鳞状细胞癌的预后和治疗
阅读：268发布：2020-05-15
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1.在受试者中诱导肿瘤的体内清除的方法，所述方法包括以足以逆转肿瘤微环境中的免疫抑制的量向所述受试者施用诱导受试者中抗肿瘤免疫应答的分离的CXCL14蛋白或包含分离的CXCL14蛋白的药物组合物，从而诱导从受试者清除肿瘤。
2.权利要求1的方法，其中所述肿瘤是头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
3.权利要求1的方法，其中与非肿瘤组织相比，所述肿瘤具有至少2倍的CXCL14表达的降低。
4.权利要求1的方法，其中所述肿瘤是人类乳头瘤病毒阳性(HPV+)肿瘤。
5.权利要求1的方法，其中足以逆转所述肿瘤微环境中的免疫抑制的量是足以降低包括CXCL1和/或CXCL2在内的趋化因子的CXCL14的量。
6.权利要求1的方法，其还包括：获得来自个体的生物样品，分析所述生物样品以确定所述样品中CXCL14蛋白的存在或不存在或量或活性，并基于所述样品中CXCL14蛋白的存在、不存在、量或活性确定是否施用治疗。
7.权利要求6的方法，其中所述样品是唾液样品。
8.权利要求1的方法，其还包括：获得来自个体的生物样品，分析所述生物样品以确定所述样品中CXCL14mRNA转录物水平，并基于所述样品中CXCL14mRNA转录物水平确定是否施用治疗。
9.权利要求8的方法，其中所述样品是唾液样品。
10.权利要求1的方法，其还包括：获得来自个体的生物样品，分析所述生物样品以确定所述样品中CXCL14基因高甲基化状态，并根据所述样品中CXCL14基因高甲基化状态来确定是否施用治疗。
11.权利要求10的方法，其中所述样品是唾液样品。
12.用于患有HPV+肿瘤的受试者的过继性细胞转移治疗的组合物，其包含CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞。
13.权利要求12的组合物，其中通过方法来生产CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞，所述方法包括获得免疫相容的CD8+T和NK细胞并将所述细胞在一定条件下与CXCL14蛋白接触一段时间，所述条件和时间足以产生CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞。
14.治疗患有HPV+肿瘤的受试者的方法，其包括向所述受试者过继性细胞转移CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述肿瘤是HPV+头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
16.权利要求14的方法，其还包括首先分析来自所述受试者的生物样品以确定所述样品中选自下组的生物标志物：
a.CXCL14蛋白活性的存在或不存在或活性；
b.CXCL14mRNA转录物水平；和
c.CXCL14基因高甲基化；并且，
基于所述样品中CXCL14蛋白活性的存在、不存在或量或活性或CXCL14mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化来确定是否施用所述过继性细胞转移治疗。
17.权利要求16的方法，其中所述生物样品是唾液样品。
18.权利要求16的方法，其还包括如果发现CXCL14蛋白水平或活性基本上低于野生型或对照蛋白质活性水平，则将CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞过继性细胞转移至所述受试者。
19.权利要求16的方法，其还包括如果发现所述样品中CXCL14mRNA转录物水平基本上低于野生型或对照CXCL14mRNA水平，则将CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞过继性细胞转移至所述受试者。
20.权利要求16的方法，其还包括如果发现所述样品中CXCL14基因高甲基化水平基本上高于野生型或对照CXCL14基因高甲基化水平，则将CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞过继性细胞转移至所述受试者。
21.在受试者中早期诊断鳞状细胞癌的方法，其包括确定来自所述受试者的生物样品中选自下组的至少一种生物标志物：
a.CXCL14基因表达；
b.CXCL14基因启动子甲基化；和，
c.CD8+T和/或NK细胞浸润至HPV+肿瘤中；和，
d.CD8+T和/或NK细胞浸润至区域淋巴结中。
22.权利要求21的方法，其中所述生物样品中的CXCL14基因表达诊断出所述受试者患者中的HPV+肿瘤。
23.权利要求21的方法，其中所述生物样品中较高的CXCL14基因启动子甲基化诊断出所述受试者患者中的HPV+肿瘤。
24.权利要求21的方法，其中所述生物样品是HNSCC肿瘤样品，并且所述较高的CD8+T和/或NK细胞浸润至所述HNSCC肿瘤中诊断出所述受试者患者中的HPV+HNSCC肿瘤。
25.权利要求21的方法，其中所述生物样品是唾液样品。
26.权利要求21的方法，其中所述鳞状细胞癌是HPV+头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
27.确定HPV+肿瘤患者预后的方法，其包括确定来自所述患者的生物样品中选自下组的至少一种生物标志物：
a.CXCL14基因表达；
b.CXCL14基因启动子甲基化；和，
c.CD8+T和/或NK细胞浸润至HPV+肿瘤中；和，
d.CD8+T和/或NK细胞浸润至区域淋巴结中。
28.权利要求28的方法，其中所述生物样品中的CXCL14基因表达预测HPV+肿瘤患者的较好的临床结果。
29.权利要求28的方法，其中所述生物样品中较高的CXCL14基因启动子甲基化预测HPV+肿瘤患者的较差的临床结果。
30.权利要求28的方法，其中所述生物样品是HNSCC肿瘤样品，并且所述较高的CD8+T和/或NK细胞浸润至所述HNSCC肿瘤中预测HPV+肿瘤患者的较好的临床结果。
31.权利要求28的方法，其中所述生物样品是唾液样品。
32.权利要求28的方法，其中所述HPV+肿瘤是HPV+头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
33.对于HPV+肿瘤进展确定HPV+肿瘤患者的预后的体外方法，其包括以下步骤：
a.在来自癌症患者的生物样品中定量指示针对所述癌症的所述患者的免疫应答状态的至少一种生物标志物；并且
b.将步骤a)处对所述至少一种生物标志物获得的值与针对相同生物标志物的预定参考值相比较，所述预定参考值与癌症进展的特定预后和/或对HPV+肿瘤疗法的响应相关联。
34.权利要求33的方法，其中步骤a)包括在所述生物样品中定量选自以下的一种或多种生物标志物：CXCL14蛋白的存在或不存在或CXCL14蛋白活性、CXCL14mRNA转录物水平，和CXCL14基因高甲基化状态。
35.权利要求33的方法，其中所述至少一种生物标志物与患者的下列至少一项正相关或负相关：
i)T阶段(T1-2对T3-4)和组织学分级(中度、较差或未分化)；
ii)淋巴结转移(N0-N2a对N2b-N3)；和，
ii)临床结果(总存活，无进展存活和复发)。
36.权利要求33的方法，其中所述HPV+肿瘤是HPV+头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
37.权利要求33的方法，其中所述生物样品是唾液样品。
38.试剂盒，其包含用于确定来自受试者的生物样品中CXCL14蛋白活性的存活或不存在，或CXCL14mRNA转录物水平，或CXCL14基因高甲基化状态的试剂。
39.权利要求38的试剂盒，其还包括确定个体自发清除包含HPV+HNSCC在内的HPV+肿瘤的能力的说明书。
40.权利要求38的试剂盒，其还包含用于治疗患有包含HPV+HNSCC在内的HPV+肿瘤的个体的说明书。
41.权利要求38的试剂盒，其还包含使用在所述受试者中诱导抗肿瘤免疫应答的分离的CXCL14蛋白，或包含分离的CXCL14蛋白的药物组合物来治疗个体的说明书。
42.权利要求38的试剂盒，其还包含在所述受试者中诱导抗肿瘤免疫应答的分离的CXCL14蛋白，或包含分离的CXCL14蛋白的药物组合物。
43.权利要求38的试剂盒，其还包含用包含CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞的过继性细胞转移组合物来治疗个体的说明书。
44.权利要求38的试剂盒，其还包含含有CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞的过继性细胞转移组合物。
45.权利要求38的试剂盒，其还包含用于确定患者中HNSCC癌症的诊断或预后进展的说明书。
46.权利要求38的方法，其还包含参考值或对照样品，其用于比较自生物样品获得的CXCL14蛋白活性的不存在或者水平或CXCL14mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化的值。
47.权利要求46的试剂盒，其中所述生物样品是唾液样品。
48.权利要求38的试剂盒，其还包括随时间在来自所述受试者的样品中通过监视CXCL14蛋白活性的存在、不存在或水平，或CXCL14mRNA转录物，或CXCL14基因高甲基化的状态用试剂监测受试者的治疗(辅助或新辅助)的有效性的说明书。
49.权利要求48的试剂盒，其中所述样品是唾液样品。
50.经修饰的CXCL14蛋白，其通过降低包含至少CXCL1和/或CXCL2的趋化因子来逆转肿瘤微环境中的免疫抑制来诱导哺乳动物中HPV阳性(HPV+)肿瘤的体内清除，所述蛋白包含通过选自以下的至少一种修饰来修饰的CXCL14：PEG化、乙酰基化、糖基化和与Fc蛋白共价连接。
51.诱导受试者中肿瘤的体内清除的方法，所述方法包括以足以逆转肿瘤微环境中免疫抑制的量向所述受试者施用在所述受试者中诱导抗肿瘤免疫应答的分离的CXCL14蛋白或包含分离的CXCL14蛋白的药物组合物，从而诱导从所述受试者中清除肿瘤。
52.权利要求51的方法，其中所述肿瘤是头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
53.权利要求51或52的方法，其中与非肿瘤组织相比，所述肿瘤具有至少2倍的CXCL14表达的降低。
54.权利要求51-53中任一项的方法，其中所述肿瘤是人类乳头瘤病毒阳性(HPV+)肿瘤。
55.权利要求51-54中任一项的方法，其中足以逆转所述肿瘤微环境中的免疫抑制的量是足以降低包括CXCL1和/或CXCL2在内的趋化因子的CXCL14的量。
56.权利要求51-55中任一项的方法，其还包括：获得来自个体的生物样品，分析所述生物样品以确定所述样品中CXCL14蛋白的存在或不存在或量或活性，并基于所述样品中CXCL14蛋白的存在、不存在、量或活性来确定是否施用治疗。
57.权利要求56的方法，其中所述样品是唾液样品。
58.权利要求51-55中任一项的方法，其还包括：获得来自个体的生物样品，分析所述生物样品以确定所述样品中CXCL14mRNA转录物水平，并基于所述样品中CXCL14mRNA转录物水平来确定是否施用治疗。
59.权利要求58的方法，其中所述样品是唾液样品。
60.权利要求51-55中任一项的方法，其还包括：获得来自个体的生物样品，分析所述生物样品以确定所述样品中CXCL14基因高甲基化状态，并根据所述样品中CXCL14基因高甲基化状态来确定是否施用治疗。
61.权利要求60的方法，其中所述样品是唾液样品。
62.用于患有HPV+肿瘤的受试者的过继性细胞转移治疗的组合物，其包含CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞。
63.权利要求62的组合物，其中通过方法来生产CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞，所述方法包括获得免疫相容的CD8+T和NK细胞并将所述细胞在一定条件下与CXCL14蛋白接触一段时间，所述条件和时间足以产生CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞。
64.治疗患有HPV+肿瘤的受试者的方法，其包括向所述受试者过继性细胞转移CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞。
65.权利要求64的方法，其中所述肿瘤是HPV+头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
66.权利要求64或65的方法，其还包括首先分析来自所述受试者的生物样品以确定所述样品中选自下组的的生物标志物：
a.CXCL14蛋白活性的存在或不存在或活性；
b.CXCL14mRNA转录物水平；和
c.CXCL14基因高甲基化；并且，
基于所述样品中CXCL14蛋白活性的存在、不存在或量或活性或CXCL14mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化来确定是否施用所述过继性细胞转移治疗。
67.权利要求66的方法，其中所述生物样品是唾液样品。
68.权利要求66或67的方法，其还包括如果发现CXCL14蛋白水平或活性基本上低于野生型或对照蛋白质活性水平，则将CXCL14诱导的CD8+T和NK细胞过继性细胞转移至所述受试者。
69.权利要求66或67的方法，其还包括如果发现所述样品中CXCL14mRNA转录物水平基本上低于野生型或对照CXCL14mRNA水平，则将CXCL14-诱导的CD8+T和NK细胞过继性细胞转移至所述受试者。
70.权利要求66或67的方法，其还包括如果发现所述样品中CXCL14基因高甲基化水平基本上高于野生型或对照CXCL14基因高甲基化水平，则将CXCL14-诱导的CD8+T和NK细胞过继性细胞转移至所述受试者。
71.在受试者中早期诊断鳞状细胞癌的方法，其包括确定来自所述受试者的生物样品中选自下组的至少一种生物标志物：
a.CXCL14基因表达；
b.CXCL14基因启动子甲基化；和，
c.CD8+T和/或NK细胞浸润至HPV+肿瘤中；和，
d.CD8+T和/或NK细胞浸润至区域淋巴结中。
72.权利要求71的方法，其中所述生物样品中CXCL14基因表达诊断出所述受试者患者中的HPV+肿瘤。
73.权利要求71或72的方法，其中所述生物样品中较高的CXCL14基因启动子甲基化诊断出所述受试者患者中的HPV+肿瘤。
74.权利要求71的方法，其中所述生物样品是HNSCC肿瘤样品，并且所述较高的CD8+T和/或NK细胞浸润至所述HNSCC生物样品中诊断出所述受试者患者中的HPV+HNSCC肿瘤。
75.权利要求71-74中任一项的方法，其中所述生物样品是唾液样品。
76.权利要求71-75中任一项的方法，其中所述鳞状细胞癌是HPV+头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
77.确定肿瘤患者如HPV+肿瘤患者中的预后的方法，其包括确定来自所述患者的生物样品中选自下组的至少一种生物标志物：
a.CXCL14基因表达；
b.CXCL14基因启动子甲基化；和，
c.CD8+T和/或NK细胞浸润至HPV+肿瘤中；和，
d.CD8+T和/或NK细胞浸润至区域淋巴结中。
78.权利要求77的方法，其中所述生物样品中CXCL14基因表达预测HPV+肿瘤患者的较好的临床结果。
79.权利要求77或78的方法，其中所述生物样品中较高的CXCL14基因启动子甲基化预测HPV+肿瘤患者的较差的临床结果。
80.权利要求77-79中任一项的方法，其中所述生物样品是HNSCC肿瘤样品，并且所述较高的CD8+T和/或NK细胞浸润至所述HNSCC肿瘤中预测HPV+肿瘤患者的较好的临床结果。
81.权利要求77-79中任一项的方法，其中所述生物样品是唾液样品。
82.权利要求77-81中任一项的方法，其中所述HPV+肿瘤是HPV+头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
83.对于HPV+肿瘤进展确定HPV+肿瘤患者的预后的体外方法，其包括以下步骤：
a.在来自癌症患者的生物样品中定量指示针对所述癌症的所述患者的免疫应答状态的至少一种生物标志物；并且
b.将步骤a)处对所述至少一种生物标志物获得的值与针对相同生物标志物的预定的参考值相比较，所述预定的参考值与癌症进展的特定预后和/或对HPV+肿瘤疗法的响应相关联。
84.权利要求83的方法，其中步骤a)包含在所述生物样品中定量选自以下的一种或多种生物标志物：CXCL14蛋白的存在或不存在或CXCL14蛋白活性、CXCL14mRNA转录物水平，和CXCL14基因高甲基化状态。
85.权利要求83或84的方法，其中所述至少一种生物标志物与患者的下列至少一项正相关或负相关：
iii)T阶段(T1-2对T3-4)和组织学分级(中度、较差或未分化)；
ii)淋巴结转移(N0-N2a对N2b-N3)；和，
iv)临床结果(总存活，无进展存活和复发)。
86.权利要求83-85中任一项的方法，其中所述HPV+肿瘤是HPV+头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
87.权利要求83-86中任一项的方法，其中所述生物样品是唾液样品。
鳞状细胞癌的预后和治疗
[0001] 政府利益
[0004] 发明背景
[0005] 人乳头瘤病毒(HPV)与包括宫颈癌和头颈癌(HNC)在内的多种人类癌症因果关联并导致每年全球约有50万例死亡(1,2)。HPV相关的癌症进展是多步骤过程，其中一些分子变化的累积效应最终导致最初感染后数十年的癌症。虽然大多数性活跃的女性感染有HPV，仅约10-20％建立持续的HPV感染并发展为癌前病变。在这些癌前病变中，只有一小部分会进展为侵入性癌症(4)。
[0006] HPV相关的口咽鳞状细胞癌(HNSCC)发病率继续急剧增加并且到2020年，它可能占美国和全世界所有HNSCC病例的大多数。在几十年的HNSCC进展中，HPV持续存在，逃避宿主监测，并持续促成宿主细胞增殖和转化。然而，有关HPV驱动的HNSCC疾病进展的分子机制知之甚少，特别是在宿主免疫的背景下。
[0007] 发明概述
[0008] 发明人已经发现CXCL14在HPV阳性癌症中显著下调。CXCL14的HPV抑制取决于HPV癌蛋白E7并与CXCL14启动子中的高甲基化有关。体内测试揭示了鼠CXCL14再表达清除了有免疫能力的同基因(immunocompetent syngeneic)小鼠中的HPV阳性肿瘤，并显著增加了肿瘤和肿瘤引流淋巴结中CD8+ T和自然杀伤细胞群体。
[0009] 因此，本公开的一方面是分离的CXCL14蛋白。分离的CXCL14蛋白可诱导受试者中抗肿瘤免疫应答。分离的CXCL14蛋白可诱导哺乳动物中体内肿瘤清除。通过降低包括CXCL1和/或CXCL2在内的数种趋化因子的存在和/或效果，分离的CXCL14蛋白可逆转肿瘤微环境中的免疫抑制。分离的CXCL14蛋白可诱导哺乳动物中HPV阳性(HPV+)肿瘤的体内清除。分离的CXCL14蛋白可以是分离的CXCL14变体，其在其全长上与野生型CXCL14蛋白至少92％相同或至少95％相同，或至少99％相同，而保持在受试者中诱导抗肿瘤免疫应答的体内生物学活性。
[0010] 分离的CXCL14蛋白可以是包含重组人CXCL14蛋白的重组CXCL14蛋白。分离的CXCL14蛋白也可以是包含诸如以下修饰的经修饰的蛋白质：共价连接至Fc蛋白、糖基化、乙酰基化、PEG化，和/或连接至纳米颗粒，如金属(如金)纳米颗粒。因此，CXCL14蛋白可以作为连接至IgG的Fc结构域，和/或IgG的重链，和/或IgG的轻链的融合蛋白来提供和/或施用。CXCL14-Fc的融合多肽/蛋白构建体也可以经由乙酰基化或PEG化修饰。
[0011] 另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含如上所述的分离的CXCL14蛋白，包含其经修饰的或融合构建体，以及药学上可接受的赋形剂。
[0012] 另一方面，本公开提供了在受试者中诱导肿瘤的体内清除的方法，所述方法包括以足以诱导清除来自患者的HPV+肿瘤的量向受试者施用本文所述的任何分离的CXCL14蛋白，或其经修饰的版本，或药物组合物。与非肿瘤组织或对照组织相比，肿瘤可具有至少2倍，或3倍，或4倍的CXCL14表达的降低。或者或另外，与非肿瘤组织或对照组织相比，肿瘤可具有至少10％，或20％，或30％或40％，或50％，或更高的CXCL14表达降低。肿瘤可以是HPV+肿瘤，如HPV+头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、宫颈癌或外阴、阴道、阴茎或肛门的肛门生殖器癌症。
[0013] 治疗患有癌症的患者的这些方法可以包括获得来自个体的生物样品，分析所述样品以确定样品中CXCL14蛋白，或CXCL14 mRNA转录物水平，或CXCL14基因高甲基化的存在或不存在，并基于样品中CXCL14蛋白，或CXCL14 mRNA转录物水平，或CXCL14基因高甲基化的存在或不存在或量确定是否施用治疗。如果发现CXCL14蛋白活性基本上低于野生型或对照蛋白质活性水平，则可以施用本公开的分离的CXCL14蛋白或药物组合物。如果发现所述样品中CXCL14 mRNA转录物水平基本上低于野生型或对照CXCL14 mRNA水平，则可以施用本公开的分离的CXCL14蛋白或药物组合物。如果发现所述样品中CXCL14基因高甲基化水平基本上高于野生型或对照CXCL14基因高甲基化水平，则可以施用本公开的分离的CXCL14蛋白或药物组合物。
[0014] 本发明人还证明了Cxcl14表达增加了CD8+ T和NK细胞浸润至肿瘤和肿瘤引流淋巴结(TDLN)中。他们也显示了Cxcl14表达肿瘤细胞刺激CD8+ T和NK细胞迁移但对巨噬细胞和CD4+ T细胞几乎没有影响。这些结果显示，CXCL14通过募集CD8+ T和NK细胞进入肿瘤微环境(TME)而在肿瘤清除中起关键作用。
[0015] 因此，本公开的一方面是用于患有HPV+肿瘤的受试者的过继性细胞转移治疗的组合物，所述组合物包含CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞。CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞可以通过方法产生，所述方法包括免疫相容的CD8+ T和NK细胞并将所述细胞在一定条件下与CXCL14蛋白接触一段时间，所述条件和时间足以产生CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞，可以将所述细胞过继转移至受试者。
[0016] 本公开的相关方面是通过向受试者过继性细胞转移CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞来治疗患有HPV+肿瘤的受试者的方法。肿瘤可以是HPV+HNSCC。所述方法可以包括首先分析来自受试者的生物样品，包括肿瘤样品以确定所述样品中CXCL14蛋白活性或CXCL14 mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化的存在或不存在，并基于样品中CXCL14蛋白活性或CXCL14mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化的存在、不存在或量来确定是否施用所述过继性细胞转移治疗。如果发现CXCL14蛋白活性基本上低于野生型或对照蛋白质活性水平，则可以施用CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞的过继性细胞转移。如果发现所述样品中CXCL14 mRNA转录物水平基本上低于野生型或对照CXCL14 mRNA水平，则可以施用CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞的过继性细胞转移。如果发现所述样品中CXCL14基因高甲基化水平基本上高于野生型或对照CXCL14基因高甲基化水平，则可以施用CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞的过继性细胞转移。
[0017] 除了简单的HPV检测外，很少有可用于指导HPV+ HNSCC中的患者治疗的预测性生物标志物。目前，用比HPV-患者更低的放化疗来治疗HPV+HNSCC患者。
[0018] 常规治疗(手术和/或放化疗)后，大多数HPV+ HNSCC患者具有比HPV- HNSCC患者更好的预后。然而，HPV+ HNSCC患者亚组显示转移至局部区域淋巴结，并且单独的结转移可将患者的总存活率降低近50％，使得结转移状态成为HNSCC中最重要的预后因素之一。此外，具有结转移的HPV+HNSCC的亚组与不具有结疾病的HPV+ HNSCC相比具有较差的预后和较低的生存率(70％比93％)。
[0019] 发明人已经显示了在与HPV相关的癌症进展期间存在明显的趋化因子变化，其中CXCL14蛋白显著减少并且CXCL14启动子高甲基化增加。另外，发明人已经显示了CXCL14启动子高甲基化在唾液和组织中都是可检测的。并且如前所述，通过增加肿瘤和淋巴结中CD8+ T和NK细胞群体，CXCL14表达清除肿瘤细胞。
[0020] 因此，本公开的一方面是CXCL14表达/启动子甲基化和/或CD8+ T和NK细胞浸润作为预后标志物以确定免疫应答和预测HPV+ HNSCC患者中临床结果的用途。在这些方法中，CXCL14表达/启动子甲基化可以与CD8+ T和NK细胞浸润到肿瘤微环境内相关联。在这些方法中，在没有结转移的HPV+HNSCC患者中，CXCL14表达/启动子甲基化可以预示更好的临床结果。
[0021] 本方面提供了用于预测HNSCC患者的癌症进展预后的体外方法，其包括以下步骤：a)在来自HNSCC患者的生物样品(其可以是肿瘤组织样品)中定量指示患者针对癌症的免疫应答状态的至少一种生物标志物；和b)将步骤a)处对所述至少一种生物标志物获得的值与针对相同生物标志物的预定参考值相比较，所述预定参考值与癌症进展的特定预后和/或对HPV+肿瘤疗法的响应相关联。在这些方法中，步骤a)可以包括在生物样品中定量选自以下的一种或多种生物标志物：CXCL14蛋白活性或CXCL14 mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化的存在或不存在。在这些方法中，CXCL14表达和/或启动子甲基化和/或CD8+ T和NK细胞肿瘤浸润与患者的下列至少一项正相关或负相关：
[0022] i)T阶段(T1-2对T3-4)和组织学分级(中度、较差或未分化)；
[0023] ii)淋巴结转移(N0-N2a对N2b-N3)；和，
[0024] ii)临床结果(总存活，无进展存活和复发)。
[0025] 本公开还提供了用于确定样品中CXCL14蛋白活性或CXCL14 mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化的存在、不存在或水平的试剂盒。试剂盒可以包含用于确定来自受试者的样品中CXCL14蛋白活性或CXCL14 mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化的存在或不存在的试剂。试剂盒可以包括确定个体自发清除包含HPV+ HNSCC在内的HPV+肿瘤的能力的说明书。试剂盒可以包括用于治疗患有包含HPV+ HNSCC在内的HPV+肿瘤的个体的说明书。试剂盒可以包括用本公开的分离的CXCL14蛋白或药物组合物治疗个体的说明书。试剂盒可以包含用包含本公开的CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞的过继性细胞转移组合物来治疗个体的说明书。试剂盒还可以包括用于确定患者中HNSCC癌症的进展预后的说明书。试剂盒还可以包括参考值或对照样品，其用于比较自生物样品获得的CXCL14蛋白活性或CXCL14 mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化的不存在或者水平的值。试剂盒还可以包括随时间在来自所述受试者的样品中通过监视CXCL14蛋白活性或CXCL14 mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化的存在、不存在或水平的状态用试剂监测受试者的治疗(辅助或新辅助)的有效性的说明书。
[0026] 本概述既不意图也不应被解释为代表本发明的全部程度和范围。此外，本文对“本公开”或其方面所作的提及应理解为是指本公开的某些实施方案，并且不应必然解释为将所有实施方案限于特定描述。在本概述中以及在附图和实施方案的描述中以各种详细水平阐述了本公开内容，在本概述中不意图通过元件、组件等的纳入或不纳入限制本发明的范围。根据实施方案的描述，特别是当结合附图考虑时，本公开的其他方面将变得更加明显。
[0027] 附图简述
[0028] 图1显示了HPV相关癌症进展期间的趋化因子表达变化。如所示，从不同疾病阶段的128个宫颈组织分析了所有已知趋化因子的基因表达水平。
[0029] 图2显示了CXCL14表达在CxCa和HPV+ HNSCC组织中下调。使用128个宫颈(A)和42个HNSCC(B；HPV- HNSCC,n＝26；HPV+ HNSCC,n＝16)组织样品分析了CXCL14 mRNA表达水平。在盒须图(box-and-whisker plot)中用针对异常值(黑方块)的Tukey氏方法显示了基因表达的标准化荧光强度。通过单因素ANOVA分析(A)或Student t检验(B)来确定每次转换之间或HPV-与HPV+HNC之间的P-值。
[0030] 图3显示了图3。HPV+角质形成细胞中CXCL14表达降低。从指示的角质形成细胞系提取总RNA。通过RT-qPCR来测量CXCL14 mRNA的表达水平。数据显示为由β-肌动蛋白标准化的相对表达(±SD)(A-C)。(D)使用CXCL14抗体(R&D Systems)，用NIKS和NIKS-16细胞进行了CXCL14的ICC。
[0031] 图4显示了HPV+细胞中CXCL14启动子高甲基化。提取了基因组DNA并用亚硫酸氢盐处理。如(Song 2010)所述进行了MSP(A&C)和亚硫酸氢盐测序(B)。(C)对照CXCL14启动子和高甲基化的CXCL14启动子的MSP产物分别表示为“C”和“M”。
[0032] 图5显示了HPV+ HNSCC(A)和CxCa进展(B)中DNMT1上调。如图1所述，使用42个头颈癌(A)和128个宫颈癌(B)组织样品分析了DNMT1mRNA水平。通过Student t检验计算HPV-和HPV+ HNSCC之间的P-值或通过单因素ANOVA分析计算每个转变间的P-值。(C)通过RT-qPCR测量DNMT1mRNA表达水平。通过Student t检验来确定P值。*p<0.001,**p<0.01。
[0033] 图6显示了通过甲基化抑制剂的CXCL14再表达。用10μM地西他滨或媒介物(vehicle)对照处理CaSki细胞6天。分别使用总RNA和基因组DNA来进行RT-qPCR和MSP。
[0034] 图7显示了小鼠口腔上皮细胞中Cxcl14表达和启动子甲基化。从小鼠上皮细胞系、MOE/shPTPBL(HPV-)和MOE/E6E7(HPV+)中提取总RNA。通过RT-qPCR测量Cxcl14 mRNA水平。通过Student t检验来计算表P值。p<0.0002。
[0035] 图8显示了Cxcl14表达清除有免疫能力的小鼠而非Rag1缺陷小鼠中的HPV+肿瘤。将表达Cxcl14的两个MOE/E6E7细胞克隆(克隆8和16)以及一个含有载体的MOE/E6E7细胞克隆注射入野生型(A&B)和Rag1-/-(C&D)B6小鼠的右后体侧(n＝10,每组野生型；n＝7,每组Rag1-/)。(A&C)通过以下公式每周确定肿瘤生长：体积＝(宽度)2x长度。使用Kaplan-Meier估计器分析存活率。(B&D)对于每个组(仅载体、Cxcl14-克隆8、Cxcl14-克隆16)确定了事件前时间(time-to-event)，其中所述事件为大于2,500mm3的肿瘤负荷。审查了与肿瘤无关的死亡。通过时序检验确定P值。
[0036] 图9显示了CXCL14增加了肿瘤和淋巴结中的CD8+ T和NK细胞群体。将具有Cxcl14(克隆#8和#16)或载体的MOE/E6E7细胞注射入B6小鼠的右体侧(n＝3，每组)。注射后21天收获肿瘤(A)和淋巴结(B)组织。通过流式细胞术测定免疫细胞群的百分比。
[0037] 图10显示了CXCL14诱导CD8+ T和NK细胞的趋化性。将具有Cxcl14或载体的MOE细胞培养于Transwell的底部室中。将脾细胞添加到上部室中。12小时孵育后，收集迁移至底部室的脾细胞，并通过流式细胞术分析。
[0038] 图11显示了由Cxcl14诱导的CD8+ T和NK细胞的过继性转移。
[0039] 图12显示了配体受体复合物TriCEPS技术的工作流程。
[0040] 图13显示了CXCR7下调和启动子高甲基化。(A)如前所述进行微阵列。显示的是基于相对荧光强度的mRNA表达。(B)从与(A)相同的NIKS细胞批次提取基因组DNA，通过亚硫酸氢盐反应转化，并在Illumina Infinium 450K甲基化珠芯片上杂交。显示的是甲基化对NIKS中的甲基化的百分比变化。所有样品都是一式三份的。
[0041] 图14显示了Cxcl14减少Rag1-/-小鼠中髓样来源的抑制细胞(MDSC)。将表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞克隆(8和16)和一个含有载体的MOE/E6E7细胞克隆注射入Rag1-/-小鼠(n＝4，每组)。注射后23天收获肿瘤(A)和脾脏(B)，均质化，并通过流式细胞术分析。使用抗MHCII、抗Gr1，和抗CD11b+抗体来确定MDSC细胞的相对丰度(A&B)。
[0042] 图15显示了CXCR2配体的表达在CxCa和HNSCC患者中上调。使用128个宫颈和56个头颈组织样品分析了CXCL1/2和IL-8mRNA水平。使用针对异常值(黑圈)的Tukey方法在盒须图中显示每个组的mRNA表达的标准化荧光强度。通过单因素ANOVA分析确定P值。
[0043] 图16显示了Cxcl14表达降低了Treg细胞。将表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞克隆(8和16)和一个含有载体的MOE/E6E7细胞克隆注射入B6小鼠的右后体侧(n＝3,每组)。注射后21天收集脾脏并通过流式细胞术分析。使用抗CD4和CD25抗体来确定Treg细胞的相对丰度。
[0044] 图17显示了患者唾液样品中CXCL14启动子高甲基化的检测。从唾液样品提取基因组DNA并用亚硫酸氢盐处理。如图4所述进行MSP。
[0045] 定义
[0046] 如本文所用，术语“约”意指所述值的+/-10％。
[0047] 如本文所用，术语分离的、纯化的等不一定是指本发明的细胞或分子的纯度。相反，此类术语是指已经从其天然环境或从产生它们的环境的组分中分离出来的细胞或分子。例如，存在于包括人在内的活动物中的天然存在的细胞或分子(例如DNA分子，蛋白质等)不是分离的。然而，自动物中的一些或全部共存材料分离的相同细胞或分子被认为是分离的。作为另一个例子，根据本发明，存在于从个体获得的血液样品中的蛋白质分子将被认为是分离的。应该理解，根据分离的并不指细胞的纯度的概念，使用进一步纯化步骤从此类血液样品中获得的蛋白质分子也称为分离的。此外，本发明的分离的CXCL14蛋白可以例如从其天然来源(如人)获得，使用重组DNA技术产生或化学合成。
[0048] “药物组合物”意指含有本公开的CXCL14蛋白或诱导的T细胞的组合物，其用药学上可接受的赋形剂配制，并经政府监管机构批准作为治疗哺乳动物疾病的治疗方案的一部分生产或销售。药物组合物可以配制成例如以单位剂型(例如片剂、胶囊、囊片(caplet)、凝胶胶囊(gelcap)或糖浆剂)口服施用；局部施用(例如，作为霜剂、凝胶剂、洗剂或软膏剂)；静脉内施用(例如，作为无颗粒栓的无菌溶液和在适于静脉内使用的溶剂体系中)，或者配制成本文所述的任何其它配制剂。
[0049] “药学上可接受的赋形剂”意指除本文描述的CXCL14蛋白和/或诱导的T细胞以外的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)并具有在患者中无毒且无炎性的特性。赋形剂例如可以包括：防粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣(coating)、压缩助剂(compression aid)、崩解剂、染料(染色剂)、润滑剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、香料(flavor)、香味剂(fragrances)、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨(printing ink)、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水(waters of hydration)。示例性的赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二元)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟乙酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C，和木糖醇。
[0050] 术语个体、受试者和患者在本领域中是公认的，并且在本文中可互换使用以指代哺乳动物，其包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，和最优选地，人。受试者可以需要抗癌治疗。术语个体、受试者和患者本身并不表示特定的年龄、性别、种族等。因此，任何年龄的个体，无论雄性或雌性旨在涵盖于本公开中。类似地，本发明的方法可应用于任何种族，例如包括高加索人(白人)、非裔美国人(黑人)、美洲原住民、夏威夷原住民、西班牙人、拉丁美洲人、亚洲人和欧洲人。在本发明的一些实施方案中，此类特征是重要的。在此种情况下，将指示重要的特征(年龄、性别、种族等)。
[0051] 如本文所用，“治疗”或“处理”是用于获得有益或期望的结果(例如临床结果)的方法。有益的或期望的结果可以包括但不限于，减轻或改善一种或多种症状或病患；减少疾病、病症或病患的程度；稳定(即，不恶化)疾病、病症或病患的状态；防止疾病、病症或病患的传播；延迟或延缓疾病、病症或病患的进展；改善或减轻疾病、病症或病患；和消退(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是检测不到的。“缓和(palliate)”疾病、病症或病患意指与在没有治疗的情况下的程度或时间过程相比，疾病，病症或病患的程度和/或不想要的临床表现得以减轻和/或进展的时间过程得以减慢或延长。“治疗癌症”、“预防癌症”或“抑制癌症”意指导致肿瘤大小或癌细胞数量减少，减缓或抑制肿瘤大小的增加或癌细胞增殖，增加肿瘤或其它癌症消失与其再次出现之间的无疾病存活时间，预防或减少初始或随后发生肿瘤或其它癌症的可能性，或减少与肿瘤或其它癌症相关的不良症状。在期望的实施方案中，如使用任何标准测定所测量的，幸免于治疗的肿瘤或癌性细胞的百分比比肿瘤或癌性细胞的初始数量低至少20、40、60、80或100％。期望地，通过施用本公开内容的肽或诱导的免疫细胞，肿瘤或癌性细胞的数量的减少与非肿瘤或非癌性细胞数量的减少相比大至少2、5、10、20或50倍。期望地，如使用标准方法测定的，本公开的方法导致肿瘤大小或癌性细胞数量减少20、40、60、80或100％。期望地，至少20、40、60、80、90或95％的治疗受试者具有完全缓解，其中肿瘤或癌症的所有证据都消失。期望地，肿瘤或癌症没有再出现或在不少于5年、10年、15年或20年后再出现。“预防性治疗”受试者的疾病或病患(如癌症)意指疾病症状出现之前降低形成(即发生)疾病或病患的风险或降低疾病或病患的严重程度。预防性治疗可以完全预防或减少疾病或其症状的出现和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良作用而言可以是治疗性的。预防性治疗可包括减少疾病或病症或防止疾病或病症(例如防止癌症)在个体中发生，所述个体可以具有疾病的素因，但尚未诊断为患有该疾病或病症。
[0052] 如本文所用，生物样品是指来自个体的任何流体或组织，其可以分析CXCL14蛋白的存在或不存在，或CXCL14基因的表达水平或甲基化状态。可用于实践本公开的方法的样品包括血液样品、唾液样品、尿液样品、泪液样品、组织样品和口腔拭样。用于提取DNA和基因分型的优选样品是血液和口腔拭子样品。获得此类品的方法也是本领域技术人员已知的。一旦已经获得样品，可以分析它以确定CXCL14 mRNA、CXCL14基因甲基化，或CXCL14蛋白的存在、不存在或水平。如本文所用，术语“确定”、“确定CXCL14 mRNA的水平”、“确定CXCL14 mRNA和蛋白质的量”、“确定CXCL14基因的甲基化状态”等意指涵盖可用于检测或测量样品中CXCL14的存在或状态的任何技术。在该语境下，CXCL14是分析物的一个例子。此类技术可以给出定性或定量的结果。可以通过检测整个CXCL14 mRNA和蛋白质或通过检测CXCL14的片段或降解产物来确定CXCL14水平。
[0053] 发明详述
[0054] 本公开提供了用于患者中癌症预后的新方法，所述方法基于检测和/或定量一种或多种生物标志物，其指示针对癌症的患者的适应性免疫应答的存在或备选地适应性免疫应答的水平。
[0055] 现在根据本公开已经令人惊讶地显示了对HPV+癌症，且特别是对HPV+HNSCC的原位适应性免疫应答的确定可用作用于预测携带癌症的患者的临床结果的参数。
[0056] 此外，CXCL14表达/启动子甲基化和HPV+肿瘤发生和生长之间的令人惊讶的相关性证明了诊断受试者中鳞状细胞癌的方法的有用性。这些方法在从受试者采样唾液样品以诊断HNSCC肿瘤的存在或确定HNSCC肿瘤的预后的非侵入性诊断方法中特别有用。此类样品(包括唾液样品)中高甲基化的CXCL14DNA的检测对于通过最小限度侵入性(minimally-invasive)或非侵入性测试早期检测鳞状细胞癌是特别有用的。
[0057] 此外，CXCL14表达/启动子甲基化和/或CD8+ T和NK肿瘤细胞浸润之间的令人惊讶的相关性证指示了含有CXCL14蛋白和/或CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞的组合物以及施用CXCL14蛋白和/或CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞的方法的有用性。
[0058] 本公开提供了含有分离的CXCL14蛋白或CXCL14蛋白变体的药物组合物，其在受试者中诱导抗肿瘤免疫应答是有用的。分离的CXCL14蛋白可以在哺乳动物中体内诱导肿瘤清除。分离的CXCL14蛋白可以在哺乳动物中诱导HPV阳性(HPV+)肿瘤的体内清除。分离的CXCL14蛋白可以是分离的CXCL14变体，在其全长上与野生型CXCL14蛋白至少92％相同或至少95％相同，或至少99％相同，而保持在受试者中诱导抗肿瘤免疫应答的体内生物学活性。
[0059] CXCL14的蛋白质变体可以是包含至少70个连续氨基酸的序列的分离的蛋白质，其中所述至少70个连续氨基酸序列在其全长上与CXCL14蛋白的至少70个连续氨基酸的序列至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同或至少98％相同。确定两种蛋白质或核酸分子之间的百分比同一性的方法是本领域技术人员已知的。
[0060] 关于此类CXCL14变体，氨基酸序列中任何类型的改变都是允许的，只要变体保留本文所述的至少一种CXCL14蛋白活性即可。此类改变的例子包括但不限于，氨基酸缺失、氨基酸插入、氨基酸取代及其组合。例如，本领域技术人员完全理解，通常可以从蛋白质的氨基和/或羧基末端去除一个或多个氨基酸，而不显著影响该蛋白质的活性。类似地，通常可以将一个或多个氨基酸插入蛋白质中而不显著影响蛋白质的活性。
[0061] 如上所述，与野生型CXCL14蛋白相比，分离的CXCL14变体蛋白也可含有氨基酸取代。任何氨基酸取代都是允许的，只要蛋白质的细胞因子活性不受显著影响。在这方面，本领域中理解，氨基酸可以基于它们的物理性质分组。此类组的例子包括但不限于，带电氨基酸、不带电氨基酸、极性不带氨基酸，和疏水性氨基酸。包含取代的优选变体是其中氨基酸被来自相同组的氨基酸取代的变体。此类取代称为保守取代。
[0062] 可以基于常见的侧链性质将天然存在的残基分为几类：
[0063] 1)疏水：Met、Ala、Val、Leu、Ile；
[0064] 2)中性亲水：Cys、Ser、Thr；
[0065] 3)酸性：Asp、Glu；
[0066] 4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
[0067] 5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
[0068] 6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
[0069] 例如，非保守性取代可以涉及用这些类别之一的成员更换为另一个类别的成员。在优选的实施方案中，可以将此类取代的残基引入人CX蛋白以形成可用于本公开的治疗方法中的活性变体。
[0070] 在进行氨基酸改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。每种氨基酸根据其疏水性和电荷特性而被赋予了亲水指数。亲水指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-
3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域通常理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性(Kyte et al.,1982,J.Mol.Biol.157:105-31)。已知可以用某些氨基酸取代具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸并仍保持相似的生物学活性。在根据亲水指数进行改变时，亲水指数在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的那些是特别优选的，并且±0.5以内的那些甚至是更特别优选的。
3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域通常理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性(Kyte et al.,1982,J.Mol.Biol.157:105-31)。已知可以用某些氨基酸取代具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸并仍保持相似的生物学活性。在根据亲水指数进行改变时，亲水指数在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的那些是特别优选的，并且±0.5以内的那些甚至是更特别优选的。
[0071] 本领域还理解，如本案中一样，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代，特别是其中生物功能等同的蛋白质或由此产生的肽旨在用于免疫学实施方案中。蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性决定)与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物学性质相关。以下亲水性值已被分配给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。在根据相似的亲水性值进行改变时，亲水性值在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的那些是特别优选的，并且±0.5以内的那些甚至是更特别优选的。也可以基于亲水性自一级氨基酸序列鉴定表位。
[0072] 期望的氨基酸取代(无论保守还是非保守)可以由本领域技术人员在期望此类取代时确定。例如，可以使用氨基酸取代以鉴定CXCL14蛋白的重要残基，或以增加或降低本文描述的CXCL14蛋白的亲和性。下表中显示了示例性的氨基酸取代：
[0073]
[0074]
[0075] 因此，本公开的CXCL14蛋白变体可以包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代是包括上表中所示的那些取代的保守取代。
[0076] 另一方面，本公开提供了治疗或预防性治疗受试者中疾病或病症的方法，所述方法包括以足以治疗所述疾病或病症的量向受试者施用任何CXCL14蛋白或CXCL14蛋白变体或含有这些蛋白质的药物组合物。疾病可以是癌症(如HNSCC)或其它新生性疾病和相关并发症。在这些治疗方法中施用CXCL14蛋白可以诱导受试者中包含HPV+ HNSCC在内的HPV+肿瘤的体内清除。
[0077] 这些治疗方法可以包括首先获得来自个体的生物样品，并分析所述样品以确定样品中CXCL14蛋白活性或CXCL14 mRNA转录物水平或CXCL14基因高甲基化的存在或不存在，并基于所述样品中CXCL14蛋白活性或CXCL14 mRNA转录物或CXCL14基因高甲基化的存在、不存在或量来确定是否施用治疗。如果发现CXCL14蛋白活性基本上低于野生型或对照蛋白质活性水平，则可以施用本公开的分离的CXCL14蛋白或CXCL14蛋白变体或药物组合物。如果发现所述样品中CXCL14 mRNA转录物水平基本上低于野生型或对照CXCL14 mRNA水平，则可以施用本公开的分离的CXCL14蛋白或药物组合物。如果发现所述样品中CXCL14基因高甲基化水平基本上高于野生型或对照CXCL14基因高甲基化水平，则可以施用本公开的分离的CXCL14蛋白或药物组合物。
[0078] 由于其在抗肿瘤免疫应答中的作用，CXCL14是基于T细胞的治疗方法的最佳目标，所述治疗方法包括本文所述的那些并且还包括过继性T细胞转移。因此，本公开还提供了免疫治疗方案，其包括向受试者(如HNSCC患者)过继性转移已经用本公开的CXCL14肽体外诱导的，或已经经修饰以表达免疫原性CXCL14肽的CD8+和/或NK细胞。使用未选择的或选择的T细胞的过继性转移方案是本领域已知的(如参见美国专利公开号2011/0052530和2010/0310534；其通过引用并入本文)并且可以根据本文的教导进行修改以用于转移含有通过一种或多种免疫原性CXCL14肽特异性诱导的T细胞的细胞群体。类似地，已经描述了用期望的核酸转染/转导T细胞的方法(例如参见美国专利公开号2004/0087025)，其具有使用期望抗原特异性的T细胞的过继性转移程序(例如参见Schmitt et al.,2009Hum.Gen.20:1240；
Dossett et al.,2009Mol.Ther.17:742；Till et al.,2008Blood 112:2261；Wang et al.,2007Hum.Gene Ther.18:712；Kuball et al.,2007Blood 109:2331；US2011/0243972；
US2011/0189141；Leen et al.,2007Ann.Rev.Immunol.25:243)，使得基于本文的教导，包括涉及能够引起抗原特异性T细胞应答的CXCL14和CXCL14衍生肽的那些，考虑了将这些方法适用于本公开的方法。本公开因此还包括含有此类CXCL14诱导的T细胞的组合物，用于在过继性转移的这些方法中施用。这些组合物含有治疗有效量的CXCL14诱导的T细胞和药学上可接受的赋形剂，其足以维持此类诱导的T细胞并将此类诱导的T细胞施用至有此施用需要的受试者。
Dossett et al.,2009Mol.Ther.17:742；Till et al.,2008Blood 112:2261；Wang et al.,2007Hum.Gene Ther.18:712；Kuball et al.,2007Blood 109:2331；US2011/0243972；
US2011/0189141；Leen et al.,2007Ann.Rev.Immunol.25:243)，使得基于本文的教导，包括涉及能够引起抗原特异性T细胞应答的CXCL14和CXCL14衍生肽的那些，考虑了将这些方法适用于本公开的方法。本公开因此还包括含有此类CXCL14诱导的T细胞的组合物，用于在过继性转移的这些方法中施用。这些组合物含有治疗有效量的CXCL14诱导的T细胞和药学上可接受的赋形剂，其足以维持此类诱导的T细胞并将此类诱导的T细胞施用至有此施用需要的受试者。
[0079] 本公开的某些方面包括预防性治疗怀疑患有或易患与CXCL14高甲基化/下调相关病患的受试者或受试者的细胞、组织或器官。预防性治疗可以与用于治疗已被证实患有与CXCL14高甲基化/下调相关的癌症(如HNSCC)的受试者或受试者的细胞、组织或器官的方案(给药和时间表，以及免疫原性CXCL14衍生肽和/或其它治疗剂如抗原呈递细胞或过继转移的T细胞的选择)相同或不同。
[0080] 本文引用的每篇出版物或专利通过引用以其整体并入本文。
[0081] 现在一般描述的公开内容将通过参考以下实施例而更容易理解，所述实施例仅为了说明本公开的实施方案的某些方面而包括。这些实施例并非意在限制本公开，因为本领域技术人员将从以上教导和以下实施例认识到其它技术和方法可以满足权利要求并且可以在不脱离所要求保护的公开范围的情况下使用其它技术和方法。实施例
[0082] 这些实施例证明了人乳头瘤病毒(HPV)诱导的对抗肿瘤免疫应答的抑制的机制以及头颈鳞状细胞癌(HNSCC)的有效预后和治疗策略的发展。
[0083] 发明人的研究揭示了趋化因子CXCL14在HPV阳性(HPV+)癌症中显著下调，而许多促炎趋化因子被上调。CXCL14(由皮肤细胞组成性分泌的约9.5kD的蛋白质)是潜在的肿瘤抑制物，调节免疫细胞募集和激活。使用患者组织和培养的角质形成细胞，发明人发现CXCL14下调与由HPV癌蛋白E7诱导的CXCL14启动子高甲基化相关联。令人惊讶地，恢复HPV+ HNSCC细胞中CXCL14表达清除了有免疫能力的同基因小鼠中的肿瘤，但未清除Rag1缺陷小鼠中的肿瘤。具有CXCL14表达的小鼠显示出肿瘤组织和肿瘤引流淋巴结(TDLN)中的CD8+ T和自然杀伤(NK)细胞的显著增加。发明人还发现CXCL14在体外诱导CD8+ T和NK细胞的趋化性。相反，髓样来源的抑制细胞(MDSC)在再表达CXCL14的小鼠的肿瘤和脾脏中降低。MDSC抑制由CD8+ T和NK细胞介导的抗肿瘤免疫性并干扰CD8+ T细胞向肿瘤的迁移。MDSC在HNSCC患者中是丰富的，并与疾病严重性相关联。MDSC通过CXCR2与IL-8、CXCL1，和CXCL2(它们在HNSCC中高度上调)的结合来浸润至肿瘤微环境(TME)中。因此，通过HPV下调CXCL14通过无法引起CD8+ T和NK细胞应答，并通过诱导MDSC浸润至TME中来驱动HNSCC发展，且趋化因子表达和TME中的免疫细胞浸润与HNSCC患者的临床结果相关联。
[0084] 人类乳头瘤病毒(HPV)是高度流行的病原体，其与所有人癌症的5％，包括约25％的头颈癌(HNSCC)在原因上相关。流行病学研究显示，1988年至2004年期间HPV阳性(HPV+)口咽鳞状细胞癌(OPSCC)的人口水平增加225％，并且到2020年，HPV+ OPSCC可能会占美国所有HNSCC的大部分。过去10年中HPV+ OPSCC流行性的迅速上升增加了改善用于这种特定亚型HNSCC的护理标准疗法的需求。
[0085] FDA批准的预防性HPV疫苗有效地预防了几种高风险HPV类型的感染。但是，这些疫苗并不涵盖所有高风险HPV，并且它们的高成本大大限制了它们在世界上最需要疫苗的地区的可用性。甚至在美国，HPV疫苗接种覆盖率低得令人失望，男性青少年中低于10％。这些疫苗也缺乏治疗效果并因此不会影响未来几十年可能导致侵入性癌症的现有HPV感染。目前的研究显示了性活跃的男性和女性中HPV的总体流行率约为50％。因此，仍然迫切需要开发预测和治疗HPV感染个体的新工具。
[0086] 尽管目前的疗法(包括手术、放射疗法和化疗)在治疗HPV+ HNSCC上是有效的，患者必须处理深刻的治疗后遗症，这需要健康和社会护理系统的大力支持。与HNSCC中的当前化放疗有关的毒性可包括显著的局部和全身症状，这包括口腔粘膜炎、严重疼痛和咀嚼困难，这经常导致吞咽困难和喂养管依赖。疲劳、苦恼、睡眠不安(disturbed sleep)和困倦是常见的其它症状，并且症状严重程度通常随治疗时间而增加。相反，一些HPV+ HNSCC不良好响应疗法并且进展至侵入性转移性肿瘤，其与HPV阴性(HPV-)HNSCC相比更可能扩散至多个器官。
[0087] HNSCC免疫治疗的新方向将大大减少治疗相关的发病率，所述新方向基于对由癌细胞进行的免疫失调的更好理解。为了开发针对HPV+ HNSCC的成功患者治疗，必须深入了解HPV如何抑制宿主免疫应答。发明人应用其来自动物模型、患者数据和肿瘤样品的理解来揭示通过趋化因子调节得到的HPV耐受性的机制。这些研究扩展了我们对免疫耐受性的基本机制的理解，以及导致管理这种新发疾病的预后和治疗策略。
[0088] 这些研究导致对CXCL14作为口腔上皮中局部免疫监视的关键通信物(communicator)的作用的新机制理解，并通过评估CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞，揭示抗肿瘤免疫应答的新功能。CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞的过继转移导致鉴定可用于免疫抑制性HNSCC管理的治疗工具。鉴定HNSCC中趋化因子表达的新机制通过浸润性MDSC创建免疫抑制性TME的新机制导致发现另一个有效的免疫检查点来逆转免疫抑制。评估与趋化因子表达和免疫细胞浸润到肿瘤组织和区域淋巴结中相关的HNSCC临床结果和患者存活指示了趋化因子是否可以用作HPV+ HNSCC的预后标志物，这可以协助用于激活该途径以加强HNSCC患者中的抗肿瘤免疫应答的药物设计。另外，由于CXCL14是小可溶性肽，重组CXCL14可用作新的治疗性药物。
[0089] 目前关于病毒癌基因如何在持续感染期间导致侵入和转移的知识是广泛的。然而，不完全清楚癌症进展期间允许免疫耐受性的病毒相关机制。发明人以前的研究揭示了，HPV+ HNSCC中的HPV癌蛋白E7抑制诱导抗肿瘤免疫应答的CXCL14。由于CXCL14表达对于肿瘤体内清除是足够的，CXCL14(约9.5kD的分泌蛋白质)可以用作癌症免疫疗法中的药物或佐剂。另外，由CXCL14的肿瘤清除与CD8+ T和NK细胞浸润相关。因此，CXCL14诱导的CD8+ T和NK细胞的过继性转移可以用作癌症免疫治疗的另一种方法。最后，CXCL14表达降低了MDSC的浸润，已知这会导致免疫抑制TME。因此，靶向诱导MDSC的CXCR2可用作靶物以加强TME中的抗肿瘤免疫应答。
[0090] CXCL14表达/启动子甲基化和免疫细胞谱可以用作HNSCC患者的预后生物标志物。尽管HPV+ HNSCC患者显示较好的总体预后，但是与HPV- HNSCC相比，他们中的20-30％显示出较高的局部淋巴结的转移率。HPV+ HNSCC预后的最大障碍之一在于缺乏有用的生物标志物来测量疾病阶段并预测结果。最近的研究表明，与TNM分类相比，免疫谱可以是更强的生存预测物。因此，国际上存在建立计数抗肿瘤免疫应答的Immunoscore的努力。趋化因子是可以容易检测到的小分泌蛋白。已显示免疫细胞浸润和免疫抑制状态是临床结果的准确指标和预测物。另外，本发明人将检测来自HPV+ HNSCC患者的唾液样品中的CXCL14启动子甲基化，这将是检测CXCL14状态的有用非侵入性方法。确定CXCL14表达/启动子甲基化、免疫细胞谱和临床结果之间相关性的研究将开发用于HNSCC患者的创新性的预后工具。
[0091] 尽管充当研究人类癌症的有用工具，用免疫缺陷小鼠的异种移植物模型对于研究抗肿瘤免疫应答不可行。使用有免疫能力的同基因小鼠模型，在完整免疫系统情况下使用可遗传修饰的同基因HNSCC细胞来研究抗肿瘤免疫应答，提供了相关的且灵活的体内系统来研究HNSCC进展中的免疫应答。发明人也将使用创新性的受体-配体捕获技术(TriCEPS)以鉴定CD8+和NK细胞上的CXCL14受体。尽管生物技术的新近进展，由于微小的表达和不溶性，仍然难以鉴定细胞表面受体。TriCEPS技术不仅可以揭示CXCL14受体，而且还将充当可以广泛用于鉴定受体的有力工具。另外，将用小分子/肽激动剂靶向鉴定的CXCL14受体以加强具有CXCL14丧失的HPV+ HNSCC患者中的抗肿瘤免疫应答。
[0092] 发明人的先前研究证明了HPV+和HPV-HNSCC在分子上是不同的。癌症基因组计划也记录了与HPV-HNSCC相比，HPV+ HNSCC含有少得多的突变基因，这提示HPV在HNSCC发展中起着重要且独特的作用。
[0093] 实施例1：分析84个新鲜冷冻人宫颈和头/颈组织样本的全局基因表达谱，比较HPV+和HPV-癌症。
[0094] 先前的结果揭示了允许区分HPV+ HNSCC和宫颈癌(CxCa)与HPV-HNSCC的显著的HPV特异性基因表达标签(signature)。这些发现清楚地指示HPV在HPV相关癌症发展中起关键作用。发明人进一步分析了不同疾病阶段，包括正常、早期和晚期恶性前上皮病变，和鳞状癌中的128个宫颈组织样本的全局基因表达谱。结果揭示了在最终转变为侵入性上皮癌时在多种基因表达变化中达到顶点的分子变化级联。为了理解HPV相关癌症进展过程中HPV在局部微环境中的免疫调节，发明人使用基因表达数据组分析了所有细胞因子表达变化，所述基因表达数据组来自癌症进展的不同阶段的218个人头/颈和宫颈组织样品。虽然许多促炎趋化因子(如IL-8、CXCL1和CXCL2)高度上调，但是当与正常和HPV- HNSCC样品相比时，CXCL14表达在HPV+癌症中显著下调(图1和2)。CXCL14是一种相对较新的趋化因子，被认为是调节细胞侵入/迁移和宿主免疫应答的潜在肿瘤抑制物。为了更好地理解HPV降低CXCL14表达的机制，发明人使用逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)分析了体外角质形成细胞培养模型中的CXCL14表达。为了重演HPV持续性感染，发明人使用了正常永生化的角质形成细胞系NIKS及其分别含有HPV16,18,和31的基因组的衍生物NIKS-16,-18,和-31。
[0095] 表1.细胞系
[0096]
[0097]
[0098] 为了模拟早期、晚期和癌性宫颈病变，发明人使用源于宫颈上皮内新生物1(CIN1)患者的W12E细胞系及其衍生物，具有整合的HPV16基因组的W12G和转化的细胞系W12GPXY。与来自组织样品的结果一致，CXCL14水平在整个CxCa进展过程中持续下降，显示出与HPV16 E7表达强烈的负相关性(图3A和3B)。此外，CXCL14表达在携带高风险HPV16,18,或31基因组的正常角质形成细胞中特异性下调(图3C)。有趣的是，在含有缺乏癌基因E7表达的HPV16基因组的NIKS-16ΔE7细胞中未观察到CXCL14表达降低(图3C)。使用免疫细胞化学(ICC)，发明人进一步证实，与HPV-角质形成细胞NIKS细胞相比，CXCL14蛋白表达在NIKS-16细胞中被消除(图3D)。这些结果显示CXCL14下调是由HPV癌蛋白E7介导的。
[0099] 实施例2：HPV+细胞中的CXCL14启动子高甲基化
[0100] 先前的研究已经显示启动子高甲基化可以抑制CXCL14的表达。为了确定降低的CXCL14表达是否与启动子高甲基化相关联，发明人使用NIKS和W12细胞系进行了甲基化特异性PCR(MSP)。CXCL14启动子甲基化与CXCL14表达呈反相关，并且在HPV+角质形成细胞和HNSCC细胞中CXCL14启动子高甲基化显著增加(图4)。CXCL14启动子高甲基化在NIKS-16ΔE7细胞中消失。这些结果表明CXCL14启动子高甲基化是由高风险的HPV诱导的并在整个癌症进展过程中积累。先前的研究显示HPV癌蛋白E7激活DNMT1的甲基转移酶活性。另外，已经在HPV+细胞和CxCa中显示了许多基因的表观遗传(epigenetic)沉默。发明人的数据还显示在HPV+ HNSCC、CxCa和NIKS-16以及W12细胞中DNMT1表达特异性增加(图5A-5C)。然而，HPV16E7除去部分地降低了DNMT1 mRNA表达水平(图5C)。总的来说，这些结果显示HPV16癌蛋白E7有助于在HPV相关癌症进展过程中增加DNMT1的表达水平。此外，用DNMT抑制剂地西他滨处理可以恢复CxCa细胞中的CXCL14表达(图6)。这些结果显示由启动子甲基化引起的CXCL14沉默由HPV癌蛋白E7介导。
[0101] 实施例3：HNSCC细胞中CXCL14再表达通过适应性免疫清除肿瘤：
[0102] CXCL14是一种进化保守的趋化因子，在人CXCL14和鼠Cxcl14之间显示出98％的同源性。为了确定CXCL14是否影响体内肿瘤生长，发明人研究了在有免疫能力的同基因C57BL/6(B6)小鼠中形成肿瘤的小鼠口咽上皮细胞(MOE/E6E7)。与人细胞系和患者组织相一致，发现MOE/E6E7细胞比同基因HPV-MOE细胞表达显著更少的Cxcl14并且显示具有高度甲基化的Cxcl14启动子(图7)。为了测试CXCL14的肿瘤抑制物功能，发明人建立了MOE/E6E7细胞系，该细胞系再表达其生理水平的Cxcl14。引人注目的是，注射有表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞的大多数B6小鼠清除了肿瘤，而注射有对照MOE/E6E7细胞的所有小鼠在21天内死于肿瘤负荷(图8A)。然而，与野生型B6小鼠相反，注射有再表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞的所有Rag1缺陷型(Rag1-/-)B6小鼠在注射后32天内死于肿瘤负荷(图8B)。这些结果指示，CXCL14介导的肿瘤清除需要适应性免疫应答。为了表征由Cxcl14表达所调节的免疫细胞浸润，发明人分析了肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结(TDLN)中，和脾脏中的各种免疫细胞，所述脾脏收获自用对照或Cxcl14表达MOE/E6E7细胞注射后21天的野生型B6小鼠。数据显示，与注射含有MOE/E6E7细胞的载体的野生型B6小鼠相比，移植有再表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞的野生型B6小鼠的肿瘤组织和TDLN中CD8+ T和NK细胞的百分比高度增加(图9)。相反，Cxcl14表达显著降低髓样来源的抑制性细胞(MDSC)和调节性T(Treg)细胞。这些结果提示为了使CD8+ T和NK细胞体内清除移植的HNSCC细胞，CXCL14表达对于引发适应性免疫应答至关重要。为了测试CXCL14是否诱导CD8+ T和NK细胞的直接趋化性，发明人使用Transwell系统进行了体外迁移测定。有趣的是，与含有载体的HNSCC细胞相比，CD8+ T和NK细胞向表达Cxcl14的HNSCC细胞的迁移增强了3-4倍(图10)。
[0103] 实施例4：确定HPV+ HNSCC细胞中恢复的CXCL14表达是否促进抗肿瘤CD8+ T和NK细胞应答
[0104] 一生期间感染有HPV的个体的高达90％将在1-2年内在没有任何干预的情况下清除其HPV感染。最近的动物研究显示了，大多数有免疫能力的小鼠通过CD4+和CD8+ T细胞效应物功能提供保护而免受小鼠乳头瘤病毒感染，并且不形成HPV相关肿瘤。这些发现提示宿主适应性免疫应答通常有效消除HPV感染并从而预防疾病进展。最近已经提示，可以通过阻断免疫检查点(如PD-1和CTLA-4)通过内在免疫功能清除包括HNSCC在内的许多癌症。这些结果显示逆转癌症患者中的免疫抑制是癌症治疗剂的有前景的策略。先前的研究已经表明，CxCa患者中的HPV16特异性CD4+ T细胞响应严重受损，并且上皮中的HPV癌蛋白E7表达通过在体内减少细胞毒性T细胞应答来触发免疫抑制。由于这些免疫效应细胞应答对于清除肿瘤细胞也是至关重要的，由HPV触发的免疫抑制可能有助于肿瘤细胞的免疫逃避。然而，对持续感染和癌症进展期间HPV逃避抗病毒和抗肿瘤免疫应答的分子机制知之甚少。
[0105] 发明人最近发现，由于E7相关启动子高甲基化，CXCL14在HPV+ HNSCC中显著下调(图1-3)。为了确定CXCL14是否影响体内肿瘤生长，发明人利用具有在有免疫能力的同基因小鼠中形成肿瘤的MOE/E6E7细胞的HNSCC小鼠模型。为了测试CXCL14的肿瘤抑制物功能，发明人建立了再表达生理水平的Cxcl14的MOE/E6E7细胞系。我们的研究揭示了注射表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞的野生型B6小鼠在体内清除了大部分肿瘤，而注射亲本MOE/E6E7细胞的所有小鼠由于肿瘤负荷而死亡(图8A)。另外，MOE/E6E7细胞中的Cxcl14再表达增加了CD8+ T和NK细胞浸润至肿瘤和TDLN中(图9)。有趣的是，注射表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞的Rag1-/-小鼠显示出延迟的肿瘤生长。然而，所有小鼠最终死于其肿瘤负荷(图8B)。接着，发明人使用Transwell系统和分离自B6小鼠的脾细胞确定了CXCL14是否直接诱导CD8+ T和NK细胞的趋化性。结果显示，表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞刺激CD8+ T和NK细胞迁移但对巨噬细胞和CD4+ T细胞几乎没有影响(图10)。这些结果提示，CXCL14通过将CD8+ T和NK细胞募集到TME中来在肿瘤清除中起关键作用。
[0106] 先前的研究已经显示为了消退肿瘤，NK细胞活化对于肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞应答是必需的。这些研究还提示CD8+ T和NK细胞两者对于Cxcl14介导的HNSCC清除都是重要的。因此，由CXCL14诱导的CD8+和NK细胞对于清除HPV+ HNSCC似乎是必需且足够的。
[0107] 每个研究中的患者或实验动物的数目是基于假设驱动的功效(power)分析来确定的。患者数和实验动物数两者将根据最初的实验中观察到的差异而调整。
[0108] 为了测试CD8+ T和/或NK细胞是否为CXCL14介导的适应性抗肿瘤免疫应答以清除HNSCC所必需，发明人将在体内特异性消减B6小鼠的CD8+ T和NK细胞。抗小鼠CD8α和抗小鼠NK1.1抗体将分别用于CD8+ T和NK细胞消减。将对6至8周龄的野生型B6小鼠腹膜内注射特异性抗体。使用从脾脏和淋巴结分离的细胞，通过流式细胞术在处理后24小时评估特异性5
细胞消减。对对照小鼠注射同种型IgG抗体。将表达CXCL14的MOE/E6E7细胞(1x10 细胞)注射到具有消减的CD8+ T和/或NK细胞的小鼠的口腔区域或右体侧中。使用先前建立的技术每周测量肿瘤体积。当肿瘤大小在任何维度上大于1.5cm时，对小鼠实施安乐死。相反，当检测不到可测量的肿瘤达2个月的时段时，将认为小鼠是无肿瘤的。或者，在萤光素酶报告物的情况下使用体内microCT成像监测肿瘤生长和转移。发明人预测，与Rag1-/-小鼠相似，即使具有CXCL14表达，消减小鼠中的CD8+ T或NK将显示肿瘤生长(图8C)。已经提示了NK细胞是先天免疫应答与适应免疫应答之间的重要联系。这些实验将揭示NK细胞是否对于CXCL14介导的适应性抗肿瘤免疫应答(可能由CD8+ T细胞产生)以清除HNSCC是必需的。
细胞消减。对对照小鼠注射同种型IgG抗体。将表达CXCL14的MOE/E6E7细胞(1x10 细胞)注射到具有消减的CD8+ T和/或NK细胞的小鼠的口腔区域或右体侧中。使用先前建立的技术每周测量肿瘤体积。当肿瘤大小在任何维度上大于1.5cm时，对小鼠实施安乐死。相反，当检测不到可测量的肿瘤达2个月的时段时，将认为小鼠是无肿瘤的。或者，在萤光素酶报告物的情况下使用体内microCT成像监测肿瘤生长和转移。发明人预测，与Rag1-/-小鼠相似，即使具有CXCL14表达，消减小鼠中的CD8+ T或NK将显示肿瘤生长(图8C)。已经提示了NK细胞是先天免疫应答与适应免疫应答之间的重要联系。这些实验将揭示NK细胞是否对于CXCL14介导的适应性抗肿瘤免疫应答(可能由CD8+ T细胞产生)以清除HNSCC是必需的。
[0109] 尽管先前的研究已经显示小鼠中CD8+ T和NK细胞的有效消减，但有可能小百分比的剩余细胞可以显示抗肿瘤免疫应答。因此，为了进一步检查CD8+ T和/或NK细胞是否是CXCL14介导的肿瘤抑制所必需的，发明人将使用敲除小鼠。将表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞注射入具有B6背景的NKp46缺陷小鼠和CD8α缺陷小鼠，并且监视肿瘤生长/转移和小鼠存活。用Kaplan-Meier曲线总结事件结果前时间(time to event outcome)(例如生存时间)的分布，使用时序检验(log-rank test)在各组间进行比较，并使用危害比进行总结。Poisson计数的ANOVA将用于比较各组之间结节(转移)的数量。线性混合模型将用于描述肿瘤生长，并用于比较研究结束时的肿瘤体积。对于7只小鼠/组，组间相等生长率的测试具有检测约0.15的非常小的效应大小(生长率的标准化差异)的80％功效。为了保守并且允许损失，使用10只小鼠/组。
[0110] 为了测试Cxcl14诱导的CD8+ T和/或NK细胞是否足以在体内消除HNSCC，发明人将进行从用表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞注射的小鼠中收获的CD8+ T和/或NK细胞的过继性转移(图11)。由于过继性转移已成功用作癌症治疗，过继性转移可发展为治疗HNSCC患者的免疫治疗工具。首先，将表达Cxcl14的MOE/E6E7注射到B6供体小鼠中并且在注射后21天收获脾脏和TDLN。使用小鼠CD8α+ T细胞和NK细胞分离试剂盒通过磁珠分别从脾细胞和淋巴样细胞分离CD8+ T和NK细胞。将分离的CD8+ T细胞在含有IL-2的培养基中扩增一周。将分离的NK细胞在含有IL-15和氢化可的松的培养基中扩增10天。为了追踪CD8+ T和NK细胞，发明人将使用慢病毒转导绿色荧光蛋白基因。通过注射无CXCL14表达的含有载体的MOE/E6E7细胞来制备携带肿瘤的B6接受体小鼠。注射后20至30天形成可见大小的肿瘤。注射后21天，将从供体小鼠分离的CD8+ T或NK细胞转移至携带肿瘤的接受体小鼠。对于携带肿瘤的接受体小鼠，发明人使用上文描述的B6野生型、CD8+ T或NK细胞消减的B6野生型，和CD8α或NKp46缺陷型B6小鼠。每周测量肿瘤体积。自用含有载体的MOE/E6E7细胞注射的小鼠分离的CD8+ T或NK细胞用作对照。如果Cxcl14诱导的CD8+ T和/或NK细胞足以体内消除HNSCC，则发明人+观察到通过CD8 T和/或NK细胞的过继性转移的显著肿瘤抑制。尽管增殖和浸润增加，但是有可能CD8+ T或NK细胞不显示效应物功能。例如，1型和2型CD8+T细胞的表型在很大程度上是不同的。同样，先前的研究已经显示CD56dim NK细胞是杀伤细胞，而CD56bright NK细胞显示对NK细胞效应物功能的更多的调节作用。因此，定义CD8+ T或NK细胞的特征是重要的。
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为了表征从注射表达CXCL14的MOE/E6E7细胞的小鼠分离的CD8 T或NK细胞，本发明人首先分析CD8+ T或NK细胞中的细胞因子表达。使用高通量Luminex xMAP珠技术，根据制造商的方案，测定CD8+ T或NK细胞的裂解物的I型(IFN-γ和IL-2)和2型(IL-4,IL-5,和IL-10)细胞因子以及由活化的CD8+ T和NK细胞表达的其它常见细胞因子(TNF-α、RANTES、MIP-1α和MIP-1β)。从Invitrogen获得用于Luminex测定的多重和单重珠试剂盒，并且在UCD癌症中心流式细胞术核心设施(UCD Cancer Center flow cytometry core facility)的Luminex仪器上进行分析细胞因子mRNA表达。作为阴性对照，也从幼稚B6小鼠和用无Cxcl14表达的含有载体的MOE/E6E7细胞注射的小鼠中分离CD8+ T或NK细胞。统计分析使用Prism软件使用Student t检验来进行。选择的细胞因子的表达使用ELISA进行验证。接着，发明人使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定(Promega)来确定分离的CD8+ T或NK细胞的细胞毒性活性。CytoTox 96测定法测量细胞裂解时释放的稳定胞质溶胶酶，乳酸脱氢酶(LDH)。简言之，将分离的CD8+ T或NK细胞在可变比率下与含有载体的MOE/E6E7细胞或表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞作为靶细胞一起孵育。收集上清液并使用偶联的酶促测定法测量细胞毒性活性。
评估针对靶细胞的CD8+ T和NK细胞的细胞毒性活性。通过单独温育靶细胞来测定自发性LDH释放，并且通过用1％Triton X-100处理靶细胞来确定最大LDH释放。发明人也使用NK敏感的YAC-1和CT26细胞系作为阳性对照。如果酶促测定不够灵敏，则本发明人考虑使用[51Cr]铬酸盐标记靶细胞，并使用γ计数器来测量51Cr的释放。基于Cxcl14的抗肿瘤功能，发明人预测，从具有表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞的小鼠分离的CD8+ T或NK细胞显示1型细胞因子产生和显著增加的细胞毒性。这些测定可应用于测试临床实验室中的人样本。
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为了表征从注射表达CXCL14的MOE/E6E7细胞的小鼠分离的CD8 T或NK细胞，本发明人首先分析CD8+ T或NK细胞中的细胞因子表达。使用高通量Luminex xMAP珠技术，根据制造商的方案，测定CD8+ T或NK细胞的裂解物的I型(IFN-γ和IL-2)和2型(IL-4,IL-5,和IL-10)细胞因子以及由活化的CD8+ T和NK细胞表达的其它常见细胞因子(TNF-α、RANTES、MIP-1α和MIP-1β)。从Invitrogen获得用于Luminex测定的多重和单重珠试剂盒，并且在UCD癌症中心流式细胞术核心设施(UCD Cancer Center flow cytometry core facility)的Luminex仪器上进行分析细胞因子mRNA表达。作为阴性对照，也从幼稚B6小鼠和用无Cxcl14表达的含有载体的MOE/E6E7细胞注射的小鼠中分离CD8+ T或NK细胞。统计分析使用Prism软件使用Student t检验来进行。选择的细胞因子的表达使用ELISA进行验证。接着，发明人使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定(Promega)来确定分离的CD8+ T或NK细胞的细胞毒性活性。CytoTox 96测定法测量细胞裂解时释放的稳定胞质溶胶酶，乳酸脱氢酶(LDH)。简言之，将分离的CD8+ T或NK细胞在可变比率下与含有载体的MOE/E6E7细胞或表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞作为靶细胞一起孵育。收集上清液并使用偶联的酶促测定法测量细胞毒性活性。
评估针对靶细胞的CD8+ T和NK细胞的细胞毒性活性。通过单独温育靶细胞来测定自发性LDH释放，并且通过用1％Triton X-100处理靶细胞来确定最大LDH释放。发明人也使用NK敏感的YAC-1和CT26细胞系作为阳性对照。如果酶促测定不够灵敏，则本发明人考虑使用[51Cr]铬酸盐标记靶细胞，并使用γ计数器来测量51Cr的释放。基于Cxcl14的抗肿瘤功能，发明人预测，从具有表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞的小鼠分离的CD8+ T或NK细胞显示1型细胞因子产生和显著增加的细胞毒性。这些测定可应用于测试临床实验室中的人样本。
[0111] 实施例5：鉴定在CD8+ T和/或NK细胞上表达的CXCL14结合受体。
[0112] 作为一种相对较新的趋化因子，尚未鉴定出CXCL14的天然受体。由于HNSCC细胞中+ +CXCL14表达在体内增加CD8 T和/或NK细胞浸润至肿瘤内(图9)并在体外直接诱导CD8 T和/或NK细胞趋化性(图10)，CD8+ T和/或NK细胞很可能表达用于CXCL14信号传导的共同受体。尽管作为小肽分子的CXCL14可以照原样用作药物，但其受体的鉴定扩大通过靶物受体来开发激动剂的选择。通常靶向趋化因子受体以通过增强或抑制其信号传导来调节免疫应+
答。因此，发明人鉴定在CD8 T和/或NK细胞上表达的CXCL14结合受体。
答。因此，发明人鉴定在CD8 T和/或NK细胞上表达的CXCL14结合受体。
[0113] 为了鉴定Cxcl14受体，发明人使用新的受体-配体捕获技术，TriCEPS。由于微量和不溶性，受体鉴别通常是不成功的。TriCEPS技术通过受体和配体之间的强烈交联而克服了这些障碍。简而言之，这项技术使用具有三个臂(arm)的化学蛋白质组学介导物(chemoproteomic mediator)：一个臂附着至配体(我们的实施例中的Cxcl14)，另一个臂含有用于与糖基化受体交联的受保护的肼，并且第三个臂具有生物素标签以纯化结合的受体。通过液相色谱，接着进行定量质谱来鉴定相互作用配偶体(图12)。发明人首先使用293T哺乳动物细胞系统来产生Cxcl14，并在Transwell系统中使用CD8+ T和NK细胞迁移来测试纯化的Cxcl14的活性(图10)。发明人使用制造商的试剂盒将Cxcl14偶联至TriCEPS并使用胰岛素和CD28抗性作为阳性对照验证偶联反应。从注射有表达Cxcl14的MOE/E6E7的小鼠的+
脾脏分离CD8+ T和NK细胞并扩增。将CD8 T或NK细胞与Cxcl14缀合的TriCEPS温育。用偶联缓冲液进行交联反应，并且通过间接超声处理来裂解细胞，并且分离膜蛋白并通过胰蛋白酶消化。使用Streptavidin Plus UltraLink树脂(Pierce)来纯化TriCEPS捕获的细胞表面肽。通过高效液相色谱(HPLC)柱上的反相色谱分离纯化的肽并通过我们的蛋白质组学核心设施(proteomics core facility)中的质谱(MS)进行分析。作为阳性对照，本发明人使用Cxcl12及其受体Cxcr4，其也结合Cxcl14。作为阴性对照，发明人使用巨噬细胞和CD4+ T细胞，其迁移不受Cxcl14的影响(图10)。为了验证鉴定的Cxcl14受体，发明人使用对鉴定的受体特异性的抗体进行共免疫沉淀。为了测试Cxcl14是否通过鉴定的受体激活信号转导，进行G蛋白偶联的受体(GPCR)信号转导测定。趋化因子受体含有用于增加或减少胞内cAMP的信号转导的7-跨膜结构。发明人首先制备稳定表达每种鉴定的Cxcl14受体的细胞系。使用cAMP-Glo测定(Promega)来测量GPCR信号转导活性。使用基于萤光素酶的GPCR信号转导10-途径受体阵列(Qiagen)来进一步研究Cxcl14受体的下游信号传导。使用shRNA敲低鉴定的受体，发明人通过测试体内肿瘤生长和体外细胞迁移来验证CXCL14受体相互作用的功能。
发明人使用Spearman相关性评估CD8+ T(或NK细胞)和HNSCC细胞之间的关联性。假设样品大小为50，在无关联的5％显著性水平下的双侧测试具有检测0.40的中等相关性的约80％的功效。此外，每当样品相关性超过0.30时，95％置信区间将排除零，并且这些间隔的宽度小于0.50。发明人还使用CXCR7，其以与CXCL14类似的方式起作用以抑制CXCR4信号传导。由于HPV癌蛋白E7通过调节DNA甲基化来影响宿主基因表达，发明人分析人角质形成细胞系中的全局转录物组/甲基化组(methylome)：NIKS、NIKS-16、NIKS-18，和NIKS-16ΔE7。在本分析中，发明人发现与在NIKS和NIKS-16ΔE7细胞相比，NIKS-16和NIKS-18细胞中CXCR7表达显著降低并且CXCR7启动子是高甲基化的(图13)。发明人使用上文描述的类似方法来测试CXCR7表达的恢复是否协同抑制肿瘤生长。发明人预测，CD8+ T和NK细胞上表达的一种或多种受体与Cxcl4相互作用并转导活化信号。如果在CD8+ T和NK细胞上未鉴定出Cxcl14受体，则发明人在TriCEPS程序中使用脾细胞和角质形成细胞的整个群体。作为受体鉴定的备选方法，发明人也考虑基于放射性同位素([35S]半胱氨酸和[35S]甲硫氨酸)的沉淀和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法，如前所述的。CD8+ T和NK细胞上CXCL14受体的鉴定导致发展有用的工具以增大CXCL14的功能并从而增强抗肿瘤免疫应答。了解CXCL14加强CD8+ T和NK细胞的效应物功能以清除HNSCC细胞的信号传导机制也是有用的。
脾脏分离CD8+ T和NK细胞并扩增。将CD8 T或NK细胞与Cxcl14缀合的TriCEPS温育。用偶联缓冲液进行交联反应，并且通过间接超声处理来裂解细胞，并且分离膜蛋白并通过胰蛋白酶消化。使用Streptavidin Plus UltraLink树脂(Pierce)来纯化TriCEPS捕获的细胞表面肽。通过高效液相色谱(HPLC)柱上的反相色谱分离纯化的肽并通过我们的蛋白质组学核心设施(proteomics core facility)中的质谱(MS)进行分析。作为阳性对照，本发明人使用Cxcl12及其受体Cxcr4，其也结合Cxcl14。作为阴性对照，发明人使用巨噬细胞和CD4+ T细胞，其迁移不受Cxcl14的影响(图10)。为了验证鉴定的Cxcl14受体，发明人使用对鉴定的受体特异性的抗体进行共免疫沉淀。为了测试Cxcl14是否通过鉴定的受体激活信号转导，进行G蛋白偶联的受体(GPCR)信号转导测定。趋化因子受体含有用于增加或减少胞内cAMP的信号转导的7-跨膜结构。发明人首先制备稳定表达每种鉴定的Cxcl14受体的细胞系。使用cAMP-Glo测定(Promega)来测量GPCR信号转导活性。使用基于萤光素酶的GPCR信号转导10-途径受体阵列(Qiagen)来进一步研究Cxcl14受体的下游信号传导。使用shRNA敲低鉴定的受体，发明人通过测试体内肿瘤生长和体外细胞迁移来验证CXCL14受体相互作用的功能。
发明人使用Spearman相关性评估CD8+ T(或NK细胞)和HNSCC细胞之间的关联性。假设样品大小为50，在无关联的5％显著性水平下的双侧测试具有检测0.40的中等相关性的约80％的功效。此外，每当样品相关性超过0.30时，95％置信区间将排除零，并且这些间隔的宽度小于0.50。发明人还使用CXCR7，其以与CXCL14类似的方式起作用以抑制CXCR4信号传导。由于HPV癌蛋白E7通过调节DNA甲基化来影响宿主基因表达，发明人分析人角质形成细胞系中的全局转录物组/甲基化组(methylome)：NIKS、NIKS-16、NIKS-18，和NIKS-16ΔE7。在本分析中，发明人发现与在NIKS和NIKS-16ΔE7细胞相比，NIKS-16和NIKS-18细胞中CXCR7表达显著降低并且CXCR7启动子是高甲基化的(图13)。发明人使用上文描述的类似方法来测试CXCR7表达的恢复是否协同抑制肿瘤生长。发明人预测，CD8+ T和NK细胞上表达的一种或多种受体与Cxcl4相互作用并转导活化信号。如果在CD8+ T和NK细胞上未鉴定出Cxcl14受体，则发明人在TriCEPS程序中使用脾细胞和角质形成细胞的整个群体。作为受体鉴定的备选方法，发明人也考虑基于放射性同位素([35S]半胱氨酸和[35S]甲硫氨酸)的沉淀和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法，如前所述的。CD8+ T和NK细胞上CXCL14受体的鉴定导致发展有用的工具以增大CXCL14的功能并从而增强抗肿瘤免疫应答。了解CXCL14加强CD8+ T和NK细胞的效应物功能以清除HNSCC细胞的信号传导机制也是有用的。
[0114] 实施例6：确定HPV+ HNSCC细胞中恢复的CXCL14表达是否逆转免疫抑制微环境。
[0115] 慢性免疫抑制是癌症发展以避免可有效消除肿瘤细胞的T和NK细胞效应物功能所必需的。在癌症进展期间，这些效应物T和NK细胞经常受免疫检查点信号转导如PD-1和CTLA-4抑制。除了通过PD-1和CTLA-4对效应物细胞的抑制外，在大多数癌症患者中存在截然不同的免疫抑制性细胞，创建免疫抑制性TME以逃避抗肿瘤免疫应答。MDSC是TME的免疫抑制细胞网络中的主要参与者之一。支持MDSC(定义为粒细胞性CD11b+Ly6G+Ly6C低)的肿瘤抑制由CD8+ T和NK细胞介导的抗肿瘤免疫性并干扰CD8+ T细胞向肿瘤的迁移。MDSC群体在HNSCC患者的肿瘤、TDLN，和外周血中丰富，并与疾病阶段相关联。新近的II期临床试验已经显示磷酸二酯酶5(PDE5)抑制剂(他达拉非(tadalafil))在HNSCC患者中降低MDSC并恢复抗肿瘤免疫应答。这些结果强烈提示MDSC是关键的免疫细胞以创建HNSCC患者中的免疫抑制。
[0116] 尽管Cxcl14表达增加了肿瘤组织中的CD8+ T和NK细胞浸润，但与注射含有空载体的细胞的对照小鼠相比，MDSC在注射有再表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞的小鼠的肿瘤和脾脏中显著降低(图14)。鉴于MDSC在许多癌症中通过抑制CD8+ T和NK细胞诱导免疫抑制性TME，发明人的结果指示具有Cxcl14表达的小鼠中CD8+ T和NK细胞的增加的百分率可能是由TME中Cxcl14介导的MDSC减少引起的。趋化因子受体CXCR1和CXCR2对粒细胞向炎症部位的迁移至关重要。最近的研究已经显示MDSC浸润至肿瘤进行癌症发展也需要CXCR2。另外，阻断CXCR2介导的MDSC浸润增强抗PD1疗法的功效。该基因表达数据显示CXCR2配体，IL-8、CXCL1，和CXCL2在HNSCC中高度上调(图15)。这些结果提示，自肿瘤细胞表达IL-8、CXCL1，和2可诱导MDSC扩增并对TME的趋化性以创建免疫抑制微环境。另一项研究已经显示，CXCL14直接与IL-8结合并抑制内皮细胞的趋化性。因此，有可能由HNSCC细胞产生的CXCR2配体将MDSC募集至TME中，并且CXCL14表达干扰IL-8介导的MDSC浸润。因此，将证实HPV+ HNSCC细胞中的CXCL14表达通过抑制Cxcr2介导的MDSC扩增和浸润来逆转免疫抑制微环境。这些实验确定CXCL14的下调触发TME中的免疫抑制的新机制。
[0117] 实施例7：确定CXCL14表达是否逆转HNSCC中MDSC介导的对CD8+ T和NK细胞响应的抑制
[0118] 为了进行由来自HPV+ HNSCC的MDSC进行的CD8+ T和NK细胞抑制的体外测定，使用含有MDSC的两个亚组，单核细胞性CD11b+Ly6G-Ly6C高和粒细胞性CD11b+Ly6G+Ly6C低MDSC的小鼠Gr-1+粒细胞。尽管两种类型的MDSC抑制T细胞增殖并诱导T细胞凋亡，但与单核细胞性MDSC相比，粒细胞性MDSC在几乎所有肿瘤中都占优势。发明人的结果还显示通过Cxcl14表达显著降低粒细胞性MDSC(图14)。为了确定粒细胞性MDSC对CD8+ T和NK细胞的效果，发明人进行CD8+ T和NK细胞增殖和凋亡测定。使用BD FACSAria流式细胞仪，从携带HPV+ HNSCC的野生型B6小鼠的脾脏分离出粒细胞性MDSC(CD45+CD11b+Gr-1高Ly6C低)(Stromnes 2014)。也纯化CD8+ T和NK细胞，并且用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记。在存在或不存在纯化的MDSC下检测CD8+ T和NK细胞增殖。使用膜联蛋白-V染色来检测凋亡性CD8+ T和NK细胞。为了进一步研究MDSC对CD8+ T和NK细胞的影响，发明人测量细胞因子表达水平(1型对2型)并测定分离的CD8+ T或NK细胞的细胞毒性活性。为了测试MDSC是否抑制CD8+ T或NK细胞迁移，如图10中所述，发明人使用Transwell系统进行体外细胞迁移测定。
[0119] 为了测试MDSC是否是HNSCC中免疫抑制所必需的，发明人使用抗Ly6G抗体(克隆1A8或RB6-8C5)来特异性消减B6小鼠中的MDSC。作为抗体介导的MDSC消减的备选，发明人使用吉西他滨，其在携带肿瘤的小鼠中通过凋亡选择地消除MDSC，而对B和T细胞、NK细胞或巨噬细胞没有任何影响。在用于黑素瘤的过继性T细胞疗法中，吉西他滨治疗已经显示T细胞扩增和肿瘤消退。通过流式细胞术来验证MDSC消减。对具有消减的MDSC的小鼠注射无Cxcl14表达的MOE/E6E7细胞，并且监测肿瘤生长。如果MDSC对于抗肿瘤免疫应答的抑制至关重要，则具有MDSC消减的小鼠显示与Cxcl14再表达类似的肿瘤抑制。为了检查MDSC消减是否逆转免疫抑制性TME，发明人从小鼠收获肿瘤组织并使用免疫组化(IHC)和12色流式细胞术组来对浸润的免疫细胞(T细胞亚组、巨噬细胞/DC、嗜中性粒细胞，和NK细胞)确定概貌(profile)。
[0120] 为了定义Cxcl14表达降低TME中的MDSC群体的机制，发明人确定MDSC中的Cxcr2信号转导对于MDSC募集入TME中和对CD8+ T和NK细胞浸润的抑制是否是重要的。编码IL-8的基因在小鼠和大鼠中是不存在的(Modi 1999)。然而，功能性的IL-8同系物Cxcl1和Cxcl2通过与受体Cxcr2相互作用而诱导包括MDSC在内的粒细胞的趋化性。人HNSCC和CxCa患者组织中CXCL1和CXCL2均高度增加(图15)。为了确定Cxcr2对于MDSC扩增并浸润至TME中是否是必需的，发明人使用具有B6背景的Cxcr2缺陷(Cxcr2-/-)小鼠。将无Cxcl14表达的同基因MOE/E6E7细胞移植到Cxcr2-/-小鼠并且监测肿瘤生长，与野生型B6小鼠中的肿瘤生长比较。如果-/-Cxcr2信号传导对MDSC的免疫抑制功能是重要的，则与野生型小鼠相比，Cxcr2 小鼠在没有Cxcl14表达的情况下显示肿瘤清除或延迟的肿瘤生长。发明人也检测TME、TDLN，和脾脏中MDSC、CD8+ T细胞，和NK细胞的浸润。接着，发明人通过将表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞注射入Cxcr2-/-小鼠来确定Cxcr2敲除和Cxcl14表达的协同效应。为了测试MDSC是否足以诱导-/-
免疫抑制，从携带肿瘤的野生型B6小鼠分离MDSC并转移至Cxcr2 小鼠。如果MDSC在抑制抗肿瘤CD8+ T和NK细胞中发挥关键作用，则MDSC的过继性转移增强Cxcr2-/-小鼠中的肿瘤生长。
免疫抑制，从携带肿瘤的野生型B6小鼠分离MDSC并转移至Cxcr2 小鼠。如果MDSC在抑制抗肿瘤CD8+ T和NK细胞中发挥关键作用，则MDSC的过继性转移增强Cxcr2-/-小鼠中的肿瘤生长。
[0121] 为了确定Cxcl1或Cxcl2是否诱导MDSC的趋化性以创建免疫抑制性TME，发明人在MOE/E6E7细胞中过表达或敲除Cxcl1和/或Cxcl2。使用慢病毒转导，将小鼠Cxcl1和/或Cxcl2基因递送入表达Cxcl14的MOE/E6E7细胞。将表达Cxcl1/2和Cxcl14的稳定MOE/E6E7细胞系注射到B6小鼠中并且监视肿瘤生长。发明人还使用流式细胞术检测具有Cxcl1/2表达细胞的小鼠的TME和TDLN中的MDSC、CD8+ T细胞和NK细胞。如果Cxcl1或Cxcl2诱导MDSCs的趋化性和免疫抑制，则发明人认为即使在Cxcl14表达的情况下，肿瘤生长不受抑制。另外，TME和TDLN中，MDSC增加并且CD8+ T和NK细胞降低。接着，使用慢病毒CRISPR系统来建立Cxcl1-或Cxcl2缺陷MOE/E6E7细胞并注射入野生型B6小鼠。如上描述确定肿瘤生长和MDSC、CD8+ T细胞和NK细胞的浸润。如果Cxcl1或Cxcl2对MDSC浸润和肿瘤生长是重要的，则Cxcl1或Cxcl2敲除抑制MDSC浸润和肿瘤生长并增加TME中的CD8+ T和NK细胞。如果由于冗余功能，Cxcl1或Cxcl2的敲除不足以抑制肿瘤，则本发明人产生Cxcl1和Cxcl2的双敲除MOE/E6E7细胞。为了验证Cxcl1/2的Cxcl14抑制，发明人使用Transwell系统来测试MDSC迁移是否受Cxcl14抑制。如果MOE/E6E7细胞中，Cxcl1和Cxcl2双敲除显示出与Cxcl14表达相似的肿瘤抑制水平，则结果提示了Cxcr2信号传导在抑制Cxcl14介导的抗肿瘤免疫应答中起主要作用。
[0122] 发明人的初步数据显示HNSCC细胞中的CXCL14再表达在体内显著降低MDSC浸润。通过自肿瘤细胞表达同源促炎性趋化因子IL-8、CXCL1和CXCL2将MDSC(免疫抑制的关键介导物)募集至TME。由于MDSC抑制CD8+ T和NK细胞，这些结果揭示了HNSCC中MDSC的免疫抑制作用，显示出CXCL14介导的CD8+ T和NK细胞增加和肿瘤抑制。但是，单独的MDSC的消减可能不足以逆转免疫抑制性TME。另一种免疫抑制性细胞类型，代表T细胞亚群的CD4+CD25+FoxP3+ Treg细胞抑制包括效应物CD8+ T和NK细胞在内的各种免疫细胞。最近的研究显示了，Treg细胞在西妥昔单抗治疗的HNSCC患者中增加，抑制NK细胞效应物功能并与较差的临床结果相关联。发明人的初步结果还已经发现，Treg细胞在具有再表达Cxcl14的肿瘤的小鼠的脾脏中显著降低(图16)。因此，发明人可以测试HPV+ HNSCC细胞中CXCL14表达是否通过抑制Treg细胞扩增而恢复CD8+ T和NK细胞的细胞毒性活性。
[0123] 实施例8：定义HNSCC患者的CXCL14表达、免疫细胞浸润和临床结果之间的临床相关性。
[0124] 选择可能对特定癌症疗法响应的患者对于有效治疗至关重要。然而，除了简单的HPV检测外，很少有预测性生物标志物可用于指导HPV+ HNSCC中的患者治疗。与HPV- HNSCC患者相比，大多数HPV+ HNSCC患者在常规治疗(手术和/或放化疗)后具有更好的预后。然而，HPV+ HNSCC患者的亚组显示转移至局部区域淋巴结。由于单独的结转移可使患者的总存活率降低近50％，结转移状态被认为是HNSCC中最重要的预后因素之一。此外，与没有结疾病的HPV+ HNSCC相比，具有结转移的HPV+ HNSCC亚组具有较差的预后和较低的存活率(70％对93％)。先前的研究发现，CD8+ T和NK细胞在防止结转移中发挥重要作用，而增加的MDSC与乳腺癌患者的结转移相关。
[0125] 最近的研究已经显示，免疫细胞和细胞因子可以用作有力的预后生物标志物。例如，浸润性CD8+ T和NK细胞的总数与乳腺癌、肾癌、结肠直肠癌、皮肤癌和胃癌中的较好的患者存活相关联。相反，MDSC被认为是胰腺癌、食管癌、胃癌和皮肤癌的负预后标志物。已经提示了，临床结果也可以通过测量患者中包括IL-8和IFN-γ在内的几种细胞因子的表达水平来预测。这些发现导致建立计数抗肿瘤免疫应答的Immunoscore的国际努力，所述Immunoscore已经显示为比TNM分类更强的存活预测物。因此，检测和评估免疫细胞浸润和趋化因子表达可以是可用于预测HNSCC患者的临床结果的可靠预后标志物。目前，用比HPV-患者更低的放化疗剂量治疗HPV+ HNSCC患者。可以选择CXCL14低HPV+ HNSCC患者并使用与CXCL14高HPV+患者相比更高的剂量和/或更长的治疗/随访治疗。
[0126] 发明人先前的研究揭示了HPV相关的癌症进展中的截然不同的趋化因子变化，其中CXCL14的显著降低和CXCL14启动子高甲基化增加(图1，2和4)。CXCL14启动子高甲基化在唾液(图17)和组织(表2)中是可检测的。
[0127] 表2.HPV+ HNSCC中CXCL14启动子甲基化。使用来自20个HPV-和16个HPV+ HNSCC组织样品的基因组DNA通过MSP来确定CXCL14启动子甲基化。基于MSP产物的条带浓度对高甲基化水平评分。
[0128]
[0129] 鉴于CXCL14表达通过增加肿瘤和淋巴结中的CD8+ T和NK细胞群来清除肿瘤细胞(图8和9)，CXCL14和免疫细胞可作为可靠的预后标志物用来确定免疫应答并预测HPV+ HNSCC患者的临床结果。因此，发明人显示CXCL14表达/启动子甲基化与CD8+ T和NK细胞浸润至TME中相关联，并且预测无结转移的HPV+ HNSCC患者中更好的临床结果。发明人还建立了HNSCC临床结果与XCL14表达/启动子甲基化和免疫细胞浸润至肿瘤组织以及区域性淋巴结的相关性。随机化临床试验形式的大型前瞻性癌症筛查研究随后进行以评估当CXCL14和免疫细胞用作HPV+ HNSCC预后的基础时可继而发生的临床疗效、益处和任何潜在的危害。已收集了大约1,000个HNSCC患者组织样品(以及相邻的正常组织和相关的患者人口统计学、HPV状态和临床结果)。在这些样品中，约250个样品是HPV+。为了确定CXCL14水平是否与浸润TME的CD8+ T和NK细胞的数目相关，发明人对来自200名HPV+ HNSCC患者的组织、淋巴结、唾液和血液样本进行测定。组织学上，该患者组以及30例正常受试者中的正常远端粘膜组织(即扁桃体切除术)用作对照。发明人还包括50名HPV-HNSCC患者作为对照组。目前或既往吸烟史的患者将按照包-年(pack-years)和持续时间分层。因此，HPV+ HNSCC吸烟者作为患者亚组纳入。
[0130] 通过p16IHC和HPV PCR(14个高风险：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66，和68)确认每个样品的HPV状态。发明人首先评估这些组织样品中的CXCL14表达/启动子甲基化水平以及CD8+ T和NK细胞浸润。在组织和手术切除的局部淋巴结两者中或者对于接受放化疗作为明确治疗的患者在细针吸出物(FNA)结样品中确定CD8+ T和NK细胞群。接着，发明人确定CXCL14表达/启动子甲基化以及CD8+ T和NK细胞浸润是否与以下正相关或负相关：i)T阶段(T1-2对T3-4)和组织学分级(中度、较差或未分化)；ii)淋巴结转移(N0-N2a对N2b-N3)和iii)临床结果(总存活，无进展存活和复发)。发明人评估该患者群体中CXCL14表达/启动子甲基化水平以及CD8+ T和NK细胞浸润中的性别差异。基于先前的研究，HPV+ HNSCC患者的3年总体存活率和3年无进展存活率分别为约80％和约70％。约40％的HPV+ HNSCC在诊断时显示淋巴结转移的N2b-N3期。在监视检查和定期成像(PET-CT、CT、MRI)的情况下对患者临床随访5年以评估局部复发以及远端转移。对初始期期间具有复发或转移的患者随访，直至实现5年无疾病间隔。用来自100位前瞻性HPV+ HNSCC患者的样品验证结果。
[0131] 发明人将使用我们的RT-qPCR程序来分析HNSCC组织样品中CXCL14的mRNA水平(图3A-3C)。提供从预先绘制的组织切片刮下制备的(宏观切割的)上皮组织。基于先前H&E染色组织的评估，如果组织包含小于80％的正常上皮或肿瘤细胞，则执行激光捕获显微解剖。接着，发明人用抗CXCL14抗体使用IHC来测量CXCL14蛋白水平。初步免疫染色显示NIKS(HPV-)和NIKS-16(HPV+)细胞中CXCL14蛋白表达之间的清楚差异(图3D)。对于CLIA认证实验室的未来测试，发明人开始阳性和阴性对照的严格计划。使用western印迹法，分别在用于阳性和阴性对照的10个CXCL14阳性正常组织样品和10个CXCL14阴性HNSCC组织样品中检测到用于CXCL14表达的单一约10kD条带。发明人还使用甲基化特异性PCR(MSP)分析了组织和唾液样品中CXCL14启动子甲基化。对于CLIA认证实验室的标准测试，HPV+ HNSCC细胞系(MSK922和HN11)以及正常口腔角质形成细胞分别用作阳性和阴性对照。初步数据显示，在HPV+ HNSCC中比在HPV-HNSCC中更常检测到高水平的CXCL14甲基化(表2)。然而，40％的HPV- HNSCC也具有甲基化的CXCL14。因此，发明人确定HPV- HNSCC中的CXCL14甲基化状态是否与在HPV+ HNSCC中一样好地与临床结果相关。
[0132] 分别用抗人CD8α和NKp46抗体使用IHC评估浸润至肿瘤和淋巴结的CD8+ T和NK细胞的总数目。另外，发明人检测免疫抑制性细胞，包含MDSC和Treg细胞，发明人已观察到所述免疫抑制性细胞在表达Cxcl14的小鼠中降低(图14和16)。为了检测MDSC和Treg细胞，发明人进行如上所述的双重IHC标记。进行所有IHC和成像分析。使用Aperio扫描仪输入IHC图像并使用NIH Image J进行分析。将根据建立的评估标准自动量化阳性细胞的数量。发明人也使用多色流式细胞术来分析患者血液和/或结样品中CD8+ T、NK、MDSC和Treg细胞。从患者血液样品分离外周血单个核细胞(PBMC)，并使用与以下独特的荧光团缀合的我们的抗体组的多色流式细胞术进行分析：嗜中性粒细胞(Gr1高)、DC(MHCII+,CD11c+)、巨噬细胞(MHCII+,F4/80+)、单核细胞(Gr1中)、CD4+ T细胞(CD4+)、CD8+ T细胞(CD8+)、Treg细胞(CD4+,CD25+)、NK细胞(NKp46+)，和MDSC(MHCII低,Gr1+,CD11b+)(修订稿)。对于在CLIA认证的实验室中验证浸润的免疫细胞的阳性和阴性对照，发明人使用磁珠分选来从PBMC分离CD8+ T细胞、NK细胞和MDSC，并使用western印迹来检测特异性标记物。进行免疫染色的定量。
[0133] 为了评估生物标志物(主要是CXCL14水平和CD8+ T和NK细胞数)是否与存活、复发和淋巴结转移相关联，第一步评估生物标志物与患者临床/人口统计学特征之间的所有配对关联，而不需要针对多重比较进行调整。随后使用Cox比例危害和逻辑回归模型(logistic regression model)来评估单独的生物标志物与事件前时间(OS，复发前时间)和二元(即转移或复发Y/N)结果的关联，调整患者特征间的混杂因素(confounder)。这些分析告知最后一步，其中使用Akaike信息标准(AIC)来建立多变量Cox和逻辑预测模型，该模型将所有生物标志物视为潜在预测物，并对混杂因素进行调整。Cox模型中在5％显著性水平下的检验具有检测经调整的危害比1.60(对于连续预测物(CXCL14表达水平或免疫细胞数量)上的1个SD增加)，和经调整的危害比2.54(具有50-50分开的二元预测物)的80％功效，两者均假设模型中标志物与其他预测物之间的R平方为0.10以及研究中预测的20％进展或死亡率。最小可检测危害比越小，事件率越高(0.3)。类似地，在5％水平的逻辑回归模型中的测试具有检测经调整的优势率(odds ratio)1.69(对于连续预测物上的1个SD增加)，和经调整的优势率2.55(具有50-50分开的二元变量)的80％功效，两者都假设模型中预测物与其他预测物之间的R平方为0.10。基线率假设为0.20。所有功效计算都基于200的样品大小。
[0134] 由于发明人的研究已显示TME中的免疫应答对肿瘤清除至关重要，发明人预测，CXCL14水平和CD8+ T和NK细胞数与较高的存活率和较低的复发和结转移率紧密相关，并且CXCL14启动子甲基化状态与较高的存活率和较低的复发和结转移率负相关。但是，CXCL14水平可能是可变的，并且不足以达到与临床结果显著相关。在这种情况下，发明人进一步分析促炎性趋化因子(IL-8、CXCL1、CXCL2)的表达。此外，考虑分析血液中1型(IFN-γ、IL-12p70)细胞因子对2型(IL-4、IL-6、IL-10)细胞因子以确定免疫应答的系统性变化以及其与HNSCC患者临床结果的相关性。HPV+ HNSCC的预后可以短期良好，但长期患者可能复发或有远端转移。因此，发明人使用回顾性数据以检查长期预后并且如果必要，发明人随访前瞻性患者达5年。另外，由于一些HPV- HNSCC也显示通过启动子甲基化的CXCL14下调，发明人未来将该研究扩大到HPV- HNSCC患者。如果IHC定量存在任何限制，发明人可以使用免疫荧光。
[0135] 已经呈现本公开的前述实施例用于解释和描述。此外，这些实施例并不意欲将本公开限制为本文所公开的形式。因此，与本公开的说明书的教导以及相关领域的技术和知识相称的变型和修改均在本公开的范围内。本文所提供的实施例中描述的具体实施方案意欲进一步解释已知的实施本公开的最佳方式并使得本领域的其它技术人员能够以这些或其它实施方案以及本公开的特定应用或使用所需的各种修改利用本公开。意图将所附权利要求书理解为在现有技术所允许的限度上包括替代实施方案。
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