一种CSF-1R报告基因细胞株及其制备方法和应用
阅读：562发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种CSF-1R报告基因细胞株及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种CSF-1R报告基因细胞株及其构建方法和应用，所述报告基因细胞株包括NFκB报告基因质粒；所述NFκB报告基因质粒上包括 荧光 素酶报告基因；所述报告基因细胞株还包括CSF-1R表达质粒。本发明的报告基因细胞株，在细胞膜上表达人源CSF-1R，胞内表达响应NFκB 信号 的荧光素酶，CSF-1/IL-34能够剂量依赖地特异性激活报告基因细胞株的荧光素酶的表达，同时靶向CSF-1R的 抗体 药物能够阻断CSF-1/IL-34与报告基因细胞株表面CSF-1R的结合，在抗体药物活性检测中具有重要应用。，下面是一种CSF-1R报告基因细胞株及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种报告基因细胞株，其特征在于，所述报告基因细胞株包括NFκB报告基因质粒；
所述NFκB报告基因质粒上包括荧光素酶报告基因。
2.根据权利要求1所述的报告基因细胞株，其特征在于，所述报告基因细胞株还包括CSF-1R表达质粒。
3.根据权利要求1或2所述的报告基因细胞株，其特征在于，所述报告基因细胞株为HEK293细胞。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的报告基因细胞株的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)采用NFκB报告基因质粒转染宿主细胞，抗性筛选；
(2)采用CSF-1R表达质粒转染步骤(1)得到的宿主细胞，抗性筛选，得到所述报告基因细胞株。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述抗性筛选采用潮霉素B进行。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述CSF-1R表达质粒的制备方法包括以下步骤：
将CSF-1R基因片段插入pcDNA3.3-TOPO载体，转化入大肠杆菌克隆菌株，抗性筛选、测序后获得重组质粒，得到CSF-1R表达质粒；
优选地，步骤(2)所述抗性筛选采用潮霉素B和G418的混合液进行。
7.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)采用NFκB报告基因质粒转染HEK293细胞，通过潮霉素B进行抗性筛选；
(2)将CSF-1R基因片段插入pcDNA3.3-TOPO载体，转化入大肠杆菌克隆菌株，抗性筛选、测序后获得重组CSF-1R表达质粒，并将所述CSF-1R表达质粒与转染试剂混合后，转染步骤(1)得到的宿主细胞，通过潮霉素B和G418的混合液进行抗性筛选，得到所述报告基因细胞株。
8.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括如权利要求1-3任一项所述的报告基因细胞株；
优选地，所述检测试剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种抗体药物生物学活性的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
将CSF-1、IL-34和CSF-1R抗体药物加入如权利要求1-3任一项所述的报告基因细胞株或如权利要求8所述的检测试剂中，根据荧光信号检测抗体药物的生物学活性。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的报告基因细胞株、如权利要求4-7任一项所述的报告基因细胞株的制备方法、如权利要求8所述的检测试剂或如权利要求9所述的抗体药物生物学活性的检测方法在检测靶向CSF-1R抗体药物活性中的应用。
一种CSF-1R报告基因细胞株及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] CSF-1最初被认为是一种造血生长因子，通过与唯一的细胞表面受体CSF-1R结合，发挥促进单核细胞、巨噬细胞和骨髓祖细胞增殖、分化和存活的生物学功能。CSF-1R由原癌基因c-Fms编码，是一种受体酪氨酸激酶，CSF-1或IL-34与CSF-1R结合时，CSF-1R二聚化，诱导受体的转磷酸作用和下游信号传递分子MAPK和Akt的活化。
[0003] CN201180017294公开了测定CSF-1R抗体药物生物学活性的方法，所述方法包括向表达CSF-1R的NKM-1肿瘤细胞系中加入CSF-1和CSF-1R抗体，放入培养箱孵育3天，根据测定的发光信号，得到CSF-1R抗体的IC50值，通过比较IC50值评价单克隆抗体的活性。然而该方法实验周期长，实验结果变异度大，不适用于大批量的抗体活性的快速评价。
[0004] 因此，提供一种快速、准确的检测CSF-1R抗体药物生物学活性的产品和方法，适用于大规模检测抗体药物的生物学活性，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种CSF-1R报告基因细胞株及其制备方法和应用，所述报告基因细胞株检测时间短，敏感度高，对监测评估单克隆抗体的活性具有重要意义。
[0006] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 第一方面，本发明提供了一种报告基因细胞株，所述报告基因细胞株包括NFκB报告基因质粒；
[0008] 所述NFκB报告基因质粒上包括荧光素酶报告基因。
[0009] 所述报告基因细胞株还包括CSF-1R表达质粒。
[0010] 本发明中，转染有报告基因质粒和CSF-1R表达质粒的报告基因细胞株，在细胞膜上表达人源CSF-1R，胞内表达响应NFκB信号的荧光素酶，CSF-1/IL-34能够剂量依赖地特异性激活报告基因细胞株的荧光素酶的表达，同时靶向CSF-1R的抗体药物能够阻断CSF-1/IL-34与报告基因细胞株表面CSF-1R的结合，在抗体药物活性检测中具有重要应用。
[0011] 本发明中，所述靶向CSF-1R的抗体药物包括S7-4，为宝船生物医药科技(上海)有限公司自制。
[0012] 优选地，所述报告基因细胞株为HEK293细胞。
[0013] 第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的报告基因细胞株的制备方法，所述方法包括：
[0014] (1)采用NFκB报告基因质粒转染宿主细胞，抗性筛选；
[0015] (2)采用CSF-1R表达质粒转染步骤(1)得到的宿主细胞，抗性筛选，得到所述报告基因细胞株。
[0016] 优选地，步骤(1)所述抗性筛选采用潮霉素B进行。
[0017] 优选地，步骤(2)所述CSF-1R表达质粒的制备方法包括以下步骤：
[0018] 将CSF-1R基因片段插入pcDNA3.3-TOPO载体，转化入大肠杆菌克隆菌株，抗性筛选、测序后获得重组质粒，得到CSF-1R表达质粒。
[0019] 优选地，步骤(2)所述抗性筛选采用潮霉素B和G418的混合液进行。
[0020] 作为优选技术方案，本发明提供了一种如第一方面所述的报告基因细胞株的制备方法，所述方法包括：
[0021] (1)采用NFκB报告基因质粒转染HEK293细胞，通过潮霉素B进行抗性筛选；
[0022] (2)将CSF-1R基因片段插入pcDNA3.3-TOPO载体，转化入大肠杆菌克隆菌株，抗性筛选、测序后获得重组CSF-1R表达质粒，并将所述CSF-1R表达质粒与转染试剂混合后，转染步骤(1)得到的宿主细胞，通过潮霉素B和G418的混合液进行抗性筛选，得到所述报告基因细胞株。
[0023] 第三方面，本发明提供了一种检测试剂，所述检测试剂包括如第一方面所述的报告基因细胞株。
[0024] 优选地，所述检测试剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
[0025] 第四方面，本发明提供了一种抗体药物生物学活性的检测方法，所述方法包括：
[0026] 将CSF-1、IL-34和CSF-1R抗体药物加入如第一方面所述的报告基因细胞株或如第三方面所述的检测试剂中，根据荧光信号检测抗体药物的生物学活性。
[0027] 第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的报告基因细胞株、如第二方面所述的报告基因细胞株的制备方法、如第三方面所述的检测试剂或如第四方面所述的抗体药物生物学活性的检测方法在检测靶向CSF-1R抗体药物活性中的应用。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0029] (1)本发明的报告基因细胞株1-4G在细胞膜上表达人源CSF-1R，胞内表达响应NFκB信号的荧光素酶；
[0030] (2)CSF-1能够剂量依赖地特异性激活报告基因细胞株1-4G的荧光素酶的表达；同时靶向CSF-1R的抗体药物S7-4能够阻断CSF-1与1-4G表面CSF-1R的结合；
[0032] 图1为TNF-ɑ刺激NFκB-HEK293 12-9E表达荧光素酶的结果图；
[0033] 图2为1-4G的CSF-1R表达流式图；
[0034] 图3为CSF-1刺激1-4G表达荧光素酶的结果图；
[0035] 图4为IL-34刺激1-4G表达荧光素酶的结果图；
[0036] 图5为S7-4阻断CSF-1与1-4G结合的结果图；
[0037] 图6为S7-4阻断IL-34与1-4G结合的结果图；
[0038] 图7为1-4G的特异性结果图。
具体实施方式
[0039] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
[0041] 实施例1构建NFκB报告基因细胞株
[0042] 本实施例通过质粒构建、细胞转染、稳定细胞株筛选和单克隆化等步骤构建报告基因细胞株，具体方法如下：
[0043] (1)报告基因质粒
[0044] 本实施例采用市售的荧光素酶质粒pGL4.32(luc2/NF-κB-RE/Hygro)(Promega公司)作为报告基因质粒，制备报告基因细胞株；
[0045] (2)细胞转染
[0046] 提前两周复苏HEK293细胞，保证使用时细胞处于对数生长期；于转染前一天收集细胞，接种于6孔板中，4E5个细胞/孔，培养基为10％FBS+DMEM；
[0047] 转染当天，将6孔板的培养基换为新鲜的10％FBS+DMEM(2mL/孔)，配制报告基因质粒pGL4.32(luc2/NF-κB-RE/Hygro)与Lipofectamine 2000的混合液(比率DNA:Lipo2000为4:10)，逐滴加入6孔板中，置于37℃培养箱中孵育5h，将细胞培养基更换为新鲜10％FBS+DMEM；
[0048] (3)稳定细胞株筛选
[0049] 转染第三天，将细胞培养基更换为10％FBS+200μg/mL潮霉素B+DMEM，加压培养16天后，得到稳定表达的细胞株；
[0050] (4)单克隆化
[0051] 将稳定表达的细胞株采用有限稀释法克隆，即将细胞以1.2个细胞/孔的密度接种于96孔板；单克隆后第二天，于显微镜下挑选单克隆细胞株；将单克隆细胞株接种于96孔板中，加入TNF-ɑ刺激，得到荧光素酶表达的窗口值，筛选出高表达NFκB的报告基因单克隆细胞NFκB-HEK293 12-9E；取单克隆细胞扩大培养，并冻存。
[0052] 图1显示TNF-ɑ剂量依赖地刺激NFκB-HEK293 12-9E的荧光素酶表达。
[0053] 实施例2构建表达CSF-1R的NFκB报告基因细胞株
[0054] (1)CSF-1R质粒的构建
[0055] 设计引物PCR扩增获得CSF-1R全长基因片段，琼脂糖凝胶电泳，胶回收后使用TM TM TMpcDNA 3.3-TOPO TA Cloning Kit试剂盒连接、转化，将CSF-1R基因片段插入pcDNA3.3-TOPO载体，转化入大肠杆菌克隆菌株，挑取单克隆送测序验证，获得CSF-1R表达质粒；
[0056] (2)细胞转染
[0057] 提前两周复苏单克隆细胞NFκB-HEK293 12-9E细胞，保证使用时细胞处于对数生长期；转染前一天收集细胞，接种于6孔板中，1E6个细胞/孔，培养基为10％FBS+DMEM；
[0058] 转染当天，将6孔板的培养基换成Opti-MEM(2mL/孔)，配制CSF-1R质粒与Lipofectamine 2000的混合液，逐滴加入6孔板中，置于37℃培养箱中孵育5h，将细胞培养基更换为10％FBS+DMEM；
[0059] (3)稳定细胞株筛选
[0060] 转染第二天，将细胞培养基更换为10％FBS+50μg/mL潮霉素B+1200μg/mL G418+DMEM，加压培养14天后，细胞接种于白色96孔板中，加入CSF-1刺激6h后，得到荧光素酶表达的窗口值，筛选出窗口值最大的稳定表达细胞株；
[0061] (4)单克隆化
[0062] 将筛选出的窗口值最大的稳定表达细胞株采用二维有限稀释法，即A1孔为2000个细胞，之后从第1列两倍倍比稀释至第12列，接着从A行两倍倍比稀释至H行；单克隆后第二天，于显微镜下挑选单克隆细胞株；将单克隆细胞株接种于白色96孔板中，1E5个细胞/孔，加入CSF-1刺激6h后，得到荧光素酶表达的窗口值，筛选出窗口值最大的单克隆细胞1-4G。
[0063] 通过流式细胞仪检测1-4G细胞膜CSF-1R的表达情况，如图2所示，CSF-1R的表达量为82.3％。取单克隆细胞1-4G扩大培养，并冻存。
[0064] 实施例3CSF-1/IL-34刺激单克隆细胞1-4G表达荧光素酶实验
[0065] (1)实验前一天，准备培养基：实验前预热分析培养基(2％FBS+DMEM)和完全培养基(10％FBS+DMEM)；
[0066] (2)收集细胞：取出细胞培养皿，倒置显微镜下观察细胞密度，确保细胞无污染；弃去旧培养基，用灭菌PBS润洗细胞，柠檬酸钠消化2min，并用完全培养基终止消化；1000rpm、5min离心后，加入含2％FBS的DMEM培养基后重悬细胞，进行细胞计数；
[0067] (3)细胞铺板：将细胞重悬至5E5个/mL，100μL/孔铺于96孔板中，周围一圈孔中加入PBS(100μL/孔)，暂置于37℃培养箱，孵育过夜；
[0068] (4)实验当天，将白色96孔板中的培养基去除，即用排枪调至95μL，将细胞上清吸出；
[0069] (5)加入CSF-1/IL-34：
[0070] 取96孔板，将CSF-1稀释至400ng/mL，并以4倍倍比稀释，即吸取前一个孔75μL混合液加入至后一个孔的225μL分析培养基中，将CSF-1以100μL/孔加入白色96孔板中；
[0071] 取96孔板，将IL-34稀释至1000ng/mL，并以3倍倍比稀释，即吸取前一个孔110μL混合液加入至后一个孔的220μL分析培养基中，将IL-34以100μL/孔加入白色96孔板中；
[0072] (6)将白色96孔板放置于培养箱中孵育6h，细胞板平衡至室温，每孔加入50μL Bio-glo，10min后酶标仪读板；
[0074] 由图3可知，CSF-1剂量依赖性地刺激单克隆细胞1-4G表达荧光素酶；由图4可知，IL-34剂量依赖性地刺激单克隆细胞1-4G表达荧光素酶。
[0075] 实施例4评价S7-4生物学活性实验
[0076] (1)实验前一天，准备培养基：实验前预热分析培养基(2％FBS+DMEM)和完全培养基(10％FBS+DMEM)；
[0077] (2)收集细胞：取出细胞培养皿，倒置显微镜下观察细胞密度，确保细胞无污染；弃去旧培养基，用灭菌PBS润洗细胞，柠檬酸钠消化2min，并用完全培养基终止消化；1000rpm、5min离心后，加入含1％FBS的DMEM培养基后重悬细胞，进行细胞计数；
[0078] (3)细胞铺板：将细胞重悬至5E5个/mL，100μL/孔铺于96孔板中，周围一圈孔加入PBS(100μL/孔)，置于37℃培养箱，孵育过夜；
[0079] (4)实验当天，将白色96孔板中的培养基去除，即用排枪调至95μL，将细胞上清吸出；
[0080] (4)加入CSF-1/IL-34和S7-4：取96孔板，将S7-4稀释至200μg/mL，并以3倍倍比稀释，即吸取前一个孔60μL混合液加入至后一个孔的120μL分析培养基中；使用分析培养基，将CSF-1稀释至8ng/mL，IL-34稀释至20ng/mL后加入96孔板中，120μL/孔；将抗体和CSF-1/IL-34混合均匀并加入白色96孔板中，100μL/孔；
[0081] (5)将白色96孔板放置于培养箱中孵育6h，细胞板平衡至室温，每孔加入50μL Bio-glo，10min后酶标仪读板；
[0082] (6)结果：用Graphpad软件进行数据处理，采用4-参数方程。
[0083] 由图5、6可知，在固定浓度的CSF-1/IL-34中，S7-4可以浓度依赖地抑制CSF-1/IL-34与1-4G的结合，说明构建的报告基因细胞株可以用来评价CSF-1/IL-34&CSF-1R抗体的生物学活性。
[0084] 实施例5特异性检验
[0085] 本实施例采用不同靶点的单抗药物检测报告基因细胞株1-4G的特异性：S7-4(宝船生物医药科技(上海)有限公司，靶点为CSF-1R)、Tecentriq(靶点为PD-L1)、Erbitux(靶点为EGFR)和Avastin(靶点为VEGF)。
[0086] (1)实验当天，准备培养基：实验前预热完全培养基(10％FBS+DMEM)和FACS buffer(1％BSA+PBS)；
[0087] (2)收集细胞：取出细胞培养皿，倒置显微镜下观察细胞密度，确保细胞无污染；弃去旧培养基，用灭菌PBS润洗细胞，柠檬酸钠消化2min，并用完全培养基终止消化；1000rpm、5min离心后，加入FACS buffer重悬细胞，进行细胞计数；
[0088] (3)细胞铺板：将细胞铺于96孔U型板中，1E5/well，3000rpm、4min离心备用；
[0089] (4)加入CSF-1和S7-4：取96孔板，将CSF-1稀释至2μg/mL，并以5倍倍比稀释，即吸取前一个孔36μL混合液加入至后一个孔的144μL FACS buffer中；使用FACS buffer，将S7-4、、Erbitux、Avastin和Tecentriq稀释至20μg/mL后加入96孔板中，144μL/孔；将抗体和CSF-1混合均匀并加入96孔U型板中，100μL/孔；
[0090] (5)4℃孵育1h，洗板：采用FACS buffer洗板，洗两次；
[0091] (6)采用FACS buffer稀释PE标记的羊抗人FC二抗，1：150倍稀释。稀释完后加入96孔U型板中，100μL/孔；
[0092] (7)4℃孵育30分钟，洗板：采用FACS buffer洗板，洗两次；
[0093] (8)流式细胞仪上机读板。
[0094] 结果如图7所示，1-4G对EGFR、VEGF和PD-L1靶点的抗体药物均没有剂量效应曲线，说明1-4G不适用于除了CSF-1/IL-34&CSF-1R靶点以外的其他药物，证明1-4G具有显著的CSF-1/IL-34&CSF-1R特异性。
[0095] 综上所述，本发明的报告基因细胞株1-4G在细胞膜上表达人源CSF-1R，胞内表达响应NFκB信号的荧光素酶；CSF-1/IL-34能够剂量依赖地特异性激活1-4G的荧光素酶的表达；同时靶向CSF-1R的抗体药物S7-4能够阻断CSF-1/IL-34与1-4G的结合；本发明的1-4G适用于评价CSF-1/IL-34与其受体CSF-1R的特异性结合，同时适用于CSF-1/IL-34&CSF-1R抗体阻断CSF-1/IL-34其与CSF-1R的结合，监测评估CSF-1/IL-34&CSF-1R抗体的活性，特异性显著，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种干细胞基因敲除方式 | 2020-05-12 | 10 |
| 一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备 | 2020-05-13 | 605 |
| 抑癌基因-细胞同质异能素的创建 | 2020-05-11 | 354 |
| 表达异源基因的方法及其所用的载体 | 2020-05-11 | 330 |
| 通过异种间的核移植产生的胚细胞或干细胞样细胞系 | 2020-05-11 | 512 |
| 一种用于治疗肿瘤的基因重组造血干细胞及其制备方法 | 2020-05-13 | 508 |
| 一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法 | 2020-05-11 | 754 |
| 一种基于10X单细胞转录组测序数据的分析方法 | 2020-05-11 | 235 |
| 通过胸腺重新激活进行疾病预防 | 2020-05-12 | 158 |
| 一种演示细胞分裂的教学模型 | 2020-05-11 | 503 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈