一种洛伐他汀酰基转移酶突变体
阅读：441发布：2020-05-18
专利汇可以提供一种洛伐他汀酰基转移酶突变体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 洛伐他汀 酰基转移酶突变体，编码该突变体的基因序列，以及用该突变体制备辛伐他汀的方法。与来源于土曲霉的野生型酰基转移酶相比，本酰基转移酶突变体的活性高。本发明可用于规模化生产他汀类化合物辛伐他汀，转化率高，原料利用率高。，下面是一种洛伐他汀酰基转移酶突变体专利的具体信息内容。
1.一种洛伐他汀酰基转移酶突变体，其特征在于：所述突变体包括以下处理：在氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型酰基转移酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者/以及在氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型酰基转移酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除 1 个或多个氨基酸。
2.根据权利要求1所述一种洛伐他汀酰基转移酶突变体，其特征在于：所述突变体在氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型酰基转移酶的氨基酸序列的基础上，包括以下M1，V2，V11A，E28K，C111S，P125A，V159M，W174S，V194L，M243Q，K252R，T258S，H263A，M338L，M363L，I373V，S393N，K307H中的任意1至18个氨基酸突变。
3.根据权利要求1或2所述一种洛伐他汀酰基转移酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
4.一种编码权利要求1或2或3所述洛伐他汀酰基转移酶突变体的编码基因。
5.根据权利要求3所述编码洛伐他汀酰基转移酶突变体的编码基因，其特征在于：其DNA序列为SEQ ID NO.5。
6.一种包含编码权利要求1或2或3所述洛伐他汀酰基转移酶突变体的编码基因的重组质粒。
7.一种产生权利要求1或2或3所述洛伐他汀酰基转移酶突变体的重组菌，其特征在于：
该菌种包含权利要求6所述的重组质粒，其宿主细胞为大肠杆菌。
8.根据权利要求7所述重组菌，其特征在于：所述大肠杆菌选用大肠杆菌E.coli DH5α。
9.权利要求1所述洛伐他汀酰基转移酶突变体用于催化莫纳可林J和α-二甲基丁酰基-S-丙酸甲酯反应合成辛伐他汀的用途。
一种洛伐他汀酰基转移酶突变体
技术领域
[0001] 本发明涉及药物合成领域，具体涉及辛伐他汀的合成及合成用酶，更具体的，涉及较野生型酰基转移酶具有活性增强、产物耐受性提高的，非天然存在的酰基转移酶突变体、编码所述酰基转移酶突变体的多核苷酸、包含此类多核苷酸的宿主细胞、所述酰基转移酶的生产方法及使用本发明所述酰基转移酶突变体生物催化合成辛伐他汀的方法。
背景技术
[0002] 辛伐他汀(simvastatin)是Merck公司研制的降血脂药，商品名Zocor，是洛伐他汀的半合成衍生物，而洛伐他汀则由土曲霉(Aspergillus terreus)发酵液中分离得到。辛伐他汀的药理作用是作为竞争性抑制剂抑制肝脏细胞内羟甲戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase)活性，限制HMG-CoA向甲基二羟戊酸的转化，从而减少内源总胆固醇生物合成的总量。与等剂量的洛伐他汀(lovastatin)相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。
[0003] 目前生产辛伐他汀使用的主流工艺路线由Sleiteinger提出，后经Verhoeven、Kumar等修改提高。该路线以洛伐他汀为起始物，经历有机胺开环、双羟基保护、甲基化、脱保护、成铵盐、环合等工艺步骤，得到辛伐他汀：但是，这一路线存在试剂毒性大，反应条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大等问题，导致目前辛伐他汀的生产成本高、污染大。因此，急需一种毒性低、效率高、污染少的生产方法。近年来，随着绿色化学概念的提出和对环境保护的日益重视，生物催化高效低毒低污染的特点引起了人们的兴趣，并将注意力转向该领域。
[0004] WO1994026920公布了一种利用脂酶和脂肪酶作为催化剂合成辛伐他汀的方法，由于需要进行区域选择性酯化，仍必须对其它羟基进行保护，导致产品收率降低。WO2005040107所公布的方法也存在同样的问题，效率仍未有明显提高。
[0005] US2009191602(A1)报道了土曲霉的洛伐他汀生物合成基因簇，该基因簇编码一个46 KDa的蛋白质（SEQ ID No.1），即洛伐他汀酰基转移酶（LovD），可将酰基硫酯的酰基基团区域选择性酰基化莫纳可林J酸C8羟基，为生物合成辛伐他汀的有效酶制剂：
虽然目前已经分离纯化并克隆表达出天然存在的LovD，但是野生型的LovD还存在很多问题，如酶活性较低，产物抑制等，导致难以实现工业化应用。US2010052038、US2010050253、CN201310315499.0、CN201310345811.0等对此进行研究，得到了活性提高的酰基转移酶突变体。然而不可忽视的是，上述突变体在高浓度条件下仍然存在产物/副产物抑制现象，尽管采取一些措施，如使用沉淀剂使酶催化产物析出沉淀，添加活性炭等吸附剂吸附反应副产物硫醇，缓解产物/副产物对酶的抑制，促使反应向产物方向移动，但是上述方法仍不能彻底解决产物/副产物抑制问题，导致反应转化率通常在95%左右，降低了原料利用率的同时，给下游分离纯化带来不便。因此，利用分子生物学手段对酰基转移酶进行改造，在提高酶活性的同时，增强酶对产物/副产物的耐受性，解除产物抑制，是促进酰基转移酶生产辛伐他汀产业化的有效途径。
虽然目前已经分离纯化并克隆表达出天然存在的LovD，但是野生型的LovD还存在很多问题，如酶活性较低，产物抑制等，导致难以实现工业化应用。US2010052038、US2010050253、CN201310315499.0、CN201310345811.0等对此进行研究，得到了活性提高的酰基转移酶突变体。然而不可忽视的是，上述突变体在高浓度条件下仍然存在产物/副产物抑制现象，尽管采取一些措施，如使用沉淀剂使酶催化产物析出沉淀，添加活性炭等吸附剂吸附反应副产物硫醇，缓解产物/副产物对酶的抑制，促使反应向产物方向移动，但是上述方法仍不能彻底解决产物/副产物抑制问题，导致反应转化率通常在95%左右，降低了原料利用率的同时，给下游分离纯化带来不便。因此，利用分子生物学手段对酰基转移酶进行改造，在提高酶活性的同时，增强酶对产物/副产物的耐受性，解除产物抑制，是促进酰基转移酶生产辛伐他汀产业化的有效途径。
发明内容
[0006] 本发明克服现有技术的不足，提供一种新的洛伐他汀酰基转移酶（LovD）突变体，编码该突变体的基因，以及该突变体在制备辛伐他汀中的用途。
[0007] 本发明采用的技术方案是，一种洛伐他汀酰基转移酶突变体包括以下处理：在氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型酰基转移酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者/以及在氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型酰基转移酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除 1 个或多个氨基酸。与使用野生型酰基转移酶相比，其酰基转移酶活性增强2-100倍。
[0008] 在本发明的一具体实施例中，所述突变体在氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型酰基转移酶的氨基酸序列的基础上，包括以下M1，V2，V11A，E28K，C111S，P125A，V159M，W174S，V194L，M243Q，K252R，T258S，H263A，M338L，M363L，I373V，S393N，K307H中的任意1至18个氨基酸突变；以上各突变用三联体表示 ：字母 - 数字 - 字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸。所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
[0009] 本发明还提供一种编码以上洛伐他汀酰基转移酶突变体的编码基因的其DNA序列为SEQ ID NO.5。其已经过密码子优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。
[0010] 本发明的又一具体实施例中提供一种包含编码洛伐他汀酰基转移酶突变体的编码基因的重组质粒。利用该重组质粒和大肠杆菌作为宿主细胞，构建一种重组菌。其中大肠杆菌选用大肠杆菌E.coli DH5α。
[0011] 本发明的实施例中还提供一种洛伐他汀酰基转移酶突变体用于催化莫纳可林J和α-二甲基丁酰基-S-丙酸甲酯反应合成辛伐他汀的用途。
[0012] 源于土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型酰基转移酶的酰基转移酶突变体，能够使天然产物洛伐他汀的水解产物莫纳可林 J(Monacolin J) 转化为辛伐他汀。所述酰基转移酶突变体，与SEQ ID NO.1的野生型酰基转移酶相比表现出更强的催化活性。酰基转移酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA 改组、易错 PCR 和定向进化方法等获得。
[0013] 本发明的LovD突变体在活性提高的同时，对产物/副产物的耐受性较野生型有明显的改善，提高了原料利用率，降低了成本，减少了能耗和环境污染。
具体实施方式
[0014] 实施例1 野生型及酰基转移酶突变体表达载体的构建将来自土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型酰基转移酶 (氨基酸序列为SEQ ID NO.1)，将野生型酰基转移酶的核酸序列进行优化（即获得SEQ ID NO.2）(见Puigbò P, Guzmán E, Romeu A, Garcia-Vallvé S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 2007）。通过基于PCR的全基因合成方式(PCR-based gene synthesis method)进行基因合成。将合成的载体片段利用以下引物F1和R1进行PCR扩增，扩增产物利用Not1和Xho1进行双酶切，酶切产物连接到表达载体上（即获得SEQ ID NO.3），通过标准方法转化到大肠杆菌E.coli DH5α中并验证表达载体是否转化成功。
[0015] F1：5' CCGCTCGAGATGGGTTCTATCATCGACGCGGC 3'；R1：5' ATTTCGCCGGCGTTAACCCTGCTGGTACTGCGC 3'。
[0016] 对野生型酰基转移酶进行优化（获得SEQ ID NO.4），将优化后的酰基转移酶（即突变体）根据大肠杆菌密码子偏好性进行序列优化(获得SEQ ID NO.5)。通过基于PCR的全基因合成方式进行基因合成。将合成的载体片段利用以下引物F2和R2进行PCR扩增，扩增产物利用Not1和Xho1进行双酶切，酶切产物连接到表达载体上（获得SEQ ID NO.6），通过标准方法转化到大肠杆菌E.coli DH5α中并验证表达载体是否转化成功。
[0017] F2：5' CCGCTCGAGATGGTTATGGGCTCTATCATCGA 3'；R2：5' ATTTCGCCGGCGTTAACCCTGCTGATACTGGGC3'。
[0018] 实施例2 酰基转移酶突变体的制备挑取实施例1中制备的含有目的表达载体质粒转化大肠杆菌BL 21中，挑取单菌落，接种于10ml 高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵 2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至50mg/L。30℃，
250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：20的接种比例接入到200ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加氨苄青霉素至50mg/L。于37℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h。加入IPTG至终浓度0.2mM，并于37℃，250rpm继续培养3-
5h。
250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：20的接种比例接入到200ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加氨苄青霉素至50mg/L。于37℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h。加入IPTG至终浓度0.2mM，并于37℃，250rpm继续培养3-
5h。
[0019] 培养结束后，将培养液于4℃，6000g下离心20min最终得到湿菌体5.2g，收集菌体。再次用蒸馏水重悬，在超声破碎仪下破碎至澄清。破碎后于4℃，12000g下离心30min，收集上清，预冷至-80℃后用冷冻干燥机制备冻干粉。最终得到粗酶冻干粉0.5g。
[0020] 实施例3 辛伐他汀铵盐的催化合成5 mL离心管中依次加入1.5 mL 莫纳可林J溶液（120 mg/mL， pH 10.0），0.115 mL α-二甲基丁酰基-S-丙酸甲酯（DMB-S-MMP）（122 mg， 1.05 eq），0.385 mL酰基转移酶突变体粗粉末（由实施例2获得）溶液（7 mg/mL），随后置于25℃水浴锅中，电磁搅拌，转速1200 r/m，开始反应计时。HPLC监控反应进程，32 h后转化率＞99%。
[0021] 实施例4 利用酰基转移酶突变体制备辛伐他汀铵盐并提取产品向500 mL三口烧瓶中加入0.1 M，pH 10.0的氯化铵缓冲液187 mL，20 g莫纳可林J（Monacolin J），搅拌均匀后以25%氨水调pH 10.0。再加入13.55 g（1.05 eq） DMB-S-MMP和
0.3 g实施例2获得的酰基转移酶突变体粗粉末，25%氨水调节pH 10.0后，将三口瓶至于水浴锅中，25℃下250r/m机械搅拌开始反应计时。定时取样HPLC监控反应进程。32 h后转化率
99.5%。将反应液4000 r/m离心30 min，收集沉淀，冷水和乙酸乙酯各洗涤一次后真空干燥，得辛伐他汀铵盐24.58 g，纯度99.1%。
0.3 g实施例2获得的酰基转移酶突变体粗粉末，25%氨水调节pH 10.0后，将三口瓶至于水浴锅中，25℃下250r/m机械搅拌开始反应计时。定时取样HPLC监控反应进程。32 h后转化率
99.5%。将反应液4000 r/m离心30 min，收集沉淀，冷水和乙酸乙酯各洗涤一次后真空干燥，得辛伐他汀铵盐24.58 g，纯度99.1%。
[0022] 以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围。
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