技术领域
[0001] 本
发明涉及分子
生物学技术领域，具体为一种干细胞基因敲除方式。
背景技术
[0002] 干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能
力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞，干细胞群的功能即为控制和维持细胞的再生，一般来说，在干细胞和其终末分化的子代细胞之间存在着被称为“定向祖细胞"的中间祖细胞群，它们具有有限的扩增能力和限制性分化潜能，这些细胞群的功能是增加干细胞每次分裂后产生的分化细胞的数量，干细胞具有自我更新的能力，但是干细胞的分裂实际上是相对不对称的，虽然在形态学和分子生物学
水平上干细胞的结构意义能帮助定义干细胞，但是干细胞的定义仍必须是建立在功能性的
基础上的，是处于细胞系起源顶端的最原始细胞，在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞。
[0003] 基因敲除是用含有一定已知序列的DNA
片段与受
体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术，它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能，基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组，指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中，此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正
机体的基因突变，基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因，用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。
[0004] 现有对干细胞基因的敲除方法在实际操作的过程中较为复杂，存在脱靶苦难以及操作繁琐等问题，同时对干细胞基因进行敲除时，容易引入外源基因，使得后续人员对目的基因功能分析的不够精确，敲除效果不佳以及效率低下，不符合实际的使用需求。
发明内容
[0005] (一)解决的技术问题
[0006] 针对
现有技术的不足，本发明提供了一种干细胞基因敲除方式，解决了现有对干细胞基因的敲除方法在实际操作的过程中较为复杂，同时对干细胞基因进行敲除时，容易引入外源基因，使得后续人员对目的基因功能分析不够精确的问题。
[0007] (二)技术方案
[0008] 为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种干细胞基因敲除方式，具体包括以下步骤：
[0009] S1、建立基因序列，然后根据基因序列在
数据库中查询目的基因的CDS序列，以单链CDNA为模板获得基因完整的CDS序列，通过比对得到完整的目的基因外显子序列；
[0010] S2、根据S1中，对目的基因进行设计，设计同源重组双交换同源臂，在敲除模板质粒基础上构建目的基因敲除质粒；
[0011] S3、把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子重组到带有标记基因的载体上，然后将基因打靶载体通过常用方式导入同源的胚胎干细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中；
[0012] S4、用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞，采用DTA进行阴性筛选，将筛选出来的靶细胞导入动物的囊胚中；
[0013] S5、观察动物的生物学形状的变化，进而了解目的基因变化前后对动物的生物学性状改变，最终人员对目的基因进行研究工作。
[0014] 优选的，所述S3中的标记基因是neo基因或TK基因其中的一种。
[0015] 优选的，所述S3中的常用方式采用的是电穿孔法。
[0016] 优选的，所述S1中的CDS序列是编码一段蛋白产物的序列，且该序列中间不含其它非该
蛋白质对应的序列，不考虑mRNA加工等过程中的序列变化，与蛋白质的密码子完全对应。
[0017] 优选的，所述S1中的单链CDNA是由依赖RNA的DNA聚合酶作用而合成，并且在合成单链cDNA后，再用
碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶作用合成双链cDNA。
[0018] 优选的，所述S4中neo基因是对新霉素的抗药基因，被克隆到表达载体，是一种筛选基因。
[0019] (三)有益效果
[0020] 本发明提供了一种干细胞基因敲除方式。具备以下有益效果：该干细胞基因敲除方式，通过S1、建立基因序列，然后根据基因序列在数据库中查询目的基因的CDS序列，以单链CDNA为模板获得基因完整的CDS序列，通过比对得到完整的目的基因外显子序列；S2、根据S1中，对目的基因进行设计，设计同源重组双交换同源臂，在敲除模板质粒基础上构建目的基因敲除质粒；S3、把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子重组到带有标记基因的载体上，然后将基因打靶载体通过常用方式导入同源的胚胎干细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中；S4、用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞，采用DTA进行阴性筛选，将筛选出来的靶细胞导入动物的囊胚中；通过本发明采用的干细胞基因敲除方式可在不引入外源基因的基础上，对干细胞基因快速进行敲除，且敲除效果好，使得后续人员对目的基因功能分析更为精确，提高了基因的敲除效率，操作简便且可重复性强度，符合实际的使用需求。
具体实施方式
[0021] 下面将对本发明
实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022] 本发明实施例提供一种技术方案：一种干细胞基因敲除方式，通过本发明采用的干细胞基因敲除方式可在不引入外源基因的基础上，对干细胞基因快速进行敲除，且敲除效果好，使得后续人员对目的基因功能分析更为精确，提高了基因的敲除效率，操作简便且可重复性强度，符合实际的使用需求，具体包括以下步骤：
[0023] S1、建立基因序列，然后根据基因序列在数据库中查询目的基因的CDS序列，以单链CDNA为模板获得基因完整的CDS序列，通过比对得到完整的目的基因外显子序列；
[0024] S2、根据S1中，对目的基因进行设计，设计同源重组双交换同源臂，在敲除模板质粒基础上构建目的基因敲除质粒，质粒广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状
真菌、大型真菌、
酵母到
植物，甚至人类机体中都含有，从分子组成看，有DNA质粒，也有RNA质粒；从分子构型看，有线型质粒、也有环状质粒；其表型也多种多样，细菌质粒是基因工程中最常用的载体，质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中
染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于
细胞质中(但酵母除外，酵母的2μm质粒存在于细胞核中)，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子，质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等，质粒携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状，有利于细菌在特定的环境条件下生存；
[0025] S3、把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子重组到带有标记基因的载体上，然后将基因打靶载体通过常用方式导入同源的胚胎干细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中，DNA序列或基因序列，是使用一串字母表示的真实的或者假设的携带基因信息DNA分子的一级结构，部分DNA序列或基因序列；
[0026] S4、用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞，采用DTA进行阴性筛选，将筛选出来的靶细胞导入动物的囊胚中，G418是一种
氨基糖苷类抗生素，在分子遗传试验中，是稳定
转染最常用的抗性筛选
试剂，它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因，干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素，包括细菌、酵母、植物和
哺乳动物细胞，也包括
原生动物和蠕虫，当neo基因被整合进真核细胞DNA后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷
磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长，G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用；
[0027] S5、观察动物的生物学形状的变化，进而了解目的基因变化前后对动物的生物学性状改变，最终人员对目的基因进行研究工作。
[0028] 本发明中，S3中的标记基因是neo基因或TK基因其中的一种，标记基因是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用，在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转
化成功与否，在基因
定位意义上来说，它是对目的基因进行标志的工具，通常用来检测目的基因在细胞中的定位。
[0029] 本发明中，S3中的常用方式采用的是电穿孔法，电穿孔法是功能强大的将核酸、蛋白及其它分子导入多种细胞的高效技术，通过高强度的
电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子，这种技术可以将核苷酸、DNA与RNA、蛋白类、染料及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内，电转化相对其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。
[0030] 本发明中，S1中的CDS序列是编码一段蛋白产物的序列，且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列，不考虑mRNA加工等过程中的序列变化，与蛋白质的密码子完全对应，是结构基因组学术语，开放阅读框ORF是基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止密码子打断。
[0031] 本发明中，S1中的单链CDNA是由依赖RNA的DNA聚合酶作用而合成，并且在合成单链cDNA后，再用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶作用合成双链cDNA，在这种情况下，mRNA的cDNA与原来的基因组DNA相同而且无内含子，相反地，对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3'末端的poly A序列等的核苷序列上，与外显子序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。
[0032] 本发明中，S4中neo基因是对新霉素的抗药基因，被克隆到表达载体，是一种筛选基因。
[0033] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0034] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由所附
权利要求及其等同物限定。
