用于过继细胞治疗的工程改造的细胞
阅读：810发布：2020-05-11
专利汇可以提供用于过继细胞治疗的工程改造的细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了用于过继 治疗 的工程改造的细胞，包括NK细胞和T细胞。还提供了用于工程改造和产生所述细胞的组合物、含有所述细胞的组合物、以及其给予对象的方法。在一些方面中，方法和细胞的特征提供了特异性和/或功效。在一些实施方式中，细胞含有特异性结合至 抗原 的遗传工程改造的抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)和共刺激受体。在一些实施方式中，细胞包括靶向多种抗原的受体。在一些实施方式中，细胞包括，例如，通过破坏编码基因产物的基因来抑制一种或多种基因产物。在一些实施方式中，破坏编码由工程改造的抗原受体识别的抗原的基因，降低工程改造的细胞的靶向可能性。，下面是用于过继细胞治疗的工程改造的细胞专利的具体信息内容。
1.一种工程改造的免疫细胞，包含：
特异性结合至靶抗原的遗传工程改造的抗原受体；和
遗传破坏，其导致所述工程改造的免疫细胞中所述靶抗原的表达降低。
2.如权利要求1所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述遗传破坏包括编码所述靶抗原的基因中的破坏。
3.如权利要求1或2所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述靶抗原是由静息T细胞、活化T细胞或两者均表达的抗原，和/或是在所述工程改造的细胞的细胞类型中天然表达的基因产物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中：
所述靶抗原在癌症中细胞表面上表达；或
所述靶抗原在癌症的组织或细胞上或在癌症的组织或细胞中表达。
5.如权利要求4所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述癌症是血液癌症、免疫癌症、白血病、淋巴瘤、和/或骨髓瘤。
6.如权利要求5所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述靶抗原在多发性骨髓瘤中表达。
7.如权利要求1-6中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述靶抗原是CD38。
8.如权利要求1-6中任一项所述的工程改造的细胞，其中靶抗原是CD33或TIM-3或者其中靶抗原是CD26、CD30、CD53、CD92、CD100、CD148、CD150、CD200、CD261、CD262、或CD362。
9.如权利要求1-8所述的细胞，其中所述遗传工程改造的抗原受体是包含特异性结合至所述靶抗原的胞外抗原识别结构域的嵌合抗原受体(CAR)。
10.如权利要求1-6和9中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述靶抗原是在癌症中表达的胞内多肽。
11.如权利要求1-10中任一项所述的工程改造的细胞，其中，所述靶抗原是普遍肿瘤抗原。
12.如权利要求11所述的工程改造的细胞，其中，所述普遍肿瘤抗原是人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。
13.如权利要求11或12所述的工程改造的细胞，其中，所述普遍肿瘤抗原是hTERT或生存素。
14.如权利要求1-13中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是T细胞受体(TCR)。
15.如权利要求1-4中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是包含在主要组织相容性复合物(MHC)分子的情况中特异性结合至所述靶抗原的肽的胞外抗原识别结构域的嵌合抗原受体(CAR)。
16.如权利要求1-15中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体能够诱导针对所述工程改造的免疫细胞的活化信号。
17.如权利要求16所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体包含具有含ITAM基序的胞内结构域。
18.如权利要求17所述的细胞，其中，所述胞内信号转导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链的胞内结构域。
19.如权利要求16-18中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的受体是CAR并且还包含共刺激信号转导区域。
20.如权利要求19所述的细胞，其中所述共刺激信号转导区域包含CD28的信号转导结构域。
21.如权利要求1-20中任一项所述的细胞，其还包含另一种遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至另一种抗原的嵌合共刺激受体并且能够诱导针对所述细胞的共刺激信号。
22.如权利要求21所述的细胞，其中，所述靶抗原和所述另一种抗原是不同的，并且单独选自CD38和CD138。
23.如权利要求1-20中任一项所述的细胞，其中在识别所述靶抗原之后，所述遗传工程改造的抗原受体能够诱导针对所述细胞的抑制性或免疫阻遏或抑制信号。
24.如权利要求23所述的细胞，其中，所述抗原是不在癌细胞或感染的细胞表面上表达的抗原，或者其在癌细胞或感染的细胞上的表达下调。
25.如权利要求23或24所述的细胞，其中，所述抗原是MHC-I类分子。
26.如权利要求23-25中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是T细胞受体(TCR)或功能性非-TCR抗原识别受体。
27.如权利要求23-26中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
28.如权利要求27所述的细胞，其中所述CAR包含胞外抗原识别结构域和胞内信号转导结构域，所述胞外抗原识别结构域特异性结合至靶抗原，并且所述胞内信号转导结构域包含免疫检验点分子的信号转导部分。
29.如权利要求28所述的细胞，其中所述免疫检验点分子是PD-1或CTLA4。
30.如权利要求23-29中任一项所述的细胞，其中，所述抗原受体是第一遗传工程改造的抗原受体，所述靶抗原是第一靶抗原，并且所述免疫细胞还包含第二遗传工程改造的抗原受体，其识别在待治疗的疾病或病症上表达的抗原并且诱导刺激或活化信号，其中所述刺激或活化信号被由所述第一遗传工程改造的抗原受体诱导的抑制性或免疫阻遏或抑制信号诱导的信号减弱。
31.如权利要求23-30中任一项所述的细胞，其中，所述第一靶抗原是在所述工程改造的细胞的细胞类型中天然表达和/或在所述细胞类型活化之后天然上调的基因产物。
32.如权利要求1-31中任一项所述的细胞，其中与在没有所述破坏的免疫细胞中的表达相比，所述工程改造的免疫细胞中靶抗原的表达降低至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
33.如权利要求1-32中任一项所述的细胞，其中，所述免疫细胞是T细胞或NK细胞。
34.如权利要求33所述的细胞，其中，所述免疫细胞是CD4+或CD8+T细胞。
35.一种产生遗传工程改造的免疫细胞的方法，包括：
(a)向免疫细胞中导入特异性结合至靶抗原的遗传工程改造的抗原受体；并且(b)在所述免疫细胞中实现对所述靶抗原表达的抑制，
从而产生遗传工程改造的免疫细胞，其中所述靶抗原的表达被抑制，
其中，步骤(a)和(b)同时或以任意顺序先后进行。
36.如权利要求35所述的方法，其中(b)中的实现包括破坏编码所述靶抗原的基因。
37.如权利要求36所述的方法，其中：
所述破坏包括在DNA水平上破坏所述基因和/或
所述破坏是不可逆的；和/或
所述破坏不是瞬时的。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中，所述破坏包括将特异性结合或杂交至所述基因的DNA-结合核酸或DNA结合蛋白导入所述免疫细胞中。
39.如权利要求38所述的方法，其中，所述破坏包括导入：(a)包含DNA-靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或(b)RNA-引导的核酸酶。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述DNA-靶向蛋白或RNA-引导的核酸酶包括锌指蛋白(ZFP)、TAL蛋白、或所述基因特异性的成簇且规律间隔的短回文核酸(CRISPR)。
41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括导入锌指核酸酶(ZFN)、TAL-效应子核酸酶(TALEN)、或和CRISPR-Cas9组合，其特异性结合至、识别或杂交至所述基因。
42.如权利要求35-41中任一项所述的方法，其中，所述靶抗原是在免疫细胞中天然表达的基因产物和/或其表达由所述遗传工程改造的抗原受体的所述导入诱导。
43.如权利要求35-42中任一项所述的方法，其中，与在没有抑制的情况下由所述方法产生的工程改造的细胞相比，所述抑制使工程改造的免疫细胞中靶抗原的表达降低至少
50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
44.如权利要求34-43中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是T细胞。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述免疫细胞是CD4+或CD8+T细胞。
46.如权利要求35-45中任一项所述的方法，其中，所述靶抗原是由静息T细胞、活化T细胞或两者均表达的抗原。
47.如权利要求35-46中任一项所述的方法，其中，所述靶抗原在多发性骨髓瘤中表达。
48.如权利要求35-47中任一项所述的方法，其中，所述靶抗原是CD38。
49.如权利要求35-47中任一项所述的方法，其中，所述靶抗原是在癌症中表达的胞内蛋白质抗原。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述靶抗原是普遍肿瘤抗原。
51.如权利要求50所述的方法，其中，所述普遍肿瘤抗原是人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。
52.如权利要求50或51所述的方法，其中，所述普遍肿瘤抗原是hTERT或生存素。
53.如权利要求35-52中任一项所述的方法，所述方法还包括：
(c)向所述免疫细胞中导入另一种遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至另一种抗原并且能够诱导针对所述细胞的共刺激信号的嵌合共刺激受体，其中步骤(a)、(b)和(c)同时或以任意顺序先后进行。
54.如权利要求35-53中任一项所述的方法，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是T细胞受体(TCR)或功能性非-TCR抗原识别受体。
55.如权利要求35-54中任一项所述的方法，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
56.一种细胞，通过权利要求35-56中任一项所述的方法产生。
57.一种工程改造的免疫细胞，包含：
(a)第一遗传工程改造的抗原受体，其特异性结合至第一抗原并且能够诱导针对所述细胞的活化信号；和
(b)第二遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至第二抗原的嵌合共刺激受体并且能够诱导针对所述细胞的共刺激信号，
其中，所述第一和第二抗原是不同的，并且单独选自CD38和CD138。
58.一种工程改造的免疫细胞，包含：
(a)第一遗传工程改造的抗原受体，其特异性结合至第一抗原并且能够诱导针对所述细胞的活化信号；和
(b)第二遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至第二抗原的嵌合共刺激受体并且能够诱导针对所述细胞的共刺激信号，
其中所述第一和第二抗原不同并且所述第一或第二抗原中的至少一个是普遍肿瘤抗原。
59.如权利要求58所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述普遍肿瘤抗原是人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白
16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。
60.如权利要求58或59所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述普遍肿瘤抗原是hTERT或生存素。
61.如权利要求58-60中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第一或第二抗原中的另一个是在肿瘤中表达的抗原。
62.如权利要求57-61中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第一遗传工程改造的抗原受体包括含ITAM的序列。
63.如权利要求62所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第一遗传工程改造的抗原受体包括CD3-ζ(CD3ζ)链的胞内信号转导结构域。
64.如权利要求62或63所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第一遗传工程改造的抗原受体不包括来自T细胞共刺激分子的信号转导结构域。
65.如权利要求57-64中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述共刺激受体包括T细胞共刺激分子的胞内信号转导结构域。
66.如权利要求65所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述T细胞共刺激分子包括选自CD28和41BB的一种或多种分子。
67.如权利要求57-66中任一项所述的工程改造的免疫细胞，还包含编码所述第一抗原的基因和/或编码所述第二抗原的基因中的破坏，所述破坏导致所述工程改造的免疫细胞中所述第一和/或第二抗原的表达降低。
68.如权利要求67所述的工程改造的免疫细胞，其中与在没有所述基因破坏的免疫细胞中的表达相比，所述工程改造的免疫细胞中所述第一和/或第二抗原的表达降低至少
50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
69.如权利要求57-68中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是T细胞。
70.如权利要求69所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是CD4+或CD8+T细胞。
71.如权利要求57-70中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，第一遗传工程改造的抗原受体是T细胞受体(TCR)或功能性非-TCR抗原识别受体。
72.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第一遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
73.一种包含权利要求1-32中任一项和权利要求57-72中任一项所述的工程改造的免疫细胞和药学上可接受运载体的药物组合物。
74.一种治疗方法，包括向具有疾病或病症的对象给予权利要求1-33和57-72中任一项所述的细胞或权利要求73所述的药物组合物。
75.如权利要求74所述的方法，其中，一种或多种所述遗传工程改造的抗原受体特异性结合至与所述疾病或病症相关联的抗原。
76.如权利要求74或75所述的方法，其中，所述疾病或病症是癌症。
77.一种药物组合物，包含权利要求1-33和57-72中任一项所述的工程改造的免疫细胞或权利要求73所述的药物组合物，其用于治疗对象中的疾病或病症。
78.包含权利要求1-33和57-72中任一项所述的工程改造的免疫细胞的组合物或权利要求73所述的组合物在制备用于治疗对象中的疾病或病症的药物中的用途。
79.如权利要求77所述的组合物或如权利要求78所述的用途，其中，一种或多种所述遗传工程改造的抗原受体特异性结合至与所述疾病或病症相关联的抗原。
80.如权利要求77-79中任一项所述的组合物或用途，其中，所述疾病或病症是癌症。
81.一种产生工程改造的免疫细胞的方法，所述方法包括：
(a)向免疫细胞中导入特异性结合至第一抗原的第一遗传工程改造的抗原受体；并且(b)向所述免疫细胞中导入第二遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至第二抗原的嵌合共刺激受体，
从而产生所述工程改造的免疫细胞，
其中，所述第一和第二抗原不同并且单独选自CD38和CD138，并且(a)和(b)同时或以任意顺序依次进行。
82.一种产生遗传工程改造的免疫细胞的方法，所述方法包括：
(a)向免疫细胞中导入特异性结合至第一抗原的第一遗传工程改造的抗原受体；并且(b)向所述免疫细胞中导入第二遗传工程改造的抗原受体，其是嵌合共刺激受体并特异性结合至第二抗原，
从而产生所述工程改造的免疫细胞，
其中，所述第一和第二抗原不同并且至少所述第一或第二抗原是普遍肿瘤抗原并且(a)和(b)同时或以任意顺序依次进行。
83.如权利要求82所述的方法，其中，所述普遍肿瘤抗原是人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。
84.如权利要求82或83所述的方法，其中，所述普遍肿瘤抗原是hTERT或生存素。
85.如权利要求82-84中任一项所述的方法，其中，所述第一或第二抗原中的另一个是在肿瘤中表达的抗原。
86.如权利要求81-85中任一项所述的方法，还包括(c)在所述免疫细胞中实现所述第一和/或第二抗原的表达的抑制。
87.如权利要求86所述的方法，其中，所述破坏包括将特异性结合或杂交至所述基因的DNA-结合核酸或DNA结合蛋白导入所述免疫细胞中。
88.如权利要求86或87所述的方法，其中，所述破坏包括导入锌指核酸酶(ZFN)、TAL-效应子核酸酶(TALEN)、或和CRISPR-Cas9组合，其特异性结合至、识别或杂交至该基因。
89.如权利要求81-88中任一项所述的方法，其中，与在没有抑制的情况下由所述方法产生的工程改造的细胞相比，所述抑制使工程改造的免疫细胞中所述靶抗原的表达降低至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
90.一种细胞，通过权利要求81-89中任一项所述的方法产生。
用于过继细胞治疗的工程改造的细胞
[0001] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请与电子格式的 序列表一同 提交。所提供的 序列表名称为735042000540seqlist.txt，创建于2015年7月15日，其文件大小为43kb。该序列表的电子格式的信息通过引用其全文纳入本文。
技术领域
[0005] 本公开在一些方面涉及用于过继治疗的工程改造的细胞，包括NK细胞和T细胞。在一些方面中，本发明还涉及用于工程改造和产生所述细胞的方法和组合物、含有该细胞的组合物、和用于向对象给予它们的方法。在一些方面中，方法和细胞的特征提供了特异性和/或功效。在一些实施方式中，细胞含有特异性结合至抗原的遗传工程改造的抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)和共刺激受体。在一些实施方式中，细胞包括靶向多种抗原的受体。在一些实施方式中，细胞包括，例如，通过破坏编码基因产物的基因来抑制一种或多种基因产物。在一些实施方式中，破坏编码由工程改造的抗原受体识别的抗原的基因，降低工程改造的细胞的靶向的可能性。
[0006] 背景
[0007] 有多种策略可用于产生并给予用于过继治疗的工程改造的细胞。例如，有策略可用于工程改造表达遗传上工程改造的抗原受体(如CAR)的免疫细胞，并且用于抑制或阻遏细胞中的基因表达。需要改善的策略，例如，以提供更广泛的靶抗原和可用这种细胞治疗的疾病，以改善细胞的特异性或选择性，例如，以避免脱靶效应，并且改善细胞的功效，例如，通过在给予对象之后避免阻遏效应功能并改善细胞的活性和/或存活。提供满足此类需求的方法、细胞、组合物、试剂盒和系统。
[0008] 概述
[0009] 提供了细胞，包括工程改造的细胞，如工程改造的免疫或免疫刺激细胞，以及产生和使用细胞的方法，如用于过继治疗中，和含有细胞的组合物，如药物组合物。所述细胞包括具有一种或多种特征的那些，如双抗原靶向特征和/或基因破坏，其本身或一起提供改善的安全性、特异性、选择性和/或功效，和/或允许通过过继治疗靶向更广泛范围的抗原或疾病。
[0010] 在一些实施方式中，细胞是工程改造的细胞，其包括：特异性结合至靶抗原的遗传工程改造的受体；和编码靶抗原的基因的破坏，所述破坏导致工程改造的细胞中靶抗原表达降低。在一些方面中，靶抗原是在静息T细胞、活化T细胞或两者的表面上表达的抗原。在一些方面中，靶抗原在癌症，如血液癌症、免疫癌症、白血病、淋巴瘤、和/或骨髓瘤，如多发性骨髓瘤的细胞表面上表达。
[0011] 在一些方面中，如在抗原受体诱导活化信号或者产生表达靶抗原的细胞处引导的免疫应答的信号的情况中，靶抗原是在待治疗的疾病或病症如癌症上表达但也通常在正经工程改造或要求用于过继细胞治疗的细胞上表达的抗原。在一些方面中，靶抗原是普遍肿瘤抗原，在一些方面中，是在工程改造的细胞内或其上天然表达的和/或在活化T细胞内或其上表达的或者在活化T细胞内或其上表达上调的抗原。在一些方面中，普遍肿瘤抗原是人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素(livin)、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。例如，靶抗原是hTERT或生存素。在一些方面中，靶抗原是CD38。在其他方面中，靶抗原是CD33或TIM-3。在其他方面中，其是CD26、CD30、CD53、CD92、CD100、CD148、CD150、CD200、CD261、CD262、或CD362。
[0012] 在一些方面中，如在受体诱导阻遏或抑制，例如，免疫阻遏信号的情况中，抗原是不在疾病或病症中表达的抗原。在一些方面中，其中在识别靶抗原之后，遗传工程改造的抗原受体能够诱导针对细胞的抑制性或免疫阻遏或抑制信号。在一些方面中，抗原是不在癌细胞或感染的细胞表面上表达的抗原，或者其在癌细胞或感染的细胞上表达下调。这类抗原的示例是MHC-I类分子。
[0013] 在一些实施方式中，抗原是在工程改造的细胞的细胞类型中天然表达的基因产物。在一些实施方式中，与在没有所述基因破坏的免疫细胞中的表达相比，工程改造的细胞中靶抗原的表达降低至少50、60、70、80、90、或95％。在一些实施方式中，破坏包括删除基因的至少一个外显子的至少部分；包括基因中的缺失、突变和/或插入，其导致基因中存在提早终止密码子；和/或包括基因的第一或第二外显子内的缺失、突变、和/或插入。
[0014] 细胞类型包括T细胞、NK细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、和干细胞，如诱导性多能干细胞(iPS细胞)。
[0015] 在一些实施方式中，遗传工程改造的抗原受体能够诱导针对细胞的活化信号。在一些方面中，遗传工程改造的抗原受体包含具有含ITAM基序的胞内结构域。在一些方面中，遗传工程改造的抗原受体是T细胞受体(TCR)或功能性非TCR抗原识别受体。在一些方面中，其是嵌合抗原受体(CAR)，如活化或刺激性CAR，抑制性CAR和/或共刺激性CAR。CAR包括具有特异性结合至靶抗原的胞外抗原识别结构域和包含ITAM的胞内信号转导结构域，如CD3-ζ(CD3-zeta)链的胞内结构域，还包括共刺激信号转导区域，如CD28或41BB的信号转导结构域的那些。在一些方面中，CAR包含特异性结合至靶抗原的胞外抗原识别结构域和包含免疫检验点分子，如PD-1或CTLA4的信号转导部分的胞内信号转导结构域。
[0016] 在一些方面中，细胞包含另一种遗传工程改造的抗原受体，如共刺激受体，如嵌合共刺激受体，其特异性结合至另一种抗原并且能够诱导针对该细胞的共刺激信号。在一些方面中，所述另一种靶抗原和由第一受体识别的第一靶抗原不同。在一些实施方式中，这类抗原中的至少一种选自人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)，并且其他为在肿瘤或癌症上表达的另一种抗原，并且在一些情况中表达在特定类型的肿瘤或癌症上，并且不在一种或多种特定其他类型的癌症上。在一些方面中，这种其他抗原是多发性骨髓瘤相关或多发性骨髓瘤特异性抗原，如CD38或CD138或BCMA或CS-1；在一些方面中，这种其他抗原表达在一种或多种血液癌症或一种或多种实体瘤类型上。在一些方面中，靶抗原和所述另一种抗原是不同的，并且单独选自CD38和CD138。在一些这类方面中，细胞还包括其他遗传工程改造的抗原受体，其识别在待治疗疾病或病症上表达的抗原或者诱导刺激或活化信号，其被第一遗传工程改造的抗原受体减弱。
[0017] 还提供了产生细胞的方法和通过所述方法产生的细胞。在一些实施方式中，通过(a)向免疫细胞中导入特异性结合至靶抗原的遗传工程改造的抗原受体；和(b)实现对免疫细胞中靶抗原表达的抑制来进行该方法，从而产生遗传工程改造的免疫细胞，其中所述靶抗原的表达被抑制。在一些方面中，步骤(a)和(b)同时或以任意顺序先后进行。
[0018] 在一些实施方式中，(b)中的实现包括破坏编码靶抗原的基因，该破坏包括在DNA水平上破坏基因和/或所述破坏是不可逆的；和/或所述破坏不是瞬时的。在一些方面中，破坏包括将特异性结合或杂交至该基因的DNA-结合核酸或DNA结合蛋白导入免疫细胞中。
[0019] 在一些实施方式中，破坏包括导入：(a)包含DNA-靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或(b)RNA-引导的核酸酶。例如，在一些实施方式中，DNA-靶向蛋白或RNA-引导的核酸酶包括锌指蛋白(ZFP)、TAL蛋白、或该基因特异性的成簇且规律间隔的短回文核酸(CRISPR)。在一些实施方式中，破坏包括导入锌指核酸酶(ZFN)、TAL-效应子核酸酶(TALEN)、或和CRISPR-Cas9组合，其特异性结合至、识别或杂交至该基因。在一些实施方式中，通过将包含编码DNA-结合蛋白、DNA-结合核苷酸、和/或包含DNA-结合蛋白或DNA-结合核苷酸的复合物的序列的核酸导入细胞来进行所述导入。在一些实施方式中，核酸是病毒载体。
[0020] 在一些实施方式中，对基因的特异性结合在基因的外显子内和/或在基因的部分内，其编码靶抗原的N-末端。在一些实施方式中，导入由此实现了基因中的移码突变和/或在基因的编码区内插入早期终止密码子。
[0021] 在一些实施方式中，该方法还包括(c)导入另一个遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至另一种抗原并且能够诱导针对细胞的共刺激信号的嵌合共刺激受体，其中步骤(a)、(b)和(c)同时或以任意顺序先后进行。还提供了由该方法产生的细胞。
[0022] 在一些实施方式中，工程改造的细胞包括：(a)第一遗传工程改造的抗原受体，其特异性结合至第一抗原并且能够诱导针对该细胞的活化信号；和(b)第二遗传工程改造的抗原受体，其是共刺激受体如特异性结合至第二抗原并且能够诱导针对该细胞的共刺激信号的嵌合共刺激受体(例如，其为第一受体与其抗原结合后该细胞或其特定效应功能的完全活化所需)。在一些这类实施方式中，第一和第二抗原是不同的并且至少一个选自下组：人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1
(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53和细胞周期蛋白(D1)。
第一第二抗原中的另一个可以是来自hTERT、生存素、MDM2、CYP1B、HER2/neu、WT1、活素、AFP、CEA、MUC16、MUC1、PSMA、p53或细胞周期蛋白(D1)中任意的不同抗原，或者可以是另一种肿瘤抗原。
(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53和细胞周期蛋白(D1)。
第一第二抗原中的另一个可以是来自hTERT、生存素、MDM2、CYP1B、HER2/neu、WT1、活素、AFP、CEA、MUC16、MUC1、PSMA、p53或细胞周期蛋白(D1)中任意的不同抗原，或者可以是另一种肿瘤抗原。
[0023] 在一些实施方式中，工程改造的细胞包括：(a)第一遗传工程改造的抗原受体，其特异性结合至第一抗原并且能够诱导针对该细胞的活化信号；和(b)第二遗传工程改造的抗原受体，其是共刺激受体如特异性结合至第二抗原并且能够诱导针对该细胞的共刺激信号的嵌合共刺激受体(例如，其为第一受体与其抗原结合后该细胞或其特定效应功能的完全活化所需)。在一些这类实施方式中，第一和第二抗原是不同的，并且单独选自下组：CD38、CS-1、和CD138。
[0024] 在一些实施方式中，工程改造的细胞包括(a)第一遗传工程改造的抗原受体，其特异性结合至第一抗原并且能够诱导针对该细胞的活化信号；和(b)第二遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至第二抗原并且能够诱导针对该细胞的共刺激信号的嵌合共刺激受体，其中第一和第二抗原是不同的，并且单独选自CD38和CD138。
[0025] 在一些实施方式中，工程改造的免疫细胞包括(a)第一遗传工程改造的抗原受体，其特异性结合至第一抗原并且能够诱导针对该细胞的活化信号；和(b)第二遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至第二抗原并且能够诱导针对该细胞的共刺激信号的嵌合共刺激受体，其中第一和第二抗原是不同的并且第一或第二抗原是CS-1。
[0026] 在一些实施方式中，第二抗原是在多发性骨髓瘤中表达的抗原。
[0027] 在一些实施方式中，第一遗传工程改造的抗原受体包括含ITAM的序列，第一遗传工程改造的抗原受体包括CD3-ζ(CD3-zeta)链的胞内信号转导结构域，和/或第一遗传工程改造的抗原受体不包括来自T细胞共刺激分子信号转导结构域，如具有T细胞共刺激分子的胞内信号转导结构域，如选自CD28和41BB的一种或多种分子。
[0028] 在一些方面中，(a)第一抗原是CD38并且第二抗原是CD138；(b)第一抗原是CD38并且第二抗原是CS-1；(c)第一抗原是CD138并且第二抗原是CD38；(d)第一抗原是CD138并且第二抗原是CS-1；(e)第一抗原是CS-1并且第二抗原是CD38；或(f)第一抗原是CS-1并且第二抗原是CD138。在一些情况中，细胞还包括识别第三抗原的第三遗传工程改造的抗原受体。
[0029] 在一些方面中，第一遗传工程改造的抗原受体含有胞外抗原识别结构域，其以至少10-8M、至少10-7M、至少10-6M、至少10-5M、10-5M、或10-4M的解离常数(KD)特异性结合至第一靶抗原。在一些方面中，第一遗传工程改造的抗原受体的连接和第二遗传工程改造的抗原受体的连接诱导细胞中的应答，该应答不被遗传工程改造的抗原受体之一的连接单独诱导。
[0030] 在一些实施方式中，应答选自下组：增殖、细胞因子分泌、和细胞毒性活性。在一些实施方式中，细胞还包括在编码第一抗原的基因和/或编码第二抗原的基因中的破坏，所述破坏导致工程改造的免疫细胞中第一和/或第二抗原的表达降低，如通过本文所述的破坏，例如，其中破坏的基因编码CD38。
[0031] 还提供了包含细胞，和在一些方面中，包含运载体，如药学上可接受的运载体的组合物，包括药物组合物。疾病和病症包括癌症和感染性疾病，如血液癌症、白血病、淋巴瘤、和多发性骨髓瘤。
[0032] 发明详述
[0033] I.提供过继细胞治疗中特异性和/或功效的方法和组合物
[0034] 提供了用于过继细胞治疗，例如，过继免疫治疗的细胞。细胞包括免疫细胞，如T细胞和NK细胞，并且一般表达遗传工程改造的抗原受体，如工程改造的TCR和/或嵌合抗原受体(CAR)。还提供了该细胞的用途和方法，如在治疗包括多发性骨髓瘤(MM)的癌症中的过继治疗中的用途和方法。还提供了用于工程改造、制备、和产生该细胞的方法，含有该细胞的组合物，以及含有并用于使用、产生和给予该细胞的装置和试剂盒。在一些实施方式中，该实施方式提供了抗原特异性过继细胞疗法的改善的选择性、特异性、和/或功效，和/或拓展了可通过过继细胞治疗靶向的靶抗原、疾病和/或病症的范围。
[0035] 一般通过导入一种或多种遗传工程改造的核酸或其产物来对细胞进行工程改造。这类产物包括遗传工程改造的抗原受体，包括遗传工程改造的T细胞受体(TCR)和功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，包括活化、刺激性和共刺激性CAR，及其组合。
[0036] 细胞还包括其中特定基因已被破坏的那些，包括编码由嵌合抗原受体(CAR)或该细胞表达的其他工程改造的抗原受体识别的抗原的基因。在一些实施方式中，抑制的基因是编码由遗传工程改造的抗原受体(如活化、抑制性或共刺激性CAR)靶向的抗原的基因。因此，还提供了实现内源性基因的表达和/或破坏的核酸，如通过基因编辑。还提供了其中一种或多种基因表达减少的细胞和实现抑制的方法。
[0037] 在一些实施方式中，例如，在活化或共刺激抗原受体的情况中，例如，活化CAR或共刺激性CAR，抑制编码在工程改造的细胞中表达的抗原的基因避免或降低了工程改造的细胞本身被针对杀伤或抑制靶向的可能性，从而改善了过继细胞治疗中细胞的功效和/或持续性或扩增。因此，在一些方面中，这种破坏避免或降低了工程改造的细胞被工程改造的细胞自身靶向的可能性。
[0038] 例如，靶向同时由该细胞表达的抗原的抗原特异性细胞，如抗原特异性T细胞可诱导细胞的自相残杀(fratricide killing)。在一些情况中，在针对生存素、hTERT、p53和其他在活化T细胞中表达的蛋白质抗原的抗原特异性T细胞的培养中观察到T细胞的自伤残杀(Turksma等，(2013)Journal of Translational Medicine，11：152；Leisegang等，(2010)J Clin.Invest.，120：3869-3877；Chen等，(2007)Cancer Biol Ther.，6：1991-1996；Theoret等，(2008)Hum Gene Ther.，19：1219-1232)。检测免疫细胞的自伤残杀，如自杀伤(self-killing)的方法可包括，例如，其中用抗原受体(例如，TCR或CAR或其他抗原受体)遗传工程改造的T细胞体外培养，例如，持续长达2周，并使用多种测试中的任意种随时间监测细胞增殖、活力和/或细胞毒性的方法。在一些情况中，用7-AAD或其他染料或其他用于区分活力和细胞死亡或凋亡或凋亡途径活化的试剂对培养的细胞进行染色。在一些示例中，可使用细胞毒性实验，如用于评价铬释放的试验评价抗原特异性免疫细胞的自相残杀诱导的细胞毒性。在一些情况中，表达遗传工程改造的抗原受体的免疫细胞本身的自杀伤可能限制了在过继细胞治疗中使用某些抗原特异性免疫细胞的方法，由于在给予之前和/或在体内给予之后可能通过离体自相残杀来消除这类细胞。群内工程改造的细胞的自杀伤可通过由同一细胞杀伤这种工程改造的细胞群内的单个细胞，或由群内的其他细胞杀伤来进行。
[0039] 提供了克服这类问题的方法和细胞。例如，在一些实施方式中，在细胞中抑制编码由一种或多种遗传工程改造的抗原受体特异性结合的抗原的基因的表达。通过抑制免疫细胞中的特异性抗原，防止或减少了免疫细胞本身的自相残杀。在一些实施方式中，如与细胞表达工程改造的抗原受体，但是由此靶向的基因或抗原或其表达还未破坏的细胞或细胞群相比，自相残杀(例如，通过增殖、活力和/或细胞毒性试验评价)降低至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些方面中，这类特征在过继细胞治疗的情况中赋予改善的特异性和/或功效。
[0040] 这类抗原包括在免疫系统的癌症，如白血病、淋巴瘤、和/或骨髓瘤如多发性骨髓瘤中表达的那些，和/或在T细胞和/或NK细胞，包括活化T细胞上表达的那些抗原。示例性的抗原是在活化或刺激的T细胞或NK细胞，或其亚组，尤其是由刺激条件产生的活化细胞上表达的那些，使用该刺激条件来促进导入编码CAR或其他工程改造的受体的核酸。例如，这类抗原包括一般不在静息T细胞上表达但是其表达在T细胞活化后被诱导和/或其在活化的T细胞上表达的那些。在一些实施方式中，该基因编码普遍肿瘤抗原，如hTERT、生存素、MDM2、CYP1B、HER2/neu、WT1、活素、AFP、CEA、MUC16、MUC1、PSMA、p53或细胞周期蛋白(D1)。例如，基因编码hTERT或生存素。在一些实施方式中，基因编码抗原CD38。在一些实施方式中，基因编码抗原CD33或TIM-3；在一些实施方式中，其编码抗原CD26、CD30、CD53、CD92、CD100、CD148、CD150、CD200、CD261、CD262、或CD362。
[0041] 在一些实施方式中，通过破坏编码该抗原的基因，如通过删除，例如，删除整个基因、外显子或区域，和/或用外源性序列置换，和/或通过突变，例如，移码或错义突变，在基因内，一般在基因的外显子内，来实现抑制。在一些实施方式中，破坏导致提早终止密码子(premature stop codon)被纳入基因中，使得抗原不被表达或者不被以由抗原受体识别的形式表达。一般在DNA水平上进行破坏。破坏一般是永久的、不可逆的，或者不是瞬时的。在其他实施方式中，使用瞬时或可逆抑制策略，如使用RNAi的基因敲减。在一些实施方式中，通过破坏或者抑制遗传工程的细胞上的抗原表达，本文提供的方法和组合物避免或降低了工程改造的细胞杀伤工程改造的细胞自身的可能性，从而促进了功效。
[0042] 在一些实施方式中，细胞包括增加细胞功效的特征，并且通过在工程改造的细胞中破坏基因表达来提供方法。在一些方面中，破坏的基因编码检验点分子、免疫阻遏分子如向细胞递送免疫阻遏信号的受体、和/或可降低工程改造的细胞的响应稳健性的任何分子，例如，在与免疫治疗联合给予之后。
[0043] 在一些实施方式中，例如，在抗原由抑制CAR识别的情况中，基因破坏防止或降低由工程改造的细胞本身表达的抑制CAR结合至也由工程改造的细胞表达的分子，从而工程改造的细胞诱导对信号转导或靶向免疫应答的消减效果的可能性。这类抗原的示例是在正常或非靶向或脱靶细胞上表达(使得包括抑制CAR分子以防止脱靶效应)，但也在用于遗传工程改造的细胞类型，如T细胞或NK细胞上表达的那些抗原。示例性的抗原是MHC分子，如MHC-I类分子，其可在一些情况中，在免疫逃逸、癌症、或感染的情况中被下调，但一般在有核细胞上表达。其他示例是也在T细胞、NK细胞、或其他针对细胞治疗工程改造的细胞上表达的任何抑制性CAR靶标。
[0044] 在其他实施方式中，一种或多种破坏的基因是除了编码该抗原的基因以外的基因，如编码免疫阻遏分子，例如检验点分子或腺苷受体(例如，A2AR)的基因。
[0045] 在一些方面中，通过基因编辑，如使用DNA结合蛋白或DNA-结合核酸来进行破坏，其特异性结合至或杂交至破坏所靶向的区域处的基因。在一些方面中，蛋白质或核酸与核酸酶偶联或络合，如以嵌合或融合蛋白的形式。例如，在一些实施方式中，使用包含DNA-靶向蛋白和核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)或TAL-效应子核酸酶(TALEN)、或RNA-引导的核酸酶如成簇且规律间隔的短回文核酸(CRISPR)-Cas系统，如CRISPR-Cas9系统的对破坏的核酸有特异性的融合体来实现破坏。
[0046] 在一些实施方式中，通过靶向多种抗原的策略来实现改善的选择性和特异性。这类策略一般包括多个抗原结合结构域，其一般存在于不同的遗传工程改造的受体上并且特异性结合至不同抗原。因此，在一些实施方式中，细胞经工程改造具有结合超过一种抗原的能力。在一些方面中，多种遗传工程改造的抗原受体被导入细胞中，其特异性结合至不同抗原，各自在待用细胞或组织或其细胞靶向的疾病或病症内或其上表达。这类特性可在一些方面中解决或降低脱靶效应的可能性。例如，在疾病或病症中表达的单抗原也在非疾病或正常细胞内或其上表达的情况中，这种多重靶向方法可通过需要多个抗原受体的结合以活化细胞或诱导特定效应功能提供针对所需细胞类型的选择性。
[0047] 在一些实施方式中，细胞表达识别第一抗原的第一遗传工程改造的抗原受体和识别第二抗原的第二遗传工程改造的抗原受体，如共刺激受体；在一些实施方式中，其他受体识别第三，或更多抗原。在一些方面中，各抗原在靶细胞、疾病或病症，如肿瘤、癌症、恶性肿瘤或感染性疾病的情况中表达。在一些方面中，一种或多种抗原也在不希望由细胞治疗靶向的细胞上或者在组织或环境中表达，如在正常或无病组织中。在一些实施方式中，多种受体和/或多种抗原识别组分的存在避免或降低了对这类组织、细胞或环境的脱靶效应的可能性。因此，在一些方面中，提供的细胞和方法的特征避免或降低了在除了由细胞治疗靶向的那些以外的细胞、组织或环境处引导的细胞应答的不合适活化的可能性。例如，在一些实施方式中，它们避免或降低了脱靶效应的可能性。
[0048] 在一些方面中，遗传工程改造的抗原受体中的至少一种针对靶抗原有特异性，该靶抗原是在超过一种类型的肿瘤上表达的普遍肿瘤抗原。例如，细胞包括靶向多种抗原的那些，其中靶抗原中的至少一种是hTERT、生存素、MDM2、CYP1B、HER2/neu、WT1、活素、AFP、CEA、MUC16、MUC1、PSMA、p53或细胞周期蛋白(D1)。在一些实施方式中，由一种或多种其他遗传工程改造的抗原受体靶向的一种或其他抗原是在肿瘤或癌症上表达的抗原。
[0049] 在一些方面中，疾病或病症是多发性骨髓瘤，靶细胞是多发性骨髓瘤细胞，和/或靶抗原是在多发性骨髓瘤中表达的抗原。细胞包括靶向多种抗原的那些，所述多种抗原在疾病或病症如多发性骨髓瘤中表达，如CD38、CD138和/或CS-1的组合。待靶向的抗原的示例性组合包括CD38、CD138、和/或CS-1中的两种或更多种。在一些方面中，细胞识别在多发性骨髓瘤中表达的2种或更多种抗原，其中的一种或更多种也可在正常或非癌细胞上表达。在一些实施方式中，抗原包括CD38、CD138、和CS-1中的两种或更多种。
[0050] 在一些实施方式中，多种抗原-识别结构域或多种抗原受体经设计或工程改造，使得仅在该多种受体或抗原-识别结构域的特异性结合或连接之后，而不是在由仅单一受体或结构域连接或结合至抗原之后在细胞中诱导应答。在一些方面中，第一受体包括活化结构域，如含ITAM的基序，如CD3-ζ链的免疫刺激结构域。在一些方面中，第二受体是共刺激受体，其并不包括这种活化结构域但包括共刺激结构域，例如，其增强由第一受体连接诱导的信号。在一些方面中，正常细胞也表达或可表达由活化受体识别的抗原。
[0051] 在一些实施方式中，细胞包括识别不同抗原的多个遗传工程改造的抗原受体并且也包括基因破坏，例如，在编码由一种或多种抗原受体靶向的抗原的基因中的破坏。在一些实施方式中，在导入抗原受体之前进行基因破坏；在一些实施方式中，在导入抗原受体的同时进行。在一些方面中，导入抗原受体实现基因破坏，如通过同源重组插入破坏的基因的基因座。
[0052] 还提供了用于产生工程改造的细胞的方法、化合物和组合物、提供了用于细胞分离、遗传工程改造和基因破坏的方法。提供了核酸，如构建体，例如，编码遗传工程改造的抗原受体和/或编码用于靶向的基因破坏的核酸和/或蛋白质的病毒载体，和用于向细胞中导入这类核酸的方法，如通过转导。还提供了含有工程改造的细胞的组合物，以及用于向对象给予细胞或组合物，如用于过继细胞治疗的方法、试剂盒和装置。在一些方面中，细胞从对象中分离，经工程改造，并给予同一对象。在其他方面中，它们从一个对象中分离，经工程改造，并给予另一个对象。
[0053] A.细胞，细胞制备和培养
[0054] 在一些实施方式中，细胞，例如，工程改造的细胞是真核细胞，如哺乳动物细胞，例如，人细胞。在一些实施方式中，细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如，骨髓或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，一般是T细胞和/或NK细胞。其他示例性的细胞包括干细胞，如专能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些方面中，细胞是人细胞。细胞一般是原代细胞，如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的那些细胞。在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由功能、活化状态、成熟、分化潜力、扩增、再循环、定位、和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或隔室中的存在、标志物或细胞因子分泌概况、和/或分化程度限定的那些。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体和/或自体的。方法包括现成的方法。在一些方面中，如对于现成的技术，细胞是多能和/或专能的，如干细胞，如诱导性多能干细胞(iPSC)。
在一些实施方式中，该方法包括从对象分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程改造，如本文所述，并且在冷冻保存前或后将其再导入同一患者。
在一些实施方式中，该方法包括从对象分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程改造，如本文所述，并且在冷冻保存前或后将其再导入同一患者。
[0055] T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括：原初T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型、例如干细胞记忆T(TSCM)、中心记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)、或最终分化的效应记忆T细胞、肿瘤-浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关的非变体T(MAIT)细胞、天然产生的和过继性调节T(Treg)细胞、辅助性T细胞、例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞、α/βT细胞，和δ/γT细胞。
[0056] 在一些实施方式中，富集或消耗的T细胞群中的一种或多种是：呈阳性(标志物+)或表达高水平(标志物高)的一种或多种具体标志物(例如表面标志物)的细胞，或呈阴性(标志物-)或表达相对较低的水平(标志物低)的一种或多种标志物的细胞。在一些情况中，此类标志物在某些T细胞群(例如非记忆细胞)上不存在或以相对较低的水平表达，但在某些其它T细胞群(例如记忆细胞)上存在或以相对较高的水平表达的那些。在一个实施方式中，对所述细胞(例如CD8+细胞或T细胞，例如，CD3+细胞)富集(即，正选择)CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L呈阳性或表达高表面水平的CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L的细胞，和/或，消耗(例如，负选择)CD45RA阳性或表达高表面水平的CD45RA的细胞。在一些实施方式中，对细胞富集或消耗CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Rα(CD127)阳性细胞或表达高表面水平的CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Rα(CD127)的细胞。在一些实例中，对CD8+T细胞富集CD62L和CD45RO阳性(或CD45RA阴性)细胞。
[0057] 在一些实施方式中，对CD4+T细胞群和CD8+T细胞亚群，例如，富集中心记忆(TCM)细胞的亚群。
[0058] 在一些实施方式中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞，和/或嗜碱性粒细胞。
[0059] 细胞制备
[0060] 一般从样品，如生物样品(例如，从对象获得或衍生自对象)中分离含有用于工程改造的细胞的组合物和细胞。在一些实施方式中，从中分离细胞的对象是患有特定疾病或病症或需要细胞治疗或将给予细胞治疗的对象。在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物，如人，例如需要特定治疗性介入的对象，如过继细胞治疗，细胞经分离、处理和/或工程改造用于该治疗。
[0061] 因此，在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。所述样品包括直接取自对象的组织、体液和其它样品，以及获自一个或多个处理步骤，例如分离、离心、遗传工程改造(例如采用病毒载体的转导)、清洗和/或孵育的样品。所述生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于，体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑膜液、尿液和汗液，组织和器官样品，包括源自它们的经处理的样品。
[0062] 在一些方面中，从中衍生或分离细胞的样品是血液或血液源性的样品，或者，是或源自单采或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关的淋巴样组织、粘膜相关的淋巴样组织、脾、其它淋巴样组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体，或其它器官，和/或源自其中的细胞。在细胞治疗(例如，过继细胞治疗)的情况中，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
[0063] 在一些实施方式中，所述细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种异体来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类、和猪。
[0064] 细胞处理，制备和不基于亲和性的分离
[0065] 在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或不基于亲和性的细胞分离步骤。在一些实例中，细胞在一种或多种物质的存在下经清洗、离心和/或孵育，例如，以移除不需要的组分，富集所需组分，裂解或移除对具体物质敏感的细胞。在一些实例中，细胞基于一种或多种性质，例如密度、粘附性质、尺寸、对具体组分的敏感性和/或抗性被分离。
[0066] 在一些实例中，例如，通过单采或白细胞去除术，获得来自对象循环血液的细胞。在一些方面中，所述样品包括淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核血液白细胞、血红细胞，和/或血小板，和，在一些方面中包括与血红细胞和血小板不同的细胞。
[0067] 在一些实施方式中，从所述对象收集的血液细胞经清洗，例如，以移除血浆部分，并将该细胞置于合适的缓冲液或培养基中以供后续处理步骤。在一些实施方式中，所述细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。在一些实施方式中，清洗溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或全部二价阳离子。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过半自动化的“流通”离心法(例如，Cobe 2991细胞处理器，百特公司(Baxter))完成。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过内切流过滤(TFF)完成。在一些实施方式中，在清洗后，所述细胞在多种生物相++ ++容缓冲液中重悬，例如，无Ca /Mg PBS。在某些实施方式中，移除血液细胞样品组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
[0068] 在一些实施方式中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，例如，通过裂解血红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心来从外周血制备血液白细胞。
[0069] 基于亲和性和/或标志物概况的分离
[0070] 在一些实施方式中，所述分离方法包括，基于细胞中一种或多种特定分子，例如表面标志物，例如，表面蛋白质、胞内标志物或核酸的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可采用基于此类标志物进行分离的任何已知方法。在一些实施方式中，所述分离是基于亲和性或基于免疫亲和性的分离。例如，在一些方面中，所述分离包括基于细胞的一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性结合至此类标志物的抗体或结合伴侣孵育，随后通常是清洗步骤，和从尚未结合至所述抗体或结合伴侣的那些细胞分离已结合所述抗体或结合伴侣的细胞。
[0071] 此类分离步骤可基于正选择，其中已结合所述试剂的细胞被保留用于进一步应用，和/或，负选择，其中尚未结合至所述抗体或结合伴侣的细胞被保留。在一些实例中，两种部分均保留用于进一步应用。在一些方面中，当没有可用于在异质群中特异性地鉴定细胞类型的抗体时，负选择可能是特别有用的，从而分离最好基于通过与所需群不同的细胞表达的标志物进行。
[0072] 所述分离不需导致具体细胞群或表达具体标志物的细胞的100％的富集或移除。例如，正选择或富集具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，增加所述细胞的数量或百分数，但不需要导致不表达所述标志物的细胞完全不存在。同样地，负选择、移除或消耗具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，减少所述细胞的数量或百分数，但不需要导致所有此类细胞的完全移除。
[0073] 在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中，对来自一个步骤的正或负选择的部分进行另一分离步骤，例如后续正或负选择。在一些实例中，单一分离步骤同时消耗表达多重标志物的细胞，例如通过孵育使细胞与各自对负选择靶向的标志物具有特异性的多种抗体或结合伴侣孵育。同样地，可通过将细胞与各种细胞类型上表达的多种抗体或结合伴侣孵育来对多重细胞类型进行同时正选择。
[0074] 例如，在一些方面中，T细胞的特定亚群，例如一种或多种表面标志物阳性细胞或表达高水平的一种或多种表面标志物的细胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞，通过正或负选择技术分离。
[0075] 例如，CD3+、CD28+ T细胞可以采用CD3/CD28连接的磁珠(例如，DYNA M-450 CD3/CD28 T细胞扩增器)来正选择。
[0076] 在一些实施方式中，分离通过如下方式进行：通过正选择富集具体细胞群或通过负选择消耗具体细胞群。在一些实施方式中，正或负选择通过将细胞与特异性结合至一种或多种表面标志物的一种或多种抗体或其它结合试剂孵育来完成，所述一种或多种表面标志物分别在正选择或负选择的细胞上表达(标志物+)或以相对较高水平表达(标志物高)。
[0077] 在一些实施方式中，T细胞通过对在非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其它血液白细胞)上表达的标志物(例如CD14)进行负选择来从PBMC样品分离分离。在一些方面中，使用CD4+或CD8+选择步骤来分离辅助性CD4+和CD8+细胞毒性T细胞。通过针对一种或多种原初、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高的程度表达的标志物进行正或负选择，可将此类CD4+和CD8+群进一步分选成亚群。
[0078] 在一些实施方式中，CD8+细胞针对原初、中心记忆、效应记忆和/或中心记忆干细胞进行进一步富集或消耗，例如通过基于与对应亚群相关联的表面抗原进行正或负选择。在一些实施方式中，进行针对中心记忆T(TCM)细胞的富集，以增加功效，例如以改善长期存活、扩增和/或给予后的植入，在一些方面中，其在此类亚群中特别强健。参见Terakura等.(2012)Blood.1：72-82；Wang等(2012)J Immunother.35(9)：689-701。在一些实施方式中，将TCM-富集的CD8+T细胞与CD4+T细胞合并以进一步增强功效。
[0079] 在实施方式中，记忆T细胞在CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚组中存在。PBMC可以针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分进行富集或消耗，例如采用抗CD8和抗CD62L抗体。
[0080] 在一些实施方式中，针对中心记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、和/或CD127阳性或高表面表达；在一些方面中，其基于CD45RA和/或粒酶B表达或高度表达的细胞进行负选择。在一些方面中，针对TCM细胞富集的CD8+群的分离通过如下方式进行：消耗表达CD4、CD14、CD45RA的细胞，和正选择或针对表达CD62L的细胞进行富集。一方面，针对中心记忆T(TCM)细胞的富集通过如下方式进行：由基于CD4表达选择的细胞的阴性部分起始，其基于CD14和CD45RA的表达进行负选择，和基于CD62L进行正选择。在一些方面中，此类选择同时进行，且在其它方面中，此类选择以某一顺序依次进行。在一些方面中，+ +相同的基于CD4表达的选择步骤用于制备CD8 细胞群或亚群，也用以产生CD4 细胞群或亚群，从而保留来自基于CD4分离的阳性和阴性部分，并任选地在一种或多种进一步正或负选择步骤之后，用于所述方法的后续步骤。
[0081] 在具体实例中，对PBMC样品或其它血液白细胞样品进行CD4+细胞选择，其中保留阴性和阳性部分。然后，基于CD14和CD45RA或CD19的表达对阴性部分进行负选择，并基于中心记忆T细胞特征性标志物，例如CD62L或CCR7，进行正选择，其中所述正和负选择以某一顺序进行。
[0082] 通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将辅助性CD4+T细胞分选成原初、中心记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，原初CD4+T淋巴细胞是CD45RO-，CD45RA+，CD62L+，CD4+T细胞。在一些实施方式中，中心记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
[0083] 在一个实例中，为了通过负选择对CD4+细胞进行富集，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。在一些实施方式中，使所述抗体或结合伴侣结合至固体支持物或基质，例如磁珠或顺磁珠，以允许分离用于正和/或负选择的细胞。例如，在一些实施方式中，所述细胞和细胞群采用免疫磁性(或亲和性磁性)分离技术分开(separated)或分离(isolated)(综述参见《分子医学方法》(Methods in Molecular Medicine)，第58卷：代谢研究方法(Metastasis Research Protocols)，第2卷：细胞体外和体内性能(Cell Behavior In Vitro and In Vivo)，第17-25页，S.A.Brooks和
U.Schumacher编 新泽西州托托华的胡玛纳出版社(Humana Press Inc.))。
U.Schumacher编 新泽西州托托华的胡玛纳出版社(Humana Press Inc.))。
[0084] 在一些方面中，使待分离的样品或细胞组合物与较小的可磁化或磁响应性材料(如磁响应性颗粒或微粒，例如顺磁珠(例如，Dynalbeads珠或MACS珠))孵育。所述磁响应性材料(例如，颗粒)一般直接或间接连接至结合伴侣(例如，抗体)，其特异性结合至某一分子，例如，需要分离(例如需要进行负或正选择)的一种或多种细胞或细胞群上存在的表面标志物。
[0085] 在一些实施方式中，所述磁性颗粒或珠包含磁响应性材料，其结合至特异性的结合部分，例如抗体或其它结合伴侣。有多种熟知的磁响应性材料用于磁性分离方法。合适的磁性颗粒包括描述于Molday，美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342 B中的那些，其通过引用纳入本文。胶体定形的颗粒，例如描述于Owen美国专利号4,795,698的那些，而Liberti等，美国专利号5,200,084是其它实例。
[0086] 孵育一般在一定条件下进行，由此，所述抗体或结合伴侣或分子，例如二抗或其它试剂，其特异性结合至所述抗体或结合伴侣，其连接至所述磁性颗粒或珠，特异性结合至所述样品中的细胞上(如果)存在的细胞表面分子。
[0087] 在一些方面中，将所述样品置于磁场中，并且，具有与其连接的磁性响应或可磁化颗粒的那些细胞将被磁铁吸引，并与未标记的细胞分离。对于正选择而言，保留被磁铁吸引的细胞；对于负选择而言，保留不被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面中，在相同选择步骤中进行正和负选择的组合，其中，保留阳性和阴性部分，并进一步处理或进行进一步分离步骤。
[0088] 在某些实施方式中，所述磁响应性颗粒在一抗或其它结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中被覆。在某些实施方式中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标志物具有特异性的一抗的覆层连接至细胞。在某些实施方式中，所述细胞，而非珠，用一抗或结合伴侣标记，然后，添加细胞类型特异性的二抗或其它结合伴侣(例如，链霉亲和素)被覆的磁性颗粒。在某些实施方式中，链霉亲和素被覆的磁性颗粒与生物素化一抗或二抗联用。
[0089] 在一些实施方式中，使所述磁响应性颗粒保留连接至待经后续孵育、培养和/或工程改造的细胞；在一些方面中，保留所述颗粒连接至用于给予患者的细胞。在一些实施方式中，从所述细胞移去可磁化的或磁响应性颗粒。用于从细胞移去可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括，例如，采用竞争性非标记的抗体、可磁化颗粒或连接至可切割接头的抗体等。在一些实施方式中，所述可磁化颗粒是生物可降解的。
[0090] 在一些实施方式中，所述基于亲和性的选择通过磁性活化的细胞分选(MACS)(加利福尼亚奥本的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))进行。磁性活化的细胞分选
(MACS)系统能够高纯度选择其上连接有磁化的颗粒的细胞。在某些实施方式中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后，依次洗脱非靶标和靶标物质。即，使附接至磁化的颗粒的细胞保持在原位，而洗脱未附接的物质。然后，在该第一洗脱步骤完成后，将滞留在磁场中且防止被洗脱的物质以某种方式解放，从而它们可以被洗脱和回收。在某些实施方式中，所述非靶细胞带标记并从异质细胞群消耗。
(MACS)系统能够高纯度选择其上连接有磁化的颗粒的细胞。在某些实施方式中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后，依次洗脱非靶标和靶标物质。即，使附接至磁化的颗粒的细胞保持在原位，而洗脱未附接的物质。然后，在该第一洗脱步骤完成后，将滞留在磁场中且防止被洗脱的物质以某种方式解放，从而它们可以被洗脱和回收。在某些实施方式中，所述非靶细胞带标记并从异质细胞群消耗。
[0091] 在某些实施方式中，所述分离(isolation)或分开(separation)采用进行所述方法的分离、细胞制备、分离、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一种或多种的系统、装置或设备来进行。在一些方面中，所述系统用以在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的各个步骤，例如，以使错误、用户处理和/或污染最小化。在一个实例中，所述系统是国际专利申请公开号WO2009/072003，或US 20110003380 A1中描述的系统。
[0092] 在一些实施方式中，所述系统或设备在整合或独立系统中，和/或以自动化的或可编程的形式，进行分离、处理、工程改造和配制步骤中的一个或多个，例如，全部。在一些方面中，所述系统或设备包括与所述系统或设备信息连通的计算机和/或计算机程序，其允许用户编程、控制、评估处理、分离、工程改造和配制步骤的结果，和/或调节处理、分离、工程改造和配制步骤的各方面。
[0093] 在一些方面中，进行所述分离和/或其它步骤使用CliniMACS系统(美天旎生物技术公司)进行，例如，以供在封闭和无菌系统中进行临床级别水平的细胞的自动化分离。组件可包括整合的微型计算机、磁性分离单元、蠕动泵、和各种夹管阀。在一些方面中，整合的计算机控制所述仪器的所有组件，并指示所述系统以标准化的顺序进行重复的步骤。在一些方面中，所述磁性分离单元包括可移动的永久磁铁和用于所述选择柱的支持物
(holder)。所述蠕动泵控制通过管组的流速，并且，与夹管阀一起，确保通过所述系统的缓冲液的受控流和细胞的连续悬液。
(holder)。所述蠕动泵控制通过管组的流速，并且，与夹管阀一起，确保通过所述系统的缓冲液的受控流和细胞的连续悬液。
[0094] 在一些方面中，CliniMACS系统使用以无菌、无热源溶液的形式提供的抗体-偶联的可磁化颗粒。在一些实施方式中，在用磁性颗粒标记细胞之后，所述细胞经清洗以移除过量的颗粒。然后，将细胞制备袋连接至管组，其进一步连接至包含缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预组装的无菌管道组成，包括前置柱和分离柱，并且仅用于单一使用。在分离程序起始之后，所述系统自动化地将所述细胞样品施加至分离柱上。使带标记的细胞保留在柱中，而通过一系列清洗步骤移除未标记的细胞。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是未标记的，并且不被保留在柱中。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是经标记的，并且被保留在柱中。在一些实施方式中，在移除磁场之后，从所述柱洗脱用于本文所述方法的细胞群，并收集在细胞收集袋中。
[0095] 在一些实施方式中，分离和/或其它步骤采用CliniMACS Prodigy系统(美天旎生物技术公司)进行。在一些方面中，CliniMACS Prodigy系统装配有细胞处理单元，所述细胞处理单元允许自动化清洗和通过离心分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可包括内置摄像机和图像识别软件，其通过识别来源细胞产物的肉眼可见层来确定最优选细胞分级分离终点。例如，外周血被自动化地分离成红细胞、血液白细胞和血浆层。CliniMACS
Prodigy系统还可包括整合的细胞培育腔室，其完成细胞培养方案，例如，细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且细胞可采用整合显微镜来监测。参见例如Klebanoff等.(2012)J Immunother.35(9)：651-660，Terakura等.(2012)Blood.1：72-82，和Wang等.(2012)J Immunother.35(9)：689-701。
Prodigy系统还可包括整合的细胞培育腔室，其完成细胞培养方案，例如，细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且细胞可采用整合显微镜来监测。参见例如Klebanoff等.(2012)J Immunother.35(9)：651-660，Terakura等.(2012)Blood.1：72-82，和Wang等.(2012)J Immunother.35(9)：689-701。
[0096] 在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过流式细胞术收集和富集(或消耗)，其中针对多重细胞表面标志物被染色的细胞携载于流体中。在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过制备规模(FACS)-分选法收集和富集(或消耗)。在某些实施方式中，本文所述的细胞群通过采用微电机系统(MEMS)芯片联合基于FACS的检测系统来收集和富集(或消耗)(参见例如，WO 2010/033140，Cho等(2010)Lab Chip 10，1567-1573；和Godin等(2008)J Biophoton.1(5)：355-376。在这两种情况中，细胞可以用多重标志物标记，以允许以高纯度分离明确界定的T细胞亚组。
[0097] 在一些实施方式中，所述抗体或结合伴侣用一种或多种可检测标志物标记，以促进用于正和/或负选择的分离。例如，分离可基于与荧光标记的抗体的结合。在一些实例中，将基于抗体或对一种或多种细胞表面标志物具有特异性的其它结合伴侣的结合所进行的细胞分离携载于流体流中，例如通过荧光活化的细胞分选(FACS)(其包括制备规模(FACS)和/或微电机系统(MEMS)芯片)，例如，与流式细胞术检测系统联合。此类方法允许进行基于多重标志物的同时正和负选择。
[0098] 冻存
[0099] 在一些实施方式中，制备方法包括：冷冻步骤，例如，在分离、孵育和/或工程改造之前或之后，冻存所述细胞。在一些实施方式中，所述冷冻和后续融化步骤移除粒细胞，并且，在某种程度上，移除细胞群中的单核细胞。在一些实施方式中，例如，在清洗步骤以移除血浆和血小板之后，将所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面中，可采用任何各种已知冷冻溶液和参数。一个实例涉及采用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白(HAS)的PBS，或其它合适的细胞冷冻培养基。然后，其用培养基1∶1稀释，从而DMSO和HSA的终浓度分别是10％和4％。然后，以1°/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃，并贮存在液氮储罐的汽相中。
[0100] 在一些实施方式中，提供的方法包括培育、孵育、培养、和/或遗传工程改造步骤。例如，在一些实施方式中，提供了用于对消耗的细胞群和培养起始组合物进行孵育和/或工程改造的方法。
[0101] 因此，在一些实施方式中，所述细胞群在培养起始组合物中孵育。可在培养器皿，如单元、腔室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋，或用于培养或培育细胞的其它容器中进行孵育和/或工程改造。
[0102] 孵育和培养
[0103] 在一些实施方式中，在遗传工程改造之前或与遗传工程改造一起孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、培育、刺激、活化、和/或增殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激性试剂存在下孵育细胞或组合物。这类条件包括设计成在群中诱导细胞增殖、繁殖、活化、和/或存活以模拟抗原接触，和/或引发细胞用于遗传工程改造，如用于导入遗传工程改造的抗原受体的那些。
[0104] 所述条件可包括如下一种或多种：具体培养基、温度、含氧量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如，营养物、氨基酸、抗生素、离子，和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体，和经设计以活化细胞的任何其它物质。
[0105] 在一些实施方式中，刺激条件或试剂包括一种或多种物质，例如，配体，其能够活化TCR复合物的胞内信号转导结构域。在一些方面中，所述物质开启或启动T细胞中的TCR/CD3胞内信号转导级联。此类物质可包括抗体，例如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些，例如，抗CD3、抗CD28，例如，其结合至固体支持物例如珠，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可包括如下步骤：向培养基(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体。在一些实施方式中，刺激剂包括1L-2和/或IL-15，例如，至少约10单位/mL浓度的IL-2。
[0106] 在一些方面中，孵育按照一些技术，例如授予Riddell等的美国专利号6,040,1 77，Klebanoff等.(2012)J Immunother.35(9)：651-660，Terakura等.(2012)Blood.1：72-
82和/或Wang等.(2012)J Immunother.35(9)：689-701中所述的那些进行。
82和/或Wang等.(2012)J Immunother.35(9)：689-701中所述的那些进行。
[0107] 在一些实施方式中，T细胞群通过如下方式扩增：添加至培养起始组合物饲养层细胞，例如非分裂型外周血单核细胞(PBMC)，(例如，从而针对待扩增的初始群中的各T淋巴细胞，所得细胞群包含至少约5、10、20或40或更多PBMC饲养层细胞)；并孵育所述培养物(例如足以扩增所述数量的T细胞的时间)。在一些方面中，所述非分裂型饲养层细胞可包括γ-辐照的PBMC饲养层细胞。在一些实施方式中，所述PBMC用约3000-3600拉德范围内的γ射线辐照以防止细胞分裂。在一些方面中，所述饲养层细胞在添加T细胞的群之前添加至培养基。
[0108] 在一些实施方式中，所述刺激条件包括适于人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，一般至少约30度，且一般是或约是37摄氏度。任选地，孵育还可包括添加非分裂型EBV-转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养层细胞。LCL可以用约6000-10,000拉德范围内的γ射线辐照。在一些方面中，LCL饲养层细胞以任何合适的量提供，例如LCL饲养层细胞与初始T淋巴细胞的比率是至少约10∶1。
[0109] 在实施方式中，通过用抗原刺激天然或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+ T细胞。例如，抗原特异性T细胞系或克隆可针对巨细胞病毒抗原产生，通过从感染的对象分离T细胞并采用相同抗原体外刺激细胞来进行。
[0110] 在一些方面中，该方法包括评价工程改造的或工程改造中的细胞的表面上一种或多种标志物的表达。在一个实施方式中，该方法包括评价寻求由过继细胞治疗，例如，通过基于亲和性的检测方法如通过流式细胞术靶向的一种或多种靶抗原(例如，由遗传工程改造的抗原受体识别的抗原)的表面表达。在一些方面中，其中该方法揭示了抗原或其他标志物的表面表达，编码抗原或其他标记物的基因被破坏或者表达被抑制，例如，使用本文所述的方法。
[0111] B.遗传工程改造的抗原受体
[0112] 在一些实施方式中，细胞包括通过遗传工程改造导入的一种或多种核酸，其编码一种或多种抗原受体，和这类核酸的遗传工程改造的产物。在一些实施方式中，核酸是异源性的，即，通常不存在于细胞或从该细胞获得的样品中，如从另一个生物体或细胞获得的样品，其例如通常不在工程改造中的细胞和/或这类细胞来源的生物体中发现。在一些实施方式中，核酸不是天然存在的，如核酸不是自然中发现的，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合。
[0113] 遗传工程改造的产物包括遗传工程改造的抗原受体。此类抗原受体包括遗传工程改造的T细胞受体(TCR)及其组分，和功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，包括嵌合活化受体和嵌合共刺激受体。在一些实施方式中，CAR含有特异性结合至抗原的胞外抗原-识别结构域。在一些实施方式中，抗原是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方式中，CAR是TCR-样CAR并且抗原是经处理的肽抗原，如胞内蛋白质的肽抗原，其像TCR那样在细胞表面上识别，在主要组织相容性复合物(MHC)分子中。
[0114] 示例性的抗原受体，包括CAR和重组TCR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，包括例如，在国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,
446,191、8,324,353、和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416中所述的那些，和/或Sadelain等，Cancer Discov.2013年4月；3(4)：388-398；Davila等，(2013)PLoS ONE 8(4)：
e61338；Turtle等，Curr.Opin.Immunol.，2012年10月；24(5)：633-39；Wu等，Cancer，2012年
3月18(2)：160-75中所述的那些。在一些方面中，遗传工程改造的抗原受体包括美国专利号
7,446,190中所述的CAR，和国际专利申请公开号WO/2014055668 A1中所述的那些。
446,191、8,324,353、和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416中所述的那些，和/或Sadelain等，Cancer Discov.2013年4月；3(4)：388-398；Davila等，(2013)PLoS ONE 8(4)：
e61338；Turtle等，Curr.Opin.Immunol.，2012年10月；24(5)：633-39；Wu等，Cancer，2012年
3月18(2)：160-75中所述的那些。在一些方面中，遗传工程改造的抗原受体包括美国专利号
7,446,190中所述的CAR，和国际专利申请公开号WO/2014055668 A1中所述的那些。
[0115] 嵌合抗原受体(CAR)
[0116] 在一些实施方式中，工程改造的抗原受体包括嵌合抗原受体(CAR)，包括活化或刺激性CAR，共刺激性CAR(参见WO2014/055668)，和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等，Sci.Transl.Medicine，5(215)(2013年12月))。在一些方面中，CAR一般包括通过接头和/或跨膜结构域与一种或多种胞内信号转导组分连接的胞外抗原(或配体)结合结构域。此类分子通常模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过此类受体联合共刺激受体的信号、和/或通过单独共刺激受体的信号。
[0117] 在一些实施方式中，构建CAR以使其具有针对特定抗原(或标志物或配体)的特异性，如在待通过过继治疗靶向的特定细胞类型中表达的抗原，例如癌症标志物，和/或意图用以诱导减弱应答的抗原，如在正常或非疾病细胞类型上表达的抗原。因此，CAR一般在其胞外部分中包合一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原-结合片段、结构域或部分，或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方式中，所述CAR包括抗体分子的一个或多个抗原-结合部分，例如源自单克隆抗体(mAb)的可变重(VH)链和可变轻
(VL)链的单链抗体片段(scFv)。
(VL)链的单链抗体片段(scFv)。
[0118] 本文术语“抗体”以最广义使用并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原-结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab′)2片段、Fab′片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)，和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语包括免疫球蛋白的遗传工程改造和/或其他修饰的形式，如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体、和异源偶联抗体、多特异性例如，双特异性抗体、双抗体、三抗体、和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另外说明，术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语也包括完整或全长抗体，包括任意类型或亚型的抗体，包括IgG及其亚型，IgM、IgE、IgA、和IgD。
[0119] 在一些实施方式中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性识别全长抗体的抗原。在一些实施方式中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方式中，抗体重链恒定区选自，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE，尤其选自，例如，IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4，更具体地，IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方式中，抗体轻链恒定区选自，例如，κ或λ，尤其是κ。
[0120] 提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”指除完整抗体以外的分子，所述分子包含完整抗体的部分，该部分结合与所述完整抗体结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于，Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(例如scFv)和单结构域VH单抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方式中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
[0121] 术语“可变区”或“可变结构域”指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有类似结构，其中各结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR(参见例如，Kindt等，Kuby Immunology《( Kuby免疫学》)，第
6版，WHF公司(W.H.Freeman and Co.)，第91页，2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合该抗原的抗体以分别筛选互补VL或VH结构域文库。参见例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；
Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。
6版，WHF公司(W.H.Freeman and Co.)，第91页，2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合该抗原的抗体以分别筛选互补VL或VH结构域文库。参见例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；
Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。
[0122] 单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方式中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方式中，所述CAR包含特异性结合抗原，如待靶向的细胞或疾病，例如肿瘤细胞或癌细胞的细胞表面抗原或癌症标记物的抗体重链结构域，例如本文所述的或本领域已知的任何靶抗
原。
原。
[0123] 可通过各种技术制备抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白酶水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方式中，抗体是重组产生的片段，如包含非天然产生的排列的片段，如具有2个或更多个通过合成接头，例如肽接头连接的抗体区域或链，和/或可能不通过对天然产生的完整抗体的酶促水解消化产生的那些。在一些方面中，抗体片段是scFv。
[0124] “人源化”抗体是其中全部或基本全部CDR氨基酸残基衍生自非人CDR并且全部或基本全部FR氨基酸参加衍生自人FR的抗体。人源化的抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指经过人源化，一般为了降低针对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和性的非人抗体的变体。在一些实施方式中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所衍生自的抗体)的相应残基取代，例如，为了恢复或改善抗体特异性或亲和性。
[0125] 在一些实施方式中，CAR含有特异性识别在细胞表面上表达的抗原，如完整抗原的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。
[0126] 在一些实施方式中，CAR含有TCR-状抗体，如特异性识别在细胞表面(如MHC-肽复合物)上呈递的胞内抗原，如肿瘤相关抗原的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。在一些实施方式中，可以重组受体，如抗原受体的部分的形式在细胞上表达识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分。抗原受体包括功能性非-TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。一般而言，含有显示针对肽-MHC复合物的TCR-状特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可被称为TCR-状CAR。
[0127] “主要组织相容性复合物”(MHC)是指蛋白质，一般是糖蛋白，其含有多晶型肽结合位点或结合沟，其在一些情况中可与多肽的肽抗原，包括由细胞器加工的肽抗原复合。在一些情况中，MHC分子可在细胞表面上展示或表达，包括与肽的复合物，即，MHC-肽复合物，用于在可被T细胞上的抗原受体，如TCR或TCR-状抗体识别的构象中呈递抗原。一般而言，MHC I类分子是具有跨膜α链，在一些情况中具有3个α结构域，和非共价结合的β2微球蛋白的异二聚体。一般而言，MHC II类分子包含2个跨膜糖蛋白α和β，两者一般都跨膜。MHC分子可包含含有用于结合肽的一个或多个抗原结合位点和被合适抗原受体识别所需的序列的MHC的有效部分。在一些实施方式中，MHC I类分子递送来源于细胞溶质的肽至细胞表面，在那里+ +MHC-肽复合物被T细胞，如一般是CD8 T细胞，但在一些情况中是CD4 T细胞识别。在一些实施方式中，MHC II类分子将来源于囊泡系统的肽递送至细胞表面，在那里它们一般被CD4+ T细胞识别。一般而言，MHC分子由一组连接的基因座编码，其在小鼠中被统称为H-2，并且在人中被统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，一般而言，人MHC也被称为人白细胞抗原(HLA)。
[0128] 术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原和MHC分子的结合或复合物，如，一般通过MHC分子的结合沟或裂中肽的非共价相互作用。在一些实施方式中，MHC-肽复合物呈递或展示在细胞表面上。在一些实施方式中，MHC-肽复合物可被抗原受体，如TCR、TCR-状CAR或其抗原结合部分特异性识别。
[0129] 术语“肽抗原”或“肽表位”是指与MHC分子结合的多肽的肽，如用于被抗原受体识别。一般而言，肽衍生自或基于较长生物分子(如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方式中，肽一般长度为约8至约24个氨基酸。在一些实施方式中，肽具有约9至22个氨基酸的长度，用于在MHC II类复合物中的识别。在一些实施方式中，肽具有约8至13个氨基酸的长度，用于在MHC I类复合物中的识别。在一些实施方式中，在MHC分子中的肽，如MHC-肽复合物识别之后，抗原受体，如TCR或TCR-状CAR产生或触发针对T细胞的活化信号，其诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
[0130] 在一些实施方式中，可通过用有效量的含有特异性MHC-肽复合物的免疫原免疫宿主来产生特异性结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分。在一些情况中，MHC-肽复合物的肽是能够结合至MHC的抗原如肿瘤抗原，例如普遍肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或下述的其他抗原的表位。在一些实施方式中，然后向宿主给予有效量的免疫原来引发免疫应答，其中免疫原保留其三维形式持续一段充足的时间以引发针对MHC分子的结合沟中肽的三维呈递的免疫应答。然后对从宿主收集的血清进行测试以确定是否产生识别MHC分子的结合沟中的肽的三维呈递的所需抗体。在一些实施方式中，可评价产生的抗体以确认，该抗体可区分MHC-肽复合物与仅MHC分子、仅感兴趣肽、和MHC与不相关肽的复合物。然后可分离所需的抗体。
[0131] 在一些实施方式中，可通过采用抗体文库展示方法，如噬菌体抗体文库来产生特异性结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，可生成突变Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，其中文库的成员在一种或多种CDR的一个或多个残基处突变。本领域已知这类方法的示例(参见，例如，美国公开申请号US20020150914，US2014/0294841；和Cohen CJ.等，(2003)J Mol.Recogn.16：324-332)。
[0132] 在一些方面中，所述抗原特异性结合或识别组分连接至一种或多种跨膜和胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，CAR包括与该CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然关联CAR中结构域之一的跨膜结构域。在一些情况中，所述跨膜结构域通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免所述结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
[0133] 在一些实施方式中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当所述来源是天然来源时，在一些方面中，所述结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括源自T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CDS，CD9，CD 16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137，CD 154的那些(即包含至少它们的跨膜区域)。或者，在一些实施方式中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面中，所述合成跨膜结构域主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三聚体将出现在合成的跨膜结构域的各末端。
[0134] 在一些实施方式中，存在短的寡肽或多肽接头，例如，长度为2-10个氨基酸的接头，例如包含甘氨酸和丝氨酸，例如，甘氨酸-丝氨酸双联体的接头，并在CAR的胞质信号转导结构域和跨膜结构域之间形成连接。
[0135] CAR一般包括至少一种或多种胞内信号转导组分。在一些实施方式中，所述CAR包括TCR复合物的胞内组分，例如介导T-细胞活化和细胞毒性的TCR CD3+链，例如，CD3ζ链。因此，在一些方面中，所述抗原结合分子连接至一种或多种细胞信号转导模块。在一些实施方式中，细胞信号转导模块包括CD3跨膜结构域、CD3胞内信号转导结构域，和/或其它CD跨膜结构域。在一些实施方式中，所述CAR还包括一种或多种其它分子的部分，例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16。例如，在一些方面中，所述CAR包括CD3-ζ(CD3-zeta)或Fc受体γ和CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
[0136] 在一些实施方式中，在CAR的连接之后，该CAR的胞质结构域或胞内信号转导结构域活化免疫细胞的正常效应功能或应答的至少一种，例如，工程改造的T细胞以表达该细胞。例如，在一些情况中，CAR诱导T细胞的功能，例如溶细胞活性或辅助性T细胞活性，例如细胞因子或其它因子的分泌。在一些实施方式中，抗原受体组分或共刺激分子的胞内信号转导结构域的截短部分。在一些方面中，例如，如果其转导效应功能信号，则此类截短部分用于替代完整免疫刺激链。在一些实施方式中，所述一种或多种胞内信号转导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，且在一些方面中，在天然情况下与此类受体一起作用以在抗原受体衔接之后起始信号转导的共同受体的那些，和/或此类分子的任何衍生物或变体，和/或具有相同功能性能力的任何合成序列。
[0137] 在天然TCR的情况中，完全活化一般不仅需要通过TCR的信号转导，而且需要共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全活化，用于产生第二或共刺激信号的组分也包括在所述CAR中。在其他实施方式中，CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面中，其他CAR在同一细胞中表达并且提供用于生成第二或共刺激信号的组分。在一些方面中，细胞包含第一CAR和第二CAR，第一CAR含有信号转导结构域以诱导第一信号并且第二CAR结合至第二抗原并且含有用于生成共刺激信号的组分。例如，第一CAR可以是活化CAR并且第二CAR可以是共刺激性CAR。在一些方面中，两种CAR必须连接以诱导细胞中的特性效应功能，其可提供针对靶向的细胞类型的特异性和选择性。
[0138] 在一些方面中，T细胞活化描述为通过两类胞质信号转导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性第一活化的那些(第一胞质信号转导序列)，和以抗原非依赖性方式作用以提供第二或共刺激信号的那些(第二胞质信号转导序列)。在一些方面中，所述CAR包括此类信号转导组分之一或两者。
[0139] 在一些方面中，CAR包括以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的第一活化的第一胞质信号转导序列。以刺激方式作用的第一胞质信号转导序列可包含信号转导基序，其已知是免疫受体基于酪氨酸的活化基序或ITAM。ITAM的实例包括第一胞质信号转导序列，其包括源自如下的那些：TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CDS，CD22，CD79a，CD79b，和CD66d。在一些实施方式中，CAR中的胞质信号转导分子包含胞质信号转导结构域，其部分，或源自CD3ζ的序列。
[0140] 在一些实施方式中，所述CAR包括共刺激受体的跨膜部分和/或信号转导结构域，例如CD28，4-1BB，OX40，DAP10，和ICOS。在一些方面中，同一CAR同时包含活化和共刺激组分；在其他方面中，由一个CAR提供活化结构域，而由识别另一种抗原的另一个CAR提供共刺激组分。
[0141] 在某些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含CD28跨膜和信号转导结构域，其连接至CD3(例如，CD3-ζ)胞内结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域，其连接至CD3ζ胞内结构域。
[0142] 在一些实施方式中，所述CAR涵盖与胞质部分中的活化结构域(例如，第一活化结构域)合并的两种或更多种共刺激结构域。一个实例是包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的胞内组分的受体。
[0143] 在一些实施方式中，CAR或其他抗原受体还包括标志物以确认对细胞的转导或工程改造以表达受体，如细胞表面受体的截短形式，如截短的EGFR(tEGFR)。
[0144] 在一些情况中，CAR被称为第一、第二和/或第三代CAR。在一些方面中，第一代CAR是仅在抗原结合后提供CD3-链诱导的信号的CAR；在一些方面中，第二代CAR是提供信号和共刺激信号的CAR，如包含来自共刺激受体如CD28或CD137的共刺激受体的胞内信号转导结构域的CAR；在一些方面中，第三代CAR在一些方面中是包含不同共刺激受体的多种共刺激结构域的CAR。
[0145] 在一些方面中，CAR或其他抗原受体是抑制CAR(例如，iCAR)并且包含减弱或阻遏细胞中的应答，如免疫应答，如ITAM-和/或共刺激-促进的应答的胞内组分。这类胞内信号转导组分的示例是在免疫检验点分子，包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体包括A2AR上发现的那些。在一些方面中，工程改造的细胞包括抑制性CAR，其包括这类抑制分子的或从中衍生的信号转导结构域，使得其用于减弱细胞的应答，例如，由活化和/或共刺激性CAR诱导的应答。使用这类CAR，例如，用于在由活化受体，例如CAR识别的抗原也在或可能也在正常细胞表面上表达的情况中降低脱靶效应的可能性。在一些方面中，抑制受体，例如，引入iCAR，其识别针对正常细胞特异性的标志物。在一些方面中，在这种抗原也在工程改造的细胞上表达的情况中，该抗原是本文提供的基因编辑或破坏方法的靶标。在一些方面中，这种破坏避免了由工程改造的细胞本身诱导的工程改造的细胞的应答的减弱。
[0146] TCR
[0147] 在一些实施方式中，遗传工程改造的抗原受体包括重组T细胞受体(TCR)和/或从天然产生的T细胞克隆的TCR。
[0148] “T细胞受体”或“TCR”是指含有可变α和β链(也分别称为TCRa和TCRβ)或可变γ和6链(也分别称为TCRγ和TCRδ)并且能够特异性结合至与MHC受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方式中，TCR是αβ形式。一般而言，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上相似，但是表达它们的T细胞具有不同的解剖学位置或功能。TCR可存在于细胞表面上或以可溶形式存在。一般而言，TCR存在于T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，其中其一般负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。在一些实施方式中，TCR也可含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如，Janeway等，《免疫学：健康和疾病中的免疫系统》(Immunobiology：The Immune System in Health and Disease)，第3版，当代生物学出版社(Current Biology Publications)，p.4：33，1997)。例如，在一些方面中，TCR的各链可具有一个N-末端免疫球蛋白可变结构域，一个免疫球蛋白恒定结构域，跨膜结构域，和在C-末端处的短胞质尾。在一些实施方式中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的非变异蛋白质结合。除非另外说明，术语“TCR”应理解为包括其功能性TCR片段。该术语也包括完整或前场TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。
[0149] 因此，出于本文的目的，引用TCR包括任何TCR或功能性片段，如结合至在MHC分子中结合的特异性抗原性肽，即MHC-肽复合物的TCR的抗原结合部分。可互换使用的TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指含有TCR的结构域的部分但结合全长TCR结合的抗原(例如，MHC-肽复合物)的分子。在一些情况中，抗原结合部分含有TCR的可变结构域，如TCR的可变α链和可变β链，其足以形成用于结合至特异性MHC-肽复合物的结合位点，如一般而言各链含有3个互补决定区的情况。
[0150] 在一些实施方式中，TCR链的可变结构域结合形成环，或与免疫球蛋白类似的互补决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点赋予抗原识别并确定肽特异性。一般而言，像免疫球蛋白那样，CDR由构架区(FR)分开(参见，例如，Jores等，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.87：9138，1990；Chothia等，EMBO J.7：3745，1988；还参见Lefranc等，Dev.Comp.Immunol.27：55，2003)。在一些实施方式中，CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR，不过也已经显示α链的CDR1与抗原性肽的N-末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C-末端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC分子。在一些实施方式中，β-链的可变区可含有其他超变(HV4)区。
[0151] 在一些实施方式中，TCR链含有恒定结构域。例如，像免疫球蛋白那样，TCR链(例如，α-链，β-链)的胞外部分可含有2个免疫球蛋白结构域，N-末端处的可变结构域(例如，Vα或Vβ；一般是氨基酸1至116，基于Kabat编号，Kabat等，《免疫感兴趣的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美国国立卫生研究院公共健康服务部(US Dept.Health and Human Services，Public Health Service National Institutes of Health)，1991，第5版)，和一个与细胞膜相邻的恒定区(例如，α-链恒定结构域或Cα，一般是氨基酸117至259，基于Kabat，β-链恒定结构域或Cβ，一般是氨基酸117至
295，基于Kabat)。例如，在一些情况中，由两条链形成的TCR的胞外部分含有两个接近膜的恒定结构域，和两个远离膜的含有CDR的可变结构域。TCR结构域的恒定结构域含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，组成两条链间的连接。在一些实施方式中，TCR在α和β链各自可具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
295，基于Kabat)。例如，在一些情况中，由两条链形成的TCR的胞外部分含有两个接近膜的恒定结构域，和两个远离膜的含有CDR的可变结构域。TCR结构域的恒定结构域含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，组成两条链间的连接。在一些实施方式中，TCR在α和β链各自可具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
[0152] 在一些实施方式中，TCR链可含有跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域带正电。在一些情况中，TCR链含有胞质尾。在一些情况中，该结构允许TCR与其他分子如CD3结合。例如，含有具有跨膜区的恒定结构域的TCR可锚定细胞膜中的蛋白质并与CD3信号转导器或复合物的非变异亚基结合。
[0153] 一般而言，CD3是多蛋白质复合物，其可具有哺乳动物中的3种不同链(γ、δ、和ε)和ζ-链。例如，在哺乳动物中，复合物可含有CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链、和CD3ζ链的同二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是免疫球蛋白超家族的高度相关细胞表面蛋白，其包含单个免疫球蛋白结构域。CD3γ、CD3δ和CD3g链的跨膜区带负电，所述特征使这些链结合带正电的T细胞受体链。CD3γ、CD3δ和CD3g链的胞内尾各自含有称为基于免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的单个保守基序，而各CD3ζ链具有三个。一般而言，ITAM涉及TCR复合物的信号转导能力。这些辅助分子具有带负电的跨膜区并在将信号从TCR传播到细胞中起作用。CD3-和ζ-链与TCR一起形成称为T细胞受体复合物的物质。
[0154] 在一些实施方式中，TCR可以是2条链α和β(或任选的γ和δ)的异二聚体，或者其可以是单链TCR构建体。在一些实施方式中，TCR是含有，如通过一个或多个二硫键连接的2条单独链(α和β链或γ和δ链)。
[0155] 在一些实施方式中，针对靶抗原(例如，癌症抗原)的TCR经鉴定并导入细胞中。在一些实施方式中，可从多种来源获得编码TCR的核酸，如通过对公开可得的TCR DNA序列的聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方式中，从生物来源，如来自细胞如来自T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、T-细胞杂交瘤或其他公众可得的来源获得TCR。在一些实施方式中，可从体内分离的细胞获得T-细胞。在一些实施方式中，可从患者分离高亲和性T细胞克隆，并分离TCR。在一些实施方式中，T-细胞可以是培养的T-细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方式中，所述针对靶抗原的TCR克隆已在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统，或HLA)工程改造的转基因小鼠中产生。参见例如，肿瘤抗原(参见例如，Parkhurst等，(2009)Clin Cancer Res.15：169-180和Cohen等.(2005)J Immunol.175：5799-5808)。在一些实施方式中，使用病原体展示以针对靶抗原的分离TCR(参见例如，Varela-Rohena等，(2008)Nat Med.14：1390-1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23：349-354)。在一些实施方式中，TCR或其抗原结合部分可从已知的TCR序列中合成生成。
[0156] 在一些实施方式中，在获得T-细胞克隆之后，将TCRα和β链分离并克隆进入基因表达载体。在一些实施方式中，所述TCRα和β基因通过小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽(skip peptide)连接，从而两条链共同表达。在一些实施方式中，TCR的遗传转移(genetic transfer)通过逆转录病毒或慢病毒载体，或通过转座子完成(参见例如，Baum等，(2006)Molecular Therapy：The Journal of the American Society of Gene Therapy.18：
1748-1757；和Hackett等，(2010)Molecular Therapy：The Journal of the American Society of Gene Therapy.18：674-683)。
1748-1757；和Hackett等，(2010)Molecular Therapy：The Journal of the American Society of Gene Therapy.18：674-683)。
[0157] 抗原
[0158] 由遗传工程改造的抗原受体靶向的抗原包括在待通过过继细胞治疗靶向的疾病、病症、或细胞类型中表达的那些。疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和病症，包括癌症和肿瘤，包括血液癌症，免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B、T和骨髓性白血病、淋巴瘤、和多发性骨髓瘤。
[0159] 在一些实施方式中，所述抗原是多肽。在一些实施方式中，其是糖或其他分子。在一些实施方式中，与正常或非靶向的细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞，例如，肿瘤或致病性细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方式中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程改造的细胞上表达。在一些这类实施方式中，使用本文提供的多靶向和/或基因破坏方法来改善特异性和/或功效。
[0160] 在一些实施方式中，所述抗原是普遍肿瘤抗原。术语“普遍肿瘤抗原”是指免疫原性分子，如蛋白质，其一般在肿瘤细胞中以比非肿瘤细胞中更高的水平表达，并且也在不同来源的肿瘤中表达。在一些实施方式中，普遍肿瘤抗原在超过30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的人类癌症中表达。在一些实施方式中，普遍肿瘤抗原在至少
3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或更多种不同类型的肿瘤中表达。在一些情况中，普遍肿瘤抗原可在非肿瘤细胞，如正常细胞中表达，但以比肿瘤细胞中表达更低的水平。在一些情况中，普遍肿瘤抗原完全不在非肿瘤细胞中表达，如不在正常细胞中表达。示例性的普遍肿瘤抗原包括，例如，人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。肿瘤抗原，包括普遍肿瘤抗原的肽表位是本领域已知的，并且在一些方面中，可用于生成MHC-限制的抗原受体，如TCR或TCR-状CAR(参见，例如，公开的PCT申请号WO2011009173或WO2012135854以及公开的美国申请号US20140065708)。
3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或更多种不同类型的肿瘤中表达。在一些情况中，普遍肿瘤抗原可在非肿瘤细胞，如正常细胞中表达，但以比肿瘤细胞中表达更低的水平。在一些情况中，普遍肿瘤抗原完全不在非肿瘤细胞中表达，如不在正常细胞中表达。示例性的普遍肿瘤抗原包括，例如，人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。肿瘤抗原，包括普遍肿瘤抗原的肽表位是本领域已知的，并且在一些方面中，可用于生成MHC-限制的抗原受体，如TCR或TCR-状CAR(参见，例如，公开的PCT申请号WO2011009173或WO2012135854以及公开的美国申请号US20140065708)。
[0161] 例如，在一些实施方式中，抗原是hTERT。hTERT是在各种癌肿中广泛表达的肿瘤抗原。在一些方面中，hTERT具有或含有SEQ ID NO：3(GenBank登录号NP_937983.2)所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4(GenBank登录号NM_198253.2)所示的核苷酸序列编码。一般而言，hTERT是作为人端粒酶复合物的部分的逆转录酶，该复合物是可维持线性染色体的端粒末端并且在一些实施方式中保护染色体免于降解和末端-末端融合的复合物。在一些方面中，hTERT表达导致从RNA模板合成端粒，并且其表达可与端粒酶活性相关，因为其是复合物的限速组分。一般而言，hTERT不在大部分人类细胞中表达，包括正常细胞，但在肿瘤和癌细胞中表达或上调。例如，超过85％的人类肿瘤表达hTERT。因此，在一些方面中，hTERT可以是普遍肿瘤抗原。hTERT的HLA-限制的肽表位是已知的(参见，例如，美国专利号7,718,777，以及公开的PCT申请号WO2000025813和WO2013135553)，并且，在一些方面中，其可用于生成或鉴定针对hTERT的抗原受体。hTERT肽表位的非限制性示例包括SEQ ID NO：7-19中所示的任何一种。针对hTERT的抗原受体，如TCR或TCR-状抗体已经生成并且是本领域已知的(参见，例如，美国专利号7,718,777以及公开的美国专利申请US20090226474和US20030223994；也参见Ugel等，(2010)Blood，115：1374-1384)。
[0162] 在一些实施方式中，抗原是生存素(也称为凋亡重复蛋白5的杆状病毒抑制物，BIRC5)。在一些方面中，生存素具有或含有SEQ ID NO：5(GenBank登录号NP_001159)所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6(GenBank登录号NM_001168.2)所示的核苷酸序列编码。在一些情况中，可存在其他转录本同种型，如具有或含有分别称为GenBank登录号NP_
001012270或NM_001012270，或者NP_001012271.1或NM_001012271.1的氨基酸或核苷酸序列的那些。一般而言，生存素是凋亡蛋白质的抑制物(IAP)家族的成员。在一些情况中，生存素在许多癌症类型，如肺、结肠、乳腺、胰腺、前列腺、黑素瘤等中上调，但一般不在正常细胞或组织中表达或上调。在一些方面中，癌症中生存素的表达可与肿瘤进展中凋亡抑制的一般作用相关。因此，在一些方面中，生存素可以是普遍肿瘤抗原。生存素的HLA-限制的肽表位是已知的(参见，例如，美国专利号7,892,559，以及公开的美国申请号US20090004214)，并且，在一些方面中，这类肽表位可用于生成或鉴定针对生存素的抗原受体，包括TCR或TCR-状CAR。生存素肽表位的非限制性示例包括SEQ ID NO：20-30中任一所示。针对生存素的抗原受体，如TCR或TCR-状抗体已经生成并且是本领域已知的(参见，例如，公开的PCT申请号WO2010075417)。
001012270或NM_001012270，或者NP_001012271.1或NM_001012271.1的氨基酸或核苷酸序列的那些。一般而言，生存素是凋亡蛋白质的抑制物(IAP)家族的成员。在一些情况中，生存素在许多癌症类型，如肺、结肠、乳腺、胰腺、前列腺、黑素瘤等中上调，但一般不在正常细胞或组织中表达或上调。在一些方面中，癌症中生存素的表达可与肿瘤进展中凋亡抑制的一般作用相关。因此，在一些方面中，生存素可以是普遍肿瘤抗原。生存素的HLA-限制的肽表位是已知的(参见，例如，美国专利号7,892,559，以及公开的美国申请号US20090004214)，并且，在一些方面中，这类肽表位可用于生成或鉴定针对生存素的抗原受体，包括TCR或TCR-状CAR。生存素肽表位的非限制性示例包括SEQ ID NO：20-30中任一所示。针对生存素的抗原受体，如TCR或TCR-状抗体已经生成并且是本领域已知的(参见，例如，公开的PCT申请号WO2010075417)。
[0163] 在一些方面中，抗原在多发性骨髓瘤上表达，如CD38、CD138、和/或CS-1。其他示例性的多发性骨髓瘤包括CD56、TIM-3、CD33、CD123、和/或CD44。针对这类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的并且包括，例如，美国专利号8,153,765、8,603477、8,008,450；美国公开申请号US20120189622；和公开的国际PCT申请号WO2006099875、WO2009080829或WO2012092612中所述的那些。在一些实施方式中，可使用这类抗体或其抗原结合片段(例如，scFv)来生成CAR。
[0164] 在一些实施方式中，抗原是CD38抗原，其是人CD38。在一些方面中，CD38具有或含有在GenBank登录号BAA18966处，例如，在BAA18966.1处引用，或者在GI：1911103处引用的氨基酸序列。在一些方面中，其具有或含有以下序列：mancefspvs gdkpccrlsr raqlclgvsi lvlilvvvla vvvprwrqqw sgpgttkrfp etvlarcvky teihpemrhv dcqsvwdafk gafiskhpcn iteedyqplm klgtqtvpcn killwsrikd lahqftqvqr dmftledtll gyladdltwc gefntskiny qscpdwrkdc snnpvsvfwk tvsrrfaeaa cdvvhvmlng srskifdkns tfgsvevhn1 qpekvqtlea wvihggreds rdlcqdptik elesiiskrn iqfsckniyr pdkflqcvkn pedssctsei(SEQ ID NO：1)。在一些方面中，可由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列编码CD38抗原。在一些实施方式中，抗原-结合结构域特异性结合的抗原的部分一般在抗原的胞外区内。例如，参考SEQ ID NO：1，胞外区对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基43-300。在一些实施方式中，抗原可以是在癌或肿瘤细胞上表达或上调，但也可在免疫细胞，如静息或活化T细胞上表达的抗原。例如，在一些情况中，报道了hTERT、生存素和其他普遍肿瘤抗原的表达存在于淋巴细胞，包括活化T淋巴细胞(参见，例如，Weng等，(1996)J Exp.Med.，183：2471-2479；Hathcock等，(1998)J Immunol.，160：5702-5706；Liu等，(1999)Proc.NatlAcadSci.，96：5147-5152；Turksma等，(2013)Journal of Translational Medicine，11：152)。同样，在一些情况中，CD38和其他肿瘤抗原也可在免疫细胞，如T细胞上表达，如在活化T细胞中上调。例如，在一些方面中，CD38是一种已知的T细胞活化标志物。在一些本文提供的实施方式中，免疫细胞，如T细胞，可经工程改造以抑制或破坏免疫细胞中编码抗原的基因，使得表达的遗传工程改造的抗原受体不在免疫细胞上自身表达的情况中特异性结合该抗原。因此，在一些方面中，这可避免脱靶效应，如工程改造的免疫细胞结合自身，其可降低工程改造在免疫细胞中的功效，例如，与过继细胞治疗关联。
[0165] 在一些实施方式中，如在抑制性CAR的情况中，靶标是脱靶标志物，如不在疾病细胞或待靶向的细胞上表达，但在正常或非疾病细胞上表达的抗原，该正常或非疾病细胞也表达被同一工程改造的细胞中的活化或刺激受体靶向的疾病特异性靶标。示例性的这类抗原是MHC分子，如MHC I类分子，例如，与治疗其中这类分子在非靶向的细胞中下调但保持表达的疾病或病症相关。
[0166] 在一些实施方式中，工程改造的细胞可含有靶向一种或多种其他抗原的抗原。在一些实施方式中，一种或多种其他抗原是肿瘤抗原或癌症标志物。在一些实施方式中，由提供的免疫细胞上的抗原受体靶向的其他抗原包括孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、和肝炎B表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3、或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、酪氨酸蛋白激酶B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2，和MAGE A3、CE7、维尔姆斯瘤(WT-1)、细胞周期蛋白如细胞周期蛋白A1(CCNA1)和/或生物素化分子，和/或通过HIV、HCV、HBV或其它病原体表达的分子。
[0167] 在一些实施方式中，所述CAR结合病原体特异性抗原。在一些实施方式中，所述CAR对病毒抗原(例如HIV，HCV，HBV等)，细菌抗原，和/或寄生性抗原具有特异性。
[0168] 多靶向
[0169] 在一些实施方式中，细胞和方法包括多靶向策略，如在细胞上表达两种或更多种遗传工程改造的受体，各自识别不同抗原并且一般各自包含不同的胞内信号转导组分。这类多靶向策略描述于，例如，国际专利申请公开号WO 2014055668 A1(描述活化和共刺激性CAR的组合，例如，靶向在脱靶，例如正常细胞上独立存在但仅在待治疗的疾病或病症的细胞上一起存在的2种不同抗原)和Fedorov等，Sci.Transl.Medicine，5(215)(2013年12月)(描述表达活化和抑制性CAR的细胞，如其中活化CAR结合至在正常或非疾病细胞以及待治疗疾病或病症的细胞上同时表达的抗原，并且抑制性CAR结合至仅在不希望治疗的一种或多种正常细胞上表达的另一种抗原的那些策略)。
[0170] 在一些实施方式中，在如下情况中使用多靶向策略，瞬时(例如，在与遗传工程改造相关的刺激下)或永久地在非疾病细胞上表达和/或工程改造的细胞本身上表达与特定疾病或病症相关的抗原。在这种情况中，通过要求连接2个分离并单独特异性的抗原受体，可改善特异性、选择性和/或功效。
[0171] 例如，在一些实施方式中，细胞包括表达第一遗传工程改造的抗原受体(例如，CAR或TCR)的受体，其能够诱导针对该细胞的活化信号，一般在特异性结合至由第一受体识别的抗原，例如第一抗原之后。在一些实施方式中，细胞还包括第二传工程改造的抗原受体(例如，CAR或TCR)，例如，嵌合共刺激受体，其能够诱导针对免疫细胞的共刺激信号，一般在特异性结合至由第二受体识别的第二抗原之后。在一些方面中，第一受体包括含有ITAM或ITAM-状基序的胞内信号转导组分。在一些方面中，第二受体包括共刺激受体的信号转导结构域，如CD28、CD137(4-1BB)、OX40、和/或ICOS。
[0172] 在一些实施方式中，由第一受体诱导的活化包括细胞中的蛋白质表达改变或信号转导，其导致引发免疫应答，如ITAM磷酸化和/或引发ITAM-介导的信号转导级联，位于结合受体附近簇集分子(例如，CD4或CD8等)和/或形成免疫学突触，一种或多种转录因子(如NF-κB和/或AP-1)的活化，和/或诱导因子如细胞因子的表达、增殖和/或存活。
[0173] 在一些实施方式中，由第二受体诱导的共刺激信号与由第一受体诱导的信号一起，导致免疫应答，如稳健且持续的免疫应答，如增加的基因表达、细胞因子和其他因子分泌、和T细胞介导的效应功能如细胞杀伤。
[0174] 在一些实施方式中，仅连接第一受体或仅连接第二受体都不会诱导稳健的免疫应答。在一些方面中，如果仅连接一个受体，细胞变得耐受或对抗原无应答，或者被抑制，和/或不被诱导增殖或分泌因子或发挥效应物功能。在一些这类实施方式中，然而，当连接多个受体时，如在表达第一和第二抗原的细胞的相遇之后，实现所需的应答，如全免疫活化或刺激，例如，由一种或多种细胞因子的分泌、增殖、持续、和/或进行免疫效应功能如细胞毒性杀伤靶细胞所示。
[0175] 在一些实施方式中，多种抗原，例如，第一和第二抗原在靶向的细胞、组织、或者疾病或病症上，如癌细胞上表达。在一些方面中，细胞、组织、疾病或病症是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。多种抗原中的一种或多种一般也在不希望用细胞治疗靶向的细胞，如正常或非疾病细胞或组织，和/或工程改造的细胞本身上表达。在这类实施方式中，通过需要连接多个受体来实现细胞应答，实现了特异性和/或功效。
[0176] 在一些实施方式中，用于多靶向策略的抗原的组合包括其中抗原中的至少一种是普遍肿瘤抗原的那些，如hTERT、生存素、MDM2、CYP1B、HER2/neu、WT1、livin、AFP、CEA、MUC16、MUC1、PSMA、p53或细胞周期蛋白(D1)，各自独立地与还靶向在肿瘤上表达的抗原的第二抗原组合。在一些实施方式中，普遍肿瘤抗原和第二抗原靶向同一肿瘤类型上的抗原。在一些实施方式中，第二抗原也可以是另一种不同的普遍肿瘤抗原或者可以是肿瘤类型特异性肿瘤抗原。在一些实施方式中，第二抗原可以是肿瘤抗原，如ROR1、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、和肝炎B表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3、或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、酪氨酸蛋白激酶B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2，和MAGE A3、CE7、维尔姆斯瘤(WT-1)、细胞周期蛋白如细胞周期蛋白A1(CCNA1)和/或生物素化分子，和/或通过HIV、HCV、HBV或其它病原体表达的分子。
[0177] 在一些实施方式中，用于多靶向策略的抗原的组合包括在多发性骨髓瘤上表达的那些，如CD38(环ADP核糖水解酶)、CD138(多配聚糖-1、多配聚糖、SYN-1)、和CS-1(CS1、CD2亚组1、CRACC、SLAMF7、CD319、和19A24)，其各自单独与也在多发性骨髓瘤中表达的第二抗原组合。在一些实施方式中，多种抗原，如分别由活化和共刺激工程改造的受体识别的那些是CD38和CD138、CD38和CS-1、CD138和CD38、CD138和CS-1、CS-1和CD38、和/或CS-1和CD138。其他多发性骨髓瘤特异性抗原包括CD20、CD40、CD56、CD74、CD200、EGFR、BCMA、和β2-微球蛋白、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1、和IIA型激活素受体(ActRIIA)。参见Benson和Byrd，Journal of Clinical Oncology，2012年6月1日，30(16)：2013-15；Tao和Anderson，Bone Marrow Research，卷2011(2011)，文章编号924058，14页；Chu等，Leukemia(26September
2013)2014年4月；28(4)：917-27；Garfall等，Discov Med.2014年1月；17(91)：37-46。在一些实施方式中，抗原包括在淋巴肿瘤、骨髓瘤、AIDS-相关淋巴瘤、和/或移植后淋巴增殖上存在的那些，如CD38。
2013)2014年4月；28(4)：917-27；Garfall等，Discov Med.2014年1月；17(91)：37-46。在一些实施方式中，抗原包括在淋巴肿瘤、骨髓瘤、AIDS-相关淋巴瘤、和/或移植后淋巴增殖上存在的那些，如CD38。
[0178] 在一些实施方式中，多种抗原受体中的一种或多种以较低亲和性识别或结合至其抗原。在一些方面中，受体以至少或约10-8M、至少或约10-7M、至少或约10-6M、至少或约10-5M、和/或至少或约10-4M的解离常数(KD)结合至其抗原。在一些这类实施方式中，抗原受体对抗原的较低亲和性有助于确保完全应答不通过连接多个遗传工程改造的抗原受体中的仅一个而实现。在一些实施方式中，CD38-靶向受体包括例如，在美国专利申请公开号
US20120189622A1中公开的抗原结合结构域，如命名为OKT10的抗体和本申请的表1中所述的其他抗体，以及与类似或相同表位结合的抗体的抗原结合部分。
US20120189622A1中公开的抗原结合结构域，如命名为OKT10的抗体和本申请的表1中所述的其他抗体，以及与类似或相同表位结合的抗体的抗原结合部分。
[0179] 在一些实施方式中，两种受体分别诱导针对细胞的活化和抑制信号，使得受体之一与其抗原的结合活化细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的结合诱导阻遏或减弱该应答的信号。示例是活化CAR与抑制性CAR或iCAR的组合。可使用这种策略，例如，其中活化CAR结合在疾病或病症中表达，但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的分开的抗原。
[0180] 用于遗传工程改造的方法和载体
[0181] 还提供了用于产生遗传工程改造的细胞的方法、核酸、化合物和试剂盒。在一些方面中，遗传工程改造包括导入编码遗传工程改造的组分或导入细胞的其他组分的核酸，如编码基因破坏蛋白质或核酸的组分。
[0182] 在一些实施方式中，通过首先刺激细胞生长，例如，T细胞生长、增殖、和/或活化，之后转导活化的细胞，并在培养中增殖至足够临床应用的数量来实现基因转移。
[0183] 在一些情况中，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对对象具有毒性。因此，在一些情况中，工程改造的细胞包括，例如在过继免疫治疗中给予之后，使细胞对体内负选择易感的基因区段。例如在一些方面中，所述细胞经工程改造，从而它们可因它们所给予的患者的体内状况的变化而被消除。可负选择的表型可通过将提供对给予的试剂(例如，化合物)的敏感性的基因来产生。可负选择的基因包括：单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等，Cell II：223，I977)，其提供更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因，细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因，细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：33(1992))。
[0184] 在一些方面中，细胞还经工程改造以促进细胞因子或其他因子的表达。用于引入遗传工程改造的组分，例如，抗原受体(例如，CAR)的各种方法是熟知的，并可采用本文提供的方法和组合物。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒，例如，逆转录病毒或慢病毒，转导，转座子，和电穿孔。
[0185] 在一些实施方式中，采用重组感染性病毒颗粒将重组核酸转移进入细胞，例如，源自猿病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体。在一些实施方式中，采用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒载体，将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Koste等，(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi：10.1038/gt.2014.25；Carlens等，(2000)Exp Hematol 28(10)：1137-46；Alonso-Camino等，(2013)Mol Ther Nucl Acids 2，e93；Park等，Trends Biotechnol.2011年11月；29(11)：550-557)。
[0186] 在一些实施方式中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)，骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，鼠胚胎干细胞病毒(MESV)，鼠干细胞病毒(MSCV)，脾病灶形成病毒(SFFV)，或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方式中，所述逆转录病毒包括源自任何禽或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染数种物种(包括人类)的宿主细胞。在一个实施方式中，用待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques7：980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy 1：5-14；Scarpa等(1991)Virology 180：849-852；Burns等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：8033-8037；和Boris-Lawrie和Temin(1993)
Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109。
Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109。
[0187] 慢病毒转导方法是已知的。示例性方法描述于，例如，Wang等，(2012)J.Immunother.35(9)：689-701；Cooper等，(2003)Blood.101：1637-1644；Verhoeyen等，(2009)Methods Mol Biol.506：97-114；和Cavalieri等，(2003)Blood.102(2)：497-505。
[0188] 在一些实施方式中，通过电穿孔将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Chicaybam等，(2013)PLoS ONE 8(3)：e60298和Van Tedeloo等，(2000)Gene Therapy 7(16)：1431-1437)。在一些实施方式中，通过转位将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Manuri等
(2010)Hum Gene Ther 21(4)：427-437；Sharma等，(2013)Molec Ther Nucl Acids 2，e74；
和Huang等，(2009)Methods Mol Biol506：115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其它方法包括磷酸钙转染(例如，描述于《分子生物学方案新编》(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州纽约)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston，Nature，346：776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等，Mol.Cell Biol.，7：2031-2034(1987))。
(2010)Hum Gene Ther 21(4)：427-437；Sharma等，(2013)Molec Ther Nucl Acids 2，e74；
和Huang等，(2009)Methods Mol Biol506：115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其它方法包括磷酸钙转染(例如，描述于《分子生物学方案新编》(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州纽约)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston，Nature，346：776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等，Mol.Cell Biol.，7：2031-2034(1987))。
[0189] 在其它实施方式中，所述细胞，例如，T细胞，未经工程改造以表达重组受体，而是包括对所需抗原具有特异性的天然产生的抗原受体，例如体外或离体培养的肿瘤-浸润性淋巴细胞和/或T细胞，例如，在孵育步骤过程中，以促进具有具体抗原特异性的细胞的扩增。例如，在一些实施方式中，产生所述细胞用于过继细胞治疗，其通过分离肿瘤特异性T细胞，例如自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)来进行。在一些情况中，采用自体肿瘤浸润性淋巴细胞直接靶向人肿瘤可介导肿瘤转归(参见Rosenberg SA等，(1988)N Engl J Med.319：1676-1680)。在一些实施方式中，从切除的肿瘤提取淋巴细胞。在一些实施方式中，此类淋巴细胞是体外扩增的。在一些实施方式中，此类淋巴细胞用淋巴因子(例如，IL-2)培养。在一些实施方式中，此类淋巴细胞介导自体肿瘤细胞但非同种异体肿瘤或自体常规细胞的特异性裂解。
[0190] 用于转移编码遗传工程改造的产物的遗传工程改造的核酸的其他方法和载体是描述于，例如，国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190的那些。
[0191] 用于引入的其他核酸(例如基因)包括用以例如通过促进转移的细胞的活力和/或功能改善治疗功效的那些；用以提供遗传标志物以供选择和/或评价细胞的基因，例如以评估体内存活或定位；用以改善安全性的基因，例如，通过使细胞对体内负选择易感，如
Lupton S.D.等，Mol.and Cell Biol.，11：6(1991)；和Riddell等，Human Gene Therapy 3：
319-338(1992)所述；也参见Lupton的公开号PCT/US91/08442和PCT/US94/05601等，其描述显性阳性可选择的标志物与阴性可选择的标志物的融合衍生的双功能可选择的融合基因
的应用。参见例如Riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏处。
Lupton S.D.等，Mol.and Cell Biol.，11：6(1991)；和Riddell等，Human Gene Therapy 3：
319-338(1992)所述；也参见Lupton的公开号PCT/US91/08442和PCT/US94/05601等，其描述显性阳性可选择的标志物与阴性可选择的标志物的融合衍生的双功能可选择的融合基因
的应用。参见例如Riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏处。
[0192] C.抑制基因表达、活性或功能
[0193] 提供的免疫细胞包括其中编码遗传工程改造的抗原受体的抗原的一种或多种基因的表达、活性、和/或功能在细胞中被抑制的免疫细胞。在一些情况中，特定感兴趣细胞可以是在疾病或病症，如肿瘤或癌症中表达，但也可由免疫细胞，如T细胞或活化T细胞表达的细胞。在一些方面中，由免疫细胞表达抗原可能是不希望的，如在对具有针对该抗原的遗传工程改造的抗原受体的免疫细胞进行工程改造的情况中，例如，在过继免疫治疗的情况中。
因此，在一些实施方式中，提供了免疫细胞，如T细胞，其含有对疾病或病症，例如，肿瘤或癌症中的靶抗原有特异性的遗传工程改造的抗原受体，并且还含有对细胞中编码该抗原的内源性基因的破坏或抑制。
因此，在一些实施方式中，提供了免疫细胞，如T细胞，其含有对疾病或病症，例如，肿瘤或癌症中的靶抗原有特异性的遗传工程改造的抗原受体，并且还含有对细胞中编码该抗原的内源性基因的破坏或抑制。
[0194] 还提供了实现这种基因抑制的方法。在一些实施方式中，通过在基因中进行破坏，如敲除、插入、错义或移码突变如双等位移码突变、删除全部或部分基因，例如其一个或多个外显子或部分、和/或敲入来进行基因抑制。在一些实施方式中，由序列特异性或靶向的核酸酶，包括DNA-结合靶向的核酸酶如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、和RNA-引导的核酸酶如CRISPR-结合核酸酶(Cas)，其经特异性设计以靶向基因的序列或其部分来实现这类破坏。
[0195] 在一些实施方式中，可在将编码遗传工程改造的抗原受体导入细胞中的方法之前、同时或之后抑制或破坏细胞中基因的方法。例如，在一些情况中，在将编码遗传工程改造的抗原受体导入细胞之前进行抑制或破坏细胞中基因的方法。
[0196] 抑制/破坏的基因
[0197] 在一些实施方式中，抑制和/或破坏的基因编码能够对工程改造的细胞具有或产生抑制性效果的产物，如抑制该细胞的免疫应答。例如，在一些情况中，抑制和/或破坏的基因编码由遗传工程改造的抗原受体识别的抗原，其是或计划在免疫细胞(如T细胞)上表达。
[0198] 在一些实施方式中，该基因编码由工程改造的细胞上的抗原受体，如遗传工程改造的抗原受体，例如CAR特异性结合的靶抗原。因此，在一些方面中，受到抑制的基因编码CAR或其他抗原受体的靶抗原。这类方面一般在特定疾病或病症中表达的靶抗原而非在工程改造中的细胞类型或其亚组上表达的靶抗原的情况中出现，如在活化工程改造的细胞之后。示例性的抗原是在活化或刺激的T细胞或NK细胞，或其亚组，尤其是由刺激条件产生的活化细胞上表达的那些，使用该刺激条件来促进导入编码CAR或其他工程改造的受体的核酸。在一些实施方式中，通过破坏或者抑制遗传工程的细胞上的抗原表达，本文提供的方法和组合物避免或降低了工程改造的细胞杀伤工程改造的细胞自身的可能性，从而促进了功效。
[0199] 在一些实施方式中，基因编码作为活化和/或共刺激性CAR靶标的抗原。在一些实施方式中，基因编码作为采用两种或更多种遗传工程改造的抗原受体的多靶向策略中的靶标的抗原，其中受体中的至少一种针对在或可在免疫细胞，如T细胞或活化T细胞上表达的抗原有特异性。
[0200] 在一些实施方式中，破坏或者其表达或功能被抑制的基因是编码普遍肿瘤抗原的任何基因，并且具体是在免疫细胞，如T细胞或活化T细胞上表达或上调的普遍肿瘤抗原。在一些实施方式中，破坏或抑制的基因是编码hTERT或生存素的基因。在一些情况中，破坏或抑制的其他示例性基因包括编码抗原MDM2、CYP1B、HER2/neu、WT1、活素、AFP、CEA、MUC16、MUC1、PSMA、p53或细胞周期蛋白(D1)的那些。在一些实施方式中，靶向的核酸酶靶向编码hTERT、生存素、p53或其他普遍肿瘤抗原的基因。在一些方面中，这种靶向破坏基因，例如，降低或消除细胞中hTERT、生存素、p53或其他普遍肿瘤抗原的表达。
[0201] 例如，在一些实施方式中，提供了免疫细胞，如T细胞，其含有特异性结合选自hTERT、生存素、MDM2、CYP1B、HER2/neu、WT1、活素、AFP、CEA、MUC16、MUC1、PSMA、p53或细胞周期蛋白(D1)的抗原的遗传工程改造并且含有对免疫细胞中相应内源性基因的表达或破坏
的抗原受体。在一些方面中，提供了免疫细胞，如T细胞，其含有特异性结合至hTERT抗原并且含有对细胞中相应内源性hTERT基因的破坏或抑制的遗传工程改造的抗原受体。在其他方面中，提供了免疫细胞，如T细胞，其含有特异性结合至生存素基因并且含有对细胞中相应内源性生存素基因的破坏或抑制的遗传工程改造的抗原受体。
的抗原受体。在一些方面中，提供了免疫细胞，如T细胞，其含有特异性结合至hTERT抗原并且含有对细胞中相应内源性hTERT基因的破坏或抑制的遗传工程改造的抗原受体。在其他方面中，提供了免疫细胞，如T细胞，其含有特异性结合至生存素基因并且含有对细胞中相应内源性生存素基因的破坏或抑制的遗传工程改造的抗原受体。
[0202] 在具体实施方式中，被破坏或者其表达或功能被抑制的基因编码CD38，如在表达抗-CD38工程改造的受体的细胞，如抗-CD38CAR中。其他示例性的基因包括编码抗原CD33和TIM-3的那些。参见Mardiros等，Blood 122(18)(2013年10月31日)。其他示例性的基因包括编码抗原CD26、CD30、CD53、CD92、CD100、CD148、CD150、CD200、CD261、CD262、和CD362的那些。在一些实施方式中，靶向的核酸酶靶向工程改造的细胞上的CD38基因。在一些方面中，靶向破坏CD38基因，例如，降低或消除工程改造的细胞上CD38的表达。在一些方面中，提供了免疫细胞，如T细胞，其含有特异性结合至CD38抗原并且含有对细胞中相应内源性CD38基因的破坏或抑制的遗传工程改造的抗原受体。
[0203] 在一些实施方式中，基因是抑制性CAR靶标。例如，在结合抑制性CAR的抗原的情况中，基因破坏在一些情况下防止或降低了工程改造的细胞自身表达的分子诱导对工程改造的细胞的应答的减弱效果的可能性。这类抗原的示例是在正常或非靶向或脱靶细胞上表达(使得包括抑制CAR分子以防止脱靶效应)，但也在用于遗传工程改造的细胞类型，如T细胞或NK细胞上表达的那些抗原。示例性的抗原是MHC分子，如MHC-I类分子，其可在一些情况中，在免疫逃逸、癌症、或感染的情况中被下调，但一般在有核细胞上表达。其他示例是也在T细胞、NK细胞、或其他针对细胞治疗工程改造的细胞上表达的任何抑制性CAR靶标。
[0204] 在一些实施方式中，该基因编码免疫抑制分子或减弱或防止工程改造的细胞的活化或刺激或其他效应功能的产物，如其例如，通过工程改造的抗原受体响应结合的增殖、存活、分泌一种或多种因子、或招募或进行细胞杀伤的能力。
[0205] 在一些实施方式中，抑制的基因编码阻遏免疫系统的蛋白质。在一些实施方式中，抑制降低基因产物对免疫系统的阻遏效果。在一些方面中，这增加了针对肿瘤细胞的免疫应答。在一些实施方式中，该基因编码腺苷受体，如A2AR。因此，在一些实施方式中，抑制了A2AR的表达、活性、和/或功能。
[0206] 基因抑制技术
[0207] 在一些实施方式中，通过破坏基因进行对基因的表达、活性、和/或功能的抑制。在一些方面中，基因被破坏，使得其表达与没有基因破坏下或没有导入以实现破坏的组分下的表达相比降低至少或约20％、30％或40％，一般至少或约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
[0208] 在一些实施方式中，一般以靶向的方式通过在基因中导入一个或多个双链断裂和/或一个或多个单链断裂来进行基因破坏。在一些实施方式中，通过核酸酶，例如，内切核酸酶，如基因靶向的核酸酶来产生双链或单链断裂。在一些方面中，在基因的编码区，例如，外显子中诱导断裂。例如，在一些实施方式中，诱导发生在编码区，例如，在第一外显子中，在第二外显子中，或在后面的外显子中的N-末端部分附近。
[0209] 在一些方面中，双链或单链断裂经过通过细胞修复过程的修复，如通过非同源末端连接(NHEJ)或同源导向修复(HDR)。在一些方面中，修复过程是易错的并且导致基因破坏，如移码突变，例如，双等位移码突变，其可导致基因的完全敲除。例如，在一些方面中，破坏包括诱导缺失、突变、和/或插入。在一些实施方式中，破坏导致存在早期终止密码子。在一些方面中，插入、缺失、易位、移码突变、和/或提早终止密码子的存在导致基因表达、活性和/或功能的抑制。
[0210] 在一些实施方式中，抑制是瞬时或可逆的，使得基因的表达在后期恢复。在其他实施方式中，抑制不是可逆或瞬时的，例如，是永久性的。
[0211] 在一些实施方式中，使用反义技术，如RNA干扰(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)来实现基因抑制，和/或使用核酶来选择性抑制或阻遏基因表达。siRNA技术包括基于采用具有与从基因转录的mRNA的核苷酸序列同源的序列和与该核苷酸序列互补的序列的双链RNA分子的RNAi的技术。siRNA一般与从基因转录的mRNA的一个区域同源/互补，或者可以是包括多个与不同区同源/互补的RNA分子的siRNA。
[0212] DNA-靶向分子和复合物；靶向的内切核酸酶
[0213] 在一些实施方式中，使用特异性结合或杂交至基因的DNA-靶向分子，如DNA-结合蛋白或DNA-结合核酸，或含有其的复合物、化合物或组合物来实现抑制。在一些实施方式中，DNA-靶向分子包含DNA-结合结构域，例如，锌指蛋白(ZFP)DNA-结合结构域、转录激活因子样蛋白(TAL)或TAL效应子(TALE)DNA-结合结构域、成簇且规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)DNA-结合结构域、或来自大范围核酸酶的DNA-结合结构域。
[0214] 锌指、TALE和CRISPR系统结合结构域可“经工程改造”，以结合至预定的核苷酸序列，例如，通过对天然产生的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区的工程改造(改变一个或多个氨基酸)。工程改造的DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非自然产生的蛋白质。设计的合理标准包括应用替代法则和计算机算法来处理现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的数据库存储信息中的信息。参见例如，美国专利号6,140,081、6,453,242和6,534,261；也参见WO 98/
53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536和WO 03/016496，以及美国公开号
20110301073。
53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536和WO 03/016496，以及美国公开号
20110301073。
[0215] 在一些实施方式中，DNA-靶向分子、复合物、或组合含有DNA-结合分子和一个或多个其他结构域，如效应结构域以促进基因的抑制或破坏。例如，在一些实施方式中，通过包含DNA-结合蛋白和异源调控结构域或功能性片段的融合蛋白来进行基因破坏。在一些方面中，结构域包括例如：活化子、抑制子、共激活子、共抑制子、沉默子、致癌基因、DNA修复酶及其相关因子和修饰子、DNA重排酶及其相关因子和修饰子、染色质相关蛋白及其修饰子(例如激酶、乙酰化酶和脱乙酰基酶)、和DNA修饰酶(例如甲基转移酶、拓扑异构酶、解螺旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、内切核酸酶)及其相关因子和修饰子。参见例如，美国专利申请号20050064474、20060188987和2007/0218528，关于DNA-结合结构域和核酸酶切割结构域的融合的详细内容通过引用全文纳入本文。在一些方面中，其他结构域是核酸酶结构域。因此，在一些实施方式中，通过基因或基因组编辑来促进基因破坏，使用工程改造的蛋白质，如核酸酶和含有核酸酶的复合物或融合蛋白，其包含与非特异性DNA-切割分子如核酸酶融合或复合的序列特异性DNA-结合结构域。
[0216] 在一些方面中，这些靶向的亲核核酸酶或含核酸酶的复合物通过诱导靶向的双链断裂或单链断裂、刺激细胞DNA-修复机制、包括易错非同源末端连接(NHEJ)和同源导向修复(HDR)来进行精确遗传修饰。在一些实施方式中，核酸酶是内切核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)、TALE核酸酶(TALEN)、RNA-引导的内切核酸酶(RGEN)，如CRISPR-结合(Cas)蛋白、或大规模核酸酶。
[0217] 在一些实施方式中，提供供体核酸，例如，编码遗传工程改造的受体的供体智力或核酸并通过HDR在引入DSB后的基因编辑位点处插入。因此，在一些实施方式中，基因的破坏和抗原受体，例如，CAR的导入同时进行，从而该基因被CAR-编码核酸的敲入或插入而部分破坏。
[0218] 在一些实施方式中，没有提供供体核酸。在一些方面中，引入DSB后的NHEJ-介导的修复产生可导致基因破坏的插入或删除突变，例如，通过产生错义突变或移码。
[0219] ZFP和ZFN；TAL，TALE，和TALEN
[0220] 在一些实施方式中，DNA-靶向分子包括与效应蛋白如内切核酸酶融合的DNA-结合蛋白如一种或多种锌指蛋白(ZFP)或转录激活因子样蛋白(TAL)。示例包括ZFN、TALE、和TALEN。参见Lloyd等，Fronteirs in Immunology，4(221)，1-7(2013)。
[0221] 在一些实施方式中，DNA-靶向分子包括一种或多种锌指蛋白(ZFP)或其结构域，其以序列特异性方式结合至DNA。ZFP或其结构域是能以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，锌指是通过锌离子配位稳定其结构的结合结构域内氨基酸序列的区域。术语锌指DNA结合蛋白常缩写作锌指蛋白或ZFP。
[0222] ZFP包括靶向特定DNA序列的人工ZFP结构域，一般长度为9-18个核苷酸，由单个指的组装生成。
[0223] ZFP包括其中单个指结构域长度为约30个氨基酸并且含有含2个非变异组氨酸残基的α螺旋，其通过锌与单个β转角的2个半胱氨酸配位，并且具有2、3、4、5或6个指。一般而言，可通过在锌指识别螺旋的4个螺旋位置(-1、2、3和6)处进行氨基酸取代来改变ZFP的序列特异性。因此，在一些实施方式中，ZFP或含ZFP的分子是非天然产生的，例如，经工程改造以结合选择的靶位点。参见例如，Beerli等(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；
Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等(2000)
Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,
503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,
635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，其均通过引用其全文纳入本文。
Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等(2000)
Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,
503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,
635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，其均通过引用其全文纳入本文。
[0224] 在一些方面中，通过如下方式抑制基因：使该基因中的第一靶位点与第一ZFP接触，从而抑制基因。在一些实施方式中，基因中的靶位点与具有6个指和调控结构域的融合ZFP接触，从而抑制基因的表达。
[0225] 在一些实施方式中，接触步骤还包括使基因中的第二靶位点与第二ZFP接触。在一些方面中，第一和第二靶位点相邻。在一些实施方式中，第一和第二ZFP是共价连接的。在一些方面中，第一ZFP是包含调控结构域或至少两个调控结构域的融合蛋白。在一些实施方式中，第一和第二ZFP是融合蛋白，各自包含调控结构域或各自包含至少2个调控结构域。在一些实施方式中，调控结构域是转录阻遏物、转录活化物、内切核酸酶、甲基转移酶、组蛋白乙酰转移酶、或组蛋白去乙酰化酶。
[0226] 在一些实施方式中，ZFP由可操作地连接至启动子的ZFP核酸编码。在一些方面中，该方法包括首先以脂质：核酸复合物或裸核酸向细胞给予核酸的步骤。在一些实施方式中，ZFP由包含可操作地连接至启动子的ZFP核酸的表达载体编码。在一些实施方式中，ZFP由可操作地连接至诱导型启动子的核酸编码。在一些方面中，ZFP由可操作地连接至弱启动子的核酸编码。
[0227] 在一些实施方式中，靶位点在基因的转录起始位点的上游。在一些方面中，靶位点与基因的转录起始位点相邻。在一些方面中，靶位点与基因的转录起始位点下游的RNA聚合酶停止位点相邻。
[0228] 在一些实施方式中，DNA-靶向分子是或者包含与DNA切割结构域融合的锌指DNA结合结构域以形成锌指核酸酶(ZFN)。在一种实施方式中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的切割结构域(或切割半结构域)和一种或多种经或未经工程改造的锌指结合域。在一些实施方式中，切割结构域来自IIS型限制性内切核酸酶Fok I。Fok I一般催化DNA的双链切割，其一是距其识别位点9个核苷酸处，而另一是距其识别位点13个核苷酸处。参见例如，美国专利号5,356,802、5,436,150和5,487,994；以及Li等，(1992)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2764-
2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等(1994b)
J.Biol.Chem.269：31,978-31,982。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2764-
2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等(1994b)
J.Biol.Chem.269：31,978-31,982。
[0229] 在一些实施方式中，ZFN靶向在工程改造的细胞中存在的基因。在一些方面中，ZFN高效生成双链断裂(DSB)，例如，在基因的编码区中的预定位点处。一般靶向的区包括外显子、编码N-末端区的区、第一外显子、第二外显子、和启动子或增强子区。在一些实施方式中，ZFN的瞬时表达促进了对遗传工程改造的细胞中靶基因的高效且永久的破坏。具体地，在一些实施方式中，ZFN的递送导致以超过50％的效率永久性破坏基因。
[0230] 许多基因特异性工程改造的锌指是市售可得的。例如，Sangamo生物科学公司(Sangamo Biosciences)(美国加利福尼亚州里士满(Richmond，CA，USA))已与西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO，USA))合作开发了用于锌指构建的平台(CompoZr)，使得研究人员能够绕过锌指构建和验证，并提供针对上千种蛋白质的特异性靶向的锌指。Gaj等，Trends in Biotechnology，2013，31(7)，397-405。在一些实施方式中，使用市售的锌指或定制。(参见，例如，西格玛奥德里奇目录号CSTZFND、CSTZFN、CTI1-1KT、和PZD0020)。
[0231] TALE和TALEN
[0232] 在一些实施方式中，DNA-靶向分子包含天然出现或工程改造(非天然出现)的转录激活因子样蛋白(TAL)DNA结合结构域，如在激活因子样蛋白效应(TALE)蛋白中，参见，例如，美国专利公开号20110301073，其通过引用全文纳入本文。
[0233] TALE DNA结合结构域或TALE是包含一种或多种TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域涉及TALE与其同类靶DNA序列的结合。单一“重复单元”(也称作“重复”)通常是33-
35个氨基酸长度，并且与自然产生的TALE蛋白中的其它TALE重复序列显示至少一些序列同源。各TALE重复单元包括1或2个DNA-结合残基，其组成重复可变双残基(RVD)，一般在重复的12位和/或13位处。已确定用于这些TALE的DNA识别的天然(规范)编码，12与13位的HD序列导致结合于胞嘧啶(C)，NG结合T、NI结合A、NN结合G或A、并且NG结合T，并且非规范(非典型)RVD也是已知的。参见美国专利公开号20110301073。在一些实施方式中，TALE可通过用针对靶DNA序列的特异性设计TAL阵列来靶向任何基因。靶序列一般从胸苷开始。
35个氨基酸长度，并且与自然产生的TALE蛋白中的其它TALE重复序列显示至少一些序列同源。各TALE重复单元包括1或2个DNA-结合残基，其组成重复可变双残基(RVD)，一般在重复的12位和/或13位处。已确定用于这些TALE的DNA识别的天然(规范)编码，12与13位的HD序列导致结合于胞嘧啶(C)，NG结合T、NI结合A、NN结合G或A、并且NG结合T，并且非规范(非典型)RVD也是已知的。参见美国专利公开号20110301073。在一些实施方式中，TALE可通过用针对靶DNA序列的特异性设计TAL阵列来靶向任何基因。靶序列一般从胸苷开始。
[0234] 在一些实施方式中，分子是DNA结合内切核酸酶，如TALE-核酸酶(TALEN)。在一些方面中，TALEN是包含衍生自TALE的DNA-结合结构域和核酸酶催化结构域以切割核酸靶序列的融合蛋白。在一些实施方式中，TALE DNA-结合结构域已经工程改造以结合编码靶抗原和/或免疫阻遏分子的基因内的靶序列。例如，在一些方面中，TALE DNA-结合结构域可靶向CD38和/或腺苷受体，如A2AR。
[0235] 在一些实施方式中，TALEN识别并切割基因中的靶序列。在一些方面中，DNA切割导致双链断裂。在一些方面中，断裂促进了同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的速率。一般而言，NHEJ是不完美的修复过程，其通常导致DNA序列在切割位点处改变。在一些方面中，修复机制包括通过直接再连接(Critchlow和Jackson，Trends Biochem Sci.1998年10月；23(10)：394-8)或通过所谓的微同源介导的末端连接再接合2个DNA末端剩余部分。在一些实施方式中，通过NHEJ的修复产生小的插入或缺失，并且可用于破坏，从而抑制基因。在一些实施方式中，修饰可以是至少一个核苷酸的取代、缺失、或添加。在一些方面中，其中已经出现切割诱导的诱变事件，即，与NHEJ事件连续的诱变事件的细胞可通过本领域熟知的方法鉴定和/或选择。
[0236] 在一些实施方式中，组装TALE重复以特异性靶向基因。(Gaj等，Trends in Biotechnology，2013，31(7)，397-405)。已经构建了靶向18740种人蛋白质编码基因的TALEN的文库(Kim等，Nature Biotechnology.31，251-258(2013))。定制设计的TALE阵列通过塞尔克蒂斯公司生物研究公司(Cellectis Bioresearch)(法国巴黎)、Transposagen生物药物公司(美国肯塔基州列克星敦(Lexington，KY，USA))、和生命技术公司(美国纽约州格兰德岛(Grand Island，NY，USA))市售可得。具体地，靶向CD38的TALEN是市售的(参见，复能基因公司(Gencopoeia)，目录号HTN222870-1、HTN222870-2、和HTN222870-3，可获自万维网www.genecopoeia.com/product/search/detail.php？prt＝26&cid＝&key＝
HTN222870)。示例性的分子描述于，例如，美国专利公开号US 2014/0120622和2013/
0315884。
HTN222870)。示例性的分子描述于，例如，美国专利公开号US 2014/0120622和2013/
0315884。
[0237] 在一些实施方式中，TALEN以由一个或多个质粒载体编码的转基因形式导入。在一些方面中，质粒载体可含有选择标志物，其提供对接受所述载体的细胞的鉴定和/或选择。
[0238] RGEN(CRISPR/Cas系统)
[0239] 在一些实施方式中，使用一种或多种DNA-结合核酸来进行抑制，如通过RNA-导向内切核酸酶(RGEN)的破坏，或通过另一种RNA-导向效应分子的其他抑制形式。例如，在一些实施方式中，使用成簇且规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR-结合(Cas)蛋白来进行抑制。参见Sander和Joung，Nature Biotechnology，32(4)：347-355。
[0240] 一般而言，“CRISPR系统”笼统指代参与CRISPR-结合(“Cas”)基因表达或指导其活性的转录本或其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式作用CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-伴侣序列(在内源性CRISPR系统中包括“直接重复”和tracrRNA-处理的部分直接重复)、引导序列(在内源性CRISPR系统中也称为“间隔子”)、和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录本。
[0241] 在一些实施方式中，CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统包括非编码RNA分子(引导)RNA，其序列特异性结合DNA，和Cas蛋白(例如，Cas9)，具有核酸酶功能(例如，2个核酸酶结构域)。
[0242] 在一些实施方式中，CRISPR系统的一个或多个元件衍生自I型、II型、或III型CRISPR系统。在一些实施方式中，CRISPR系统的一个或多个元件衍生自包含内源性CRISPR系统的特定生物体，如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
[0243] 在一些实施方式中，将Cas核酸酶和gRNA(包括靶序列特异性的crRNA与固定的tracrRNA的融合)导入细胞中。一般而言，在gRNA的5’末端处的靶位点使用互补碱基配对将Cas核酸酶靶向所述靶位点，例如，所述基因。在一些实施方式中，基于其原型间隔子邻近基序(PAM)序列刚好5’处的位置选择靶位点，如一般NGG或NAG。在该方面中，通过修饰引导RNA的前20个核苷酸以对应靶DNA序列来使gRNA靶向所需序列。
[0244] 在一些实施方式中，CRISPR系统在靶位点处诱导DSB，之后进行破坏，如本文所述。在其他实施方式中，被视为“缺刻酶”的Cas9变体用于在靶位点处切开单链。在一些方面中，使用配对的缺刻酶，例如，以改善特异性，各自由一对不同的gRNA靶向序列指导，使得在诱导缺口的同时导入5’突出端。在其他实施方式中，催化上无活性的Cas9与异源效应结构域，如转录阻遏物或活化物融合，以影响基因表达。
[0245] 一般而言，CRISPR系统由促进在靶序列位点处形成CRISPR复合物的元件表征。一般而言，在形成CRISPR复合物的情况中，“靶序列”一般是指引导序列被针对其设计具有互补性的序列，其中靶序列与引导序列之间的杂交促进形成CRISPR复合物。并不必然需要完全互补，前提是有充足的互补性产生杂交并促进CRISPR复合物形成。
[0246] 靶序列可包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方式中，靶序列位于细胞的核或胞质中。在一些实施方式中，靶序列可在细胞的细胞器内。一般而言，可用于重组到包含靶序列的靶向的基因座中的序列或模板被称作“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面中，外源性模板多核苷酸可被称为编辑模板。在一些方面中，重组是同源重组。
[0247] 一般而言，在内源性CRISPR系统中，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一个或多个Cas蛋白复合的引导序列)的形成导致在靶序列中或其附近(例如，在来自其中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多碱基对内)切割一条链或两条链。不希望受理论限制，可包含或由全部或部分野生型tracr序列组成的tracr序列(例如，野生型tracr序列的约或超过约20、26、32、45、48、54、63、67、85、或更多个核苷酸)也可形成CRISPR复合物的部分，如通过沿着tracr序列的至少一部分与可操作地连接至引导序列的tracr伴侣序列的全部或部分
杂交。在一些实施方式中，tracr序列与tracr伴侣序列有充足的互补性以杂交并参与
CRISPR复合物形成。
杂交。在一些实施方式中，tracr序列与tracr伴侣序列有充足的互补性以杂交并参与
CRISPR复合物形成。
[0248] 对于靶序列，在一些实施方式中，完全互补性并非必需。在一些实施方式中，tracr序列在最佳比对时沿tracr伴侣序列的长度有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。在一些实施方式中，驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达的一个或多个载体被导入细胞中，使得CRISPR系统的元件的表达在一个或多个靶位点处指导
CRISPR复合物形成。例如，Cas酶、与tracr-伴侣序列连接的引导序列、和tracr序列可各自可操作地连接至分开的载体上的分开的调控元件。或者，从相同或不同调控元件表达的元件中的两个或更多个可在单一载体中组合，一个或多个其他载体提供不包括在第一载体内的CRISPR系统的任意组分。在一些实施方式中，在单一载体中组合的CRISPR系统元件可以任意合适的取向排列，使得一个元件位于第二元件的5’(“上游”)或3’(“下游”)。一个元件的编码序列可位于第二元件的编码序列的相同或相反链上，并且可以相同或相反方向取
向。在一些实施方式中，单一启动子驱动编码CRISPR酶的转录本和一种或多种以下的表达：
引导序列、tracr伴侣序列(任选地可操作地连接至引导序列)、和包埋在一个或多个内含子序列内的tracr序列(例如，各自在不同内含子中，2个或更多个在至少一个内含子中，或者全部在单一内含子中)。在一些实施方式中，CRISPR酶、引导序列、tracr伴侣序列、和tracr序列可操作地连接至同一启动子并从其表达。
CRISPR复合物形成。例如，Cas酶、与tracr-伴侣序列连接的引导序列、和tracr序列可各自可操作地连接至分开的载体上的分开的调控元件。或者，从相同或不同调控元件表达的元件中的两个或更多个可在单一载体中组合，一个或多个其他载体提供不包括在第一载体内的CRISPR系统的任意组分。在一些实施方式中，在单一载体中组合的CRISPR系统元件可以任意合适的取向排列，使得一个元件位于第二元件的5’(“上游”)或3’(“下游”)。一个元件的编码序列可位于第二元件的编码序列的相同或相反链上，并且可以相同或相反方向取
向。在一些实施方式中，单一启动子驱动编码CRISPR酶的转录本和一种或多种以下的表达：
引导序列、tracr伴侣序列(任选地可操作地连接至引导序列)、和包埋在一个或多个内含子序列内的tracr序列(例如，各自在不同内含子中，2个或更多个在至少一个内含子中，或者全部在单一内含子中)。在一些实施方式中，CRISPR酶、引导序列、tracr伴侣序列、和tracr序列可操作地连接至同一启动子并从其表达。
[0249] 在一些实施方式中，载体包含一个或多个插入位点，如限制性内切核酸酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方式中，一个或多个插入位点(例如，约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个插入位点)位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施方式中，载体包含在tracr伴侣序列上游，和任选地在可操作地连接至tracr伴侣序列的调控元件下游的插入位点，使得在将引导序列插入插入位点并表达之后，引导序列指导CRISPR复合物与真核细胞中靶序列的序列特异性结合。在一些实施方式中，载体包含2个或更多个插入位点，各插入位点位于2个tracr伴侣序列之间以使得在各位点处插入引导序列。在这种排列中，2个或更多个引导序列可包含2个或更多个不同引导序列、单一引导序列的2个或更多个拷贝、或这些的组合。当使用多个不同的引导序列时，可使用单一表达构建体来将CRISPR活性靶向细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单一载体可包含约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个引导序列。在一些实施方式中，可提供约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个这类含引导序列的载体，并任选地递送至细胞。
[0250] 在一些实施方式中，载体包含可操作地连接至编码CRISPR酶(如Cas蛋白的酶编码序列)的调控元件。Cas蛋白的非限制性示例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物、或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，可在登录号Q99ZW2下在SwissProt数据库中发现酿脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列。在一些实施方式中，未修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性，如Cas9。在一些实施方式中，CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自酿脓链球菌或肺炎链球菌的Cas9。在一些实施方式中，CRISPR酶指导在靶序列位置处，如在靶序列内和/或在靶序列的互补物内的一条或两条链的切割。在一些实施方式中，CRISPR酶指导在距离靶序列的第一或最后核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多碱基对内切割一条或两条链。在一些实施方式中，载体编码相对于相应野生型酶突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺少切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸的突变(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转变为缺刻酶(切割单链)。在一些实施方式中，Cas9缺刻酶可与引导序列联用，例如，2个引导序列，其分别靶向DNA靶标的正义链和反义链。这种组合使得两条链被切开并用于诱导NHEJ。
[0251] 在一些实施方式中，编码CRISPR酶的酶编码序列经密码子优化用于在特定细胞，如真核细胞中表达。真核细胞可以是特定生物体的那些或从中衍生的那些，所述生物体诸如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、或非人灵长类。一般而言，密码子优化是指通过将天然序列的至少一个密码子(例如，约或超过约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个密码子)用在宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换修饰核酸序列用于增强宿主细胞中的表达同时保持天然氨基酸序列的过程。各种物种显示出对特定氨基酸的某些密码子的特定偏好。密码子偏好(生物体间密码子使用差异)常和信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，继而认为其依赖于被翻译的密码子性质和具体转移RNA(tRNA)分子的有效性。所选tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中使用最频繁的密码子。因此，可基于密码子优化就给定生物体中最佳的基因表达来调整基因。在一些实施方式中，编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多、或全部密码子)对应于特定氨基酸的最频繁使用的密码子。
[0252] 一般而言，引导序列是与靶多核苷酸序列有足够互补性以与靶序列杂交并引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方式中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，引导序列与其相应靶序列之间的互补程度为约或超过约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。
[0253] 可使用任意合适的用于比对序列的算法来确定最佳比对，其非限制性示例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如，Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft技术公司)、ELAND(加利福尼亚州圣迭戈的亿明达公司(Illumina，San Diego，Calif.))、SOAP(可获自soap.genomics.org.cn)、和Maq(可获自maq.sourceforge.net)。在一些实施方式中，引导序列为约或超过约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、35、40、45、50、75或更多个核苷酸。在一些实施方式中，引导序列的长度小于约
75、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少个核苷酸。可通过任意合适的试验来评价引导序列指导CRISPR复合物序列特异性结合靶序列的能力。例如，足够形成CRISPR复合物的
CRISPR系统的组分，包括待测试的引导序列，可提供至具有相应靶序列的细胞，如通过用编码CRISPR序列的组分的载体转染，之后评价靶序列内的优先切割，如通过本文所述的
Surveyor试验。类似地，可通过提供靶序列，CRISPR复合物的组分，包括待测试的引导序列和与测试引导序列不同的对照引导序列，并比较测试和对照引导序列反应之间在靶序列处的切割速率或结合，来试管中评价靶多核苷酸序列的切割。
28、29、30、35、40、45、50、75或更多个核苷酸。在一些实施方式中，引导序列的长度小于约
75、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少个核苷酸。可通过任意合适的试验来评价引导序列指导CRISPR复合物序列特异性结合靶序列的能力。例如，足够形成CRISPR复合物的
CRISPR系统的组分，包括待测试的引导序列，可提供至具有相应靶序列的细胞，如通过用编码CRISPR序列的组分的载体转染，之后评价靶序列内的优先切割，如通过本文所述的
Surveyor试验。类似地，可通过提供靶序列，CRISPR复合物的组分，包括待测试的引导序列和与测试引导序列不同的对照引导序列，并比较测试和对照引导序列反应之间在靶序列处的切割速率或结合，来试管中评价靶多核苷酸序列的切割。
[0254] 可选择引导序列来靶向任意靶序列。在一些实施方式中，靶序列是细胞基因组内的序列。示例性的靶序列包括在靶基因组中特有的那些。在一些实施方式中，选择引导序列以降低引导序列内的二级结构的程度。可通过任意合适的多核苷酸折叠算法来确定二级结构。
[0255] 一般而言，tracr伴侣序列包括与tracr序列有足够互补性以促进以下一种或多种的任意序列：(1)在含有相应tracr序列的细胞中切割由tracr伴侣序列侧接的引导序列；和(2)在靶序列处形成CRISPR复合物，其中CRISPR复合物包含与tracr序列杂交的tracr伴侣序列。一般而言，互补程度参考tracr伴侣序列与tracr序列沿两条序列中较短序列的长度的最佳比对。
[0256] 最佳比对可通过任何合适的比对算法确定，并且还考虑二级结构，如tracr序列或tracr伴侣序列内的自互补。在一些实施方式中，当最佳比对时，tracr序列和tracr伴侣序列之间沿两者之间较短的序列的互补程度是约或超过约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。在一些实施方式中，tracr序列长度为约或超过约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多个核苷酸。在一些实施方式中，tracr序列和tracr伴侣序列包含在单一转录本内，使得两者之间的杂交产生具有二级结构如发夹的转录本。在一些方面中，用于发夹结构的环形成序列长度为4个核苷酸，并且具有序列GAAA。然而，可使用较长或较短的环序列，替代序列也可以。在一些实施方式中，序列包括核苷酸三连体(例如，AAA)，和额外核苷酸(例如，C或G)。环形成序列的示例包括CAAA和AAAG。在一些实施方式中，转录本或转录的多核苷酸序列具有至少2个或更多个发夹。在一些实施方式中，转录本具有2、3、4或5个发夹。在其他实施方式中，转录本具有至多5个发夹。在一些实施方式中，单个转录本还包括转录终止序列，如聚T序列，例如，6个T核苷酸。
[0257] 在一些实施方式中，CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白质结构域(例如，除CRISPR酶外，约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个结构域)的融合蛋白。CRISPR酶融合蛋白可包含任何其他蛋白质序列，和任选的任意两个结构域之间的接头序列。可与
CRISPR酶融合的蛋白质结构域的示例包括，但不限于，表位标签、报告基因序列、和具有一种或多种以下活性的蛋白质结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录活化活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性示例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的示例包括，但不限于，谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、和自荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(BFP)。CRISPR酶可融合至编码结合DNA分子或结合其他细胞分子的蛋白质或蛋白质的片段的基因序列，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合体、GAL4A DNA结合结构域融合体、和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合体。可形成包括CRISPR酶的融合蛋白的部分的其他结构域描述于
US20110059502，其通过引用纳入本文。在一些实施方式中，带标签的CRISPR酶用于鉴定靶序列的位置。
CRISPR酶融合的蛋白质结构域的示例包括，但不限于，表位标签、报告基因序列、和具有一种或多种以下活性的蛋白质结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录活化活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性示例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的示例包括，但不限于，谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、和自荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(BFP)。CRISPR酶可融合至编码结合DNA分子或结合其他细胞分子的蛋白质或蛋白质的片段的基因序列，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合体、GAL4A DNA结合结构域融合体、和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合体。可形成包括CRISPR酶的融合蛋白的部分的其他结构域描述于
US20110059502，其通过引用纳入本文。在一些实施方式中，带标签的CRISPR酶用于鉴定靶序列的位置。
[0258] 在一些实施方式中，向细胞递送与引导序列的组合(和任选复合)的CRISPR酶。例如，CRISPR/Cas9技术可用于敲减工程改造的细胞中靶抗原的基因表达。在一个示例性方法中，Cas9酶(例如，由来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或来自酿脓链球菌(Stretpococcus pyogenes)的mRNA编码的那些，例如，pCW-Cas9，Addgene#50661，Wang等，(2014)Science，3：343-80-4；或可以目录号K002、K003、K005或K006购自应用生物材料公司(Applied Biological Materials)(ABM；加拿大)的核酸酶或缺刻酶慢病毒载体)和对靶抗原基因有特异性的引导RNA被导入细胞，例如，使用慢病毒递送载体或多种用于转移至细胞的已知递送方法或载剂中的任一种，如多种用于递送Cas9分子和引导RNA的已知方法中的任一种。也生成非特异性或空载体对照T细胞。使用多种用于评价细胞中基因破坏的熟知试验中的任一种来评价基因的敲除程度(例如，转移后24-72小时)。
[0259] 可获得用于敲除普遍肿瘤抗原，如MDM2、CYP1B、HER2/neu、WT1、活素、AFP、CEA、MUC16、MUC1、PSMA、p53或细胞周期蛋白(D1)中的任意一种或多种的市售试剂盒、gRNA载体和供体载体，例如，来自傲锐基因公司(Origene)(马里兰州洛克维尔(Rockville，MD))、金斯瑞公司(GenScript)(佐治亚州亚特兰大(Atlanta，GA))、应用生物材料公司(ABM；不列颠哥伦比亚里士满(Richmond，British Colombia))、BC公司(BioCat)(德国海德堡(Heidelberg，Germany))等。例如，用于通过CRISPR敲除hTERT的市售试剂盒包括，例如，目录号K0009801、K0009802、K009803和/或K0009804的那些，各自购自ABM。用于通过CRISPR敲除生存素的市售试剂盒包括，例如，购自OG公司的目录号KN205935和各自购自ABM的目录号K0184401、K0184402、K0184403、K0184404。用于通过CRISPR敲除MDM2的市售试剂盒包括，例如，购自OG公司的KN219518和购自ABM的目录号K1283521。用于通过CRISPR敲除Her2/neu的市售试剂盒包括，例如，购自OG公司的KN212583。用于通过CRISPR敲除Cyp1B1的市售试剂盒包括，例如，购自BC公司的KN204074-OR。用于通过CRISPR敲除WT1的市售试剂盒包括，例如，购自OG公司的KN220079。
[0260] 用于通过CRISPR敲除CD38的市售试剂盒、gRNA载体和供体载体可购自，例如，OG公司。参见www.origene.com/CRISPR-CAS9/Product.aspx？SKU＝KN203179；目录号KN203179G1、KN203179G2、KN203179D。
[0261] 在一些方面中，靶多核苷酸在真核细胞中修饰。在一些实施方式中，该方法包括使CRISPR复合物结合至靶多核苷酸以实现对所述靶多核苷酸的切割，从而修饰该靶多核苷酸，其中CRISPR复合物包含与杂交至所述靶多核苷酸内的靶序列的引导序列复合的CRISPR酶，其中所述引导序列连接至tracr伴侣序列，其进而杂交至tracr序列。
[0262] 在一些方面中，该方法包括在真核细胞中修饰多核苷酸的表达。在一些实施方式中，该方法包括使CRISPR复合物结合至靶多核苷酸使得所述结合导致增加或降低的所述多核苷酸的表达；其中CRISPR复合物包含与杂交至所述多核苷酸内的靶序列的引导序列复合的CRISPR酶，其中所述引导序列连接至tracr伴侣序列，其进而杂交至tracr序列。
[0263] 编码基因破坏分子和复合物的核酸的递送
[0264] 在一些方面中，编码DNA靶向分子、复合物或组合的核酸给予或导入细胞。一般以表达载体，如病毒表达载体的形式给予核酸。在一些方面中，表达载体是慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、DNA质粒表达载体、或AAV表达载体。在一些方面中，向细胞递送编码破坏分子或复合物，如DNA-靶向分子的一种或多种多核苷酸。在一些方面中，递送是通过一个或多个载体、一个或多个其转录本、和/或从其转录的蛋白质递送至细胞。
[0265] 在一些实施方式中，通过向细胞中导入编码多肽的多核苷酸，来在细胞中原位合成多肽。在一些方面中，多肽可在细胞外产生，然后向细胞中导入。用于向动物细胞中导入多核苷酸构建体的方法是已知的并且包括，作为非限制性示例，稳定转化方法，其中多核苷酸构建体被整合到细胞基因组中，瞬时转化方法，其中多核苷酸构建体不被整合到细胞基因组中，以及病毒介导的方法。在一些实施方式中，可通过例如，重组病毒载体(例如，逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等向细胞中导入多核苷酸。例如，在一些方面中，瞬时转化方法包括微注射、电穿孔或颗粒轰击。在一些实施方式中，可将多核苷酸包括在载体中，更具体地，质粒或病毒中，以供在细胞中表达。
[0266] 在一些实施方式中，可使用病毒和非病毒基基因转移方法在哺乳动物细胞或靶组织中导入核酸。这类方法可用于向宿主生物体中或培养中的细胞给予编码CRISPR、ZFP、ZFN、TALE、和/或TALEN系统的组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，本文所述载体的转录本)、裸核酸和与递送载体(例如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有附加体或整合的基因组。对于基因治疗法的综述，参见Anderson，Science 256：808-813(1992)；Nabel和Felgner，TIBTECH11：211-217(1993)；Mitani和Caskey，TIBTECH 11：162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11：167-175(1993)；Miller，Nature 357：455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology 6(10)：1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience 8：35-36(1995)；Kremer和Perricaudet，British Medical Bulletin51(1)：31-44(1995)；Haddada等，刊于《微生物与免疫学热门主题》(Current Topics in Microbiology and Immunology)Doerfler与
(编)(1995)；和Yu等，Gene Therapy 1：13-26(1994)。
(编)(1995)；和Yu等，Gene Therapy 1：13-26(1994)。
[0267] 非病毒递送核酸的方法包括脂质转染、核转染、微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸偶联物、裸DNA、人工病毒粒，和试剂增强型DNA摄取。脂质转染描述于例如，美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355，并且脂质转染试剂市售可得(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适于多核苷酸的高效受体-识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括那些Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024的那些。可以递送至细胞(例如，体外或离体给予)或靶组织(例如，体内给予)。
[0268] 在一些实施方式中，递送是通过使用用于递送核酸的基于RNA或DNA病毒的系统。在一些方面中，病毒载体可直接给予患者(体内)或者它们可用于体外或离体治疗细胞，并然后给予患者。在一些实施方式中，基于病毒的系统包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。
[0269] 在一些方面中，包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、和自荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(BFP)的报告基因可被导入细胞中以编码基因产物，其用作标记物，通过其测量基因产物的表达改变或修饰。在另一个实施方式中，可通过载体将编码基因产物的DNA分子导入细胞中。在一些实施方式中，基因产物是荧光素酶。在另一个实施方式中，基因产物的表达降低。
[0270] II.组合物、制剂、试剂盒、装置、方法和用途
[0271] 还提供了细胞、细胞群、和含通过提供的方法产生的细胞的组合物。组合物包括用于给药的药物组合物和制剂，如用于过继细胞治疗。还提供治疗方法，例如，将所述细胞和组合物给予对象(例如患者)的治疗方法。
[0272] 提供了细胞的方法和用途，包括治疗方法和用途，如用于过继细胞治疗。在一些实施方式中，该方法包括向对象、组织或细胞，如具有疾病、病症或紊乱风险或疑似具有疾病、病症或紊乱的对象、组织或细胞给予细胞或含有该细胞的组合物。在一些实施方式中，该方法能治疗癌症和其他疾病、病症和紊乱。在一些实施方式中，将所述细胞、群和组合物给予具有具体待治疗(例如，通过过继细胞治疗，例如过继T细胞治疗)的疾病或病症的对象。在一些实施方式中，向对象，如具有疾病或病症或者处于疾病或病症风险中的对象给予细胞或组合物。在一些方面中，所述方法由此治疗，例如，减轻所述疾病或病症的一种或多种症状，例如通过减小表达由所述工程改造的细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负荷。
[0273] 用于给予用于过继细胞治疗的细胞的方法是已知的，并可与本文提供的方法和组合物联用。例如，过继T细胞治疗方法描述于，例如，Gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin
Oncol.8(10)：577-85)。参见例如Themeli等.(2013)Nat Biotechnol.31(10)：928-933；
Tsukahara等.(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1)：84-9；Davila等.(2013)PLoS ONE 8(4)：e61338。
Oncol.8(10)：577-85)。参见例如Themeli等.(2013)Nat Biotechnol.31(10)：928-933；
Tsukahara等.(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1)：84-9；Davila等.(2013)PLoS ONE 8(4)：e61338。
[0274] 在一些实施方式中，所述细胞治疗，例如，过继T细胞治疗，通过如下方式进行：自体转移，其中所述细胞经分离和/或在其它情况中从接受所述细胞治疗的对象或从源自此类对象的样品制备。因此，在一些方面中，所述细胞源自需要治疗和所述细胞的对象(例如，患者)，其在分离和处理之后给予同一对象。
[0275] 在一些实施方式中，所述细胞治疗，例如，过继T细胞治疗，通过如下方式进行：同种异体转移，其中所述细胞分离和/或在其它情况中从对象制备，该对象与待接受或最终接受所述细胞治疗的对象(例如，第一对象)不同。在此类实施方式中，然后将所述细胞给予相同物种的不同对象，例如，第二对象。在一些实施方式中，所述第一和第二对象是遗传学相同的。在一些实施方式中，所述第一和第二对象是遗传学相似的。在一些实施方式中，所述第二对象表达与第一对象相同的HLA类别或超类型。
[0276] 在一些实施方式中，向其给予所述细胞、细胞群或组合物的对象(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类，例如人。在一些实施方式中，所述灵长类是猴子或猿。所述对象可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿，少年，青少年，成人，和老年对象。在一些实施方式中，所述对象是非灵长类哺乳动物，例如啮齿类。在一些示例中，患者或对象是针对疾病、过继细胞治疗、和/或评价毒性结果如细胞因子释放综合征(CRS)的验证的动物模型。
[0277] 还提供用于此类方法的药物组合物。
[0278] 所述疾病、病症和紊乱包括肿瘤，包括实体肿瘤、血液恶性肿瘤，和黑素瘤，以及感染性疾病，例如病毒或其它病原体，例如，HIV，HCV，HBV，CMV的感染，和寄生性疾病。在一些实施方式中，所述疾病或病症是肿瘤，癌症，恶性肿瘤，赘生物，或其它增殖性疾病。这类疾病包括但不限于免疫系统的癌症，白血病、淋巴瘤、例如、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、ALL、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治滤泡性淋巴瘤淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌(包括黑素瘤)、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、尤文肉瘤、成神经管细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤，和/或间皮瘤。在一个实施方式中，疾病或病症是多发性骨髓瘤或与多发性骨髓瘤相关。
[0279] 在一些实施方式中，所述疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于，病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方式中，所述疾病或病症是自体免疫或炎性疾病或病症，例如关节炎，例如类风湿性关节炎(RA)，I型糖尿病，系统性红斑狼疮(SLE)，炎性肠病，牛皮癣，硬皮病，自身免疫性甲状腺疾病，格雷夫斯病，克罗恩病多发性硬化，哮喘和/与移植相关的疾病或病症。
[0280] 在一些实施方式中，一种或多种遗传工程改造的抗原受体特异性结合至与疾病或病症相关的靶抗原。在一些情况中，两种或更多种遗传工程改造的抗原受体结合至两种或更多种与疾病或病症相关的不同抗原。在一些实施方式中，至少一种与疾病或病症相关的抗原是普遍肿瘤抗原。例如，在一些情况中，该抗原是hTERT、生存素、MDM2、CYP1B、HER2/neu、WT1、活素、AFP、CEA、MUC16、MUC1、PSMA、p53或细胞周期蛋白(D1)。例如，普遍肿瘤抗原是hTERT或生存素。在一些实施方式中，至少一种与疾病或病症相关的抗原是骨髓瘤抗原。例如，在一些情况中，骨髓瘤抗原是CD38、CD138、CS-1、CD56、TIM-3、CD33、CD123或CD44。例如，骨髓瘤抗原是CD38。
[0281] 在一些实施方式中，一种或多种与所述疾病或紊乱相关的其他抗原选择自下组：孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、和肝炎B表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3、或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、酪氨酸蛋白激酶B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2，和MAGEA3、CE7、维尔姆斯瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白如细胞周期蛋白A1(CCNA1)和/或生物素化分子，和/或通过HIV、HCV、HBV或其它病原体表达的分子。抗原包括蛋白质、糖和其他分子。
[0282] 在一些实施方式中，细胞和细胞群以组合物，如药物组合物的形式给予对象。在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它药学活性物质或药物，例如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，长春新碱等。在一些实施方式中，所述细胞群以盐，例如，药学上可接受的盐，的形式给予。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸的那些，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，和有机酸，例如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如，对甲苯磺酸。
[0283] 在一些方面中，所述药物组合物中所用的运载体部分通过具体工程改造的CAR或TCR、载体，或表达CAR或TCR的细胞来确定，以及根据用以给予所述载体或表达所述CAR的宿主细胞的具体方法来确定。因此，存在多种合适的配方。例如，所述药物组合物可包含防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，采用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量通常是约0.0001％至约2％(以组合物总重量计)。
[0284] 此外，在一些方面中，所述组合物包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。在一些方面中，采用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的存在量通常是约0.001％至约4％(以组合物总重量计)。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法具体描述于，例如《，雷明顿：药物科学与实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，LWW公司(Lippincott Williams&Wilkins)；第21版(2005年5月1日)。
[0285] 在某些实施方式中，包含本文所述细胞群的药物组合物可配制为包合复合物，例如环糊精包合复合物，或配制为脂质体。脂质体可用以靶向宿主细胞(例如，T-细胞或NK细胞)至具体组织。许多方法可用于制备脂质体，例如描述于，例如，Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9：467(1980)和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和
5,019,369中的那些。
5,019,369中的那些。
[0286] 在一些方面中，所述药物组合物采用时间-释放、延迟释放和持续释放递送系统，从而所述组合物的递送在待治疗的部位敏化之前发生，并且具有足够的时间造成该部位敏化。许多类型的释放递送系统是本领域技术人员可以获得和已知的。此类系统能避免重复给予所述组合物，由此提高对象和医师的便利度。
[0287] 在一些实施方式中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量，如治疗有效或预防有效量的细胞。在一些实施方式中，通过定期评估治疗的对象来监测治疗或预防性功效。对于经数天或更长时间的重复给药，可根据所述病症使治疗重复直至疾病症状得到所需阻遏。然而，其它剂量方案可能是有用的并可以确定。所需剂量可以通过单药丸给予所述组合物，通过多药丸给予所述组合物，或通过连续输注给予组合物来递送。
[0288] 在某些实施方式中，以如下范围给予所述对象：约100万-约1000亿细胞，例如，100万-约500亿细胞(例如，约5百万细胞，约2500万细胞，约500亿细胞，约10亿细胞，约50亿细胞，约200亿细胞，约300亿细胞，约400亿细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，例如约1000万-约1000亿细胞(例如，约2000万细胞，约3000万细胞，约4000万细胞，约6000万细胞，约7000万细胞，约8000万细胞，约9000万细胞，约100亿细胞，约250亿细胞，约500亿细胞，约
750亿细胞，约900亿细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，和在一些情况中，约1亿细胞-约500亿细胞(例如，约1.2亿细胞，约2.5亿细胞，约3.5亿细胞，约4.5亿细胞，约6.5亿细胞，约8亿细胞，约9亿细胞，约30亿细胞，约300亿细胞，约450亿细胞)或这些范围之间任何值。
750亿细胞，约900亿细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，和在一些情况中，约1亿细胞-约500亿细胞(例如，约1.2亿细胞，约2.5亿细胞，约3.5亿细胞，约4.5亿细胞，约6.5亿细胞，约8亿细胞，约9亿细胞，约30亿细胞，约300亿细胞，约450亿细胞)或这些范围之间任何值。
[0289] 在一些实施方式中，使用标准给药技术、制剂和/或装置给予细胞和组合物。提供了用于组合物储存和给予的制剂和装置，如注射器和瓶。给药可以是自体同源或异源的。例如，免疫抑制细胞或祖细胞可获自一个对象，并给予相同对象或不同的相容对象。本发明的外周血衍生的免疫抑制细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可通过局部注射给予，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射、或胃肠外给药。当给予本发明的药物组合物(例如，含有遗传修饰的免疫抑制细胞的药物组合物)时，其通常被配制成单位剂型的可注射形式(溶液、悬液、乳液)。
[0290] 制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内、鼻内、粘膜、舌下或栓剂给药的那些。在一些实施方式中，所述细胞群胃肠外给予。本文所用的术语“胃肠外”，包括静脉内，肌内，皮下，直肠，阴道和腹膜内给予。在一些实施方式中，所述细胞群通过静脉内，腹膜内或皮下注射采用外围全身递送给予对象。
[0291] 在一些实施方式中，细胞的组合物以无菌液体制剂的形式提供，例如，等渗水性溶液、悬液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面中可缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物多少更便于给药，尤其是通过注射。在另一方面，粘性组合物可在合适的粘度范围内配制以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包括运载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适混合物。
[0292] 可通过将遗传改造物纳入溶剂中，如与合适运载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等来制备无菌可注射溶液。该组合物也可被冻干。组合物可含有辅助性物质，如润湿、分散、或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、风味剂、色素等，取决于所需的给药和制备途径。在一些方面中，可查阅标准教科书来制备合适制备物。
[0293] 可添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。也可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的物质，如单硬脂酸铝和明胶演唱可注射药物形式的吸收。
[0294] 在一些实施方式中，细胞与一种或多种其它治疗剂共同给予，或与另一治疗介入联合，同时或以任何顺序依次进行。在一些情况中，所述细胞与另一治疗在足够接近的时间共同给予，从而所述细胞群增强一种或多种其它治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，所述细胞群在一种或多种其它治疗剂之前给予。在一些实施方式中，所述细胞群在一种或多种其它治疗剂之后给予。
[0295] 一旦向哺乳动物(例如，人)给予细胞，在一些方面中，通过多种已知方法中的任一种来测量工程改造的细胞群的生物活性。用以评估的参数包括：工程改造的或天然T细胞或其它免疫细胞与抗原的特异性结合，体内方式(例如，通过成像)或离体方式(例如，通过ELISA或流式细胞术)。在某些实施方式中，工程改造的细胞破坏靶细胞的能力可采用本领域已知的任何合适的方法来检测，例如描述于如下文献的细胞毒性试验，例如，Kochenderfer等，J.Immunotherapy，32(7)：689-702(2009)，和Herman等.J.Immunological Methods，285(1)：25-40(2004)。在某些实施方式中，也可通过测定某些细胞因子，例如CD
107a，IFNγ，IL-2和TNF的表达和/或分泌，来测量细胞的生物活性。在一些方面中，生物活性通过评估临床结果，例如肿瘤负荷或负载的减少，来检测。
107a，IFNγ，IL-2和TNF的表达和/或分泌，来测量细胞的生物活性。在一些方面中，生物活性通过评估临床结果，例如肿瘤负荷或负载的减少，来检测。
[0296] 在某些实施方式中，工程改造的细胞以任何数量的方式修饰，从而增加其治疗或预防性功效。例如，通过所述群表达的工程改造的CAR或TCR可通过接头直接或间接连接靶向部分。连接化合物，例如，将CAR或TCR连接至靶向部分的实践是本领域已知的。参见例如，Wadwa等，J.Drug Targeting 3：1 1 1(1995)，和美国专利5,087,616。
[0297] III.定义
[0298] 本文所用的基因表达的“抑制”是指与没有抑制的情况下由细胞中对象基因编码的一种或多种基因产物的表达水平相比，该基因产物的表达的消除或降低。示例性的基因产物包括mRNA和由基因编码的蛋白质产物。抑制在一些情况中是瞬时或可逆的并且在其他情况中是永久的。在一些情况中，抑制是功能性或全长蛋白质或mRNA的，尽管可产生截短或非功能性产物。在本发明的一些实施方式中，基因活性或功能而非表达被抑制。一般通过人工方法诱导基因抑制，例如，通过添加或引入化合物、分子、复合物、或组合物，和/或通过破坏基因的核酸或与基因相关的核酸，如在DNA水平上。基因抑制的示例性方法包括基因沉默、敲减、敲除、和/或基因破坏技术，如基因编辑。示例包括反义技术，如RNAi、siRNA、shRNA、和/或核酶，其一般导致表达的瞬时降低，以及基因编辑技术，其导致靶向的基因失活或破坏，例如，通过诱导断裂和/或同源重组。
[0299] 本文所用的基因“破坏”是指基因序列在DNA水平上的改变。示例包括插入、突变和缺失。破坏一般导致由基因编码的正常或“野生”产物的表达的抑制和/或完全缺失。这类基因破坏的示例是基因或基因部分的插入、移码和错义突变、缺失、敲入和敲除，包括整个基因的缺失。这种破坏可发生在编码区中，例如，在一个或多个外显子中，导致无法产生全长产物、功能性产物、或任何产物，如通过插入终止密码子。这种破坏也可由启动子或增强子或影响转录活性的其他区域的破坏导致，以防止基因转录。基因破坏包括基因靶向，包括通过同源重组的靶向的基因失活。
[0300] 如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。例如，“一种”或“一个”指“至少一种或一个”或“一种(个)或多种(个)”。
[0301] 本公开内容中，请求保护的主题的各个方面均以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述的或中间的值均被包括在要求保护的主题内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于请求保护的主题的范围，除非明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，请求保护的主题也包括排除所述限值之一个或两个的范围。这适用而无关范围的宽度。
[0302] 本文使用的术语“约”是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。本文中述及“约”值或参数，包括(并描述)指向该值或参数本身的实施方式。
[0303] 本文中所用的对象包括任何活的生物体，例如人类和其它哺乳动物。哺乳动物，包括但不限于，人类和非人动物，包括农场动物，体育动物，啮齿类和宠物。
[0304] 本文中所用的组合物指，两种或更多种产物、物质或化合物，包括细胞，的任何混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
[0305] 本文中所用的术语“治疗”、“治疗的”和“治疗性”指完全或部分减轻或减少疾病或病症或紊乱，或与其相关的症状、不利作用或结果，或表型。在某些实施方式中，所述作用是治疗性的，从而其部分或完全治愈疾病或病症或与其相关的不利症状。
[0306] 本文中所用的化合物或组合物或组合的“治疗有效量”指，某一个量，其在剂量上和必需时程上，有效于实现所需治疗结果，例如疾病、病症或紊乱的治疗，和/或该治疗的药物动力学或药代动力学效果。治疗有效量可根据多种因素变化，例如，疾病状态、年龄、性别，和对象体重，以及给予的细胞群。
[0307] 本文中所用的，称细胞或细胞群针对具体标志物呈“阳性”指，所述细胞上或细胞中具体标志物(通常是表面标志物)的可检测的存在。当述及表面标志物时，该术语指，通过流式细胞术检测到存在表面表达，例如，通过用特异性结合至所述标志物的抗体染色，并检测所述抗体，其中，所述染色可被流式细胞术以一定水平检测到，所述水平显著高于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平、和/或基本相似于已知对所述标志物呈阳性的细胞的水平、和/或显著高于已知对所述标志物呈阴性的细胞的水平。
[0308] 本文中所用的，称细胞或细胞群针对具体标志物呈“阴性”指，所述细胞上或细胞中具有具体标志物，通常是表面标志物，的基本可检测的不存在。当述及表面标志物时，该术语指，通过流式细胞术检测到存在表面表达，例如，通过用特异性结合至所述标志物的抗体染色，并检测所述抗体，其中，所述染色可被流式细胞术以一定水平检测到，所述水平显著高于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平、和/或显著低于已知对所述标志物呈阳性的细胞的水平、和/或基本相似于已知对所述标志物呈阴性的细胞的水平。
[0309] 在一些实施方式中，所述标志物中的一种的表达的减少指，平均荧光强度损失1 log10和/或细胞显示的标志物的百分数相比参照细胞群减小所述细胞的至少约20％，所述细胞的25％，所述细胞的30％，所述细胞的35％，所述细胞的40％，所述细胞的45％，所述细胞的50％，所述细胞的55％，所述细胞的60％，所述细胞的65％，所述细胞的70％，所述细胞的75％，所述细胞的80％，所述细胞的85％，所述细胞的90％，所述细胞的95％，所述细胞的和100％，和20和100％之间的任何％。在一些实施方式中，对于所述标志物之一呈阳性的细胞群指，显示所述标志物的细胞的百分比相比参照细胞群是所述细胞的至少约50％，所述细胞的55％，所述细胞的60％，所述细胞的65％，所述细胞的70％，所述细胞的75％，所述细胞的80％，所述细胞的85％，所述细胞的90％，所述细胞的95％，所述细胞的和所述细胞的100％，以及50和100％之间的任何％。
[0310] 除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它技术和科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的有显著差异。
[0311] 本发明中提及的所有出版物，包括专利文件、学术论文和数据库，均以各个体出版物好似独立地通过引用纳入的相同程度通过引用其全文纳入本文用于所有目的。如果本文所示的定义与通过引用纳入本文的专利、公开申请和其它出版物中所示的定义不同或其它情况下不一致，则相对于通过引用纳入本文的文件中的定义，以本文所示的定义为主。
[0312] 本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述客体。
[0313] IV.示例性实施方式
[0314] 本文中提供的实施方式是：
[0315] 1.一种工程改造的免疫细胞，包含：
[0316] 特异性结合至靶抗原的遗传工程改造的抗原受体；和
[0317] 编码靶抗原的基因的破坏，所述破坏导致所述工程改造的免疫细胞中靶抗原的表达降低。
[0318] 2.如实施方式1所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述靶抗原是在表面上或由静息T细胞、活化T细胞或两者同时表达的抗原。
[0319] 3.如实施方式1或实施方式2所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述靶抗原在癌症中在细胞表面上表达。
[0320] 4.如实施方式3所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述癌症是血液癌症、免疫癌症、白血病、淋巴瘤、和/或骨髓瘤。
[0321] 5.如实施方式4所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述靶抗原在多发性骨髓瘤中表达。
[0322] 6.如实施方式1-5中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述靶抗原是CD38。
[0323] 7.如实施方式1-5中任一项所述的工程改造的细胞，其中靶抗原是CD33或TIM-3或者其中靶抗原是CD26、CD30、CD53、CD92、CD100、CD148、CD150、CD200、CD261、CD262、或CD362。
[0324] 8.如实施方式1或实施方式2所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述靶抗原是在癌症中表达的胞内蛋白质抗原。
[0325] 9.如实施方式8所述的工程改造的细胞，其中，所述靶抗原是普遍肿瘤抗原。
[0326] 10.如实施方式9所述的工程改造的细胞，其中，所述普遍肿瘤抗原是人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。
[0327] 11.如实施方式9或实施方式10所述的工程改造的细胞，其中普遍肿瘤抗原是hTERT或生存素。
[0328] 12.如实施方式1-11中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是T细胞受体(TCR)或功能性非-TCR抗原识别受体。
[0329] 13.如实施方式1-12中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
[0330] 14.如实施方式13所述的细胞，其中：
[0331] 所述CAR包含胞外抗原识别结构域，其特异性结合至靶抗原和包含ITAM的胞内信号转导结构域。
[0332] 15.如实施方式1-7所述的细胞，其中所述遗传工程改造的抗原受体是包含特异性结合至靶抗原的胞外抗原识别结构域的嵌合抗原受体(CAR)。
[0333] 16.如实施方式1-2和8-11中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是T细胞受体(TCR)。
[0334] 17.如实施方式1-2和8-11中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是包含在主要组织相容性复合物(MHC)分子中特异性结合至靶抗原的肽的胞外抗原识别结构域的TCR-状嵌合抗原受体(CAR)。
[0335] 18.如实施方式1-17中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体能够诱导针对细胞的活化信号。
[0336] 19.如实施方式18所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体包含具有含ITAM基序的胞内结构域。
[0337] 20.如实施方式19所述的细胞，其中，所述胞内信号转导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链的胞内结构域。
[0338] 21.如实施方式18-20中任一项所述的细胞，其中所述遗传工程改造的受体是CAR或TCR-状CAR并且还包含共刺激信号转导区域。
[0339] 22.如实施方式21所述的细胞，其中所述共刺激信号转导区域包含CD28的信号转导结构域。
[0340] 23.如实施方式1-22中任一项所述的细胞，还包含另一种遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至另一种抗原的嵌合共刺激受体并且能够诱导针对所述细胞的共刺激信号。
[0341] 24.如实施方式23所述的细胞，其中，所述靶抗原和所述另一种抗原是不同的，并且单独选自CD38和CD138。
[0342] 25.如实施方式1或实施方式2所述的细胞，其中在识别靶抗原之后，遗传工程改造的抗原受体能够诱导针对细胞的抑制性或免疫阻遏或抑制信号。
[0343] 26.如实施方式25所述的细胞，其中，所述抗原是不在癌细胞或感染的细胞表面上表达的抗原，或者其在癌细胞或感染的细胞上的表达下调。
[0344] 27.如实施方式25或实施方式26所述的细胞，其中，所述抗原是MHC-I类分子。
[0345] 28.如实施方式25-27中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是T细胞受体(TCR)或功能性非-TCR抗原识别受体。
[0346] 29.如实施方式25-27中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
[0347] 30.如实施方式29所述的细胞，其中所述CAR包含胞外抗原识别结构域和胞内信号转导结构域，所述胞外抗原识别结构域特异性结合至靶抗原并且所述胞内信号转导结构域包含免疫检验点分子的信号转导部分。
[0348] 31.如实施方式30所述的细胞，其中所述免疫检验点分子是PD-1或CTLA4。
[0349] 32.如实施方式25-31中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包括其他遗传工程改造的抗原受体，其识别在待治疗疾病或病症上表达的抗原或者诱导刺激或活化信号，其被第一遗传工程改造的抗原受体减弱。
[0350] 33.如实施方式1-32中任一项所述的细胞，其中所述靶抗原是在工程改造的细胞的细胞类型中天然表达的基因产物。
[0351] 34.如实施方式1-33中任一项所述的细胞，其中与在没有所述基因破坏的免疫细胞中的表达相比，工程改造的细胞中靶抗原的表达降低至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
[0352] 35.如实施方式1-34中任一项所述的细胞，其中所述破坏包括删除所述基因的至少一个外显子的至少一部分。
[0353] 36.如实施方式1-35中任一项所述的细胞，其中：
[0354] 所述破坏包括基因中的缺失、突变和/或插入，导致在所述基因中存在提早终止密码子；和/或
[0355] 所述破坏包括基因的第一或第二外显子内的缺失、突变、和/或插入。
[0356] 37.如实施方式1-36中任一项所述的细胞，其中，所述免疫细胞是T细胞或NK细胞。
[0357] 38.如实施方式37所述的细胞，其中所述免疫细胞是CD4+或CD8+ T细胞。
[0358] 39.如实施方式1-38中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是诱导性多能干细胞(iPS细胞)。
[0360] 41.一种治疗方法，包括向具有疾病或病症的对象给予实施方式1-39中任一项所述的细胞或实施方式40所述的药物组合物。
[0361] 42.如实施方式41所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症是多发性骨髓瘤。
[0362] 43.如实施方式41或42所述的方法，其中，所述给药在所述对象中减轻疾病或病症的一种或多种症状。
[0363] 44.一种产生遗传工程改造的免疫细胞的方法，包括：
[0364] (a)向免疫细胞中导入特异性结合至靶抗原的遗传工程改造的抗原受体；并且
[0365] (b)在所述免疫细胞中实现对靶抗原表达的抑制，
[0366] 从而产生遗传工程改造的免疫细胞，其中所述靶抗原的表达被抑制，
[0367] 其中，步骤(a)和(b)同时或以任意顺序先后进行。
[0368] 45.如实施方式44所述的方法，其中(b)中的实现包括破坏编码靶抗原的基因。
[0369] 46.如实施方式45所述的方法，其中：
[0370] 所述破坏包括在DNA水平上破坏基因，和/或
[0371] 所述破坏是不可逆的；和/或
[0372] 所述破坏不是瞬时的。
[0373] 47.如实施方式45或46所述的方法，其中，所述破坏包括将特异性结合或杂交至所述基因的DNA-结合核酸或DNA结合蛋白导入所述免疫细胞中。
[0374] 48.如实施方式47所述的方法，其中，所述破坏包括导入：(a)包含DNA-靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或(b)RNA-引导的核酸酶。
[0375] 49.如实施方式48所述的方法，其中，所述DNA-靶向蛋白或RNA-引导的核酸酶包括锌指蛋白(ZFP)、TAL蛋白、或该基因特异性的成簇且规律间隔的短回文核酸(CRISPR)。
[0376] 50.如实施方式47-49中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括导入锌指核酸酶(ZFN)、TAL-效应子核酸酶(TALEN)、或和CRISPR-Cas9组合，其特异性结合至、识别或杂交至该基因。
[0377] 51.如实施方式47-50中任一项所述的方法，其中，通过将包含编码DNA-结合蛋白、DNA-结合核苷酸、和/或包含DNA-结合蛋白或DNA-结合核苷酸的复合物的核酸导入细胞来进行所述导入。
[0378] 52.如实施方式51所述的方法，其中，所述核酸是病毒载体。
[0379] 53.如实施方式47-52中任一项所述的方法，其中，对基因的特异性结合在基因的外显子内和/或在基因的部分内，其编码靶抗原的N-末端。
[0380] 54.如实施方式47-53中任一项所述的方法，其中，导入从而实现了基因中的移码突变和/或在基因的编码区内插入早终止密码子。
[0381] 55.如实施方式44-54中任一项所述的方法，其中，所述靶抗原是在免疫细胞中天然表达的基因产物和/或其表达由所述遗传工程改造的抗原受体的所述导入诱导。
[0382] 56.如实施方式44-55中任一项所述的方法，其中，与在没有抑制的情况下由所述方法产生的工程改造的细胞相比，所述抑制使工程改造的免疫细胞中靶抗原的表达降低至少50、60、70、80、90、或95％。
[0383] 57.如实施方式44-56中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
[0384] 58.如实施方式57所述的方法，其中所述免疫细胞是CD4+或CD8+ T细胞。
[0385] 59.如实施方式44-58中任一项所述的方法，其中，所述靶抗原是由静息T细胞、活化T细胞或两者均表达的抗原。
[0386] 60.如实施方式44-59中任一项所述的方法，其中，所述靶抗原在多发性骨髓瘤中表达。
[0387] 61.如实施方式44-60中任一项所述的方法，其中，所述靶抗原是CD38。
[0388] 62.如实施方式44-59中任一项所述的方法，其中，所述靶抗原是在癌症中表达的胞内蛋白质抗原。
[0389] 63.如实施方式62所述的方法，其特征在于，所述靶抗原是普遍肿瘤抗原。
[0390] 64.如实施方式63所述的方法，其中，所述普遍肿瘤抗原是人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。
[0391] 65.如实施方式63或实施方式64所述的方法，其中普遍肿瘤抗原是hTERT或生存素。
[0392] 66.如实施方式44-65中任一项所述的方法，其中，由所述方法产生的遗传工程改造的免疫细胞包括如实施方式1-39中任一项所述的细胞。
[0393] 67.如实施方式44-66中任一项所述的方法，所述方法还包括：
[0394] (c)向所述免疫细胞中导入另一种遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至另一种抗原并且能够诱导针对细胞的共刺激信号的嵌合共刺激受体，其中步骤(a)、(b)和(c)同时或以任意顺序先后进行。
[0395] 68.如实施方式67所述的方法，其中，所述遗传工程改造的细胞包括实施方式25-32中任一项所述的细胞。
[0396] 69.如实施方式44-68中任一项所述的方法，其中，通过导入包含编码遗传工程改造的抗原受体的序列的核酸来进行(a)中的导入。
[0397] 70.如实施方式69所述的方法，其中，所述核酸是病毒载体。
[0398] 71.如实施方式44-70中任一项所述的方法，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是T细胞受体(TCR)或功能性非-TCR抗原识别受体。
[0399] 72.如实施方式44-71中任一项所述的方法，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
[0400] 73.一种细胞，通过实施方式44-72中任一项所述的方法制备。
[0401] 74.一种工程改造的免疫细胞，包含：
[0402] (a)第一遗传工程改造的抗原受体，其特异性结合至第一抗原并且能够诱导针对所述细胞的活化信号；和
[0403] (b)第二遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至第二抗原的嵌合共刺激受体并且能够诱导针对所述细胞的共刺激信号。
[0404] 其中，所述第一和第二抗原是不同的，并且单独选自下组：CD38、CS-1、和CD138。
[0405] 75.一种工程改造的免疫细胞，包含：
[0406] (a)第一遗传工程改造的抗原受体，其特异性结合至第一抗原并且能够诱导针对所述细胞的活化信号；和
[0407] (b)第二遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至第二抗原的嵌合共刺激受体并且能够诱导针对所述细胞的共刺激信号，
[0408] 其中，所述第一和第二抗原是不同的，并且单独选自下组：CD38和CD138。
[0409] 76.一种工程改造的免疫细胞，包含：
[0410] (a)第一遗传工程改造的抗原受体，其特异性结合至第一抗原并且能够诱导针对所述细胞的活化信号；和
[0411] (b)第二遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至第二抗原的嵌合共刺激受体并且能够诱导针对所述细胞的共刺激信号，
[0412] 其中，所述第一和第二抗原不同并且所述第一或第二抗原是CS-1。
[0413] 77.如实施方式76所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第二抗原是在多发性骨髓瘤中表达的抗原。
[0414] 78.一种工程改造的免疫细胞，包含：
[0415] (a)第一遗传工程改造的抗原受体，其特异性结合至第一抗原并且能够诱导针对所述细胞的活化信号；和
[0416] (b)第二遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至第二抗原的嵌合共刺激受体并且能够诱导针对所述细胞的共刺激信号，
[0417] 其中所述第一和第二抗原不同并且所述第一或第二抗原中的至少一个是普遍肿瘤抗原。
[0418] 79.如实施方式78所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述普遍肿瘤抗原是人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。
[0419] 80.如实施方式78或实施方式79所述的工程改造的免疫细胞，其中普遍肿瘤抗原是hTERT或生存素。
[0420] 81.如实施方式78-80中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第一或第二抗原中的另一个是在肿瘤中表达的抗原。
[0421] 82.如实施方式74-81中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第一遗传工程改造的抗原受体包括含ITAM的序列。
[0422] 83.如实施方式82所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第一遗传工程改造的抗原受体包括CD3-ζ链的胞内信号转导结构域。
[0423] 84.如实施方式82或实施方式83所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第一遗传工程改造的抗原受体不包括来自T细胞共刺激分子的信号转导结构域。
[0424] 85.如实施方式74-84中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述共刺激受体包括T细胞共刺激分子的胞内信号转导结构域。
[0425] 86.如实施方式85所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述T细胞共刺激分子包括选自CD28和41BB的一种或多种分子。
[0426] 87.如实施方式74、77和82-86中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中：
[0427] (a)所述第一抗原是CD38并且所述第二抗原是CD138；
[0428] (b)所述第一抗原是CD38并且所述第二抗原是CS-1；
[0429] (c)所述第一抗原是CD138并且所述第二抗原是CD38；
[0430] (d)所述第一抗原是CD138并且所述第二抗原是CS-1；
[0431] (e)所述第一抗原是CS-1并且所述第二抗原是CD38；
[0432] (6)所述第一抗原是CS-1并且所述第二抗原是CD138。
[0433] 88.如实施方式74-87中任一项所述的工程改造的免疫细胞，还包含识别第三抗原的第三遗传工程改造的抗原受体。
[0434] 89.如实施方式74-88中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述第一遗传工程改造的抗原受体含有胞外抗原识别结构域，其以至少10-8M、至少10-7M、至少10-6M、至少10-5M、10-5M、或10-4M的解离常数(KD)特异性结合至第一靶抗原。
[0435] 90.如实施方式74-89中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，第一遗传工程改造的抗原受体的连接和第二遗传工程改造的抗原受体的连接诱导细胞中的应答，任一遗传工程改造的抗原受体的连接单独并不诱导该应答。
[0436] 91.如实施方式90所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述应答选自下组：增殖、细胞因子分泌、和细胞毒性活性。
[0437] 92.如实施方式74-91中任一项所述的工程改造的免疫细胞，还包含编码所述第一抗原的基因，和/或编码所述第二抗原的基因中的破坏，所述破坏导致所述工程改造的免疫细胞中所述第一和/或第二抗原的表达降低。
[0438] 93.如实施方式92所述的工程改造的免疫细胞，其中，破坏的基因编码CD38。
[0439] 94.如实施方式92所述的工程改造的免疫细胞，其中，破坏的基因编码普遍肿瘤抗原。
[0440] 95.如实施方式92-94中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中与在没有所述基因破坏的免疫细胞中的表达相比，所述工程改造的免疫细胞中第一和/或第二抗原的表达降低至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
[0441] 96.如实施方式92-95中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中：
[0442] 所述破坏包括至少删除所述基因的外显子部分；
[0443] 所述破坏包括基因中的缺失、突变和/或插入，导致在所述基因中存在早期终止密码子；和/或
[0444] 所述破坏包括基因的第一或第二外显子内的缺失、突变、和/或插入。
[0445] 97.如实施方式74-96中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是T细胞或NK细胞。
[0446] 98.如实施方式97所述的工程改造的免疫细胞，其中所述免疫细胞是CD4+或CD8+ T细胞，或是iPS细胞。
[0447] 99.如实施方式74-98中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，第一遗传工程改造的抗原受体是T细胞受体(TCR)或功能性非-TCR抗原识别受体。
[0448] 100.如实施方式99所述的工程改造的免疫细胞，其中，第一遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
[0449] 101.一种包含如实施方式74-100中任一项所述的工程改造的免疫细胞和药学上可接受运载体的药物组合物。
[0450] 102.一种治疗方法，包括向具有疾病或病症的对象给予实施方式74-100中任一项所述的工程改造的免疫细胞或实施方式101所述的药物组合物。
[0451] 103.如实施方式102所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症是多发性骨髓瘤。
[0452] 104.如实施方式102或103所述的方法，其中，所述给药在所述对象中减轻疾病或病症的一种或多种症状。
[0453] 105.如实施方式41-43和102-104中任一项所述的方法，其中，一种或多种所述遗传工程改造的抗原受体特异性结合至与所述疾病或病症相关联的抗原。
[0454] 106.如实施方式105所述的方法，其中，所述疾病或病症是癌症。
[0455] 107.一种药物组合物，包含实施方式1-39和54-100中任一项所述的细胞或实施方式40或101所述的药物组合物，用于治疗对象中的疾病或病症。
[0456] 108.包含如实施方式1-30和54-100中任一项所述的细胞的组合物或者实施方式40或实施方式101所述的组合物在制备用于治疗对象中疾病或病症的药物中的用途。
[0457] 109.如实施方式107所述的组合物或如实施方式108所述的用途，其中，一种或多种所述遗传工程改造的抗原受体特异性结合至与所述疾病或病症相关联的抗原。
[0458] 110.如实施方式107-109中任一项所述的组合物或用途，其中，所述疾病或病症是癌症。
[0459] 111.一种产生工程改造的免疫细胞的方法，所述方法包括：
[0460] (a)向免疫细胞中导入特异性结合至第一抗原的第一遗传工程改造的抗原受体；并且
[0461] (b)向所述免疫细胞中导入第二遗传工程改造的抗原受体，其是嵌合共刺激受体并特异性结合至第二抗原，
[0462] 从而产生所述工程改造的免疫细胞，
[0463] 其中，所述第一和第二抗原不同并且单独选自CD38、CS-1、和CD138，并且(a)和(b)同时或以任意顺序依次进行。
[0464] 112.一种产生工程改造的免疫细胞的方法，所述方法包括：
[0465] (a)向免疫细胞中导入特异性结合至第一抗原的第一遗传工程改造的抗原受体；并且
[0466] (b)向所述免疫细胞中导入第二遗传工程改造的抗原受体，其是特异性结合至第二抗原的嵌合共刺激受体，
[0467] 从而产生所述工程改造的免疫细胞，
[0468] 其中，所述第一和第二抗原不同并且单独选自CD38和CD138，并且(a)和(b)同时或以任意顺序依次进行。
[0469] 113.一种产生遗传工程改造的免疫细胞的方法，所述方法包括：
[0470] (a)向免疫细胞中导入特异性结合至第一抗原的第一遗传工程改造的抗原受体；并且
[0471] (b)向所述免疫细胞中导入第二遗传工程改造的抗原受体，其是嵌合共刺激受体并特异性结合至第二抗原，
[0472] 从而产生所述工程改造的免疫细胞，
[0473] 其中，所述第一和第二抗原不同并且所述第一或第二抗原是CS-1，并且(a)和(b)同时或以任意顺序依次进行。
[0474] 114.一种产生遗传工程改造的免疫细胞的方法，所述方法包括：
[0475] (a)向免疫细胞中导入特异性结合至第一抗原的第一遗传工程改造的抗原受体；并且
[0476] (b)向所述免疫细胞中导入第二遗传工程改造的抗原受体，其是嵌合共刺激受体并特异性结合至第二抗原，
[0477] 从而产生所述工程改造的免疫细胞，
[0478] 其中，所述第一和第二抗原不同并且至少所述第一或第二抗原是普遍肿瘤抗原并且(a)和(b)同时或以任意顺序依次进行。
[0479] 115.如实施方式114所述的方法，其中，所述普遍肿瘤抗原是人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆氏(Wilms’)肿瘤基因1(WT1)、活素、α胎甲球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺-特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。
[0480] 116.如实施方式114或实施方式115所述的方法，其中普遍肿瘤抗原是hTERT或生存素。
[0481] 117.如实施方式113-116中任一项所述的方法，其中，所述第一或第二抗原中的另一个是在肿瘤中表达的抗原。
[0482] 118.如实施方式113-117中任一项所述的方法，其中，通过向所述免疫细胞中导入一种或多种编码所述第一和/或第二遗传工程改造的抗原受体的核酸来进行(a)中的所述导入和/或(b)中的所述导入。
[0483] 119.如实施方式118所述的方法，其中，所述核酸包括病毒载体。
[0484] 120.如实施方式113-119中任一项所述的方法，还包括在所述免疫细胞中实现所述第一和/或第二抗原的表达的抑制。
[0485] 121.如实施方式113-120中任一项所述的方法，其中，所述工程改造的免疫细胞包括如实施方式74-100中任一项所述的细胞。
[0486] 122.如实施方式85所述的方法，其中(b)中的实现包括破坏编码所述第一或第二抗原的基因。
[0487] 123.如实施方式122所述的方法，其中：
[0488] 所述破坏包括在DNA水平上破坏基因和/或
[0489] 所述破坏是不可逆的；和/或
[0490] 所述破坏不是瞬时的。
[0491] 124.如实施方式122或123所述的方法，其中，所述破坏包括将特异性结合或杂交至所述基因的DNA-结合核酸或DNA结合蛋白导入所述免疫细胞中。
[0492] 125.如实施方式124所述的方法，其中，所述DNA结合蛋白或DNA-结合核酸包括：(a)包含DNA-靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或(b)RNA-引导的核酸酶。
[0493] 126.如实施方式125所述的方法，其中，所述DNA-结合蛋白或DNA-结合核酸包括锌指蛋白(ZFP)、TAL蛋白、或该基因特异性的成簇且规律间隔的短回文核酸(CRISPR)。
[0494] 127.如实施方式124-126所述的方法，其中，所述破坏包括导入锌指核酸酶(ZFN)、TAL-效应子核酸酶(TALEN)、或和CRISPR-Cas9组合，其特异性结合至、识别或杂交至该基因。
[0495] 128.如实施方式124-127中任一项所述的方法，其中，通过将包含编码DNA-结合蛋白、DNA-结合核苷酸、和/或包含DNA-结合蛋白或DNA-结合核苷酸的复合物的核酸导入细胞来进行所述导入。
[0496] 129.如实施方式128所述的方法，其中，所述核酸是病毒载体。
[0497] 130.如实施方式124-129中任一项所述的方法，其中，对基因的特异性结合在基因的外显子内和/或在基因的部分内，其编码靶抗原的N-末端。
[0498] 131.如实施方式124-130中任一项所述的方法，其中，导入从而实现了基因中的移码突变和/或在基因的编码区内插入早期终止密码子。
[0499] 132.如实施方式111-131中任一项所述的方法，其中，与在没有抑制的情况下由所述方法产生的工程改造的细胞相比，所述抑制使工程改造的免疫细胞中靶抗原的表达降低至少50、60、70、80、90、或95％。
[0500] 133.一种细胞，通过实施方式111-132中任一项所述的方法制备。
[0501] 134.如权利要求1-39中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，所述遗传破坏包括编码所述靶抗原的基因中的破坏。
[0502] 135.如权利要求1-39或权利要求134中任一项所述的工程改造的免疫细胞，其中，与表达所述抗原受体但没有基因破坏的细胞相比，所述细胞显示出少于40％、50％、60％、70％、80％、90％或更少的自相残杀。
[0503] 136.如权利要求135所述的工程改造的免疫细胞，其中，通过测量细胞活力、增殖或细胞毒性的试验来评价自相残杀。
[0504] V.实施例
[0505] 下面的实施例仅是为了阐述，而不是用来限制本发明的范围。
[0506] 实施例1：在内源性hTERT抑制存在或缺失下具有针对hTERT有特异性的嵌合抗原受体(CAR)的工程改造的T细胞的细胞毒性活性评价
[0507] 进行示例性研究以评价在在T细胞中或其上表达的特定抗原T细胞中的表达抑制和/或遗传破坏或敲除之后，表达针对这种抗原有特异性的工程改造的抗原受体的T细胞。
通过破坏普遍肿瘤蛋白质抗原，人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达来进行这种示例性研究。
在其他研究中，通过破坏其他感兴趣抗原靶标(在表达识别这种抗原的遗传工程改造的抗原受体的细胞中)，如其他普遍蛋白质抗原(例如，生存素)和/或其他感兴趣抗原(包括在T细胞和/或活化的T细胞中天然表达的那些(例如，CD38))来进行类似方法。
通过破坏普遍肿瘤蛋白质抗原，人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达来进行这种示例性研究。
在其他研究中，通过破坏其他感兴趣抗原靶标(在表达识别这种抗原的遗传工程改造的抗原受体的细胞中)，如其他普遍蛋白质抗原(例如，生存素)和/或其他感兴趣抗原(包括在T细胞和/或活化的T细胞中天然表达的那些(例如，CD38))来进行类似方法。
[0508] 通过基于免疫亲和性的选择从来自表达HLA-A*0201等位基因的对象，如，在一些情况中，患有癌症的对象的人血液成分分离产物样品中分离T细胞。在IL-2(100IU/mL)存在下，使用抗-CD3/抗-CD28试剂活化所得细胞，例如，在37℃下持续72小时。
[0509] 使用CRISPR/Cas9技术来敲减活化的T细胞中hTERT的基因表达。在一个示例性方法中，Cas9酶(例如，由来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或来自酿脓链球菌(Stretpococcus pyogenes)的mRNA编码的那些，例如，pCW-Cas9，Addgene#50661，Wang等，(2014)Science，3：343-80-4；或可以目录号K002、K003、K005或K006购自应用生物材料公司(Applied Biological Materials)(ABM；加拿大)的核酸酶或缺刻酶慢病毒载体)和hTERT引导RNA(gRNA，例如，购自ABM的示例性gRNA载体，目录号K0009811)被导入细胞，例如，使用慢病毒递送载体或多种用于转移至细胞的已知递送方法或载剂中的任一种，如多种用于递送Cas9分子和引导RNA的已知方法中的任一种。也生成非特异性或空载体对照T细胞。使用多种用于评价细胞中基因破坏的熟知试验中的任一种来评价hTERT的敲除程度(例如，转移后24-72小时)。
[0510] 在CRISPR/Cas9系统转导后24-96小时内，用空载体或编码hTERT抗原受体，如T细胞受体(TCR)或抗-hTERT嵌合TCR-样抗体或其抗原结合片段(例如，scFv)，其在HLA-A*0201中特异性结合至hTERT-衍生的肽表位，例如，如美国专利号7,718,777中所述，包括针对SEQ ID NO：7、8或10-14中所示的任意肽有特异性的抗体结合分子的病毒载体来转导细胞(hTERT敲减和对照细胞)。因此，总共成以下四组细胞：1)hTERT敲除(没有遗传工程改造的受体)；2)hTERT敲除/遗传工程改造的hTERT-抗原受体；3)hTERT野生型T细胞/遗传工程改造的hTERT-抗原受体；和hTERT野生型(没有遗传工程改造的受体)(对照)。
[0511] 在所述引入之后，细胞经进一步培养，一般在37摄氏度，例如，以允许细胞扩增。通过进行细胞增殖试验、铬释放试验、针对IFN-γ、粒酶B和/或穿孔蛋白的ELISPOT试验和/或针对细胞活力的试验，如通过使用CellTiter- (CTG)-试验或其他测量细胞的增殖、活力和/或细胞毒性的试验来评价各组培养中细胞的活化和/或抗原-诱导的细胞毒性。在不同组的生成的细胞间比较细胞的细胞毒性。作为细胞毒性或活化或其他功能的阳性对照，包含已知表达hTERT和/或呈递从中衍生的由细胞识别的肽的细胞以确认评价的工程改造
的细胞的hTERT-特异性功能。
的细胞的hTERT-特异性功能。
[0512] 在其他研究中，各种条件组中的细胞被给予动物对象并且随时间跟踪其持续性并比较，以评价敲除对这类细胞自杀和这类细胞随时间的持续性的影响，在表达靶抗原的靶向细胞，如肿瘤细胞中的功效。
[0513] 任选地，向对象给予自体hTERT敲除/上述工程改造的hTERT-抗原特异性T细胞(发现其在培养中避免自杀或显示降低自杀的潜力)以在例如1x107个细胞至5x1010个细胞的剂量上治疗癌症。
[0514] 本发明不局限于本文所述实施方式的范围，这些实施方式仅旨在说明本发明的单独方面，任何功能等同形式也在本发明范围内。本文所述以外的对发明的组合物和方法的各种改良通过以上描述和教导对本领域技术人员显而易见，所述改良同样旨在落入本发明的范围内。可以实施此类改良或其它实施方式而不偏离本发明的真实范围和精神。
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