本发明所属技术领域

本发明涉及疾病预防领域。特别是，本发明涉及通过胸腺重新 激活来刺激患者的免疫系统，并且可选地使用造血干细胞(HSC)、 造血祖细胞、上皮干细胞、或骨髓进行基因治疗。

与本发明相关的背景技术

免疫系统

免疫系统的主要功能是将“异己”抗原同“自身”抗原相区分， 并相应地进行应答，来保护机体免受感染。在正常的免疫应答中， 事件的序列涉及专门的抗原递呈细胞(APC)捕获异已抗原并且将 其加工为小的肽片断，后者在APC表面呈现为主要组织相容性复 合物(MHC)分子的裂片(clefts)。该MHC分子可为I型(在 所有有核细胞上表达，被细胞毒T细胞(Tc)识别)或II型(主 要经免疫系统细胞进行表达，被辅助T细胞(Th)识别)。这 些细胞识别APC上的MHCII/肽复合物并进行应答；然后这些细胞 释放的因子促进Tc细胞或产生B细胞的抗体(其对特定抗原具有 特异性)的活化。Th细胞在事实上所有免疫应答中的重要性在 HIV/AIDS中得到最好的体现，其中HIV/AIDS就是因为病毒破 坏Th细胞导致Th细胞缺乏，从而引起严重免疫缺陷并最终导致 死亡。Th细胞的不正常发育(和Tc，但程度较轻)可导致多种 其他疾病，如过敏症、癌症、以及自身免疫病。

T淋巴细胞和B淋巴细胞的细胞膜受体具有识别抗原的能 力。这些受体由许多可能基因的复杂重排序列随机产生，这样每个 独立的T或B细胞具有独特的抗原受体。这种庞大的潜在多样性意 味着，对机体可能遇到的任何单个抗原，多种淋巴细胞能够以不同 的结合强度(亲和力)对它进行识别并且进行不同程度的应答。因 为抗体受体的特异性是偶然产生的，因而可提出如下问题，即为什 么机体不通过对抗自身抗原的淋巴细胞进行“自身破坏”。幸运的 是，存在几种可阻止T和B细胞这样做的机制-它们共同营造了免 疫系统对自身耐受的环境。

自身耐受最有效的形式是，将所有具有潜在反应性的淋巴细 胞从它们产生的部位(胸腺产生T细胞，骨髓产生B细胞)物理 性地除去(杀死)。这称为中枢耐受(central tolerance)。耐受 的另一种重要方法是通过调控Th细胞，它可直接或更有可能地通 过细胞因子来抑制自身反应性细胞。鉴于事实上所有的免疫应答 都需要T辅助细胞的启动和调控，因此任何耐受诱导方案的主要目 标是针对这些细胞。类似地，因Tc细胞是非常重要的效应细胞， 因此对例如抗癌和抗病毒疗法而言，产生此类细胞是这些治疗 策略的主要目标。

胸腺

有人认为胸腺是免疫系统的主要器官，因其是产生T淋巴细 胞的主要部位。它的作用是从血液中吸引适当的来源于骨髓的前 体细胞，并诱导它们分化成T细胞系，包括产生T细胞抗原受体 (TCR)所必需的基因重排。与此相联系的是程度明显的细胞分裂， 使T细胞的数量增加，从而提高每个外来抗原被识别和清除的可 能性。然而，和B细胞不同的是，T细胞识别抗原的很奇怪的特征 是TCR只识别与MHC分子物理上相连的肽片段；正常情况下这 是自身MHC，而且这一能力只有胸腺才有。此过程称作正性选择， 并且是皮质上皮细胞独有的特征。如果TCR无法与自身MHC/肽复 合物结合，T细胞就会因为“忽略”而死亡-T细胞的继续成熟需 要某种程度的经由TCR的信号传导。

尽管胸腺对于一个功能性的免疫系统来说是不可缺少的， 它每天将T细胞容量的1％释放到血流中，哺乳动物的明显异常 之一是，由于性类固醇的产生，胸腺会严重萎缩。这甚至在儿童时 期就开始了，不过从青春期开始加剧。对正常健康的个体来说，产 生和释放新T细胞这一功能的丧失并不总是带来临床后果(尽 管随着年龄的增长免疫有关的疾病的发病率和严重程度也随之增 加)。当大量丧失T细胞时，例如患有爱滋病、化疗或放疗以后， 因为免疫受到抑制，患者对疾病高度易感。

然而，许多T细胞会继续发育，其可偶然地(具有较高的亲 和力)识别自身MHC/肽复合物。这种T细胞因而可能发生自身 反应并能引起严重的自身免疫病，比如多发性硬化症、关节炎、糖 尿病、甲状腺炎、系统性红斑狼疮(SLE)。幸运的是，如果胸腺中 TRC与自身MHC/肽复合物的亲和力过高，正在发育的胸腺细胞 就会经诱导产生自杀活性并且通过细胞凋亡而死亡，此过程称 为负性选择。这称为中枢耐受。这种T细胞会死亡而不会发生应答， 因为在胸腺中它们还不成熟。在胸腺中这种负性选择的最有效诱导 物是称为树突状细胞(DC)的APC。作为APC，它们把最强烈的 信号传递给T细胞；在胸腺中这会引起消除，而在T细胞更为成 熟的外周淋巴器官中，DC会激活T细胞。

胸腺萎缩

胸腺在很大程度上受它自己与神经内分泌系统双相交流的影 响(Kendall，1988)。垂体、肾上腺、和性腺之间的相互作用对胸腺 功能的影响尤其重要，包括营养(促甲状腺激素或TSH，和生长 激素或GH)和萎缩的影响(促黄体激素或LH，促卵泡激素或 FSH，和促肾上腺皮质激素或ACTH)(Kendall，1988； Homo-Delarche，1991)。实际上胸腺生理学的一个显著的特征是其 结构和功能的进行性退化，其与在青春期循环血中性类固醇产生 的增加成比例(Hirokawa和Makinodan，1975；Tosi等，1982，和 Hirakawa等，1994)。这些激素的精确目标以及诱导胸腺萎缩的机制 还有待弄清楚。因为胸腺是产生和维持外周T细胞库的主要场所， 所以普遍认为这种萎缩是老年时期免疫性疾病发病率升高的主要 原因。尤其是，由T细胞依赖的免疫功能(比如溶细胞T细胞 的活力和促有丝分裂反应)的下降而说明的免疫系统缺陷，可 以从老年时期免疫缺陷、自身免疫以及肿瘤(tumor load)的发 病升高得到反映(Hirokawa，1998)。

胸腺萎缩的影响反映在外周，随着胸腺释放到T细胞库的细胞 数的减少，导致T细胞受体(TCR)免疫库的多样性减少。还观 察到细胞因子的改变(profile)(Hobbs等，1993；Kurashima等， 1995)、CD4+和CD8+亚群的改变、以及由纯真T细胞向记忆细胞 的转变(Mackall等，1995)。而且，胸腺生成(thymopoiesis)的 效率随着年龄下降，以致在T细胞耗竭后免疫系统重新生成正常数 量T细胞的能力最终丧失(Mackall等，1995)。然而，最近Douek 等(1998)的研究显示人类即使在老年时期胸腺输出可能仍然发 生。TCR基因重排的外切DNA产物被用来证实老年患者HIV 感染后循环血中存在重新产生的纯真T细胞。这种输出率和随 后的外周T细胞库再生还需要进一步研究，因为经过化疗后，青春 期后的病人与青春期前的病人比较，T细胞库的再生率显著下降， 尤其是CD4+T细胞(Machall等，1995)。最近Timm和Thoman的研 究(1999)进一步证明了这一点，他们研究表明尽管CD4+T细胞在 老年小鼠骨髓移植(BMT)后可以再生，但由于外周微环境的老化， 其表现出对记忆细胞的倾向性，胸腺产生纯真T细胞的能力亦 较差。

胸腺主要由正在发育的胸腺细胞组成，这些胸腺细胞散布在不 同的基质细胞(主要是上皮细胞亚群)中，这些基质细胞构成微环 境并提供T细胞最佳发育所必需的生长因子和细胞相互作用。胸腺 细胞和控制其分化和成熟的上皮细胞亚群之间共生性的发育关系 (Boyd等，1993)意味着性类固醇抑制可以发生在任何细胞类 型，后者随后影响其他类型细胞。胸腺细胞自身有内在缺陷的可 能性比较小，因为以前采用辐射嵌合体研究表明，骨髓(BM)干 细胞不受年龄的影响(Hirokawa，1998；Mackall和Gress，1997)并且 与年轻BM细胞具有相似程度的胸腺再生(repopulation)潜能。 而且，老年动物的胸腺细胞至少在某些程度上保留了分化能力 (Mackall和Gress，1997；George和Ritter，1996；Hirokawa等，1994)。 然而，Aspinall(1997)最新的研究显示，前体CD3-CD4-CD8-三阴 性(TN)群体的缺陷发生于TCRγ链基因重排阶段。

发明简述

本发明提供了预防疾病的方法，该方法是通过引起患者胸腺重 新激活并增强外周T细胞功能状态，从而使患者能更好地抵御感染 或免疫系统的挑战。如在本文所使用的，“预防”和“防止”指的 是完全或部分地保护患者免受感染原导致的疾病。可选的基因治疗 (采用经遗传修饰的HSC、淋巴样祖细胞、骨髓性祖细胞、或上皮 干细胞、或其组合形式(该组和每个成员在本文称为“GM细胞”)) 可给予正重新激活的胸腺，以产生特定的免疫力。在优选的具体实 施例中，年老(青春期后)患者的萎缩胸腺被重新激活。重新激活 的胸腺变得能够从血中摄取HSC和骨髓细胞，并且将它们在胸腺 中转化为新的T细胞和DC。

本发明的一个方面提供预防或减少患者患病危险的方法，此方 法包括切断性类固醇介导的传向患者胸腺的信号。

在一个具体实施例中，还移植骨髓或HSC到患者体内。

在一个具体实施例中，该疾病具有特定的基因基础。

在优选的具体实施例中，该疾病是T细胞失调，选自由病毒 感染(如由人类免疫缺陷病毒(HIV)所感染)、T细胞功能失调、 以及其它直接或间接降低T细胞数量或功能的疾病或状态组成的 组。

另一方面，本发明提供了防止感染原感染的方法。进行了遗传 修饰(来抵抗或预防感染原的感染、活化、复制等、及其组合)的 GM细胞，在胸腺重新激活的同时，被注射入患者体内。

在优选的具体实施例中，HSC经遗传修饰，从而在胸腺重新激 活的过程中和重新激活之后形成的T细胞中产生HIV抗性。例如， HSC经修饰从而包括一种基因，该基因的产物能干扰HIV在T细 胞中的感染、功能和/或复制。这赋予针对病毒的一定程度的抗性， 由此预防该病毒导致的疾病。

在另一个方面，本发明提供了通过阻断性类固醇介导的信号来 重新激活胸腺的方法。在一个具体实施例中，利用阉割来阻断性 类固醇介导的信号。在优选的具体实施例中，采用化学阉割。在 另一个具体实施例中，采用手术阉割。阉割将胸腺状态恢复至青 春期前，由此使胸腺重新激活。

在特定的具体实施例中，对传向胸腺的性类固醇介导的信号 的阻断是通过给予LHRH的激动剂或拮抗剂、抗雌激素抗体、抗雄 激素抗体、被动(抗体)或主动(抗原)的抗LHRH接种疫苗 (vaccinations)、或其组合(“阻断剂”)来实现。

在优选的具体实施例中，阻断剂以肽缓释剂型给予。在WO 98/08533中提供了肽缓释剂型的例子，其内容结合于此作为参考。

在本发明的优选具体实施例中，经遗传修饰的HSC在胸腺 重新激活之前、同时或随后移植到患者体内，产生新的经遗传 修饰的T细胞群。

附图简要描述

图1A和B：阉割前后胸腺细胞数的变化。胸腺萎缩导致胸腺 细胞数随年龄明显减少。阉割后2周，细胞数已增加至年轻成体的 水平。阉割后3周，细胞数明显高于年轻成体，阉割后4周稳定下 来。***＝与年轻成年(2月)胸腺相比显著不同，p＜0.001。

图2A-C：(A)脾细胞数量不受年龄和阉割的影响。外周B∶T 细胞比率也维持稳定(B)，然而，CD4∶CD8比率随年龄明显降低 (p＜0.001)，并在阉割后4周恢复到幼年时的正常水平。

图3：荧光激活的细胞分拣器(FACS)图，显示年龄和阉割 对CD4与CD 8胸腺细胞群的影响。每一象限的百分比在图上给 出。胸腺细胞亚群不随年龄发生变化，阉割后，胸腺细胞同步扩增。

图4：胸腺细胞的增殖，如通过结合BrdU脉冲所探测的。正 在增殖的胸腺细胞的比例不随年龄和阉割发生变化。

图5A-D：年龄和阉割对胸腺细胞亚群增殖的影响。(A)构成 整体增殖群的每一亚群的比例：增殖群中CD8+T细胞的比例显 著升高。(B)每一个正在增殖的亚群的百分数：TN和CD8亚群在 2年时的增殖显著少于2个月时的增殖。阉割后两周，TN亚群恢复 到正常年轻时的增值水平，而CD8亚群显著增殖。阉割4周后， 其水平等于正常年幼时的水平。(C)整体TN的增殖不随年龄 和阉割而变化。然而(D)TN1亚群的增殖随年龄显著下降，在阉 割后4周也没有恢复到正常的水平。***＝高度显著，p＜0.001，** ＝显著，p＜0.01。

图6：小鼠胸腺内注射FITC。24小时以后计算外周中FITC+ 细胞数量。尽管最新胸腺迁移(RTE)的比例保持恒定，占胸腺 细胞数目的1％，但在阉割后2周显著降低，RTE细胞数量随年 龄显著减少(p＜0.01)。阉割后，这些值虽然上升，但仍显著低于 阉割2周时年幼小鼠的水平。随着年龄的增加，可以看到CD4+∶ CD8+RTE比值显著升高，不过阉割一周后，就恢复正常。

图7A-C：用环磷酰胺(一种化疗药物)治疗后，胸腺(A)、 脾(B)、和淋巴结(C)细胞数量的变化。注意：在治疗后1周和 2周，阉割组动物与未阉割组动物(仅采用环磷酰胺治疗)相 比胸腺发生快速扩增。另外，与仅用环磷酰胺治疗组相比，阉割组 脾和淋巴结细胞数明显增加。到第四周时，细胞数量恢复正常。(每 个治疗组和时点的n＝3-4)。

图8A-C：外科阉割一周后并接着辐照(625拉德)后，胸腺(A)、 脾(B)、和淋巴结(C)细胞数量的变化。注意：在治疗后1周和 2周，阉割组动物与未阉割组动物(仅采用辐照)相比胸腺发 生快速扩增。(每个治疗组和时点的n＝3-4)。

图9A-C：同一天进行辐照和阉割后，胸腺(A)、脾(B)、和 淋巴结(C)细胞数量的变化。注意：与未阉割组相比，在治疗后 两周时，阉割动物中的胸腺快速扩增。然而，其差别不如治疗前1 周小鼠进行阉割那么显著(图7)。(每个治疗组和时点的n＝ 3-4)。

图10：同一天用化疗药物环磷酰胺、外科或化学阉割治疗后， 胸腺(A)、脾(B)、和淋巴结(C)细胞数量的变化。注意：在治 疗后1周和2周，阉割组动物与未阉割组动物(仅采用环磷酰 胺治疗)相比胸腺发生快速扩增。另外，与仅用环磷酰胺治疗组 相比，阉割组脾和淋巴结细胞数明显增加。(每个治疗组和时点的n ＝3-4)。在用环磷酰胺治疗后免疫系统的再生中，化学阉割的效果 可以和外科阉割相比。

图11：用I型单纯性疱疹病毒(HSV-1)足跖免疫接种(foot-pad immunization)后的淋巴结细胞构成(cellularity)。注意：老年 阉割组与老年未阉割组相比细胞数量上升。下图说明CD25对 CD 8细胞荧光激活细胞分离器门化总激活的细胞数。

图12A-C：HSV-1接种后，在激活的LN(淋巴结)中，Vβ10 在细胞毒性T淋巴细胞(CTL)上的表达。注意：年长小鼠中克隆 反应减少，以及阉割后预期反应的恢复。

图13A-C：阉割恢复对HSV-1免疫的反应。(a)与年幼和阉割 后小鼠相比，年长小鼠感染后总的淋巴结细胞数显著下降。(b) HSV-1感染小鼠的淋巴结中激活的(CD8+CD25+)细胞的典型FACS 图。没有看到激活的CTL的比例会随着年龄或阉割后而不同。(c) 激活的CTL数量的显著下降反映了年长小鼠淋巴结细胞数量的下 降。年长小鼠阉割后可恢复对HSV-1的免疫应答，并且CTL数量 与年轻小鼠相当。结果用8-12只小鼠的均值±1SD(标准偏差) 表示。**＝与年幼小鼠(2个月)相比，p≤0.01；与年长的小鼠(未 阉割)相比，^＝p≤0.01。

图14：腘窝淋巴结取自经HSV-1免疫的小鼠，并培养三天。 用未经免疫的小鼠进行CTL(细胞毒性T细胞)检测，以作为裂 解的背景水平的对照(测定51Cr-释放)。结果用8只小鼠的平均 值表示，三次测量值±1SD。年老小鼠表现出CTL活性的明显降低 (p≤0.01，*)，E∶T比值为10∶1和3∶1，显示淋巴结中特异CTL表 达的百分数的降低。年长小鼠阉割后CTL反应恢复至年轻成年水 平。

图15A和15B：分析CD4+T细胞辅助和VβTCR对HSV-1感 染的反应。腘窝淋巴结在HSV-1感染后第5天被切除并在体外分析 (a)CD25、CD8和特异性TCR Vβ标记物和(b)CD4/CD8T细 胞的表达。(a)表达Vβ10或Vβ8.1的活化的(CD25+)CD8+T细胞 的百分率，以每组8只小鼠的均值±1SD表示。结果不随年龄或是 否阉割而变化。(b)在静息LN群中CD4/CD8比例随着年龄降 低。阉割后恢复。结果以每组8只小鼠的均值±1SD表示。***＝与 年幼和阉割小鼠相比p≤0.001。

图16A-D：Ly5同种小鼠骨髓移植后，胸腺(A)、脾(B)、淋 巴结(C)、和骨髓(D)中细胞数量的变化。注意：与未阉割组相 比，阉割组动物在治疗后所有的时点胸腺都迅速扩增。另外，与仅 用环磷酰氨组相比，阉割组的脾和淋巴结数明显增加。(每个治疗 组和每一时点n＝3-4)。与未阉割动物相比，阉割小鼠同种细胞 (Ly5.2)显著增加。(没有显示数据)。

图17A和B：胎儿肝脏重建后阉割和未阉割小鼠中胸腺细胞数 的变化。每一测试组有3-4只小鼠。(A)两周时，阉割小鼠的胸腺 细胞数处于正常水平，显著高于未阉割小鼠(*p≤0.05)。四周后， 可以看到阉割小鼠的胸腺呈肥大。未阉割小鼠的细胞数仍低于对照 水平。(B)CD45.2+细胞：CD45.2+是显示供体来源的标记。重建后 两周，阉割和未阉割小鼠中均出现源于供体的细胞。治疗后四周， 阉割小鼠胸腺中约85％的细胞是来源于供体的。在未阉割小鼠胸腺 中没有来源于供体的细胞。

图18：在致死辐照和胎儿肝脏重建、以及其后的外科阉割后， CD4和CD8供体来源的胸腺细胞群的FACS图。每个象限的百分 比在图的右边给出。年龄相配的对照图是八个月大的Ly5.1同种小 鼠胸腺。阉割和未阉割小鼠用CD45.2+细胞门化，只显示来源于供 体的细胞。重建后两周，阉割小鼠和未阉割小鼠的胸腺细胞亚群没 有不同。

图19A和B：致死辐照、胎儿肝脏重建以及阉割后，骨髓性 以及淋巴样树突状细胞(DC)数。每一测试组有3-4只小鼠。图中 对照(在其上标斜线)条图是基于在未经治疗的年龄相配的小鼠 中发现的树突状细胞的正常数。(A)来源于供体的骨髓性树突状 细胞：重建后两周，未阉割小鼠中DC处于正常水平。在相同时点， 阉割小鼠中DC显著更多(*p≤0.05)。四周时，阉割小鼠中DC数 仍高于对照水平。(B)来源于供体的淋巴样树突状细胞：重建后两 周，阉割小鼠的DC数是未阉割小鼠的两倍。治疗后四周，DC数 仍高于对照水平。

图20A和B：胎儿肝脏重建后，阉割和未阉割小鼠中总细胞 数和CD45.2+骨髓细胞数的变化。每一测试组有3-4只小鼠。(A) 总的细胞数：重建后两周，骨髓细胞数恢复正常，阉割和未阉割小 鼠的细胞数没有显著差异。重建后四周，阉割和未阉割小鼠的细胞 数有显著差异(*p≤0.05)。(B)CD45.2+细胞数。重建后两周，阉 割和未阉割小鼠骨髓中的CD45.2+细胞数没有显著差异。四周时， 阉割小鼠中的CD45.2+细胞数仍较高。在相同的时点，未阉割小鼠 体内没有来源于供体的细胞。

图21A-C：胎儿肝脏重建后，阉割和未阉割小鼠骨髓中T细胞、 骨髓和淋巴来源的树突状细胞(DC)的变化。每一测试组有3-4 只小鼠。图中对照(在其上标斜线)条图是基于在未经治疗的年 龄相配的小鼠中发现的T细胞和树突状细胞的正常数量。(A)T细 胞数：重建后两周和四周，阉割和未阉割小鼠中的细胞数均减少。 (B)来源于供体的骨髓性树突状细胞：重建后两周，阉割和未阉 割小鼠中的DC细胞数都正常。在此时点，阉割和未阉割小鼠的细 胞数之间没有显著差异。(C)来源于供体的淋巴样树突状细胞：重 建后两周和四周，细胞数均处于正常水平。两周时，阉割和未阉割 小鼠的细胞数之间没有显著差异。

图22A和B：胎儿肝脏重建后，在阉割和未阉割小鼠中总细胞 数和供体(CD45.2+)脾细胞数的变化。每一测试组有3-4只小鼠。 (A)总的细胞数：重建后两周，细胞数下降，并且阉割和未阉割 小鼠的细胞数之间没有显著差异。重建四周后，阉割小鼠的细胞数 接近正常水平。(B)CD45.2+细胞数：重建后两周，阉割和未阉割 小鼠脾中的CD45.2+细胞数没有显著差异。四周时，阉割小鼠的 CD45.2+细胞数仍较高。在相同的时点，未阉割小鼠体内没有来源 于供体的细胞。

图23A-C：胎儿肝脏重建后的脾T细胞以及来源于骨髓和淋巴 的树突状细胞(DC)。每一测试组有3-4只小鼠。图中对照(在其 上标斜线)条图是基于在未经治疗的年龄相配的小鼠中发现的T 细胞和树突状细胞的正常数量。(A)T细胞数：重建后两周和四周， 阉割和未阉割小鼠的细胞数均减少。(B)来源于供体的(CD45.2+) 骨髓性树突状细胞：重建后两周和四周，阉割和未阉割小鼠的DC 数都正常。在两周时，阉割和未阉割小鼠的细胞数之间没有显著差 异。(C)来源于供体的(CD45.2+)淋巴样树突状细胞：重建后两 周和四周细胞数处于正常水平。两周时，阉割和未阉割小鼠的细胞 数之间没有显著差异。

图24A和B：胎儿肝脏重建后，阉割和未阉割小鼠中总细胞数 和供体(CD45.2+)淋巴结细胞数的变化。每一测试组有3-4只小鼠。 (A)总的细胞数：重建后两周，细胞数处于正常水平，并且阉割 和未阉割小鼠的细胞数之间没有显著差异。重建后四周，阉割小鼠 的细胞数处于正常水平。(B)CD45.2+细胞数：重建后两周，阉割 和未阉割小鼠淋巴结中的供体CD45.2+细胞数没有显著差异。四周 时，阉割小鼠中的CD45.2细胞数仍较高。在相同的时点，未阉割 小鼠体内没有来源于供体的细胞。

图25A-C：胎儿肝脏重建后，阉割和未阉割小鼠肠系膜淋巴结 中，T细胞、来源于骨髓以及淋巴的树突状细胞(DC)的变化。 每一测试组有3-4只小鼠。对照(在其上标斜线)条图是在未经治 疗的年龄相配的小鼠中发现的T细胞和树突状细胞的数量。(A)重 建后两周和四周，阉割和未阉割小鼠的T细胞数均减少。(B)阉割 和未阉割小鼠中，来源于供体的骨髓性树突状细胞数均正常。四周 时，它们都减少。在两周时，阉割和未阉割小鼠的细胞数之间没有 显著差异。(C)来源于供体的淋巴样树突状细胞：重建后两周和四 周细胞数处于正常水平。两周时，阉割和未阉割小鼠的细胞数之间 没有显著差异。

图26：经LHRH激动剂治疗前列腺癌后，对病人(所有患者 大于60岁)外周血淋巴细胞的表型组成进行了分析。治疗前和开 始LHRH激动剂治疗后四个月时，分析了病人样品。治疗前，所有 病人的每毫升血中总的淋巴细胞数都是在对照值的较低端。治疗 后，6/9的病人总淋巴细胞计数显著升高(一些病例增加了一倍)。 与此相关的是6/9的病人的总T细胞数增加。在CD4+亚群中，这 种增加更明显，8/9的病人的CD4T细胞水平升高。而在CD8+亚 群中，趋势不是很明显，有4/9的病人的水平升高，虽然一般来 说升高的程度也小于CD4+T细胞。

图27：LHRH激动剂治疗前后病人血分析显示：T细胞、CD4 或CD8T细胞总比例没有显著改变，治疗后CD4∶CD8比值有不定 的变化。这说明对T细胞亚群的内环境稳定的维持具有最小的 治疗作用，虽然治疗后总T细胞数显著升高。所有的值均与对 照值比较。

图28：经LHRH激动剂治疗后，病人外周血中B细胞和骨髓 性细胞(NK、NKT、和巨噬细胞)的比例分析显示在亚群中具有 不同程度的变化。虽然治疗后NK、NKT、和巨噬细胞的比例相 对不变，但在4/9的患者中B细胞比例下降。

图29：治疗后，病人外周血中B细胞和骨髓性细胞的总细胞 数分析显示，NK(5/9病人)、NKT(4/9病人)和巨噬细胞(3/9 病人)数量在治疗后明显上升。B细胞数未见明显趋势：2/9病 人水平升高，4/9病人没有变化，3/9病人水平下降。

图30A和B：LHRH激动剂治疗后所见到的主要变化是在外周 血的T细胞群内。尤其是纯真(CD45RA+)CD4+细胞的比例选择 性升高，CD4+T细胞亚群中纯真(CD45RA+)与记忆(CD45RO+) 的比例在6/9病人中升高。

图31：用不同的激光脉冲能量降低皮肤的阻碍效应。用低至 10mJ能量辐照皮肤，皮肤阻碍效应则下降，利用拟合曲线来内推 数值。

图32：药物通过皮肤的渗透。把胰岛素作为样本药物，经激光 辐照后，皮肤的渗透性大大增加。

图33：给皮肤施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)和单个脉冲瞬态 后，皮肤荧光随时间的变化。强度的峰值出现于大约640nm处， 并在治疗210分钟后最高(虚线)。

图34：不加脉冲瞬态，只加5-氨基乙酰丙酸(ALA)后，皮 肤荧光随时间的变化。在不同的时点强度几乎没有什么变化。

图35：给皮肤施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)和在不同峰值应 力下的单次脉冲瞬态后，皮肤荧光变化的比较。角质层的可渗透 程度取决于峰值应力。

发明详述

本发明包括患者预防疾病的方法。如上所述，年老的(青春期 后)胸腺导致机体免疫系统功能下降(与峰值水平相比)。本发明 利用重新激活胸腺的方法来增强免疫系统功能，因而增加抵抗力， 并且预防多种外来因素引起的感染。在一些情况下，未能预防感染， 但在这些情况下，更为强大有力的免疫系统可以帮助机体减少感染 的广度和病程的长度。

在某些情况下，本发明的方法利用经遗传修饰的造血干细胞、 淋巴样祖细胞、骨髓性祖细胞、上皮干细胞、或其组合(GM细胞)， 来对特定抗原产生免疫系统抗性。这种实施例在共同提出的未决美 国专利申请09/758,910中有详细描述。一种合适的能产生或诱导对 一种或多种感染原的抗性的基因或多核苷酸，被加入到干和/或祖细 胞中。把经修饰的细胞注射到其胸腺用本发明的方法进行重新激活 的患者体内。经修饰的干和祖细胞被胸腺摄取并转化为T细胞、树 突状细胞、和其它在胸腺中产生的细胞。每种新细胞都含有母体干 /祖细胞的遗传修饰，并因此对一种或多种感染原引起的感染具有抗 性。在阉割后两周内，骨髓、血液和外周淋巴器官(如脾和淋巴结) 中B细胞的数量也增加。

受体的胸腺可通过阻断性类固醇介导的传向胸腺的信号而被 重新激活。这种阻断逆转了受体的激素状态。产生阻断的优选方 法是通过阉割。阉割的方法包括但不限于化学阉割和手术阉割。 在阉割过程中或阉割之后，GM细胞被移植入患者体内。这些细胞 被患者胸腺接纳，变为胸腺产生的新的T细胞和DC的一部分。得 到的T细胞群含有已被插入干/祖细胞中的遗传修饰。

一种优选的重新激活胸腺的方法是通过阻断LHRH对垂体的 直接和/或间接的刺激作用，这可导致促性腺激素FSH和LH的丢 失。这些促性腺激素通常作用于性腺来释放性激素，特别是女性的 雌激素和男性的睾酮；该释放因FSH和LH的丢失而被阻断。直接 导致的结果是类固醇血浆水平的急剧下降，从而导致对胸腺不断 释放抑制信号。胸腺再生的程度和动力学可通过注射CD34+造血 细胞(最好是自体的)而得到增强。

本发明可用于任何受性类固醇驱使成熟并具有免疫系统的动 物种属(包括人类)，例如哺乳类和有袋动物，较好为大型哺乳类， 优选为人类。

术语“再生”、“重新激活”、和“重建”、及它们的派生词在本 文可以替换使用，指的是萎缩的胸腺恢复到它的活性状态。

如本文所使用的，“阉割”是指体内性类固醇的产生和分布 的明显减少或消失。当胸腺的功能完全恢复时，就可以有效地使病 人恢复到青春期前的状态。手术阉割切除患者的性腺。

一种非持久的阉割方法是通过在一段时间内给予化学药物，本 文称作“化学阉割”。许多种化学药物都有这种作用。在化学药物 使用期间以及随后的一段时间里，患者的激素产生停止。优选地， 在施药停止后，该阉割作用会逆转。

切断传向胸腺的性类固醇介导的信号

很易理解，传向胸腺的性类固醇介导的信号可用多种方式切 断，这些方式为专业技术人员所熟知，其中的一部分在本文进行描 述。例如，抑制性类固醇的产生或阻断胸腺内一种或多种性类固醇 受体就会完成所希望的切断，如可给予性类固醇激动剂或拮抗剂、 或主动(抗原)或被动(抗体)的抗性类固醇接种疫苗(vaccinations)。 给予一种或多种性类固醇类似物也可抑制性类固醇的产生。在一些 临床病例中，通过物理阉割永久切除性腺可被采用。

在优选具体实施例中，传向胸腺的性类固醇介导的信号是通 过给予性类固醇类似物、优选为促黄体激素释放激素(LHRH)的 类似物加以切断。性类固醇类似物及其在治疗和化学阉割中的应用 是众所周知的。此类类似物包括但不限于下列LHRH受体 (LHRH-R)的激动剂：布舍瑞林(Hoechst公司)、塞托瑞林 (Cystorelin(Hoechst公司))、达必佳(商品名Debiopharm； Ipsen/Beaufour公司)、地洛瑞林(Deslorelin)(Balance Pharmaceuticals公司)、戈那瑞林(Ayerst公司)、戈舍瑞林(商品 名Zoladex诺雷德；Zeneca公司)、组氨瑞林(Orth公司)、亮丙立 德(商品名Lupron利普安；Abbott/TAP公司)、亮丙瑞林(Plosker 等公司)、黄体瑞林(Wyeth公司)、美替瑞林(Meterelin)(WO 9118016)、那法瑞林(Syntex公司)、和曲普瑞林(美国专利第 4,010,125号)。LHRH类似物还包括但不限于下列LHRH-R的拮抗 剂：阿巴瑞克(Abarelix)(商品名Plenaxis；Praecis公司)和西曲 瑞克(Cetrorelix)(商品名；Zentaris公司)。激动剂的组合、拮抗 剂的组合、及激动剂同拮抗剂的组合也包括在内。上述参考文献 所披露的内容结合于此作为参考。目前优选的类似物是地洛瑞林 (Deslorelin)(在美国专利第4,218,439中披露)。更多的目录可参 见Vickery等，1984。

在优选具体实施例中，给予患者LHRH-R拮抗剂，之后给予 LHRH-R激动剂。这种方法可以在性类固醇产量降低之前，阻止 或限制任何由于施用激动剂而可能诱导的性类固醇产生高峰。 在另一个具体实施例中，采用只引起很少或不引起性类固醇生产 高峰的LHRH-R激动剂，之前可给予或不给予LHRH-R拮抗剂。

虽然刺激胸腺重新激活主要基于对性类固醇的效应和/或 LHRH类似物的直接效果的抑制，包括其它一些增强胸腺功能的物 质也是有用的。这类化合物包括但不限于白介素2(IL2)、白介素 7(IL7)、白介素15(IL15)、上皮和成纤维细胞生长因子家族成员、 干细胞因子、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，GCSF)、和角质形成细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)。可以想象这些附加的化合物只能在LHRH类似物 初次应用时使用一次。然而，这些物质中的一种或其组合可以在任 何时侯增加使用，来进一步刺激胸腺。另外，可开发和应用基于

通常胸腺及免疫系统改进的一个重要特征是，阻断性类固醇之 后，骨髓功能也有增强。这包括但不限于HSC产生和/或释放的增 加。这些HSC能够迁移到胸腺并辅助增加胸腺生成(thymopoiesis)。

药物组合物

本发明所用的化合物可负载于任何药用载体或不使用载体。具 体例子包括生理性兼容的包衣、溶剂、和稀释剂。用于胃肠道外、 皮下、静脉、和肌肉注射等途径的药物应被保护起来，比如采用胶 囊化方式(encap sulation)。可替换地，这些药物组合物可采用能 保护有效成分的载体形式给予，同时允许这些成分的缓慢释放。本 技术领域内已知有多种多聚体和共聚物可用于制备定时释放制剂， 比如多种形式(versions)的乳酸/羟乙酸共聚物。例见美国专利 第5,410,016号，其利用聚乙二醇(PEG)的改性多聚体作为生物 可降解的胶囊。

用于口服的剂型可制成液体、胶囊、片剂等。这些组合物可包 括，例如，赋形剂、稀释剂、和/或防止有效成分分解的包被物 (coverings)。这些剂型为大家所熟知。

在任何制剂中，可包括对LHRH类似物的活性没有负面影响的 其它化合物。具体例子是本文所描述的各种生长因子和其它细胞 因子。

剂量

LHRH同源物可一次性给予，其效果会持续一段时间。较好地， 制剂的有效期为一至两个月，更好为一至三个月。当使用激动剂时， 血中性类固醇降至最低值需要的时间大约为3周，而当使用拮抗剂 时则需要1天。在优选具体实施例中，一次剂量应能维持一个流行 病的周期。例如，“流感季”通常发生在冬季的几个月。可制备 LHRH类似物制剂并用本文所描述的方法给予，以便能在流感季 开始后的两个或更多月内保护患者不受感染，每两个月或更多个 月追加剂量，直至感染的危险降低或消失。

标准剂量根据所用类似物的种类有所不同。一般来讲，剂量在 大约0.01μg/kg和大约10mg/kg之间，优选为大约0.01mg/kg和大 约5mg/kg之间。剂量根据所用LHRH类似物或疫苗的种类而有所 不同。例如，对男性，在目前给药条件下，在第21天(在胸腺加 强日之前)时一次性(有效期3个月)给予10.8mg戈舍瑞林，在 第63天(在胸腺加强日之后)时再次注射3.6mg，其可以再维持 效果28天左右。对女性，在第1、7、35和63天分别给予3/6mg (有效期28天)。

这种制剂可用于增强免疫系统。可替换地，该制剂可制备成在 特别地防止流感病毒感染的同时增强免疫系统。后一种制剂可包括 经基因改造(engineered)并能对流感病毒产生抗性(见下文) 的GM细胞。GM细胞可同LHRH激动剂制剂同时给予或分别给予 (包括空间上和/或时间上)。正如非GM细胞的情况一样，根据 流感季的长短，可向患者追加多次剂量，来保护并避免流感病毒的 感染。

化学阉割剂的施用

本发明的化合物的给药可采用许多本领域技术人员熟知的方 法来完成。给予化学抑制剂来抑制传向胸腺的性类固醇介导的信号 的一个标准方法是，一次性给予LHRH激动剂，其疗效可维持3个 月。对此，简单的一次性静脉注射或肌肉注射是不够的，因为这种 激动剂在三个月结束之前就会从患者体内清除掉。作为替代，可以 采用长效制剂注射或植入物，或者采用其它任何能缓慢释放抑制剂 的方法。同样，可采用延长抑制剂在体内的半衰期的方法，例如通 过对化合物进行修饰，而同时保持此处所需的功能。

更为有效的给药机制的实例包括但不限于皮肤的激光辐照、以 及在皮肤上产生高压脉冲瞬态(impulse transients)(也称为应力波 或脉冲暂态)，在每种方法实施的同时或在其实施之后，在同样的 皮肤区域放置带有或不带有载体的化合物。优选的放置方法是采用 贴片并在治疗过程中一直贴于皮肤上。

给药的一种方式是采用激光束(特殊地聚焦的并在合适的波长 产生激光)，以在患者的皮肤上产生小的穿孔或蚀变。参见美国专 利第4,775,361号、美国专利第5,643,252号、美国专利第5,839,446 号、和美国专利第6,056,738号，所有这些结合于此作为参考文献。 在优选的具体实施例中，激光束的波长是在0.2和10微米之间。更 好地，波长是在大约1.5-3.0微米之间。最好地，波长是大约2.94 微米。在一个具体实施例中，激光束是用透镜进行聚焦，以通过皮 肤表皮在皮肤上产生辐照斑。在另一个具体实施例中，对激光束进 行聚焦，从而只通过皮肤的角质层产生辐照斑。

如本文所使用的，“消融”和“打孔”是指在皮肤上产生的孔。 这样的孔可具有不同的深度；例如它可以只透过角质层，可以一直 穿入皮肤的毛细血管层，或者可以终止于这两层之间的任何地方。 如本文所使用的，“蚀变”指在不产生孔的情况下皮肤结构的改变， 其使得皮肤的通透性增加。正如打孔的情况一样，皮肤可以被蚀变 (altered)至任何厚度。

在规定激光束的时候可考虑几种因素，包括波长、能注量、 脉冲时间(pulse temporal width)、和辐照斑的大小。在优选的具 体实施例中，能注量的范围是0.03-100,000J/cm2。更优选地，能注 量的范围是0.03-9.6J/cm2。光束波长部分取决于激光材料，例如铒: 钇铝石榴石。脉冲时间宽度是脉冲宽度的结果，该脉冲宽度由例 如一系列电容器、闪光灯、和激光棒材料(laser rod material) 所决定。该脉冲宽度最优是在1fs(尘秒)和1000μs之间。

依照此方法，由激光产生的穿孔或蚀变不必由来自激光的单脉 冲实现。在优选的具体实施例中，透过角质层的穿孔或蚀变是利 用多个激光脉冲产生，每个脉冲只穿孔或蚀变靶组织深度的一部 分。

为此，用单脉冲的能量除以所希望的脉冲数，就能粗略估计 多个脉冲在角质层上形成穿孔或蚀变所需要的能量。例如，如果如 果特定大小的斑需要1J的能量来产生穿过整个角质层的穿孔或 蚀变，那么可用10个脉冲来产生定性上相似的穿孔或蚀变，每个 脉冲的能量为1/10。因为希望患者在辐照期间不移动靶组织(人的 反应时间在100ms左右)，并且希望每个脉冲产生的热量不会明显 扩散，所以，在优选的具体实施例中，来自激光的脉冲重复率 应该能使整个穿孔过程在不到100ms内完成。可选地，靶组织 和激光的定位可进行机械固定，从而在更长的辐照时间内也不会发 生靶位置的改变。

为了采用引起很少出血或不引起出血的方法进行皮肤穿孔，可 通过外表面(outer surface)对皮肤进行穿孔或蚀变，比如角质层， 但不要深入到毛细血管层。激光束可精确地在皮肤上聚焦，在皮肤 上产生直径约为0.5μm-5.0cm的光束。可选地，光斑可以是狭缝形 状，宽度大约为0.05-0.5mm，长度可达2.5mm。宽度可以是任何尺 寸，决定于辐照区域的解剖特点和所需要的有待被移除液体或将要 施予的药物的渗透速率。聚焦透镜的焦距可是任意长度，但在一个 具体实施例中为30mm。

通过改变波长、脉冲宽度、能注量(其是激光输出能量(单位 是焦耳)和焦点光束大小(cm2)的函数)、和辐照斑大小，可以将 对角质层的影响控制在消融(穿孔)和非消融改变(蚀变)之 间。角质层的消融和非消融蚀变均可增加随后施用药物的渗透性。

例如，其它变量维持不变的情况下，通过减少脉冲能量，对组 织产生的效应可在消融和非消融之间进行改变。利用脉冲宽度在 300μs左右的铒:钇铝石榴石激光器，采用单脉冲或辐射能并在皮 肤上辐照2mm大的斑点，超过大约100mJ的脉冲能量可导致部分 或全部消融，而低于约100mJ的任何脉冲能量则导致角质层的部分 消融或非消融蚀变。可选地，通过采用多脉冲方式，增强体液或所 给药物的渗透性所需的阈脉冲能量(threshold pulse energy)则下 降，下降的系数大约等于脉冲数目。

可替换地，维持其它变量不变的情况下，通过减少光斑尺寸， 也可以使对皮肤的改变处于消融和非消融组织效应之间。例如， 减半光斑面积将导致产生同样效应所需的能量减半。可获得小至0.5 微米的辐照，例如，通过将激光器的辐射输出(radiant output) 耦合于显微镜物镜的多个物镜中(例如，可购自Nikon公司， Melville，纽约)。在这种情况下，激光束聚焦形成的光斑可能会 小至显微镜的分辨率限制的数量级，后者大约为0.5微米的数量 级。事实上，如果激光束呈高斯分布，受辐照影响的区域尺寸可 以小于测量的光束尺寸，并且可超过显微镜的成像分辨率。在这 种情况下，为非消融性地蚀变组织，采用3.2J/cm2的能注量可能 比较合适，其对于半微米大的光斑将需要大约5nJ的脉冲能量。这 么低的脉冲能量可容易从二极管激光器获得，也可以，例如，将 铒:钇铝石榴石激光器产生的激光束经吸收滤光器(如玻璃) 衰减后获得。

可选地，保持其他变量不变，通过改变辐射能的波长，就可以 使对皮肤的改变处于消融和非消融性组织效应之间。例如，利 用钬:钇铝石榴石(Ho:YAG；2.127微米)代替铒:钇铝石榴石 (Er:YAG；2.94微米)激光器，可使得组织对能量的吸收减少， 产生较轻的穿孔或蚀变。

激光器产生的皮秒和尘秒脉冲也可用于产生皮肤的蚀变或消 融。这可用调制的二极管或相关的微片激光器来完成，其输出时 间宽度(temp oral widths)在1尘秒至1ms之间的单脉冲。(参 见D.Stern等，“用在532和625nm处的纳秒、皮秒、和尘秒激 光进行角膜消融”，《角膜激光消融》，(“Corneal Ablation by Nanosecond，Picosecond，and femtosecond Lasers at 532and 625 nm，”Corneal Laser Ablation)Vol.107，pp.587-592(1989)，其结合 于此作为参考文献，该参考文献披露了低至1尘秒的脉冲宽度 的应用)。

另一种递药方法采用高压脉冲瞬态在皮肤上产生通透性。 参见美国专利第5,614,502号和美国专利第5,658,892号，两者结 合于此作为参考文献。高压脉冲瞬态，例如，应力波(例如，当 应力波是由激光产生时的激光应力波(LSW)，具有特定的上升时 间和峰值应力(或压力)，可安全和有效地影响化合物(比如本发 明中所披露的那些化合物)通过上皮组织层(例如角质层和粘膜) 的转运。这些方法可用于很大尺寸范围的化合物的给药，与其净电 荷无关。另外，本方法中所用脉冲瞬态可避免组织损伤。

在暴露于脉冲瞬态之前，上皮组织层(例如，角质层)对外来 化合物可能是不通透的；这阻止该化合物向上皮层下面的细胞扩 散。将上皮层暴露于脉冲瞬态可以使化合物通过上皮层进行扩散。 通常，扩散的速率取决于脉冲瞬态的性质和被施予的化合物的大 小。

通过特定上皮组织层(例如皮肤角质层)的穿透速率，还取决 于其它几种因素，包括pH值、皮肤基质组织(cutaneous substrate tissue)的代谢、角质层的外部与内部的压力差、以及皮肤的解剖 学部位和物理条件。皮肤的物理条件又取决于健康状况、年龄、性 别、种族、皮肤护理、和接触史。例如，之前接触过有机溶剂或表 面活性剂可影响皮肤的物理条件。

通过上皮组织层给予的化合物的量还取决于上皮层保持通透 的时间、以及变得可通透的上皮层表面积的大小。

脉冲瞬态的性质和特点由其产生能源所控制。参见WO 98/23325，其结合于此作为参考文献。然而，它们的特点因其传 播所经过的偶联介质的线性和非线性特性而改变。偶联介质引起的 线性衰减主要衰减脉冲瞬态的高频成分。这使得带宽随着脉冲瞬 态相应的上升时间的增加而减少。另一方面，偶联介质的非线性 特性使上升时间缩短。上升时间的缩短是声音和粒子速度对应力 (压力)依赖的结果。随着应力升高，声速和粒子速度也提高。 这使得脉冲瞬态的前沿变得更陡。线性衰减、非线性系数、和峰值 应力的相对强度决定了波需传播多远，才能使上升时间的陡度增 加变得显著。

选择上升时间、强度(magnitude)、和脉冲瞬态的持续时间， 以产生非破坏性的(即，非休克波)脉冲瞬态，其可临时增加上皮 组织层的通透性。通常上升时间至少为1ns，优选为大约10ns。

对不同的上皮组织或细胞层，脉冲瞬态的峰值应力或压力有所 不同。例如，为通过角质层传送化合物，脉冲瞬态的峰值应力或 压力应设置于至少400巴；优选至少1,000巴，但不能超过约2,000 巴。

对上皮粘膜层来说，峰值压力应设于300巴和800巴之间， 优选为300巴和600巴之间。优选地，脉冲瞬态的持续时间为几 十ns，因此仅与上皮组织相互作用很短时间。与脉冲瞬态相互 作用后，上皮组织未受到永久损伤，但保持通透性最长达约3分 钟。

另外，这些方法涉及对患者仅施加数个离散的高幅脉冲。施于 患者的脉冲瞬态的数量一般少于100，更好少于50，而最好少于10。 当多个光脉冲被用于产生脉冲瞬态时，相邻脉冲之间的时间间隔为 10至120秒，这对避免上皮组织的永久损伤是足够长的。

脉冲瞬态的特性可用本技术领域的标准方法进行测量。例如， 峰值应力或压力、和上升时间可用聚偏氟乙烯(PVDF)换能器的 方法(描述于Doukas等，超声波生物医学(Ultrasound Med.Biol.)， 21：961(1995))进行测量。

可用多种能源产生脉冲瞬态。产生脉冲瞬态的物理现象通常 选自下列三种不同的机制：(1)热弹性产生；(2)光学击穿；或(3) 消融。

例如，通过采用高能激光源来消融靶材料，可激发脉冲瞬 态，然后通过偶联介质将脉冲瞬态偶联于上皮组织或细胞层。 该偶联介质可以是，例如，液体或凝胶，只要它是非线性的。因此， 水、油(例如蓖麻油)、等渗介质(如磷酸缓冲盐水(PBS))、或凝 胶(如胶原凝胶)，可用作偶联介质。

另外，该偶联介质可包括能增强转运的表面活性剂，例如，在 脉冲瞬态发生之后，通过延长角质层对化合物保持通透的时间。该 表面活性剂可以是，例如，离子型去污剂或非离子型去污剂，因此 可包括，例如，月桂基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、和N，N- 二甲基-N-十二烷胺氧化物(月桂基氧化二甲胺)。

吸收靶材料担当光学触发换能器的角色。随着对光的吸收， 靶材料经历快速热膨胀，或被消融，从而发射脉冲瞬态。通常，金 属和聚合物膜在可见光和紫外光谱区具有高吸收系数。

许多类型的材料可与激光束一起用作靶材料，只要它们在所 用激光的波长可以完全吸收光。靶材料可以是金属(如铝或铜)； 塑料(如聚苯乙烯，例如黑色聚苯乙烯)；陶瓷；或高浓度染料溶 液。靶材料的尺寸必须比所用激光能量的截面积大。另外，靶材料 必须厚于光穿透深度以保证光不会达到皮肤表面。靶材料还必须 足够厚以提供机械支撑。当靶材料是由金属制成时，典型的厚度可 以是1/32英寸(0.79375mm)至1/16英寸(1.5875mm)。对塑料靶材 料来说，厚度为1/16英寸(1.5875mm)至1/8英寸(3.175mm)。

也可利用限制性消融来增强脉冲瞬态。在限制性消融中，激 光束透明材料，如石英光学窗，被放置在紧密接触靶材料的位置。 等离子体的限制(利用透明材料使靶材料消融而产生)在数量 级上提高了耦合系数(Fabro等，应用物理学杂志(J.Appl. Phys)，68：775，1990)。该透明材料可以是石英、玻璃、或透明塑料。

因靶材料和限制性透明材料之间的空隙允许等离子体进行膨 胀，因此降低了传给靶的动量(momentum)，所以透明材料优 选采用起初为液态的粘合剂(比如含碳的环氧物)来粘结于靶 材料，以预防这类空隙。

激光束可用业内熟知的标准光调制技术来产生，如使用Q开 关或锁模激光器，利用，例如，电光装置或声光装置。标准的 商业上可购的能够在红外线、可见光、和/或红外线光谱采用脉冲 形式的激光器包括Nd:YAG激光器、Nd:YLF激光器、CO2激光器、 激基分子激光器、染料激光器、Ti：蓝宝石激光器、二极管激光 器、钬(及其它稀土材料)激光器、以及金属蒸气激光器。这些 光源的脉冲宽度是可调的，并且可在数十皮秒(ps)到数百微秒之 间变化。在本发明的应用中，光脉冲宽度可在100ps和约200ns间 变化，优选在大约500ps和40ns之间。

脉冲瞬态还可以由体外碎石器产生(一个实例可参见Coleman 等，超声波生物医学(Ultrasound Med.Biol.)，15：213-227，1989)。 这些脉冲瞬态的上升时间为30至450ns，其比激光产生的脉冲瞬 态长。为了形成具有合适的上升时间的脉冲瞬态(对利用体外 碎石器的新方法而言)，让脉冲瞬态在非线性偶联介质(如， 水)中传播一定的距离(用前述方程(1)计算而得)。例如， 当采用碎石器产生出的脉冲瞬态具有100ns的上升时间和500巴的 峰值压力时，在与上皮细胞层接触之前，脉冲瞬态应该在偶联介质 中穿行的距离大约为5mm。

对由碎石器产生的脉冲瞬态进行修整(shaping)的另一个好 处是，作为在非线性偶联介质中传播的结果，波的拉伸分量 (tensile component)将变宽并衰减。这个传播距离应该进行调 整来产生这样的脉冲瞬态，其拉伸分量的压力仅为波的压缩分量 的峰值压力的约5％至10％。这样，修整过的脉冲瞬态不会损伤 组织。

所用的碎石器的类型无严格限制。可采用电动液压的、电磁 的、或压电的碎石机。

脉冲瞬态还可由换能器产生，如压电换能器。优选地，该换 能器直接与偶联介质接触，并在施加光场、热场、或电场后迅速 位移，从而产生脉冲瞬态。例如，可采用电介体击穿，并通常采 用高压电火花或压电换能器(与某些体外碎石机中用到的类似， Coleman等，超声波生物医学(Ultrasound Med.Biol.)， 15：213-227，1989)进行诱发。在采用压电换能器的情况下，该换 能器在施加电场后经受快速膨胀，从而在偶联介质中引起快速 位移。

此外，脉冲瞬态可在纤维光学的帮助下产生。光纤供给系统特 别易于操作，并且可用于辐照与上皮组织层相邻的靶材料，从而在 难以到达的位置产生脉冲瞬态。当光学上与激光器联用时，这些 类型的供给系统是优选的，因为其可以结合于导管及相应柔性装置 中，并用于辐照人体内大部分器官。另外，为了能发射具有预期的 上升时间和峰值应力的脉冲瞬态，光源的波长可以容易地进行整 形，以在特定靶材料中产生适当的吸收。

可替换地，响应爆炸脉冲(detonating impulse)，高能材料 可产生脉冲瞬态。引爆剂可通过产生放电或电火花来引爆高能材 料。

可将流体静压力与脉冲瞬态联用以增强穿过上皮组织层的 化合物转运。因为脉冲瞬态引发的效应持续数分钟，通过脉冲瞬 态之后在上皮组织层(例如，皮肤角质层)表面施加流体静压的方 法，药物顺应其浓度梯度穿过上皮细胞层的转运速度可以加快。

干细胞或祖细胞的遗传修饰

基因

对本发明有用的基因和基因片段(多核苷酸)包括那些编码T 细胞对特定感染原引起的感染具有抗性的基因和基因片段。这类感 染因素包括但不限于HIV、T细胞白血病病毒、和其它导致淋巴组 织增生病的病毒。对于HIV/AIDS，可使用多种基因和基因片段， 包括但不限于：船形盆转录因子(nef transcription factor)；编码 特异性切断HIV基因的核酶的基因，如tat和rev(Bauer G.等，1997)； HIV-1rev基因的反显性突变株(trans-dominant mutant form)， RevM10，它已显示可抑制HIV复制(Bonyhadi等，1997)；HIV-1 rev应答元件(RRE)的过表达结构(Kohn等，1999)；编码RNA 或蛋白的任何基因，其表达能抑制细胞HIV感染或复制；及其片段 和组合。

这些基因或基因片段以稳定表达的形式应用。如在本文所使 用的，术语“稳定表达形式”是指，在基因或基因片段(“功能片 段”)转入宿主细胞后，其产物(RNA和/或蛋白)能在该细胞及其 分裂和/或分化后的子代中，能够至少半恒定地进行表达。这需要该 基因或基因片段，无论是否被包含于载体中，都具有适合的DNA 向RNA转录的信号序列。另外，当基因或基因片段编码的蛋白是 影响患者状态的活性分子时，DNA也将编码翻译信号。

在大多数情况下，基因或基因片段包含在载体中。本领域的一 般技术人员熟知可用于表达所需RNA或蛋白的表达载体。表达载 体是能够引导转录其中所含DNA序列并能引导翻译目标RNA (resulting RNA)的载体。表达载体能够在要进行遗传修饰的细 胞内进行复制，并包括质粒、噬菌体、病毒、和微型染色体。可替 换地，该基因或基因片段可以成为细胞染色体DNA的整合部分。 重组载体及方法学是本领域熟知的。

用于表达本发明的蛋白的表达载体包括复制起点。适当构建的 表达载体包括可在细胞内自主复制的复制起点，或能够整合到宿主 细胞染色体中。这样的载体还可包括选择性标记物、有限数量的有 用的限制性内切酶位点、高拷贝数、和强启动子。启动子是DNA 序列，其引导RNA聚合酶结合到DNA并引发RNA合成；强启 动子可以高频引发这种起始。本发明的表达载体是可操作连接于 编码RNA或蛋白(用于本发明)的DNA，即，该载体能引导 附着DNA分子的复制，又能引导DNA分子编码的RNA或蛋 白的表达。因此，对于蛋白而言，该表达载体必须具有附着DNA 分子的适当的转录起始信号上游片段，保持正确的阅读框架， 从而允许在调控序列的调控下表达DNA；分子以及产生所预期 的由DNA分子编码的蛋白。表达载体可包括但不限于克隆载体、 修饰的克隆载体、和特定设计的质粒或病毒。优选地，采用诱导启 动子，从而可以控制插入基因或多核苷酸表达的数量和时间。

细胞

造血干细胞(HSC)是用于遗传修饰的优选细胞。这些细胞可 来源于骨髓、外周血、或脐带、或任何其他造血干细胞来源，并 且可为自体的或非自体的。淋巴样和骨髓性祖细胞以及上皮干细 胞也是有用的，并且也可以是自体的或非自体的。

如果使用非自体(供体)细胞，对这些细胞的耐受性则在胸腺 重新激活的步骤中产生。在阻断传向胸腺的性类固醇介导的信号的 起始过程中或其后，将有关的经遗传修饰的供体细胞移植入受体体 内。这些细胞被供体胸腺接纳，并且成为胸腺产生的新T细胞和 DC的一部分。所获得的T细胞群将受体和供体细胞都识别为自体 细胞，因此可产生对来自供体的移植物的耐受性。参见共同提出的 未决专利申请U.S.S.N.09/，，其结合于此作为参考文献。

基因修饰的方法

标准的重组方法可用于介导遗传修饰物进入用于基因治疗的 细胞内。例如，反转录病毒载体转导培养的HSC是一种成功的方 法(Belmont和Jurecic，1997，Bahnson，A.B.等，1997)。其它载体 包括但不限于腺病毒衍生或慢病毒衍生的载体和莫洛尼鼠白血病 病毒衍生的载体。

还可采用下列方法：微粒介导(particle-mediated)的基因转移 如用基因枪(Yang和Ziegelhoffer，1994)、脂质体介导的基因转移 (Nabel等，1992)、磷酸钙和遗传修饰载体的共沉淀(Graham和 Van Der Eb，1973)、电打孔(Potter等，1984)、和微注射(Capecchi， 1980)，以及任何其它可以稳定地将基因或寡核苷酸(优选在载体 中)转移入HSC和要进行遗传修饰的其它细胞中，以致基因至少 在部分时间内表达的方法。

预防

本发明提供了通过重新激活患者胸腺预防感染或增强抗感染 能力的方法。这是通过切断性类固醇介导的传向胸腺的信号来实现 的。在这个阶段，患者的免疫系统得到恢复，增强了其对外来抗原 (如病毒和细菌)的应答能力。如图10-15所示，其说明了在病毒 (HSV)侵犯的情况下，胸腺重新激活对小鼠免疫系统的影响。预 先进行胸腺重新激活的小鼠表现出对HSV感染的抗性，而那些没 有进行胸腺重新激活(老年胸腺)的小鼠有较严重的HSV感染。 众所周知，小鼠免疫系统与人类的免疫系统很类似，小鼠的试验结 果可以反映人类的情况。这通过上述的人类胸腺重新激活的效应的 试验数据得到进一步证实。

一个进一步的步骤，即在胸腺重新激活的过程中向患者补充天 然的(native)造血细胞，增加了患者机体的免疫功能。特别是， 通过向受体给予遗传修饰的细胞，免疫系统可对不同抗原产生特异 性反应。经遗传修饰的细胞可以是造血干细胞(HSC)、上皮干细 胞、或造血祖细胞。较好地，该经遗传修饰的细胞是CD34+HSC、 淋巴祖细胞、或骨髓性祖细胞。优选地，该经遗传修饰的细胞是 CD34+HSC。经遗传修饰的细胞被施予患者体内，并通过外周血系 统迁移到胸腺。在缺少性类固醇的情况下，胸腺对这些造血前体细 胞的摄取明显增强。这些细胞整合入胸腺，并产生带有来自这些改 变了的细胞的遗传修饰的树突状细胞和T细胞。结果为，循环在受 体外周血中带有预期遗传变化的T细胞群、以及通过患者胸腺重新 激活导致的相应的细胞群、组织和器官的增加，其能够对抗原产生 迅速、特异的反应。

对骨髓和HSC的影响

本发明提供了增加患者骨髓产量，包括增加HSC产量的方法。 这可用于多种情况。例如，化疗的严重副反应之一，无论是用于癌 症或其它目的，可以是其对患者骨髓的负面影响(negative impact)。 取决于化疗的剂量，骨髓可能被破坏，并且血细胞的产生可能被阻 止。根据本发明，在化疗治疗之后，给予一定剂量的LHRH类似物， 可帮助恢复化疗破坏的骨髓和血细胞。可替换地，在化疗之前给予 LHRH类似物能够增加HSC和其它血细胞的数量，从而可减少化 疗的影响。

在一些化疗情况(regiment)中，例如治疗任一种血癌的大剂 量化疗，对骨髓的破坏是预想的后果。本发明的方法可在破坏发生 之后立即使用，来刺激骨髓并且增加HSC和其后代血细胞的产量， 从而缩短患者的恢复期。在化疗之后，通常允许1天或几天的时间 来将化疗药物从患者体内清除，根据本文所述的方法，一定剂量的 LHRH类似物可给予患者。这可同自体或异体(heterologous)骨髓 或造血干细胞或祖细胞、以及其它诸如干细胞因子等因子合并使 用。

另外，患者可具有“倦怠的”骨髓，并且可能不能产生维持正 常功能的足够数量的HSC和其它血细胞。这可由多种状况导致， 包括正常衰老、延长的感染、化疗后、放疗后、慢性疾病状态(包 括癌症)、基因异常、和移植导致的免疫抑制。进一步，放射(例 如全身放射)可对骨髓产量产生较大的影响。这些状况也可以被提 前处理以最大程度减少不良反应(例如对化疗和/或放疗)，或可在 发生之后进行处理来逆转该效果。

小动物研究

材料和方法

动物

获自Monash大学动物服务中心的CBA/CAH和C57B16/J雄性 小鼠饲养于常规条件下。年龄在4-6周至26月，并对相关情况进行 标记。

阉割

向动物腹腔内注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(盐酸赛拉嗪； Bayer Australia公司，Botany NSW，澳大利亚)和1.5mg盐酸氯 胺酮(氯胺酮针剂(Ketalar)；Parke-Davis公司，Caringbah，NSW，澳 大利亚)的生理盐水进行麻醉。外科阉割的进行如下：阴囊切开、 暴露睾丸、用缝线系住睾丸、然后随同周围的脂肪组织除去睾丸。

溴脱氧尿苷(BrdU)掺入

小鼠接受两次腹腔内注射BrdU(Sigma化学试剂公司，St. Louis，密苏里州)(100mg/kg体重，于100μl PBS中)，时间间隔 是4小时。对照小鼠只接收赋形剂的注射。第二次注射后一小时， 切开胸腺，或者制成细胞悬液进行FACS分析，或者立即在Tissue Tek(O.C.T.化合物，Miles公司，印第安纳州)中进行包埋，在液 氮中迅速冷冻并储存于-70℃待用。

流式细胞计分析

用CO2窒息法处死小鼠，取出胸腺、脾和肠系膜淋巴结。器官 在冷的PBS/1％FCS/0.02％叠氮化物中，通过一个200μm的滤网轻 柔地进行过滤，离心(650g，5分钟，4℃)，重悬于任何一种PBS/FCS/ 叠氮化物中。脾细胞在4℃下，在红细胞裂解缓冲液(8.9克/升氯 化铵)中孵育10分钟，洗涤并重悬于PBS/FCS/叠氮化物中。细 胞的浓度和存活度用血球计数仪和溴乙锭/吖啶橙测定两次，在 荧光显微镜下观察(Axioskop公司；Carl Zeiss，Oberkochen，德国)。

为进行三色免疫荧光检测，将胸腺细胞用抗αβTCR-FITC或抗 γδTCR-FITC、抗CD4-PE、和抗CD8-APC(均获自Pharmingen公 司，圣地亚哥，加利福尼亚)进行常规标记，然后进行流式细胞仪 分析。脾和淋巴结悬液用αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或 B220-B(Sigma公司)连同CD4-PE和CD8-APC进行标记。B220-B 用抗生蛋白链菌素三色共轭物(购自Caltag实验室公司，Burlingame， 加利福尼亚)显色。

为进行BrdU检测，细胞用CD4-PE和CD8-APC进行表面标记， 随后进行固定和通透性处理，如先前所述(Carayon和Bord，1989)。 简单地说，染色的细胞用1％PFA/0.01％吐温-20在4℃固定O/N。 洗涤过的细胞在37℃下在500μl DNA酶(100孔尼兹单位， Boehringer Mannheim公司，西德)中孵育30分钟，以使DNA变 性。最后，细胞用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson公司)进行孵 育。

为进行四色免疫荧光检测，胸腺细胞用CD3、CD4、CD8、B220、 和Mac-1进行标记，用抗大鼠Ig-Cy5(Amersham公司，英国)共同 检测，门化的阴性细胞(TN)用于分析。继而用 CD25-PE(Pharmingen公司)和CD44-B(Pharmingen公司)染色， 接着用抗生蛋白链菌素三色共轭物(Caltag公司，加利福尼亚) 显色，如前所述(Godfrey和Zlotnik，1993)。然后按照前述方 法进行BrdU检测。

样品用FacsCalibur(Becton-Dickinson公司)进行分析。存活 的淋巴细胞依照0°和90°光散射图进行门化，数据分析采用细胞 寻找(quest)软件(Becton-Dickinson公司)。

免疫组化

冰冻胸腺切片(4μm)用冷冻箱(Leica)切片，并立即用100 ％丙酮固定。

为进行两色免疫荧光检测，切片用本实验室生产的一组单克隆 抗体进行双标记：MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35、 和44(Godfrey等，1990；表1)，并用多价兔抗细胞角蛋白抗体 (Dako公司，Carpinteria，加利福尼亚)评估上皮细胞决定子 (determinants)的共表达。结合的单克隆抗体(mAb)用FITC 共轭的绵羊抗大鼠免疫球蛋白(Silenus实验室)显色，而抗细胞 角蛋白则用TRITC共轭的山羊抗兔免疫球蛋白(Silenus实验室) 显色。

为进行BrdU检测，将切片用抗细胞角蛋白继而用抗兔-TRITC 染色，或用特异的mAb染色，然后用抗大鼠Ig-Cγ3(Amersham公 司)显色。然后按照前述方法进行BrdU检测(Penit等，1996)。简 单地说，切片在70％乙醇中固定30分钟。半干切片在4M盐酸中 进行孵育，用硼酸缓冲液(Sigma公司)进行洗涤以中和，之后用PBS 冲洗两次。用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson公司)检测BrdU。

为进行三色免疫荧光检测，切片用特异性MTS mAb和抗细胞 角蛋白一起标记。然后按照前述方法进行BrdU检测。

用Leica荧光显微镜和Nikon共焦显微镜对切片进行分析。

迁移研究

向动物腹腔内注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(盐酸赛拉嗪； Bayer Australia公司，Botany NSW，澳大利亚)和1.5mg盐酸氯 胺酮(氯胺酮针剂；Parke-Davis公司，Caringbah，NSW，澳大利亚) 的生理盐水进行麻醉。

FITC标记胸腺细胞技术的细节与其它地方(Scollay等，1980； Berzins等，1998)描述的类似。简单地说，暴露胸腺叶，并且每叶 注射大约10μm(μl)的350μg/ml FITC(在PBS中)。伤口经用手术 针缝合，保温小鼠直到从麻醉状态中恢复。注射后约24h，小鼠用 CO2窒息法处死，取下淋巴器官用于分析。

细胞计数后，样品用抗CD4-PE和抗CD8-APC染色，然后用 流式细胞计分析。迁移的细胞被认为是表达CD4或CD8的活的门 化的(live-gated)FITC+细胞(以排除自身荧光细胞和双联体 (doublets))。加入FITC+CD4和CD8细胞的百分率，分别得到淋 巴结和脾的总迁移率。每日输出率用Berzins等(1998)的方法计算。

数据采用不成对的t检验或非参数的曼-惠特尼检验进行分 析，并用来确定对照和实验检验结果之间的统计显著性，实验至少 重复3次。试验数据同对照数据相比的显著性差异用下列方式表示： *p≤0.05，**p≤0.01以及***p≤0.001。

结果

年龄对胸腺细胞群的影响

(i)胸腺重量和胸腺细胞数目

随着年龄的增长，胸腺重量(图1A)和总胸腺细胞数(图1B) 都显著降低(p≤0.0001)。年轻成体的相对胸腺重量(mg胸腺/g 体重)平均值为3.34，在18-24个月时则降为0.66(由于脂肪沉积 无法精确计算)。胸腺重量的降低可归因于胸腺细胞总数的减少： 1-2月的胸腺含有～6.7×107胸腺细胞，24个月时细胞数则减少至～ 4.5×106。阉割使得性类固醇对胸腺的作用消除，于是胸腺再生， 并且在阉割后4周，胸腺的重量和细胞数目都达到与年轻成体相当 的水平(图1A和1B)。有趣的是，在阉割后2周时，胸腺细胞数 目(～1.2×108个)有显著的增长(p≤0.001)，在阉割后4周时恢 复至正常年轻时的水平(图1B)。

胸腺产生的T细胞数的减少不反映在外周，脾细胞数随年龄增 长保持不变(图2A)。外周的内环境稳定机制是明显的，因为脾和 淋巴结中B细胞和T细胞的比例不受年龄和随后到达外周的T细胞 数减少的影响(图2B)。然而，CD4+同CD8+T细胞比例随年龄增 长明显降低(p≤0.001)，从2月时的2∶1降至2岁时的1∶1(图2C)。 阉割和随后进入外周的T细胞数增多后，没有观察到外周T细胞数 目的变化：脾T细胞数、以及脾和淋巴结中的B∶T细胞比例都不因 阉割而改变(图2A和B)。随年龄增长导致的外周中CD4∶CD8比 值的降低在阉割后2周时依然明显，但阉割后4周就完全恢复(图 2C)。

(ii)αβTCR、γδTCR、CD4和CD8表达

为确定随年龄增长胸腺细胞数的减少是否为特定细胞群损耗 的结果，胸腺细胞用特定标记物进行标记，以分析不同的亚群。另 外，这允许对阉割后胸腺再生(repopulation)的动力学进行分析。 主要胸腺细胞亚群的比例同那些正常年轻胸腺进行比较(图3)，发 现其不随年龄变化。此外，将胸腺细胞按表达αβTCR和γδTCR进 行细分，显示这些细胞群的比例不随年龄变化(数据未显示)。在 阉割后2周和4周，胸腺细胞亚群保持同样比例，并且因为胸腺细 胞数量在阉割后增长至高达100倍，这表明所有胸腺细胞亚群的同 步扩增，而并非进化式的逐步扩增。

因此这种老年动物胸腺中细胞数目的减少看来是所有细胞表 型均衡减少的结果，而未见T细胞群体的显著改变。胸腺再生以同 步方式进行，同时补充所有T细胞亚群，而不是按次序补充。

胸腺细胞的增殖

如图4所示，15-20％的胸腺细胞在4-6周时进行增殖。大部分 (～80％)是DP，TN亚群次之(～6％)(图5A)。相应地，通过 免疫组化，大多数细胞分裂见于被膜下和皮质(数据未显示)。用 FACS分析可在髓质区见到一些细胞分裂，显示部分SP细胞(9％ 的CD4T细胞，25％的CD8T细胞)分裂(图5B)。

尽管在年长胸腺中细胞数明显减少，胸腺细胞的增殖仍保持恒 定，在2岁时降至12-15％(图4)，同时增殖群体的表型与2月时 的胸腺相类似(图5A)。免疫组化揭示1岁时的细胞分裂反映年轻 成体的情景；然而，在2岁时，增殖主要见于外层皮质和维管结构 周围(数据未显示)。在阉割后2周，尽管胸腺细胞数明显减少， 增殖的胸腺细胞的比例不变，再次表明细胞的同步扩增(图4)。免 疫组化揭示了胸腺细胞增值的定位和分裂细胞的范围类似于2个月 胸腺在阉割后2周的状况(数据未显示)。当分析代表增殖群的每 个亚群的比例时，增殖群体中的CD8T细胞百分比明显升高 (p＜0.001)(2月和2岁时1％，在阉割后2周增加到～6％)(图 5A)。

图5B显示年轻、年长、和阉割后小鼠中，各亚群的增殖范围。 DN亚群的增殖有明显的衰减(p≤0.001)(2月时的35％到2岁时 的4％)。CD8+T细胞的增殖也明显下降(p≤0.001)，反映了免疫 组化的结果(数据未显示)，即在年长胸腺的髓质中无明显的细胞 分裂。在阉割后4周，DN增殖的下降没有恢复到正常年轻时的水 平。然而，CD8+T细胞亚群的增殖在阉割后2周时明显增加(p≤ 0.001)，并于阉割后4周恢复到正常年轻水平。

用CD44和CD25标记进一步对DN亚群中的增殖下降进行分 析。DN亚群中除已含胸腺细胞前体外还包含αβTCR+CD4-CD8-胸 腺细胞，后者被认为下调向SP细胞转换的两种共同受体 (co-receptor)(Godfrey和Zlotnik，1993)。通过对这些成熟细胞进 行门化(gating)，便可以分析真正的TN区室(compartment) (CD3-CD4-CD8-)，这些随年龄或阉割在增殖率上没有表现出差别 (图5C)。然而，对表达CD44和CD25的亚群进行分析，表明 TN1亚群(CD44+CD25-)的增殖明显下降(p＜0.001)，从正常年轻 时的20％下降到18个月时的6％左右(图5D)，其在阉割后4周 恢复。TN1亚群的增殖下降被TN2亚群(CD44+CD25+)增殖的明 显增加(p≤0.001)所补偿，后者在阉割后2周恢复到正常年轻水 平(图5D)。

年龄对胸腺微环境的影响

使用来自MTS系列、用多克隆抗细胞角蛋白抗体双标记的单 克隆抗体，用免疫荧光，来观察胸腺微环境随年龄的变化。

被这些单克隆抗体(MAbs)识别的抗原可分为3组：胸腺上 皮亚群、血管相关抗原、和那些在基质细胞和胸腺细胞上都存在的 抗原。

(i)上皮细胞抗原

对2岁大的小鼠胸腺进行抗角蛋白染色(泛上皮)，表明总体 胸腺结构的丧失，伴随严重的上皮细胞无序化和明显的皮质-髓质连 接的丧失。用单克隆抗体MTS 10(髓质)和MTS 44(皮质)进一 步分析，显示皮质大小随年龄明显减少，伴有不很明显的髓质上皮 的减少(数据未显示)。无上皮细胞区域，或角蛋白阴性区域(KNA’ s，van Ewijk等，1980；Godfrey等，1990；Bruijntjes等，1993)在年 长胸腺中更为明显，并增大，如抗细胞角蛋白标记所见。在年长胸 腺中亦见胸腺上皮“囊状”结构，在髓质区尤为明显(数据未显示)。 通过抗细胞角蛋白染色，明确表明脂肪沉积、胸腺体积的严重缩小 以及皮质-髓质连接完整性的下降(数据未显示)。胸腺在阉割后2 周开始再生。这明显表现在胸腺叶的大小、通过MTS44显示的皮 质上皮的增加、以及髓质上皮的定位。髓质上皮用MTS10检测， 在2周时，仍有用MTS 10染色的副囊(subpockets)散布在皮质中。 阉割后4周，便有清楚的髓质和皮质，以及可辨别的皮质-髓质连接 (数据未显示)。

标记MTS20和24被认为可用于检测原生上皮细胞(primordial epithelial cells)(Godfrey等，1990)，并且进一步显示年长胸腺的 退化。它们在E14很多，在4-6周可检测到孤立的髓质上皮细胞群， 但在年长胸腺中强度再次增加(数据未显示)。阉割后，所有这些 抗原都以相当于年轻成体胸腺的水平表达(数据未显示)，并且 MTS20和MTS24转回到位于皮质-髓质连接区的分散的副囊 (subpockets)中。

(ii)血管相关抗原

血-胸腺屏障被认为负责T细胞前体向胸腺的迁移，以及成熟 T细胞从胸腺向外周的迁移。

MAb MTS 15对胸腺血管内皮具有特异性，呈现出颗粒状、弥 散的染色图像(Godfrey等，1990)。在年长胸腺中，MTS 15的表 达显著增加，反映出血管和血管周围间隙的增多和体积的增大(数 据未显示)。

胸腺细胞外基质，包括重要的结构和细胞粘附分子，例如胶原 蛋白、层粘连蛋白、和血纤蛋白原，可用mAb MTS 16检测。MTS 16 表达在正常年轻胸腺中较分散，而在老年胸腺中变得更为扩散并彼 此相连。MTS16的表达在阉割后2周进一步增加，而在阉割后4 周，这种表达反映的状况类似于2月龄胸腺(数据未显示)。

(iii)共有抗原

用MAb MTS 6检测的在正常年轻胸腺中的MHC II表达在皮质 上皮中呈强阳性(颗粒)(Godfrey等，1990)，髓质上皮则染色较 弱。年长胸腺显示MHC II表达的降低，而在阉割后2周其表达明 显增加。阉割后4周，表达再次减少并似乎与2月大的胸腺类似(数 据未显示)。

弱。年长胸腺显示MHC II表达的降低，而在阉割后2周其表达明 显增加。阉割后4周，表达再次减少并似乎与2月大的胸腺类似(数 据未显示)。

胸腺细胞迁出

在年轻小鼠体内，每天大约有1％的T细胞迁出胸腺(Scollay 等，1980)。我们发现14个月和甚至2岁的小鼠，尽管在数量上明 显降低(p≤0.0001)，其迁移细胞的比例与正常年轻小鼠相当(图 5)。(校：当心)新近迁出的胸腺细胞中CD4∶CD8的比例有所增加， 从2个月时的～3∶1升到26个月时的～7∶1。阉割后一周，迁移至外 周的细胞数明显增加，而总迁移率仍保持在1-1.5％。

实施例

下面的实施例提供了本发明的方法的特定实施例，其描述并不 构成对本发明的内容的限制。为了方便起见，这些实施例描述了给 予LHRH激动剂来阻断传向胸腺的性类固醇介导的信号以及所产 生的对HSV感染的预防。

实施例1

性类固醇消融治疗

如果涉及不匹配的供体，则给予患者免疫抑制治疗(例如环孢 菌素治疗)，以防止对供体细胞的排斥。

采用对患者施用LHRH激动剂的方式进行性类固醇消融治疗。 以Leucrin(醋酸亮丙瑞林，长效制剂注射；22.5mg)或醋酸性瑞林(灌 输；10.8mg)的形式给药，任何一种单次剂量可维持疗效3个月。这 可有效降低性类固醇水平，从而足以重新激活胸腺。在一些情况下， 也需要给予抑制肾上腺产生性类固醇的抑制剂，例如在性类固醇消 融治疗期间，每天服用一片Cosudex(5mg/天)。肾上腺生产的性类 固醇约占人体类固醇的10-15％。

将血液中的性类固醇降低至最低值大约需要1-3周，与之相对 应的是胸腺的重新激活。在某些情况下，有必要延长治疗时间，进 行第二个三个月的注射/灌输疗程。

实施例2

其他给药方法

可采用其它方法来替代这种3个月的长效制剂注射或灌输 LHRH激动剂的给药方法。在一个实施例中，患者的皮肤可用激光 器(如铒:钇铝石榴石激光器)进行辐照，来消融或蚀变皮肤，从 而减少角质层的阻碍效应(impeding effect)。

A.激光消融或蚀变：红外激光辐射脉冲是由固态的、脉冲铒: 钇铝石榴石激光器产生，该激光器由如下部分组成：两个平面共振 腔反射镜(flat resonator mirrors)、作为激活介质的铒:钇铝石榴 石晶体、电源、和聚焦激光束的方式。激光束的波长是2.94微米。 采用单脉冲。

操作参数如下：每个脉冲的能量是40、80、或120mJ，焦点 位置的光束大小是2mm，产生的能注量为1.27、2.55、或3.82J/cm2。 脉冲时间宽度为300μs，产生的能注量率(energy fluence rate)为 0.42、0.85、或1.27×104W/cm2。

随后，一定剂量的LHRH激动剂敷于皮肤，并分散于辐照部位。 该LHRH激动剂的形式可以是药膏，这样它能够保持在辐照部位。 可选地，封闭贴片(occlusive patch)可置于激动剂上，从而使其保 持于辐照部位上。

天。

B.压力波：一定剂量的LHRH激动剂被置于适合的容器(如 可变形的塑料垫圈(washer)(直径大约1英寸(25.4mm)，厚度 大约1/16英寸(1.5875mm))内，放于要产生压力波的皮肤处。该 部位的皮肤用靶材料(如大约1mm厚的黑色聚苯乙烯片)覆盖。 用Q开关固态红宝石激光器(脉冲持续20ns，每个脉冲产能达2 焦耳)来产生激光束，后者击中靶材料并且产生单脉冲瞬态。黑色 聚苯乙烯靶材料完全吸收激光辐射，因此皮肤只暴露于脉冲瞬态， 而不会暴露于激光辐射。此过程不会引起疼痛。这种操作可每天重 复，或根据需要进行，来维持循环血液中激动剂的水平。

实施例3

施入HSC来增强胸腺重新激活

从患者，或优选从供体收集HSC。可选地，这些细胞可在有干 细胞因子(SCF)的条件下通过体外培养进行扩增。给予LHRH激 动剂后大约1-3周，在胸腺开始重新激活时或在此之前，给患者注 射HSC，最佳剂量是约2-4×106细胞/公斤。可选地，G-CSF也可被 注入患者体内，来帮助HSC的扩增。重新激活的胸腺摄取HSC并 且将供体HSC转化为供体型的T细胞和树突状细胞，将患者的HSC 转化为患者型的T细胞和树突状细胞。通过诱导清除(通过细胞死 亡)，或通过诱导耐受性(通过免疫调节细胞)，供体树突状细胞将 可耐受任何对受体具有潜在反应性的T细胞。

实施例4

对HSC进行遗传修饰来预防HIV感染

在实践中，在细胞收集前，通过以10μg/kg的剂量注射粒细胞 集落刺激因子(G-CSF)2-5天，来增强患者或供者血中的HSC水 平。CD34+供体细胞从供体或患者血中或骨髓中纯化得到，优选采 用流式细胞计或免疫磁珠。HSC通过流式细胞计分析被确定为 CD34+。可选地，这些HSC可在体外用SCF进行扩增。

反转录病毒载体被构建为含有HIV-1rev基因的反显性突变 株，RevM10，其可抑制HIV复制(Bonyhadi等，1997)。含有两 性(Amphotropic)载体的上清液是由经载体转染的嗜同生产者细胞 (ecotropic producer cells)的过滤上清液感染得到。收集的CD34+ 细胞被置于加有IL-3、IL-6和SCF(每种10ng/ml)的LCTM培养 基中预刺激24小时，以诱导细胞进入细胞周期。然后，在细胞中 重复加入含有这种载体的上清液2-3天，来实现载体向细胞内的转 录。

在施用LHRH激动剂后大约1-3周，在胸腺开始重新激活时或 之前，给患者注射经遗传修饰的HSC，最佳剂量是约2-4×106细胞/ 公斤。可选地，G-CSF也可注入受体体内，来帮助HSC的扩增。 重新激活的胸腺摄取经遗传修饰的HSC，并且将它们转化为供体型 的T细胞和树突状细胞，同时将受体的HSC转化为受体型的T细 胞和树突状细胞。通过诱导清除(通过细胞死亡)，或通过诱导耐 受性(通过免疫调节细胞)，供体树突状细胞将可耐受任何对受体 具有潜在反应性的T细胞。

实施例5

当使用供体细胞时免疫抑制的终结

当胸腺嵌合体已经建立并且新的成熟T细胞群开始从胸腺中 排出时，采集患者的血液，并且用标准淋巴细胞混合反应体外检测 T细胞对供体细胞的反应性缺失(lack ofresponsiveness)。如果没有 反应，免疫抑制治疗则逐渐减少，以建立对感染的抵抗力。如果没 有排斥现象，如由血液中存在活化T细胞所部分地表明的，则最终 完全停止免疫抑制治疗。因为HSC具有很强的自我更新能力，如 此形成的造血嵌合体(chimera)在理论上在患者一生中都是稳定的 (如对于正常、没有耐受化、和非移植人群而言)。

实施例6

用LHRH激动剂来重新激活人类胸腺

为了显示人类胸腺可通过本发明的方法进行重新激活，这些方 法用于那些经过前列腺癌化疗的患者。在性类固醇消融治疗前和治 疗后4月，对前列腺癌症患者进行评估。结果总结于图23-27中。 总的来讲，数据表明许多患者体内T细胞状态在质和量上都有改善。

LHRH治疗对总淋巴细胞数目及其T细胞亚群的影响：

分析了接受LHRH激动剂治疗前列腺癌的患者(均＞60岁)的 外周血淋巴细胞表型组成(图23)。在治疗前和开始LHRH激动剂 治疗后4个月对患者的标本进行分析。治疗前所有患者的每毫升血 液的总淋巴细胞数是在对照值的较低端。治疗后，6/9患者的总淋 巴细胞计数明显增加(在一些病例，总细胞数可翻倍)。与此相关 的是6/9患者的总T细胞数增加。在CD4+亚群中，这种增长更加明 显，有8/9患者显示升高的CD4+T细胞水平。CD8+亚群的趋势不 很明显，有4/9患者的水平有所增加，虽然一般来说升高的程度也 小于CD4+T细胞。

LHRH治疗对T细胞亚群比例的影响：

对LHRH激动剂治疗前后患者血液的分析表明，T细胞、CD4+ 或CD8+T细胞的总比例没有明显变化，而CD4+∶CD8+比例在治疗 后有不同的改变(图24)。这表明，尽管治疗之后T细胞总数有明 显增加，但治疗对T细胞亚群的内环境稳定的维持没有影响。所有 的数据同对照值进行比较。

LHRH治疗对B细胞和骨髓性细胞比例的影响：

对接受LHRH激动剂治疗的患者外周血中的B细胞和骨髓性 细胞(NK、NKT、和巨噬细胞)的比例进行分析，表明各亚群存 在不同程度的改变(图25)。虽然NK、NKT、和巨噬细胞的比例 在治疗后相对保持不变，但B细胞的比例在4/9患者中则下降。

LHRH激动剂治疗对B细胞和骨髓性细胞总数的影响：

对治疗后外周血内的B细胞和骨髓性细胞总数进行分析，分析 结果清楚显示治疗后NK(5/9患者)、NKT(4/9患者).和巨噬细 胞(3/9患者)的细胞数目明显增加(图26)。B细胞数量无明显变 化趋势：2/9患者水平增加，4/9患者无变化，还有3/9患者水平降 低。

LHRH治疗对相对于记忆细胞的纯真细胞水平的影响：

在LHRH激动剂治疗后所见到的主要变化是在外周血T细胞群 内。特别是，纯真(CD45RA+)CD4+细胞的比例选择性地升高， 同时CD4+T细胞亚群中的纯真细胞(CD45RA+)对记忆细胞 (CD45RO+)的比例在6/9患者中增加(图27)。

结论

因此可得出这样的结论，用LHRH激动剂治疗动物(如具有萎 缩胸腺的人类)，可以诱导胸腺的重新激活。接受性类固醇消融治 疗的前列腺癌患者，其血液T淋巴细胞的状态显示出总体的改善。 虽然精确判断这些细胞是否仅来自于胸腺是很难的，但这是进行逻 辑推理的结果，因为还没有关于其他来源的主流(CD8αβ链)T细 胞的描述。胃肠道T细胞主要是TCRγδ或CD8αα链。

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