体转化DNA中，而所说的反式-作用元 件可以在染色体转化DNA或由宿主细胞提供。可以使用转座子(插入 序列(IS)和Tn3家族的转座子)将DNA整合到宿主细胞的染色体上。如 上所述的大肠杆菌素质粒中的顺式作用转座子元件可以包含在染色体 转化DNA，而反式作用因子可以包含在染色体转化DNA中或由宿主 细胞提供。染色体转化DNA也可以携带与宿主细胞染色体的序列同源 的序列，其有利于染色体转化DNA经同源重组的整合。所有这些方法 都在本发明的范围内。

这一方法的主要特征是编码异源兴趣蛋白质的基因在所说的转化 DNA构建过程中，决不可操作地连接到多拷贝载体的功能启动子上。 在外源基因以低拷贝数导入到所说的细胞之前，通过使功能启动子与 此兴趣基因分离，可以将此基因产物的潜在毒性或致死作用降至最小 程度。如果所说的基因没有可操作地连接到启动子上，多拷贝数质粒 的毒性外源基因则不能表达。其它将兴趣基因整合到宿主细胞染色体 上的方法使用了携带可操作地连接到启动子上的兴趣基因的多拷贝数 质粒(如Diederich等和Weinberg等)；这些基因将在此质粒的复制过 程中表达，如果所说的兴趣基因对质粒复制所在的宿主细胞有毒，则 产生足够量的该质粒将极其困难(如果可能产生)。

由于染色体转化DNA的形成或由于整合到宿主细胞染色体上，可 以在编码异源兴趣蛋白质的基因和所说的启动子之间产生可操作的连 接。在由于染色体转化DNA的形成而形成的可操作的连接时，所说的 连接是通过染色体转化DNA的环化而产生的。环化的完成是通过，例 如连接一个或多个DNA片段以形成环形DNA，或者通过在环形DNA 中的异源重组(这将导致插入物的环化)。优选的是，通过连接一个或多 个DNA片段完成环化。

另外，可以通过多整合或通过选择整合基因的扩增来完成毒性较小 的基因产物的高水平表达。 重组DNA的方法和试剂

例如在Sambrook等的分子克隆：实验手册，1-3卷(冷泉港实验室 出版社，第2版，(1989)；或F.Ausubel等的现代分子生物学方案(Green Publishing和Wiley-interscience：纽约，1987))和最新期刊中一般性 地描述了对实施所要求的发明有用的核酸操作的一般技术。从卖主 (New England BioLabs；Boerhinger Mannheim；Amersham；Promega Biotec，U.S.；Biochemicals和New England Nuclear)可以买到核酸操 作中用到的试剂，如限制酶、T7 RNA聚合酶、DNA连接酶等等。 定义 ″外源″或者″异源″或者″非细菌″；″天然″或者″同源″

“外源”或者″异源″多肽是通常在特定物种的宿主细胞中不能发现 的多肽。编码这种多肽的核酸被称为″外源″或者″异源″的。例如，胰 岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)和转化生 长因子β(TGF-β)天然存在于哺乳动物细胞中，而人类鼻病毒3C蛋白 酶天然存在于病毒和病毒感染的哺乳动物细胞中，但这些蛋白对大肠 杆菌则是外源的。″非细菌蛋白″通常是细菌细胞中没有的蛋白质或多 肽。非细菌蛋白、外源或异源蛋白可以融合在非细菌蛋白、外源或异 源蛋白和其它蛋白或多肽之间。在本发明的实施方案中，″异源蛋白″ 和″非细菌蛋白″都可以使用。如本文所公开的，编码异源或非细菌兴 趣蛋白质的基因不包含在宿主细胞中有功能的启动子。为了进行表 达，所说的基因必须连接到分离的启动子(该启动子在宿主细胞中是有 功能的)上。相反，″天然″或″同源″的多肽或DNA序列通常存在于所 说的宿主细胞中。如果启动子或其它作用于，例如基因的转录或翻译 的序列在所说的宿主细胞中有功能，也可以认为是″同源″的。例如， 如果T7 RNA聚合酶存在于所说的宿主细胞中，认为T7启动子与大 肠杆菌宿主细胞是″同源″的，这是因为T7启动子能够驱使与其可操作 地连接的编码多肽的序列的转录。 ″编码异源、外源或非细菌蛋白的基因″

除了在宿主细胞中有功能的启动子外，″编码异源、外源或非细菌 蛋白的基因″还包含所有对表达异源、外源或非细菌蛋白必要的元件。 这些基因涉及重组基因，所说的重组基因包含宿主细胞天然的基因元 件。并且，可以任意优化这些基因编码区的宿主细胞密码子的使用。 ″编码″

如果核酸序列可以转录和/或翻译以产生所说的多肽，则核酸序列以 其天然的状态或经重组DNA方法操作的状态来″编码″多肽。 ″可操作地连接″

当将核酸序列置于与另一核酸序列的功能关系中时，其就被可操作 地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子 就可操作地连接到此编码序列上。一般来说，可操作地连接的DNA序 列是邻近的，并且如果必要，其在读框中。 ″重组″

″重组″核酸是通过体外连接两个不同的分离的核酸序列片段或通 过化学合成而产生的。 ″染色体扩增″

″染色体扩增″指DNA序列的拷贝数在所说的宿主染色体上的增 加。染色体扩增不指染色体外的扩增(如多拷贝数质粒的复制)或者体外 扩增(如聚合酶链反应(PCR))。 探针和引物

核酸探针和引物是分离的核酸，一般是单链的，并且尤其是探针一 般附着在标记或报道分子上。例如，探针用于鉴定组织或其它样品中 的杂交核酸序列或者文库中的cDNA或者基因组克隆。例如，引物用 于扩增核酸序列，如通过聚合酶链反应(PCR)。例如Sambrook等(上 文)或Ausubel等(上文)描述了探针和引物的制备和用途。 核酸的化学合成

可以通过化学合成(如通过Beaucage和Carruthers(1981)描述的亚 磷酰胺方法(Tetra.Letts.22：1859-1862)或者通过Matteucci等(1981) 的三酯方法(美国化学学会杂志，103：3185))产生核酸，特别是如扩增引 物的短核酸，并且可以在自动寡核苷酸合成仪上进行。通过合成互补 链并在合适的条件下使这两条链一起退火或者使用DNA聚合酶及合适 的引物序列通过加入互补链而从化学合成的单链产物中获得双链片 段。 染色体转化DNA和它们构建过程中所用质粒的特征

染色体转化DNA包含编码选择标记的DNA片段和编码所需异源多 肽的序列。染色体转化DNA也可以以可操作地与编码所需异源多肽的 序列连接的方式包含或不包含转录和翻译起始调节序列和表达控制序 列，所说的表达控制序列可以包含启动子、增强子和必要的加工信息 位点(如核糖体结合位点、mRNA稳定序列以及必要的分泌序号，在合 适的地方，分泌序号使所说的蛋白穿过和/或定居在细胞膜上，这样保 留了它的拓扑结构或者从细胞中分泌出来)。

在染色体转化DNA构建中所用的质粒一般也包含宿主能识别的复 制系统，这种复制系统包括复制起点或自我复制序列(ARS)。在染色体 转化DNA构建过程中所用的质粒携带重复DNA序列时，这种质粒可 以在rec宿主细胞中繁殖。优选的是，在这些质粒携带重复DNA序列 时，使用rec宿主细胞繁殖所用的质粒，以便产生染色体转化DNA和 携带染色体转化DNA组件的质粒，而一般不使用其作为整合染色体转 化DNA的宿主细胞。

可以通过本领域公知的标准重组技术(例如Sambrook等和Ausubel 等的描述)从所说的载体中制备染色体转化DNA。

选择合适的启动子和其它对有效转录和/或翻译必要的序列，以便使 之在宿主细胞中有功能。Sambrook等(上文)和Ausubel等(上文)描述 了能够使用的细胞系组合及表达载体的例子；也参见Metzger等(1988) 自然334：31-36。在原核宿主中这些启动子是有用的，如trp、lac 和λ噬菌体启动子(例如T7，T3，SP6)、tRNA启动子和糖酵解酶启动 子。有用的酵母启动子包括金属硫蛋白3-磷酸甘油酸激酶或者其它糖 酵解酶(这些酶的作用是利用麦芽糖和半乳糖及其它)的启动子区(例如 参见Hitzeman等，EP73，657A)。合适的哺乳动物启动子包括猿猴病毒 40的早期和晚期启动子(Fiers等(1978)自然273：113)，或者来自鼠莫 洛尼氏白血病病毒、小鼠乳房肿瘤病毒、鸟肉瘤病毒、腺病毒II、牛 乳头瘤病毒或者多瘤病毒的启动子。此外，可以将所说的构建体与扩 增基因(如DHFR)连接，以便在需要的地方产生此基因的多个拷贝。合 适的真核增强子和其它表达控制序列参见，例如增强子和真核基因表 达(冷泉港出版社，纽约，1983)。

优选的是，当整合到宿主染色体中，驱使异源基因表达的启动子是 可控制的。

染色体转化DNA和构建过程中所用的质粒通常包含选择标记、编 码蛋白的基因，所说的蛋白对染色体转化DNA或质粒转化的宿主细胞 的存活和生长是必要的。典型的选择标记(a)赋予对抗生素或者其它有 毒物质的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤等等；(b)弥补营养 缺陷；或(c)供给不能从复合培养基得到的关键营养，如编码杆菌(Bacilli) 的D-丙氨酸消旋酶的基因。合适的选择标记的选择将取决于宿主细 胞。

本发明的染色体转化DNA可以包含位点专一性的重组位点，如噬 菌体λattP位点。当其转化到细菌宿主菌株(如大肠杆菌B1384)中，产 生整合酶，这种整合酶识别染色体转化DNA上的attP位点，并催化 与att位点的重组(整合酶可以催化attP和attB或者两个attP位点之间 的重组)。以整合的DNA携带的选择标记为基础，选择含有整合的DNA 的细菌宿主细胞。

这样，使用位点专一性的重组一般与酶(例如整合酶)的表达有关， 这种酶催化位点专一重组，并且此酶能识别在染色体转化DNA和细菌 染色体上存在的位点。其它由″整合酶″或相似酶赋予特色的位点专一 重组系统和由″整合酶″特异识别的位点也可以使用。

整合到多拷贝的宿主细胞染色体上的外源基因的高水平表达也是 可能的，例如通过结合宿主细胞的多个att位点并将多个染色体转化 DNA导入到宿主细胞中。另外，可以通过选择染色体的扩增来获得含 有多拷贝整合DNA的宿主细胞。当选择标记的两侧是重复DNA序列 时，有利于染色体的扩增。理想的是，重复DNA序列侧翼于第一和第 二选择标记。第一选择标记在低拷贝数时是有效的，并可以选择整合 的染色体转化DNA。理想的是第二选择标记仅在高拷贝数时是有效 的。使用第一选择标记对整合进行选择后，然后使用第二选择标记选 择包含整合的DNA的多拷贝的宿主细胞。

本发明的染色体转化系统的主要特征是在整合前，编码异源蛋白的 基因不能表达；直到(a)体外构建了转化DNA或者(b)染色体转化DNA 整合到宿主细胞染色体上时，染色体转化DNA才能可操作地连接到启 动子上。这一方法使技术人员能使用高拷贝数的质粒作为DNA源来构 建染色体转化DNA。当毒性基因可操作地连接到启动子上时，携带毒 性异源基因的高拷贝数的质粒很难繁殖。例如，DNA的小量制备产生 的DNA不足以用于体外操作。通过选择的DNA片段的环化从有关或 多个DNA源构建染色体转化DNA。

当使用单一DNA构建染色体转化DNA时，编码异源兴趣蛋白质的 基因和启动子都定位在同一DNA上，然而所说的基因和启动子不是可 操作地连接的。可以通过，例如将所说的启动子和兴趣基因置于阻止 任何可操作地连接(如经包含终止子序列)的间隔DNA序列的任何一侧 来完成这一过程。理想的是，间插DNA序列也包含源DNA的任何其 它的部分(如复制起点或ARS)，这些部分在产生染色体转化DNA时必 须除去。通过使阻止所说的基因和启动子间的可操作连接的DNA序列 缺失，然后使剩下的DNA环化来构建染色体转化DNA。

如图7，8和9所示，染色体转化DNA可以任意包含或不包含表达 大肠杆菌亲环蛋白的DNA序列，美国专利5,459,051描述了这一点。

技术人员使用两种或者更多DNA源构建染色体转化DNA的方法有 几种。如图7所示，在一个优选的实施方案中，使用了两种DNA源。 在此实施方案中，两种DNA源的每一种都携带编码异源兴趣蛋白质的 基因的一个拷贝和启动子，但是，所说的编码异源兴趣蛋白质的基因 和启动子不是可操作地连接到任何DNA源上的。与前面描述的实施方 案一样，任何DNA源可以携带其它必需序列(另外，所说的其它必须 序列可以由一个或多个副DNA源提供)。切割两个DNA源，然后将它 们彼此连接，形成环形染色体转化DNA，这种染色体转化DNA具有 两个拷贝的外源基因，每一个都可操作地连接到启动子的一个拷贝 上。将第一DNA源的启动子可操作地连接到第二DNA源的编码异源 兴趣蛋白质的基因上，将第二DNA源的启动子可操作地连接到第一 DNA源的编码异源兴趣蛋白质的基因上。

也可以把染色体转化DNA设计成不含启动子(图8和9)。将这些没 有启动子的染色体转化DNA整合到细菌染色体的靶位点上，此位点使 编码异源兴趣蛋白质的基因与宿主细胞染色体上的启动子可操作地连 接。此实施方案的染色体转化DNA包含符合读框地连接到一部分与宿 主细胞染色体的DNA同源的靶位点DNA片段上的编码异源兴趣蛋白 质的基因的一个拷贝和选择标记。此靶位点DNA序列一般是定位在细 菌染色体启动子下游之基因的5’端。染色体转化DNA在宿主细胞染色 体上的整合使编码异源兴趣蛋白质的基因可操作地与细菌启动子连 接。所说的宿主细胞染色体上的靶序列可以是天然存在的序列或者可 以是导入到宿主细胞染色体上的位点。使用与宿主细胞染色体的片段 同源的DNA序列可以将目标导入到宿主细胞染色体上，如上文有关染 色体转化DNA整合的描述。使用位点专一的重组(如上文描述的 attB/attP系统)也可以将靶位点导入。靶位点序列为至少大约10个碱 基长，优选的是至少大约30个碱基长，最优选的是至少大约100分碱 基长。染色体转化DNA与靶位点具有至少大约80％的同源性，优选 的是至少大约90％的同源性，最优选的是至少大约95％的同源性。理 想的是宿主细胞染色体上的靶位点是稀少的，更理想的是其在宿主细 胞染色体上是唯一的。使用与宿主细胞染色体的片段同源的序列整合 染色体转化DNA有利于整合的DNA的扩增(通过在整合DNA的侧翼 置于重复DNA序列来进行扩增)(参见图8和9)。 DNA导入到宿主细胞中

将核酸导入到宿主细胞的各种方法在本领域是公知的，包括但不限 于：电穿孔；使用氯化钙、氯化铷磷酸钙的转染；DEAE-葡聚糖或其 它物质；微粒轰击；脂转染；和感染(其中所说的载体是感染剂，如逆 转录病毒基因组)。一般参见Sambrook等(上文)和Ausubel等(上文)。 宿主细胞

尽管这些方法对真核宿主细胞也是适用的，但理想的是以原核宿主 细胞使用本发明的方法。在原核宿主中，革兰氏阴性细菌是理想的， 特别是大肠杆菌。也可以使用其它原核生物，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或假单胞菌属(Pseudomonas)。

也可以使用哺乳动物或其它真核宿主细胞(如酵母、丝状真菌、植 物、昆虫、两栖或者鸟类物种)。参见组织培养(Kruse和Patterson等 编辑，学院出版社，1973)。有用的哺乳动物宿主细胞系包括但不限于： VERO和HeLa细胞系；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；W138，BHK和 COS细胞系。 整合DNA的扩增

通过几种方法的任何一种都可以有效地进行整合的基因的扩增， 例如，染色体复制或复制转座。包含或者其侧翼是25或更多个碱基对 的重复DNA序列的整合DNA将形成染色体复制(Normark等(1977) 细菌学杂志132：912-922；Edland等(1979)分子基因遗传学173：115- 125；Tlsty等(1984)细胞37：217-224；Stem等(1984)细胞37：1015- 1026)。如果重复DNA包含选择标记(如抗生素抗性基因或者弥补宿主 细胞缺陷的基因)一般有利于对复制(扩增)进行选择。优选的是整合的 DNA包括两种选择标记；第一种选择标记在低拷贝数下操作，用于整 合体的选择；第二种选择标记要求高拷贝数，用于选择扩增整合DNA 的宿主细胞。可以通过复制转座完成扩增，其中所说的染色体转化DNA 包含合适的转座子序列或者将染色体转化DNA整合到转座子中。理想 的是，通过染色体复制的选择完成扩增。 非细菌蛋白的产生

在所说的染色体转化DNA整合到宿主细胞染色体上及整合的DNA 扩增后，就可以表达外源基因，结果产生非细菌兴趣蛋白质。理想的 是控制此整合基因表达的启动子是可以控制的(即可诱导的)，这样可以 使任何基因产物的毒性作用最小化。在外源基因表达后，可以纯化得 到的蛋白产物。纯化的方法依赖于外源蛋白的特性，这一点对本领域 技术人员是显而易见的。

参考下列实施例将更好地理解本发明，这些实施例的宗旨只是具体 地说明本发明。本发明的范围不受这些实施例的限制。

                   实施例

                  实施例1

          包含外源基因的染色体转化DNA

       在大肠杆菌菌株B1384染色体上的整合

图1系统地描述了包含外源基因的染色体转化DNA整合到大肠杆 菌染色体上的一般策略。构建两种质粒：pDM26432包含外源兴趣基 因(在此实施例中，为IGF-I融合基因)，缺乏可操作连接的细菌启动 子；pDM25423包含T7启动子。通过连接从这些载体中的每一个中 纯化的限制性片段，产生了缺乏复制起点的DNA环(即染色体转化 DNA)。此染色体转化DNA包含赋予氯霉素抗性的抗生素抗性基因 (CAM-r)和λ噬菌体的位点专一重组位点attP。将此染色体转化DNA 转化到细菌菌株(如大肠杆菌B1384)中(Mascarenhas等(1983)病毒学 124：100-108)(图2)，此菌株使整合酶(INT)在typ启动子的控制之下， 在通过向培养基中加入1mM吲哚-3-乙酸(IAA)的转化过程中可以诱 导此酶的产生。B1384在其染色体上也可以包含att P。整合酶识别染 色体转化DNA和B1384染色体上的att P位点，并催化它们的重组， 使染色体转化DNA在att P位点上位点专一性地整合在细菌染色体上 (WeisberE等广义病毒学vol.8，pp.197-258(Plenum，Fraenckel- Conrat和Wagner，编辑，New York，NY，1977)。以它们对氯霉素的抗 性为基础选择含有整合的DNA的细菌宿主。

如图3的概述，检测具有氯霉素抗性的染色体整合体。经采用下列 引物系统(如UBUF x IGFR，1243 x T7REV或者TRPPF x 1239)的 PCR通过扩增宿主染色体DNA确认整合的染色体转化DNA的存在。

IGFR：    5’...CCC ATC GAT GCA TTA AGC GGA TTT AGC

CGG TTT CAG...3’

#1239：   5’...GCC TGA CTG CGT TAG CAA TTT AAC TGT

GAT...3’

#1243：   5；...CTG GGC TGC TTC CTA ATG CAG GAG TCG

CAT...3’

#1227：   5’...TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA...3’

TRPPF：   5’...GAT CTG TTG ACA ATT AAT CAT CGA ACT

AGT TAA CTA GTA CGC AAG TT...3’

T7REV：   5’...TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG...3’

CYCF1：   5’...CAG GAT CCG ATC GTG GAG GAT GAT TAA

ATG GCG AAA GGG GAC CCG CAC...3’

CYCR1：   5’...CAG GAA GCT TAC GGC AGG ACT TTA GCG

GAA AG...3’

UBUF：    5’...GGG GCC GCG GTG GCA TGC AGA TTT TCG

TCA AGA CTT TGA...3 

用适当的限制性内切酶(分别为SacII，HinCII或者BamHI)消化扩 增的片段。通过琼脂糖凝胶电泳确定产物的大小。通过扩增下列物质 证实整合的序列的存在：

·染色体遍在蛋白和IGF序列，证实相关外源基因的存在；

·染色体tet和T7序列，证实T7启动子和所说的融合基因的并列； 和

·邻近的染色体trp和tet序列，证实染色体转化DNA在期望位点 的插入。 通过下列证据也证实了染色体转化DNA在染色体上的整合：

·细菌宿主对氯霉素的抗性；

·在DNA小量制备时没有质粒DNA；

·β-内酰胺酶活性的缺乏，确认没有亲本质粒(β-内酰胺酶使用生色

  底物7-噻吩基-2-乙酰氨基-3-2-4n，n-二甲基野芝麻花碱苯基偶氮吡

  啶姆甲基-3-头孢烯-4-羧酸(PADAC)测定，如酶抑制剂pp.169-

  177(Verlage Chemie，Broderick，V编辑)的描述)；和

·分离分析：37℃下将分离物在有或没有1mM IAA的L肉汤中

  生长过夜，并接种在LB琼脂平板上。检测每一种培养物中单菌落

  氯霉素抗性的保持情况。在没有IAA的培养物中观察到了100％

  的保持；在有IAA的培养物中观察到了11％的保持。 7个检测的分离物中有6个显示出期望的表型。

B1383不包含T7 RNA聚合酶的基因。为了检测染色体构建体的表 达，在6个携带整合DNA的菌株的每一个中制备P1裂解物，并将其 用于转导W3110DE3菌株以获得氯霉素抗性(细菌遗传学简明教程：实 验室手册和大肠杆菌及相关细菌的操作指南(冷泉港实验室出版社， Miller，J.H.编辑，1992))。W3110DE3菌株携带有在lac启动子控制之 下的T7 RNA聚合酶基因。其与B1384不同，也是Gal+。因此在含有 20Tg/ml氯霉素的半乳糖基本平板上选择转导体。纯化并进一步测定每 个转导体实验(独立的供体)中的单菌落。

在所有6个独立实验中所获得的结果是一致的：即已将染色体转化 DNA高效地转移到细菌染色体的新位点att位点(位于W3110DE3中的 原噬菌体的两侧)上。下列事实证实了此结论：

·氯霉素抗性；

·在DNA小量制备中没有质粒DNA；

·i21免疫性(DE3溶素原；将噬菌体裂解物用标准技术接种在细菌 菌苔上)；

·gal+(即在半乳糖基本平板上生长)；

·在lac控制之下表达IGF蛋白(如实施例1或共有未决美国专利申 请08/101,506(1993年8月2日申请)所述进行表达和分析)。

用BgIII和NcoI完全消化6个菌株(″整合体″)的染色体DNA，并 用标记的0.6kb DsbADNA探针检测消化的DNA的Southern印迹 (Bardwell等(1991)细胞：581-589；也参见Kamitani等(1992)EMBO J 11：57-62)。6个整合体的每一个都包含插入；印迹表明有几个双插 入、一个单插入和一个(分离物WB3-6)明显的重复双(三个)插入存在。

在用异丙基-J-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导后，检测6个整合体 的IGF融合蛋白的表达。用IPTG诱导这些细胞2小时，然后通过 12％SDSPAGE、Western印迹分离诱导的整合体的总细胞提取物、 以及不同大小的标记和IGF融合蛋白对照，并与多克隆抗IGF血清反 应(参见共有的未决美国申请08/101,506(1993年8月2日)的实施例 1)(图4)。分离物WB3-6(图4的6道)显示出IGF融合蛋白的高水平表 达。在考马斯蓝染色的凝胶上也可以见到同样大小的诱导带。

使用不同的二元系统产生携带卡那霉素抗性标记的染色体转化 DNA。附图中描述了所使用的质粒pDM25424和pDM25427。通过 PCR确定插入物的构型和位置，得出实质上与上面描述相同的结果。 在转导W3110DE3后，得到了几个个别的以由Western印迹很容易检 测出的水平表达IGF融合蛋白的分离物(图5)。所用的方法与上文描述 的用于氯霉素抗性分离物的方法相同，只是抗生素和抗性基因由卡那 霉素代替了氯霉素。纯化的融合蛋白作为对照。1道和2道包含两个 转导分离物的总细胞裂解物。

图10-13概述了用于这两个二元系统的载体的构建方法。所用的质 粒源是：pBR322，pUC18，pUC19，pKK233-2，ptRC99A， pCH110，pNEO(Pharmacia，piscataway，NJ)；pLG339HLY(Dr. Barry Holland，Institute de Génétiques et Microbiologie，Université Paris-Sud)；pRcCMV(Inviuogen，San Diego，CA)；pACYC177和 pACYC184(New Eneland BiaLabs，Beverly，MA)；pET3b(Studier和 Moffat(1986)分子生物学杂志189：113-130)；pYZ22070(在共有的未决 美国申请08/101,744(1993年8月2日)的实施例1中描述过)。

从B.Bachmann，ECGSC，耶鲁大学得到大肠杆菌K-12菌株 W3110。将其用如Studier和Moffat(1986)(分子生物学杂志189： 113-130)描述的DE3缺陷噬菌体溶源化。W3110DE3是这样的溶素 原。使用引物CYCF1和CYCR1从W3110通过聚合酶链式反应(PCR) 扩增所说的亲环蛋白(参见上文)。

                实施例2

      DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合基因的染色体表达

DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合基因是可装配的，将其整合到带有使 用双盒二元系统产生的染色体转化DNA的细菌宿主细胞的染色体上。 构建双盒二元系统载体的策略如图14所示。用双盒系统构建染色体转 化DNA(CTD)的一般策略如图7所示。产生携带DsbA∷遍在蛋 白∷IGF-I融合基因的染色体转化DNA所用的策略如图12所示。在染 色体整合后，表达融合基因，结果此蛋白以极高的水平积累。

双盒二元系统使用两种质粒pDM25470和pDM25465，如图7和 14所示。pDM25425是携带多拷贝的attP、T7启动子和单拷贝的 rrntl t2终止子的pUC19的衍生物，通过BglII/BamHI消化从pUC19 中切除1.6kb的片段。将终止子和编码DsbA的序列加入到 EcoRI(fill)/NsiI消化的pDM25459中，经连接形成pDM25470(双盒二 元系统之一)。另一个双盒质粒pDM25465携带终止子的两个拷贝、卡 那霉素抗性基因和亲环蛋白基因(共有未决美国专利申请08/101,506描 述了亲环蛋白基因有助于蛋白产生的用途，其全部内容本文一并参 考)。将亲环蛋白基因从pER15951(HinDIII(fill)/XbaI，0.6kb片段)克 隆到pDM25424(BamHI(fill)/XbaI，5.2kb片段；携带两个拷贝终止子 和卡那霉素抗性基因的pUC19骨架)。pDM25430中卡那霉素抗性基 因(来源于pDM25424)的有效性不够，因此用pLG339hly(PvuII/EcoRI 消化)的卡那霉素抗性基因代替，产生质粒pDM35443。通过将寡T7F 和T7R退火并将它们连接到EcoRI-消化的pDM25443中而将T7启 动子克隆到pDM25443中，产生pDM25465。

合成两组寡核苷酸(1，2，1R，2R和3，4，3R，4R)，将其磷酸化，变性 和退火。将编码遍在蛋白的1，2，1R和2R的退火产物连接到 pUC18(SphI-BamHI消化)上。将编码IGF-I的3，4，3R和4R的退火 产物连接到pUC18(EcoRI-BamHI消化)上。将所得的质粒转化到 JM109中，并在氨苄青霉素平板上选择转化的宿主细胞。分析转化体 中遍在蛋白和IGF-I序列的存在情况，然后测序以鉴定正确形成的构 建体。从每一个中选择一个分离物，分别命名为pPO39354和 pPO39334。 5’-CAG ATT TTC GTC AAG ACT TTG ACC GGT AAA ACC ATA ACA TTG GAA GTT GAA CCT TCC GAT ACC ATC GAG AAC GTT AAG GCG AAA ATT CAA GAC AAG GAA GGT ATC CCT CCA GAT CA-3’ 2 5’-ACA AAG ATT GAT CTT TCC CGG CAA GCA GCT AGA AGA CGG TAG AAC GCT GTC TGA TTA CAA CAT TCA GAA GGA GTC CAC CTT ACA TCT TGT GCT AAG GCT CCG CG-3’ 1R 5’-ATA CCT TCC TTG TCT TGA ATT TTC GCC TTA ACG TTC TCG ATG GTA TCG GAA GGT TCA ACT TCC AAT GTT ATG GTT TTA CCG GTC AAA GTC TTG ACG AAA ATC TGC ATG-3’ 2R 5’-GAT CCG CGG AGC CTT ACC ACA AGA TGT AAG GTG GAC TCC TTC TGA ATG TTG TAA TCA GAC AGC GTT CTA CCG TCT TCT AGC TGC TTG CCG GCA AAG ATC AAT CTT TGT TGA TCT GGA GGG-3’ 3 5’-GAT CCC CGC GGT GGT GGT CCG GAA ACC CTG TGC GGT GCT GAA CTG GTT GAC GCT CTT CAG TTC GTT TGC GGT GAC CGT GGT TTC TAC TTC AAC AAA CCG ACC GGT TAC GGT TCC TCC TCC CGT CGT GCT CCG CAG-3’ 5’-ACC GGT ATC GTT GAC GAA TGC TGC TTC CGG TCC TGC GAC CTG CGT CGT CTG GAA ATG TAC TGC GCT CCG CTG AAA CCG GCT AAA TCC GCT TAA TGC ATC GAT CTC GAG-3’ 3R 5’-AGC ACG ACG GGA GGA GGA ACC GTA ACC GGT CGG TTT GTT GAA GTA GAA ACC ACG GTC ACC GCA AAC GAA CTG AAG AGC GTC AAC CAG TTC AGC ACC GCA CAG GGT TTC CGG ACC ACC ACC GCG GG-3’ 4R 5’-AAT TCT CGA GAT CGA TGC ATT AAG CGG ATT TAG CCG GTT TCA GCG GAG CGC AGT ACA TTT CCA GAC GAC GCA GGT CGC AGG ACC GGA AGC AGC ATT CGT CAA CGA TAC CCG TCT GCG G-3’

从pPO39354和pPO39334中分离遍在蛋白和IGF-I序列(分别通过 SphI-SacII和SacII-NsiI消化)，并将其克隆到SphI-NsiI消化的 pDM25454(以pUC19为基础的质粒，携带编码DsbA的序列)中，以产 生命名为pPO39358的质粒，此质粒携带DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融 合基因。

将pPO39358的融合基因连接到双盒二元亲本载体pDM25470和 pDM25465中，以分别产生pPO39377和pPO41623。连接pPO39377 和pPO41623的EcoRI-XbaI片段形成所说的染色体转化DNA(图7)。

将所说的染色体转化DNA转化到含有attP位点以及在Trp启动子 控制之下的编码整合酶(INT)的序列的大肠杆菌菌株B1384。加入吲哚 -3-乙酸(1mM)以便诱导INT的表达，结果使转导的染色体转化DNA 整合。通过下列方法检测细胞中染色体转化DNA的整合：

用AmpScreen(BRL)通过蓝/黄筛选检测蓝/黄筛选细胞的整合的 DNA。进一步筛选带有蓝表型的克隆，弃掉黄色克隆。使用下列引物 对通过宿主细胞染色体DNA的扩增来检测PCR细胞正确整合的 DNA：

T7F1 5’-AAT TGT CGA CAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC AAC GGT TTC CCT GAA TTG TCG ACA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCA CAA CGG TTT CCC-3’

IGFREV 5’-CCC ATC GAT GCA TTA AGC GGA TTT AGC CGG TTT CAG-3’ 这些引物确认了所说的带有它的启动子的完全融合基因的存在，而

T7REV 5’-TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG-3’

TRPBR2 5’-AAG GGC TTC ATC ATC GGT AAT AGA GA-3’ 这些引物确认了所说的染色体转化DNA整合到B1384的att位点上。

整合基因的蛋白的产生需要在B1384中没有的T7 RNA聚合酶活 性。为了检测此整合基因的蛋白产生，使用B1384整合体产生P1裂解 物。然后用这些裂解物转导大肠杆菌菌株W3110DE3(如实施例1所 述)，这种菌株是Gal+并携带一个拷贝的在lac启动子控制之下T7 RNA 聚合酶基因。通过在含有10lg/ml卡那霉素的半乳糖基本培养基平板 上接种选择转化体。分离单一的kan+/Gal+菌落，并在带有卡那霉素的 半乳糖基本培养基平板上进行再选择。使用下列引物对通过PCR进一 步分析kan+/Gal+菌落：

ATT3 5’-GAG GTA CCA GCG CGG TTT GAT CAG-3′

T7RNAP1 5’-CAG CGT TAT CCG CAA CCT CAC-3’ 所得的结果表明W3110DE3中在原噬菌体两侧的上游att位点没有被 占据；和

T7F1 5’-AAT TGT CGA CAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC AAC GGT TTC CCT GAA TTG TCG ACA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCA CAA CGG TIT CCC TG-3’

IGFREV 5’-CCC ATC GAT GCA TTA AGC GGA TTT AGC CGG TTT CAG-3’ 所得的结果确认完整地转移了融合基因表达盒。

通过将W3110DE3转导中的各个分离物和需要T7 RNA聚合酶活 性以裂解细菌的噬菌体4107(Novagen)划线培养来检测这些分离物的 T7 RNA聚合酶活性。使用包含完整融合基因表达盒且T7 RNA聚合 酶活性为阳性的命名为c49222的分离物检测蛋白的产生。在12.5％的 丙烯酰胺凝胶上通过总细胞裂解物的SDS-PAGE分析蛋白的产生。 SDS-PAGE凝胶的光密度分析显示出DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合蛋 白的积累达总细胞蛋白的22.3％。

也使用P1裂解物将所说的整合基因转导到大肠杆菌菌株 cDM46809(其是cam’，malE缺失，并包含导入到lac区的attB位点) 中。通过在含有卡那霉素和氯霉素的平板上生长选择转导体。使用下 列引物对通过PCR确认在lac区的整合：

UBI1 5’-CAG ATT TTC GTC AAG ACT TTG ACC GGT AAA ACC ATA ACA TTG GAA GTT GAA CCT TCC GAT ACC ATC GAG AAC GTT AAG GCG AAA ATT CAA GAC AAG GAA GGT ATC CCT CCA GAT CA-3′

1224 5’-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’

从为kanr/camr且整合到lac区的分离物中产生P1裂解物。此P1 用于转导W3110DE3。通过在选择培养基上生长选择对卡那霉素和氯 霉素抗性。通过与如上所述的噬菌体4107划线培养来检测kanr/camr 分离物的T7 RNA聚合酶活性。经IPTG诱导2个小时后，检测T7 RNA 聚合酶活性为阳性的命名为c49258#46和c49258#50的两个分离物的 蛋白积累情况。在12.5％的丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分析总细 胞裂解物。在c49222#46中DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合蛋白的积累达 总细胞蛋白的19.6％，这一点是通过SDS-PAGE凝胶的光密度分析确 定的。

进行c49222和c49258#46的染色体DNA的Southern印迹分析以 测定所说的整合的DNA的拷贝数。分离c49222和c49258#46的染色 体DNA，用限制性核酸内切酶消化，转移到Hybond-N(Amersham) 上，并用编码所说的融合蛋白的遍在蛋白和IGF-I部分的DNA片段检 测。Southern印迹显示出整合到染色体c49222和c49258#46上的每 一个DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I基因大约有2个拷贝(图24)，即单拷贝的 整合的DNA。考虑到SDS-PAGE所示的DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I蛋白 的积累水平(分别为总细胞蛋白的22.3％和19.6％)，这一结果是令人惊 奇的和出人意料的。一般来说，这种高水平的蛋白积累仅能通过高拷 贝数的质粒携带的异源基因的表达来完成。

通过整合除了携带卡那霉素抗性基因外还携带四环素抗性基因的 染色体转化DNA也能产生DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I。使用由B1384 整合体制备的P1裂解物转导W3110DE3以产生卡那霉素抗性(参见实 施例1)。使用如上所述的引物对T7F1×IGFREV和ATT3×T7RNAP1 检测Kanr分离物正确整合的DNA。通过与如上所述的噬菌体4107划 线培养来检测分离物的T7 RNA聚合酶活性。然后通过在含有卡那霉 素(10μg/ml)和四环素(30μg/ml)的培养基上生长来选择T7 RNA聚合酶 活性为阳性的分离物的整合的DNA的扩增。结合到此构建体中的四环 素等位基因在高拷贝数时是有效的，因此四环素抗性克隆可以扩增所 说的整合的DNA。如上所述经IPTG诱导，检测Kanr/tetr克隆的蛋白 积累情况。所有的Kanr/tetr克隆在诱导后都产生所说的融合蛋白。

                      实施例3

            遍在蛋白水解酶(UBP-1)的染色体表达

图10-16描述了在此实施例所用的质粒的构建方法。pJT70是遍在 蛋白水解酶的来源。pDM25493是此构建体中所用的trp启动子的来 源。从pDM46813、pDM25472或者pDM25448制备在trp启动子控 制之下的酵母UBP-1基因的染色体转化DNA。在此实施例中使用 pDM25472(即图16的染色体转化DNA#1)。经此染色体转化DNA形 成的融合基因编码在截断的DsbA基因和失去氨基末端92个密码子的 UBP-1cDNA之间的符合读框的融合。

如实施例2中的描述将所说的染色体转化DNA转入到B1384中。 用卡那霉素(10μg/ml)选择整合体。使用引物TRPPF和1239在诊断 PCR反应中检测分离的克隆(如实施例1所述)。通过此检验，所有的 克隆都是阳性的。所有的分离物对氨苄青霉素也是敏感的。

选择一个克隆进一步确定其性质。制备此分离物的P1裂解物，并 如实施例1所述用于转导W3110DE3以获得卡那霉素抗性。如实施例 2所述使用引物ATT3和T7RNAP1通过PCR进一步检测卡那霉素抗 性克隆。所有的分离物都显示出预料的位置在位于DE3溶素原两侧的 attB/P或attP/B位点上。

通过检测遍在蛋白水解酶活性检测所说的分离物的蛋白的表达。将 分离物培养在酪蛋氨基酸基本培养基中，收获，并通过超声处理裂解。 通过在37℃下与DsbA∷遍在蛋白∷IGF-I融合蛋白底物温育1小时分 析可溶部分的活性。经SDS-PAGE监测切割情况。所有的分离物 (WBD311，312，313，314，331和333)都显示出很好的酶活性(即在测定 条件下该底物完全切割)。

                      实施例4

   胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)融合蛋白的表达

使用双盒方法产生携带融合蛋白的染色体转化DNA，所说的融合 蛋白包含DsbA、含有人类鼻病毒2A蛋白酶位点的接头、IGFBP- 3(DsbA∷2A∷IGFBP-3)。如如18所示构建所说的融合蛋白和染色体转 化DNA。DsbA来自pDM46905，通过将引物2ATA和V2ATB退火 产生2A蛋白酶位点，使用引物BP3RZ和NBP3F从pYZ42580 PCR 扩增IGFBP-3。

通过将多个合成的寡核苷酸退火并连接而产生用于制备 DsbA∷2A∷IGFBP-3融合物的IGFBP-3基因，当其完全装配时编码 IGFBP-3蛋白。在三个部分(5’，3’和中部)装配所说的寡核苷酸。使下 列寡核苷酸退火并连接以形成IGFBP-3的5’部分：

F1-1 5’-AGC TTG GTG CTT CTT CTG CTG GTC TTG GAC CAG

TTG TTC GTT GTG AAC CAT GTG ATG CAC GAG CTT TAG CTC

AAT GTG CTC CAC CAC CAG CTG TT-3’，

F1-2 5’-TGT GCT GAA TTA GTT CGA GAA CCA GGT TGT GGT

TGT TGT TTA ACT TGT GCT TTA TCT GAA GGT CAA CCA TGT

GGT ATT TAT ACT GAA CGT TGC GG-3’，

F1-3 5’-TAG TGG TTT GCG TTG TCA ACC AAG CCC AGA TGA

AGC TAG GCC TTT ACA AGC ATT ATT AGA TGG TCG AGG TCT

GTG TGT TAA TGC GTC CGC TGT TTC TCG ATT GCG CGC G-3’，

C1-1 5’-TCG ACG CGC GCA ATC GAG AAA CAG CGG ACG CAT

TAA CAC ACA GAC CTC GAC CAT CTA ATA ATG CTT GTA AAG

GCC TAG CTT CAT CTG GGC TTG GTT G-3’，

C1-2 5’-ACA ACG CAA ACC ACT ACC GCA ACG TTC AGT ATA

AAT ACC ACA TGG TTG ACC TTC AGA TAA AGC ACA AGT TAA

ACA ACA ACC ACA ACC TGG TTC TC-3’，

和C1-3 5’-GAA CTA ATT CAG CAC AAA CAG CTG GTG GTG GAG

  CAC ATT GAG CTA AAG CTC GTG CAT CAC ATG GTT CAC AAC      

  CAA CAA CTG GTC CAA GAC CAG CAG AAG AAG CAC C-3’ 然后将其克隆到pUC18(HinDIII-SalI消化)中；此构建体命名为 pYZ37437。通过使下列寡核苷酸退火并连接产生此基因的3’部分：

F-1 5’-TCG ACG TGA GAT GGA GGA TAC CTT AAA CCA TTT

AAA ATT TTT GAA CGT TTT ATC CCC GCG TGG CGT TCA TAT

CCC GAA TTG CGA T-3’，

F-2 5’AAA AAA GGC TTC TAC AAA AAG AAA CAA TGC CGT

CCG AGT AAG GGT CGT AAA CGA GGT TTT TGT TGG TGC GTT

GAC AAA TAC GGT-3’，

F-3 5’-CAA CCG TTG CCG GGT TAT ACT ACT AAA GGC AAA

GAA GAT GTT CAT TGT TAT TCT ATG CAA TCT AAA TAA TGC

ATC TCG AG-3’，

C-1 5’-AAT TCT CGA GAT GCA TTA TTT AGA TTG CAT AGA

ATA ACA ATG AAC ATC TTC TTT GCC TTT AGT AGT ATA ACC

CGG C-3’，

C-2 5’-AAC GGT TGA CCG TAT TTG TCA ACG CAC CAA CAA

AAA CCT CGT TTA CGA CCC TTA CTC GGA CGG CAT TGT TTC

TTT TTG TAG AAG-3’，

和

C-3 5’-CCT TTT TTA TCG CAA TTC GGG ATA TGA ACG CCA

CGC GGG GAT AAA ACG TTC AAA AAT TTT AAA TGG TTT AAG

GTA TCC TCC ATC TCA CG-3’， 之后将其克隆到SalI-EcoRI消化的pUC18(命名为pYZ37405)中。 pYZ374100包含IGFBP-3基因的中间部分，其是通过下列过程产生 的，即将下列寡核苷酸退火并连接。

MF1 5’-CGC GCT TAT TTA TTA CCT GCC CCA CCG GCA CCG

GGT AAC GCC TCC GAA A-3’，

MF2 5’-GCG AAG AGG ATC GTT CTG CGG GTT CCG TTG AAT

CTC CAA GTG TGA GTT CTA CCC ATC GAG TTA GCG ACC CGA

AA-3’，

MF3 5’-TTT CAT CCG TTG CAC TCT AAA ATC ATT ATT ATT

AAA AAG GGT CAC GCA AAG GAT TCT CAA CGT TAT AAG

GT-3’，

MF4 5’-GGA TTA TGA AAG CCA ATC TAC CGA CAC TCA AAA

TTT TAG TAG TGA AAG TAA ACG TGA AAC CGA GTA CGG CCC

GTG-3’，

MB1 5’-TCG ACA CGG GCC GTA CTC GGT TTC ACG TTT ACT

TTC ACT ACT AA-3’，

MB2 5’-AAT TTT GAG TGT CGG TAG ATT GGC TTT CAT AAT

CCA CCT TAT AAC GTT GAG AAT CCT TTG CGT GAC CCT TTT

T-3’，

  MB3 5’-AAT AAT AAT GAT TTT AGA GTG CAA CGG ATG AAA

  TTT CGG GTC GCT AAC TCG ATG GGT AGA ACT CAC ACT TGG

  AGA TT-3’

和

  MB4 5’-CAA CGG AAC CCG CAG AAC GAT CCT CTT CGC TTT

  CGG AGG CGT TAC CCG GTG CCG GTG GGG CAG GTA ATA

  AAT AAG-3’，

用BssHII和SalI消化连接的DNA，用Klenow填补，然后克隆到 Klenow填补的XbaI消化的pUC18中：使用pYZ37490片段的PCR 扩增来加入SacII位点并修复克隆的人工产物。使用下列引物对引入限 制性位点并修复错误：

pF1 5’-GGT TGT TGT TTA ACT TGT GCT TTA TCT GAA GGT

CAA CCA TGT GGT ATT TAT ACT GAA CGT TGC GGT AGT GGT

TTG CGT TGT CAA CCA AGC CCA GAT GAA GCT AGG-3’

1233 5’-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3’ 和

pR1 5’-TAA AGC ACA AGT TAA ACA ACA ACC ACA ACC TGG

TTC TCG AAC TAA TTC AGC ACA AAC AGC TGG TGG TGG AGC

ACA TTG AGC TAA AGC TCG TGC ATC ACA TGG T-3’

1224 5’-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’ 然后将两个PCR扩增的片段混合并使用引物对1233和1224扩增形成 单一DNA。将所得的DNA片段克隆到HinDIII-SalI消化的pYZ37437 中，产生pYZ37490。

也使用PCR扩增引入另外的SaclI位点，以便有利于下面的克隆 步骤。使用下列引物扩增pYZ37490片段：

5pMP 5’-GAC TGC AAG CTT CCG CGG TGG TGG TGC TTC TTC TGC

TGG TCT TGG A-3’和

1233 5’-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3’ 然后将pYZ37490片段连接到HinDIII-SalI消化的pYZ37490上，形 成pYZ42519。

在三种途径的连接反应中从所说的三种片段装配IGFBP-3基因。 将pYZ42519(HinDIII-BssHII消化)、pYZ374100(BssHII-SalI消化) 和pYZ37405(SalI-EcoRI消化)连接到HinDIII-EcoRI消化的pUC18 上。通过作图和测序反应确定正确装配的克隆。

使用PCR修复克隆错误。使用下列引物通过扩增pYZ42509，并 将得到的片段(BssHII-SalI消化)克隆到BssHII-SalI消化的pYZ42509 中而产生BPFIX1：

YZMI 5’-CTC GAT TGC GCG CTT ATT TAT TAC-3’和

YZM2 5’-TCT CAC GTC GAC ACG GGC CGT ACT CGG TTT CAC GTT TAC TCA GTA CTA AAA-3’ 将HinDIII-BssHII消化的BPFIX1与HinDIII-BssHII消化的 pYZ42519连接，产生pYZ42529。使用下列引物对完成第二次修复：

715F1’5’-TGT TGG TGC GTC GAC AAA TAC GGT-3’

1233 5’-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3’和

715R’5’-GAC CGT ATT TGT CGA CGC ACC AAC A-3’

1224 5’-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’

这样修复了一个克隆的错误并加入一个SalI位点。使用引物对 715F1’×1233和715R’×1224从pYZ42529扩增两个DNA片段。将这 两个片段混合，并使用1233×1224通过PCR扩增成单一的DNA片 段。用BssHI和SalI消化这一单一的片段，然后将其连接到BssHI-SalI 消化的pYZ42529，产生pYZ50559。

通过连接pYZ50559和pDM25497的EcoRI-SacII片段产生 IGFBP-3基因的供体构建体pYZ42580。

将携带DsbA∷2A∷IGFBp-3融合基因的染色体转化DNA转染到 大肠杆菌B1384中，将此菌株在含有100mM IAA的培养基中培养， 以诱导INT的表达和所说的染色体转化DNA的整合。用卡那霉素选 择整合体。所有的分离物对氨苄青霉素也是敏感的。

通过宿主细胞染色体的诊断PCR扩增进一步定性分离物。使用下 列引物对的PCR扩增确认完整染色体转化DNA在att位点上正确地整 合到所说的染色体上：

1227 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3’

BP3-607 5’-GGG ATA TGA ACG CCA CGC GGG GAT AA-3’，

INT107 5’-GCG GAG AAA CCA TAA TTG CAT CTA CTC-3’

BP3-559 5’-CGT GAA ACC GAG TAC GGC CCG TGT C-3’

T7REV 5’-TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG-3’

TRPBR2 5’-AAG GGC TTC ATC ATC GGT AAT AGA CA-3’

从单一分离物制备P1裂解物，并将其用于转导W3110DE3以获得 卡那霉素抗性(如实施例1所述)。如实施例2所述通过与噬菌体4107 划线培养测定卡那霉素抗性分离物的T7 RNA聚合酶活性。通过IPTG 诱导，检测具有T7 RNA聚合酶活性的分离物此融合基因的表达情况， 之后在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上通过总细胞裂解物的SDS-PAGE分析 蛋白的表达情况。总细胞裂解物的光密度分析表明 DsbA∷2A∷IGFBP-3融合蛋白的积累至22.6％(图25A)。

                实施例5

          IGF-I融合蛋白的产生

使用双盒二元系统产生包含由含有人类鼻病毒2A或3C蛋白酶之 位点的序列连接的DsbA和IGF-I的融合蛋白。图19和20以图表的 形式说明了二元质粒和染色体转化DNA的构建。

为了表达DsbA∷2A∷IGF-I，连接EcoRI/Xbal消化的pPO53096 和pPO57211片段以形成染色体转化DNA(CTD-DsbA∷2A∷IGF-I)。 连接pPO53097和pPO57210的EcoRI/XbaI片段以形成携带编码 DsbA∷3C∷IGF-I(CTD-DsbA∷3C∷IGF-I)的染色体转化DNA。在吲哚 -3-乙酸(诱导INT的表达)存在的情况下，将CTD-DsbA∷3C∷IGF-1和 CTD-DsbA∷2A∷IGF-I分别转化到B1384中。将转化体培养在含有卡 那霉素的培养基中以选择整合体。检测每个转化体的9个单个的kanr 菌落的氨苄青霉素敏感性。所有检测的菌落对氨苄青霉素都是敏感 的。

如实施例2所述，通过使用引物对T7F1×IGFREV和T7REV× TRPBR2的PCR扩增检测正确整合之DNA的分离物，以确认完整融 合基因的存在和B1384的att位点上的整合。

从每个转化体的一个B1384整合体制备P1裂解物，并用于转导 W3110DE3以获得卡那霉素抗性。如实施例2所述检测Kanr/gal+分离 物的T7 RNA聚合酶活性的存在情况。如实施例2所述使用引物对 T7F1×IGFREV和ATT3×T7RNAP1通过PCR进一步检测T7 RNA 聚合酶活性，以确认所说的完整融合基因的合适整合。

然后在含有卡那霉素和四环素的培养基上培养每次转导的两个分 离物(DsbA∷2A∷IGF-I的c57265#44和c57265#54；DsbA∷3C∷IGF-I 的c57264#5和c57264#28)。DsbA∷3C∷IGF-I和DsbA∷2A∷IGF-I都 携带赋予抗性的四环素抗性等位基因(当所说的基因以高拷贝数存在 时)。在四环素存在的情况下选择所说的整合的DNA的扩增。每次转 化的两个分离物都是Kanr/tetr。通过IPTG诱导后，检测这些分离物 的所说的融合蛋白的表达。通过总细胞裂解物的SDS-PAGE测定蛋白 的表达。SDS-PAGE凝胶的光密度扫描显示出表达DsbA∷3C∷IGF-I 融合蛋白的两个分离物积累所说的融合蛋白达总细胞蛋白的20％和 20.1％，另外表达DsbA∷2A∷IGF-I的两个分离物积累所说的融合蛋白 达总细胞蛋白的25.7％和38％。

                      实施例6

          使用双盒二元系统染色体表达TGF-β2

使用双盒方法产生编码包含DsbA、遍在蛋白和人类TGF-J2的融 合蛋白(DsbA∷遍在蛋白∷TGF-β2)的染色体转化DNA。此融合基因和 染色体转化DNA的构建如图21所示。DsbA∷遍在蛋白来自于 pDM25497，使用下列引物从pPC21(Madisen(1988)DNA7：1-8)等经 PCR扩增产生TGF-J2：

UBTGFJ2F 5’-GGG GCC GCG GTG GTG CTT TGG ATG CGG CCT ATT GCT TTA GA-3’和

TGFJ2R 5’-GGG GAA TTC TTA GCT GCA TTT GCA AGA CTT TAC A-3’。

用SacII-EcoRI消化pDM25497，并分离含有4.3kb片段的pUC18 和DsbA∷遍在蛋白序列。纯化由扩增编码人类TGF-J2最后的112个 氨基酸的pPC-21得到的0.35kb PCR产物，并用SacII-EcoRI消 化。将这两个片段连接产生pDP26，一种包含DsbA∷遍在蛋 白∷TGF-J2融合基因的pUC18衍生物。pDP26是装备用于产生所说 的染色体转化DNA的二元质粒的供体构建体。

将pDP26的融合基因连接到双盒二元载体pDM25470和 pDM25465，分别产生pC9DP和pA6DP。简言之，用BamHI-SmaI 消化PDM25470，并分离4.2kb片段。用EcoRI消化pDP26，以DNA 聚合酶的Klenow片段补齐平端，然后用BamHI消化。连接此消化中 得到的1.1kb片段。连接上述的两个片段产生pC9DP。

用BamHI消化pDM25465，以Klenow补齐平端，用XbaI消化， 并分离7.1kb的片段。用EcoRI消化pDP26。以Klenow片段补齐平 端，用BamHI消化，分离所说的1.2kb片段。将此1.2kb片段连接到 pDM25465的7.1kb片段上产生pA6DP。

使用从XbaI-XhoI消化的pDM4693中分离的7.2kb片段和pA6DP 的融合基因(2.7kb的XbaI-XhoI片段)产生另一个包含四环素抗性选择 标记的二元质粒。将这两个片段连接产pA6DPIIT。连接pC9DP的 XcoRI-XhaI片段(2.2kb)和pA6DPIIT的XcoRI-XhaI片段(6.4kb)以产 生所说染色体转化DNA(图21)。

用所说的染色体转化DNA转化大肠杆菌菌株B1384，将此菌株在 500μm IAA存在的情况下培养以便诱导INT的表达和所说的染色体转 化DNA的整合。以10μg/ml卡那霉素选择整合体。发现所有的分离物 对卡那霉素都是敏感的。

通过宿主染色体DNA的诊断PCR扩增进一步定性分离物。使用下 列引物对及前面描述过的引物T7REV和TRPBR2(参见实施例2)的 PCR扩增确认所说的完整染色体转化DNA在att位点上正确地整合到 所说的染色体上：

1127 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3’

β21079 5’-GGA AAT GGA TAC ACG AAC CC-3’，和

INT107 5’-GCG GAG AAA CCA TAA TTG CAT CTA CTC-3’

6HEβ2 5’-GGG GGA TCC GAT CGT GGA GGA TGA TTA AAT GCA

CCA CCA ccA ccA ccA CGA CGA CGA CAA AGC TTT GGA

TGC GGC CTA T-3’

从单一分离物制备P1裂解物，并将其用于转导W3110DE3以获得 卡那霉素抗性(如上所述)。通过在包含卡那霉素和四环素(30μg/ml)的培 养基上培养卡那霉素抗性分离物而完成整合的融合基因的扩增。如实 施例2所述通过与噬菌体4107划线培养测定卡那霉素抗性分离物的T7 RNA聚合酶活性。通过IPTG诱导就融合基因的表达检测具有T7 RNA 聚合酶活性的分离物，之后在10％聚丙烯酰胺凝胶上通过总细胞裂解 物的SDS-PAGE分析蛋白的表达(图26)。将染色体整合体的蛋白积累 情况与包含多拷贝数质粒(使用同样的连接到编码DsbA∷遍在蛋 白∷TGF-P2融合蛋白的一个拷贝基因上的T7启动子)的宿主细胞中所 见到的蛋白积累水平比较。光密度分析表明染色体整合体的蛋白积累 高达总细胞蛋白的36.7％。

                    实施例7

          使用无启动子的CTD表达异源蛋白

此实施例显示出不携带启动子的染色体转化DNA的用途。所说的 染色体转化DNA携带与符合读框地连接到编码异源兴趣蛋白质(为实 施例5的DsbA∷3C∷IGF-I融合蛋白)之DNA序列上的细菌基因(在此 实施例中是lacZ或者DsbA)同源的DNA片段和选择标记基因。所说 的同源DNA编码此细菌基因的5’区。用所说的染色体转化DNA转导 该宿主细胞，该DNA整合到宿主细胞染色体的同源基因上，在此同源 基因的启动子和编码异源兴趣蛋白质的DNA序列间形成可操作地连 接。使用此染色体转化DNA携带的选择标记选择整合体。经此同源基 因启动子表达所说的异源兴趣蛋白质(图8)。

如实施例5所述构建编码DNA∷3C∷IGF-I融合蛋白的DNA。然 后将此融合基因符合读框地插入到编码lacZ基因氨基末端的前100个 氨基酸的DNA片段中，形成lacZ/DsbA∷3C∷IGF-I基因。也将在实施 例5中使用的亲环蛋白、卡那霉素抗性和四环素抗性基因克隆到携带 lacZ/DsbA∷3C∷IGF-I基因的质粒中。然后用限制性核酸内切酶切割 此质粒以除去此质粒的复制起点、氨苄青霉素抗性基因和其它的非必 需序列，然后再连接形成环形的染色体转化DNA。用此染色体转化 DNA转化大肠杆菌宿主细胞，并将转化的宿主细胞在包含卡那霉素 (10μg/ml)的培养基上培养。检验卡那霉素抗性分离物的氨苄青霉素活 性，表明此宿主细胞携带整合的DNA，而不是质粒DNA。使用PCR 也检测了Kanr分离物。使用lacZ启动子和编码DsbA之DNA序列的 PCR引物确认完整染色体转化DNA的整合。通过在含有卡那霉素和 四环素(30μg/ml)的培养基上培养kanr分离物来选择此整合的融合基因 的扩增。通过在IPTG存在下培养kanr/tetr分离物来诱导所说的整合 的融合基因的表达。通过SDS-PAGE测定蛋白的表达。

也可以将没有启动子的染色体转化DNA整合到宿主细胞染色体的 其它位点上(图9)。可以构建特定的携带连接到特定基因(这里所说的是 DsbA)上的诱导型启动子的一个染色体拷贝(这里所说的是T7启动子) 的宿主细胞。此宿主细胞是通过用变异的染色体转化DNA(携带lacZ 基因的一个拷贝、可操作地连接到DsbA基因的5’端的T7启动子和氯 霉素抗性基因)转化所说的宿主细胞(这里所说的是也携带编码T7 RNA 聚合酶之基因的一个拷贝的W3110DE3)。通过在含有氯霉素的培养基 中培养转化的W3110DE3选择此染色体转化DNA的整合。此染色体 转化DNA的整合产生包含连接到DsbA基因5’部分的T7启动子的 W3110DE3宿主细胞。然后此整合的DNA在携带编码异源兴趣蛋白质 之DNA序列的染色体转化DNA的整合中成为靶。

构建携带编码异源兴趣蛋白质之DNA序列的染色体转化DNA(这 里所说的是上文及实施例5描述的DsbA∷3C∷IGF-I融合基因)。将亲 环蛋白、卡那霉素抗性和四环素抗性基因也克隆到此质粒中。然后用 合适的限制性酶切割此质粒以便除去此质粒的复制起点、氨苄青霉素 抗性基因和其它非必需序列，再连接以形成环形的染色体转化DNA。 用此染色体转化DNA转化上述的T7-DsbA W3110DE3宿主细胞。通 过在含有氯霉素和卡那霉素的培养基中生长选择整合体。通过PCR检 测Kanr/camr分离物中完整的此染色体转化DNA的整合。使用引物对 T7F1×IGFREV的宿主细胞染色体DNA的PCR扩增确认了所说的 完整染色体转化DNA的整合。如实施例2所述通过与噬菌体4107划 线培养来检测整合体的T7 RNA聚合酶活性。通过在含有卡那霉素、 氯霉素和四环素的培养基中培养T7 RNA聚合酶阳性菌落选择整合的 DNA的扩增。通过用IPTG诱导后，测定抗性分离物的蛋白质表达。 通过SDS-PAGE测定蛋白质表达。

                    实施例8

      使用双盒系统表达DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白

如图7所示使用双盒系统表达编码DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白 的基因。DsbA序列最初是通过大肠杆菌染色体的DsbA基因的PCR 扩增分离的；质粒pDM25454用作此融合基因的DsbA序列源。通过 合成下列两个寡核苷酸产生3C蛋白酶的位点。

RV3CTA 5’-CCCGATTCTCTGGAAGTTCTGTTCCAA-3’和

RV3CTB 5’-TTGGAACAGAACTTCCAGAGAATCGGGCATG- 3’ 这两个寡核苷酸退火形成编码3C蛋白酶切割位点的双链DNA片段。 如实施例4所述通过退火和连接合成的寡核苷酸构建IGFBP-3基因。 用于构建编码DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白之基因的IGFBP-3序列是 使用引物BP3RZ和NBP3F和模板pYZ42580产生的PCR扩增的 DNA片段。用于产生携带编码DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白之基因的 染色体转化DNA的两个DNA源(pDM46947和pDM46948)的克隆如 图22所示。

使用EcoRI/XbaI片段从pDM46947和pDM46948构建所说的染色 体转化DNA。用此染色体转化DNA转化生长在吲哚-3-乙酸(以便诱导 INT的表达)中的B1384。通过在含有卡那霉素的培养基中培养转化体 来选择整合体。所有的卡那霉素抗性分离物对氨苄青霉素敏感也都是 敏感的。如实施例4所述，通过使用引物对1227×BP3-607、INT107 ×BP3-559和T7REV×TRPBR2的PCR检测卡那霉素抗性菌落。

从一个卡那霉素抗性菌落中制备P1裂解物，并用其转导 W3110DE3以获得卡那霉素抗性。如实施例2所述通过与噬菌体4107 划线培养测定卡那霉素抗性转化体的T7 RNA聚合酶活性的存在情 况。通过在含有卡那霉素和四环素的培养基上培养选择卡那霉素抗性 /T7 RNA聚合酶阳性分离物的染色体扩增。选择一个kanr/tetr分离物 并通过IPTG诱导检测蛋白质的表达。通过SDS-PAGE测定蛋白质的 积累情况(图25B)。SDS-PAGE凝胶的光密度分析表明 DsbA∷3C∷IGFBP-3融合蛋白的积累量平均为总细胞蛋白的27.4％。

此说明书引用的所有出版物、专利和专利申请本文以同样的程度一 并参考，好象本文所参考的每一个出版物、专利或专利申请都特定和 个别指明的那样。

很明显，本领域的一般技术人员应该能够推测在上述描述范围内的 此发明的等同部分。这些等同部分将包括在本发明的范围内。

权利要求书

按照条约第19条的修改

1.一种产生异源兴趣蛋白质的方法，该方法包括下列步骤：

将染色体转化DNA转移到细菌宿主细胞中，其中所说的染色体转 化DNA包含至少编码异源兴趣蛋白质基因的一个拷贝和选择标记，其 中所说的宿主细胞包含染色体；

对所说的染色体转化DNA整合到所说的宿主染色体进行选择，形 成的宿主细胞染色体包含编码异源兴趣蛋白质的基因和侧翼于重复 DNA的选择标记，所说的基因可操作地连接到在宿主细胞中有功能的 启动子上；和

表达所说的基因，其中所说的基因在构建转化DNA的过程中，决 不可操作地连接到宿主细胞的多拷贝质粒载体的功能性启动子上，其 中所说的异源兴趣蛋白质在所说的宿主细胞中积累水平超过总细胞蛋 白的0.1％。

2.权利要求1的方法，其中所说的染色体转化DNA还包含所说的 在宿主细胞中有功能的启动子，所说的启动子可操作地连接到编码异 源兴趣蛋白质的基因上，并且其中所说的可操作的连接是由染色体转 化DNA的环化而产生的。

3.权利要求1的方法，其中所说的宿主细胞染色体还包含宿主细胞 启动子，所说的染色体转化DNA还包含与所说的宿主细胞启动子下游 的宿主细胞染色体片段同源的DNA序列，所说的DNA序列符合读框 地连接到所说的编码异源兴趣蛋白质的基因上，其中所说的染色体转 化DNA的整合导致在所说的DNA序列与此宿主细胞的启动子之间合 适的连接的形成。

4.权利要求1的方法，其中所说的异源兴趣蛋白质在所说的宿主细 胞中的积累水平超过总细胞蛋白的1％。

5.权利要求1的方法，其中所说的异源兴趣蛋白质是真核蛋白质。

6.权利要求1的方法，其中所说的异源兴趣蛋白质是哺乳动物蛋白 质。

7.权利要求1的方法，其中所说的重复DNA包含所说的连接到所 说的启动子上的编码异源兴趣蛋白质的基因。

8.权利要求1的方法，该方法还包括在所说的染色体转化DNA整 合到所说的宿主细胞的染色体上后，对所说的染色体转化DNA的染色 体扩增进行选择。

9.一种产生染色体转化DNA的方法，该方法包括：将各个第一质 粒载体的限制性片段与第二质粒载体连接，进而产生所说的染色体转 化DNA，所说的第一载体包含缺乏可操作连接的启动子的编码异源兴 趣蛋白质的基因，所说的第二载体包含在宿主细胞中有功能的启动 子，其中所说的染色体转化DNA包含选择标记、所说的可操作地连接 到所说的启动子上的编码异源兴趣蛋白质的基因、侧翼于此基因的重 复DNA，并在所说的宿主细胞中缺乏合适的复制起点。

10.一种产生染色体转化DNA的方法，该方法包括：将各个第一 质粒载体的限制性片段与第二质粒载体连接，进而产生所说的染色体 转化DNA，所说的第一质粒包含编码异源兴趣蛋白质的第一基因和在 宿主细胞中有功能的第一启动子，并且其中所说的第一基因没有与第 一启动子可操作地连接，所说的第二载体包含编码异源兴趣蛋白质的 缺乏可操作地连接的启动子的第二基因和在宿主细胞中有功能的第二 启动子，其中所说的染色体转化DNA包含选择标记，但在所说的宿主 细胞中没有合适的复制起点，并且所说的第一基因与染色体转化DNA 的第二启动子可操作地连接，所说的第二基因与染色体转化DNA的第 一启动子可操作地连接。

11.一种染色体转化DNA，该DNA包含：可操作地连接到在宿主 细胞中有功能的启动子上的编码异源兴趣蛋白质的基因和选择标记， 所说的选择标记侧翼于重复DNA；其中所说的编码异源兴趣蛋白质的 基因决不可操作地连接到在宿主细胞中有功能的多拷贝的质粒载体的 启动子上。

12.一种染色体转化DNA，该DNA包含：编码异源兴趣蛋白质的 基因的两个拷贝和选择标记，其中的每一个拷贝都可操作地连接到在 宿主细胞中有功能的启动子上；所说的选择标记侧翼于所说的编码异 源兴趣蛋白质的基因的拷贝；所说的基因的每一个拷贝决不可操作地 连接到在宿主细胞中有功能的多拷贝的质粒载体的启动子上。