多能细胞的基因组工程改造
阅读：462发布：2020-09-24
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1.一种构筑体，包含：一种或多种所关注的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸在整合后可操作地连接到所述构筑体中所含的一个或多个外源启动子，或连接到所选位点中所含的内源启动子；和一对同源臂，所述同源臂对所述所选位点具有特异性且侧接所关注的所述外源多核苷酸，
其中所述构筑体是用于使所述外源多核苷酸靶向整合于iPSCs中的所述所选位点；
其中所述一种或多种外源多核苷酸在后续扩增的iPSCs、衍生自所述iPSCs的分化细胞和/或由其衍生的脱分化细胞中保持整合状态和功能。
2.根据权利要求1所述的构筑体，其中所述一种或多种外源多核苷酸彼此通过连接序列连接；或其中所述一种或多种外源多核苷酸在相同或不同启动子下表达。
3.根据权利要求2所述的构筑体，其中所述连接序列编码自我裂解肽。
4.根据权利要求2所述的构筑体，其中所述连接序列提供内部核糖体入口序列(IRES)。
5.根据权利要求1所述的构筑体，进一步包含至少一种编码标记物的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的构筑体，进一步包含编码标记物的多核苷酸，所述标记物由位于所述所选位点的所述内源启动子驱动。
7.根据权利要求1所述的构筑体，其中所述所选位点是安全港基因座、高表达基因座、按时表达基因座，或中断用的基因座。
8.根据权利要求7所述的构筑体，其中所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的基因座；
或其中中断用的所述基因座包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白(Tapasin)、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
9.根据权利要求1所述的构筑体，其中所述外源多核苷酸中的至少一种可操作地连接到外源启动子，所述外源启动子包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC，或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子。
10.根据权利要求1所述的构筑体，其中所述一种或多种多核苷酸编码一种或多种安全开关蛋白质；靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；医药学活性蛋白质或肽；药物标靶候选物；和促进整合有所述构筑体的所述iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
11.根据权利要求1所述的构筑体，其中所述一种或多种多核苷酸编码包含半胱天冬
酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20或其任何组合的安全开关蛋白质。
12.根据权利要求11所述的构筑体，其中编码安全开关蛋白质的所述多核苷酸可操作地连接到CAG。
13.一种产生基因组经工程改造的iPSCs的方法，包含在基因组中的一个或多个所选位点进行的至少一种靶向基因组编辑，所述方法包含(I)、(II)或(III)：
(I)：对iPSCs进行基因工程改造，包含任何次序的(i)和(ii)中的一个或两个：
(i)将一个或多个根据权利要求1所述的构筑体引入iPSCs中，以在所选位点实现靶向整合；
(ii)(a)使用一种或多种能够识别所选位点的核酸内切酶将一个或多个位于所述所选位点的双股断裂引入iPSCs中；和
(b)培养步骤(I)(ii)(a)的所述iPSCs，以实现内源DNA修复，从而在所述所选位点产生靶向插入/缺失；
(II)：对重编程非多能细胞进行基因工程改造，以获得基因组经工程改造的所述
iPSCs，包含：
(i)使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选存在的小分子组合物接触，以启动所述非多能细胞重编程，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；和
(ii)将(a)和(b)中的一个或两个按任何次序引入步骤(II)(i)的所述重编程非多能细胞中：
(a)一种或多种根据权利要求1所述的构筑体，以在所选位点实现靶向整合；
(b)位于所选位点的一个或多个双股断裂，其使用至少一种能够识别所选位点的核酸内切酶实现，
其中培养步骤(II)(ii)(b)的所述细胞，以实现内源DNA修复，从而在所述所选位点产生靶向插入/缺失；
和，
(III)：对重编程的非多能细胞进行基因工程改造，以获得基因组经工程改造的iPSCs，包含(i)和(ii)：
(i)将(a)和(b)中的一个或两个按任何次序引入非多能细胞：
(a)一种或多种根据权利要求1所述的构筑体，以在所选位点实现靶向整合；
(b)位于所选位点的一个或多个双股断裂，其使用至少一种能够识别所选位点的核酸内切酶实现，
其中培养步骤(III)(i)(b)的所述细胞，以实现内源DNA修复，从而在所述所选位点产生靶向插入/缺失；和，
(ii)使步骤(III)(i)的所述细胞与一种或多种重编程因子和任选存在的小分子组合
物接触，以获得基因组经工程改造的包含位于所选位点的靶向编辑的iPSCs，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；
借此获得基因组经工程改造的包含至少一种功能性靶向基因组编辑的iPSCs，且
其中基因组经工程改造的所述iPSCs能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在一个或多个所选位点发生的所述至少一种靶向基因组编辑包含一种或多种外源多核苷酸的插入，所述外源多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进基因组经工程改造的所述iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述外源多核苷酸可操作地连接到(1)一个或多个外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或(2)所述所选位点中所包含的一个或多个内源启动子，所述所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
16.根据权利要求14所述的方法，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含一种或多种不同的外源多核苷酸，所述多核苷酸编码包含半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR或B细胞CD20的蛋白质，其中当基因组经工程改造的所述iPSCs包含两种或更多种自杀基因时，所述自杀基因整合于不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
17.根据权利要求14或16所述的方法，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含与以下相关的一种或多种内源基因处的插入/缺失：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节，或抑制所述iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述内源基因包含以下中的至少一种：B2M、
TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体
6p21区域中的任何基因。
19.根据权利要求16所述的方法，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含位于AAVS1基因座的编码半胱天冬酶的外源多核苷酸和位于H11基因座的编码胸苷激酶的外源多核苷酸。
20.根据权利要求13所述的方法，其中组(I)、(II)和/或(III)进一步包含：使基因组经工程改造的所述iPSCs与包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的小分子组合物接触。
21.根据权利要求13到20中任一权利要求所述的方法，其中基因组经工程改造的所得包含至少一种靶向基因组编辑的所述iPSCs具有功能，有效分化，且能够分化成包含所述相同功能基因组编辑的非多能细胞。
22.一种基因组经工程改造的iPSCs，通过根据权利要求13到21中任一权利要求所述的方法产生。
23.根据权利要求22所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述iPSCs包含根据权利要求1所述的构筑体中所含的一种或多种外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸整合于一个或多个所选位点。
24.根据权利要求22或23所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述iPSCs包含与以下相关的内源基因中所含的一个或多个插入/缺失：靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；药物标靶候选物；免疫反应调控和调节；和抑制所述iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
25.根据权利要求24所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述内源基因包含以下中的一种或多种：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
26.根据权利要求22所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含以下中的至少一种的缺失或表达减少：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
27.根据权利要求22或26所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含以下中的至少一种的表达引入或增加：HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体、接合体，和用于与双特异性、多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体。
28.根据权利要求27所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述表达引入或增加是通过用于引入编码外源蛋白质的多核苷酸的整合或非整合方法实现。
29.根据权利要求22或26所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中基因组经工程改造的所述iPSCs缺乏HLA I类和/或II类。
30.根据权利要求22或29所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含B2M剔除型或低含量型、TAP1剔除型或低含量型，和/或TAP2剔除型或低含量型。
31.根据权利要求22或30所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含整合或非整合的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码HLA-E、HLA-G、CD16、
41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种；或其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入。
32.根据权利要求22或31所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含至少一种编码高亲和力CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码高亲和力且不可裂解的CD16受体(hnCD16)的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的HLA-E的外源多核苷酸；或至少一种编码不可裂解的HLA-G的外源多核苷酸。
33.根据权利要求22到32中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述iPSC包含一种或多种编码蛋白质的外源多核苷酸，所述蛋白质包含安全开关蛋白质；靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；医药学活性蛋白质或肽；药物标靶候选物；或促进所述iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
34.根据权利要求33所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述一种或多种构筑体包含的所述外源多核苷酸在整合后可操作地连接到(1)一种或多种外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；
或(2)所选位点包含的一种或多种内源启动子，所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
35.根据权利要求22到34中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述iPSCs包含至少一种编码安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述安全开关蛋白质包含半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR，或B细胞CD20。
36.根据权利要求22到35中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述iPSCs包含至少两种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于所述相同的安全港基因座中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
37.根据权利要求22到36中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述iPSCs包含两种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
38.根据权利要求22到37中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中基因组经工程改造的所述iPSCs相较于未进行相同基因组工程改造的iPSCs，实现了存留的改善、对免疫细胞的抗性增强、免疫抗性增强，或对T和/或NK细胞的抗性增强；其中基因组经工程改造的所述iPSCs维持多能性；且其中基因组经工程改造的所述iPSCs维持向保留所述相同功能基因组工程改造的非多能细胞分化的潜能。
39.根据权利要求22到38中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述iPSCs能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞，且其中所述部分分化细胞或完全分化细胞包含所述iPSCs中所含的至少一种靶向基因组编辑。
40.根据权利要求22到39中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述iPSCs能够分化成造血谱系细胞。
41.根据权利要求22到39中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述部分分化细胞包含中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞或NK细胞祖细胞；且其中所述完全分化细胞包含T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
42.一种基因组经工程改造的iPSCs，包含：
(i)B2M剔除型或低含量型；
(ii)TAP1剔除型或低含量型；
(iii)TAP2剔除型或低含量型；
(iv)TAP相关糖蛋白剔除型或低含量型；
(v)HLA-E或不可裂解的HLA-E的表达引入；
(vi)HLA-G或不可裂解的HLA-G的表达引入；
(vii)PDL1的表达引入；
(viii)不可裂解的高亲和力CD16(hnCD16)；
(ix)Fc受体；
(x)T细胞受体(TCR)；
(xi)嵌合抗原受体(CAR)
(xii)一种或多种表达安全开关蛋白质的自杀基因；
(xiii)双特异性、多特异性或通用接合体，或
其任何组合。
43.根据权利要求42所述的基因组经工程改造的iPSCs，其中所述TCR、CAR、接合体、Fc受体或自杀基因是可诱导的。
44.根据权利要求42或43所述的基因组经工程改造的iPSCs，其相较于未进行所述相同基因组工程改造的iPSCs，实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；其中基因组经工程改造的所述iPSCs维持多能性；且其中基因组经工程改造的所述iPSCs维持向保留所述相同功能基因组工程改造的非多能细胞分化的潜能。
45.一种缺乏HLA的已改造iPSCs，其中所述iPSCs缺乏HLA I类和/或II类，而另外包含(1)外源HLA-E、HLA-G、CD16、4lBBL、CD47、CD113和PDL1中的一种或多种；或(2)HLA-E、HLA-G、CD16、4lBBL、CD47、CD113和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入；和任选存在的(3)TCR、CAR、接合体、Fc受体和单一或双重安全开关蛋白质中的一种或多种。
46.根据权利要求45所述的缺乏HLA的已改造iPSCs，其中所述TCR、CAR、接合体、Fc受体或自杀基因是可诱导的。
47.根据权利要求45或46所述的缺乏HLA的已改造iPSCs，其相较于未进行所述相同基因组工程改造的iPSCs，实现了存留的改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；其中缺乏HLA的经修饰的iPSCs维持多能性；且其中所述缺乏HLA的已改造iPSCs维持向非多能细胞分化的潜能，所述非多能细胞缺乏HLA且保留所述相同功能性基因组工程改造。
48.一种产生基因组经工程改造的非多能细胞的方法，所述非多能细胞衍生自基因组经工程改造的iPSCs，所述方法包含：
(i)获得根据权利要求22到44中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSCs或根
据权利要求45到47所述的缺乏HLA的已改造iPSCs，其中所述iPSC包含至少一种功能性基因组编辑；和
(ii)使基因组经工程改造的所述iPSCs或缺乏HLA的已改造iPSCs分化，以获得衍生的非多能细胞，所述非多能细胞包含基因组经工程改造的所述iPSCs中所含的所述相同功能性靶向基因组编辑。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述衍生非多能细胞包含造血谱系细胞；且其中所述分化步骤(ii)无需形成类胚胎体。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述衍生非多能细胞包含中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
51.一种由iPSCs产生基因组经工程改造的非多能细胞的方法，所述方法包含：
(i)使iPSCs经历足以启动谱系特异性分化的条件；和
(ii)利用(a)和(b)中的一个或两个按任何次序对步骤(i)的所述分化细胞进行基因工程改造，以获得基因组经工程改造的所述非多能细胞：
(a)将一种或多种根据权利要求1所述的构筑体引入步骤(i)的所述分化细胞中，以在所选位点实现靶向整合；
(b)(1)使用至少一种能够识别所选位点的核酸内切酶将位于所述所选位点的一个或
多个双股断裂引入步骤(i)的所述分化细胞中；和
(2)培养得自步骤(ii)(b)(1)的所述细胞，以实现内源DNA修复，从而在所述所选位点产生靶向插入/缺失；
借此获得基因组经工程改造的非多能细胞，其包含在一个或多个所选位点发生的一种或多种功能性靶向编辑。
52.根据权利要求51所述的方法，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含造血谱系细胞。
53.根据权利要求51所述的方法，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
54.一种基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其使用根据权利要求48到53中任一权利要求所述的方法产生，其中所述非多能细胞包含一种或多种功能性靶向基因组编辑。
55.根据权利要求54所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中所述非多能细胞包含中胚层细胞、生血内皮细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
56.根据权利要求54和55所述的基因组经工程改造的iPSCs源非多能细胞，其中所述非多能细胞包含一种或多种编码蛋白质的外源多核苷酸，所述蛋白质包含安全开关蛋白质；
靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；医药学活性蛋白质或肽；药物标靶候选物；或促进所述非多能细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
57.根据权利要求54和56所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，包含与以下相关的内源基因中所含的一个或多个插入/缺失：靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；药物标靶候选物；免疫反应调控和调节；和抑制所述非多能细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
58.根据权利要求57所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中包含一个或多个插入/缺失的所述内源基因包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
59.根据权利要求57所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中基因组经工程改造的所述衍生非多能细胞包含以下中的至少一种的缺失或表达减少：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
60.根据权利要求57所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中基因组经工程改造的所述衍生非多能细胞包含以下中的至少一种的表达引入或增加：HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体、接合体，和用于与双特异性或多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体。
61.根据权利要求54到60中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中所述非多能细胞包含
(i)至少两种各自整合于所述相同安全港基因座中的外源多核苷酸，且其中所述外源多核苷酸编码所述相同或不同的安全开关蛋白质；或
(ii)至少两种各自整合于不同安全港基因座中的外源多核苷酸，且其中所述外源多核苷酸编码所述相同或不同的安全开关蛋白质。
62.根据权利要求61所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中所述外源多核苷酸编码安全开关蛋白质，所述安全开关蛋白质选自半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20和其任何组合。
63.根据权利要求61所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
64.根据权利要求54到63中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中所述非多能细胞能够重编程为iPSCs，且其中所述iPSCs包含所述非多能细胞中所含的所述相同功能性外源多核苷酸。
65.根据权利要求64所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中由其重编程的所述iPSCs能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞。
66.根据权利要求54到63所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中细胞能够转分化成不同命运的非多能细胞。
67.一种基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞，包含：
(i)B2M剔除型或低含量型；
(ii)TAP1剔除型或低含量型；
(iii)TAP2剔除型或低含量型；
(iv)TAP相关糖蛋白剔除型或低含量型；
(v)HLA-E或不可裂解的HLA-E的表达引入；
(vi)HLA-G或不可裂解的HLA-G的表达引入；
(vii)PDL1的表达引入；
(viii)不可裂解的高亲和力CD16(hnCD16)；
(ix)Fc受体；
(x)T细胞受体(TCR)；
(xi)嵌合抗原受体(CAR)
(xii)一种或多种表达安全开关蛋白质的自杀基因；
(xiii)双特异性、多特异性或通用接合体，或
其任何组合，其中所述iPSC包含与基因组经工程改造的所述造血谱系细胞相同的所述基因组编辑。
68.根据权利要求67所述的基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞，其中所述TCR、CAR、接合体、Fc受体或自杀基因是可诱导的。
69.根据权利要求67或68所述的基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞，其中所述造血谱系细胞包含中胚层细胞、生血内皮细胞、CD34细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞或NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
70.根据权利要求67到69中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞，其实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；其中基因组经工程改造的所述低分化造血谱系细胞维持向保留所述相同功能性基因组工程改造的高分化造血谱系细胞分化的潜能。
71.一种包含iPSC源造血细胞的组合物，其中所述组合物包含权利要求67到70中任一权利要求的：
(a)基因组经工程改造的iPSC源CD34细胞；
(b)基因组经工程改造的iPSC源造血干细胞和祖细胞；
(c)基因组经工程改造的iPSC源造血干细胞和祖细胞；
(d)基因组经工程改造的iPSC源造血多潜能祖细胞；
(e)基因组经工程改造的iPSC源T细胞祖细胞；
(f)基因组经工程改造的iPSC源NK细胞祖细胞；
(g)基因组经工程改造的iPSC源T细胞；或
(h)基因组经工程改造的iPSC源NK细胞；
或其任何组合。
72.一种基因组经工程改造的造血谱系细胞，包含：
(i)B2M剔除型或低含量型；
(ii)TAP1剔除型或低含量型；
(iii)TAP2剔除型或低含量型；
(iv)TAP相关糖蛋白剔除型或低含量型；
(v)HLA-E或不可裂解的HLA-E的表达引入；
(vi)HLA-G或不可裂解的HLA-G的表达引入；
(vii)PDL1的表达引入；
(viii)不可裂解的高亲和力CD16(hnCD16)；
(ix)Fc受体；
(x)T细胞受体(TCR)；
(xi)嵌合抗原受体(CAR)
(xii)一种或多种表达安全开关蛋白质的自杀基因；
(xiii)双特异性、多特异性或通用接合体，或
其任何组合。
73.根据权利要求72所述的基因组经工程改造的造血谱系细胞，其中所述TCR、CAR、接合体、Fc受体或自杀基因是可诱导的。
74.根据权利要求72或73所述的基因组经工程改造的造血谱系细胞，其中所述造血谱系细胞包含中胚层细胞、生血内皮细胞、CD34细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
75.根据权利要求72到74中任一权利要求所述的基因组经工程改造的造血谱系细胞，其实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；其中基因组经工程改造的所述低分化造血谱系细胞维持向保留所述相同功能性基因组工程改造的高分化造血谱系细胞分化的潜能。
76.一种缺乏HLA的已改造造血谱系细胞，其中所述造血谱系细胞缺乏HLA I类和/或II类，而另外包含(1)外源HLA-E、HLA-G、CD16、4lBBL、CD47、CD113和PDL1中的一种或多种；或(2)HLA-E、HLA-G、CD16、4lBBL、CD47、CD113和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入；和任选存在的(3)TCR、CAR、接合体、Fc受体和单一或双重安全开关蛋白质中的一种或多种。
77.根据权利要求76所述的缺乏HLA的已改造造血谱系细胞，其中所述TCR、CAR、接合体、Fc受体或自杀基因是可诱导的。
78.根据权利要求76或77所述的缺乏HLA的已改造造血谱系细胞，其实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；其中缺乏HLA的所述低分化造血谱系细胞维持向具有所述相同功能性基因组工程改造的高分化造血谱系细胞分化的潜能。
79.一种用于获得基因组经工程改造的iPSCs的组合物，所述组合物包含：
(i)根据权利要求54到70或72到78中任一项所述的基因组经工程改造的非多能细胞或细胞，其中所述非多能细胞包含在所述基因组中的一个或多个所选位点处发生的至少一种靶向基因组编辑；
(ii)一种或多种重编程因子；和任选地，
(iii)包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂的小分子组合物；
其中所述组合物适用于获得iPSCs，所述iPSCs包含基因组经工程改造的所述非多能细胞中所含的所述相同靶向基因组编辑。
80.根据权利要求79所述的组合物，其中在一个或多个所选位点发生的所述至少一种靶向基因组编辑包含一种或多种外源多核苷酸的插入，所述外源多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进所述非多能细胞和由其重编程的所述iPSCs移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
81.根据权利要求80所述的组合物，其中所述一种或多种外源多核苷酸可操作地连接到(1)一个或多个外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或(2)所述所选位点中所包含的一个或多个内源启动子，所述所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
82.根据权利要求80所述的组合物，其中所述一种或多种外源多核苷酸可操作地连接到所选插入位点中所包含的一个或多个内源启动子，所述插入位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
83.根据权利要求80所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含一种或多种编码安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述安全开关蛋白质包含半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20或其任何组合。
84.根据权利要求80所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含两种或更多种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-
2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
85.根据权利要求80所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含位于AAVS1基因座的编码半胱天冬酶的多核苷酸，和位于H11基因座的编码胸苷激酶的多核苷酸。
86.根据权利要求79或80所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含与以下相关的内源基因中所含的一个或多个插入/缺失：靶向模式；受体；信号传导分子；
转录因子；药物标靶候选物；免疫反应调控和调节；和抑制所述非多能细胞和得自其的所述iPSCs移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
87.根据权利要求86所述的组合物，其中所述内源基因包含以下中的一种或多种：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体
6p21区域中的任何基因。
88.根据权利要求79到87中任一权利要求所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含以下中的至少一种的缺失或表达减少：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
89.根据权利要求79到88中任一权利要求所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含以下中的至少一种的表达引入或增加：HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体、接合体，和用于与双特异性或多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体。
90.根据权利要求79到89中任一权利要求所述的组合物，其中所述表达引入或增加是通过用于引入编码外源蛋白质的多核苷酸的整合或非整合方法实现。
91.根据权利要求79到90中任一权利要求所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞缺乏HLA I类和/或II类。
92.根据权利要求79到91中任一权利要求所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含B2M剔除型或低含量型、TAP1剔除型或低含量型和/或TAP2剔除型或低含量型。
93.根据权利要求79到92中任一权利要求所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含编码HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种的整合或非整合外源多核苷酸；或其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入。
94.根据权利要求79到93中任一权利要求所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含至少一种编码高亲和力CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码高亲和力且不可裂解的CD16受体(hnCD16)的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的HLA-E的外源多核苷酸；或至少一种编码不可裂解的HLA-G的外源多核苷酸。
95.根据权利要求79到94中任一权利要求所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞包含中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
96.根据权利要求79到95中任一权利要求所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述非多能细胞实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；或其中基因组经工程改造的所述非多能细胞对T和/或NK细胞的抗性增强。
97.一种用于获得基因组经工程改造的iPSCs的组合物，所述组合物包含：
(i)非多能细胞；
(ii)一种或多种用于在一个或多个所选基因座实现靶向编辑的构筑体；
(iii)一种或多种重编程因子；和任选地，
(iv)包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂的小分子组合物；
其中所述组合物适用于获得包含靶向基因组编辑的iPSCs，且由此，基因组经工程改造的所述iPSCs实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；或
其中基因组经工程改造的所述iPSCs对T和/或NK细胞的抗性增强。
98.根据权利要求97所述的组合物，进一步包含一种或多种能够识别所选位点以便在所选位点引入双股断裂的核酸内切酶；和/或包含一种或多种外源多核苷酸的构筑体，所述外源多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进所述非多能细胞重编程的iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
99.根据权利要求98所述的组合物，其中所述一种或多种外源多核苷酸可操作地连接到(1)一个或多个外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或(2)所述所选位点中所包含的一个或多个内源启动子，所述所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
100.根据权利要求97所述的组合物，其中所得基因组经工程改造的所述iPSCs包含一种或多种编码安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述安全开关蛋白质包含半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20或其任何组合。
101.根据权利要求97所述的组合物，其中所得基因组经工程改造的所述iPSCs包含两种或更多种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-
2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
102.根据权利要求97所述的组合物，其中所得基因组经工程改造的所述iPSCs包含位于AAVS1基因座的编码半胱天冬酶的外源多核苷酸和位于H11基因座的编码胸苷激酶的外源多核苷酸。
103.根据权利要求97所述的组合物，其中所得基因组经工程改造的所述iPSCs包含与以下相关的内源基因中所含的一个或多个插入/缺失：靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；药物标靶候选物；免疫反应调控和调节；和抑制所述iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
104.根据权利要求103所述的组合物，其中所得基因组经工程改造的包含一个或多个插入/缺失的所述iPSCs包含以下中的一种或多种：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
105.根据权利要求97所述的组合物，其中所述非多能细胞包含中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
106.根据权利要求97所述的组合物，进一步包含小分子组合物，所述小分子组合物包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，用于维持所得基因组经工程改造的所述iPSCs的多能性。
107.一种组合物，包含：
(i)基因组经工程改造的iPSCs，其中基因组经工程改造的所述iPSCs如下获得：
(a)对基因组经工程改造的非多能细胞进行重编程，其中所述所得iPSCs在所选位点处包含基因组经工程改造的所述非多能细胞中的所述相同靶向整合和/或插入/缺失；或(b)通过在一个或多个所选位点引入一个或多个靶向整合和/或插入/缺失而对克隆
iPSC或iPSCs池进行基因组工程改造；或
(c)通过将位于一个或多个所选位点的一个或多个靶向整合和/或插入/缺失引入重编程非多能细胞池来进行基因组工程改造，所述非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选存在的小分子组合物接触，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；
和
(ii)包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的小分子组合物，
其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含一种或多种外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进所述非多能细胞重编程的iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质；和/或位于一种或多种与以下相关的内源基因处的插入/缺失：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节，或抑制所述非多能细胞重编程的iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
108.根据权利要求107所述的组合物，进一步包含一种或多种能够识别所选位点以便在所选位点引入双股断裂的核酸内切酶。
109.根据权利要求107所述的组合物，其中所述一种或多种外源多核苷酸可操作地连接到(1)一个或多个外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或(2)所述所选位点中所包含的一个或多个内源启动子，所述所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
110.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含一种或多种编码安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述安全开关蛋白质选自半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20，和其任何组合。
111.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含两种或更多种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
112.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含位于
AAVS1基因座的编码半胱天冬酶的基因和位于H11基因座的编码胸苷激酶的基因。
113.根据权利要求107所述的组合物，其中包含一个或多个插入/缺失的所述基因组经工程改造的iPSCs包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
114.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含以下中的至少一种的缺失或表达减少：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
115.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含以下中的至少一种的表达引入或增加：HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体、接合体，和用于与双特异性或多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体。
116.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含通过用于引入编码外源蛋白质的多核苷酸的整合或非整合方法实现的表达引入或增加。
117.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs缺乏HLAI类和/或II类。
118.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含B2M剔除型或低含量型、TAP1剔除型或低含量型和/或TAP2剔除型或低含量型。
119.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含整合或非整合的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种；或其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入。
120.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs包含至少一种编码高亲和力CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码高亲和力且不可裂解的CD16受体(hnCD16)的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的HLA-E的外源多核苷酸；或至少一种编码不可裂解的HLA-G的外源多核苷酸。
121.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强或免疫抗性增强；或其中基因组经工程改造的所述iPSCs对T和/或NK细胞的抗性增强。
122.根据权利要求107所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs具有分化成非多能细胞的潜能，所述非多能细胞包含具有所述相同功能性靶向基因组编辑的造血谱系细胞。
123.根据权利要求122所述的组合物，其中基因组经工程改造的所述iPSCs具有分化成中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞的潜能。
124.一种医药组合物，包含：
(a)根据权利要求22到44中任一权利要求所述的基因组经工程改造的iPSCs；
(b)根据权利要求45到47中任一权利要求所述的缺乏HLA的已改造iPSCs；
(c)根据权利要求54到66中任一权利要求所述的基因组经工程改造的非多能细胞；
(d)根据权利要求67到70和72到75中任一权利要求所述的基因组经工程改造的造血谱系细胞；或
(e)根据权利要求76到78中任一权利要求所述的缺乏HLA的已改造造血谱系细胞；或其任何组合；和医药学上可接受的介质。
125.一种根据权利要求124所述的医药组合物的治疗用途，其通过将所述组合物引入适于过继性细胞疗法的受检者来实现，其中所述受检者患有自体免疫病症；血液恶性疾病；
实体肿瘤；癌症；或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关的感染。
126.一种根据权利要求13到21中的任一权利要求制造基因组经工程改造的iPSCs和根据权利要求48到53中的任一权利要求制造由其衍生的非多能细胞的方法。
多能细胞的基因组工程改造
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2015年11月4日提交的美国临时申请第62/251,032号；2016年5月16日提交的美国临时申请第62/337,258号；和2016年7月25日提交的美国临时申请第62/366,503号的优先权，所述美国临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本公开大体上涉及干细胞的基因编辑和基因组工程改造领域。更具体地说，本公开涉及通过分子策略对克隆多能干细胞使用基因调节，所述分子策略靶向特异性基因座且确保所编辑的遗传物质的连续保持和/或功能发挥。
背景技术
[0004] 随着人类诱导多能干细胞(hiPSC)研究领域继续推进，且随着遗传工程改造的hiPSC源细胞疗法的临床研究开始出现，必须解决和缓解与基因改变的细胞投与有关的安全问题。为了解决这些安全问题，已探究多种策略来促进异常细胞的选择性排除，所述策略包括重组肽、单克隆抗体、经小分子调节的酶活性和基因特异性修饰。一般来说，此前研究已利用病毒载体(例如慢病毒)和短启动子将自杀基因(包括疱疹复合体病毒胸苷激酶或可诱导半胱天冬酶-9(iCasp9))稳定引入人类细胞中。然而，病毒载体的使用可能引起随机整合事件，所述随机整合事件能分裂或活化疾病有关基因，潜在地导致有害影响。现用方法中的其它问题包括(但不限于)低插入率；随机插入；突变；高插入拷贝数目；和针对因随机插入所致的拷贝数插入变化的非均质细胞群选择时分选细胞麻烦。另外，在iPSC基因组工程改造时，在多能与分化状态下，许多人工启动子和基因组区域容易发生表观遗传基因表达静默，以致所述启动子或所插入基因对例如细胞扩增、传代、重编程、分化和/或脱分化等事件变得无响应。因此，为了维持所插入功能模式的响应而无损于安全，尤其是在开发经基因工程改造的免疫细胞用于治疗用途时，鉴别出最优的基因组编辑策略、整合位点、启动子和其它因子具有非常重要的作用。发明内容
[0005] 本发明的一个目标是提供产生单一细胞源iPSC克隆系或自其衍生的细胞的方法和组合物，包含在所选位点进行一个或若干个基因修饰，包括多核苷酸插入、缺失和取代，且所述修饰在分化、脱分化、重编程、扩增、传代和/或移植之后保留于后续衍生细胞中且保持功能。
[0006] 本发明的一个目标是产生包含一个或若干个位于所选位点的基因修饰的单一细胞源iPSC克隆系，其通过将包含相同基因修饰的非多能细胞重编程而产生，包括靶向整合和/或靶向插入/缺失。具体地说，本发明的一个目标是在对重编程细胞进行基因组工程改造之前将非多能细胞重编程，由此首先获得iPSCs或低分化细胞，随后进行基因组编辑。将非多能细胞经基因组工程改造之后的非多能细胞重编程也是本发明的一个目标，由此首先获得基因组经工程改造的非多能细胞，随后进行细胞重编程。本发明的另一个目标是使非多能细胞重编程与非多能细胞基因组工程改造同时进行，由此，无需通过或为了重编程或基因组工程改造而分离中间细胞，并且两种过程在单一细胞池中同时发生。
[0007] 本发明的一个目标是产生包含一个或若干个位于所选位点的基因修饰的iPSC(或低分化细胞)源非多能细胞，包括(但不限于)CD34细胞、生血内皮细胞、HSCs(造血干细胞和祖细胞)、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞和B细胞，其通过使包含位于相同所选位点的相同基因修饰的iPSCs或低分化细胞分化而产生。具体地说，本发明的一个目标是在对低分化细胞进行基因组工程改造之后，使所述低分化细胞(包括祖细胞和多能细胞)分化，由此首先获得基因组经工程改造的低分化细胞，随后进行细胞分化。本发明的另一个目标是使低分化细胞分化与低分化细胞基因组工程改造同时进行，由此，无需通过或为了分化或基因组工程改造而分离中间细胞，并且两种过程在单一细胞池中同时发生。
[0008] 本发明的一个方面提供一种构筑体，包含：(1)一种或多种所关注的外源多核苷酸，其在整合后可操作地连接到构筑体包含的一种或多种外源启动子，或连接到所选位点包含的内源启动子；和(2)一对同源臂，其对所选位点具有特异性且侧接所关注的外源多核苷酸，用于使外源多核苷酸靶向整合于iPSCs中的所选位点；且在随后扩增的iPSCs、衍生自iPSCs的分化细胞和/或由其衍生的脱分化细胞中，那些一种或多种外源多核苷酸保持整合状态且发挥功能。在一些实施例中，一种或多种外源多核苷酸彼此通过连接序列连接。在一些实施例中，连接序列编码自我裂解肽。在一些实施例中，连接序列提供内部核糖体入口序列(IRES)。在一些其它实施例中，上述构筑体进一步包含至少一种编码标记物的多核苷酸。在其它实施例中，所述构筑体包含的多核苷酸编码由所选位点的内源启动子驱动的标记物。在一些实施例中，所选位点是安全港基因座、高表达基因座、按时表达基因座，或中断基因座。在一些实施例中，安全港基因座可以是AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足如本文所定义的基因组安全港准则的基因座。在一些实施例中，中断基因座包含TAP1、TAP2或TAP相关糖蛋白(tapasin)，或其中断与所期望的细胞功能或特性有关的其它所关注基因，例如NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
[0009] 在上述构筑体的一些实施例中，至少一种外源多核苷酸可操作地连接到外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子。在一个实施例中，构筑体包含的外源启动子是CAG。在一些其它实施例中，一种或多种多核苷酸编码以下中的一种或多种：安全开关蛋白质；靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；医药学活性蛋白质或肽；药物标靶候选物；和促进整合有构筑体的iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些特定实施例中，一种或多种多核苷酸编码包含半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20或其任何组合的安全开关蛋白质。在一些实施例中，半胱天冬酶可以是半胱天冬酶9、半胱天冬酶3或半胱天冬酶7。在一些其它实施例中，编码安全开关蛋白质的多核苷酸在构筑体中可操作地连接到CAG。
[0010] 本发明的一个方面提供一种产生基因组经工程改造的iPSCs的方法，所述iPSCs包含在基因组中的一个或多个所选位点发生的至少一种靶向基因组编辑，所述方法包含(I)、(II)或(III)：
[0011] (I)：通过(i)和(ii)中的一个或两个、按任何次序对iPSCs进行基因工程改造：(i)将一个或多个根据权利要求1所述的构筑体引入iPSCs中，以允许在所选位点发生靶向整合；(ii)(a)使用一种或多种能够识别所选位点的核酸内切酶将位于所选位点的一个或多个双股断裂引入iPSCs中；和(b)培养步骤(I)(ii)(a)的iPSCs，以实现内源DNA修复，从而在所选位点产生靶向插入/缺失，借此获得基因组经工程改造的iPSCs，其包含至少一种功能性靶向基因组编辑，且其中基因组经工程改造的iPSCs能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞。
[0012] (II)：对重编程非多能细胞进行基因工程改造，以获得基因组经工程改造的iPSCs，包含：(i)使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选存在的小分子组合物接触，以启动非多能细胞重编程，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；和(ii)将(a)和(b)中的一个或两个按任何次序引入步骤(II)(i)的重编程非多能细胞中：(a)一种或多种根据权利要求1所述的构筑体，以允许靶向整合于所选位点；(b)使用至少一种能够识别所选位点的核酸内切酶在所选位点产生的一个或多个双股断裂，其中培养步骤(II)(ii)(b)的细胞以实现内源DNA修复，从而在所选位点产生靶向插入/缺失，借此获得基因组经工程改造的iPSCs，其包含至少一种功能性靶向基因组编辑，且其中基因组经工程改造的iPSCs能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞。
[0013] (III)：对重编程的非多能细胞进行基因工程改造以获得基因组经工程改造的iPSCs，包含(i)和(ii)：将(a)和(b)中的一个或两个按任何次序引入非多能细胞：(a)一个或多个根据权利要求1所述的构筑体以允许靶向整合于所选位点；(b)使用至少一种能够识别所选位点的核酸内切酶在所选位点产生的一个或多个双股断裂，其中培养步骤(III)(i)(b)的细胞以实现内源DNA修复，从而在所选位点产生靶向插入/缺失；和(ii)使步骤(III)(i)的细胞与一种或多种重编程因子和任选存在的小分子组合物接触，以获得基因组经工程改造的iPSCs，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂，所述iPSCs包含位于所选位点的靶向编辑，借此获得基因组经工程改造的iPSCs，所述iPSCs包含至少一种功能性靶向基因组编辑，且其中基因组经工程改造的iPSCs能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞。
[0014] 在上述方法的一个实施例中，在一个或多个所选位点发生的至少一种靶向基因组编辑包含一种或多种外源多核苷酸的插入，所述外源多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进基因组经工程改造的iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，插入的外源多核苷酸可操作地连接到(1)一种或多种外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或(2)所选位点包含的一种或多种内源启动子，所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些实施例中，使用上述方法产生的基因组经工程改造的iPSCs包含一种或多种不同的外源多核苷酸，所述多核苷酸编码的蛋白质包含半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR或B细胞CD20，其中当基因组经工程改造的iPSCs包含两种或更多种自杀基因时，所述自杀基因整合于不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。
[0015] 在一些其它实施例中，使用本文所提供方法产生的基因组经工程改造的iPSCs包含位于一种或多种与以下相关的内源基因处的插入/缺失：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节，或抑制iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，用于中断的内源基因包含以下中的至少一种：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
[0016] 在又一些其它实施例中，使用本文所提供方法产生的基因组经工程改造的iPSCs包含位于AAVS1基因座的编码半胱天冬酶的外源多核苷酸，和位于H11基因座的编码胸苷激酶的外源多核苷酸。
[0017] 在另外一些其它实施例中，方法(I)、(II)和/或(III)进一步包含：使基因组经工程改造的iPSCs与包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的小分子组合物接触，以维持基因组经工程改造的iPSCs的多能性。在一个实施例中，包含至少一种靶向基因组编辑的所得基因组经工程改造的iPSCs具有功能，能有效分化并且能够分化成包含相同功能基因组编辑的非多能细胞。
[0018] 本发明的另一方面提供通过上述任一种方法产生的基因组经工程改造的iPSCs。在一个实施例中，所产生的基因组经工程改造的iPSCs包含使用以上提供的构筑体所引入的一种或多种外源多核苷酸，且所述外源多核苷酸在一个或多个所选位点整合于iPSCs中。
在一个实施例中，所产生的基因组经工程改造的iPSCs包含与以下相关的内源基因中所含的一个或多个插入/缺失：靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；药物标靶候选物；免疫反应调控和调节；和抑制iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一个实施例中，所述内源基因包含以下中的一种或多种：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含以下中的至少一种的缺失或表达减少：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含以下中的至少一种的表达引入或增加：HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体、接合体，和用于与双特异性、多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体。在一些实施例中，表达引入或增加是通过整合或非整合方法进行，以便引入编码外源蛋白质的多核苷酸。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs缺乏HLA I类和/或II类。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含B2M剔除型或低含量型、TAP1剔除型或低含量型，和/或TAP2剔除型或低含量型。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含整合或非整合的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种；或其中基因组经工程改造的iPSCs包含HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入。在一些实施例中，所述表达引入是所述细胞中包含的非表达或低表达基因的表达增加。在一些实施例中，非整合的外源多核苷酸是利用仙台病毒(sendai virus)、游离体或质体引入。
在一个实施例中，所产生的基因组经工程改造的iPSCs包含与以下相关的内源基因中所含的一个或多个插入/缺失：靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；药物标靶候选物；免疫反应调控和调节；和抑制iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一个实施例中，所述内源基因包含以下中的一种或多种：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含以下中的至少一种的缺失或表达减少：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含以下中的至少一种的表达引入或增加：HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体、接合体，和用于与双特异性、多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体。在一些实施例中，表达引入或增加是通过整合或非整合方法进行，以便引入编码外源蛋白质的多核苷酸。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs缺乏HLA I类和/或II类。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含B2M剔除型或低含量型、TAP1剔除型或低含量型，和/或TAP2剔除型或低含量型。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含整合或非整合的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种；或其中基因组经工程改造的iPSCs包含HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入。在一些实施例中，所述表达引入是所述细胞中包含的非表达或低表达基因的表达增加。在一些实施例中，非整合的外源多核苷酸是利用仙台病毒(sendai virus)、游离体或质体引入。
[0019] 在一些其它实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含至少一种编码高亲和力CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码高亲和力且不可裂解的CD16受体(hnCD16)的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的HLA-E的外源多核苷酸；或至少一种编码不可裂解的HLA-G的外源多核苷酸。在一些实施例中，所述iPSC包含一种或多种编码蛋白质的外源多核苷酸，所述蛋白质包含安全开关蛋白质；靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；医药学活性蛋白质或肽；药物标靶候选物；或促进iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
[0020] 在又一些其它实施例中，整合后，一种或多种构筑体包含的外源多核苷酸可操作地连接到(1)一种或多种外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或(2)所选位点包含的一种或多种内源启动子，所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。在一些其它实施例中，iPSCs包含至少一种编码安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述安全开关蛋白质包含半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR，或B细胞CD20。在一些特定实施例中，所述iPSCs包含至少两种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于相同的安全港基因座中，包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一个实施例中，所述iPSCs包含两种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于不同的安全港基因座中，包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一个特定实施例中，所述iPSCs包含两种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于不同的安全港基因座中，包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。
[0021] 在一些实施例中，使用所提供方法产生的基因组经工程改造的iPSCs相较于未进行相同基因组工程改造的iPSCs，实现了存留的改善、对免疫细胞的抗性增强、免疫抗性增强，或对T和/或NK细胞的抗性增强，其中基因组经工程改造的iPSCs维持多能性；且其中基因组经工程改造的iPSCs维持向保留相同功能基因组工程改造的非多能细胞分化的潜能。在一个实施例中，所产生的基因组经工程改造的iPSCs能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞，且其中所述部分分化细胞或完全分化细胞包含iPSCs中所含的至少一种靶向基因组编辑。在一个实施例中，所产生的基因组经工程改造的iPSCs能够分化成造血谱系细胞，包括中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
[0022] 本发明的另一方面提供基因组经工程改造的iPSCs，其包含(i)B2M剔除型或低含量型；(ii)TAP1剔除型或低含量型；(iii)TAP2剔除型或低含量型；(iv)TAP相关糖蛋白剔除型或低含量型；(v)HLA-E或不可裂解的HLA-E的表达引入；(vi)HLA-G或不可裂解的HLA-G的表达引入；(vii)PDL1的表达引入；(viii)不可裂解的高亲和力CD16(hnCD16)；(ix)Fc受体；(x)T细胞受体(TCR)；(xi)嵌合抗原受体(CAR)；(xii)一种或多种表达安全开关蛋白质的自杀基因；(xiii)双特异性、多特异性或通用接合体，或其任何组合。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs是B2M剔除型、TAP1剔除型、TAP2剔除型，或TAP相关糖蛋白剔除型。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs是B2M剔除型，其中引入了HLA-E、HLA-G、PDL1和hnCD16中的一种或多种的表达。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs是B2M剔除型，其中引入了HLA-E、HLA-G、PDL1、hnCD16和CAR中的一种或多种的表达。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs是B2M剔除型，其中引入了HLA-E、HLA-G、PDL1、hnCD16、CAR和至少一种安全开关蛋白质中的一种或多种的表达。在一些实施例中，所述表达引入是所述细胞中包含的非表达或低表达基因的表达增加。在一些其它实施例中，所述表达引入是外源表达。在一些实施例中，TCR、CAR、接合体、Fc受体或自杀基因是可诱导的。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs相较于未进行相同基因组工程改造的iPSCs，实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强，其中基因组经工程改造的iPSCs维持多能性；且其中基因组经工程改造的iPSCs维持向保留所述相同功能基因组工程改造的非多能细胞分化的潜能。
[0023] 另外提供缺乏HLA的已改造iPSCs，其缺乏HLA I类和/或II类，而另外包含(1)外源HLA-E、HLA-G、CD16、4lBBL、CD47、CD113和PDL1中的一种或多种；或(2)HLA-E、HLA-G、CD16、4lBBL、CD47、CD113和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入；和任选存在的(3)TCR、CAR、接合体、Fc受体和单一或双重安全开关蛋白质中的一种或多种。在一些实施例中，所述表达引入是所述细胞中包含的非表达或低表达基因的表达增加。在一个实施例中，缺乏HLA的已改造iPSCs所包含的TCR、CAR、接合体、Fc受体或自杀基因是可诱导的。在一些实施例中，缺乏HLA的已改造iPSCs相较于未进行相同基因组工程改造的iPSCs，实现了存留的改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强，其中缺乏HLA的已改造iPSCs维持多能性；且其中缺乏HLA的已改造iPSCs维持分化潜能，以生成缺乏HLA且具有相同基因组工程功能的非多能细胞。
[0024] 本发明的又一方面提供一种产生基因组经工程改造的非多能细胞的方法，所述非多能细胞衍生自基因组经工程改造的iPSCs，所述方法包含：(i)如上文所提供，获得基因组经工程改造的iPSCs或缺乏HLA的已改造iPSCs，其中所述iPSC包含至少一种功能性基因组编辑；和(ii)使基因组经工程改造的iPSCs或缺乏HLA的已改造iPSCs分化，以获得衍生的非多能细胞，其包含与基因组经工程改造的iPSCs中所包含相同的功能性靶向基因组编辑。在一些实施例中，分化步骤不需要形成类胚胎体。在一些实施例中，分化是在无饲养层、无基质或无血清下进行。在一些实施例中，衍生的非多能细胞包含造血谱系细胞。在一些实施例中，衍生的非多能细胞包含中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
[0025] 本发明的另一方面提供一种由iPSCs产生基因组经工程改造的非多能细胞的方法，所述方法包含(i)使iPSCs经受足以引发谱系特异性分化的条件；和(ii)通过(a)和(b)中的一个或两个按任何次序对步骤(i)的分化细胞进行基因工程改造，以获得基因组经工程改造的非多能细胞：(a)将一种或多种根据权利要求1所述的构筑体引入步骤(i)的分化细胞中，以允许靶向整合于所选位点；(b)(1)使用一种或多种能够识别所选位点的核酸内切酶将一个或多个位于所选位点的双股断裂引入步骤(i)的分化细胞中；和(2)培养得自步骤(ii)(b)(1)的细胞，以实现内源DNA修复，从而在所选位点产生靶向插入/缺失，借此获得基因组经工程改造的非多能细胞，其包含位于一个或多个所选位点的一种或多种功能靶向编辑。在一些实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含造血谱系细胞。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
[0026] 本发明进一步提供使用以上通用方法产生的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，且所产生的非多能细胞包含一种或多种功能性靶向基因组编辑。在一个实施例中，基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞包含中胚层细胞、生血内皮细胞、CD34细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞包含一种或多种外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码的蛋白质包含安全开关蛋白质；靶向模式受体；信号传导分子；转录因子；医药学活性蛋白质或肽；药物标靶候选物；或促进非多能细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在又一些其它实施例中，基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞包含与以下相关的内源基因中所含的一种或多种插入/缺失：靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；药物标靶候选物；免疫反应调控和调节；和抑制非多能细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些特定实施例中，基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞包含具有一个或多个插入/缺失的内源基因，且所述内源基因包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，或染色体6p21区域中的任何基因。在一些实施例中，基因组经工程改造的衍生非多能细胞包含以下中的至少一种的缺失或表达减少：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的衍生非多能细胞包含以下中的至少一种的表达引入或增加：HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体、接合体，和用于与双特异性或多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体。
[0027] 在又一些其它实施例中，根据权利要求54至60中任一项所述的基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞，其中所述非多能细胞包含：(i)至少两种各整合于相同安全港基因座中的外源多核苷酸，且其中所述外源多核苷酸编码相同或不同的安全开关蛋白质；或(ii)至少两种各整合于不同安全港基因座中的外源多核苷酸，且其中所述外源多核苷酸编码相同或不同的安全开关蛋白质。在基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞的一些实施例中，所述外源多核苷酸编码安全开关蛋白质，所述安全开关蛋白质选自半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20和其任何组合。在基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞的一些实施例中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞能够重编程为iPSCs，且其中所述iPSCs包含非多能细胞中所含的相同功能外源多核苷酸。在基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞的一些实施例中，由其重编程的iPSCs能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞。在另外一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞能够转分化成不同命运的非多能细胞。
[0028] 本发明的另一方面提供基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞，其包含(i)B2M剔除型或低含量型；(ii)TAP1剔除型或低含量型；(iii)TAP2剔除型或低含量型；(iv)TAP相关糖蛋白剔除型或低含量型；(v)HLA-E或不可裂解的HLA-E的表达引入；(vi)HLA-G或不可裂解的HLA-G的表达引入；(vii)PDL1的表达引入；(viii)不可裂解的高亲和力CD16(hnCD16)；(ix)Fc受体；(x)T细胞受体(TCR)；(xi)嵌合抗原受体(CAR)；(xii)一种或多种表达安全开关蛋白质的自杀基因；(xiii)双特异性、多特异性或通用接合体，或其任何组合。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞是B2M剔除型、TAP1剔除型、TAP2剔除型或TAP相关糖蛋白剔除型。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞是B2M剔除型，其中引入HLA-E、HLA-G、PDL1和hnCD16中的一种或多种的表达。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞是B2M剔除型，其中引入HLA-E、HLA-G、PDL1、hnCD16和CAR中的一种或多种的表达。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞是B2M剔除型，其中引入HLA-E、HLA-G、PDL1、hnCD16、CAR和至少一种安全开关蛋白质中的一种或多种的表达。在一些实施例中，所述表达引入是所述细胞中包含的非表达或低表达基因的表达增加。在一些其它实施例中，所述表达引入是外源表达。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞中所包含的TCR、CAR、接合体、Fc受体或自杀基因是可诱导的。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源造血谱系细胞实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；并且基因组经工程改造的低分化造血谱系细胞维持向保留所述相同功能基因组工程改造的非多能细胞分化的潜能。
[0029] 本发明进一步提供一种包含iPSC源造血细胞的组合物，所述组合物包含如上文所述的(a)基因组经工程改造的iPSC源CD34细胞；(b)基因组经工程改造的iPSC源造血干细胞和祖细胞；(c)基因组经工程改造的iPSC源造血多潜能祖细胞；(d)基因组经工程改造的iPSC源T细胞祖细胞；(e)基因组经工程改造的iPSC源NK细胞祖细胞；(f)基因组经工程改造的iPSC源T细胞；(g)基因组经工程改造的iPSC源NK细胞，和其任何组合。
[0030] 进一步提供基因组经工程改造的造血谱系细胞，其包含(i)B2M剔除型或低含量型；(ii)TAP1剔除型或低含量型；(iii)TAP2剔除型或低含量型；(iv)TAP相关糖蛋白剔除型或低含量型；(v)HLA-E或不可裂解的HLA-E的表达引入；(vi)HLA-G或不可裂解的HLA-G的表达引入；(vii)PDL1的表达引入；(viii)不可裂解的高亲和力CD16(hnCD16)；(ix)Fc受体；(x)T细胞受体(TCR)；(xi)嵌合抗原受体(CAR)；(xii)一种或多种表达安全开关蛋白质的自杀基因；(xiii)双特异性、多特异性或通用接合体，或其任何组合。在一些实施例中，基因组经工程改造的造血谱系细胞是B2M剔除型、TAP1剔除型、TAP2剔除型或TAP相关糖蛋白剔除型。在一些实施例中，基因组经工程改造的造血谱系细胞是B2M剔除型，其中引入HLA-E、HLA-G、PDL1和hnCD16中的一种或多种的表达。在一些实施例中，基因组经工程改造的造血谱系细胞是B2M剔除型，其中引入HLA-E、HLA-G、PDL1、hnCD16和CAR中的一种或多种的表达。
在一些实施例中，基因组经工程改造的造血谱系细胞是B2M剔除型，其中引入HLA-E、HLA-G、PDL1、hnCD16、CAR和至少一种安全开关蛋白质中的一种或多种的表达。在一些实施例中，所述表达引入是所述细胞中包含的非表达或低表达基因的表达增加。在一些其它实施例中，所述表达引入是外源表达。在一些实施例中，基因组经工程改造的造血谱系细胞中所包含的TCR、CAR或自杀基因是可诱导的。在一些实施例中，基因组经工程改造的造血谱系细胞实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；并且基因组经工程改造的低分化造血谱系细胞维持向保留所述相同功能基因组工程改造的非多能细胞分化的潜能。
在一些实施例中，基因组经工程改造的造血谱系细胞是B2M剔除型，其中引入HLA-E、HLA-G、PDL1、hnCD16、CAR和至少一种安全开关蛋白质中的一种或多种的表达。在一些实施例中，所述表达引入是所述细胞中包含的非表达或低表达基因的表达增加。在一些其它实施例中，所述表达引入是外源表达。在一些实施例中，基因组经工程改造的造血谱系细胞中所包含的TCR、CAR或自杀基因是可诱导的。在一些实施例中，基因组经工程改造的造血谱系细胞实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；并且基因组经工程改造的低分化造血谱系细胞维持向保留所述相同功能基因组工程改造的非多能细胞分化的潜能。
[0031] 另外提供缺乏HLA的经修饰的造血谱系细胞，其缺乏HLA I类和/或II类，而另外包含(1)外源HLA-E、HLA-G、CD16、4lBBL、CD47、CD113和PDL1中的一种或多种；或(2)HLA-E、HLA-G、CD16、4lBBL、CD47、CD113和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入；和任选存在的(3)TCR、CAR、接合体、Fc受体和单一或双重安全开关蛋白质中的一种或多种。在一些实施例中，所述表达引入是所述细胞中包含的非表达或低表达基因的表达增加。在一些实施例中，HLA缺乏的经修饰的造血谱系细胞中所包含的TCR、CAR、接合体、Fc受体或自杀基因是可诱导的。在一些实施例中，如本文所提供的HLA缺乏的经修饰的造血谱系细胞实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强、对T和/或NK细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；其中HLA缺乏的经修饰的低分化造血谱系细胞维持向保留所述相同功能基因组工程改造的非多能细胞分化的潜能。
[0032] 本发明的另一方面提供一种用于获得基因组经工程改造的iPSCs的组合物，所述组合物包含：(i)如本文所提供的基因组经工程改造的非多能细胞，所述细胞包含在所述基因组的一个或多个所选位点进行的至少一种靶向基因组编辑；(ii)一种或多种重编程因子；和任选存在的(iii)包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂的小分子组合物，其中所述组合物适用于获得包含基因组经工程改造的非多能细胞中所含的相同靶向基因组编辑的iPSCs。在一些实施例中，上述细胞在一个或多个所选位点发生的至少一种靶向基因组编辑包含一种或多种外源多核苷酸的插入，所述外源多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进非多能细胞和由其重编程的iPSCs移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
[0033] 在所述组合物的一些实施例中，所述一种或多种外源多核苷酸可操作地连接到(1)一个或多个外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或(2)所选位点中所包含的一个或多个内源启动子，所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。在所述组合物的一些实施例中，所述一种或多种外源多核苷酸可操作地连接到所选插入位点中所包含的一个或多个内源启动子，所述插入位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。在所述组合物的又一些其它实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含一种或多种编码安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述安全开关蛋白质包含半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20或其任何组合。在所述组合物的一些实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含两种或更多种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在所述组合物的一个特定实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含位于AAVS1基因座的编码半胱天冬酶的多核苷酸，和位于H11基因座的编码胸苷激酶的多核苷酸。在所述组合物的一些其它实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含与以下相关的内源基因中所含的一个或多个插入/缺失：靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；药物标靶候选物；免疫反应调控和调节；和抑制非多能细胞和来自其的iPSCs移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
[0034] 在组合物的一些实施例中，通过插入/缺失而中断的一个或多个内源基因选自B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。在所述组合物的一些实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含以下中的至少一种的缺失或表达减少：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。在所述组合物的一些其它实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含以下中的至少一种的表达引入或增加：HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体、接合体，和用于与双特异性或多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体。在所述组合物的一些实施例中，所述表达引入或增加是通过引入编码外源蛋白质的多核苷酸的整合或非整合方法来实现。在一些实施例中，非整合的外源多核苷酸是利用仙台病毒、游离体或质体引入。在所述组合物的一个实施例中，基因组经工程改造的所述非多能细胞缺乏HLA I类和/或II类。在一个实施例中，基因组经工程改造的所述非多能细胞包含B2M剔除型或低含量型、TAP1剔除型或低含量型、TAP2剔除型或低含量型，和/或TAP相关糖蛋白剔除型或低含量型。在所述组合物的一些其它实施例中，基因组经工程改造的所述非多能细胞包含编码HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种的整合或非整合外源多核苷酸。在一些实施例中，非整合的外源多核苷酸是利用仙台病毒、游离体或质体引入。在一些实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入，其中所述表达引入是所述细胞中所包含的非表达或低表达基因的表达增加。在所述组合物的一些实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含至少一种编码高亲和力CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码高亲和力且不可裂解的CD16受体(hnCD16)的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的HLA-E的外源多核苷酸；或至少一种编码不可裂解的HLA-G的外源多核苷酸。在所述组合物的又一些其它实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞包含中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。在所述组合物的一些实施例中，基因组经工程改造的非多能细胞实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强，或免疫抗性增强；或其中基因组经工程改造的所述非多能细胞对T和/或NK细胞的抗性增强。
[0035] 本发明的又一个方面提供一种用于获得基因组经工程改造的iPSCs的组合物，所述组合物包含：(i)非多能细胞；(ii)一种或多种用于在一个或多个所选基因座进行靶向编辑的构筑体；(iii)一种或多种重编程因子；和任选存在的(iv)包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂的小分子组合物，其中所述组合物适用于获得包含靶向基因组编辑的iPSCs，且基因组经工程改造的iPSCs借此实现存留改善、对免疫细胞的抗性增强或免疫抗性增强；或其中基因组经工程改造的所述iPSCs对T和/或NK细胞的抗性增强。
[0036] 在一些实施例中，上述组合物进一步包含一种或多种能够识别所选位点以便在所选位点引入双股断裂的核酸内切酶；和/或包含一种或多种外源多核苷酸的构筑体，所述外源多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进非多能细胞重编程的iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，所述一种或多种外源多核苷酸可操作地连接到(1)一个或多个外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或(2)所选位点中所包含的一个或多个内源启动子，所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。在所述组合物的一些其它实施例中，基因组经工程改造的所得iPSCs包含一种或多种编码安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述安全开关蛋白质包含半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20或其任何组合。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的所得iPSCs包含两种或更多种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。
[0037] 在一些其它实施例中，基因组经工程改造的所得iPSCs包含位于AAVS1基因座的编码半胱天冬酶的外源多核苷酸和位于H11基因座的编码胸苷激酶的外源多核苷酸。在又一些其它实施例中，基因组经工程改造的所得iPSCs包含与以下相关的内源基因中所含的一个或多个插入/缺失：靶向模式；受体；信号传导分子；转录因子；药物标靶候选物；免疫反应调控和调节；和抑制iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，基因组经工程改造的包含一个或多个插入/缺失的所得iPSCs包含以下中的一种或多种：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。
[0038] 在一个实施例中，所述组合物中的非多能细胞包含中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。在另一个实施例中，所述组合物进一步包含小分子组合物，所述小分子组合物包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，用于维持基因组经工程改造的所得iPSCs的多能性。
[0039] 本发明的另一方面包含用于维持基因组经工程改造的iPSCs的多能性的组合物，并且所述组合物包含(i)基因组经工程改造的iPSCs，和(ii)包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的小分子组合物。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs是由基因组经工程改造的非多能细胞重编程而获得，其中所得iPSCs包含与基因组经工程改造的非多能细胞相同的位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs是通过对克隆iPSC或iPSCs池进行基因组工程改造、通过引入位于一个或多个所选位点的一个或多个靶向整合和/或插入/缺失来获得。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的iPSCs是利用基因组工程、通过将位于一个或多个所选位点的一个或多个靶向整合和/或插入/缺失引入与一种或多种重编程因子和任选存在的小分子组合物接触的重编程非多能细胞池来获得，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂。
[0040] 所述组合物中的所述基因组经工程改造的iPSCs包含一种或多种外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进非多能细胞重编程的iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质；和/或位于一种或多种与以下相关的内源基因处的插入/缺失：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节，或抑制非多能细胞重编程的iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，所述一种或多种外源多核苷酸可操作地连接到(1)一个或多个外源启动子，包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、可诱导、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或(2)所选位点中所包含的一个或多个内源启动子，所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。在一些实施例中，所述组合物进一步包含一种或多种能够识别所选位点以便在所选位点引入双股断裂的核酸内切酶。
[0041] 在一些实施例中，组合物中的所述基因组经工程改造的iPSCs包含一种或多种编码安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述安全开关蛋白质选自半胱天冬酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20和其任何组合。在一些实施例中，所述基因组经工程改造的iPSCs包含两种或更多种编码相同或不同安全开关蛋白质的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸整合于不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些实施例中，所述基因组经工程改造的iPSCs包含位于AAVS1基因座的编码半胱天冬酶的基因，和位于H11基因座的编码胸苷激酶的基因。在一些实施例中，包含一个或多个插入/缺失的所述基因组经工程改造的iPSCs包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。在一些实施例中，所述基因组经工程改造的iPSCs包含以下中的至少一种的缺失或表达减少：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，和染色体6p21区域中的任何基因。在一些实施例中，组合物中的所述基因组经工程改造的iPSCs包含以下中的至少一种的表达引入或增加：HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体、接合体，和用于与双特异性或多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体。在一些实施例中，所述基因组经工程改造的iPSCs包含通过引入编码外源蛋白质的多核苷酸的整合或非整合方法来实现的表达引入或增加。
[0042] 在一些实施例中，组合物中的所述基因组经工程改造的iPSCs缺乏HLA I类和/或II类。在一些实施例中，组合物中的所述基因组经工程改造的iPSCs包含B2M剔除型或低含量型、TAP1剔除型或低含量型和/或TAP2剔除型或低含量型。在一些实施例中，组合物中的所述基因组经工程改造的iPSCs包含整合或非整合的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种；或其中基因组经工程改造的iPSCs包含HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL和PDL1蛋白质中的一种或多种的表达引入。在一些实施例中，组合物中的所述基因组经工程改造的iPSCs包含至少一种编码高亲和力CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的CD16受体的外源多核苷酸；至少一种编码高亲和力且不可裂解的CD16受体(hnCD16)的外源多核苷酸；至少一种编码不可裂解的HLA-E的外源多核苷酸；或至少一种编码不可裂解的HLA-G的外源多核苷酸。
[0043] 在一些实施例中，组合物中的所述基因组经工程改造的iPSCs实现了存留改善、对免疫细胞的抗性增强或免疫抗性增强；或其中基因组经工程改造的iPSCs对T和/或NK细胞的抗性增强。在一些实施例中，组合物中的所述基因组经工程改造的iPSCs具有分化成非多能细胞的潜能，所述非多能细胞包含具有相同功能性靶向基因组编辑的造血谱系细胞。在一些实施例中，组合物中的所述基因组经工程改造的iPSCs具有分化成中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞的潜能。
[0044] 本发明另外提供一种医药组合物，包含(i)如利用本发明所公开的方法和组合物提供的一种或多种以下群体：基因组经工程改造的iPSCs、缺乏HLA的已改造iPSCs、基因组经工程改造的非多能细胞、基因组经工程改造的造血谱系细胞、缺乏HLA的经修饰的造血谱系细胞，或其任何组合；和(ii)医药学上可接受的介质。在一些实施例中，所述造血谱系细胞是中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
[0045] 另外提供上述医药组合物的治疗用途，其通过将所述组合物引入适于过继性细胞疗法的受检者来实现，其中所述受检者患有自体免疫病症；血液恶性疾病；实体肿瘤；癌症；或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关的感染。
[0046] 本发明的又一个方面提供一种使用本文所提供的方法和组合物制造基因组经工程改造的iPSCs源非多能细胞的方法。
附图说明
[0048] 图1以图解方式表示经CMV启动子驱动的iCasp9自杀基因靶向插入AAVS1安全港中，以及当自杀基因被AP1903活化时的细胞反应。A.图解说明经设计以靶向AAVS1基因座的供体构筑体AAVS1-G1.0。B.针对经嘌呤霉素选择的293T细胞中的GFP表达进行的流式细胞术，所述293T细胞经对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和供体构筑体转染。C.经嘌呤霉素选择的293T细胞经受AP1903(或DMSO对照物)处理24小时。收集处理过的细胞且用7AAD染色(将膜受损的死亡细胞染色)且通过流式细胞术分析。针对每次处理(n＝2)的7AAD阴性细胞(可能是活细胞)百分比作图。AP1903处理后，检测到显著的细胞死亡。D.对来自经嘌呤霉素选择的293T细胞的基因组DNA进行的连接式PCR表明供体载体靶向插入AAVS1基因座中。E.hiPSCs用对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和包含经CMV驱动的iCasp9的供体构筑体(AAVS1-G1.0)转染。通过流式细胞术分析嘌呤霉素抗性细胞中的GFP表达。基于GFP强度分选并且扩增三种群体供进一步分析。F.使分选出且经扩增的GFP(阴性)、GFP(低)和GFP(高)群体经受AP1903(或DMSO对照物)处理24小时。收集处理过的细胞且用7AAD染色且通过流式细胞术分析。针对每次处理的7AAD阴性细胞(活细胞)百分比作图。G.对来自经嘌呤霉素选择且分选出的hiPSCs的基因组DNA进行的连接式PCR表明，供体载体靶向插入GFP(低)群的AAVS1基因座中，但未插入GFP(阴性)或GFP(高)群的AAVS1基因座中。
[0049] 图2以图解方式表示iCasp9在多种内源和外源启动子控制下靶向插入hiPSCs的安全港基因座中。A.图解说明经设计以通过驱动基因表达的AAVS1启动子靶向AAVs1基因座的构筑体。B.hiPSCs在AAVS1内源启动子的控制下用对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和包含iCasp9的供体构筑体转染；通过流式细胞术分析嘌呤霉素抗性细胞中的GFP表达。C.使扩增的嘌呤霉素抗性iPSCs经受AP1903(或DMSO对照物)处理24小时。收集处理过的细胞且用7AAD染色。针对每次处理的7AAD阴性细胞百分比作图。D.对来自嘌呤霉素抗性池的基因组DNA进行的连接式PCR表明供体载体靶向插入这个群体的AAVS1基因座中。E.图解说明经设计以通过多种启动子靶向AAVs1基因座的构筑体。F.hiPSCs在多种内源和外源启动子的控制下用对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和包含iCasp9的供体构筑体转染，且通过流式细胞术分析嘌呤霉素抗性细胞中的GFP表达。
[0050] 图3以图解方式表示经EF1α启动子驱动的iCasp9靶向插入iPSC的AAVS1安全港中。A.对hiPSCs进行嘌呤霉素选择，随后进行AP1903处理，所述hiPSCs经对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和包含经EF1a驱动的iCasp9的供体构筑体(参见图2)转染。闸选区域突出显示了GFP阳性细胞响应于AP1903细胞死亡诱导。B.在96孔板中批量或个别地分选出TRA181和GFP阳性hiPSCs。C.批量分选出的GFP阳性hiPSCs在无嘌呤霉素的培养基中超时维持以确定群体随时间的分布。D.由单一细胞分选出的TRA181和GFP细胞所衍生的克隆hiPSC的明视场影像。E.扩增克隆的hiPSCs，且扩增之后，GFP表达发生不同程度地损失。
[0051] 图4以图解方式表示经CAG启动子驱动的iCasp9靶向插入hiPSC的AAVS1安全港中。A.hiPSCs用对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和包含经CAG驱动的iCasp9的供体构筑体转染(参见图2)。在96孔板中批量或个别地分选出嘌呤霉素抗性细胞。B.批量分选出的GFP+iPSCs在无嘌呤霉素的培养基中维持21天，随后通过流式细胞术分析GFP表达。C.用AP1903处理时，GFP阳性细胞对7AAD染色呈阳性。D.个别分选后的典型群落的亮视场影像。E.扩增来源于单一细胞的群落，且流式细胞术评估展示高GFP和TRA181表达。F.所选克隆系的平均荧光强度。G.对基因组DNA进行的连接式PCR检测到亲代hiPSCs与CAG hiPSC群体池中的供体构筑体和AAVS1基因座的同源重组。
[0052] 图5以图解方式表示CAG-hiPSC克隆系的多能性表征。A.在无饲养层的培养物中所维持的CAG克隆系C38的代表性影像。B.多能性标记物NANOG和OCT4的免疫荧光染色。C.针对多种内源多能性标记物的表达的定量RT-PCR。D.使所选CAG克隆系发生定向的谱系特异性分化且评估谱系标记物：巢蛋白，外胚层；αSMA，中胚层；SOX17，内胚层。E.评估CAG-C38产生由多种谱系组成的畸胎瘤的潜能。注射后6周收集畸胎瘤。
[0053] 图6以图解方式表示经诱导的自杀基因介导杀死处于多能和分化状态的hiPSC克隆系，其中经CAG驱动的iCasp9靶向AAVS1基因座。A.将CAG-iCasp9靶向的二十种hiPSC克隆系用AP1903(或DMSO对照物)处理24小时，且然后通过流式细胞术分析GFP和7AAD染色。这个图中还展示了克隆系CAG-C5和CAG-C38的流式细胞测量图。B.CAG-iCasp9靶向的十五种iPSC克隆系中有一种在AP1903(10nM)处理之后存活。C.AP1903(10nM)处理之后，10cm培养皿上的CAG-C5活细胞覆盖率动力学。D.CAG-iCasp9靶向的hiPSC克隆系被诱导而分化成内胚层、中胚层或外胚层细胞且各自用AP1903处理，随后允许恢复和分化。处理之前且恢复之后的重复孔用结晶紫染色且成像。CAG-C5克隆系影像以图示展示。E.CAG-iCasp9靶向的hiPSC克隆系被诱导而分化成CD34+细胞，用AP1903处理48小时且通过流式细胞术分析细胞死亡。
[0054] 图7以图解方式表示活体内AP1903诱导衍生自iCasp9-iPSC克隆系的畸胎瘤消退。A.图解说明NSG小鼠研究中的皮下注射定位。B.第7-11天用AP1903(腹膜內，总计200μg)处理亲代hiPSC系和CAG-C38克隆系之后，在第34天收集的畸胎瘤影像。C.测量所收集的畸胎瘤的体积。D.衍生自亲代hiPSC或CAG-C38系的所收集畸胎瘤用苏木精和曙红染色。虽然亲代hiPSC系大多数显示为三谱系分化细胞类型，但CAG-C38似乎主要由高组织化脂肪样细胞组成。E.第40-46天，按照4E6个细胞注射亲代hiPSC系和CAG克隆系且用AP1903(腹膜內，总计200μg)处理。按常规方式测量所有肿瘤的体积。
[0055] 图8以图解方式表示逃逸克隆系的表征。A.图解说明选择在AP1903处理后存活的克隆系的方法。B.PCR扩增iCasp9转基因，随后进行提纯和基因组测序，以确定是否存在任何序列变化。C.对逃逸克隆系的流式细胞术评估展示了高GFP和TRA181表达。D.在所测序的所有克隆系中鉴别出单点突变K189E。E.为了鉴别K189E是否为难治克隆系的直接原因，产生并且测试iCasp9突变体形式。F.证明iCasp9突变型转基因是在AP1903处理后存活的原因。
[0056] 图9以图解方式表示使用CRISPR/Cas9对人类ROSA26基因座进行的基因组编辑，以便靶向插入或核酸酶不依赖型插入iCasp9。A.图解说明CRISPR/Cas9靶向ROSA26基因座的构筑体设计。B.hiPSCs用对ROSA26基因座具有特异性的gRNA/Cas9-RFP质体和如A所示的包含经CAG驱动的iCasp9的供体构筑体转染。转染两天后，通过流式细胞术分析细胞群的GFP表达，以确定转染效率(约89％)。通过流式细胞术分析嘌呤霉素抗性细胞在转染20天后的GFP表达。C.对经构筑体转染的293T细胞进行的AP1903诱导细胞死亡分析。D.构筑体靶向插入293T细胞。E.经构筑体转染且经嘌呤霉素选择以富集靶向细胞的hiPSCs。
[0057] 图10以图解方式表示靶向整合有单等位基因和双等位基因iCasp9的iPSC克隆系的产生。A.基于定量PCR来评估所指定的经CAG启动子驱动的iCasp9克隆系中的转基因(iCasp9-GFP)拷贝数。B.分选出的混合培养物(黑色)中或经单等位基因(浅灰色)或双等位基因的(暗灰色)iCasp9靶向插入的克隆系中的iCasp9-GFP的平均荧光强度(MFI)，如流式细胞术所测定。C.使用与所靶向的混合细胞和克隆系中的AAVS1-转基因接点重叠的引物，对转基因整合进行PCR分析。D.使用基于PCR的方法和对AAVS1整合位点具有特异性的引物评估AAVS1等位基因内的靶向整合数目。E.添加10nM AP1903之后，立即使用活细胞成像来评估未分选出的靶向池细胞、针对iCasp9-GFP分选出的靶向池细胞以及克隆CAG-C38和CAG-C5细胞系在板表面上的覆盖率。
[0058] 图11以图示方式展示外源CAG启动子允许iCasp9介导排除已建立的iPSC源畸胎瘤。A.研究设计的示意性描述。B.AP1903投与之前(上图)和投与结束之后第3天(125μg，腹膜內，第19-25天，下图)，所指定3组NSG小鼠(n＝2)的生物发光影像。C.来自指定细胞类型的畸胎瘤的总通量(光子数/秒)以平均值和SD表示。D.指定细胞类型在处理之后的总通量相对于处理之前的比率(平均值-/+SD)。E.向小鼠注射克隆CAG-C38和CAG混合细胞的结果。F.衍生自指定细胞类型的畸胎瘤的终末体积测量(第28天)。G.第28天时的畸胎瘤影像。从注射CAG-C38克隆系或CAG-iCasp9混合细胞的体侧未检测到畸胎瘤。*p值<0.05，通过不成对T检验所测量。ns：不显著。
[0059] 图12以图示方式展示所移植的双等位基因的iCasp9克隆系的可诱导杀死比单等位基因iCasp9克隆系更有效。A.研究设计的示意性描述。B.移植有指定细胞类型(双等位基因CAG-C5克隆系、单等位基因CAG-C38克隆系和亲代iPSCs)的NSG小鼠在iPSC移植之后第7天、第14天和第42天的生物发光影像。第7天成像是在即将投与AP1903(125μg，腹膜內，第7天-第13天)之前进行。C.下图展示第42天所收集(如果发现)的畸胎瘤的影像。D.来自指定群组的畸胎瘤的总通量(光子数/秒)以平均值和SD展示。*p值<0.05；**p值<0.01；*****p值<0.001，如通过不成对T检验所测量。ns：不显著。
[0060] 图13以图示方式展示其中双重自杀基因靶向个别安全港基因座的安全防护系统的产生。A.使用对sr39TK、sr39TK-杀稻瘟菌素(Bsd)接点或内源H11序列-转基因接点具有特异性的引物，对sr39TK在H11安全港基因座内的特异性基因组整合进行PCR分析。GAPDH用作内参考物。B.其中sr39TK靶向插入H11基因座内的CAG-C38iCasp9iPSC克隆系(i)不用GCV或AP1903处理而生长；(ii)仅用AP1903处理2天；(iii)仅用GCV处理9天；和(iv)AP1903与GCV并行处理2天，然后洗去AP1903，继续用GCF处理7天以上。
[0061] 图14以图解方式表示B2M-/-、缺乏HLA I的iPSCs的产生。A.流式细胞术分析转染之前(左图)和转染之后(中间图)的GFP和B2M和HLA-I表达。批量分选出对B2M与HLA-I均呈阴性的细胞(右图)。B.流式细胞术分析96孔板内以克隆方式分选出的B2M和HLA-I阴性细胞。
[0062] 图15以图解方式表示B2M-/-、缺乏HLA I的iPSCs的存留改善。A.B2M-/-hiPSCs未被预致敏T细胞杀死。B.B2M-/-hiPSCs在单一孔中共培养未被NK细胞识别。C.B2M-/-hiPSCs在个别孔中共培养未被NK细胞识别。D.B2M-/-hiPSCs在免疫胜任小鼠中已获得存留。
[0063] 图16展示HLA I类对iPSC的调节使iPSC在免疫胜任型接受者中的存留增强。A.基因工程改造的经HLA修饰的iPSCs在细胞表面上表达HLA-E且维持多能表型。B.注射B2M-/-HLAE iPSC后72小时，畸胎瘤的活体内荧光素成像，其展示存留相较于野生型iPSC增强。
[0064] 图17表明经基因工程改造以表达不可裂解的高亲和力CD16受体和41BBL共刺激分子的iPSC在分化成iCD34细胞的整个期间保持表达。A.第0天未分化细胞；B.第10天分化细胞。
[0065] 图18描绘了将CAR-T细胞重编程为iPSCs(TiPSCs)，根据对经基因工程改造而具有FTV106的T细胞所衍生的iPSCs中的CAR(FTV106)整合进行的PCR分析，所述iPSCs保留来源T细胞的相同遗传印记。
[0066] 图19表明经基因工程改造以表达CD19嵌合抗原受体(CAR)和截断的LNGFR细胞表面标记物作为CAR的共识别标志的iPSC在分化成iCD34细胞的期间保持表达。A.第0天未分化细胞；B.第10天分化细胞。
[0067] 图20描绘了由内源TCR启动子驱动的CAR的细胞类型特异性表达，和因CAR的基因座特异性插入而引起TCR的表达和功能基因敲除。
[0068] 图21表明经工程改造以表达免疫抑制蛋白质的hiPSC能够生成CD34细胞：A.HLAE、HLAG和PDL1在缺乏HLAI的已改造iPSCs的细胞表面上的表达；B.所有缺乏HLA I的已改造iPSCs在分化培养10天之后分化成CD34+HE。
[0069] 图22表明经工程改造以表达免疫抑制蛋白质的hiPSC能够生成造血谱系细胞。
[0070] 图23表明在hiPSCs的造血分化期间，经工程改造的非经典HLA免疫抑制蛋白质的表达被下调：A.HLA-E和HLA-G蛋白质不存在，而PDL1表达得以维持；B.上清液部分中存在HLA-E和HLA-G蛋白质，表明蛋白质脱落。
[0071] 图24描绘了不可裂解的HLAG融合蛋白在hiPSC中的设计和表达。A.HLA-E/B2M和HLA-G/B2M融合蛋白的抗裂解形式的设计；B.HLA-G/HLA-A3不可裂解蛋白质在细胞表面上表达而不影响iPSC的品质。
[0072] 图25描绘了展现HLA I类表达减少的TAP2-/-iPSC的产生：A.流式细胞术分析2种所选克隆系展现HLA I类的表达相较于亲代FTi121显著减少；B.用IFNγ处理之后，TAP2-/-克隆系展现HLA I类的表达相较于野生型FTi121减少。
[0073] 图26表明宿主NK细胞在免疫胜任接受者中导致hiPSC畸胎瘤排斥反应：A.抗体注射后3天，CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞不存在；B.相较于经IgG对照处理的动物，iPSC注射后120小时，NK耗乏的小鼠展现最高的针对肿瘤排斥反应的抗性。
[0074] 图27表明缺乏HLA I的已改造iPSCs在试管内实现了增强的存留和抗性。免疫抑制蛋白质在hiPSC源细胞上的表达阻止了以下细胞的识别和增殖：A.提纯的同种异体人类T细胞；B.PBMC同种异体人类T细胞；C.PBMC同种异体人类NK细胞。
[0075] 图28表明hnCD16蛋白质的表达不影响经工程改造的iPSCs的造血分化潜能。A.经工程改造而具有hnCD16表面表达的iNK细胞；B.hnCD16在衍生自经基因工程改造的iPSCs的iNKs上受到组成型表达且得到连续维持。
[0076] 图29描绘了表达hnCD16的iNK细胞的增强的功能：A.CD16刺激诱导表达hnCD16的iNK细胞增强细胞因子产生；B.hnCD16使表达hnCD16的iNK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增强。
[0077] 图30借助于iNK细胞扩增展示iPSC源iNK细胞的品质。
[0078] 图31表明iNK细胞相对于成人NK细胞具有更长的端粒。
[0079] 图32描绘了经基因工程改造而具有多西环素(doxycycline)可诱导CAR的iPSC系中的Tet可诱导CAR-2A-LNGFR表达：A.TetCAR iPSC中的可诱导CD19CAR表达；B.通过流式细胞术，根据半胱天冬酶-3在靶细胞上的表达来评估iNK介导的细胞毒性，且iNK细胞毒性因可诱导的CD19CAR表达而增强。
[0080] 图33说明iPSC中的Cre或多西环素可诱导表达：A.去除终止密码子且CAR表达在A.一次Cre重组酶诱导；B.多西环素诱导后活化。
[0081] 图34说明所关注基因在针对中断所选的基因座处插入，和基因编辑之后的hiPSC克隆选择：A.针对标靶载体和供体载体的构筑体设计，以便将所关注基因插入B2M基因座；B.基因编辑之后针对在供插入的所选基因座含有所选基因的克隆群体进行的hiPSC选择。
[0082] 图35描绘了iProT转化、低温保存，以及CD34和CD7在proT细胞中的表达(根据流式细胞术)：A.在proT细胞分离之前；B.解冻后第3天；C.第10+13天经低温保存的；D.未低温保存；E.proT细胞在解冻后可存活且在T细胞分化培养基中培养时展现增强的细胞增殖。
[0083] 图36描绘了iPSC源和CB源ProT细胞的功能表征：细胞因子释放和趋化性：A.iPSC源ProT细胞能够成功地向CCL21和SDF迁移；B.iPSC源proT细胞能够响应而产生且分泌IFNγ和TNFα细胞因子。
[0084] 图37表明iPSC源ProT细胞从TCRγ基因座保留的胚系的百分比降低，由此引发TCR基因座的VDJ重组。
具体实施方式
[0085] 干细胞(例如hESCs(胚胎干细胞)或iPSCs(诱导多能干细胞))的基因组修饰包括多核苷酸插入、缺失和取代。基因组经工程改造的iPSCs中的外源基因表达往往遇到问题，例如在原始基因组经工程改造的iPSCs在长期克隆扩增之后、细胞分化之后的基因静默或基因表达减少，和衍生自基因组经工程改造的iPSCs的细胞的脱分化细胞类型。本发明提供一种高效、可靠的靶向方法，用于将一种或多种外源基因(包括自杀基因和其它功能模式)稳定整合到iPSC中且维持所述基因在衍生自基因组经工程改造的iPSC的经扩增的iPSC和分化细胞中的功能响应。在一个实施例中，iPSC是单一细胞源克隆iPSC。在一个实施例中，本发明提供一种基因编码的可诱导“自杀”系统，其适用于靶向整合于一个或多个所选位点，所述系统响应于iPSC、经扩增的iPSC和由其衍生的分化细胞中的特异性无毒性化学诱导因子。本发明因此代表了一种高效、可靠的靶向方法，其用于排除所投与的细胞而不损伤周围细胞和组织，适用于多种细胞疗法。另外，本发明还提供了一种用于获得克隆iPSC的方法和系统，所述克隆iPSC整合有与以下有关的多种基因模式：重编程和脱分化、iPSC分化、促进iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、迁移、细胞毒性、活力、维持、扩增、长寿命、自我更新、存留和/或存活的蛋白质，包括(但不限于)HSC(造血干细胞和祖细胞)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞。另外，本发明描述了诱导半胱天冬酶9基因突变的鉴别，所述突变使得其难以用化学诱导法治疗且允许逃避诱导的细胞死亡；和克服或防止此类逃逸的方法，例如双重自杀基因安全防护系统，或双等位基因自杀基因插入。
[0086] 定义
[0087] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。为了本发明的目的，以下术语定义如下。冠词“一(a/an/the)”在本文中用来指所述冠词的一个或超过一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一成分”意味着一个成分或超过一个成分。
[0088] 替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。
[0089] 术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一个或两个。
[0090] 如本文所使用，术语“约”或“大约”是指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度相比，变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施例中，术语“约”或“大约”是指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度的范围，所述范围为参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度的±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％。
[0091] 如本文所使用，术语“实质上”或“基本上”是指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度为参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度的约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。在一个实施例中，术语“基本上相同”或“实质上相同”是指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度的范围与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度大约相同。
[0092] 如本文所用，术语“实质上不含”与“基本上不含”可互换地使用，且当用于描述组合物(例如细胞群或培养基)时，係指不含所指定物质或其来源的组合物，例如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含所指定物质或其来源，或检测不到，如通过传统方式所测量。术语组合物中“不含”或“基本上不含”某种成分或物质也意指(1)所述组合物中不包括任何浓度的此类成分或物质，或(2)所述组合物中包括功能上呈惰性、但处于低浓度的此类成分或物质。类似含义可以应用于术语“缺乏”，其是指组合物中缺乏特定物质或其来源。
[0093] 在通篇本说明书中，除非上下文另外要求，否则“包含(comprise/comprises/comprising)”一词应理解成暗指包括所述步骤或成分或一组步骤或成分，但不排除任何其它步骤或成分或一组步骤或成分。在特定实施例中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义地使用。
[0094] “由……组成”意指包括并且局限于短语“由……组成”之后的任何事物。因此，短语“由……组成”表示所列成分为需要或必需的，并且不能存在其它成分。
[0095] “基本上由……组成”意指包括短语后所列的任何成分，并且局限于不干扰或影响本公开中针对所列成分所指定的活性或作用的其它成分。因此，短语“主要由……组成”表示所列成分为需要或必需的，但其它成分是任选存在的且视其是否影响所列成分的活性或作用而定，可以或可以不存在。
[0096] 通篇本说明书中提及“一个实施例”、“一实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某一实施例”、“额外实施例”或“另一实施例”或其组合意指结合实施例所述的具体特点、结构或特征包括于本发明的至少一个实施例中。因此，通篇本说明书中的各处出现的前述短语不一定都指同一实施例。另外，在一个或多个实施例中，具体特点、结构或特性可以任何适合方式组合。
[0097] 术语“活体外”一般是指在生物体外部发生的活动，例如在生物体外部的人工环境中、在活组织中或活组织上进行的实验或测量，优选为天然条件的改变最小。在特定实施例中，“活体外”程序涉及从生物体中获取活细胞或组织且在实验室装置中培养、通常在无菌条件下典型地培养几小时或长达约24小时，但包括长达48或72小时或更长，此视情况而定。在某些实施例中，可以收集和冷冻此类组织或细胞，且日后解冻以便进行活体外处理。持续时间长于几天的使用活细胞或组织的组织培养实验或程序典型地被视为“试管内”，但在某些实施例中，这个术语可以与活体外互换使用。
[0098] 术语“活体内”一般是指在生物体内部进行的活动。
[0099] 如本文所用，术语“重编程”或“去分化”或“提高细胞效能”或“提高发育效能”是指一种提高细胞效能或使细胞脱分化成低分化状态的方法。举例来说，相较于非重编程状态下的相同细胞，细胞效能增加的细胞具有更大的发育可塑性(即，能分化成更多细胞类型)。换句话说，重编程细胞是分化状态比处于非重编程状态下的相同细胞弱的细胞。
[0100] 如本文所用，术语“分化”是未特化(“未专门化”)或弱特化细胞借以获得特化细胞(例如血细胞或肌肉细胞)的特点的过程。分化细胞或分化诱导细胞是已处在细胞谱系内的更特化(“专门化”)位置的细胞。术语“专门化”当应用于分化过程时，是指一种细胞，其在分化路径中已经行进到在正常情形下其将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的亚群且在正常情形下其不能分化成不同细胞类型或恢复为更弱分化细胞类型的时刻。如本文所用，术语“多能”是指细胞形成身体或躯体(即，胚胎本身)的所有谱系的能力。举例来说，胚胎干细胞是一种类型的多能干细胞，其能够形成三种胚层中的每一种的细胞：外胚层、中胚层和内胚层。多能是一种连续的发育效能，范围为不能产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如外胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整生物体的更原始、更多能细胞(例如胚胎干细胞)。
[0101] 如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或iPSCs意指由分化的成人、新生儿或胎儿细胞产生的干细胞，所述干细胞已经诱导或改变，即，重编程为能够分化成所有三种胚层或真皮层的组织的细胞：中胚层、内胚层和外胚层。所产生的iPSCs并非指如其在自然界中被发现的那样的细胞。
[0102] 如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指胚胎囊胚的内部细胞团块中的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的且在发育期间生成三种初始胚层的所有衍生细胞：外胚层、内胚层和中胚层。其对胚胎外膜或胎盘没有贡献，即，并非分化全能的。
[0103] 如本文所用，术语“多潜能干细胞”是指具有分化成一种或多种胚层(外胚层、中胚层和内胚层)、但非全部三种胚层的细胞的发育潜能的细胞。因此，多潜能细胞也可以称为“部分分化细胞”。多潜能细胞在所属领域中是众所周知的，且多潜能细胞的实例包括成体干细胞，例如造血干细胞和神经干细胞。“多潜能”表示细胞可以形成指定谱系内的许多类型的细胞，而非其它谱系的细胞。举例来说，多潜能造血细胞能够形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但其不能形成神经元。因此，术语“多潜能性”是指一种细胞状态，其发育潜能的程度小于分化全能和多能。
[0104] 多能性能够部分地通过评估细胞的多能性特征来确定。多能性特征包括(但不限于)：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜能；(iii)多能干细胞标记物的表达，所述标记物包括(但不限于)SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/凸素(prominin)、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化成所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；以及(vi)由来自三种体细胞谱系的细胞组成的类胚胎体的形成。
[0105] 此前已描述两种类型的多能性：“激发”或“亚稳定”的多能状态等效于后期囊胚的外胚层干细胞(EpiSC)，且“初始”或“基础”的多能状态等效于早期/植入前囊胚的内部细胞团块。尽管两种多能状态均展现如上文所述的特征，但所述初始或基础状态进一步展现；(i)雌性细胞中的X-染色体的预先不活化或再活化；(ii)在单一细胞培养期间，克隆性和存活率改善；(iii)DNA甲基化总体减少；(iv)发育调控基因启动子上的H3K27me3抑制性染色质标记沉积减少；以及(v)相对于激发状态的多能细胞，分化标记物的表达减少。通常发现细胞再编程标准方法(其中将外源多能性基因引入体细胞中，表达，且然后静默或从所得多能细胞中去除)具有多能性激发状态的特征。在标准多能细胞培养条件下，除非维持外源性转基因表达(其中观察到基础状态的特征)，否则此类细胞保持激发状态。
[0106] 如本文所用，术语“多能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态特点。正常胚胎干细胞形态的特征是小圆形形状，细胞核与细胞质比率高，明显存在核仁，和典型的细胞间间距。
[0107] 如本文所用，术语“受检者”是指任何动物，优选的是人类患者、牲畜或其它驯养动物。
[0108] “多能因子”或“重编程因子”是指一种药剂，其能够单独或与其它药剂组合来增强细胞的发育效能。多能因子包括(但不限于)能够提高细胞发育效能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性多能因子包括例如转录因子和小分子重编程药剂。
[0109] “培养”或“细胞培养”是指细胞在试管内环境中维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基”(在各种情况下，为单数形式“培养基(medium)”)、“补充剂”和“培养基补充剂”是指培育细胞培养物的营养组合物。
[0110] “培育”或“维持”是指细胞在组织或身体外部(例如在无菌塑料(或经涂布的塑料)细胞培养皿或烧瓶中)维持、繁殖(生长)和/或分化。“培育”或“维持”可以使用培养基作为有助于细胞繁殖和/或维持的营养、激素和/或其它因子来源。
[0111] 如本文所用，术语“中胚层”是指三种胚层之一，其出现于早期胚胎发生期间且产生各种特化细胞类型，包括循环系统的血细胞、肌肉、心脏、真皮、骨骼和其它支持和结缔组织。
[0112] 如本文所用，术语“永久性生血内皮细胞”(HE)或“多能干细胞源永久性生血内皮细胞”(iHE)是指在称为内皮细胞向造血细胞转变的过程中生成造血干细胞和祖细胞的内皮细胞亚群。胚胎中的造血细胞发育依序进行：从侧板中胚层到成血管细胞到永久性生血内皮细胞和造血祖细胞。
[0113] 术语“造血干细胞和祖细胞”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前驱细胞”是指向造血谱系定型、但能够进一步向造血分化的细胞，且包括多潜能造血干细胞(血胚细胞)、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。造血干细胞和祖细胞(HSCs)是多潜能干细胞，其生成所有血细胞类型，包括骨髓(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)，和淋巴谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。如本文所用，术语“永久性造血干细胞”是指CD34+造血细胞，其能够生成成熟骨髓细胞类型和淋巴细胞类型，包括T细胞、NK细胞和B细胞。造血细胞还包括原始造血细胞的多种亚群，其生成原始红细胞、巨核细胞和巨噬细胞。
[0114] 如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换地使用且是指白血细胞的主要类型，其在胸腺中完成成熟且在免疫系统中具有多种作用，包括鉴别体内的特异性外来抗原和使其它免疫细胞活化和去活化。T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如初代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或获自哺乳动物的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞且可以处于任何发育阶段，包括(但不限于)CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、周边血液单核细胞(PBMCs)、周边血液白细胞(PBLs)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)、记忆T细胞、未处理T细胞、调控T细胞、gamma deltaT细胞(γδT细胞)等等。其它类型的辅助T细胞包括例如Th3(Treg)、Th17、Th9或Tfh细胞等细胞。其它类型的记忆T细胞包括例如中枢记忆T细胞(Tcm细胞)、效应子记忆T细胞(Tem细胞和TEMRA细胞)等细胞。T细胞还可以指经基因工程改造的T细胞，例如经修饰可表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞还能够由干细胞或祖细胞分化而得。
[0115] “CD4+T细胞”是指T细胞的一个亚群，其在其表面上表达CD4且与细胞介导的免疫反应相关。其通过刺激之后的分泌分布曲线来表征，所述分泌分布曲线可以包括例如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10等细胞因子的分泌。“CD4”是55-kD糖蛋白，其最初定义为T淋巴细胞上的分化抗原，但是也发现于包括单核细胞/巨噬细胞的其它细胞上。CD4抗原是免疫球蛋白家族成员且表明为MHC(主要组织相容性复合体)II类限制的免疫反应中的相关识别成分。在T淋巴细胞上，它们界定了辅助/诱导因子亚群。
[0116] “CD8+T细胞”是指T细胞的一个亚群，其在其表面上表达CD8，受限于MHC I类，且充当细胞毒性T细胞。“CD8”分子是发现于胸腺细胞上和细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族成员且主要组织相容性复合体I类限制的相互作用中的相关识别成分。
[0117] 如本文所用，术语“NK细胞”或“自然杀手细胞”是指周边血液淋巴细胞的一个亚群，其根据CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的缺乏来定义。如本文所用，术语“适应性NK细胞”与“记忆NK细胞”可互换且是指NK细胞的一个亚群，其表型为CD3-和CD56+，表达NKG2C和CD57和任选存在的CD16，但缺乏以下一种或多种的表达：PLZF、SYK、FceRγ和EAT-2。在一些实施例中，分离的CD56+NK细胞亚群包含CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配体、NKp30、NKp40、NKp46、活化和抑制性KIRs、NKG2A以及DNAM-1的表达。CD56+可以是较弱或较强的表达。
[0118] 如本文所用，术语“NKT细胞”或“自然杀手T细胞”是指局限于CD1d的T细胞，其表达T细胞受体(TCR)。不同于传统T细胞检测由传统主要组织相容(MHC)分子呈递的肽抗原，NKT细胞识别由CD1d(一种非经典MHC分子)呈递的脂质抗原。目前已识别两种类型的NKT细胞。恒定型或I型NKT细胞表达非常有限的TCR谱系：典型α链(人类中为Vα24-Jα18)与有限范围的β链(人类中为Vβ11)的结合。第二个NKT细胞群，称为非经典或非恒定II型NKT细胞，显示更不均匀的TCRαβ利用率。I型NKT细胞目前被认为适于免疫疗法。适应性或恒定型(I型)NKT细胞可以根据以下标记物中的至少一种或多种的表达来鉴别：TCR Va24-Ja18、Vb11、CD1d、CD3、CD4、CD8、αGalCer、CD161和CD56。
[0119] 如本文所用，术语“分离”等是指一种细胞或细胞群，其已从其原始环境中分离，即，分离细胞的环境基本上不含如存在“未分离”参考细胞的环境中所发现的至少一种组分。所述术语包括脱除如在其天然环境(例如组织、活检)中所发现的一些或所有组分的细胞。所述术语还包括脱除至少一种、一些或所有组分的细胞，如同所述细胞发现于非天然存在的环境中，例如培养物、细胞悬浮液中。因此，分离的细胞部分地或完全地与至少一种组分(包括其它物质、细胞或细胞群)分离，如同其在自然界中发现或如同其在非天然存在的环境中生长、储存或生存。分离细胞的特定实例包括部分纯细胞、基本上纯细胞和非天然存在的培养基中培养的细胞。分离的细胞可以通过将所期望的细胞或其群体与环境中的其它物质或细胞分离或通过从环境中去除一或多个其它细胞群或亚群来获得。如本文所用，术语“提纯”等是指提高纯度。举例来说，纯度可以提高到至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
[0120] 如本文所用，术语“编码”指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中的核苷酸的特异性序列的固有特性，其充当生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板，所述其它聚合物和大分子具有定义的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列和由其得到的生物学特性。因此，如果与一种基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生一种蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。编码股(其核苷酸序列与mRNA序列一致且通常提供于序列表中)与非编码股(用作基因或cDNA转录的模板)均可以称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
[0121] “构筑体”是指包含待试管内或活体内递送到宿主细胞中的多核苷酸的大分子或分子复合体。如本文所用，“载体”是指能够引导外来遗传物质递送或转移到靶细胞的任何核酸构筑体，在靶细胞中，所述核酸构筑体能够复制和/或表达。如本文所用，术语“载体”包含待递送的构筑体。载体可以是线性或圆形分子。载体可以是整合或非整合载体。主要的载体类型包括(但不限于)质体、游离型载体、病毒载体、粘质体和人工染色体。病毒载体包括(但不限于)腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。
[0122] “整合”意指构筑体的一个或多个核苷酸稳定插入细胞基因组中，即，共价连接至细胞染色体DNA内的核酸序列。“靶向整合”意指构筑体的核苷酸插入细胞染色体或线粒体DNA中的预选位点或“整合位点”。如本文所用，术语“整合”另外是指一种过程，其涉及在内源序列或核苷酸缺失或不缺失的情况下将构筑体的一个或多个外源序列或核苷酸插入整合位点。在插入位点存在缺失的情况下，“整合”可以进一步包含用一个或多个所插入核苷酸置换缺失的内源序列或核苷酸。
[0123] 如本文所用，术语“外源”意指将参考分子或参考活性引入宿主细胞中。所述分子可以通过例如将编码核酸引入宿主遗传物质中来引入，例如整合于宿主染色体中，或整合于非染色体遗传物质(例如质体)中。因此，所述术语当关于编码核酸的表达使用时是指编码核酸以可表达形式引入细胞中。术语“内源”是指存在于宿主细胞中的参考分子或活性。类似地，所述术语当关于编码核酸的表达使用时，是指细胞内所含而非外源引入的编码核酸的表达。
[0124] 如本文所用，“所关注基因”或“所关注多核苷酸序列”是当放置在适当调控序列的控制下时活体内转录成RNA且在一些情况下翻译成多肽的DNA序列。所关注基因或多核苷酸可以包括(但不限于)原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。举例来说，所关注基因可以编码miRNA、shRNA、原生多肽(即，自然界中发现的多肽)或其片段；变异型多肽(即，与原生多肽序列一致性小于100％的原生多肽突变体)或其片段；经工程改造的多肽或肽片段、治疗肽或多肽、成像标记物、可选标记物等等。
[0125] 如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)聚合物形式，或其类似物。多核苷酸序列是由四个核苷酸碱基组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；和尿嘧啶(U)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶代替胸腺嘧啶)。多核苷酸可以包括基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖核酸酶、cDNA、重组多核苷酸、分支链多核苷酸、质体、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸还指双股和单股分子。
[0126] 如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用且是指氨基酸残基通过肽键共价连接的分子。多肽必须含有至少两个氨基酸，且多肽的氨基酸最大数目不受限制。如本文所用，所述术语是指短链(在所属领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)和较长链(在所属领域中通常称为多肽或蛋白质)。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变异体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白以及其它。所述多肽包括天然多肽、重组多肽、合成多肽或其组合。
[0127] “可操作地连接”是指单一核酸片段上的核酸序列的结合，以使得一者的功能受另一者影响。举例来说，当启动子能够影响编码序列或功能RNA表达(即，所述编码序列或功能RNA处于启动子的转录控制下)时，所述启动子与所述编码序列或功能RNA可操作地连接。编码序列可以按照有义或反义定向可操作地连接到调控序列。
[0128] 如本文所用，术语“遗传印记”是指对源细胞或iPSC的优选治疗属性有贡献的遗传或表观遗传信息，并且能保留于源细胞衍生的iPSCs和/或iPSC衍生的造血谱系细胞中。如本文所用，“源细胞”是一种可以用于通过重编程来产生iPSCs的非多能细胞，且源细胞衍生的iPSCs可以进一步分化成特定细胞类型，包括任何造血谱系细胞。视上下文而定，源细胞衍生的iPSCs和其分化细胞有时统称为“衍生细胞”。如本文所用，赋予优选治疗属性的遗传印记是通过使对供者、疾病或治疗反应具有特异性的所选源细胞重编程或通过使用基因组编辑将基因修饰模式引入iPSC来并入iPSCs中。在从特别选择的供者、疾病或治疗背景所获得的源细胞的所述方面中，对优选治疗属性具有贡献的遗传印记可以包括任何背景特有的遗传或表观遗传改造，其显现能保留的表型，即优选的治疗属性，所述表型传递到所选源细胞的衍生细胞，无论潜在分子事件得到鉴别或未得到鉴别。对供者、疾病或治疗反应具有特异性的源细胞可以包含能保留于iPSCs和衍生造血谱系细胞中的遗传印记，所述遗传印记包括(但不限于)预排列的单特异性TCR，例如来自病毒特异性T细胞或恒定型天然杀手T(iNKT)细胞；能追踪且令人期望的遗传多态性，例如对编码所选供者中的高亲和力CD16受体的点突变来说为同型；和预定的HLA需求，即，所选的HLA匹配供者细胞随着群体增大而展现单倍型。如本文所用，优选治疗属性包括衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性改善。优选的治疗属性还可以涉及靶向抗原的受体表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；靶向特异性改善，同时肿瘤外效应减小；对例如化学疗法等疗法的抗性。
[0129] 如本文所用，术语“增强的治疗特性”是指细胞的治疗特性相较于相同一般细胞类型的典型免疫细胞增强。举例来说，相较于典型的、未改造的和/或天然存在的NK细胞，具有“增强的治疗特性”的NK细胞将具有增强、改善和/或强化的治疗特性。免疫细胞的治疗特性可以包括(但不限于)细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性也通过以下来显现：靶向抗原的受体表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；靶向特异性改善，同时肿瘤外效应减小；对例如化学疗法等疗法的抗性。
[0130] 如本文所用，术语“接合体”是指一种分子，例如融合多肽，其能够使免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)与肿瘤细胞之间形成连接；且活化所述免疫细胞。接合体的实例包括(但不限于)双特异性T细胞接合体(BiTEs)、双特异性杀手细胞接合体(BiKEs)、三特异性杀手细胞接合体，或多特异性杀手细胞接合体，或与多种免疫细胞类型相容的通用接合体。
[0131] 如本文所用，术语“表面触发受体”是指一种能够触发或起始免疫反应(例如细胞毒性反应)的受体。表面触发受体可以加以工程改造，且可以在效应细胞上表达，例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞。在一些实施例中，表面触发受体促进效应细胞与特定靶细胞(例如肿瘤细胞)之间发生双特异性或多特异性抗体接合，不依赖于效应细胞的天然受体和细胞类型。使用这种方法，可以产生包含通用表面触发受体的iPSCs，且然后使此类iPSCs分化成表达所述通用表面触发受体的各种效应细胞类型的群体。“通用”意指表面触发受体能够表达于任何效应细胞中且活化任何效应细胞(不论细胞类型)且表达通用受体的所有效应细胞能够与表面触发受体可识别的具有相同抗原决定基的接合体偶联或连接(不论接合体的肿瘤结合特异性)。在一些实施例中，具有相同肿瘤靶向特异性的接合体用于与通用表面触发受体偶联。在一些实施例中，具有不同肿瘤靶向特异性的接合体用于与所述通用表面触发受体偶联。因而，能够使一种或多种效应细胞类型接合，从而在一些情况下杀死一种特定类型的肿瘤细胞且在一些其它情况下杀死两种或更多种类型的肿瘤。表面触发受体通常包含用于效应细胞活化的共刺激域和对接合体的抗原决定基具有特异性的抗抗原决定基。双特异性接合体对位于一端的表面触发受体的抗抗原决定基具有特异性，且对位于另一端的肿瘤抗原具有特异性。
[0132] 如本文所用，术语“安全开关蛋白质”是指一种工程化蛋白质，其经设计以防止细胞疗法的潜在毒性或以其它方式防止不良效应。在一些情况下，安全开关蛋白质表达受到有条件的控制，以解决所移植的工程化细胞的安全问题，所述细胞已经将编码安全开关蛋白质的基因永久性地并入其基因组中。这种条件性调控可以是可变的且可能包括通过小分子介导的翻译后活化和组织特异性和/或按时转录调控来进行控制。所述安全开关能够介导细胞凋亡的诱导、蛋白质合成的抑制、DNA复制、生长阻滞、转录和转录后基因调控，和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下，所述安全开关蛋白质被外源分子(例如前药)活化，其活化时，触发治疗细胞发生细胞凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白质的实例包括(但不限于)自杀基因，例如半胱天冬酶9(或半胱天冬酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、经修饰的EGFR，和其任何组合。在这种策略中，在不良事件情况下投与的前药被自杀基因产物活化且杀死经转导的细胞。
[0133] 如本文所用，术语“医药学活性蛋白质或肽”是指能够对生物体实现生物学和/或医药作用的蛋白质或肽。医药学活性蛋白质具有针对疾病的治愈性或姑息性特性，且可以投与以改善、减轻、缓解、逆转或减轻疾病严重度。医药学活性蛋白质还具有预防特性且用于防止疾病发作或减轻此类疾病或病理性病状在其显现时的严重度。医药学活性蛋白质包括完整蛋白质或肽或其医药学活性片段。其还包括所述蛋白质或肽的医药学活性类似物或所述蛋白质或肽的片段的类似物。术语医药学活性蛋白质还指以协作或协同方式发挥作用以提供治疗效益的多种蛋白质或肽。医药学活性蛋白质或肽的实例包括(但不限于)受体、结合蛋白、转录和翻译因子、肿瘤生长抑制蛋白质、抗体或其片段、生长因子和/或细胞因子。
[0134] 如本文所用，术语“信号传导分子”是指调节、参与、抑制、活化、减少或增加细胞信号转导的任何分子。信号转导是指分子信号以化学修饰形式传递，其通过沿着最终触发细胞中的生物化学事件的路径募集蛋白质复合物来实现。信号转导路径在所属领域中是众所周知的，且包括(但不限于)G蛋白偶联受体信号传导、酪胺酸激酶受体信号传导、整合素信号传导、TG点信号传导、配体闸选离子通道信号传导、ERK/MAPK信号传导路径、Wnt信号传导路径、cAMP依赖性路径，和IP3/DAG信号传导路径。
[0135] 如本文所用，术语“靶向模式”是指分子(例如多肽)以遗传方式并入细胞中以促进抗原和/或抗原决定基特异性，包括(但不限于)i)抗原特异性(当其涉及独特嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)时)；ii)接合体特异性(当其涉及单克隆抗体或双特异性接合体时)；ⅲ)靶向转化细胞；iv)靶向癌症干细胞，和v)在缺乏特异性抗原或表面分子的情况下的其它靶向策略。
[0136] 如本文所用，与非特异性或非选择性结合相比，术语“特异性”可以用于指分子(例如受体或接合体)能够选择性地结合到靶分子。
[0137] 如本文所用，术语“过继性细胞疗法”是指一种基于细胞的免疫疗法，如本文所用，其是指自体或同种异体淋巴细胞的输注，所述淋巴细胞经鉴别为经遗传改造或未经遗传改造的T或B细胞，其在所述输注之前已在活体外扩增。
[0138] 如本文所用，“治疗上足量”在其含义内包括无毒性、但足够和/或有效量的其所提及的特定治疗和/或医药组合物，以提供所期望的治疗效果。所需确切量将因受检者而异，这取决于例如患者总体健康状况、患者年龄和病状分期和严重度等因素。在特定实施例中，治疗上足够的量足以和/或有效减轻、减少和/或改善与所治疗的受检者的疾病或病状相关的至少一种症状。
[0139] 多能干细胞的分化需要改变培养系统，例如改变培养基中的刺激剂或细胞的物理状态。大部分传统策略是使用类胚胎体(EBs)的形成作为起始谱系特异性分化的共同和关键中间步骤。“类胚胎体”是三维团簇，其已表明可模拟胚胎发育，因为其在其三维区域内产生多种谱系。通过分化过程，典型地为几小时到几天，简单的EBs(例如经诱发可分化的聚集多能干细胞)继续成熟且发育成囊性EB，此时，典型地进一步将其处理数日到几周以继续分化。EB形成是通过使多能干细胞彼此紧密接近地形成三维多层细胞团簇来起始，这典型地是通过若干种方法之一来实现，包括允许多能细胞在液滴中沉降、使细胞在“U”形底孔板中沉降或通过机械搅拌。为了促进EB发育，多能干细胞聚集体需要进一步分化提示，原因是多能培养维持性培养基中所维持的聚集体不形成适当EBs。因而，多能干细胞聚集体需要转移到分化培养基中，所述分化培养基向所选谱系提供诱发提示。通过在EB细胞团簇内适度增殖，基于EB的多能干细胞培养典型地引起分化细胞群(外胚层、中胚层和内胚层胚层)生成。虽然经证实可促进细胞分化，然而，EBs产生了分化状态可变的异质细胞，原因是三维结构中的细胞不一致地暴露于来自环境的分化提示。另外，EBs的产生和维持麻烦。此外，通过EB进行的细胞分化伴随适度细胞扩增，这也导致分化效率降低。
[0140] 相比之下，与“EB形成”不同的“聚集体形成”可以用于扩增多能干细胞源细胞群。举例来说，在基于聚集体的多能干细胞扩增期间，选择可维持增殖和多能性的培养基。细胞增殖通常增加聚集体的尺寸，从而形成更大聚集体，这些聚集体能够用常规的机械或酶方式解离成更小聚集体，从而维持培养物内的细胞增殖且增加细胞数目。不同于EB培养，维持培养的聚集体内所培养的细胞维持多能性标记。多能干细胞聚集体需要进一步分化提示来诱导分化。
[0141] 如本文所用，“单层分化”是关于分化方法的术语，其不同于通过三维多层细胞团簇进行的分化，即，“EB形成”。单层分化以及本文所公开的其它优点避免了分化起始需要EB形成。由于单层培养不模拟胚胎发育，例如EB形成，因此相较于EB中的所有三种胚层分化，向特定谱系的分化被认为是最少的。
[0142] 如本文所用，“解离”的细胞是指与其它细胞已基本上分离或从其它细胞中提纯的细胞，或与表面(例如培养板表面)已基本上分离的细胞。举例来说，细胞能通过机械或酶方法从动物或组织解离。或者，试管内聚集的细胞能彼此解离，例如以酶或机械方式解离到团簇、单一细胞或单一细胞与团簇的混合物的悬浮液中。在又一个替代实施例中，粘附细胞从培养板或其它表面解离。因此，解离可以涉及中断细胞与胞外基质(ECM)和衬底(例如培养表面)的相互作用，或中断细胞之间的ECM。
[0143] 如本文所用，“饲养细胞”或“饲养层”为描述一种类型的细胞的术语，其与第二类型的细胞共培养以提供所述第二类型的细胞能够生长的环境，因为饲养细胞提供支持所述第二细胞类型的生长因子和营养。饲养细胞任选地来自与其支持的细胞不同的物种。举例来说，某些类型的人类细胞，包括干细胞，可以由小鼠胚胎成纤维细胞和永生化小鼠胚胎成纤维细胞的初代培养物支持。饲养细胞当与其它细胞共培养时，可以典型地通过照射或用抗有丝分裂剂(例如丝裂霉素(mitomycin))处理来灭活，以防止其生长超出其支持的细胞。饲养细胞可以包括内皮细胞、基质细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)，和白血病细胞。不限于前述，一种特定的饲养细胞类型可以是人类饲养层，例如人类皮肤成纤维细胞。另一饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。一般来说，多种饲养细胞能够部分地用于维持多能性、向某种谱系直接分化和促进成熟为特化细胞类型，例如效应细胞。
[0144] 如本文所用，“无饲养层”(FF)环境是指一种环境，例如培养条件、细胞培养物或培养基，其基本上不含饲养层或基质细胞，和/或尚未通过培育饲养细胞加以预调节。“预调节”培养基是指饲养细胞在培养基内已培育一段时间(例如至少一天)之后所收集的培养基。预调节培养基含有多种介体物质，包括在培养基中培育的饲养细胞所分泌的生长因子和细胞因子。
[0145] 如在iPSC和由其分化的衍生非多能细胞的基因组编辑或修饰或非多能细胞和由其重编程的衍生iPSCs的基因组编辑或修饰的背景下所用的“功能”是指(1)在基因层面上成功的敲入、敲除、降低基因表达、转基因或可控基因表达，例如所期望的细胞发育阶段的可诱导或按时表达，这通过直接的基因组编辑或修饰或通过“传递”、通过最初进行基因组工程改造的起始细胞的分化或重编程来实现；或(2)在细胞层面成功的去除、添加或改变细胞功能/特征，这通过以下实现：(i)在所述细胞中通过直接的基因组编辑而获得的基因表达变化；(ii)在所述细胞中通过“传递”、通过从最初进行基因组工程改造的起始细胞的分化或重编程而维持的基因表达变化；(iii)在所述细胞中作为基因表达变化的结果的下游基因调控，所述基因表达变化仅出现于所述细胞的较早发育阶段或仅出现于通过分化或重编程而生成所述细胞的起始细胞中；或(iv)成熟细胞产物内所呈现的增强的或新获得的细胞功能或属性，所述成熟细胞产物最初通过对祖细胞或脱分化细胞来源的iPSC进行基因组编辑或修饰而获得。
[0146] “缺乏HLA”，包括缺乏HLA-I类，或缺乏HLA-II类，或两者，是指缺乏或不再维持包含HLA I类蛋白质异二聚体和/或HLA II类异二聚体的完整MHC复合体的表面表达或所述表面表达的水平降低，使得减弱或降低的水平低于被其它细胞天然可检测到的或被合成方法可检测到的水平。HLA I类缺乏可以通过使HLA I类基因座(染色体6p21)的任何区域发生功能缺失或使HLA I类相关基因(包括(不限于)β-2微球蛋白(B2M)基因、TAP 1基因、TAP 2基因和TAP相关糖蛋白)缺失或表达水平降低来实现。HLA II类缺乏可以通过使HLA-II相关基因(包括(不限于)RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP)发生功能缺失或降低来实现。在本发明之前，不清楚HLA复合体缺乏或改变的iPSCs是否有能力进入发育、成熟和产生功能分化细胞，同时保持调节活性。另外，在本发明之前，不清楚缺乏HLA复合体的分化细胞是否能够重编程为iPSCs且作为同时缺乏HLA复合体的多能干细胞维持。在细胞重编程、多能性维持和分化期间发生的非预期失败可能涉及包括(但不限于)以下各方面：发育阶段的特异性基因表达或其缺乏、需要HLA复合体呈递、所引入的表面表达模式中的蛋白质脱落、需要适当和高效的克隆重编程，和需要分化方案的重配置。
[0147] 如本文所用，“缺乏HLA的已改造iPSC”是指缺乏HLA的iPSC，其另外通过引入基因表达蛋白质而经修饰，所述蛋白质与以下有关(但不限于以下)：改善的分化潜能、抗原靶向、抗原呈递、抗体识别、存留、免疫逃避、抑制抗性、增殖、共刺激、细胞因子刺激、细胞因子产生(自分泌或旁分泌)、趋化性和细胞介导的细胞毒性，例如非经典HLA I类蛋白质(例如HLA-E和HLA-G)、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、CD16Fc受体、BCL11b、NOTCH、RUNX1、IL15、41BB、DAP10、DAP12、CD24、CD3z、41BBL、CD47、CD113和PDL1。“缺乏HLA的经修饰的”细胞还包括除iPSCs之外的细胞。
[0148] “Fc受体”(缩写为FcR)是基于它们识别的抗体类型而分类。举例来说，结合最普通类别的抗体(IgG)的那些受体称为Fc-γ受体(FcγR)，结合IgA的那些受体称为Fc-α受体(FcαR)且结合IgE的那些受体称为Fc-ε受体(FcεR)。FcR's的类别还通过表达其的细胞(巨噬细胞、粒细胞、自然杀手细胞、T和B细胞)和每种受体的信号传导特性来区分。Fc-γ受体(FcγR)包括若干成员：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)，其因其分子结构不同而对抗体具有不同亲和力。
[0149] CD16已鉴别有两种同功异型物：Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。CD16a是由NK细胞表达的跨膜蛋白，其结合附着到靶细胞的单体IgG以活化NK细胞和促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。如本文所用，“高亲和力CD16”、“不可裂解的CD16”或“不可裂解的高亲和力CD16”是指CD16变异体。野生型CD16具有低亲和力且经历胞外域脱落，这是一种蛋白分解裂解过程，其在NK细胞活化后调控白细胞上的多种细胞表面分子的细胞表面密度。F176V和F158V是具有高亲和力的示例性CD16变异体；而S197P变异体是CD16的不可裂解形式的一个实例。
[0150] I.在iPSC细胞中的所选基因座进行靶向基因组编辑的方法
[0151] 如本文中可互换使用，基因组编辑或基因编辑是一种类型的基因工程，其中在靶细胞的基因组中进行DNA插入、缺失和/或置换。靶向基因组编辑(与“靶向基因组编辑”或“靶向基因编辑”可互换)能够在基因组中的预选位点实现插入、缺失和/或取代。当在靶向编辑期间使内源序列在插入位点缺失时，可以敲除包含受影响序列的内源基因或因序列缺失而降低其基因表达。因此，靶向编辑还可以用于中断内源基因表达。本文中类似地使用术语“靶向整合”，其是指一种涉及在使内源序列在插入位点缺失或不缺失的情况下插入一个或多个外源序列的方法。相比之下，随机整合的基因经历位置效应和静默，以致其表达不可靠且不可预测。举例来说，着丝点和亚端粒区域特别容易发生转基因静默。相反，新整合的基因可以影响周围内源基因和染色质，潜在地改变细胞特性或有利于细胞转化。因此，将外源DNA插入预选基因座(例如安全港基因座或基因组安全港(GSH))对于安全、效率、拷贝数控制以及可靠的基因反应控制来说具有重要作用。
[0152] 靶向编辑可以通过核酸酶非依赖性方法或通过核酸酶依赖性方法实现。在核酸酶非依赖性靶向编辑方法中，同源重组是通过宿主细胞的酶机制、通过同源序列侧接待插入的外源多核苷酸而引导。
[0153] 或者，靶向编辑可以通过利用特异性稀有切割核酸内切酶特异性引入双股断裂(DSBs)来实现。此类核酸酶依赖性靶向编辑是利用DNA修复机制，包括非同源末端连接(NHEJ)，其响应于DSBs而发生。不使用含有外源遗传物质的供体载体，NHEJ通常引起少量的内源核苷酸的随机插入或缺失(插入/缺失)。相比之下，当含有与一对同源臂侧接的外源遗传物质的供体载体存在时，可以在同源性定向修复(HDR)期间通过同源重组将外源遗传物质引入基因组中，从而产生“靶向整合”。
[0154] 能够引入特异性和靶向DSBs的可用核酸内切酶包括(但不限于)锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)、RNA引导的CRISPR-Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9；簇聚的规则间隔的短回文重复关联9)。另外，利用phiC31和Bxb1整合酶的DICE(双整合酶盒交换)系统也是靶向整合的一种有前景的工具。
[0155] ZFNs是靶向核酸酶，其包含与锌指DNA结合域融合的核酸酶。“锌指DNA结合域”或“ZFBD”意指按照序列特异性方式、通过一个或多个锌指结合DNA的多肽域。锌指是锌指结合域内的约30个氨基酸的结构域，其结构通过锌离子的配位而稳定化。锌指实例包括(但不限于)C2H2锌指、C3H锌指和C4锌指。“设计”的锌指域是一种不存在于自然界中的结构域，其设计/组成主要来源于合理准则，例如应用代入规则和计算机化算法来处理存储现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息。参见例如美国专利第6,140,081号；第6,453,242号；和第6,534,261号；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。A“所选”锌指域是一种在自然界中未发现的结构域，其产生主要来源于经验方法，例如噬菌体呈现、相互作用截留或杂交选择。ZFNs更详细地描述于美国专利第7,888,121号和美国专利第7,972,854号中，其完整公开内容以引入的方式并入本文中。ZFN在所属领域中的最公认实例是FokI核酸酶与锌指DNA结合域的融合物。
[0156] TALEN是一种靶向核酸酶，其包含与TAL效应子DNA结合域融合的核酸酶。“转录活化因子样效应子DNA结合域”、“TAL效应子DNA结合域”或“TALE DNA结合域”意指负责TAL效应子蛋白质结合到DNA的TAL效应蛋白的多肽域。TAL效应蛋白由黄单胞菌属(Xanthomonas)植物病原体在感染期间分泌。这些蛋白质进入植物细胞的核，通过其DNA结合域结合效应子特异性DNA序列，且通过其反式活化域活化这些序列的基因转录。TAL效应子DNA结合域特异性取决于不完美的34个氨基酸重复的效应子可变数目，其包含所选重复位置处的多态性，称为重复可变双残基(RVD)。TALENs更详细地描述于美国专利申请第2011/0145940号，所述申请以引用的方式并入本文中。TALEN在所属领域中的最公认实例是FokI核酸酶与TAL效应子DNA结合域的融合多肽。
[0157] 用于本发明方法中的靶向核酸酶的另一实例是靶向Spo11核酸酶，一种包含Spo11多肽的多肽，所述Spo11多肽具有与DNA结合域(例如对所关注的DNA序列具有特异性的锌指DNA结合域、TAL效应子DNA结合域等)融合的核酸酶活性。参见例如美国申请第61/555,857号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
[0158] 适用于本发明的靶向核酸酶的其它实例包括(但不限于)Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1和Wβ/SPBc/TP901-1，不论个别地或组合地使用。
[0159] 靶向核酸酶的其它非限制性实例包括天然存在的重组核酸酶，例如CRISPR/半胱天冬酶9、限制核酸内切酶、大核酸酶、归巢核酸内切酶等等。
[0160] CRISPR/半胱天冬酶-9需要两种主要组分：(1)半胱天冬酶-9核酸内切酶(Casp9)和(2)crRNA-tracrRNA复合体。共表达时，所述两种组分形成募集到标靶DNA序列的复合体，包含PAM和靠近PAM的接种区域。crRNA与tracrRNA可以组合而形成嵌合向导RNA(gRNA)以指引Casp9靶向所选序列。这两种组分然后可以通过转染或转导递送到哺乳动物细胞。
[0161] DICE介导的插入是利用一对重组酶(例如phiC31和Bxb1)来提供外源DNA的单向整合，其严格局限于每种酶自身的小attB和attP识别位点。由于这些att靶点并非天然存在于哺乳动物基因组中，因此必须首先将它们引入基因组中的所期望整合位点。参见例如美国申请公开第2015/0140665号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
[0162] 本发明的一个方面提供一种构筑体，其包含一个或多个用于靶向基因组整合的外源多核苷酸。在一个实施例中，所述构筑体进一步包含对所期望的整合位点具有特异性的一对同源臂，且所述靶向整合方法包含将所述构筑体引入细胞中以允许细胞宿主酶机制实现定点同源重组。在另一个实施例中，在细胞中实现靶向整合的方法包含将包含一个或多个外源多核苷酸的构筑体引入细胞中，和将包含对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合域的ZFN表达盒引入细胞中以实现ZFN介导的插入。在又另一个实施例中，在细胞中实现靶向整合的方法包含将包含一个或多个外源多核苷酸的构筑体引入细胞中，和将包含对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合域的TALEN表达盒引入细胞中以实现TALEN介导的插入。在另一个实施例中，在细胞中实现靶向整合的方法包含将包含一个或多个外源多核苷酸的构筑体引入细胞中、将Cas9表达盒和包含对所期望的整合位点具有特异性的向导序列的gRNA引入细胞中以实现Cas9介导的插入。在再另一个实施例中，在细胞中实现靶向整合的方法包含将包含一对DICE重组酶的一个或多个att位点的构筑体引入细胞中的所期望的整合位点、将包含一个或多个外源多核苷酸的构筑体引入细胞中，和将DICE重组酶的表达盒引入以实现DICE介导的靶向整合。
[0163] 有望用于靶向整合的位点包括(但不限于)安全港基因座或基因组安全港(GSH)，其是人类基因组的基因内或基因外区域，在理论上，其能够容纳新整合的DNA的可预测表达而不会对宿主细胞或生物体产生不利影响。适用的安全港必须允许转基因表达足以产生由载体编码的蛋白质或非编码RNA的所期望含量。安全港还不得使细胞容易发生恶性转化，也不得改变细胞功能。如果整合位点是潜在的安全港基因座，则理想的是需要满足包括(但不限于)以下的准则：如通过序列注释所判断，调控元件或基因没有中断；是基因密集区域中的基因间区域，或沿相反方向转录的两种基因之间的汇聚位置；保持距离以使载体编码的转录活化因子与相邻基因(特别是癌症相关和微RNA基因)的启动子之间的长程相互作用的可能性最小化；且具有明显普遍存在的转录活性，如通过按较宽空间和时间表达的序列标签(EST)表达谱所反映，其指示普遍存在的转录活性。这个后一特点在干细胞中特别重要，其中在分化期间，染色质重塑典型地引起一些基因座的静默和其它基因座的潜在活化。在适于外源插入的区域内，选用于插入的确切基因座应该不含重复元件和保守序列且可以针对其容易地设计出用于扩增同源臂的引物。
[0164] 适用于人类基因组编辑或具体地说靶向整合的位点包括(但不限于)腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(CC基元)受体5(CCR5)基因座和小鼠ROSA26基因座的人类直系同源物。另外，小鼠H11基因座的人类直系同源物也可以是使用本文所公开的靶向整合组合物和方法进行插入的适合位点。另外，也可以使用胶原蛋白和HTRP基因座作为靶向整合的安全港。然而，每个所选位点的验证已表明是必需的，特别是在特异性整合事件的干细胞中，并且通常需要优化插入策略，包括启动子选择、外源基因序列和配置，以及构筑体设计。
[0165] 用于靶向插入/缺失的编辑位点通常包含于其表达和/或功能旨在是中断的内源基因中。在一个实施例中，包含靶向插入/缺失的内源基因与免疫反应调控和调节相关。在一些其它实施例中，包含靶向插入/缺失的内源基因与以下相关：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节，或抑制干细胞和/或祖细胞和其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
[0166] 因而，本发明的一个方面提供一种在所选基因座中进行靶向整合的方法，所选基因座包括基因组安全港或已知或证实安全的预选基因座且经充分调控以实现连续或按时基因表达，例如如本文所提供的B2M、TAP1、TAP2或TAP相关糖蛋白基因座。在一个实施例中，靶向整合方法用的基因组安全港包含一个或多个所期望的整合位点，包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一个实施例中，在细胞中进行靶向整合的方法包含：将包含一个或多个外源多核苷酸的构筑体引入细胞中，和将包含对所期望的整合位点具有特异性的一对同源臂和一个或多个外源序列的构筑体引入，以通过细胞宿主酶机制实现定点同源重组，其中所期望的整合位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。
[0167] 在另一个实施例中，在细胞中进行靶向整合的方法包含：将包含一个或多个外源多核苷酸的构筑体引入细胞中，和将包含对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合域的ZFN表达盒引入细胞中以实现ZFN介导的插入，其中所期望的整合位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在又另一个实施例中，在细胞中进行靶向整合的方法包含：将包含一个或多个外源多核苷酸的构筑体引入细胞中，和将包含对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合域的TALEN表达盒引入细胞中，以实现TALEN介导的插入，其中所期望的整合位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在另一个实施例中，在细胞中进行靶向整合的方法包含：将包含一个或多个外源多核苷酸的构筑体引入细胞中、将Cas9表达盒和包含对所期望的整合位点具有特异性的向导序列的gRNA引入细胞中以实现Cas9介导的插入，其中所期望的整合位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在再另一个实施例中，在细胞中进行靶向整合的方法包含：将包含一对DICE重组酶的一个或多个att位点的构筑体引入细胞中的所期望整合位点、将包含一个或多个外源多核苷酸的构筑体引入细胞中，和引入DICE重组酶的表达盒，以实现DICE介导的靶向整合，其中所期望的整合位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。
[0168] 另外，如本文所提供，用于靶向整合于安全港的上述方法是用于插入所关注的任何多核苷酸，例如编码以下的多核苷酸：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，和促进干细胞和/或祖细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些其它实施例中，包含一个或多个外源多核苷酸的构筑体进一步包含一个或多个标记物基因。在一个实施例中，本发明的构筑体中的外源多核苷酸是编码安全开关蛋白质的自杀基因。适用于诱导细胞死亡的自杀基因系统包括(但不限于)半胱天冬酶9(或半胱天冬酶3或7)和AP1903；胸苷激酶(TK)和苷昔洛韦(ganciclovir，GCV)；胞嘧啶脱氨酶(CD)和5-氟胞嘧啶(5-FC)。另外，一些自杀基因系统对细胞类型具有特异性，例如使用B细胞分子CD20对T淋巴细胞进行基因修饰允许其在投与mAb利妥昔单抗(Rituximab)后排除。另外，当经基因工程改造的细胞暴露于西妥昔单抗时，含有被西妥昔单抗识别的抗原决定基的经修饰的EGFR可以用于耗乏所述细胞。因而，本发明的一个方面提供一种靶向整合一个或多个编码安全开关蛋白质的自杀基因的方法，所述安全开关蛋白质选自半胱天冬酶9(半胱天冬酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR和B细胞CD20。
[0169] 在一些实施例中，通过本文中的方法整合的一个或多个外源多核苷酸是通过用于靶向整合的构筑体中所含的可操作连接的外源启动子驱动。所述启动子可以是可诱导的或结构性的，且可以是时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的。适用于本发明方法的结构性启动子包括(但不限于)细胞巨大病毒(CMV)、延长因子1α(EF1α)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、杂交CMV增强子/鸡肉β-肌动蛋白(CAG)和泛素C(UBC)启动子。在一个实施例中，外源启动子是CAG。
[0170] 通过本文中的方法整合的外源多核苷酸可以通过宿主基因组中的内源启动子在整合位点驱动。在一个实施例中，本发明的方法是用于使一个或多个外源多核苷酸靶向整合于细胞基因组中的AAVS1基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源AAVS1启动子驱动。在另一个实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的ROSA26基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源ROSA26启动子驱动。在再另一个实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的H11基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源H11启动子驱动。在另一个实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的胶原蛋白基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源胶原蛋白启动子驱动。在再另一个实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的HTRP基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源HTRP启动子驱动。理论上，只有正确插入所期望位置才能实现由内源启动子驱动的外源基因的基因表达。
[0171] 在一些实施例中，靶向整合方法用的构筑体中所含的一个或多个外源多核苷酸是由一个启动子驱动。在一些实施例中，所述构筑体包含一个或多个位于由同一个启动子驱动的两个相邻多核苷酸之间的连接序列，以使得各部分之间的物理间距更大且使酶机制可及性最大化。连接序列的连接肽可以由为了使各部分(外源多核苷酸，和/或由其编码的蛋白质或肽)之间产生物理间距而选择的氨基酸组成，视相关功能而定，其较柔软或较硬。连接序列可以通过蛋白酶裂解或以化学方式裂解以产生个别部分。连接子中的酶裂解位点实例包括蛋白水解酶(例如肠激酶、因子Xa、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和凝血酶)的裂解位点。在一些实施例中，所述蛋白酶是由宿主天然产生的蛋白酶或其通过外源引入。或者，连接子中的裂解位点可以是在暴露于所选化学物质(例如溴化氰、羟胺或低pH)后能够裂解的位点。任选存在的连接序列可以服务于除提供裂解位点之外的目的。连接序列应该允许所述部分相对于另一相邻部分有效定位，以便所述部分正确地发挥功能。连接子还可以是长度足以防止所述部分之间出现任何空间位阻的简单氨基酸序列。另外，所述连接序列可以实现翻译后修饰，包括(但不限于)例如磷酸化位点、生物素化位点、硫酸化位点、γ-羧基化位点等等。在一些实施例中，连接序列是柔软的，以便使生物活性肽不能保持单一非期望的构形。
连接子可以主要包含具有小侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以提供柔性。在一些实施例中，连接序列中的约80或90％或更多包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，尤其是甘氨酸和丝氨酸残基。在若干实施例中，G4S连接肽将融合蛋白的末端处理域和核酸内切酶域分隔。在其它实施例中，2A连接序列允许单次翻译产生两个个别蛋白质。适合的连接序列能容易凭经验鉴别。另外，连接序列的适合尺寸和序列也能通过传统的计算机建模技术确定。在一个实施例中，连接序列编码自我裂解肽。在一个实施例中，自我裂解肽是2A。在一些其它实施例中，连接序列提供内部核糖体入口序列(IRES)。在一些实施例中，任何两个相邻的连接序列是不同的。
连接子可以主要包含具有小侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以提供柔性。在一些实施例中，连接序列中的约80或90％或更多包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，尤其是甘氨酸和丝氨酸残基。在若干实施例中，G4S连接肽将融合蛋白的末端处理域和核酸内切酶域分隔。在其它实施例中，2A连接序列允许单次翻译产生两个个别蛋白质。适合的连接序列能容易凭经验鉴别。另外，连接序列的适合尺寸和序列也能通过传统的计算机建模技术确定。在一个实施例中，连接序列编码自我裂解肽。在一个实施例中，自我裂解肽是2A。在一些其它实施例中，连接序列提供内部核糖体入口序列(IRES)。在一些实施例中，任何两个相邻的连接序列是不同的。
[0172] 将包含待靶向整合的外源多核苷酸的构筑体引入细胞中的方法可以使用本来已知的将基因转移到细胞的方法实现。在一个实施例中，所述构筑体包含病毒载体的骨架，例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体。在一些实施例中，质体载体用于将外源多核苷酸递送到靶细胞中且/或使外源多核苷酸在靶细胞中表达(例如pAl-11、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等等。在一些其它实施例中，游离型载体用于将外源多核苷酸递送到靶细胞。在一些实施例中，重组腺相关病毒(rAAV)可用于基因工程以通过同源重组来引入插入、缺失或取代。不同于慢病毒，rAAVs不能整合于宿主基因组中。另外，游离型rAAV载体介导同源性定向基因靶向的速率比传统靶向质体的转染速率高得多。在一些实施例中，AAV6或AAV2载体用于将插入、缺失或取代引入iPSCs基因组中的靶点。
[0173] II.获得和维持基因组经工程改造的iPSCs的方法
[0174] 本发明提供一种获得维持基因组经工程改造的iPSCs的方法，所述iPSCs包含在一个或多个所期望的位点进行的一个或多个靶向编辑，其中所述靶向编辑在基因组经工程改造的经扩增的iPSCs或iPSCs源非多能细胞中、在相应所选编辑位点处保持完整的功能。所述靶向编辑将iPSC插入、缺失和/或取代引入基因组中，即，将靶向整合和/或插入/缺失引入所选位点。
[0175] 在特定实施例中，基因组经工程改造的包含在一个或多个所选位点进行一个或多个靶向编辑的iPSCs作为单一细胞在表1所示的作为命运维持培养基(FMM)的细胞培养基中长期维持、传代和扩增，其中所述iPSCs在所选位点保持靶向编辑和功能修饰。培养基的组分可以表1中所示的最优范围内的量存在于培养基中。FMM中所培养的iPSCs已表明继续维持其未分化和基础或未处理轮廓；基因组稳定性，而不需要培养物清洗或选择；且通过试管内类胚胎体或单层分化(不形成类胚胎体)和活体内畸胎瘤形成的分化容易产生所有三种体细胞谱系。参见例如美国申请第61/947,979号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
[0176]
[0177] 在一些实施例中，基因组经工程改造的包含一个或多个靶向整合和/或插入/缺失的iPSCs是在包含MEKi、GSKi和ROCKi且不含或基本上不含TGFβ受体/ALK5抑制剂的中维持、传代和扩增，其中所述iPSCs在所选位点保持完整的功能靶向编辑。在一些实施例中，靶向整合位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些实施例中，靶向插入/缺失位点是选自与以下相关的内源基因：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物；免疫反应调控和调节；或抑制iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，基因组经工程改造的经维持、传代和扩增的iPSCs包含在一个或多个所期望的整合位点整合的一个或多个可诱导自杀基因，所述整合位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的经维持、传代和扩增的iPSCs包含位于相同或不同的所期望整合位点的多核苷酸，所述多核苷酸编码：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进干细胞和/或祖细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
[0178] 在一些实施例中，基因组经工程改造的包含一个或多个外源多核苷酸的iPSC进一步包含一个或多个内源基因中的插入/缺失。在一些实施例中，内源基因中所包含的插入/缺失引起基因表达中断。在一些实施例中，内源基因中所包含的插入/缺失引起所编辑基因被敲除。在一些实施例中，内源基因中所包含的插入/缺失引起所编辑基因的表达降低。在一些实施例中，基因组经工程改造的包含一个或多个位于所选位点的外源多核苷酸的iPSC可以进一步包含一个或多个靶向编辑，包括位于所选位点的插入/缺失。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个与免疫反应调控和介导相关的内源基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源检查点基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源T细胞受体基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源MHC I类抑制基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个与主要组织相容性复合体相关的内源基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源基因中，包括(但不限于)B2M、PD1、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、TCR基因。在一个实施例中，基因组经工程改造的包含一个或多个位于所选位点的外源多核苷酸的iPSC进一步包含B2M(β-2微球蛋白)编码基因中的靶向编辑。
[0179] 本发明的另一方面提供一种产生基因组经工程改造的iPSCs的方法，其通过iPSCs的靶向编辑；或首先通过靶向编辑来产生基因组经工程改造的非多能细胞，且然后将所选/经分离的基因组经工程改造非多能细胞重编程，以获得包含与非多能细胞相同的靶向编辑的iPSCs。本发明的另一个方面提供基因组经工程改造的非多能细胞，其通过将靶向整合和/或靶向插入/缺失引入细胞中而同时经历重编程，其中所接触的非多能细胞处于足以用于重编程的条件下，且其中重编程条件包含使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触。在同时进行基因组工程改造和重编程的方法的各种实施例中，可以在启动重编程之前或基本上同时，通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触而将靶向整合和/或靶向插入/缺失引入非多能细胞中。
[0180] 在一些实施例中，为了对非多能细胞同时进行基因组工程改造和重编程，还可以在通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触而启动多日重编程工艺之后，将靶向整合和/或插入/缺失引入非多能细胞中，且其中携带构筑体的载体是在重编程细胞呈现一种或多种内源多能基因(包括(但不限于)SSEA4、Tra181和CD30)的稳定表达之前引入。
[0181] 在一些实施例中，重编程是通过使非多能细胞与至少一种重编程因子和任选存在的TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂与ROCK抑制剂的组合(FRM；表1)接触来启动。在一些实施例中，通过上述任何方法实现的基因组经工程改造的iPSCs进一步使用包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合的混合物(FMM；表1)来维持和扩增。
[0182] 在产生基因组经工程改造的iPSCs的方法的一些实施例中，所述方法包含：对iPSC进行基因组工程改造，其通过将一个或多个靶向整合和/或插入/缺失引入iPSCs中的所选位点以获得基因组经工程改造的iPSCs。或者，产生基因组经工程改造的iPSCs的方法包含：(a)将一个或多个靶向编辑引入非多能细胞中，以获得基因组经工程改造的包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的非多能细胞，和(b)使基因组经工程改造的非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选存在的小分子组合物接触，以获得基因组经工程改造的包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的iPSCs，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂。或者，产生基因组经工程改造的iPSCs的方法包含：(a)使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选存在的小分子组合物接触，以启动非多能细胞的重编程，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；(b)将一种或多种靶向整合和/或插入/缺失引入基因组工程改造用的重编程非多能细胞中；和(c)获得基因组经工程改造的包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的克隆iPSCs。
[0183] 重编程因子选自由以下组成的组：OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、SV40LT、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3、L1TD1和其任何组合。一种或多种重编程因子可以采取多肽形式。重编程因子也可以采取多核苷酸形式，且从而通过载体(例如逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体和小环)引入非多能细胞中。在特定实施例中，编码至少一种重编程因子的一种或多种多核苷酸是通过慢病毒载体引入。在一些实施例中，一种或多种多核苷酸是通过游离型载体引入。在多个其它实施例中，一种或多种多核苷酸是通过仙台病毒载体引入。
[0184] 在一些实施例中，非多能细胞是利用包含不同外源多核苷酸和/或不同启动子的多种构筑体、通过用于在相同或不同所选位点进行靶向整合的多种载体转移。这些外源多核苷酸可以包含自杀基因，或编码靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物的基因，或编码蛋白质的基因，所述蛋白质促进iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活。在一些实施例中，外源多核苷酸编码RNA，包括(但不限于)siRNA、shRNA、miRNA和反义核酸。这些外源多核苷酸可以由一种或多种选自由以下组成的组的启动子驱动：组成型启动子、诱导型启动子、时间特异性启动子，以及组织或细胞类型特异性启动子。因此，当处于活化启动子的条件下(例如在诱导剂存在下或在特定的分化细胞类型中)时，多核苷酸是可表达的。在一些实施例中，多核苷酸是在iPSCs中和/或在由iPSCs分化的细胞中表达。在一个实施例中，一种或多种自杀基因是由组成型启动子驱动，例如由CAG驱动的半胱天冬酶-9。包含不同外源多核苷酸和/或不同启动子的这些构筑体可以同时或连续地转移到非多能细胞中。经历多种构筑体的靶向整合的非多能细胞可以与一种或多种重编程因子同时接触以使重编程与基因组工程同时启动，借此获得基因组经工程改造的iPSCs，其在相同细胞池中包含多种靶向整合。因而，这种稳定方法能够使重编程与工程改造策略同时进行，以得到在一个或多个所选靶点处整合有多种模式的基因组经工程改造的克隆hiPSC。
[0185] 在一些实施例中，将一个或多个插入/缺失引入非多能细胞中的所选位点，包括一个或多个内源基因。在一些实施例中，包含一个或多个插入/缺失的非多能细胞进一步包含一个或多个上述靶向整合。在一些实施例中，内源基因中所包含的插入/缺失引起基因表达中断。在一些实施例中，内源基因中所包含的插入/缺失引起所编辑基因被敲除。在一些实施例中，内源基因中所包含的插入/缺失引起所编辑基因的表达降低。在一些实施例中，基因组经工程改造的包含位于所选位点的一个或多个外源多核苷酸的iPSC可以进一步包含一个或多个位于所选位点的靶向编辑，包括插入/缺失。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个与免疫反应调控和介导相关的内源基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源检查点基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源T细胞受体基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源MHC I类抑制基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个与主要组织相容性复合体相关的内源基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源基因中，包括(但不限于)B2M、PD1、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、TCR基因。在一个实施例中，基因组经工程改造的包含一个或多个位于所选位点的外源多核苷酸的iPSC进一步包含B2M(β-2-微球蛋白)编码基因中的靶向编辑。
[0186] III.通过使基因组经工程改造的iPSC分化而获得基因工程改造的非多能细胞的方法
[0187] 本发明的另一方面提供一种通过畸胎瘤形成而使基因组经工程改造的iPSC发生活体内分化的方法，其中活体内衍生自基因组经工程改造的iPSCs的分化细胞保持完整的功能性靶向编辑，包括位于所期望位点的靶向整合和/或插入/缺失。在一些实施例中，活体内通过畸胎瘤衍生自基因组经工程改造的iPSCs的分化细胞包含在一个或多个所期望位点整合的一个或多个可诱导自杀基因，所期望位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些其它实施例中，活体内通过畸胎瘤衍生自基因组经工程改造的iPSCs的分化细胞包含编码靶向模式的多核苷酸，或编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质促进干细胞和/或祖细胞运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活。在一些实施例中，活体内通过畸胎瘤衍生自基因组经工程改造的iPSCs的包含一个或多个可诱导自杀基因的分化细胞进一步包含位于与免疫反应调控和介导相关的内源基因中的一个或多个插入/缺失。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源检查点基因。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源T细胞受体基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源MHC I类抑制基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个与主要组织相容性复合体相关的内源基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一个或多个内源基因中，包括(但不限于)B2M、PD1、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、TCR基因。在一个实施例中，基因组经工程改造的包含一个或多个位于所选位点的外源多核苷酸的iPSC进一步包含位于B2M(β-2-微球蛋白)编码基因中的靶向编辑。
[0188] 在特定实施例中，如本文所提供的基因组经工程改造的包含一个或多个位于所选位点的靶向编辑的iPSCs用于在试管内衍生造血细胞谱系或任何其它特定细胞类型，其中衍生的非多能细胞在所选位点保持功能性靶向编辑。在一个实施例中，基因组经工程改造的iPSC源细胞包括(但不限于)具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞和B细胞，其中衍生自基因组经工程改造的iPSCs的这些细胞在所期望的位点保持功能性靶向编辑。
[0189] 可应用于获得iPSC源造血细胞谱系的分化方法和组合物包括例如国际申请第PCT/US2016/044122号中所描绘的那些方法和组合物，所述申请的公开内容以引入的方式并入本文中。如所提供，用于产生造血细胞谱系的方法和组合物是通过衍生自多能干细胞的永久性生血内皮细胞(HE)(包括hiPSCs)在无血清、无饲养层和/或无基质条件下且在可扩展的单层培养平台中实现，而无需形成EB。可以根据所提供方法分化的细胞的范围为多能干细胞到向特定终末分化细胞和转分化细胞定型的祖细胞，直接向造血命运转变而不通过多能中间体的多种谱系细胞。类似地，干细胞分化所产生的细胞的范围为多潜能干细胞或祖细胞到终末分化干细胞，和所有中间造血细胞谱系。
[0190] 用于多能干细胞在单层培养中分化成和扩增造血谱系细胞的方法包含使多能干细胞与BMP路径活化剂和任选存在的bFGF接触。如所提供，获得和扩增多能干细胞源中胚层细胞而无需由多能干细胞形成类胚胎体。然后使中胚层细胞与BMP路径活化剂、bFGF和WNT路径活化剂接触，以获得具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的扩增的中胚层细胞，而无需由多能干细胞形成类胚胎体。通过随后与bFGF和任选存在的ROCK抑制剂和/或WNT路径活化剂接触，使具有永久性HE潜能的中胚层细胞分化成永久性HE细胞，所述永久性HE细胞也在分化期间扩增。
[0191] 本文所提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB介导的多能干细胞分化，原因在于：EB形成产生了适度到最低限度的细胞扩增；不允许单层培养，而单层培养对于需要所述细胞在群体中均匀扩增和均匀分化的许多应用来说具有重要作用；并且费力且效率低。
[0192] 所提供的单层分化平台促进向永久性生血内皮细胞分化，从而衍生出造血干细胞和分化后代，诸如T、B、NKT和NK细胞。单层分化策略实现了增强的分化效率与大规模扩增的组合，从而能够在不同治疗应用中递送治疗上相关数目个多能干细胞源造血细胞。另外，使用本文所提供方法进行的单层培养产生了功能造血谱系细胞，其实现了全范围的试管内分化、活体外调节，和活体内长期造血自我更新、重构和移植。如所提供，iPSC源造血谱系细胞包括(但不限于)永久性生血内皮细胞、造血多潜能祖细胞、造血干细胞和祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
[0193] 用于引导多能干细胞分化成永久性造血谱系细胞的方法，其中所述方法包含：(i)使多能干细胞与包含BMP活化剂和任选存在的bFGF的组合物接触，以启动多能干细胞分化成和扩增中胚层细胞；(ii)使所述中胚层细胞与包含BMP活化剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物接触，以启动中胚层细胞分化成和扩增具有永久性HE潜能的中胚层细胞，其中所述组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂；(iii)使具有永久性HE潜能的所述中胚层细胞与组合物接触，以启动具有永久性生血内皮细胞潜能的多能干细胞源中胚层细胞分化成和扩增永久性生血内皮细胞，所述组合物包含ROCK抑制剂、一个或多个生长因子和细胞因子和任选存在的Wnt路径活化剂，所述细胞因子选自由以下组成的组：bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6和IL11，其中所述组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
[0194] 在一些实施例中，所述方法进一步包含使多能干细胞与包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物接触，以接种和扩增多能干细胞，其中所述组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施例中，多能干细胞是iPSCs，或未处理iPSCs，或包含一个或多个遗传印记的iPSCs；且iPSC中所包含的一个或多个遗传印记保留于由其分化的造血细胞中。在用于引导多能干细胞分化成造血谱系细胞的方法的一些实施例中，多能干细胞分化成造血谱系细胞不包含产生类胚胎体，且采取单层培养形式。
[0195] 在上述方法的一些实施例中，所得的多能干细胞源永久性生血内皮细胞是CD34+。在一些实施例中，所得的永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-CXCR4-CD73-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞是CD34+CXCR4-CD73-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-CD93-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞是CD34+CD93-。
[0196] 在上述方法的一些实施例中，所述方法进一步包含(i)使多能干细胞源永久性生血内皮细胞与组合物接触以起始所述永久性生血内皮细胞分化成前T细胞祖细胞，所述组合物包含ROCK抑制剂、一种或多种生长因子和细胞因子和任选存在的BMP活化剂，所述细胞因子选自由以下组成的组：VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO和IL7；和任选地，(ii)使所述前T细胞祖细胞与组合物接触以起始所述前T细胞祖细胞分化成T细胞祖细胞或T细胞，所述组合物包含一种或多种生长因子和选自由SCF、Flt3L和IL7组成的组的细胞因子，但不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在所述方法的一些实施例中，所述多能干细胞源T细胞祖细胞是CD34+CD45+CD7+。在所述方法的一些实施例中，所述多能干细胞源T细胞祖细胞是CD45+CD7+。
[0197] 在用于引导多能干细胞分化成造血谱系细胞的上述方法的又一些实施例中，所述方法进一步包含：(i)使多能干细胞源永久性生血内皮细胞与组合物接触，以起始所述永久性生血内皮细胞分化成前NK细胞祖细胞，所述组合物包含ROCK抑制剂、一种或多种生长因子和细胞因子以及任选存在的BMP活化剂，所述细胞因子选自由以下组成的组：VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15；和任选地，(ii)使多能干细胞源前NK细胞祖细胞与包含一种或多种生长因子和细胞因子的组合物接触，以起始所述前NK祖细胞分化成NK细胞祖细胞或NK细胞，所述细胞因子选自由以下组成的组：SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15，其中所述培养基不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施例中，多能干细胞源NK祖细胞是CD3-CD45+CD56+CD7+。在一些实施例中，多能干细胞源NK细胞是CD3-CD45+CD56+，且任选地进一步通过NKp46+、CD57+和CD16+定义。
[0198] 因此，使用上述分化方法可以获得一种或多种iPSC源造血细胞群：(i)CD34+HE细胞(iCD34)，使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基；(ii)永久性生血内皮细胞(iHE)，使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基；(iii)永久性HSCs，使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基；(iv)多潜能祖细胞(iMPP)，使用iMPP-A；(v)T细胞祖细胞(ipro-T)，使用一种或多种选自iTC-A2和iTC-B2的培养基；(vi)T细胞(iTC)，使用iTC-B2；(vii)NK细胞祖细胞(ipro-NK)，使用一种或多种选自iNK-A2和iNK-B2的培养基；和/或(viii)NK细胞(iNK)，和iNK-B2。在一些实施例中，培养基：
[0199] a.iCD34-C包含ROCK抑制剂、一种或多种生长因子和选自由bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11、IGF和EPO组成的组的细胞因子，和任选存在的Wnt路径活化剂；且不含TGFβ受体/ALK抑制剂；
[0200] b.iMPP-A包含BMP活化剂、ROCK抑制剂，和一种或多种生长因子和选自由以下组成的组的细胞因子：TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、Flt3L和IL11；
[0201] c.iTC-A2包含ROCK抑制剂、一种或多种生长因子和选自由SCF、Flt3L、TPO和IL7组成的组的细胞因子；和任选存在的BMP活化剂；
[0202] d.iTC-B2包含一种或多种生长因子和选自由SCF、Flt3L和IL7组成的组的细胞因子；其中所述组合物不含VEGF、bFGF、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；
[0203] e.iNK-A2包含ROCK抑制剂和一种或多种生长因子和细胞因子以及任选存在的BMP活化剂，所述细胞因子选自由以下组成的组：SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15，且[0204] f.iNK-B2包含一种或多种生长因子和选自由SCF、Flt3L、IL7和IL15组成的组的细胞因子。
[0205] 在一些实施例中，上述方法获得的基因组经工程改造的iPSC源细胞包含在一个或多个所期望整合位点整合的一种或多种可诱导自杀基因，所述整合位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的iPSC源细胞包含的多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进干细胞和/或祖细胞运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，基因组经工程改造的包含一种或多种自杀基因的iPSC源细胞进一步包含一种或多种与免疫反应调控和介导相关的内源基因中所含的一种或多种插入/缺失，所述内源基因包括(但不限于)检查点基因、内源T细胞受体基因，和MHC I类抑制基因。在一个实施例中，基因组经工程改造的包含一种或多种自杀基因的iPSC源细胞进一步包含位于B2M基因中的插入/缺失，其中所述B2M被敲除。
[0206] 另外，可应用于获得第一命运的基因组经工程改造的造血细胞到第二命运的基因组经工程改造的造血细胞的脱分化方法和组合物包括例如国际公开第WO2011/159726号中所描绘的那些方法和组合物，其公开内容以引入的方式并入本文中。其中提供的方法和组合物允许部分地将初始非多能细胞重编程为非多能中间细胞，这是通过在重编程期间限制内源Nanog基因表达以及使所述非多能中间细胞经历用于使中间细胞分化成所期望细胞类型的条件来实现。
[0207] IV.允许在所选基因座进行靶向整合以将所关注基因并入iPSC细胞中的组合物[0208] 鉴于上述内容，本发明提供一种构筑体，其通过或不通过使整合位点处的任何内源序列缺失而使一个或多个外源多核苷酸靶向整合于诱导多能干细胞(iPSCs)基因组中的所选位点处。在一个实施例中，所述构筑体包含至少一个外源启动子，所述外源启动子可操作地连接到表达一种或多种所关注蛋白质的一种或多种外源多核苷酸。在一个实施例中，所述构筑体是通过靶向整合用的载体转移到iPSCs中。在另一个实施例中，所述构筑体是通过靶向整合用的载体转移到非多能细胞中，且然后对所述非多能细胞进行重编程以获得基因组经工程改造的iPSCs。通过任一方法，述构筑体保持整合且外源多核苷酸在重编程或载体转移说的iPSC中、在随后扩增的iPSCs中、在衍生自iPSCs的分化细胞中和在由其衍生的脱分化细胞中发挥功能。
[0209] 在一些实施例中，包含至少一个可操作地连接到一种或多种外源多核苷酸的外源启动子的构筑体进一步包含对所选位点具有特异性的同源臂，且所述同源臂在构筑体中侧接启动子和所关注的外源多核苷酸。所述构筑体的这个实施例实现了核酸酶非依赖性靶向整合策略。在一些实施例中，外源启动子是CAG。
[0210] 在一些实施例中，具有至少一个外源启动子的构筑体中所含的一种或多种外源多核苷酸彼此通过连接序列连接。在一些实施例中，连接序列编码自我裂解肽。在一些其它实施例中，连接序列提供内部核糖体入口序列(IRES)。在一些实施例中，构筑体中的一种或多种外源多核苷酸是多顺反子的。
[0211] 包含一个或多个外源启动子和可操作地连接的一种或多种外源多核苷酸的构筑体的一些实施例进一步包含至少一种编码标记物的多核苷酸。在一些实施例中，所述至少一种编码标记物的多核苷酸是由所选位点的内源启动子驱动。在一个实施例中，一种多核苷酸编码荧光蛋白质。在另一个实施例中，一种多核苷酸是嘌呤霉素抗性基因。
[0212] 在一些实施例中，包含可操作地连接的多核苷酸的构筑体进一步包含允许在安全港基因座实现靶向整合的组分，所述安全港基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些实施例中，安全港基因座选自由以下组成的组：AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR和RUNX1。
[0213] 包含可操作地连接的多核苷酸的构筑体可以包含一种或多种多核苷酸，其编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进基因组经工程改造的iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，一种或多种多核苷酸是由相同启动子驱动。在一些实施例中，一种或多种多核苷酸是由一种或多种选由以下组成的组的不同启动子驱动：组成型启动子、诱导型启动子、时间特异性启动子，以及组织或细胞类型特异性启动子。在一些实施例中，一种或多种多核苷酸整合于相同的所选安全港基因座中。在一些实施例中，一种或多种多核苷酸整合于不同的所选安全港基因座中。在一个特定实施例中，可操作地连接到外源或内源启动子的一种或多种外源多核苷酸编码一种或多种安全开关蛋白质。所述安全开关蛋白质可以选自由以下组成的组：半胱天冬酶9(或半胱天冬酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR，和B细胞CD20。在一个实施例中，构筑体中所包含的自杀基因编码半胱天冬酶-9。在一个实施例中，构筑体中所包含的自杀基因编码胸苷激酶。在一些实施例中，所述构筑体是用于在AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1和满足基因组安全港准则的其它基因座中的一者处实现靶向整合。在一些实施例中，所述构筑体是用于在AAVS1实现靶向整合。在一些实施例中，所述构筑体是用于在ROSA26实现靶向整合。在一些实施例中，所述构筑体是用于在H11实现靶向整合。
[0214] 本发明还提供一种基因组经工程改造的iPSC，其包含一种或多种外源多核苷酸和/或位于所选位点的插入/缺失。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC是通过载体将构筑体转移到iPSCs且/或使用NHEJ编辑来获得。在一些其它实施例中，基因组经工程改造的iPSC是由重编程非多能细胞利用靶向编辑(包括靶向整合和/或插入/缺失)来获得。在又一些其它实施例中，基因组经工程改造的iPSC是通过使用重编程因子、重编程小分子和/或携带用于靶向整合所关注多核苷酸的构筑体的载体对非多能细胞同时进行重编程和基因组工程改造而获得。
[0215] 在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC包含一种或多种编码蛋白质的外源多核苷酸，所述蛋白质选自安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物；或促进iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含存在于一种或多种内源基因中的插入/缺失，所述内源基因编码与以下相关的蛋白质：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节；或抑制iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，基因组经工程改造的包含一种或多种外源多核苷酸的iPSC进一步包含存在于一种或多种内源基因中的插入/缺失。在一些实施例中，内源基因中所含的插入/缺失引起基因表达中断。在一些实施例中，内源基因中所含的插入/缺失引起所编辑基因被敲除。在一些实施例中，内源基因中所含的插入/缺失引起所编辑基因的表达降低。在一些实施例中，基因组经工程改造的包含位于所选位点的一种或多种外源多核苷酸的iPSC可以进一步包含位于所选位点的一个或多个靶向编辑，包括插入/缺失。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一种或多种与免疫反应调控和介导相关的内源基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一种或多种内源检查点基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一种或多种内源T细胞受体基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一种或多种内源MHC I类抑制基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一种或多种与主要组织相容性复合体相关的内源基因中。在一些实施例中，所述插入/缺失包含于一种或多种内源基因中，包括(但不限于)B2M、PD1、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、TCR基因。在一个实施例中，基因组经工程改造的包含一种或多种位于所选位点的外源多核苷酸的iPSC进一步包含B2M(β-2-微球蛋白)编码基因中的靶向编辑。在一个实施例中，基因组经工程改造的包含B2M基因中的靶向编辑的iPSC是B2M剔除型或低含量型，且缺乏HLA-I。
[0216] 在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC包含至少一种整合于所选位点处的自杀基因。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC包含至少两种各自整合于相同或不同整合位点处的自杀基因。在一些实施例中，外源多核苷酸是由一个或多个选自由以下组成的组的启动子驱动：组成型启动子、诱导型启动子、时间特异性启动子，以及组织或细胞类型特异性启动子。在一些实施例中，基因组经工程改造的包含位于所选整合位点的一个或多个自杀基因的iPSC进一步包含存在于一种或多种所选内源基因中的插入/缺失。如本文所公开，具有多种所期望的靶向编辑模式的非多能细胞适于使用表1中的培养平台重编程，以获得基因组经工程改造iPSCs的衍生iPSCs。在一些实施例中，为了靶向整合或插入/缺失而对非多能细胞进行的基因组工程改造是与非多能细胞的重编程同时发生，且按照稳定、高效、精确且可靠的方式产生基因组经工程改造的iPSCs。
[0217] 本发明进一步提供由基因组经工程改造的iPSCs衍生的非多能细胞，其中基因组经工程改造的iPSCs是通过对iPSCs进行靶向编辑，或通过对基因组经工程改造的具有定点整合或插入/缺失的非多能细胞进行重编程而获得，所述靶向编辑与重编程连续进行(首先获得重编程的iPSC，然后进行基因组工程改造；或首先获得基因组经工程改造的非多能细胞，然后进行重编程)，或同时进行(对同一细胞池同时进行重编程和基因组工程改造)。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源非多能细胞是祖细胞或完全分化细胞。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSC源细胞是中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞或祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞或B细胞。
[0218] 本发明还提供一种用于获得基因组经工程改造的iPSCs的组合物。在一个实施例中，所述组合物包含基因组经工程改造的非多能细胞；一种或多种重编程因子；和包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂的小分子组合物，用于将基因组经工程改造的非多能细胞重编程为基因组经工程改造的包含相同靶向编辑的iPSCs。在上述组合物的一些实施例中，基因组经工程改造的用于重编程的非多能细胞包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质，其中一种或多种多核苷酸是由一种或多种选自由以下组成的组的启动子驱动：组成型启动子、诱导型启动子、时间特异性启动子，以及组织或细胞类型特异性启动子。在一些实施例中，所述一种或多种多核苷酸包含于能够在相同或不同所选位点实现靶向整合的不同构筑体中。在一些实施例中，所述一个或多个所选位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。
[0219] 在一些其它实施例中，用于获得基因组经工程改造的iPSCs的组合物包含非多能细胞、一种或多种定点核酸内切酶、一种或多种重编程因子；和TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂的组合，和任选存在的一种或多种构筑体，所述构筑体包含侧接有同源臂的可操作地连接的多核苷酸用于靶向整合，其中所述组合物适用于对非多能细胞同时进行基因组工程改造和重编程，得到基因组经工程改造的包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的iPSCs。在一些实施例中，不同构筑体和/或插入/缺失与重编程因子同时或连续地引入非多能细胞中。在一些实施例中，不同构筑体和/或插入/缺失是在重编程期间引入非多能细胞中，以便同时或并行进行基因组工程改造和重编程。
[0220] 在一些其它实施例中，用于获得基因组经工程改造的iPSCs的组合物包含非多能细胞、一种或多种重编程因子；和TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合，和一种或多种构筑体，所述构筑体包含侧接有同源臂的可操作地连接的多核苷酸用于靶向整合，其中所述组合物适用于对非多能细胞同时进行基因组工程改造和重编程，得到基因组经工程改造的包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的iPSCs。在一些实施例中，不同构筑体和/或插入/缺失与重编程因子同时或连续地引入非多能细胞中。在一些实施例中，不同构筑体和/或插入/缺失是在重编程期间引入非多能细胞中，以便同时或并行进行基因组工程改造和重编程。
[0221] 另外，本文还提供一种用于维持基因组经工程改造的iPSCs的组合物，所述iPSCs是通过对基因组经工程改造的非多能细胞进行重编程而获得。在一个实施例中，所述组合物包含基因组经工程改造的iPSCs，所述iPSCs是基因组经工程改造的非多能细胞重编程而得；和MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合。在一个实施例中，重编程获得的iPSCs在长期传代和扩增期间保持多能性和靶向编辑。
[0222] 还提供一种组合物，其包含：基因组经工程改造的iPSCs和包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的小分子组合物，其中基因组经工程改造的iPSCs如下获得：(a)将基因组经工程改造的非多能细胞重编程，其中所得iPSCs包含基因组经工程改造的非多能细胞中所含的相同靶向编辑；或(b)通过将一种或多种靶向编辑引入所选位点来对克隆iPSC或iPSCs池进行基因组工程改造；或(c)通过将所选位点的一种或多种靶向编辑引入重编程非多能细胞池来进行基因组工程改造，所述重编程非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选存在的小分子组合物接触，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，或促进非多能细胞重编程的iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，基因组经工程改造的iPSCs包含存在于一种或多种内源基因中的插入/缺失，所述内源基因编码与以下相关的蛋白质：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节；或抑制iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，基因组经工程改造的包含一种或多种外源多核苷酸的iPSC进一步包含存在于一种或多种内源基因中的插入/缺失。
[0223] V.基因工程改造的iPSCs和由其衍生的具有功能模式的免疫细胞的治疗用途[0224] 本发明提供一种组合物，其包含已使用所公开的方法和组合物衍生自所述iPSC的经基因工程改造的iPSCs和/或免疫细胞的分离群体或亚群，其中所述免疫细胞经基因工程改造且适于基于细胞的过继性疗法。在一个实施例中，经基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC源HSC细胞。在一个实施例中，经基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC源HSC细胞。在一个实施例中，经基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC源proT或T细胞。在一个实施例中，经基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC源proNK或NK细胞。在一些实施例中，经基因工程改造的iPSC源免疫细胞在活体外进一步调节以便改善治疗潜能。在一个实施例中，已衍生自iPSC的经基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含数目或比率提高的未处理T细胞、干细胞记忆T细胞和/或中枢记忆T细胞。在一个实施例中，已衍生自iPSC的经基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含数目或比率提高的I型NKT细胞。在另一个实施例中，已衍生自iPSC的经基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含数目或比率提高的适应性NK细胞。在一些实施例中，衍生自iPSC的经基因工程改造的CD34细胞、HSC细胞、T细胞或NK细胞的分离群体或亚群是同种异体的。在一些其它实施例中，衍生自iPSC的经基因工程改造的CD34细胞、HSC细胞、T细胞或NK细胞的分离群体或亚群是自生的。
[0225] 在一些实施例中，分化用的iPSC包含传递效应细胞的所期望治疗属性的遗传印记，所述遗传印记在衍生自所述iPSC的分化造血细胞中保留且发挥作用。
[0226] 在一些实施例中，多能干细胞中的遗传印记包含(i)在将非多能细胞重编程为iPSC期间或之后通过在多能细胞基因组中进行基因组插入、缺失或取代而获得的一种或多种基因修饰模式；或(ii)对供者、疾病或治疗反应具有特异性的来源特异性免疫细胞的一种或多种能保留治疗属性，且其中所述多能细胞是由来源特异性免疫细胞重编程，其中所述iPSC保留来源治疗属性，iPSC源造血谱系细胞中也包含所述来源治疗属性。
[0227] 在一些实施例中，基因修饰模式包含以下中的一种或多种：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物；或促进iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节和/或存活的蛋白质。在一些其它实施例中，基因修饰模式包含以下中的一种或多种：(i)B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5或RFXAP以及染色体6p21区域中的任何基因的缺失或表达减少；(ii)HLA-E、HLA-G、HACD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体或用于与双特异性或多特异性接合体或通用接合体偶联的表面触发受体的表达引入或增加。
[0228] 在再一些其它实施例中，造血谱系细胞包含与以下中的一种或多种有关的来源特异性免疫细胞的治疗属性：(i)靶向抗原的受体表达；(ii)HLA呈递或其缺乏；(iii)对肿瘤微环境的抗性；(iv)诱导旁观者免疫细胞和免疫调节；(iv)靶向特异性改善，同时肿瘤外效应减小；(v)对例如化学疗法等疗法的抗性；和(vi)改善的归巢、存留和细胞毒性。
[0229] 在一些实施例中，iPSC和其衍生造血细胞包含以下中的一种或多种：B2M剔除型或低含量型、HLA-E/G、PDL1、A2AR、CD47、LAG3剔除型或低含量型、TIM3剔除型或低含量型、TAP1剔除型或低含量型、TAP2剔除型或低含量型、TAP相关糖蛋白剔除型或低含量型、NLRC5剔除型或低含量型、PD1剔除型或低含量型、RFKANK剔除型或低含量型、CIITA剔除型或低含量型、RFX5剔除型或低含量型，和RFXAP剔除型或低含量型。经HLA I类和/或II类修饰的这些细胞对免疫检测的抗性增强，且因此呈现改善的活体内存留。此外，此类细胞能避免过继性细胞疗法中的HLA匹配的需要且从而提供通用、现成的治疗方案来源。
[0230] 在一些实施例中，iPSC和其衍生造血细胞包含hnCD16(不可裂解的高亲和力CD16)、HLA-E、HLA-G、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR或TCR中的一种或多种。此类细胞具有改善的免疫效应能力。
[0231] 在一些实施例中，iPSC和其衍生的造血细胞对抗原具有特异性。
[0232] 多种疾病可以通过将本发明的免疫细胞引入适于过继性细胞疗法的受检者而得到改善。疾病实例包括多种自体免疫病症，包括(但不限于)斑秃、自体免疫溶血性贫血、自体免疫肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、青少年特发性关节炎的一些形式、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves'disease)、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barrésyndrome)、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、心肌炎的一些形式、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/全身性硬化症、休格连氏综合症、全身红斑狼疮、甲状腺炎的一些形式、葡萄膜炎的一些形式、白斑病、肉芽肿性多血管炎(韦格纳氏病(Wegener's))；血液恶性疾病，包括(但不限于)急性和慢性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓发育不良综合症；实体肿瘤，包括(但不限于)脑、前列腺、乳房、肺、结肠、子宫、皮肤、肝脏、骨骼、胰脏、卵巢、睾丸、膀胱、肾脏、头、颈、胃、子宫颈、直肠、喉或食道的肿瘤；和感染，包括(但不限于)HIV-(人类免疫缺陷病毒)、RSV-(呼吸道合胞体病毒)、EBV-(埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus))、CMV-(细胞巨大病毒)、腺病毒相关病症和BK多瘤病毒相关病症。
[0233] 本发明的特定实施例是关于通过向有需要的受检者投与包含本文所述的任何细胞的组合物来治疗所述受检者的方法。在特定实施例中，术语“治疗”等在本文中通常用于指获得所期望的药理学和/或生理学作用。对于疾病和/或可归因于所述疾病的不良影响，所述作用就完全或部分防止疾病来说，可以是预防的，且/或就部分或完全治愈来说，可以是治疗的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物疾病的任何治疗，且包括：防止可能易患所述疾病、但尚未被诊断患有其的受检者发生所述疾病；抑制所述疾病，即，阻滞其发展；或缓解所述疾病，即，引起所述疾病消退。治疗剂或组合物可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后投与。对正进行的疾病的治疗尤其受到关注，其中治疗使患者的不良临床症状稳定或减少。
[0234] 在特定实施例中，受检者患有能够通过细胞疗法治疗、减轻和/或改善的疾病、病状和/或损伤。一些实施例预期需要细胞疗法的受检者是患有损伤、疾病或病状的受检者，其中细胞疗法(例如将细胞材料投与所述受检者的疗法)能够治疗、减轻、改善和/或降低与所述损伤、疾病或病状相关的至少一种症状的严重度。某些实施例预期需要细胞疗法的受检者包括(但不限于)骨髓或干细胞移植候选者、已接受化学疗法或照射疗法的受检者、患有或处于产生过度增生性病症或癌症(例如过度增生性病症或造血系统癌症)的风险下的受检者、患有肿瘤或处于产生肿瘤(例如实体肿瘤)的风险下的受检者、出现病毒感染或与病毒感染相关的疾病或处于病毒感染或与病毒感染相关的疾病的风险下的受检者。
[0235] 相应地，本发明进一步提供医药组合物，其包含通过本文所公开的方法和组合物制备的多能细胞源造血谱系细胞，其中所述医药组合物进一步包含医药学上可接受的介质。在一个实施例中，医药组合物包含通过本文所公开的方法和组合物制备的多能细胞源T细胞。在一个实施例中，医药组合物包含通过本文所公开的方法和组合物制备的多能细胞源NK细胞。在一个实施例中，医药组合物包含通过本文所公开的方法和组合物制备的多能细胞源CD34+HE细胞。在一个实施例中，医药组合物包含通过本文所公开的方法和组合物制备的多能细胞源HSCs。
[0236] 另外，提供上述医药组合物的治疗用途，其通过将所述组合物引入适于过继性细胞疗法的受检者来实现，其中所述受检者患有自体免疫病症；血液恶性疾病；实体肿瘤；或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关的感染。
[0237] 分离的多能干细胞源造血谱系细胞可以具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或HSCs。在一些实施例中，分离的多能干细胞源造血谱系细胞具有约95％至约100％T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或HSCs。在一些实施例中，本发明向需要细胞疗法的受检者提供具有经提纯的T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞、proT细胞、proNK细胞或HSCs的医药组合物，例如具有约95％T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或HSCs的分离群体的组合物。
[0238] 在一些实施例中，所述医药组合物包括多能干细胞源造血谱系细胞的分离群体，其中群体具有低于约0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％或30％iPSC源T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或HSCs。在一些实施例中，衍生造血谱系细胞的分离群体可以具有超过约0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％或30％T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或HSCs。在其它实施例中，衍生造血谱系细胞的分离群体可以具有约0.1％至约1％、约1％至约3％、约3％至约5％、约10％至约15％、约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％、约35％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约60％至70％、约70％至80％、约80％至90％、约
90％至95％或约95％至约100％T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或HSCs。
90％至95％或约95％至约100％T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或HSCs。
[0239] 在特定实施例中，衍生的造血谱系细胞可以具有约0.1％、约1％、约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约
80％、约90％、约95％、约98％、约99％或约100％T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或HSCs。
80％、约90％、约95％、约98％、约99％或约100％T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或HSCs。
[0240] 如所属领域的技术人员将理解，自体与同种异体免疫细胞均可以用于细胞疗法。自体细胞疗法能够减少感染、降低GvHD概率和加快免疫重构。同种异体细胞疗法能够具有免疫介导的移植物抗恶性疾病(GVM)作用，和较低的复发率。基于需要细胞疗法的患者或受检者的特定条件，所属领域的技术人员能够确定投与哪一种特定类型的疗法。
[0241] 在特定实施例中，本发明医药组合物中的衍生造血谱系细胞相对于受检者来说是同种异体的。在特定实施例中，本发明医药调配物中的衍生造血谱系细胞相对于受检者来说是自体的。对于自体移植来说，衍生造血谱系细胞的分离群体相对于患者是完全或部分HLA匹配的。在另一个实施例中，衍生的造血谱系细胞相对于受检者并非HLA匹配的。
[0242] 在一些实施例中，医药组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是至少0.1×105个细胞、至少0.5×105个细胞、至少1×105个细胞、至少5×105个细胞、至少10×105个细胞、至少0.5×106个细胞、至少0.75×106个细胞、至少1×106个细胞、至少1.25×106个细胞、至少
6 6 6 6
1.5×10个细胞、至少1.75×10个细胞、至少2×10个细胞、至少2.5×10个细胞、至少3×
106个细胞、至少4×106个细胞、至少5×106个细胞、至少10×106个细胞、至少15×106个细胞、至少20×106个细胞、至少25×106个细胞或至少30×106个细胞。
6 6 6 6
1.5×10个细胞、至少1.75×10个细胞、至少2×10个细胞、至少2.5×10个细胞、至少3×
106个细胞、至少4×106个细胞、至少5×106个细胞、至少10×106个细胞、至少15×106个细胞、至少20×106个细胞、至少25×106个细胞或至少30×106个细胞。
[0243] 在一些实施例中，医药组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是约0.1×105个细胞到约10×105个细胞；约0.5×106个细胞到约5×106个细胞；约1×106个细胞到约3×106个细胞；约1.5×106个细胞到约2.5×106个细胞；或约2×106个细胞到约2.5×106个细胞。
[0244] 在一些实施例中，医药组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是约1×106个细胞到约3×106个细胞；约1.0×106个细胞到约5×106个细胞；约1.0×106个细胞到约10×106个细胞；约10×106个细胞到约20×106个细胞；约10×106个细胞到约30×106个细胞；或约20×106个细胞到约30×106个细胞。
[0245] 在一些其它实施例中，医药组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是约1×个细胞到约30×106个细胞；约1.0×106个细胞到约20×106个细胞；约1.0×106个细胞到约10×106个细胞；约2.0×106个细胞到约30×106个细胞；约2.0×106个细胞到约20×106个细胞；或约2.0×106个细胞到约10×106个细胞。
[0246] 在又其它实施例中，医药组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是约1×106个细胞、约2×106个细胞、约5×106个细胞、约7×106个细胞、约10×106个细胞、约15×106个细胞、约17×106个细胞、约20×106个细胞、约25×106个细胞或约30×106个细胞。
[0247] 在一个实施例中，医药组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是部分或单一脐带血5 5
中的免疫细胞数目，或是至少0.1×10个细胞/kg体重、至少0.5×10个细胞/kg体重、至少1×105个细胞/kg体重、至少5×105个细胞/kg体重、至少10×105个细胞/kg体重、至少0.5×
106个细胞/kg体重、至少0.75×106个细胞/kg体重、至少1×106个细胞/kg体重、至少1.25×
106个细胞/kg体重、至少1.5×106个细胞/kg体重、至少1.75×106个细胞/kg体重、至少2×
106个细胞/kg体重、至少2.5×106个细胞/kg体重、至少3×106个细胞/kg体重、至少4×106个细胞/kg体重、至少5×106个细胞/kg体重、至少10×106个细胞/kg体重、至少15×106个细胞/kg体重、至少20×106个细胞/kg体重、至少25×106个细胞/kg体重或至少30×106个细胞/kg体重。
中的免疫细胞数目，或是至少0.1×10个细胞/kg体重、至少0.5×10个细胞/kg体重、至少1×105个细胞/kg体重、至少5×105个细胞/kg体重、至少10×105个细胞/kg体重、至少0.5×
106个细胞/kg体重、至少0.75×106个细胞/kg体重、至少1×106个细胞/kg体重、至少1.25×
106个细胞/kg体重、至少1.5×106个细胞/kg体重、至少1.75×106个细胞/kg体重、至少2×
106个细胞/kg体重、至少2.5×106个细胞/kg体重、至少3×106个细胞/kg体重、至少4×106个细胞/kg体重、至少5×106个细胞/kg体重、至少10×106个细胞/kg体重、至少15×106个细胞/kg体重、至少20×106个细胞/kg体重、至少25×106个细胞/kg体重或至少30×106个细胞/kg体重。
[0248] 本发明提供的基因工程改造的衍生造血谱系细胞可以投与受检者而无需在投与之前进行活体外或试管内扩增。在特定实施例中，基因工程改造的衍生造血谱系细胞的分离群体是使用一种或多种试剂进行活体外调节和处理，以获得治疗潜能改善的免疫细胞。可以将基因工程改造的衍生造血谱系细胞的调节群体洗涤以去除处理剂，且将改进的群体投与患者而无需在试管内进一步扩增所述群体。
[0249] 在其它实施例中，本发明提供在用一种或多种试剂调节之前扩增的基因工程改造的衍生造血谱系细胞的分离群体。可以使用本文所提供的方法和组合物以重组方式产生衍生造血谱系细胞的分离群体以表达TCR、CAR或其它蛋白质。
[0250] 对于经基因工程改造的表达重组TCR或CAR的衍生造血谱系细胞来说，不论对细胞进行基因修饰之前或之后，都能够使用如以下文献中所述的方法对所述细胞进行活化和扩增：例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,
874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开第20060121005号。
874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开第20060121005号。
[0251] 在某些实施例中，可以利用不同方案提供基因工程改造的衍生造血谱系细胞的主要刺激信号和共刺激信号。举例来说，提供每种信号的试剂可以存在于溶液中或与表面偶联。与表面偶联时，所述试剂可以与相同表面(即，“顺式”形式)或个别表面(即，“反式”形式)偶联。或者，一种试剂可以与表面偶联且另一种试剂存在于溶液中。在一个实施例中，提供共刺激信号的试剂可以结合到细胞表面且提供主要活化信号的试剂存在于溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种试剂均可以存在于溶液中。在另一个实施例中，所述试剂可以采取可溶形式，且然后与表面交联，例如表达Fc受体的细胞或将结合到所述试剂的抗体或其它结合剂，例如美国专利申请公开第20040101519号和第20060034810号中关于人工抗原呈递细胞(aAPCs)所公开的内容，预期所述人工抗原呈递细胞在本发明中用于活化和扩增T淋巴细胞。
[0252] 包含本发明的衍生造血谱系细胞群的组合物可以是无菌的，且可以适于投与和备好投与(即，可以在不进行任何进一步处理的情况下投与)人类患者。在一些实施例中，所述治疗组合物备好输注至患者。备好投与的基于细胞的组合物意指所述组合物在移植或投与受检者之前不需要任何进一步处理或操作。
[0253] 适合投与患者的治疗上可接受的无菌组合物可以包括一种或多种医药学上可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂(例如医药学上可接受的介质，例如细胞培养基)，或医药学上可接受的其它组分。医药学上可接受的载剂和/或稀释剂部分地由所投与的特定组合物以及用于投与治疗组合物的特定方法决定。因此，本发明的治疗组合物存在多种适合的配方(参见例如《雷明顿氏医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》第17版，1985，其公开内容以全文引用的方式并入本文)。
[0254] 在特定实施例中，具有基因工程改造的衍生造血谱系细胞的分离群体的治疗细胞组合物还具有医药学上可接受的细胞培养基。包含如本文所公开的基因工程改造的衍生造血谱系细胞群的治疗组合物可以分别通过肠内或肠胃外投药方法或与实现所期望治疗目标的其它适合化合物组合投与。
[0255] 医药学上可接受的载剂和/或稀释剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使其适合投与所治疗的人类受检者。另外应该维持或增强治疗组合物的稳定性。
[0256] 此类载剂溶液也可以含有缓冲液、稀释剂和其它适合添加剂。缓冲液是指其化学组成使酸或碱中和而使PH不发生显著变化的溶液或液体。本发明设想的缓冲液实例包括(但不限于)杜尔贝科氏磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、林格氏溶液(Ringer's solution)、5％右旋糖水溶液(D5W)、标准/生理盐水(0.9％NaCl)。
[0257] 医药学上可接受的这些载剂和/或稀释剂可以按照足以使治疗组合物的PH维持在约3与约10之间的量存在。因而，缓冲剂可以占总组合物的高达约5％(重量/重量)。治疗组合物中还可以包括电解质，例如(但不限于)氯化钠和氯化钾。在一个方面中，治疗组合物的PH在约4到约10范围内。或者，治疗组合物的PH在约5到约9范围内、在约6到约9范围内或在约6.5到约8范围内。在另一个实施例中，治疗组合物包括PH在所述PH范围之一中的缓冲液。在另一个实施例中，治疗组合物具有约7的PH。或者，治疗组合物具有约6.8到约7.4范围内的PH。在再另一个实施例中，治疗组合物具有约7.4的PH。
[0258] 本发明的无菌组合物可以是存在于医药学上可接受的无毒介质中的无菌溶液或悬浮液。悬浮可以是指非粘附条件，其中细胞不附着到固体载体。举例来说，可以搅拌悬浮液中维持的细胞且使其不粘附到载体，例如培养皿。
[0259] 悬浮液是分散液(混合物)，其中精细分裂的物质与另一种物质合并，其中形成体经如此精细分裂且混合以致其不能快速沉降。可以使用媒剂(例如液体介质，包括溶液)制备悬浮液。在一些实施例中，本发明的治疗组合物是悬浮液，其中干细胞和/或祖细胞分散于可接受的液体介质或溶液内，例如生理盐水或无血清培养基，且不附着到固体载体。在日常生活中，最常见的悬浮液是固体于液态水中的那些悬浮液。可以使用的可接受稀释剂(例如媒剂和溶剂)是水、林格氏溶液、等张氯化钠(生理盐水)溶液和无血清细胞培养基。在一些实施例中，使用高张溶液制备悬浮液。另外，传统上使用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。在肠胃外施药中，特别适合的媒剂由溶液(优选油或水溶液)以及悬浮液、乳液或植入物组成。水性悬浮液可以含有提高悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或聚葡萄糖。在一些实施例中，输注溶液相对于受检者组织来说具有等张性。在一些实施例中，输注溶液相对于受检者组织来说具有高张性。
[0260] 医药学上可接受的载剂、稀释剂和构成本发明的即投型医药组合物的其它组分衍生自允许治疗组合物在临床疗法中使用的美国医药级试剂。典型地，这些成品试剂，包括任何介质、溶液或医药学上可接受的其它载剂和/或稀释剂，按照所属领域中的传统方式灭菌，例如过滤灭菌，且在使用前，针对多种非期望的污染物(例如霉浆菌、内毒素或病毒污染)加以测试。在一个实施例中，医药学上可接受的载剂实质上不含人类或动物来源的天然蛋白质，且适合于储存医药组合物中的细胞群，包括造血干细胞和祖细胞。所述医药组合物旨在投与人类患者，且因此基本上不含细胞培养组分，例如牛血清白蛋白、马血清和胎牛血清。
[0261] 本发明还部分地提供医药学上可接受的细胞培养基在本发明的特定组合物和/或培养物中的用途。此类组合物适合投与人类受检者。一般来说，支持本发明的衍生造血谱系细胞维持、生长和/或健康的任何培养基适用作医药学细胞培养基。在特定实施例中，医药学上可接受的细胞培养基是无血清且/或无饲养层的培养基。
[0262] 所述医药组合物可以具有适于储存经调节且经分离的衍生造血谱系细胞群的无血清培养基。在各种实施例中，无血清培养基是非动物的，且可以任选地是不含蛋白质。任选地，所述培养基可以含有生物医药学上可接受的重组蛋白。非动物培养基是指其中所述组分来源于非动物来源的培养基。重组蛋白置换非动物培养基中的原生动物蛋白且营养获自合成、植物或微生物来源。相比之下，无蛋白质培养基定义为基本上不含蛋白质。
[0263] 所属领域的技术人员将了解，上述培养基实例具有说明性且决不限制适用于本发明的培养基配方，存在许多已知的且可供所属领域的技术人员使用的适合培养基。
[0264] 所述医药组合物基本上不含霉浆菌、内毒素和微生物污染。在特定实施例中，治疗组合物含有低于约10、5、4、3、2、1、0.1或0.05μg/ml的牛血清白蛋白。
[0265] 关于霉浆菌和微生物污染，如本文所用，“基本上不含”意指所属领域的技术人员已知的公认测试读数为阴性。举例来说，使用适当的阳性和阴性对照，通过将治疗组合物样品在肉汤培养基中传代培养且在第1天、第3天、第7天和第14天分配于37℃琼脂板上来确定霉浆菌污染。在100倍显微镜下，比较样品外形与阳性和阴性对照组的外形。另外，将指示细胞培养物的接种体培育3天和5天且通过落射荧光显微镜、在600倍下、使用DNA结合的荧光染料检查霉浆菌的存在。如果琼脂和/或肉汤培养基程序和指示细胞培养程序表明不存在霉浆菌污染证据，那么所述样品被认为是令人满意的。
[0266] 有机溶剂或适合的有机溶剂一般是指含碳液体或气体，其溶解固体、液体或气态溶质，从而产生溶液。适合的有机溶剂是适于活体外投与哺乳动物细胞或与哺乳动物细胞一起培育的有机溶剂，且还能够适于活体内投与受检者，例如在活体外(例如细胞培养)或活体内条件下、在所选浓度下、在培育或投与期间具有最小的毒性或其它抑制作用。适合有机溶剂对于本文所述试剂的储存稳定性和操作来说也应该是适当的。
[0267] 适合有机溶剂的实例包括(但不限于)二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲氧基乙烷(DME)和二甲基乙酰胺，包括其混合物或组合。在某些实施例中，组合物或有机溶剂基本上不含乙酸甲酯，此意味着组合物或溶剂中存在仅痕量的乙酸甲酯，优选检测不到的量(例如如高压液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等所测量)。
[0268] 不含内毒素的容器或组合物意指所述容器或组合物含有至多痕量(即，对受检者无不良生理学作用的量)的内毒素或检测不到的量的内毒素。细胞“基本上不含内毒素”意指每剂量细胞中存在较少的内毒素，其已被FDA允许用于生物，总内毒素为每天每公斤体重5EU，对于平均70kg的人来说，是每总细胞剂量350EU。
[0269] 在一个实施例中，不含内毒素的容器和/或组合物不含至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％内毒素。内毒素是与某些细菌(典型地，革兰氏阴性细菌(gram-negative bacteria))相关的毒素，但内毒素可以发现于革兰氏阳性细菌中，例如单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)。最流行的内毒素是发现于多种革兰氏阴性细菌外膜中的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)，其代表这些细菌致病能力的重要病原性特点。少量内毒素在人体中会产生发热、降低血压，以及活化炎症和凝血，以及其它不良生理学作用。因此，通常希望从药品容器中去除大部分或所有痕量内毒素，因为甚至少量也会对人体产生不良作用。可以使用所属领域中已知的方法从容器中去除内毒素，例如，可以将容器在HEPA过滤式洗涤设备中用不含内毒素的水清洁，在250℃去除热原质，且在位于100/10类无尘室(例如100类无尘室在一立方英尺的空气中含有不超过100个大于半微米的颗粒)内部的HEPA过滤式工作站中清洁包装。
[0270] 实例
[0271] 以下实例是为了说明，而非为了限制而提供。
[0272] 实例1-材料和方法
[0273] 为了在与不同安全港基因座整合策略组合的不同启动子的控制下有效选择和测试自杀系统，使用本申请人的一种专有hiPSC平台，其能够完成单一细胞传代和高通量的基于96孔板的流式细胞术分选，以便衍生具有单一或多种基因调节的克隆hiPSCs。
[0274] hiPSC在小分子培养物中的维持：hiPSCs按常规方式，在培养物汇合度达到75％-90％后，即作为单一细胞传代。单一细胞解离时，hiPSCs用PBS(Mediatech)洗涤一次且在37℃用阿库酶(Accutase)(Millipore)处理3-5分钟，随后移液以确保单一细胞解离。然后将单一细胞悬浮液与传统培养基等体积混合，在225×g下离心4分钟，再悬浮于FMM中且接种于经基质胶涂布的表面上。传代数典型地为1:6-1:8，转移预先涂有基质胶的组织培养板在
37℃维持2-4小时且每2-3天用FMM饲养。细胞培养物在设定为37℃和5％CO2的增湿培育箱中维持。
37℃维持2-4小时且每2-3天用FMM饲养。细胞培养物在设定为37℃和5％CO2的增湿培育箱中维持。
[0275] 使用ZFN、CRISPR进行人类iPSC基因组编辑以便将iCasp9靶向插入基因组安全港：对于ZFN介导的基因组编辑，用2.5ug ZFN-L(FTV893；SEQ ID NO:2和4)、2.5ug ZFN-R(FTV894；SEQ ID NO:3和5)和5ug AAVS1iCasp9供体构筑体(FTV895、FTV930、FTV921、FTV931、FTV932、FTV952或FTV953；诱导半胱天冬酶9SEQ ID NO:7和8)质体DNA的混合物转染2百万个iPSCs。对于CRISPR介导的基因组编辑，用5ug ROSA26-gRNA/Cas9(FTV922；SEQ ID NO:6)和5ug ROSA26iCasp9供体构筑体(FTV955或FTV956)的混合物转染2百万个iPSCs。
使用Neon转染系统(生命技术公司(Life Technologies))、使用参数1500V、10ms、3个脉冲进行转染。转染后第2天或第3天，如果所述质体含有人工启动子驱动GFP和/或RFP表达盒，则利用流式细胞术测量转染效率。转染后第4天，将嘌呤霉素按照开始7天0.1ug/ml和随后7天0.2ug/ml的浓度添加到培养基中以选择靶细胞。在嘌呤霉素选择期间，在第10天，使细胞在新鲜基质胶涂布的孔上传代。在嘌呤霉素选择的第16天或更晚，通过流式细胞术分析存活细胞中的GFP+iPS细胞百分比。
使用Neon转染系统(生命技术公司(Life Technologies))、使用参数1500V、10ms、3个脉冲进行转染。转染后第2天或第3天，如果所述质体含有人工启动子驱动GFP和/或RFP表达盒，则利用流式细胞术测量转染效率。转染后第4天，将嘌呤霉素按照开始7天0.1ug/ml和随后7天0.2ug/ml的浓度添加到培养基中以选择靶细胞。在嘌呤霉素选择期间，在第10天，使细胞在新鲜基质胶涂布的孔上传代。在嘌呤霉素选择的第16天或更晚，通过流式细胞术分析存活细胞中的GFP+iPS细胞百分比。
[0276] 基因组编辑的iPSCs的批量分选和克隆分选：嘌呤霉素选择20天之后，从ZFN介导AAVS1EF1α或CAG启动子驱动的iCasp9-2A-GFP所靶向的iPSCs中批量分选和克隆分选出GFP+SSEA4+TRA181+iPSCs。将单一细胞解离的靶向iPSC池再悬浮于冷却的染色缓冲液中，所述缓冲液含有汉克氏平衡盐溶液(Hanks'Balanced Salt Solution)(MediaTech)、4％胎牛血清(Invitrogen)、1×青霉素/链霉素(Mediatech)和10mM Hepes(Mediatech)；新鲜制备以达到最优性能。向细胞溶液中添加所结合的一级抗体，包括SSEA4-PE、TRA181-Alexa Fluor-647(BD Biosciences)，且在冰上培育15分钟。所有抗体都按照每百万细胞7μL/100μL染色缓冲液使用。所述溶液永染色缓冲液洗涤一次，在225g下离心4分钟且再悬浮于含有10μM噻唑维的染色缓冲液中且在冰上维持以供流式细胞术分选。对FACS Aria II(BD Biosciences)进行流式细胞术分选。批量分选时，将GFP+SSEA4+TRA181+细胞闸选和分选到装填有7ml FMM的15ml标准管中。克隆分选时，使用100μM喷嘴，按照每孔3个事件的浓度，将分选出的细胞直接喷射到96孔板中。每个孔预装填有200μL FMM，所述FMM补充有5μg/mL纤维结合蛋白和1×青霉素/链霉素(Mediatech)且预先经5x基质胶涂布整夜。5x基质胶预涂布包括将一个基质胶等分试样添加到5mL DMEM/F12中，然后在4℃培育整夜以允许适当再悬浮且最终按照每孔50μL添加到96孔板中，随后在37℃培育整夜。即将添加培养基到每个孔之前，抽出5x基质胶。完成分选后，在培育之前，96孔板在225g下离心1到2分钟。培养板保持不受干扰七天。第七天，从每个孔中去除150μL培养基且用100μL FMM置换。分选后第10天，孔中再馈入另外100μL FMM。早在第2天就检测出群落形成且大部分群落在分选后第7天到第10天之间扩增。在第一次传代中，各孔用PBS洗涤且在37℃用30μL阿库酶解离约10分钟。需要延长阿库酶处理反映了长期培养中已闲置的群落的紧密性。发现细胞解离之后，将
200μL FMM添加到每个孔中且吸移若干次以使群落破碎。将解离的群落转移到预先涂有5x基质胶的96孔板的另一孔中，且然后在225g下离心2分钟后再培育。扩增之前，进行这种1:1传代以扩展早期群落。后续传代按常规方式用阿库酶处理3-5分钟且在FMM中、在预先涂有
1x基质胶的较大孔中达到75-90％汇合后按1:4-1:8扩增。分析每种克隆细胞系的GFP荧光水平和TRA1-81表达水平。选择近似100％GFP+和TRA1-81+的克隆系用于进一步PCR筛检和分析。在Guava EasyCyte 8HT(Millipore)上进行流式细胞术分析且使用Flowjo(FlowJo,LLC)分析。
200μL FMM添加到每个孔中且吸移若干次以使群落破碎。将解离的群落转移到预先涂有5x基质胶的96孔板的另一孔中，且然后在225g下离心2分钟后再培育。扩增之前，进行这种1:1传代以扩展早期群落。后续传代按常规方式用阿库酶处理3-5分钟且在FMM中、在预先涂有
1x基质胶的较大孔中达到75-90％汇合后按1:4-1:8扩增。分析每种克隆细胞系的GFP荧光水平和TRA1-81表达水平。选择近似100％GFP+和TRA1-81+的克隆系用于进一步PCR筛检和分析。在Guava EasyCyte 8HT(Millipore)上进行流式细胞术分析且使用Flowjo(FlowJo,LLC)分析。
[0277] 试管内可诱导iCasp9整合的iPSCs被杀死：二聚合的化学诱导剂(CID；AP1903)购自Medchemexpress(Monmouth Junction,NJ)。CID暴露之后二十四个小时，收集细胞且根据制造商说明书(BD Biosciences)用7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色。通过流式细胞术(Guava,EMD Millipore,Billerica,MA)以死亡细胞量化7-AAD阳性细胞的百分比且使用flowjo软件分析。
[0278] 为了测试AP1903是否诱导iCasp9靶向的iPSC克隆系发生彻底的细胞死亡，我们将含有每种靶向iPSC克隆系的3个孔用AP1903处理48小时且然后用PBS洗涤孔两次，随后添加新鲜iPSC培养基。每2天用更新培养基使孔恢复，历时共5天。然后将各孔用碱性磷酸酶染色试剂(Sigma)染色。
[0279] iCasp9靶向克隆系的试管内三谱系定向分化和可诱导杀死：为了进行单层三谱系定向分化，分化开始前一天，将hiPSCs于FMM中接种于基质胶涂布孔中(例如内胚层为200K个细胞/孔，外胚层为50K个细胞/孔，中胚层为10K和50K个细胞/孔)。每种谱系分化配置四个重复孔。为了进行内胚层分化，将FMM培养基置换成内胚层诱导培养基：RPMI-1640、抗坏血酸(50μg/ml)、单硫甘油(450μM)、1X谷氨酸盐、Knockout血清替代物(0.20％)、活化素A(100ng/ml)、CHIR99021(Biovision)(3μM)、1X青霉素/链霉素。2天之后，置换成培养基：RPMI-1640、抗坏血酸(50μg/ml)、单硫甘油(450μM)、1X谷氨酸盐、Knockout血清替代物(0.50％)、bFGF(5ng/ml)、活化素A(100ng/ml)、1X青霉素/链霉素。第3天，使一个孔固定且针对Sox17染色(R&D Systems)。第3天，一个孔用结晶紫(crystal violet)染色。其它两个孔用AP1903处理48小时，然后用新鲜分化培养基洗涤和补充且继续培养5天，随后用结晶紫染色。为了进行中胚层分化，将培养基置换成补充有ITS、10ng/ml bFGF、20μM毛喉素(Forskolin)和3μM CHIR99021的DMEM/F12(Mediatech)。隔日更换培养基且第4天，使一个孔固定且针对αSMA染色(Sigma)。第4天，一个孔用结晶紫染色。其它两个孔用AP1903处理48小时，然后用新鲜分化培养基洗涤和补充且继续培养5天，随后用结晶紫染色。为了进行外胚层分化，将FMM培养基置换成神经诱导培养基：补充有1x B27培养基添加剂(生命技术公司)、1x N2培养基添加剂(生命技术公司)、10μM SB431542和100nM LDN-193189的DMEM/F12(Mediatech)。隔日更换培养基且第7天，使一个孔固定且针对巢蛋白染色(Abcam)。第7天，一个孔用结晶紫染色。其它两个孔用AP1903处理48小时，然后用新鲜分化培养基洗涤和补充且继续培养5天，随后用结晶紫染色。
[0280] 结晶紫染色：通过将0.5g结晶紫染料(Sigma)溶解于100mL去离子水中来制备0.5％结晶紫溶液。过滤且在室温下储存。染色时，用PBS洗涤细胞2次。在室温下用含有4％多聚甲醛的PBS置换15分钟。用PBS冲洗两次。在室温下用0.1％结晶紫(在10％乙醇中制备)染色15分钟。倒出CV。用洗涤瓶的去离子水轻轻地洗涤细胞直至水不再变深。抽出去离子水且使染色的细胞干燥，随后拍照。
[0281] 活体内可诱导杀死来源于iCasp9整合的iPSCs的畸胎瘤：所有小鼠圈养于申请人的设施中。申请人机构动物护理及使用委员会(applicant's Institutional Animal Care and Use Committee)批准涉及小鼠的所有实验方案。此研究中所用的所有小鼠是7-10周龄剔除雌性NSG小鼠(NOD/SCID/γ ，杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。)在畸胎瘤分析中，将由含有1-2x106个iPSCs的50％FMM培养基和50％基质胶组成的200μl皮下引入背侧区域中。
每只小鼠在双侧接受两次细胞注射，其中将iCasp9整合的iPSCs注射于左侧且将未修饰的亲代iPSC系注射于右侧。为了在指定时间点起始活体内杀死，每天通过腹膜内(i.p.)注射向小鼠投与AP1903(125μg/小鼠)，历时5或7天。监测小鼠的畸胎瘤形成且在第3周或根据指示来起始体积测量。在指定时间点收集畸胎瘤且进行处理以便进行组织学或分子分析。在DMSO中制备AP1903储备液(25μg/ml)。对于单次腹膜內注射来说，将5μl储备溶液添加到200μl PBS中，随后在水浴中声波处理10分钟。在组织学分析中，收集畸胎瘤置于PBS中，在室温下、在4％多聚甲醛中固定整夜且之后在室温下、在70％乙醇中维持以供处理。将样品递交给UCSD组织学核心机构(UCSD Histology Core Facility)以便进行切片以及苏木精和曙红染色。检查切片，解释且使用装备有尼康DS-Fi1相机的尼康Eclipse TS100显微镜进行拍照。
每只小鼠在双侧接受两次细胞注射，其中将iCasp9整合的iPSCs注射于左侧且将未修饰的亲代iPSC系注射于右侧。为了在指定时间点起始活体内杀死，每天通过腹膜内(i.p.)注射向小鼠投与AP1903(125μg/小鼠)，历时5或7天。监测小鼠的畸胎瘤形成且在第3周或根据指示来起始体积测量。在指定时间点收集畸胎瘤且进行处理以便进行组织学或分子分析。在DMSO中制备AP1903储备液(25μg/ml)。对于单次腹膜內注射来说，将5μl储备溶液添加到200μl PBS中，随后在水浴中声波处理10分钟。在组织学分析中，收集畸胎瘤置于PBS中，在室温下、在4％多聚甲醛中固定整夜且之后在室温下、在70％乙醇中维持以供处理。将样品递交给UCSD组织学核心机构(UCSD Histology Core Facility)以便进行切片以及苏木精和曙红染色。检查切片，解释且使用装备有尼康DS-Fi1相机的尼康Eclipse TS100显微镜进行拍照。
[0282] 对所移植的表达荧光素酶的iPSCs的可诱导杀死进行的活体内可视化：为了使AP1903诱导的活体内杀死可视化，将iCasp9整合的iPSCs和未修饰的亲代iPSCs用含有多顺反子盒的慢病毒感染，所述多顺反子盒由荧火虫荧光素酶基因和RFP经IRES连接而组成；且在EF1α(Biosettia)的控制下表达。从感染细胞中分选出RFP+细胞且如上所述注射。将2x106个iCasp9整合的iPSCs皮下注射于NSG小鼠左侧且将相同数目个亲代iPSCs注射于右侧。在指定的日子投与AP1903腹膜內注射。iPSCs植入(第0天)之后立即开始使用Xenogen IVIS成像系统每周监测移植物和畸胎瘤体积。为了成像，将D-荧光素(4mg/小鼠，Thermo Fisher)腹膜内注射至小鼠中且随后10分钟记录生物发光。使用Xenogen Living Image软件进行分析。
[0283] 实例2-CMV启动子所调控的靶向AAVS1安全港的iCasp9自杀基因当被AP1903活化时引发可变响应
[0284] 为了对iPSCs的正确整合和表达策略进行高通量分析，选择iCasp9自杀基因平台，其中小分子化学二聚合诱导剂(例如AP1903)可以诱导半胱天冬酶-9介导的快速细胞死亡。注意到小分子诱导在向最终产物发育的各阶段展现功效，因此iCasp9基因需要在多能干细胞维持和分化的每个阶段中连续表达。按照单一的每孔hiPSC方式，为了高效且精确地将各种自杀基因表达盒整合和维持于安全港基因座中，包括(但不限于)AAVS1、ROSA26和H11基因座。测试若干整合载体，其各含有位于各种外源和内源启动子下游的基因表达盒，所述启动子包括内源AAVS1或ROSA26、细胞巨大病毒(CMV)、延长因子1α(EF1α)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、杂交CMV增强子/鸡肉β-肌动蛋白(CAG)和泛素C(UBC)启动子，从而系统地分析和比较不同自杀系统在hiPSCs和hiPSC源分化细胞中的活性。
[0285] 设计靶向AAVS1基因座(图1A)且将Casp9自杀基因整合到293T细胞中的供体构筑体，所述供体构筑体包含CMV驱动的iCasp9(AAVS1-G1.0)。所述供体构筑体还包含GFP和嘌呤霉素基因，其表达是在靶向插入发生后由AAVS1内源启动子驱动(图1A)。293T细胞经对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和供体构筑体AAVS1-G1.0转染。转染三天后，开始进行嘌呤霉素选择且持续12天。通过流式细胞术分析经嘌呤霉素选择的群体的GFP表达，且观察GFP表达水平的范围。观察到经嘌呤霉素选择的细胞群中约82％表达GFP(图1B)。接着，经嘌呤霉素选择的293T细胞用10nM或120nM AP1903(DMSO用作对照)处理24小时。然后收集处理过的细胞且用选择性地将膜受损死亡细胞染色的7AAD染色，且通过流式细胞术进行分析。对每次处理的7AAD阴性细胞(可能是活细胞)百分比作图(DMSO为对照；AP1903 10nM；和AP1903 120nM)(n＝2)。在两种浓度下进行AP1903处理后检测到显著的细胞死亡(图1C)。AP1903剂量对死亡细胞率似乎不起作用。通过对来自经嘌呤霉素选择的这些293T细胞的基因组DNA使用连接式PCR(图1D)，根据对因供体载体插入而形成的接点具有特异性的PCR扩增产物的存在，进一步验证供体载体靶向插入经嘌呤霉素选择的293T细胞的AAVS1基因座。
[0286] 类似于293T细胞，hiPSCs经对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和包含CMV驱动的iCasp9的供体构筑体(AAVS1-G1.0)转染。转染3天后，开始进行嘌呤霉素选择且持续16天。通过流式细胞术分析嘌呤霉素抗性细胞中的GFP表达。通过流式细胞术，基于GFP强度分选出三种群体：GFP(阴性)、GFP(低)和GFP(高)(图1E)。扩增分选出的GFP(阴性)、GFP(低)和GFP(高)群体，且然后进行AP1903处理(10nM或100nM)或DMSO对照物处理24小时。收集处理过的细胞且用7AAD染色且通过流式细胞术分析。对每次处理的7AAD阴性细胞(可能是活细胞)百分比作图。然而，与Casp9靶向插入AAVS1基因座的293T细胞相比，在对Casp9靶向插入AAVS1基因座的iPSCs的所有处理中均未检测到AP1903介导的细胞死亡(图1F)。对来自经嘌呤霉素选择且分选出的hiPSCs的基因组DNA进行的连接式PCR表明，供体载体靶向插入AAVS1基因座仅发生于GFP(低)群体，而未发生于GFP(阴性)或GFP(高)群体(图1G)。因此，相信GFP(高)群体没有细胞死亡是与不正确(未靶向)的插入基因组相关且推测在CMV启动子控制下未发生iCasp9表达(图1G，泳道4；泳道1-标记物)。然而，相信GFP(低)没有细胞死亡是与iCasp9基因在CMV启动子控制下的表达减少相关，尽管iPSCs中的靶向插入正确(图1G，泳道5)。因此，CMV启动子调控的靶向AAVS1安全港的iCasp9自杀基因当被AP1903活化时引发可变的响应，这可能取决于整合用的细胞类型和基因组中的整合位点。
[0287] 实例3-iCasp9在各种内源和外源启动子控制下靶向插入hiPSCs的安全港基因座[0288] 由于在此前研究中，嘌呤霉素选择在AAVS1启动子控制下受到稳固的表达以在选择期间维持活力和生长，因此设计在插入后通过内源AAVS1启动子驱动iCasp9基因表达(和GFP，和嘌呤霉素标记物基因)而靶向AAVS1基因座的下一种包含iCasp9的供体构筑体(图2A)。hiPSCs经对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和包含处于AAVS1内源启动子控制下的iCasp9的供体构筑体转染。转染3天后，开始进行嘌呤霉素选择且持续20天，随后通过流式细胞术分析嘌呤霉素抗性细胞，且表明具有GFP表达(图2B)。然后对扩增的嘌呤霉素抗性iPSCs进行AP1903(或DMSO对照物)处理24小时。收集处理过的细胞且用7AAD染色且通过流式细胞术分析。对每次处理的7AAD阴性细胞(即，活细胞)百分比作图。然而，在对Casp9靶向插入AAVS1基因座和通过内源AAVS1启动子控制Casp9表达的iPSCs进行的所有处理中未检测到AP1903介导的细胞死亡(图2C)。对来自嘌呤霉素抗性池的基因组DNA进行的连接式PCR表明供体载体靶向插入这个群体的AAVS1基因座中(图2D)。因而，内源AAVS1启动子调控的靶向AAVS1安全港的iCasp9自杀基因似乎不能引发iCasp9表达，尽管在AAVS1基因座的插入正确。同样，基于GFP表达强度，低水平的表达似乎不足以实现iCasp9介导的细胞死亡。
[0289] 不同于其它基因递送策略，例如慢病毒介导的转基因整合(其中每个个别细胞中引入基因的多个拷贝)，在基因座特异性靶向方法中，不同启动子的特性在功能输出中似乎起显著作用。为了调查哪种启动子使稳定的表达维持在所期望的水平，然后设计通过各种外源启动子驱动iCasp9表达和通过AAVS1内源启动子驱动GFP和嘌呤霉素标记物基因靶向AAVS1基因座的构筑体(图2E)。所测试的外源启动子包括CMV、UBC、PGK、EF1α和CAG。hiPSCs经对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和包含处于所选外源启动子之一的控制下的iCasp9的供体构筑体转染。转染3天后开始进行嘌呤霉素选择且持续20天，随后通过流式细胞术分析嘌呤霉素抗性细胞中的GFP表达。观察到经包含处于EF1α和CAG(参见SEQ ID NO:1)控制下的iCasp9的构筑体转染的hiPSCs在展现稳定表达的单独CAG转染后展现较高的GFP表达(图2F和表1)。选择这两种策略用于进一步分析。
[0290] 实例4-EF1α启动子驱动的iCasp9靶向插入iPSC的AAVS1安全港中.
[0291] 根据图2E，设计靶向AAVS1基因座的包含EF1α驱动的iCasp9的供体构筑体。经对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和包含EF1a驱动的iCasp9的供体构筑体转染的hiPSCs用嘌呤霉素选择20天，随后进行AP1903处理。图3A中的闸选区域展示的流式细胞术分析突出显示了有靶向插入的GFP阳性iPSC细胞虽然很少，但响应于AP1903细胞死亡诱导。为了确定这些GFP阳性群体是否能够富集和维持，在选择后的大约第16天，在96孔板中批量或个别地分选出TRA181(展示多能和未分化状态的一种标记物)和GFP阳性(指示iCasp9表达)hiPSCs(图3B)。根据GFP阳性批量分选出的hiPSCs在不含嘌呤霉素的培养基中超时维持，以确定群体随时间的分布曲线(图3C)。观察到表达高TRA181和高GFP的细胞百分比随时间减少(例如分选后第2天到分选后第16天)。这个数据表明，虽然EF1a显示了高水平表达，但其不能够维持所述表达，原因很可能是多能状态的静默。为了确定是否能发现含有稳定EF1a介导的表达的个别hiPSCs，筛检个别hiPSC分选细胞。来源于单一细胞分选的TRA181和GFP细胞的克隆hiPSC的明视场影像展现来源于单一分选细胞的hiPSC群落的形态(图3D)。然后将EF1α驱动的iCasp9靶向插入AAVS1基因座的克隆hiPSCs扩增且评估GFP表达。然而，扩增之后，所有群落的GFP表达都有不同程度的损失，这表明在插入之后，在扩增期间，EF1α启动子不能维持hiPSCs中的表达(参见图3E，例如EF1α克隆系C1和C23)。总体而言，在批量和个别分选的水平上，EF1a不能稳固地维持GFP且继而不能稳固地维持iCasp9表达。
[0292] 实例5-CAG启动子驱动的iCasp9靶向插入hiPSC的AAVS1安全港中
[0293] 发现若干内源启动子在hiPSCs克隆扩增期间驱动iCasp9的存留表达，但表达水平经测定太低而不能有效响应于AP1903处理。iCasp9在各种外源启动子控制下的表达还展示在hiPSCs的长期克隆扩增期间会失去，且不能驱动AP1903诱导的细胞死亡。接着评估经对AAVS1基因座具有特异性的ZFNs和包含CAG驱动的iCasp9的供体构筑体转染的hiPSCs(图2E和表1)。
[0294] 转染3天后开始进行嘌呤霉素选择且持续16天，随后在96孔板中根据高GFP表达来批量或个别地分选出嘌呤霉素抗性细胞。靶向和嘌呤霉素选择之后根据GFP阳性批量分选出的iPSCs在不含嘌呤霉素的培养基中维持21天，随后通过流式细胞术进行分析以证明高GFP表达是否能够在iPSC扩增期间得到维持。图4B表明GFP阳性细胞百分比不仅在长期扩增期间得到维持，而且GFP阳性细胞百分比高于99％。这是第一次观察到，靶向特异性基因座的启动子能够维持稳定表达，这类似于将多个拷贝插入基因组中的慢病毒方法。接着，对维持99％GFP表达的批量分选细胞的iCasp9基因响应进行测试。图4C表明，当用AP1903处理时，GFP阳性细胞经历诱导性细胞死亡，且在处理之后变成7AAD染色阳性。在CAG批量群体展现的稳定表达转化成有效的iCasp9介导细胞死亡的情况下，我们接着评估个别克隆系。接着，评估在基质胶涂布的96孔板中以克隆方式分选的嘌呤霉素抗性iPSCs。个别分选后的典型群落的亮视场影像展示高品质的多能形态(图4D)。个别地扩增来源于单一细胞的群落且通过流式细胞术评估其GFP和TRA181表达。所有选定的群落(例如CAG-C5、CAG-C8、CAG-C12、CAG-C38)均表明在扩增期间维持高百分比的GFP和TRA181表达(图4E)。所选克隆系的平均荧光强度(MFI)描绘于图4F中，其中CAG-C5具有最高MFI 1500，而CAG-C38在四种克隆系中具有相对最低的MFI，是858。对所有选定的GFP+克隆系的基因组DNA进行连接式PCR，以检测供体构筑体和AAVS1基因座的同源重组。亲代hiPSCs代表转染之前的原始hiPSC系。
[0295] CAG hiPSC群体池代表靶向转染和16天嘌呤霉素选择之后的群体。扩增GAPDH基因组序列以确保基因组DNA的品质。所有选定的GFP阳性克隆系在AAVS1基因座展现正确的插入(图4G)。因此，上述数据表明，在靶向插入hiPSC细胞的AAVS1基因座中之后，在iPSC扩增期间，CAG是有能力稳定维持所述基因在其控制下高水平表达的唯一启动子。
[0296] 类似地评估其它启动子在转染时(转染后的第2-3天)的性能、嘌呤霉素选择后的维持(嘌呤霉素选择后的第20天)和AP1903处理后的功能响应。下表1概述了外源启动子CMV、UBC、EF1α、CAG和PGK以及内源启动子AAVS1的性能。在表1中，基于响应于AP1903处理的GFP阳性细胞的数目来量化自杀基因响应。
[0297] 表1：靶向AAVS1的启动子介导基因表达维持、强度和功能响应。
[0298]
[0299] 因而，在所有测试的启动子中，CAG在所有计数方面均展现最佳性能，且如下进一步表征CAG-iPSC克隆系。
[0300] 实例6-CAG-hiPSC克隆系的多能性表征
[0301] 分析所有选定的CAG-hiPSC克隆系进行多能性表征。图5A是无饲养层培养物上所维持的CAG克隆系C38的代表性影像，其展示均质的hiPSCs培养物，其中个别细胞具有较高的细胞核与细胞质比率。图5B中的多能性标记物NANOG和OCT4的免疫荧光染色表明，CAG-hiPSC克隆系是多能的，且无分化。为了描绘所选CAG-hiPSC克隆系(CAG-C5、CAG-C8、CAG-C12、CAG-C38和CAG-C40)的多能状态，还针对各种内源多能性标记物(包括NANOG、OCT4、SOX2、REX1、DPPA2和MYC)的表达进行定量RT-PCR。已表明在所有CAG-hiPSC克隆系中，NANOG表达低于亲代iPSC。还对TRA181、SSEA3和CD30标记物表达进行流式细胞术分析。接着，使所选CAG克隆系发生定向的谱系特异性分化且评估谱系标记物。图5D展示在所选CAG克隆系发生定向分化之后，巢蛋白(外胚层标记物)、αSMA(中胚层标记物)和SOX17(内胚层标记物)的表达。进一步评估CAG-iPSC克隆系之一(CAG-C38)产生由各种谱系组成的畸胎瘤的潜能。在图5E中，注射后第6周收集畸胎瘤且展现三种胚层(内胚层、中胚层或外胚层)。这些数据表明CAG-iPSC克隆系保持分化成所有谱系的非多能细胞的多能性和能力。
[0302] 实例7-诱导性自杀基因通过CAG驱动的iCasp9靶向插入AAVS1基因座来介导处于多能状态和分化状态的hiPSC克隆系被杀死
[0303] 二十种靶向CAG-iCasp9的hiPSC克隆系用AP1903(或DMSO对照物)处理24小时，随后用7AAD染色且通过流式细胞术分析GFP和7AAD染色。所有克隆系在AP1903处理之后均已显示大于95％7AAD染色呈阳性(图6A)。得自两种代表性克隆系(CAG-C5和CAG-C38)的流式细胞测量图也绘示出Casp9基因对CAG-iPSC克隆系的多能状态的响应(图6A)。十五种靶向CAG-iCasp9的iPSC克隆系在12孔板的三重复孔中培养。汇合后，一个孔针对碱性磷酸酶染色且拍照，另外两个孔用AP1903(10nM)处理48小时。处理过的孔用PBS洗涤且添加新鲜培养基以使任何残余的活细胞恢复。八天的恢复孔针对碱性磷酸酶染色且拍照以记录iPSC克隆系的任何存活率。在十五种克隆系中，仅克隆系CAG-C14含有存活克隆系，即，已逃避诱导性死亡(图6B)。其它十四种克隆系不展示任何染色，这表明在Casp9诱导性表达后，没有细胞存活。图6C展现AP1903(10nM)处理之后，克隆系CAG-C5在10cm培养皿上的活细胞覆盖率动力学。活细胞在处理后大约8分钟开始死亡，且AP1903处理之后的12分钟，几乎所有活细胞都被杀死。接着，诱导靶向CAG-iCasp9的hiPSC克隆系分化成三种胚层(内胚层、中胚层或外胚层)的细胞，且各自用AP1903处理48小时且允许在分化培养基中恢复5天。处理之前和恢复之后的重复孔用结晶紫染色且成像，如图6D所示。得自CAG-C5克隆系的影像以图示展示，其展现所有谱系的细胞在AP1903处理之后都被杀死。最后，靶向CAG-iCasp9的hiPSC克隆系被诱导而分化成CD34+细胞，且用AP1903处理48小时且通过流式细胞术分析细胞死亡。图6E中所示的7AAD染色升高表示在AP1903处理后出现CD34+细胞死亡。数据表明，不论细胞的表观遗传状态，即，多能状态(相对于外胚层、内胚层或中胚层)，或细胞类型特异性状态，例如CD34阳性细胞，靶向AAVS1基因座的CAG稳定地维持iCasp9表达。
[0304] 实例8-AP1903诱导来源于iCasp9-iPSC克隆系的畸胎瘤消退的活体内证明
[0305] NSG小鼠研究中的皮下注射位置展示于图7A中以展现通过iCasp9表达和诱导而介导的活体内细胞死亡。亲代hiPSC系和CAG-C38克隆系按照4E6个细胞注射(第0天)且在第7-11天用AP1903处理(腹膜內，总计200μg)。第34天，收集畸胎瘤且成像以展示尺寸(图7B)。在CAG-C38收集物中，一个注射部位不含有任何肿瘤，而另一个则主要由脂肪样细胞组成。也测量所收集的畸胎瘤的体积(图7C)。在所收集的肿瘤中，来源于CAG-38hiPSC的畸胎瘤未检测到或发现显著小于其亲代对照。所收集的畸胎瘤用苏木精和曙红染色，且染色结果展示亲代iPSC与CAG-hiPSC克隆系之间的组织学差异(图7D)。虽然亲代hiPSC系呈现大部分的三谱系分化细胞类型，但CAG-C38似乎主要由高组织化脂肪样细胞组成，所述细胞可能由小鼠产生。接着，亲代hiPSC系和CAG克隆系按照4E6个细胞注射且在第40-46天用AP1903处理(腹膜內，总计200μg)。按常规方式测量所有肿瘤的体积，且CAG-iPSC仍响应于Casp9基因表达且使注射任一种所选CAG-iPSC克隆系的小鼠中的肿瘤体积减小。总体而言，数据证明靶向AAVS1基因座的CAG启动子在试管内和活体内受到稳定表达。
[0306] 实例9-使用CRISPR/Cas9对人类ROSA26基因座进行基因组编辑，以便靶向或核酸酶非依赖性插入iCasp9
[0307] 为了测试其它靶向策略与安全港基因座的协同性，在这个实验中，测试iPSC基因组的不同内源基因座供CAG启动子驱动的外源基因发生核酸酶非依赖性靶向插入的潜能。设计通过CRISPR/Cas9靶向ROSA26基因座的构筑体，如9A图所示。hiPSCs用对ROSA26基因座具有特异性的gRNA/Cas9-RFP质体和包含CAG驱动型iCasp9的供体构筑体转染。转染两天后，通过流式细胞术分析细胞群中的细胞对GFP的表达，以确定转染效率，所述转染效率表明在约80％至约85％之间(图9B)。转染3天后开始进行嘌呤霉素选择且持续20天，随后通过流式细胞术分析嘌呤霉素抗性细胞中的GFP表达。GFP表达在iPSC扩增期间维持(图9B)。下表2概括了具有图9A中所示的构筑体的iPSC的表达水平和功能响应。
[0308] 表2：靶向ROSA26的CAG启动子介导基因表达维持、强度和功能响应：
[0309]
[0310] 表2证明CAG驱动的外源基因靶向插入不仅适于AAVS1基因座，而且适于ROSA26基因座且能够通过ZFN和CRISPR策略介导。为了测试策略可行性，还采用根据核酸酶非依赖性策略、通过利用同源臂来靶向ROSA26基因座的另一种构筑体设计。核酸酶非依赖性ROSA26基因座用的构筑体是由CAG启动子驱动型GFP和iCasp9组成，而RFP则指示脱靶整合(图9C)。经图9C中的构筑体转染且经嘌呤霉素选择的293T细胞和hiPSCs各自针对靶细胞富集(图9D和图9E)。数据证明核酸酶非依赖性策略也能够应用于当前平台以高效地产生靶向hiPSCs。
[0311] 总之，在hiPSCs的长期克隆扩增期间，CAG启动子维持高水平的iCasp9表达，不论靶向策略、基因座或不同分化状态。另外，这些通过iCasp9整合的克隆系在AP1903存在下经历了快速的细胞死亡，且当允许培养物在缺乏二聚合分子的情况下恢复时未观察到残余细胞存活。另外，hiPSC克隆系在试管内分化成三种体细胞谱系且发现全部发生AP1903诱导的细胞死亡。克隆系还特别向造血细胞分化，从而展现AP1903处理完全诱导的细胞死亡。当注射到NSG小鼠中以形成畸胎瘤时，观察活体内出现类似的细胞死亡介导响应。发现CAG驱动的无核酸酶靶向整合于iPSC具有类似结果。因此，如本文所提供的CAG驱动型靶向整合系统除了高效、精确和可持续外，还具有可靠性，原因是其似乎不会引起表观遗传概貌变化，而所述变化在其它启动子和/或构筑体情况下通常被发现，所述变化会消除自杀基因介导的iPSC的响应，在试管内和活体内均扩增iPSC或iPSC源分化细胞。其它外源基因和/或不同的所选基因座也能应用于这个平台。举例来说，除产生含有GFP和iCasp9的构筑体之外，可以将不同功能的基因并入构筑体中。还能够将靶向模式(例如嵌合抗原受体或工程改造的T细胞受体)引入特异性基因座中。在另一个实例中，各种基因靶向特异性基因座可以在重编程时进行。如早先所论述，hiPSC平台能够选择具有多种属性的个别细胞，这些属性可以包括成功重编程的hiPSC，其接触到引入特异性基因座中的所期望基因。
[0312] 值得注意的是，一种hiPSC克隆系含有某些稀有细胞且逃避诱导性细胞死亡，且表征这种克隆系和这些稀有细胞以评估逃逸分子机制。
[0313] 实例10-逃逸克隆系的表征揭露所有扩增克隆系中的单点突变
[0314] 用于在AP1903处理后发现存活克隆系的程序进一步为拣选和扩增在AP1903处理中存活的克隆系(图8A)。如所证明，所有逃逸克隆系具有正确的靶向插入，如连接式PCR所示。为了确定逃逸克隆系中是否发现序列变化，对iCasp9转基因进行PCR扩增，随后进行提纯和基因组测序(图8B)。在测序的所有克隆系中，那些逃逸克隆系的iCasp9转基因序列呈现单点突变K189E(图8C)。为了证实K189E是否为顽固性克隆系的直接原因，根据图2E产生iCasp9突变体形式，且用于转染且测试所得靶向iPSC细胞。图8E描绘了表达GFP的CAS-iCasp9m iPSC细胞不响应于AP1903处理，且在处理后存活的所有细胞相较于CAS-iCasp9wt iPSC细胞具有相同的高水平的GFP表达。
[0315] 实例11-拯救包含共同单点突变的逃逸克隆系的方法
[0316] 上述实例表明，对于所有测试的克隆系来说，来源于单一顽固性株系的对试管内处理具有抗性的克隆系包含位于iCasp9中的共同不活化点突变。然而，通过选择双等位基因iCasp9插入的hiPSC克隆系，使得试管内和活体内的杀死动力学改善且抗性率减小。因此，为了提防对单一可诱导安全系统产生抗性的可能性，探究含有多种条件自杀基因的hiPSC克隆系的产生和选择，包括iCasp9和单纯疱疹病毒胸苷激酶，其各自并入独特的安全港基因座中。试管内和活体内比较双重安全防护系统与单一iCasp9安全开关，以评估移植细胞的安全和有效排除。
[0317] 实例12-CAG启动子驱动的iCasp9靶向插入hiPSC的AAVS1安全港处的拷贝数[0318] 基于定量PCR评估CAG启动子驱动型iCasp9克隆系中的转基因(iCasp9-GFP)拷贝数揭露，少数克隆系具有超过一个转基因拷贝。如图10A所示，拷贝数为1表示单等位基因iCasp9整合，拷贝数为2表示双等位基因iCasp9整合，而高于2则表示潜在的随机整合。在分选的混合培养物中或在单等位基因或双等位基因iCasp9靶向插入的克隆系中，如图10B所示的iCasp9-GFP平均荧光强度(MFI)证明，转基因表达水平对应于拷贝数，拷贝数越高，则MFI读数越高。PCR分析使用与AAVS1-转基因接点重叠的引物在混合靶细胞和克隆系中进行的转基因整合证明，iCasp9-GFP转基因特异性整合于AAVS1基因座中(图10C)。使用对AAVS1整合位点具有特异性的引物评估靶向整合的等位基因的数目。缺乏色带表明，两种AAVS1等位基因的整合位点均中断，即双等位基因插入，而存在色带则表明一种或两种等位基因未受干扰(图10D)。如图10C和10D所示，CAG-C5和CAG-C35克隆系的两个转基因拷贝发生双等位基因插入，而CAG-C38克隆系的一个拷贝插入一个等位基因的靶向位置中。添加10nM AP1903之后，立即使用活细胞成像来评估培养板表面覆盖率。如图10E所示，未分选的混合靶细胞(整合和非整合)具有最小的诱导杀死能力，而针对iCasp9-GFP分选的混合靶细胞(靶向和随机整合，拷贝数可变)展示稍微更佳的诱导杀死能力。克隆CAG-C38(单等位基因靶向插入)和CAG-C5(双等位基因靶向插入)细胞系的杀死速率和效率比混合细胞高得多。
[0319] 实例13-在活体内可诱导杀死和畸胎瘤消退方面比较所移植的双等位基因和单等位基因iCasp9克隆系
[0320] 图11A中展示了注射位置在皮下的NSG小鼠研究，其展现了在CAG-C38克隆系、CAG池、PGK池(PGK-iCasp9转基因)、UBC池(UBC-iCasp9转基因)和CMV池(CMV-iCasp9转基因)中通过iCasp9表达和诱导所介导的活体内细胞死亡。第0天，按照4E6个细胞将CAG-C38克隆系和池注射到三组NSG小鼠(n＝2)中，且第19-25天，用AP1903处理小鼠(腹膜內，125μg)。第28天，收集畸胎瘤且成像以展示尺寸。3组NSG小鼠在AP1903投与之前(图11B，上图)和投与结束之后第3天(图11B，下图)的生物发光成像表明，只有外源CAG启动子实现了iCasp9介导的已建立iPSC源畸胎瘤的排除。这个观察结果进一步描绘于图11C-11G中。图11C中以平均值和SD展示的总通量(光子数/秒)，其指示来源于指定细胞类型的畸胎瘤中的肿瘤细胞数量，证实了图11B中的畸胎瘤尺寸结果。指定细胞类型在处理之后相对于之前的总通量(平均值±SD)的比率展示于图11D中。注射克隆CAG-C38和CAG混合细胞的小鼠的结果以较高清晰度分别绘制于图11E中。第28天对来源于指定细胞类型的畸胎瘤进行最终体积测量，测量结果展现于图11F中。图11G展示来源于指定细胞类型的畸胎瘤在第28天的影像。注射CAG-C38克隆系或CAG-iCasp9混合细胞的体侧未检测到畸胎瘤。总体而言，数据得到证实的对不同启动子驱动iCasp9-GFP转基因表达进行的这些试管内研究表明，CAG启动子在试管内和活体内测试中是最有效的。数据还表明，CAG-C38克隆系尽管对于iCasp9-GFP是单等位基因型，但是在自杀基因诱导后，在畸胎瘤排除方面比CAG混合细胞更有效。
[0321] 此外，测试所移植的双等位基因iCasp9克隆系的可诱导杀死且与单等位基因iCasp9克隆系的可诱导杀死进行比较。图12A中展示了注射位置位于皮下的NSG小鼠研究，以展现在亲代细胞、CAG-C5克隆系和CAG-C38克隆系中通过iCasp9表达和诱导所介导的活体内细胞死亡。第0天，将相应细胞类型注射到4组NSG小鼠(n＝2)中，且第7-13天，用AP1903处理小鼠(腹膜內，125μg)。第7天、第14天和第42天，对畸胎瘤成像。第42天，收集畸胎瘤且成像以展示尺寸。
[0322] 移植有指定细胞类型(双等位基因CAG-C5克隆系、单等位基因CAG-C38克隆系和亲代iPSCs)的NSG小鼠在iPSC移植之后的第7天、第14天和第42天进行生物发光成像(图12B)。即将投与AP1903(125μg，腹膜內；第7-13天)之前，在第7天进行成像。中间图展示第14天所收集的畸胎瘤(如果发现)的影像，且下图展示第42天所收集的畸胎瘤(如果发现)的影像。
如图所示，CAG-C5和CAG-C38均能够在第14天排除所有测试小鼠中的畸胎瘤。然而，移植有CAG-C38的小鼠中的畸胎瘤不迟于第42天消退，而移植有CAG-C5的小鼠中排除的畸胎瘤不复发。图12C展示来源于指定细胞类型的畸胎瘤在第42天的影像。图12D中以平均值和SD展示的指定群组的畸胎瘤的总通量(光子数/秒)证实了图12B和12C中的成像数据。总体而言，这些数据证明所移植的双等位基因iCasp9克隆系的可诱导杀死比单等位基因iCasp9克隆系的可诱导杀死更有效。
如图所示，CAG-C5和CAG-C38均能够在第14天排除所有测试小鼠中的畸胎瘤。然而，移植有CAG-C38的小鼠中的畸胎瘤不迟于第42天消退，而移植有CAG-C5的小鼠中排除的畸胎瘤不复发。图12C展示来源于指定细胞类型的畸胎瘤在第42天的影像。图12D中以平均值和SD展示的指定群组的畸胎瘤的总通量(光子数/秒)证实了图12B和12C中的成像数据。总体而言，这些数据证明所移植的双等位基因iCasp9克隆系的可诱导杀死比单等位基因iCasp9克隆系的可诱导杀死更有效。
[0323] 实例14-双重自杀基因靶向插入个别安全港基因座的安全防护系统的产生
[0324] 为了展现高分辨率精确工程在单一细胞层面的能力和功效，产生具有安全防护系统的克隆iPSCs，其中双重自杀基因靶向插入个别安全港基因座。除了CAG-iCasp9整合至AAVS1基因座中之外，还使用本文所述的靶向插入方法将CAG-sr39TK整合至CAG-C38克隆iPSC的H11安全港中。如图13A所示，PCR分析证实，使用对sr39TK、sr39TK-杀稻瘟菌素(Bsd)接点或内源H11序列-转基因接点具有特异性的引物实现了sr39TK于H11安全港基因座中的特异性基因组整合，其中GAPDH用作内参考物。sr39TK靶向插入H11基因座的iCasp9iPSC克隆系(对于sr39TK为非克隆的)用25μg/mL苷昔洛韦(Ganciclovir，GCV)处理九天，前两天用10nM AP1903处理或不处理。仅用AP1903处理CAG-C38iCasp9克隆系(对于iCasp9为单等位基因的)两天便可诱导性杀死大部分细胞，但有很少的细胞保留下来(图13B(ii))。单独GCV处理对CAG-C38iCasp9克隆系处理九天便引起GCV顽固性细胞扩增(图13B(iii))。然而，AP1903与GCV并行处理，使所有顽固性细胞均被有效排除，这表明使用双重自杀安全防护系统比使用单独iCasp9自杀基因更有效地杀死在可诱导自杀基因下逃逸的残余细胞。
[0325] 本文还提供iPSCs的设计，其包含位于安全港基因座的可诱导盒，用于所关注基因的可控表达。可诱导盒特异性插入基因座是在iPSC层面发生。所关注基因的表达(本文中作为一个实例描绘的CAR)是通过侧接两个loxP位点的翻译终止密码子达成不活化。在Cre重组酶(图33A)或多西环素(图33B)诱导一次后，终止密码子因此被去除且CAR表达被活化。诱导剂可以在活体外iPSC分化期间的任何所选阶段投与，从而促进了分化程序的优化。CAR受到强组成型启动子驱动以便在最终产物(例如iT或iNK)中实现高水平和持续表达。
[0326] 还开发出一种新颖策略，其独特地靶向所选基因座以实现基因特异性中断，同时将所关注的新基因插入hiPSC群体中，随后按照高通量方式进行单一细胞分选以选择含有全部所需准则的hiPSC克隆系，所需准则包括独特的插入基因拷贝数、靶向基因的功能中断和脱靶效应的缺乏。
[0327] 图34A展现了一种针对标靶载体和供体载体的构筑体设计，所述标靶载体含有引导核酸酶结合的负股和正股，且供体载体含有B2M的同源臂、中断用的示例性基因和用于插入所中断基因座的所关注基因(例如CD16、HLA-G和PDL1)。图34B描绘基因编辑之后，针对所选基因座含有所选基因的克隆群体进行hiPSC选择的图示。
[0328] 实例15-产生B2M剔除(B2M-/-)、缺乏HLA I的iPSCs和其修饰
[0329] 为了展现执行单一细胞基因编辑以实现HLA复合体修饰的能力，使用靶向B2M的gRNA对、通过表达Cas9切口酶的质体转染iPSC系，所述质体经工程改造以提供比野生型Cas9更少的脱靶效应。图14A展示转染之前(左图)和之后(中间图)对GFP和B2M/HLA-I表达进行的流式细胞术分析。使用与相同染料结合的B2M特异性抗体和HLA-I特异性抗体同时检测B2M和HLA-I。对B2M与HLA-I均呈阴性的细胞(封闭的群体)在96孔板中批量分选出(图14A)或以克隆方式分选出以产生克隆系(图14B)。通过克隆基因组DNA测序进一步分析使用靶向编辑得到的B2M-/-且缺乏HLA I的克隆系且证实具有少量缺失或插入，产生B2M基因敲除表型。
[0330] 然后，对缺乏HLA I类的iPSCs(B2M-/-iPSCs，也称为HLA I剔除型iPSCs)进行基因工程改造，例如使用慢病毒引入HLA-E/B2M融合蛋白以便进一步改造缺乏HLA I的细胞。利用流式细胞术，根据多能性标记物TRA-181和SSEA4以及HLA-E的表达来评估缺乏HLA I的已改造iPSCs(B2M-/-HLA-E iPSCs)的品质(即，多能性状态)。图16A表明缺乏HLA I的经改造iPSCs在细胞表面上表达HLA-E且维持多能表型。当表达核苷酸的HLA-E/B2M融合蛋白整合于缺乏HLA I的iPSCs中时，发现与慢病毒转导结果类似的结果。
[0331] 随后对B2M-/-HLA-E iPSCs进行基因工程改造以含有PDL1蛋白质，从而产生缺乏HLA I的已改造iPSC：B2M-/-HLA-E PDL1iPSCs。另外，对B2M-/-iPSC进行基因工程改造以含有HLA-G/B2M融合蛋白且然后进行后续基因工程改造以含有PDL1蛋白质，从而产生另一种经HLA I修饰的B2M剔除型iPSC：B2M-/-HLA-G PDL1iPSCs。图21A展示缺乏HLA I的已改造iPSCs的细胞表面上的HLA-E、HLA-G和PDL1的表达。当表达核苷酸的HLA-G/B2M融合蛋白整合于缺乏HLA I的iPSCs中时，发现类似结果。
[0332] 为了确定缺乏HLA-I的已改造iPSCs是否维持其造血分化能力，使用本文中使用的iCD34分化方案将缺乏HLA-I的各种已改造iPSCs(B2M-/-、B2M-/-HLA-E、B2M-/-HLA-E/PDL1、B2M-/-HLA-G和B2M-/-HLA-G/PDL1)分别分化成CD34+HE。图21B表明缺乏HLA I的所有已改造iPSCs都能够分化成CD34+HE，如分化10天之后通过流式细胞术所发现。分离出CD34+细胞且放入iNK或iT淋巴分化培养物中。图22表明，再分化10天之后，通过基因工程免疫抗性模式(例如HLA-E、HLA-G或PDL1)调节缺乏HLA I的iPSCs不会干扰iCD34细胞生成ProNK(NK祖细胞；CD45+CD56)和ProT(T细胞祖细胞；CD45+CD34+CD7+)细胞的能力，如通过流式细胞术所发现。当表达核苷酸的PDL1蛋白质整合于缺乏HLA I的iPSCs中时，发现类似结果。
[0333] 为了确定基因工程改造的免疫抗性蛋白质的表达是否在造血分化期间得到维持，通过流式细胞术评估iNK细胞的细胞表面上的HLA-E、HLA-G和PDL1的表达，所述iNK细胞是由缺乏HLA-I的已改造CD34+细胞分化20天而得。图23A表明HLA-E和HLA-G蛋白质不存在，同时PDL1表达得到维持。为了确定在造血分化期间，HLA-E和HLA-G蛋白质是否从细胞表面裂解，通过西方印迹分析来检查来自第20天iNK细胞和第20天培养基上清液的蛋白质溶解物中的HLA-E和HLA-G蛋白质的表达。图23B表明在上清液部分中发现HLA-E和HLA-G蛋白质且因此断定：HLA-E和HLA-G蛋白质从iPSC源NK细胞的细胞表面脱落。
[0334] 为了使缺乏HLA I的已改造iPSC源淋巴效应细胞的存留增强得到维持，设计HLA-E/B2M和HLA-G/B2M融合蛋白的抗裂解形式(图24A)且对B2M-/-iPSCs进行基因工程改造以含有不可裂解的HLA-G/HLA-A3融合蛋白。图24B表明，根据针对HLA-G表达进行的流式细胞术，HLA-G/HLA-A3不可裂解蛋白质在细胞表面上受到表达且不影响iPSC品质，如根据多能蛋白质(TRA-181、SSEA4、NANOG和OCT3/4)的表达所发现。
[0335] 一种产生缺乏HLA I类的iPSCs的替代方法是中断载肽复合体(PLC)，所述复合体负责将肽装载到HLA I类分子上。与抗原处理相关的转运体(TAP)是PLC的一个整体式部件且中断所述基因引起细胞表面上的稳定HLA I类分子显著减少。然而，不知道TAP2剔除(TAP2-/-)、缺乏HLA I的iPSCs是否对iPSCs的分化潜能或存留具有任何影响。为了产生TAP2剔除iPSC系FTi121，使用TAP2gRNA对、通过表达Cas9切口酶的质体转染iPSCs。在96孔板中以克隆方式分选出HLA-I呈阴性/低的细胞，以产生克隆系。图25A表明对2种所选克隆系的流式细胞术分析展现HLA I类表达相较于亲代FTi121显著减少。用IFNγ处理iPSC诱导表面上的HLA I类分子上调。图25B表明，TAP2-/-克隆系在用IFNγ处理之后，展现HLA I类的表达相较于野生型FTi121减少，这暗含着一种鉴别最优的HLA复合体表达水平以躲避T细胞与NK细胞检测的独特策略。
[0336] 实例16-B2M-/-且缺乏HLA I的iPSCs的存留改善
[0337] 为了确定缺乏HLA-I是否能够使B2M-/-hiPSCs躲避T淋巴响应，将周边血液T细胞通过与hiPSCs共培养10天来预致敏。10天之后，收集经扩增且预致敏的T细胞且用作细胞毒性效应细胞。将野生型hiPSC(WT)或B2M-/-(工程改造)hiPSC靶细胞单独接种或与预致敏的T细胞按照1:3比率共培养。使用Incucyte Zoom测量5天期间的每孔靶细胞数目。如图15A所示，预致敏的T细胞识别且杀死WT hiPSC靶细胞，而经工程改造的hiPSC不受影响。
[0338] 虽然B2M-/-hiPSCs已表明能够躲避T细胞识别和杀死，但问题在于，这些细胞可以更高效地被NK细胞杀死，原因是NK细胞已知被缺乏MHC I类的细胞活化，对于缺乏B2M的细胞来说，也是这样；并且如果是这样，那么这会导致活体内排斥反应。为了测试B2m-/-hiPSCs是否更多地被NK细胞识别，分别用CFSE、e670增殖染料(eBioscience)或e450增殖染料(eBioscience)单独地标记K562细胞、由野生型iPSC(WT)分化成的CD45+细胞，或由B2M-/-iPSC(B2M-/-)分化成的CD45+细胞。所有三种经标记的靶细胞按等比率混合且按照指定的比率添加到单一孔的NK细胞效应细胞中(图15B)，或三种经标记的靶细胞各自添加到相应个别孔的NK细胞效应细胞中(图15C)。培育细胞4小时，随后根据流式细胞术量化细胞的细胞毒性。如图15B和15C所示，在试管内，NK细胞识别似乎未增加，其中B2M-/-与WT hiPSC CD45+细胞均按相同的速率被杀死，且含量均相对低于K562细胞(一种已知的NK细胞标靶，作为阳性对照而包括在内)的杀死。因此，数据表明，这种B2M-/-iPSC株系能够避免T细胞介导的杀死，同时不诱导NK细胞识别，这表明通用的供者/接受者兼容hiPSC克隆系的存留改善。
[0339] 进一步评估通用B2M-/-hiPSC克隆系在活体内的存留改善。为了确定在胜任型免疫系统的存在下，HLA-A的缺乏是否实现活体内存留增加，将荧光素化WT hiPSC(WT)和B2M-/-hiPSCs(工程改造)皮下且两侧注射到免疫功能不全NSG(图15D左)或免疫胜任型WT C57BL/6(图15D右)接受者小鼠中以形成畸胎瘤。96小时之后，对小鼠进行生物发光IVIS成像，以检测畸胎瘤。在NSG接受者中，WT和工程改造的畸胎瘤均以相等的强度被检测到，而在WT C57BL/6小鼠中，工程改造的B2M-/-hiPSCs的存留相较于WT hiPSC增加。
[0340] 实例17-HLA I类对iPSC的调节使iPSC活体内存留增加
[0341] 为了确定缺乏HLA I的已改造iPSC的活体内存留是否增加，在畸胎瘤分析中将荧光素化野生型iPSCs和B2M-/-HLA-E iPSCs皮下注射到完全免疫胜任型C57BL/6接受者的相对侧腹中。每天通过IVIS成像，配合荧光素注射(以使正形成的畸胎瘤可视化)来分析小鼠。图16B表明，注射后第72-144小时，B2M-/-HLA-E iPSCs展示增加的定量存留，为野生型iPSC的约6倍。图16B中还呈现了三只代表性小鼠，其描绘了B2M-/-HLA-E iPSC畸胎瘤的荧光素成像增强。当使用HLA-G代替HLA-E时，观察到存留出现类似的改善。另外，如上文所述，应用为了避免裂解而经修饰的HLA-E或HLA-G形式，以进一步增强经HLA I类修饰的iPSCs的活体内存留。有趣的是，我们认识到，在获自CMV+供体的NK细胞展现NKG2C表达且因此被活化的一些情形中，HLA-E表面表达反而活化NKG2C且因此产生不利影响，包括NK细胞识别且随之杀死表达HLA-E的细胞。与其中NK细胞表达NKG2A相比，NK细胞不能被表面表达HLA-E的iPSCs和分化后代活化，从而增强了表面表达HLA-E的这些细胞的存留。
[0342] 为了确定宿主免疫反应中的哪种组分涉及缺乏HLA I的已改造增强型iPSCs在野生型接受者小鼠中的排斥反应，分别通过注射抗CD4、抗CD8a和抗NK1.1抗体来个别地耗乏CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞。图26A展现抗体注射后三天，CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞不存在。抗体介导的耗乏之后第三天，将荧光素化B2M-/-经HLA I修饰的iPSCs皮下注射到免疫胜任型C57BL/6小鼠的侧腹以形成畸胎瘤。每天通过IVIS成像，配合荧光素注射(以使正形成的畸胎瘤可视化)来分析小鼠。图26B表明，在iPSC注射后120小时，相较于IgG对照物处理的动物，NK细胞耗乏的小鼠对肿瘤排斥反应展现最高的抗性。
[0343] 为了确定基因工程改造的经HLA I修饰的iPSC是否具有增强的试管内存留和抗性，将B2M-/-PDL1HLA-I修饰的iPSCs在悬浮液中培养3天且然后用IFNγ处理24小时以诱导HLA I类表达。然后将处理过的iPSCs与预先经细胞追踪紫(Cell Trace Violet，CTV)标记以监测细胞增殖的提纯过的同种异体T细胞(图27A)、全部周边血液单核细胞(PBMCs，图27B和27C)中所含的同种异体T细胞和NK细胞共培养放置。单独T细胞/PBMCs(未刺激)和经抗CD3/CD28珠粒刺激以诱导活化和增殖的T细胞/PBMCs(已刺激)用作对照。共培养起始后的第12天，通过流式细胞术评估细胞，以测定CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD56+NK细胞的增殖量作为其识别和响应于经HLA I修饰的iPSC源细胞的能力的度量。图27A和27B表明，相较于与野生型iPSC源细胞共培养的T细胞，与B2M-/-和另外B2M-/-经HLA I修饰的iPSC源细胞共培养的T细胞展现更少的增殖，如根据CTV增殖染料的稀释所发现。图27C展现对NK细胞增殖的类似影响，总体上意味着HLA I类修饰能够增强对T和NK细胞的免疫抗性。
[0344] 实例18-通过其它编辑产生具有增强的特性的iPSCs
[0345] 在iPSC层面经修饰或调节的分子可以用于增强使用通过本发明分化平台所得的衍生淋巴细胞的免疫疗法的期望特性。这些分子可以包括安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物；或促进iPSCs或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节和/或存活的蛋白质。除B2M/HLA-I和HLA-E/G之外，对期望特性有贡献的靶向分子进一步包括(但不限于)CD16受体和41BBL共刺激分子、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR(嵌合抗原受体)、TCR(T细胞受体)、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、染色体6p21区域中的任何基因、接合体，和用于与双特异性或多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体。更具体地说，iPSC中的靶向分子的基因修饰包括以下中的一种或多种：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP和染色体6p21区域中的任何基因的缺失或表达减少；HLA-E、HLA-G、HACD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体、接合体或用于与双特异性或多特异性或通用接合体偶联的表面触发受体的表达引入或增加。靶向分子的表达增加或减少可以是持久的、短暂的、按时的或可诱导的，且可以通过内源或外源启动子控制。
[0346] 这些期望模式可以使用所属领域中已知的各种递送方法引入iPSC中。在这个示例性图示中，iPSCs经基因工程改造而含有不可裂解的高亲和力CD16受体(hnCD16)和41BBL共刺激分子以产生具有增强的细胞毒性的iPSC。图17A通过流式细胞分析展现慢病毒转导之后，iPSC表面上的hnCD16和41BBL的高效表达。图17B表明hnCD16表达和41BBL表达得到维持且在分化10天之后不干扰iPSC生成CD34+HE细胞的能力。
[0347] 为了评估hnCD16(不可裂解的高亲和力CD16受体)蛋白质的表达是否影响经工程改造的iPSCs的造血分化，在96孔板中以克隆方式分选出经基因工程改造的hnCD16/41BBL iPSCs池。选择三种阳性克隆系且分化10天以产生iCD34+细胞。图28A展现hnCD16和41BBL均匀表达于CD34+HE上，如通过流式细胞术所发现。分离出CD34+细胞且进一步使其在促进NK的条件下分化10天以产生proNK细胞。图28A表明CD56+NK祖细胞维持hnCD16蛋白质的高水平表达，且表明hnCD16和41BBL的表达不干扰工程改造的iPSCs的造血分化能力。
[0348] NK细胞所表达的内源CD16受体在NK细胞活化之后从细胞表面裂解。为了证实hnCD16工程化蛋白质不裂解，将表达hnCD16的iNK细胞和周边血液(PB)源NK细胞培养于：1)恒稳培养物中；2)存在或不存在抑制CD16裂解的TACE/ADAM抑制剂的恒稳培养物中；或3)用K562靶细胞刺激，以促进NK细胞活化和随后CD16脱落。未经刺激的PB源NK细胞和iNK细胞代表恒稳对照。图28B表明PB源NK细胞的CD16表达损失在恒稳培养期间减少或受到TACE/ADAM抑制剂的抑制，且在与K562靶细胞共培养后，CD16表达的损失增强。相比之下，K562靶细胞使iNK细胞活化后，hnCD16工程化iNK上的CD16的表达保持恒定，从而确认不可裂解的高亲和力CD16受体的完整性。
[0349] 为了评估hnCD16受体的增强的功能，使表达hnCD16的iNK细胞不受刺激或用5ug/ml抗CD16刺激，或与单独的P815细胞或与5ug/ml抗CD16的组合按照1:1比率刺激。利用流式细胞术评估iNK细胞的促炎性细胞因子释放和脱颗粒，这是NK细胞活化的标志。图29A描绘基于CD45+CD56+CD3-部分闸选的iNK细胞且展示IFNγ、TNFα和CD107a表面表达。表达hnCD16的iNK细胞响应于抗CD16抗体对TNFα和CD107a的表达增强，其可以进一步通过与P815细胞和抗CD16共培养来增强。这些数据表明hnCD16受体对iPSC源iNK细胞发挥作用。
[0350] 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是NK细胞介导溶解的一种机制，其通过CD16结合到抗体所涂靶细胞来实现。为了评估ADCC功能，将表达hnCD16的iNK细胞与经核红标记的SKOV靶细胞在赫赛汀(Herceptin)抗体存在或不存在下共培养120小时。使用Incucyte ZOOM细胞分析系统(Essen BioScience,Ann Arbor,Michigan)，每2小时分析靶细胞的量化。图29B表明表达hnCD16的iNK细胞在赫赛汀抗体存在下具有强ADCC，从而为工程化iNK细胞的功能增强提供进一步的证据。
[0351] 为了进一步评估iPSC源iNK细胞的品质，将培养物如下放在促进扩增的条件下。CD34+细胞向iNK分化的第18天，获得CD45+CD3-CD56+(约66％)。细胞(2.5×10^5个/毫升)每周与相等数目个被照射过的K562/mbIL-21/41BBL饲养细胞加250U/mL rhIL-2一起培养。
每一轮添加饲养细胞之后，第3天添加新鲜培养基(B0)加IL-2。第5天将细胞稀释到2.5×10^5个/毫升且用新鲜培养基加IL-2(250U/mL)饲养。利用细胞计数和流式细胞术测定NK细胞扩增倍数。图30表明iNK细胞在15天培养期间经历495倍扩增。
每一轮添加饲养细胞之后，第3天添加新鲜培养基(B0)加IL-2。第5天将细胞稀释到2.5×10^5个/毫升且用新鲜培养基加IL-2(250U/mL)饲养。利用细胞计数和流式细胞术测定NK细胞扩增倍数。图30表明iNK细胞在15天培养期间经历495倍扩增。
[0352] 因此，产生了包含以下中的一种或多种的iPSCs：B2M剔除型或低含量型、HLA-E/G、PDL1、A2AR、CD47、LAG3剔除型或低含量型、TIM3剔除型或低含量型、TAP1剔除型或低含量型、TAP2剔除型或低含量型、TAP相关糖蛋白剔除型或低含量型、NLRC5剔除型或低含量型、PD1剔除型或低含量型、RFKANK剔除型或低含量型、CIITA剔除型或低含量型、RFX5剔除型或低含量型和RFXAP剔除型或低含量型。经HLA I类和/或II类修饰的这些细胞对免疫检测的抗性增强，且因此呈现改善的活体内存留。此外，此类细胞能避免过继性细胞疗法中的HLA匹配的需要且从而提供通用、现成的治疗方案来源。
[0353] 还产生了包含以下中的一种或多种的iPSCs：HLA-E、HLA-G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR和TCR，从而提供改善的免疫效应能力。
[0354] 实例19-CAR-T源iPSCs保留CAR
[0355] 嵌合抗原受体(CARs)是工程化跨膜受体，其用于向免疫效应细胞(例如T或NK细胞)施加特异性。CARs是典型地由以下组成的融合蛋白：提供抗原识别的衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFV)；和向免疫效应细胞提供活化信号的细胞内信号传导域的组合。由于CAR免疫效应细胞能够进行工程改造而识别任何肿瘤相关抗原且从而使经工程改造的免疫效应细胞只靶向肿瘤细胞而无需HLA匹配，因此CARs保持了作为有效通用癌症免疫疗法的巨大潜能。
[0356] 我们已经表明CAR-T细胞重编程为iPSCs保留了源细胞的相同遗传印记，即，相同嵌合抗原受体(图18)。经基因工程改造以表达CD19嵌合抗原受体(CAR)和截断的LNGFR细胞表面标记物作为CAR的共识别标志的iPSC在分化成iCD34细胞期间保持表达(图18)。
[0357] 本文还提供包含位于内源TCR基因座的CAR的iPSCs。在T细胞层面上实现CAR的基因座特异性插入，随后使所述T细胞重编程为包含CAR的靶向插入的iPSC。或者，CAR的基因座特异性插入可以在iPSC层面上发生。由于仅存在一个表达性TCR基因座，因此具有表达性的CAR插入的拷贝数是通过基因座特异性插入来控制。另外，将CAR插入TCR的恒定区中。TCR恒定区的截断引起TCR基因敲除，从而消除了细胞疗法中的HLA匹配需要。此外，CAR表达是通过TCR内源启动子控制，且因此与TCR处于相同水平和相同发育阶段。模拟内源TCR的可控CAR表达避免了在iPSC分化过程中对分化效能的潜在影响。图20表明CAR的表达水平类似于亲代系的TCR表达，且工程化细胞系中的TCR的表达和功能均消除。然后将工程改造过的T细胞重编程为包含位于内源TCR基因座的CAR的iPSC。
[0358] 另外，我们已产生一种多西环素可诱导CAR表达的iPSC系。iPSCs是通过转导含有四环素响应元件(TRE)、CD19CAR和截断的LNGFR表面标记物作为共同识别标志的慢病毒进行基因工程改造。还对含有Tet开启式高级反式活化因子(rtTA)的个别慢病毒在iPSC中进行基因工程改造以产生TetCAR iPSC。为了测定多西环素可诱导系统TetCAR的效率，在多西环素存在下或不存在下培养iPSC且通过流式细胞术评估CAR和LNGFR标记物的表达。另外，针对Tra-181将iPSCs染色，以评估iPSC的多能品质。图32A表明在多西环素处理之后，约65％iPSC对于CAR和LNGFR的表达呈阳性，同时维持Tra-181表达。
[0359] 为了确定TetCAR iPSC是否具有增强的功能，使TetCAR iPSC分化10天以产生CD34+HE。分离出CD34+HE且使细胞再分化30天以产生iNK细胞。iNK细胞用多西环素处理24小时以诱导CAR表达。然后，通过与表达CD19的Raji B细胞淋巴瘤株系、不表达CD19的K562细胞或经工程改造以表达人类CD19的K562细胞共培养24小时来评估iNK细胞毒性。通过流式细胞术，根据靶细胞上的半胱天冬酶-3的表达来评估iNK介导的细胞毒性。图32B表明相较于未处理对照，经多西环素处理的TetCAR iNK细胞展现增强的细胞毒性，这证明CAR赋予iPSC源淋巴效应细胞增强的功能。
[0360] 实例20-产生包含通用接合体以便改善靶向特异性的iPSC
[0361] iPSC和衍生淋巴效应细胞(包括T、NK、NKT细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞)的细胞介导细胞毒性可以通过与双特异性或多特异性接合体偶联来进一步增强，所述接合体能够使效应细胞再导向标靶肿瘤细胞。一般来说，双特异性或多特异性接合的构思集中于使用双特异性或多特异性抗体使效应细胞再靶向特定肿瘤细胞，所述双特异性或多特异性抗体同时靶向肿瘤相关抗原和效应细胞表面上的活化受体。这种双特异性结合还刺激了效应细胞功能，引起有效的效应细胞活化且最终摧毁肿瘤细胞。由于效应细胞活化和肿瘤细胞杀死只在效应细胞和靶细胞通过双特异性接合体交联时才发生，因此其提供了安全控制机制。另外，通过这种再靶向接合体，绕过了主要组织相容性复合体(MHC)限制的活化。
[0362] 在肿瘤细胞一侧，可用于双特异性接合体偶联的已确定肿瘤相关抗原包括(但不限于)血液恶性疾病的CD19、CD20或CD30；实体肿瘤的EGFR(表皮生长因子受体)、HER2/ERBB2/neu(人类表皮生长因子受体2)、EPCAM(上皮细胞粘附分子)、EphA2(产生红细胞生成素的肝细胞癌A2)和CEA(癌胚抗原)。另外，表面双特异性抗体/接合体可以进一步包含其它特点，例如经生物素标记的蛋白质以增强双特异性接合和结合；表面膜锚定域用于长期的表面呈递；共刺激域以在双特异性相互作用后增强信号传导；以及实现接合体的可诱导或按时表达控制的接通和断开机制。
[0363] 双特异性接合体介导的效应细胞再靶向涉及效应细胞一侧的表面受体的偶联。天然存在的表面受体包括(但不限于)分别在T细胞、NKT细胞、NK细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞上表达的CD3、FcgRIII(CD16)、FcgRI(CD64)和FcaR(CD89)。另外，可以引入在效应细胞表面上表达的经工程改造的表面触发受体以便再靶向接合体偶联。不依赖于天然受体和细胞类型，经基因工程改造的表面触发受体促进了效应细胞与特定靶细胞之间的双特异性或多特异性抗体接合。使用这种方法，使得利用本文所公开的方法产生包含通用表面触发受体的iPSCs是可行的，且然后将此类iPSCs分化成表达通用表面触发受体的各种效应细胞类型的群体。一般来说，经工程改造的通用表面触发受体含有抗抗原决定基和共刺激域。表面触发受体的抗抗原决定基引导表达所述受体的任何效应细胞与在一个末端具有匹配抗原决定基的双特异性或多特异性接合体偶联。接合体在另一末端的靶向特异性使偶联效应细胞导向具有特异性抗原的肿瘤细胞以便杀死。对于通用表面触发受体来说，在一个实例中，所述共刺激域可以包含IL2蛋白质或其一部分，以实现典型或非典型的细胞活化和/或增强效应细胞功能，不论效应细胞类型。
[0364] 实例21-iPSC衍生的细胞产物具有更长的端粒长度，这代表着更大的增殖、存活和存留潜能
[0365] 端粒随着细胞老化而缩短且与干细胞功能障碍和细胞衰老相关。iPSC衍生细胞疗法的重要动机是iPSC衍生的细胞产物具有更长的端粒长度，这代表着更大的增殖潜能。为了评估iPSC源iNK细胞的端粒完整性，从第27天iNK细胞培养物和成人PB源NK细胞中分离出CD56+细胞。提纯之后，将每个样品与相等数目个参考细胞(端粒大于30kb的人类T细胞白血病细胞系(1301细胞系))合并。在每个样品/参考细胞混合物中，使DNA在不含探针的杂交溶液存在下或在含有荧光素结合的肽核酸(PNA)端粒探针(端粒PNA试剂盒，Dako Inc)的杂交溶液中变性。样品/参考细胞混合物在室温(RT)下在黑暗中培育整夜，然后洗涤以去除未结合的探针。将DNA染色溶液添加到所有样品中，然后在BD Fortessa X-20(BD Biosciences)上采集。相较于1301细胞系的相对端粒长度是按照每个样品与参考细胞(1301细胞系)的端粒信号之间的比率计算，相对于G0/1细胞的DNA指数校正。图31表明iNK细胞的端粒长度相较于两个个别成人NK细胞供体延长，但端粒长度相较于iPSC对照却缩短，使iPSC源NK细胞相较于供体NK细胞呈现更大的增殖、存活和存留潜能。
[0366] 实例22-低温保存的iPSC衍生细胞产物维持其作为功能细胞的分化潜能和遗传印记
[0367] 使用iPSC源ProT(T祖细胞)作为实例，评估iPSC衍生的细胞产物低温保存的能力；和关于iPSC衍生的祖细胞产物，评估其维持进一步分化成完全分化细胞的潜能。分选出的iPSCs源CD34+细胞在T细胞分化培养物中再分化10天。第10+10天，通过FACS分离出CD45+CD34+CD7+ProT细胞且在两个个别低温保存培养基中低温保存。低温保存ProT细胞且然后解冻且放回到T细胞分化培养物中。图35描绘proT细胞分离之前(A)、然后解冻后3天(B和C)的CD34和CD7的表达(根据流式细胞术)。第10+13天，低温保存的ProT细胞按照与未低温保存的ProT细胞(B)类似的方式进一步分化成CD34-CD45+CD7+细胞(C)。图35进一步表明ProT细胞在解冻后可存活(D)，且表明当在T细胞分化培养基中培养时细胞增殖增强(E)。
[0368] 在T细胞发育期间，造血祖细胞从骨髓迁移到胸腺以分化成ProT细胞。为了进一步表征iPSC源proT细胞，我们评估其向趋化因子迁移的能力，所述趋化因子已知表达于胸腺中以募集正发育的T细胞。第10+10天，根据标记物CD45+CD7+，通过FACS分离出iPSC源ProT细胞且将所述细胞接种于具有趋化因子CCL21、CCL25和SDF的跨孔迁移分析中。4小时之后，通过流式细胞术、使用Accucount量化颗粒(Spherotech,Lake Forest,IL)量化向趋化因子迁移的活ProT细胞的数目。图36A表明iPSC源ProT细胞能够成功地向CCL21和SDF迁移，为T细胞谱系定型提供进一步的证据。ProT细胞在进入胸腺后响应于胸腺环境而分泌细胞因子IFNγ、TNFα和IL2。为了评估iPSC源proT细胞响应于胸腺环境的能力，不刺激或用PMA+离子霉素(ionomycin)刺激iPSC源proT细胞、CB源proT细胞和周边血液T细胞4小时。4小时之后，收集细胞且针对IFNγ、TNFα和IL2染色。图36B表明iPSC源proT细胞能够响应而产生和分泌IFNγ和TNFα细胞因子。
[0369] 功能proT细胞的另一个特征是启动TCRγ基因座发生VDJ重组以产生功能T细胞受体。为了确定iPSC源ProT细胞是否已经启动VDJ重组，分离出基因组DNA。TCR基因重组之后失去的基因组区域(V-Jγ和V-DJβ)通过qPCR扩增作为胚系DNA的对照。还扩增保持不变的另一区域(Cβ2)作为胚系DNA的对照。获自成纤维细胞系的基因组DNA用于构建标准曲线。通过比较V-Jγ或V-DJβ的拷贝数与Cβ2的拷贝数来分别计算胚系构形中保留的TCRγ基因座或TCRβ基因座的百分比。FTi121iPSCs和由T细胞重编程的iPSC(TiPS C9.1)分别充当阴性和阳性对照。图37表明FTi121iPSC源ProT细胞的从TCRγ基因座中保留的胚系百分比相较于FTi121和TiPS C9.1减少，这表示它们的TCR基因座已开始重排且向T细胞谱系定型。
[0370] 所属领域的技术人员将容易了解，本文所述的方法、组合物和产物代表示例性实施例，且不希望限制本发明的范围。对于所属领域的技术人员显而易见的是，可以对本文所公开的本公开进行各种更替和润饰而不脱离本发明的范围和精神。
[0371] 本说明书中提到的所有专利和公开都表现出本发明所属领域的技术人员的技能水平。所有专利和公开均以引用的方式并入，其引用程度就如同每一个别公开被特别地且个别地指示以引用方式并入一般。
[0372] 本文说明性描述的本公开可以在本文未特别公开的任何成分、限制不存在的情况下适当地实施。因此，例如，在本文中的每一种情况下，术语“包含”、“主要由……组成”和“由……组成”中的任一个可以用其它两个术语中的任一个替换。已使用的术语和表述是作为描述而非限制的术语使用，且使用这类术语及表述时，不希望排除所示和所述特点的任何等效物或其一部分，而是应认识到，在所要求的本公开的范围内可以存在各种润饰。因此，应理解，虽然本公开已通过优选实施例和任选存在的特点进行特别地公开，但所属领域的技术人员可以对本文中所公开的观点进行润饰和变更，且这类润饰和变更被视为属于如所附权利要求书限定的本发明范围内。
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