A.关于溶解性差的药物的纳米颗粒的背景
在水溶液中溶解性差或不溶药物的配制其数量正在不断增长。这 种药物对于配制肠胃外给药的注射剂型是一种挑战。然而，在水中不 溶的药物当在水性介质中配制成亚微米颗粒的悬浮体时，能够提供明 显的稳定性优点。为安全和有效地使用这些制剂，必须精确控制粒径。 颗粒直径通常必须小于7微米，以安全地通过毛细管，而不会造成栓 塞(Allen等人，1987；Davis和Taube，1978；Schroeder等人，1978； Yokel等人，1981)。
输送不溶药物的一种技术记载在美国专利2,745,785中。该专利公 开了一种制备适于肠胃外给药的片状或板状青霉素G晶体(N，N′-二苄 基乙二胺盐)的方法。该方法包括以下步骤：通过加入水降低青霉素G 的溶解度，从甲酰胺溶液重结晶青霉素G。′785专利还提供可以用润湿 剂如卵磷脂、乳化剂、表面活性剂、消泡剂、山梨糖醇的高脂肪酸偏 酯、其聚氧化烯衍生物和芳烷基聚醚醇或其盐涂布的青霉素G盐颗粒。 ′785专利还公开了在压力下用气流冲击使青霉素G微米化，形成约5～20 微米的晶体。
美国专利5,118,528中公开的另一种技术记载了一种制备纳米颗 粒的方法。该方法包括以下步骤：(1)在可以加有一种或多种表面活性 剂的溶剂或溶剂混合物中制备物质的液相，(2)制备非溶剂或非溶剂混 合物的第二液相，非溶剂可与所述物质用的溶剂或溶剂混合物混溶，(3) 搅拌下将溶液(1)和(2)加到一起；以及(4)除去不想要的溶剂，得到纳 米颗粒的胶状悬浮体。′528专利公开了无能量供应而制得的小于500 nm的颗粒。特别地，′528专利阐明了不需要使用高能量设备如超声波 破碎仪和均质器。
美国专利4,826,689公开了一种从水不溶性药物或其他有机化合 物制备均匀尺寸颗粒的方法。首先，在有机溶剂中溶解适合的固体有 机化合物，并可以用非溶剂稀释溶液。然后，注入水性析出液体，析 出具有基本上均匀平均直径的非聚集的颗粒。然后使颗粒与有机溶剂 分离。取决于有机化合物和所需的粒径，可以根据该发明改变温度、 非溶剂与有机溶剂之比、注入速率、搅拌速率和体积等参数。这种方 法形成了亚稳态的药物，其是热动力学不稳定的，并最终转化成更稳 定的结晶态。药物被保留在亚稳态，其中自由能处于原始药物溶液和 稳定的晶型之间。′689专利公开了利用结晶化抑制剂(例如，聚乙烯吡 咯烷酮)和表面活性剂(例如，聚(氧乙烯)-共-氧丙烯))使沉淀足够稳定以 通过离心、膜过滤或反渗透被分离出来。
美国专利5,091,188；5,091,187和4,725,442公开了(a)用天然或合 成的磷脂涂布药物小颗粒或(b)在适合的亲脂性载体中溶解药物并形 成用天然或半合成的磷脂稳定的乳状液。这些技术的一个缺点在于， 它们依赖于药物原料的质量，并且没有公开改变原料形态使材料呈易 碎、更易加工形式的步骤。
提供用于肠胃外输送的不溶药物制剂的另一种技术记载在美国专 利5,145,684中。′684专利公开了在表面改性剂存在下湿磨不溶药物， 以提供平均有效粒径小于400nm的药物颗粒。表面改性剂吸附在药物 颗粒的表面上，其量足以防止凝聚成更大颗粒。
提供用于肠胃外输送的不溶药物制剂的另一种尝试记载在美国专 利5,922,355中。′355专利公开了通过使用表面改性剂和磷脂的混合物， 然后使用诸如声波处理、均质化、研磨、微流化、析出或重结晶等技 术使粒径减小，来提供不溶药物的亚微米尺寸颗粒。在′355专利中没有 公开改变加工条件以制得更易碎形式的晶体。
美国专利5,780,062公开了一种制备不溶药物小颗粒的方法，包括 (1)在水可混溶的第一溶剂中溶解药物，(2)在其中药物是基本上不溶 的水性第二溶剂中制备聚合物和两性物质的第二溶液，从而形成聚合 物/两性物质复合物，和(3)混合第一和第二步骤的溶液，析出药物和 聚合物/两性物质复合物的凝聚体。
美国专利5,858,410公开了一种适于肠胃外给药的药用纳米悬浮 体。′410专利记载了一种使溶剂中分散的至少一种固态治疗活性化合物 在活塞-间隙式均质器中进行高压均质化的方法。根据光子相关光谱 (PCS)测定，所形成颗粒的平均直径为10nm～1000nm，在总量中大于 5微米的颗粒比例小于0.1％(通过Coulter计数器测定数量分布)，没有 预先转化成熔融体。′410专利的实施例中公开了在均质化之前喷射研 磨。溶剂的使用受到阻碍，因为这种使用使得形成过大的晶体。
美国专利4,997,454公开了一种从固体化合物制造均匀尺寸的颗 粒的方法。该方法包括以下步骤：在适合的溶剂中溶解固体化合物， 然后注入析出液体，从而析出非凝聚的基本上均匀平均直径的颗粒。 然后使颗粒与溶剂分离。′454专利不主张形成结晶态颗粒，因为在析出 过程中，晶体可能溶解并重结晶，从而扩宽了粒径分布范围。′454专利 鼓励在析出过程中捕集亚稳定颗粒态的颗粒。
美国专利5,605,785公开了一种形成照相用化合物的纳米无定形 分散体的方法。这种形成纳米无定形分散体的方法包括用于生产具有 无定形颗粒的分散相的任何已知乳化方法。
U.S.2002/0127278A1公开了一种制备亚微米尺寸的有机化合物颗 粒的方法。
美国专利6,607,784公开了一种制备亚微米尺寸的有机化合物颗 粒的方法，其在水可混溶的第一溶剂中的溶解度比在水性第二溶剂中 大，该方法包括以下步骤：(i)在水可混溶的第一溶剂中溶解有机化合 物，形成溶液，(ii)使溶液与第二溶剂混合，得到预悬浮体；以及(iii)向 预悬浮体施加能量，形成平均有效粒径400nm～2微米的颗粒。
B.关于吲哚衍生物的背景和其作为抗癌剂的用途
美国公开2002/0091124A1公开了吲哚和杂吲哚衍生物及其作为抗 癌剂的用途。
美国专利6,008,231；6,232,327和6,693,119公开了N-取代的吲哚 -3-乙醛酰胺，制备方法及其用于治疗癌症，哮喘，敏感症的用途和用 作免疫抑制剂的用途。这种化合物特别适于治疗耐抗癌剂的肿瘤，转 移性癌(包括转移性癌发展和扩散)，对血管生成抑制剂敏感的肿瘤，或 者耐抗癌剂并对血管生成抑制剂敏感的肿瘤。
美国公开2003/0195244A1公开了吲哚化合物和其用于治疗癌症 和血管生成相关病症的用途。在2003/0195244A1中没有公开这种衍生 物纳米颗粒制剂的制备或用途。
美国公开2004/0033267A1公开了包括血管生成抑制剂的纳米颗 粒组合物。
C.关于微管蛋白抑制剂的背景
在有丝分裂中，细胞的DNA被复制，然后分裂成两个新细胞。这 种将新复制的染色体分成两个形成细胞的过程涉及到用微管构造的纺 缍纤维，而微管本身通过被称作微管蛋白的较小蛋白亚单位的长链形 成。纺缍微管与复制的染色体连接，并将一个复制的染色体拉到分裂 细胞的一侧。没有这些微管，细胞分裂是不可能的。参见，Cancerquest (2003)：″Cancer Treatments-Chem其他apy″ www.cancerquest.org/index.cfm7page＝520或相似的网址。
因此，微管是抗癌化疗的最重要的亚细胞靶，因为它们存在于所 有细胞中，并且对于有丝分裂、分裂期间和细胞维护功能(例如细胞内 运输，发展和细胞形状、细胞运动性的维护，以及分子在细胞膜上的 可能分布)是必须的。与微管蛋白相互作用的化合物可能通过使微管蛋 白析出和隔离而干预细胞循环，从而中断多种依赖于微管类亚细胞的 细胞器官的重要生物功能。因此，这种化合物可能潜在地抑制源于各 种器官的肿瘤细胞系的增殖。参见，例如，Bacher等人，(2001)Pure Appl. Chem.73：9459-1464和Rowinsky & Donehower(1991)Pharmαc.Ther. 52：35-84。
一类显著特征并临床使用的抗有丝分裂药物是天然来源的，即， 紫杉烷类(紫杉醇，紫杉萜)，长春花生物碱(长春新碱，长春碱，长春 花)和鬼臼毒素/秋水仙碱。这些药剂或者抑制微管蛋白(长春花生物碱/ 秋水仙素)的聚合或防止微管(紫杉烷)分解。紫杉烷和长春花生物碱的 主要缺点在于，由于药物干预介导神经元囊泡输送的轴突中的微管功 能而发展的神经元毒性。
埃博霉素A和B及其类似物表现出高细胞毒性和良好的微管稳定 性。这些天然产物最初从粘细菌中分离出来。与紫杉烷相比，它们抑 制耐泰素肿瘤细胞系的独特能力和良好溶解度是最大优点。然而，复 杂的化学结构和天然来源的受限制使用以及耐药性的形成，常限制了 这些天然产物的潜力。
其他天然产物或衍生类似物的特征是溶解度或能力增强，但化学 结构仍然复杂。
D.关于Indibulin的背景
新的合成小分子化学实体与微管蛋白结合，但不是跨膜泵的基底， 也不干预轴突微管的功能，将大大增强治疗恶性肿瘤的治疗指数。
一系列合成的与微管蛋白结合的分子目前正在临床前或临床早期 阶段中评价。其中合成化合物，N-(吡啶-4-基)-[1-(4-氯苄基)-吲哚-3-基] 乙醛酸酰胺，称为D-24851，也称作″Indibulin″。
D-24851是一种合成的小分子吲哚微管蛋白抑制剂，具有显著的 体外和体内抗癌活性。其使肿瘤细胞以及无细胞体系中的微管不稳定。 D-24851的结合部位看起来没有与显著特征的微管不稳定剂长春新碱 或秋水仙碱的微管蛋白-结合部位重叠。此外，这种分子选择性阻断分 裂中期的细胞循环进展。
在体外，D-24851对于各种恶性肿瘤(例如，前列腺，脑，胸，胰 腺，和结肠)发挥明显的抗癌活性。在动物中，D-24851显示出高体内 抗肿瘤效力。基于其作用机理，预期其以所有类型的实体瘤为靶。也 预期表现出抗哮喘、抗过敏、免疫抑制和免疫调节作用。在动物实验 中至今没有发现神经症状。在啮齿动物的临床前实验中，化合物对高 效剂量具有极好耐受性。进一步发展的另一个优点在于，与其他微管 蛋白-抑制性化合物相比，其易于合成。
吲哚化学类的其他微管蛋白抑制化合物也已经被识别作为对 Indibulin具有相似作用模式的潜在候选药物，包括但不限于D-64131， 2-芳基吲哚衍生物，记载在″New Small-Molecule Tubulin Inhibitors″， Pure Appl.Chem.，Vol.73，No.9，2001中。

本发明涉及吲哚类微管蛋白抑制剂的颗粒组合物。优选的组合物 包括用至少一种表面活性剂涂布的吲哚类微管蛋白抑制剂的纳米颗粒 的水性悬浮体，所述表面活性剂选自离子表面活性剂、非离子表面活 性剂、两性离子表面活性剂、生物衍生的表面活性剂、氨基酸及其衍 生物及其组合。
所述组合物可以给药至动物，特别是人类。所述组合物和其相关 的给予方法提供了多种优点，包括将所述组合物通过肠胃外或口服给 予而输送的能力，降低毒性和增大生物利用度。此外，由于本发明的 颗粒(例如，纳米颗粒)构成了高比例的抗微管蛋白剂，因此本发明的纳 米悬浮体含有明显低浓度的赋形剂，如表面活性剂或其他增溶剂，而 其他情况则需要大量赋形剂来使给予的药剂增溶。赋形剂水平降低使 得活性剂剂量明显更高(因为赋形剂低浓度，所以赋形剂引起的并发症 下降)。此外，本发明优选的悬浮体含有少量溶剂到没有溶剂，从而使 活性剂剂量更大，同时降低了对受试者的溶剂毒性。
在提供本发明的制剂时，可以避免现有技术中的多种缺点。这些 缺点包括毒性，对多药耐药(MDR)肿瘤的无效性，低吸收速率，差的生 物利用度和复杂的化学结构(使合成变难)。
本发明还涉及制造微管蛋白抑制剂的颗粒组合物的方法，包括制 备至少一种微管蛋白抑制剂化合物和任选的至少一种表面活性剂的颗 粒，以及在适合的给药载体中配制得到的颗粒。优选的方法涉及制备 用于肠胃外给予的微管蛋白抑制剂的水性类纳米悬浮体。
本发明还涉及治疗哺乳动物-优选人受试者的方法，通过给予治 疗有效量的抗微管蛋白悬浮体。优选地，给予的组合物将提供抗癌、 抗哮喘、抗过敏、免疫抑制或免疫调节活性。最优选的方法涉及给予 用于治疗癌症的Indibulin纳米悬浮体。
通过阅读本发明的下面详细说明将更清楚本发明的其他优点和各 方面。
附图说明
图1是静脉注射组合物4和5之后比较D-24851血浆水平的图；
图2是表明静脉给予至狗-第1天(组合物4)后，D-24851的平均血 浆浓度图；
图3是表明静脉给予至狗-第27天(组合物4)后，D-24851的平均 血浆浓度图；
图4示出方法″A″，一种制造颗粒悬浮体的优选方法；以及
图5示意性示出方法″B″，一种制造颗粒悬浮体的优选方法。
图6是比较在Rat AH 13肿瘤模型中的D-24851纳米悬浮体(组合 物4)剂量相关性与对照溶液的图。
图7是表明在大鼠中静脉给予不同剂量的D-24851纳米悬浮体(组 合物4)之后血浆浓度图，
图8是表明在大鼠中静脉给予D-24851纳米悬浮体(组合物4)之后 在第1天和第15天的血浆浓度图。

尽管本发明具有多种不同形式的实施方案，但下面将集中于本发 明优选的实施方案，应该理解，这些实施方案应被认为是解释本发明 的原理，而不意图限制本发明的广义方面。
在本申请中，使用下述几个定义描述本发明。
″约″应被本领域普通技术人员理解并在使用它的上下文中有某种 程度的变化。如果在使用它的上下文中，该术语的使用对本领域普通 技术人员不清楚，那么″约″将用于指达到特定范围的加上或减去10％。
针对药物组合物的药代动力学性能，″生物利用度″在本领域中常 用于描述制剂的体内性能。在本领域中常用于描述制剂的体内性能的 参数(或生物利用度)是Cmax，活性剂在血液中的最大浓度；Tmax，药物 剂量到达Cmax后的所用时间；以及AUC(曲线下面积)，患者吸收的药 物总量的量度。因此，针对本发明的纳米悬浮体，对于本发明的给定 的吲哚微管蛋白抑制剂，″改进的生物利用度″指这种纳米悬浮体比纳米 颗粒组合物之外的制剂具有改进的性能(例如，改进的Cmax，Tmax，AUC 或其他性能标准)。相对于含有相同药物的其他制剂的多种剂量方案， 这种改进的生物利用度也适用于本发明的纳米悬浮体的多种剂量方 案。取决于给予的药物剂量、被给予的患者和患者待治疗的疾病严重 程度，可以增大或减小Cmax，Tmax，AUC或其他性能标准值，以获得 改进的生物利用度。例如，如果对于给定药物的Cmax需要减小以改进 药物的有效性(即，功效和安全性)，那么当给予本发明的纳米悬浮体时， 与含有相同药物的其他给予制剂相比，Cmax减小将具有改进的生物利 用度。同样，如果Tmax需要增大以改进药物的有效性，那么此参数增 大的本发明的纳米悬浮体将具有改进的生物利用度。
针对颗粒(例如，纳米或微米颗粒)组合物的表面活性剂或其他赋形 剂，″涂布的″指在这种化合物存在于粒子表面或其附近。用这种化合物 ″涂布的″粒子可以用这种化合物部分或完全地包覆，并且这种化合物可 以部分地夹带在粒子内，或者不夹带在粒子内。
″易碎的″指易碎并且更容易破裂成更小粒子的粒子。
″微米悬浮体″指微米粒子的悬浮体，除非另有规定，″微米粒子″ 指平均粒径约200nm～约5微米的活性剂粒子。
″纳米悬浮体″指纳米粒子的悬浮体，除非另有规定，″纳米粒子 (nanoparticle)″和″纳米颗粒(nanoparticulate)″指平均粒径约15nm～约2 微米的活性剂粒子。″粒子悬浮体″指各种尺寸分布的粒子悬浮体。
本发明中，″粒径″或″尺寸″(针对粒子)基于体积重均粒径测定，根 据本领域技术人员公知的常规粒径测量技术进行测量。这种技术包括 例如沉降场流分离，光子相关光谱，光散射，碟式离心，光显微镜法 或电子显微镜法。
″预悬浮体″指可以是无定形、半结晶或结晶的固体分散体，其尺 寸没有充分降低到所需范围和/或需要能量输入来稳定固体分散体。
″水溶性差″指化合物的水溶解度小于约10mg/ml。
针对稳定的药物粒子，″稳定的″指微管蛋白抑制剂颗粒没有显著 絮凝或凝集或以其他方式增大粒径。
″缓释″指给予本发明的纳米悬浮体，其中在给予后血流中的活性 药物成分的有效浓度在相对长的时间内得以保持，或比给予含有相同 活性药物成分的其他制剂后的有效浓度保持更长时间。
″治疗有效量″指通常对给予的受试者提供改善效果的药物剂量。 应该强调的是，由于疾病状态和个体反应性的变化，在特定情况下， 给予特定受试者本发明组合物的″治疗有效量″对于治疗所述疾病不总 是有效的，即使这种剂量被本领域技术人员认为是″治疗有效量″。还应 该理解，在特定情况下，在肠胃外或口服剂中测定药物剂量，或在血 液或血浆中测量药物水平。
″耐受性″指个体接受给予的连续、大丸药剂、多剂量或比通过相 同活性药物成分的其他制剂给予的更大剂量的本发明纳米悬浮体(含有 活性药物成分)的能力，没有有害或不需要的效果，或者相对于在个体 中给予这类其他制剂的效果而言有害或不需要的效果降低，而不论是 连续、大丸药剂或多剂量方案给予这种制剂。
化合物/粒子
以下术语具有本发明说明书中的含义：
术语″自由羟基″指OH基。术语″官能修饰的羟基″指已被官能化形 成以下物质的OH基：醚，其中烷基，芳基，环烷基，杂环烷基，烯基， 环烯基，杂环烯基，酰基烷基，炔基，或杂芳基取代氢；酯，其中酰 基取代氢；氨基甲酸酯，其中氨羰基取代氢；或碳酸酯，其中芳氧基-， 杂芳氧基-，烷氧基-，环烷氧基-，杂环烷氧基-，烯氧基-，环烯氧基-， 杂环烯氧基-，或炔氧基-羰基取代氢。优选的部分包括OH， OCH2C(O)CH3，OCH2C(O)C2H5，OCH3，OCH2CH3，OC(O)CH3，和 OC(O)C2H5。
术语″自由氨基″指NH2。术语″官能修饰的氨基″指已被官能化形成 以下物质的NH2基：芳氧基-，杂芳氧基-，烷氧基-，环烷氧基-，杂环 烷氧基-，烯基-，环烯基-，杂环烯基-，炔基-，或羟基-氨基，其中适 合的基团取代一个氢；芳基-，杂芳基-，烷基-，环烷基-，杂环烷基-， 烯基-，环烯基-，杂环烯基-，酰基烷基，或炔基-氨基之一，其中适合 的基团取代一个或两个氢；酰胺，其中酰基取代一个氢；氨基甲酸酯， 其中芳氧基-，杂芳氧基-，烷氧基-，环烷氧基-，杂环烷氧基-，烯基-， 环烯基-，杂环烯基-，或炔基-羰基取代一个氢；或脲，其中氨羰基取 代一个氢。这些取代形式的组合也落入官能修饰的氨基定义内并包括 在本发明的范围内，例如其中一个氢被烷基取代、另一个氢被烷氧基 羰基取代的NH2。优选的部分包括NH2，NHCH3，NHC2H5，N(CH3)2， NHC(O)CH3，NHOH，和NH(OCH3)。
术语″自由硫醇基″指SH基。术语″官能修饰的硫醇基″指已被官能 化形成以下物质的SH基：硫醚，其中烷基，芳基，环烷基，杂环烷基， 烯基，环烯基，杂环烯基，炔基，酰基烷基，或杂芳基取代氢；或硫 酯，其中酰基取代氢。优选的部分包括SH，SC(O)CH3，SCH3，SC2H5， SCH2C(O)C2H5，和SCH2C(O)CH3。
术语″酰基″代表通过具有结合到氧原子上的双键和结合到另一个 碳原子上的单键的碳原子而连接起来的基团。
术语″烷基″包括饱和的直链或支链的脂肪族烃基，即它们不含有 碳碳双键。烷基可以插入一种或多种杂原子，如氧、氮或硫，可以用 其他基团取代，如卤素，羟基，芳基，环烷基，芳氧基，或烷氧基。 优选的直链或支链的烷基包括甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲 丁基，异丁基，和叔丁基。
术语″环烷基″包括连接形成一个或多个可以是稠合或分离的环、 直链或支链的、饱和或不饱和的脂肪族烃基。环可以用其他基团取代， 如卤素，羟基，芳基，芳氧基，烷氧基，或烷基。优选的环烷基包括 环丙基，环丁基，环戊基，环己基，和环庚基。
术语″杂环烷基″指在环中含有至少一个杂原子如O、S或N、可以 是稠合或分离的环烷基环。环可以用其他基团取代，如卤素，羟基， 芳基，芳氧基，烷氧基，或烷基。优选的杂环烷基包括吡咯烷基，四 氢呋喃基，哌嗪基，哌啶基，吗啉基，和四氢吡喃基。
术语″烯基″包括具有至少一个碳碳双键的直链或支链的烃基，其 链可任选地插入一种或多种杂原子。其链氢可以用其他基团取代，如 卤素。优选的直链或支链的烯基包括烯丙基，1-丁烯基，1-甲基-2-丙烯 基和4-戊烯基。
术语″环烯基″包括将直链或支链的、饱和或不饱和的脂肪族烃基 连接形成一个或多个含有碳碳双键的非芳香族环，其可以是稠合或分 离的。环可以用其他基团取代，如卤素，羟基，烷氧基，或烷基。优 选的环烯基包括环戊烯基和环己烯基。
术语″杂环烯基″指在环中含有一个或多个杂原子如O、N或S、可 以是稠合或分离的环烯基环。环可以用其他基团取代，如卤素，羟基， 芳基，芳氧基，烷氧基，或烷基。优选的杂环烯基包括吡咯烷基，二 氢吡喃基，和二氢呋喃基。
术语″羰基″代表与氧原子双键结合的碳原子，其中碳原子具有两 个自由价态。
术语″氨羰基″代表其氮原子与羰基碳原子结合的自由或官能修饰 的氨基，羰基本身通过其碳原子与另一个原子结合。
术语″卤素″代表氟，氯，溴，或碘。
术语″芳基″指芳香族的碳环。环可以是分离的，如苯基，或可以 是稠合的，如萘基。环氢可以用其他基团取代，如烷基，卤素，自由 或官能化的羟基，三卤甲基等。芳基的例子包括苯基和取代的苯基， 如2-，3-，或4-卤代苯基，烷基苯基，和3-(三氟甲基)苯基。
术语″芳烷基″指其中烷基取代基上的至少一个氢被芳基取代的烷 基。其例子包括苄基和取代的苄基，如2-，3-，或(4-卤代苯基)甲基， 和(4-烷基苯基)甲基。
术语″杂芳基″指在环中含有至少一种杂原子如O，S，或N的芳香 族烃环。杂芳基环可以是分离的，具有5～6个环原子，或可以是稠合 的，具有8～10个原子。具有开放化合价的杂芳基环氢或杂原子可以用 其他基团取代，如烷基或卤素。杂芳基的例子包括咪唑，吡啶，吲哚， 喹啉，呋喃，噻吩，苯并噻吩，吡咯，吡唑，噁唑，异噁唑，噻唑， 四氢喹啉，苯并呋喃，二氢苯并呋喃，和二氢苯并吲哚。
术语″芳氧基″，″杂芳氧基″，″烷氧基″，″环烷氧基″，″杂环烷氧基 ″，″烯氧基″，″环烯氧基″，″杂环烯氧基″，和″炔氧基″分别代表通过氧 键连接的芳基，杂芳基，烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，环烯基， 杂环烯基，或炔基。
术语″烷氧基羰基″，″芳氧基羰基″，″杂芳氧基羰基″，″环烷氧基 羰基″，″杂环烷氧基羰基″，″烯氧基羰基″，″环烯氧基羰基″，″杂环烯 氧基羰基″，和″炔氧基羰基″分别代表其氧原子与羰基碳原子结合的烷 氧基，芳氧基，杂芳氧基，环烷氧基，杂环烷氧基，烯氧基，环烯氧 基，杂环烯氧基，或炔氧基，羰基本身通过其碳原子与另一个原子结 合。
本发明的吲哚微管蛋白抑制剂化合物是通式(1)：

式(1)
其中：
X是氢，卤素，烷基，环烷基，杂环烷基，烯基，环烯基，杂环 烯基，酰基，羧基(-C＝OOR)，烷氧基，羟基，官能修饰的羟基(例如， 酰氧基)，芳基，杂芳基，

其中Y和Z独立地是NR，O，或S，其中R是氢，烷基，芳基， 酰基，环烯基，杂环烯基，烯基，环烯基，杂环烯基，氨羰基，
R3和R3′独立地是烷基，芳基，杂芳基，
或X是NR8R9，其中，R8和R9独立地是氢，烷基，环烷基，杂环 烷基，烯基，环烯基，杂环烯基，酰基，芳基，或杂芳基；
A，B，C和D独立地是氮或碳，
条件是如果A是氮，那么R4不存在，并且如果A是碳，那么R4 是氢、卤素或烷基；
如果B是氮，那么R5不存在，并且如果B是碳，那么R5是氢、 卤素或烷基；
如果C是氮，那么R6不存在，并且如果C是碳，那么R6是氢、 卤素或烷基；
如果D是氮，那么R7不存在，并且如果D是碳，那么R7是氢、 卤素或烷基；
R1是氢，烷基，烷芳基，酰基，或芳基；以及
R2是氢，烷基，酰基，芳基，烷氧基羰基，芳氧基羰基，杂芳氧 基羰基，环烷氧基羰基，杂环烷氧基羰基，烯氧基羰基，环烯氧基羰 基和杂环烯氧基羰基。
优选地，R1是取代的苄基，更优选卤代苄基(2-，3-，或(4-卤代苯 基)甲基)，最优选(4-氯苯基)甲基。
优选地，R4，R5，R6，和R7是氢原子。
优选地，R3或R3′是氢，另一个取代基(R3或R3′)是吡啶基(吡啶环)。 更优选地，R3或R3′是氢，另一个取代基(R3或R3′)是4-吡啶基.
本发明的吲哚微管蛋白抑制剂的优选物质是在美国专利 2003/0195244中记载的那些(特别是N-取代的和3-取代的)，其被引入 本发明作为参考并成为本发明的一部分。
本发明的吲哚微管蛋白抑制剂的优选物质是在美国公开 2002/0091124A1中记载的那些(2-酰基吲哚类)，其被引入本发明作为参 考并成为本发明的一部分。
本发明的吲哚的最优选物质是在美国专利6,008,231；6,232,327和 6,693,119中记载的那些(N-取代的吲哚-3-乙醛酰胺)，其被引入本发明 作为参考并成为本发明的一部分。
本发明最优选的吲哚是D-24851，具有式2的化学结构：

式(2)。
本发明的吲哚可通过本领域技术人员已知的方法合成，这些方法 公开在前述引入作为参考的专利和出版物中。
本发明的组合物中一种或多种微管蛋白抑制剂的存在量为约 0.01％～约20％重量/体积(w/v)，优选约0.05％～约15％w/v，更优选约 0.1％～约10％w/v。
本发明的粒子其尺寸分布随多种因素变化，包括活性剂，存在的 表面活性剂，给药方案和剂量方案。通常，颗粒其尺寸分布为约15 nm～50微米，优选约50nm～10微米，更优选约50nm～2微米。当制备 注射给予的粒子时，它们具有有效粒径。优选地，这种粒子尺寸将小 于约5微米(微米粒子)，更优选地，尺寸小于约2微米(纳米粒子)。
表面活性剂/悬浮体
用于在本发明中涂布颗粒的适合表面活性剂可选自离子表面活性 剂，非离子表面活性剂，两性离子表面活性剂，磷脂，生物衍生的表 面活性剂或氨基酸及其衍生物。离子表面活性剂可以是阴离子或阳离 子型。表面活性剂在组合物中的存在量为约0.01％～10％w/v，优选约 0.05％～约5％w/v。
适合的阴离子表面活性剂包括但不限于：烷基磺酸盐，芳基磺酸 盐，烷基磷酸盐，烷基膦酸盐，月桂酸钾，月桂基硫酸钠，十二烷基 硫酸钠，烷基聚氧乙烯硫酸盐，藻酸钠，磷脂酸和其盐，羧基甲基纤 维素钠，胆酸和其盐(例如，胆酸、脱氧胆酸、甘胆酸、牛磺胆酸和甘 氨脱氧胆酸的盐)，和羧基甲基纤维素钙，硬脂酸和其盐(例如，硬脂酸 钠和钙)，磷酸盐，十二烷基硫酸钠，羧基甲基纤维素钙，羧基甲基纤 维素钠，二辛基硫代琥珀酸钠(DOSS)，硫代琥珀酸钠的二烷基酯，月 桂基硫酸钠以及磷脂。
适合的阳离子表面活性剂包括但不限于：季铵化合物，氯化苄烷 铵，鲸蜡基三甲基溴化铵，壳聚糖，月桂基二甲基苄基氯化铵，酰基 肉碱盐酸盐，烷基卤化吡啶，鲸蜡基氯化吡啶，阳离子脂质，聚甲基 丙烯酸甲酯三甲基溴化铵，锍化合物，聚乙烯吡咯烷酮-2-二甲基氨基 乙基甲基丙烯酸酯二甲基硫酸盐，十六烷基三甲基溴化铵，鏻化合物， 季铵化合物，苄基-二(2-氯乙基)乙基溴化铵，椰子油三甲基氯化铵，椰 子油三甲基溴化铵，椰子油甲基二羟乙基氯化铵，椰子油甲基二羟乙 基溴化铵，癸基三乙基氯化铵，癸基二甲基羟乙基氯化铵，癸基二甲 基羟乙基氯溴化铵，C12-15-二甲基羟乙基氯化铵，C12-15-二甲基羟乙基 氯溴化铵，椰子油二甲基羟乙基氯化铵，椰子油二甲基羟乙基溴化铵， 肉豆蔻基三甲基甲基硫酸铵，月桂基二甲基苄基氯化铵，月桂基二甲 基苄基溴化铵，月桂基二甲基(乙烯氧基)4氯化铵，月桂基二甲基(乙烯 氧基)4溴化铵，N-烷基(C12-18)二甲基苄基氯化铵，N-烷基(C14-18)二甲基 -苄基氯化铵，N-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物，二甲基二癸基 氯化铵，N-烷基和(C12-14)二甲基1-萘基甲基氯化铵，三甲基卤化铵烷 基-三甲基铵盐，二烷基-二甲基铵盐，月桂基三甲基氯化铵，乙氧基化 的烷酰氨基烷基二烷基铵盐，乙氧基化的三烷基铵盐，二烷基苯二烷 基氯化铵，N-二癸基二甲基氯化铵，N-十四烷基二甲基苄基氯化铵一 水合物，N-烷基(C12-14)二甲基1-萘基甲基氯化铵，十二烷基二甲基苄 基氯化铵，二烷基苯烷基氯化铵，月桂基三甲基氯化铵，烷基苄基甲 基氯化铵，烷基苄基二甲基溴化铵，C12三甲基溴化铵，C15三甲基溴 化铵，C17三甲基溴化铵，十二烷基苄基三乙基氯化铵，聚二烯丙基二 甲基氯化铵(DADMAC)，二甲基氯化铵，烷基二甲基卤化铵，三鲸蜡 基甲基氯化铵，癸基三甲基溴化铵，十二烷基三乙基溴化铵，十四烷 基三甲基溴化铵，甲基三辛基氯化铵，″POLYQUAT 10″(聚合的季铵 化合物的混合物)，四丁基溴化铵，苄基三甲基溴化铵，胆碱酯，氯化 苄烷铵，硬脂基二甲基苄基氯化铵(stearalkonium chloride)，鲸蜡基溴化 吡啶，鲸蜡基氯化吡啶，季铵化的聚氧乙基烷基胺的卤化盐，烷基吡 啶盐，胺，胺盐，酰亚胺叠氮盐，质子化的季化丙烯酰胺，甲基化的 季化聚合物，阳离子瓜尔胶，氯化苄烷铵，十二烷基三甲基溴化铵， 三乙醇胺，和poloxamine。
适合的非离子表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脂肪醇醚，聚 氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯脂肪酸酯，山梨糖醇酯，甘油酯， 甘油单硬脂酸酯，聚乙二醇，聚丙二醇，聚丙二醇酯，鲸蜡基醇，十 八十六醇，硬脂基醇，芳烷基聚醚醇，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物， poloxamer，poloxamine，甲基纤维素，羟基纤维素，羟甲基纤维素， 羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，非晶纤维素，多聚糖，淀粉，淀 粉衍生物，羟乙基淀粉，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，三乙醇胺硬脂 酸盐，胺氨化物，右旋糖苷，甘油，阿拉伯树胶，胆固醇，黄芪胶， 甘油单硬脂酸酯，十八十六醇，聚西托醇乳化腊，山梨糖醇酯，聚氧 乙烯烷基醚，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯， 聚乙二醇，聚氧乙烯硬脂酸盐，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素， 甲基纤维素，羟乙基纤维素，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素，非晶纤 维素，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，环氧乙烷和甲醛的4-(1，1，3，3-四甲 基丁基)苯酚聚合物，poloxamer，烷芳基聚醚磺酸盐，蔗糖硬脂酸盐和 蔗糖二硬脂酸盐的混合物， C18H37CH2C(O)N(CH3)CH2(CHOH)4(CH2OH)2，p-异壬基苯氧基聚(缩水 甘油)，癸酰基-N-甲基葡糖酰胺，n-癸基-β-D-葡萄吡喃糖苷，n-癸基-β-D- 麦芽糖吡喃糖苷，n-十二烷基-β-D-葡萄吡喃糖苷，n-十二烷基-β-D-麦 芽糖苷，庚酰基-N-甲基葡糖酰胺，n-庚基-β-D-葡萄吡喃糖苷，n-庚基 -β-D-硫代葡萄糖苷，n-己基-β-D-葡萄吡喃糖苷；壬酰基-N-甲基葡糖酰 胺，n-壬基-β-D-葡萄吡喃糖苷，辛酰基-N-甲基葡糖酰胺，n-辛基-β-D- 葡萄吡喃糖苷，辛基-β-D-硫代葡萄吡喃糖苷，PEG-胆固醇，PEG-胆固 醇衍生物，PEG-维生素A，PEG-维生素E，以及乙酸乙烯酯和乙烯基 吡咯烷酮的无规共聚物。
两性离子表面活性剂是电中性的，但在同一分子内具有局部正电 荷和负电荷。分子上的净电何可取决于pH，因此在低pH时，一些两 性离子表面活性剂可以用作阳离子表面活性剂，而在高pH时，它们还 可以用作阴离子表面活性剂。适合的两性离子表面活性剂包括但不限 于两性离子磷脂。这些磷脂包括磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，二酰基- 甘油酰-磷酸乙醇胺(如二肉豆蔻酰-甘油酰-磷酸乙醇胺(DMPE)，二榈棕 酰-甘油酰-磷酸乙醇胺(DPPE)，二硬脂酰-甘油酰-磷酸乙醇胺(DSPE)， 和二油酰-甘油酰-磷酸乙醇胺(DOPE)，pegylated磷脂，PEG-磷脂酰胆 碱，PEG-二酰基-甘油酰-磷酸乙醇胺，PEG-磷脂酰乙醇胺，PEG-二酰 基-甘油酰-磷酸乙醇胺，PEG-二肉豆蔻酰-甘油酰-磷酸乙醇胺，PEG- 二榈棕酰-甘油酰-磷酸乙醇胺，PEG-二硬脂酰-甘油酰-磷酸乙醇胺， PEG-二油酰-甘油酰-磷酸乙醇胺，甲氧基聚乙二醇(mPEG)-磷脂， mPEG-磷脂酰胆碱，mPEG-二酰基-甘油酰-磷酸乙醇胺，mPEG-磷脂酰 乙醇胺，mPEG-二酰基-甘油酰-磷酸乙醇胺，mPEG-二肉豆蔻酰-甘油 酰-磷酸乙醇胺，mPEG-二榈棕酰-甘油酰-磷酸乙醇胺，mPEG-二硬脂 酰-甘油酰-磷酸乙醇胺，和mPEG-二油酰-甘油酰-磷酸乙醇胺。
在本发明中可以使用包括阴离子和两性离子磷脂的磷脂混合物。 这种混合物包括但不限于溶血磷脂，卵磷脂或大豆磷脂或其任何组合。
适合的生物衍生的表面活性剂包括但不限于：脂蛋白，凝胶，酪 蛋白，溶菌酶，白蛋白，酪蛋白，肝磷脂，水蛭素，或其他蛋白。
优选的离子表面活性剂是胆汁盐，优选的胆汁盐是脱氧胆酸钠。 优选的非离子表面活性剂是聚烷氧基醚，优选的聚烷氧基醚是聚氧乙 烯-聚氧丙烯三嵌段共聚物，如Poloxamer 188和Poloxamer 407。另一 种优选的表面活性剂是脂质，其中聚烷氧基醚通过醚键与脂质共价连 接。优选的这类表面活性剂是pegylated磷脂。另一种优选的表面活性 剂是pegylated磷脂甲基醚(例如，mPEG-DSPE)。
在本发明的优选实施方案中，颗粒悬浮在还包括pH调节剂的水性 介质中。适合的pH调节剂包括但不限于氢氧化钠，盐酸，tris缓冲液， 一元、二元、三元羧酸和其盐，柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐，甘油-1-磷 酸盐，甘油-2-磷酸盐，乙酸盐，乳酸盐，三(羟甲基)氨基甲烷，氨基糖， 一、二和三烷基化的胺，甲葡胺(N-甲基葡萄糖胺)，和氨基酸。水性介 质还可以包括渗透压调节剂，例如但不限于甘油、单糖如葡萄糖、二 糖如蔗糖，海藻糖和麦芽糖、三糖如棉子糖，以及糖醇如甘露醇和山 梨醇。
在本发明的实施方案中，除去颗粒悬浮体组合物的水性介质形成 干颗粒。除去水性介质的方法可以是本领域中已知的任何方法。一个 例子是蒸发。另一个例子是冻干。干颗粒可以配制成任何可接受的物 理形式，包括但不限于溶液，片剂，胶囊，悬浮体，霜剂，洗剂，乳 状液，气雾剂，粉末，加到贮存器或基体装置中以缓释(如植入物或皮 贴)等。本发明的水性悬浮体也可以冷冻，以提高贮存时的稳定性。冷 冻水性悬浮体以改进稳定性公开在共同受让人的共同未决美国专利申 请Serial No.10/270,267中，其被引入本发明作为参考并成为本发明的 一部分。
优选的组合物包括0.05％～10％w/v的微管蛋白抑制剂颗粒的水性 悬浮体，用0.05％～5％w/v的离子表面活性剂(例如，脱氧胆酸盐)或两 性离子表面活性剂(例如，mPEG-DSPE)，和0.05％～5％w/v聚烷氧基 醚(例如，Poloxamer 188)，和用于调节制剂渗透压的甘油涂布颗粒。
本发明的颗粒悬浮体可通过本领域技术人员已知的方法和下面说 明的这些方法制备。
颗粒/悬浮体制备方法
制备本发明颗粒悬浮体的能量加入方法公开在共同受让人的共同 未决美国专利申请Serial No.60/258,160；09/874,799；09/874,637； 09/874,499；09/964,273；10/03 5,821，60/347,548；10/021,692；10/183,035； 10/213,352；10/246,802；10/270,268；10/270,267，和10/390,333中； 引入本发明作为参考并成为本发明的一部分。制备本发明用的悬浮体 的一般过程如下。
这些方法可以分成三大类。每一类方法共有以下步骤：(1)在水可 混溶的第一有机溶剂中溶解微管蛋白抑制剂化合物，产生第一溶液；(2) 混合第一溶液与水的第二溶剂，析出微管蛋白抑制剂，产生预悬浮体； 以及(3)高剪切混合或加热形式将能量加到预悬浮体中，提供稳定形式 的具有所需上述尺寸范围的微管蛋白抑制剂。
基于通过在能量加入步骤之前和能量加入步骤之后的x-射线衍射 研究、差示扫描量热法(DSC)研究或其他适合研究测定的微管蛋白抑制 剂的物理性能区别三类方法。
I.第一类方法
第一类方法通常包括以下步骤：在水可混溶的第一溶剂中溶解微 管蛋白抑制剂，然后使溶液与水溶液混合，形成预悬浮体，其中微管 蛋白抑制剂根据x-射线衍射研究，DSC，光或电子显微镜或其他分析 技术测定是无定形形式、半晶型或超冷液体型，并且平均有效粒径在 上述有效粒径范围内。混合步骤后进行能量加入步骤，并且在本发明 优选形式中是退火步骤。
II.第二类方法
第二类方法包括基本上与第一类方法步骤相同的步骤，但以下方 面不同。预悬浮体的x-射线衍射，DSC或其他适合的分析表明微管蛋 白抑制剂是晶体形式并具有平均有效粒径。在能量加入步骤之后的微 管蛋白抑制剂具有与能量加入步骤之前基本上相同的平均有效粒径， 但与预悬浮体的颗粒相比，更不易凝聚成更大颗粒。尽管不限于理论， 但是认为，颗粒稳定性差异可能是由于在固体-液体界面处表面活性剂 分子重新排序的原因。
III.第三类方法
第三类方法改进了第一和第二类方法的最初两个步骤，以确保预 悬浮体中的微管蛋白抑制剂是具有平均有效粒径的易碎形式(例如，细 针状和薄板状)。通过选择适合的溶剂，表面活性剂或表面活性剂组合， 各溶液的温度，混合比和析出速率等可以形成易碎颗粒。通过在第一 溶液与水溶液的混合步骤中引入晶格缺陷(例如，破裂面)也可以增强易 碎性。这将通过例如在析出步骤中提供的快速结晶化实现。在能量加 入步骤中，这些易碎晶体转化成动力学稳定的并且具有小于预悬浮体 的平均有效粒径的晶体。动力学稳定是指与动力学不稳定的颗粒相比， 颗粒凝聚的趋势降低。在这种情况下，能量加入步骤使得易碎颗粒破 裂并涂布。通过确保预悬浮体的颗粒处于易碎态，与没有采用使其成 为易碎形式的步骤的有机化合物处理相比，可以将有机化合物更容易 和更快地制成在所需尺寸范围内的颗粒。
能量加入步骤可以任何方式进行，其中预悬浮体经历气蚀，剪切 或冲击力。在本发明一个优选的形式中，能量加入步骤是退火步骤。 在本发明中，退火被定义为通过一次或反复施加能量(直接加热或机械 应力)，然后热弛豫，使热动力学不稳定的物质转化成更稳定形式的过 程。通过使固体形式从更无序转化成更有序的晶格结构，可以实现能 量降低。可选择地，通过在固体-液体界面处使表面活性剂分子重新排 序进行这种稳定化。
下面分别讨论这三类方法。然而，应该理解，可以选择方法条件， 如选择表面活性剂或表面活性剂组合，表面活性剂用量，反应温度， 溶液混合比，析出速率等，以使待处理的任何药物在下述任一类中。
第一类方法以及第二和第三类方法可以再分成两个小类，分别是 图4和图5中示意性所示的方法A和方法B。
根据本发明的第一溶剂是其中相关有机化合物相对溶解并可与第 二溶剂混溶的溶剂或溶剂混合物。这种溶剂包括但不限于水可混溶的 质子化合物，其中分子中的氢原子与电负性原子键合，如氧，氮，或 元素周期表中的其他族VA，VIA和VIIA。这种溶剂的例子包括但不 限于醇，胺(伯或仲)，肟，羟胺酸，羧酸，磺酸，膦酸，磷酸，酰胺和 脲。
第一溶剂的其他例子还包括非质子有机溶剂。这些非质子溶剂中 的一些可以与水形成氢键，但是仅用作质子受体，因为它们缺少有效 的给质子基团。一类非质子溶剂是根据国际纯粹与应用化学联合会 (IUPAC Compendium of Chemical Terminology，第二版，1997)定义的 偶极非质子溶剂：
一种具有大于约15的高相对介电常数和相当大的永久偶极矩的 溶剂，其不能给予适合不稳定的氢原子而形成强氢键，例如二甲基亚 砜。
偶极非质子溶剂可以选自：酰胺(完全取代，没有连接氢原子的氮)， 脲(完全取代，没有连接氮的氢原子)，醚，环醚，腈，酮，砜，亚砜， 完全取代的磷酸酯，膦酸酯，磷酰胺，硝基化合物等。二甲基亚砜 (DMSO)，N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，2-吡咯烷酮，1，3-二甲基-2-咪唑 烷酮(DMI)，二甲基乙酰胺(DMA)，二甲基甲酰胺(DMF)，二噁烷，丙 酮，四氢呋喃(THF)，四亚甲基砜(环丁砜)，乙腈，和六甲基磷酰胺 (HMPA)，硝基甲烷，1，2-丙二醇碳酸酯，它们是这类的成员。
还可以选择通常水不可混溶的，但在小体积(小于10％)下具有足 够水溶解度，而在这些减小的体积下用作水可混溶的第一溶剂的溶剂。 例子包括芳香族烃，烯烃，烷烃，和卤代芳香物、卤代烯烃和卤代烷 烃。芳香物包括但不限于苯(取代的或未取代的)，单环或多环芳烃。取 代苯的例子包括但不限于二甲苯(邻、间或对)和甲苯。烷烃的例子包括 但不限于己烷，新戊烷，庚烷，异辛烷，和环己烷。卤代芳香物的例 子包括但不限于氯苯，溴苯，和氯甲苯。卤代烷烃和烯烃的例子包括 但不限于三氯乙烷，二氯甲烷，二氯乙烷(EDC)等。
上述溶剂类别的例子包括但不限于：N-甲基-2-吡咯烷酮(N-甲基 -2-吡咯烷酮)，2-吡咯烷酮(2-吡咯烷酮)，1，3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)， 二甲基亚砜，二甲基乙酰胺，羧酸(如乙酸和乳酸)，脂肪族醇(如甲醇， 乙醇，异丙醇，3-戊醇，和n-丙醇)，苄基醇，甘油，丁二醇(1，2-丁二 醇，1，3-丁二醇，1，4-丁二醇，和2，3-丁二醇)，乙二醇，丙二醇，单和 二酰基化的甘油酯，二甲基异山梨酯，丙酮，二甲基砜，二甲基甲酰 胺，1，4-二噁烷，四亚甲基砜(环丁砜)，乙腈，硝基甲烷，四甲基脲， 六甲基磷酰胺(HMPA)，四氢呋喃(THF)，二乙醚，叔丁基甲基醚 (TBME)，芳香族烃，烯烃，烷烃，卤代芳香物，卤代烯烃，卤代烷烃， 二甲苯，甲苯，苯，取代的苯，乙酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸丁酯，氯 苯，溴苯，氯甲苯，三氯乙烷，二氯甲烷，二氯乙烷(EDC)，己烷，新 戊烷，庚烷，异辛烷，环己烷，聚乙二醇(PEG)，PEG酯，PEG-4，PEG-8， PEG-9，PEG-12，PEG-14，PEG-16，PEG-120，PEG-75，PEG-150， 聚乙二醇酯，PEG-4二月桂酸酯，PEG-20二月桂酸酯，PEG-6异硬脂 酸酯，PEG-8硬脂酸棕榈酸酯，PEG-150硬脂酸棕榈酸酯，聚乙二醇山 梨糖醇，PEG-20山梨糖醇异硬脂酸酯，聚乙二醇单烷基醚，PEG-3二 甲基醚，PEG-4二甲基醚，聚丙二醇(PPG)，聚丙烯藻酸酯，PPG-10 丁二醇，PPG-10甲基葡萄糖醚，PPG-20甲基葡萄糖醚，PPG-15硬脂 醚，丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯，丙二醇月桂酸酯，和四氢呋喃聚乙二 醇醚(四氢糠醇聚乙二醇醚).
优选的第一溶剂是N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。另一种优选的第一 溶剂是乳酸。
第二溶剂是水性溶剂。这种水性溶剂可以是水本身。这种溶剂还 可以含有缓冲液，盐，表面活性剂，水溶性聚合物，以及这些赋形剂 的组合。
方法A
在方法A中，微管蛋白抑制剂首先溶解在第一溶剂中，产生第一 溶液。取决于微管蛋白抑制剂在第一溶剂中的溶解度，微管蛋白抑制 剂可以加入约0.01％～约20％重量/体积(w/v)。可能需要将浓缩物从约 30℃加热到约100℃，以确保在第一溶剂中完全溶解微管蛋白抑制剂。
第二水溶液含有一种或多种加到其中的表面活性剂。表面活性剂 可以选自上述离子表面活性剂，非离子表面活性剂，阳离子表面活性 剂，两性离子表面活性剂，磷脂，或生物衍生的表面活性剂。
还优选将pH调节剂加到第二溶液中，如氢氧化钠，盐酸，氨基酸 如甘氨酸，tris缓冲液或柠檬酸盐，乙酸盐，乳酸盐，甲葡胺等。第二 溶液其pH为约2～约12。
然后混合第一和第二溶液。优选地，以可控制速率将第一溶液加 到第二溶液中。加入速率取决于物料大小和微管蛋白抑制剂的析出动 力学。通常，对于小规模实验方法(制备1升)，加入速率约0.05cc/分 钟～约50cc/分钟。在加入过程中，恒定搅拌溶液。使用光显微镜法观 察到无定形颗粒，半结晶固体，或超冷却液体形成预悬浮体。所述方 法还包括以下步骤：使预悬浮体进行退火步骤，使无定形颗粒，超冷 却液体或半结晶固体转化成更稳定固态的结晶。根据动态光散射方法 (例如，光校正光谱，激光衍射，低角度激光光散射(LALLS)，中角度 激光光散射(MALLS))，光透法方法(Coulter方法，例如)，流变学，或 显微镜法(光或电子)测量，得到的颗粒具有上述范围内的平均有效颗粒 尺寸。
能量加入步骤包括通过下述方法加入能量：声波处理，均质化， 逆流流动均质化(例如，Mini DeBEE 2000均质器，从BEE Incorporated， NC得到，其中流体射流沿第一通路导向，并且结构插在第一通路中， 使流体沿新通路以可控流路再次导向，使流体乳化或混合)，微流化， 或提供冲击的其他方法，剪切或气蚀力。在此阶段中，样品可以被冷 却或加热。在本发明的一个优选形式中，通过均质化进行退火步骤。 在本发明的另一个优选形式中，通过超声波处理进行退火。在本发明 的另一个优选形式中，通过使用美国专利5,720,551中所述的乳化设备 进行退火，其被引入本发明作为参考并成为本发明的一部分。
取决于退火速率，优选将处理样品的温度从约0℃调节到30℃。 可选择地，为在处理固体中进行所需的相变，在退火步骤中，还可能 需要将预悬浮体的温度调节到约-30℃～约100℃的温度范围。
方法B
方法B在以下方面与方法A不同。第一个差别是表面活性剂或表 面活性剂组合被加到第一溶液中。表面活性剂可以选自上述离子表面 活性剂，非离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性 剂，磷脂，或生物衍生物。从本发明所述方法得到的药物悬浮体可以 作为注射溶液直接给予，只要使用适合的溶液消毒装置。
消毒
通过在混合形成预悬浮体之前，使药物浓缩物(药物，溶剂，和任 选的表面活性剂)和稀释介质(水，和任选的缓冲液和表面活性剂)单独 消毒，可以实现消毒。消毒方法包括但不限于首先通过3.0微米过滤器 预过滤，然后通过0.45-微米颗粒过滤器过滤，然后蒸汽或加热消毒， 或通过两个多余的0.2-微米膜过滤器消毒过滤。
制备无溶剂悬浮体
任选地，通过在析出之后除去溶剂可以制造无溶剂悬浮体。这可 通过离心，透析，渗滤，力场分离，高压过滤或本领域公知的其他分 离技术来实现。通常通过1～3个连续离心步骤完全除去乳酸或N-甲基 -2-吡咯烷酮；每次离心后，倾析出上清液并弃去。没有有机溶剂的新 体积悬浮体载体加到残余固体中，通过均质化使混合物分散。本领域 技术人员应该理解，在此重构步骤中可以使用其他高剪切混合技术。
置换赋形剂
此外，使用上段所述分离方法，任何不需要的赋形剂如表面活性 剂都可以被更需要的赋形剂置换。在离心或过滤后，溶剂和初始赋形 剂可随上清液弃去。然后可加入没有溶剂和没有第一赋形剂的新体积 的悬浮体载体。可选择地，可以加入新的表面活性剂。例如，在离心 和除去上清液之后，由药物，N-甲基-2-吡咯烷酮(溶剂)，Poloxamer 188 (初始赋形剂)，脱氧胆酸钠，甘油和水构成的悬浮体可以被磷脂(新的 表面活性剂)，甘油和水置换。
冻干
通过冻干形成冻干的悬浮体可以干燥悬浮体，重构成适于给予的 悬浮体。为制备稳定的、干固体，在冻干之前可以加入填充剂，如甘 露醇，山梨醇，蔗糖，淀粉，乳糖，海藻糖或棉子糖。可以使用任何 适用的冻干过程，使悬浮体冻干，例如：
在+25℃下加载
在1小时内冷却到-45℃
在-45℃保持时间3.5小时
在压力0.4mbar下连续升高温度到+15℃，平均干燥33小时
在压力0.03mbar下在+20℃下最终干燥10小时
冷冻保护剂：甘露醇
除了上述微析出方法之外，本领域中用于制备活性剂颗粒(更优选 地，纳米颗粒)的任何其他已知析出方法都可用于本发明中。以下说明 其他析出方法的例子。这些例子仅用于说明，不意图限制本发明的范 围。
乳状液析出方法
一种适合的乳状液析出技术公开在共同未决的、共同受让人的U.S. Ser.No.09/964,273中，其被引入本发明作为参考并成为本发明的一部 分。在这种技术中，该方法包括以下步骤：(1)提供具有有机相和水相 的多相体系，有机相中具有药物有效化合物；以及(2)声波处理体系， 以蒸发有机相部分，析出在水相中并且平均有效粒径小于约2μm的化 合物。提供多相体系的步骤包括以下步骤：(1)使水不可混溶的溶剂与 药物有效化合物混合形成有机溶液，(2)制备含有一种或多种表面活性 化合物的水性基溶液，和(3)使有机溶液与水溶液混合形成多相体系。 混合有机相和水相的步骤可以包括使用活塞-间隙式均质器，胶体研磨 机，高速搅拌设备，挤出设备，手动搅拌或摇动设备，微流化器，或 其他提供高剪切条件的设备或技术。粗乳状液具有在水中的直径尺寸 约小于1μm的油滴。粗乳状液被声波处理形成微乳液，最终形成亚微 米尺寸颗粒悬浮体。
制备亚微米尺寸颗粒的另一种技术公开在共同未决的、共同受让 人的U.S.Ser.No.10/183,035中，其被引入本发明作为参考并成为本发 明的一部分。该方法包括以下步骤：(1)提供具有有机相和水相的多相 体系的粗分散体，有机相中具有药物化合物；(2)向粗分散体提供能量 形成微分散体；(3)冷冻微分散体；以及(4)冻干微分散体得到亚微米 尺寸的药物化合物颗粒。提供多相体系的步骤包括以下步骤：(1)使水 不可混溶的溶剂与药物有效化合物混合形成有机溶液；(2)制备含有一 种或多种表面活性化合物的水性基溶液；以及(3)使有机溶液与水溶液 混合形成多相体系。混合有机相和水相的步骤包括使用活塞-间隙式均 质器，胶体研磨机，高速搅拌设备，挤出设备，手动搅拌或摇动设备， 微流化器，或其他提供高剪切条件的设备或技术。
溶剂反溶剂析出
适合的溶剂反溶剂析出技术公开在美国专利5,118,528和 5,100,591中，其被引入本发明作为参考并成为本发明的一部分。该方 法包括以下步骤：(1)在可以加有一种或多种表面活性剂的溶剂或溶剂 混合物中制备生物活性物质的液相；(2)制备非溶剂或非溶剂混合物的 第二液相，非溶剂可与物质的溶剂或溶剂混合物混溶；(3)搅拌下将(1) 和(2)的溶液加到一起；以及(4)除去不想要的溶剂，制得纳米颗粒的胶 状悬浮体。′528专利公开了在没有供应能量下可制得小于500nm的物 质颗粒。
相反转析出
一种适合的相反转析出公开在美国专利6,235,224，6,143,211和美 国专利申请2001/0042932中，其被引入本发明作为参考并成为本发明 的一部分。相反转是用于描述连续相溶剂体系中的溶解的聚合物转化 成固体高分子网络的物理现象的术语，其中聚合物是连续相。诱导相 反转的一种方法是将非溶剂加到连续相中。聚合物发生从单相到不稳 定的两相混合物的转变：聚合物富集部分和聚合物贫乏部分。聚合物 富集相中的非溶剂胶束滴用作成核位置，并用聚合物涂布。′224专利公 开了在某些条件下聚合物溶液的相反转可以自发形成包括纳米颗粒的 离散微米颗粒。′224专利公开了在溶剂中溶解或分散聚合物。药剂也溶 解或分散在溶剂中。为使晶体成种步骤在该方法中有效，需要药剂溶 解在溶剂中。聚合物，药剂和溶剂一起形成具有连续相的混合物，其 中溶剂是连续相。然后将混合物加入至少10倍过量的可混溶的非溶剂 中，使得自发形成微胶囊化的平均粒径10nm～10μm的药剂微米颗粒。 粒径受溶剂非溶剂体积比，聚合物浓度，聚合物-溶剂溶液的粘度，聚 合物的分子量，和溶剂-非溶剂对的特性的影响。该方法例如通过形成 溶剂的乳状液避免了产生微滴的步骤。该方法也避免了搅拌和/或剪切 力。
pH移位析出
pH移位析出技术通常包括在药物溶解的一定pH溶液中溶解药物 的步骤，然后改变pH到药物不再溶解的步骤。取决于特定的药物化合 物，pH可以是酸性的或碱性的。然后中和溶液，形成药物活性化合物 的亚微米尺寸颗粒的预悬浮体。一种适合的pH移位析出方法公开在美 国专利5,665,331中，其被引入本发明作为参考并成为本发明的一部分。 该方法包括以下步骤：在碱性溶液中使药剂与晶体生长调节剂(CGM) 一起溶解，然后在适合的表面改性用表面活性剂存在下，用酸中和溶 液形成药剂的微颗粒分散体。析出步骤后可以进行渗滤清洗分散体的 步骤，然后将分散体浓度调节到所需水平。据报道，这种方法形成的 微晶颗粒根据光子相关光谱测量的Z-平均直径小于400nm。
pH移位析出方法的其他例子公开在美国专利5,716,642； 5,662,883；5,560,932；以及4,608,278中，其被引入本发明作为参考并 成为本发明的一部分。
注入析出方法
适合的注入析出技术公开在美国专利4,997,454和4,826,689中， 其被引入本发明作为参考并成为本发明的一部分。首先，在适合的有 机溶剂中溶解适合的固体化合物，形成溶剂混合物。然后，在约-10℃～ 约100℃的温度下，将可与有机溶剂混溶的析出非溶剂注入溶剂混合 物中，注入速率约0.01ml/分钟～约1000ml/分钟/50ml体积，制得析出 的化合物非凝聚固体颗粒的悬浮体，基本上均匀的平均直径小于10 μm。搅动(例如，通过搅拌)注入析出非溶剂的溶液是优选的。非溶剂 可以含有表面活性剂，以稳定颗粒，防止凝聚。然后颗粒与溶剂分离。 取决于固体化合物和所需的粒径，可以根据本发明改变温度、非溶剂 与溶剂之比、注入速率、搅拌速率和体积等参数。粒径与非溶剂：溶 剂体积之比以及注入温度成正比，并与注入速率和搅拌速率成反比。 析出非溶剂可以是水性的或非水性的，这取决于化合物的相对溶解度 和所需的悬浮载体。
温度移位析出
温度移位析出技术，也称作热熔技术，公开在Domb的美国专利 5,188,837中，其被引入本发明作为参考并成为本发明的一部分。在该 发明的一个实施方案中，通过如下步骤制备脂球：(1)在熔融的载体中 熔融或溶解待输送的物质如药物，形成待输送的物质的液体；(2)在高 于物质或载体的熔融温度的温度下将磷脂及水性介质一起加到熔融的 物质或载体中；(3)在高于载体的熔融温度的温度下混合悬浮体，直到 得到均匀的微制剂；然后(4)快速冷却制剂到室温或以下。
溶剂蒸发析出
溶剂蒸发析出技术公开在美国专利4,973,465中，其被引入本发明 作为参考并成为本发明的一部分。′465专利公开了制备微晶的方法，包 括以下步骤：(1)提供溶解在共用有机溶剂或溶剂组合中的药物组合物 和磷脂的溶液，(2)蒸发一种溶剂或多种溶剂，和(3)使通过剧烈搅拌 蒸发水溶液中的一种溶剂或多种溶剂得到的薄膜悬浮。通过向溶液加 入能量蒸发足量的溶剂来除去溶剂，析出化合物。也可以通过其他公 知技术除去溶剂，如向溶液施加真空，或在溶液上方吹氮气。
反应析出
反应析出包括在适合的溶剂中溶解药物化合物而形成溶液的步 骤。化合物的加入量应在化合物在溶剂中的饱和点或其下。通过与化 学试剂反应修饰化合物，或通过加入能量如热量或UV光等进行修饰， 使得修饰的化合物在溶剂中具有更低溶解度并从溶液析出。
压缩流体析出
通过压缩流体而析出的适合技术公开在美国专利6,576,264中，其 被引入本发明作为参考并成为本发明的一部分。该方法包括在溶剂中 溶解水不溶性药物而形成溶液的步骤。然后将溶液喷射进压缩流体中， 流体可以是气体、液体或超临界流体。向溶质在溶剂的溶液中加入压 缩流体，使溶质达到或接近超饱和态，并析出微颗粒。在这种情况下， 压缩流体用作反溶剂，反溶剂用于降低溶解药物的溶剂的内聚能量密 度。
可选择地，药物可以溶解在压缩流体中，然后喷射进水相中。压 缩流体的快速膨胀降低的流体的溶剂能力，这反过来使得溶质作为水 相中的微颗粒析出。在这种情况下，压缩流体用作溶剂。
制备颗粒的其他方法
通过机械研磨活性剂也可以制备本发明的颗粒。机械研磨包括诸 如喷射研磨，珠磨，球磨，锤磨，流体能量研磨等技术，或湿磨技术， 如公开在美国专利5,145,684中的那些，其被引入本发明作为参考并成 为本发明的一部分。
制备本发明颗粒的另一种方法是悬浮活性剂。在这种方法中，通 过将颗粒直接加到水性介质中形成预悬浮体，使活性剂的颗粒分散在 水性介质中。颗粒通常用表面改性剂涂布以抑制颗粒凝聚。一种或多 种其他赋形剂可以加到活性剂中或加到水性介质中。
实施例1：小规模制备(300g)D-24851的悬浮体(组合物1)
将含有0.1％脱氧胆酸钠，2.2％甘油(紧张剂)，和0.142％磷酸氢二 钠(缓冲液)的水性表面活性剂溶液冷却到低温(＜10℃)。将D-24851和 Poloxamer 188的乳酸溶液加到上述表面活性剂溶液中。经混合这两种 溶液形成悬浮体。总悬浮体重量为300g，药物浓度约1％(w/w)。析出 后立即进行高压均质化，压力约10,000psi，温度＜70℃。离心除去乳 酸，悬浮体再次均质化，约10,000psi，温度＜70℃。均质化后，使用 光散射检测悬浮体粒径。平均粒径约190nm。
实施例2：制备2,000g D-24851的悬浮体(组合物2)
将含有0.1％脱氧胆酸钠，2.2％甘油(紧张剂)，和0.142％磷酸氢二 钠(缓冲液)的水性表面活性剂溶液冷却到低温(＜10℃)。将D-24851和 Poloxamer 188的乳酸溶液加到上述表面活性剂溶液中。经混合这两种 溶液形成悬浮体。总悬浮体重量为2,000g，药物浓度约1％(w/w)。析 出后立即进行高压均质化，压力约10,000psi，温度＜70℃。离心除去 乳酸，悬浮体再次均质化，约10,000psi，温度＜70℃。均质化后，使 用光散射检测悬浮体粒径。平均粒径约325nm。
实施例3：大规模制备(6,000g)D-24851的悬浮体(组合物3)
将含有0.1％脱氧胆酸钠，2.2％甘油(紧张剂)，和0.142％磷酸氢二 钠(缓冲液)的水性表面活性剂溶液冷却到低温(＜10℃)。将D-24851和 Poloxamer 188的乳酸溶液加到上述表面活性剂溶液中。经混合这两种 溶液形成悬浮体。总悬浮体重量为6,000g，药物浓度约1％(w/w)。析 出后立即进行高压均质化，压力约10,000psi，温度＜70℃。离心除去 乳酸，悬浮体再次均质化，约10,000psi，温度＜70℃。均质化后，使 用光散射检测悬浮体粒径。平均粒径约370nm。
实施例4：本发明的纳米悬浮体的稳定性
使用加速应力(热循环，搅拌，冷冻-解冻，和离心)以及在5℃下 贮存达到6个月测试悬浮体的稳定性。平均粒径没有明显变化，99％和 100％值(对于组合物3)。此外，在任一种应力测试中都没有观察到凝聚。 通过在声波处理之前和之后的1分钟测量粒径来评价凝聚，和使用以 下等式计算凝聚百分比：
凝聚％＝(P99-P99S)×100/P99S
其中P99代表在声波处理之前粒径分布的99％，P99S代表在声波处 理之后粒径分布的99％。
实施例5：D-24851(″组合物4)
本发明的优选组成：
成分               浓度
D-24851           10mg/g
Poloxamer 188     1mg/g
脱氧胆酸，钠盐    1mg/g
甘油              22mg/g
磷酸氢二钠        1.42mg/g
NaOH溶液，HCl溶液 用于pH调节
注射用水          调节到总重100g
pH                8.5
实施例6：Solutol/丙二醇制剂(组合物5)
制备以下组合物与本发明的组合物作比较。
每500g溶液组成：
D-24851            1.0g(0.2％，w/w)
Solutol HS15       375.0g
1，2-丙二醇        125.0g
实施例7：乳酸制剂(组合物6)
制备以下组合物与本发明的组合物作比较。乳酸制剂是用于口服 给予的D-24851的过饱和溶液。由于过饱和的药物浓度和物理不稳定 性，因此，重要的是溶液必须在给予之前新制。药物以制剂组提供。 这些组包括如下的3个小瓶或3个容器：
药物小瓶的内容(小瓶1)
1个小瓶/容器(100mL容器)，含有：
Indibulin(D-24851)       60.0mg
溶剂小瓶A的内容(小瓶2)
1个小瓶/容器(10mL容器)，含有：
乳酸90％           9041.3mg
溶剂小瓶B的内容(小瓶3)
1个小瓶/容器(75mL容器)，含有：
葡萄糖             5705.5mg
西番莲香精         10.0mg
纯水               51347.0mg
制备后D-24851-乳酸饮用溶液的组成
1个小瓶/容器，含有：
成分                 量
D-24851            60.0mg
乳酸               7269.2mg
葡萄糖             5601.8mg
西番莲香精         9.8mg
纯水               50413.4mg
实施例8：优选的组合物
  成分     浓度   式1的化合物     范围     0.1％-10％w/w   第一优选的表面活性剂(或类)   非离子表面活性剂，例如poloxamer     范围     0.01％-5％w/w   第二优选的表面活性剂(或类)   阴离子或两性离子表面活性剂，例如胆酸   盐，磷脂，或混合物     范围     0.01％-5％w/w   赋形剂1   缓冲剂，例如磷酸钠     范围     1-50mM   赋形剂2   紧张剂，例如甘油或海藻糖     范围     1％-5％w/w
实施例9：优选的组合物
表1-通过直接均质化形成的D-24851悬浮体制剂批料
  批号     表面活性剂1 表面活性剂2 紧张剂 缓冲液   1     磷脂E80，1.2％ - 海藻糖，4％ Na2HPO4，0.142％   2     磷脂E80，1.2％ - 甘油，2.2％ Na2HPO4，0.142％   3     磷脂E80，1.2％ DMPG，0.1％ 海藻糖，4％ Na2HPO4，0.142％   4     DMPC，1.2％ DMPG，0.1％ 海藻糖，4％ Na2HPO4，0.142％   5     大豆磷脂100H，     1.2％ DMPG，0.1％ 海藻糖，4％ Na2HPO4，0.142％   6     磷脂E80，1.2％ 脱氧胆酸钠，0.1％ 甘油，2.2％ Na2HPO4，0.142％   7     磷脂E80，0.6％ 脱氧胆酸钠，0.05％ 甘油，2.2％ Na2HPO4，0.142％   8     磷脂E80，2.4％ - 甘油，2.2％ Na2HPO4，0.142％   9     磷脂E80，2.4％ 脱氧胆酸钠，0.1％ 甘油，2.2％ Na2HPO4，0.142％
表2-通过微析出/直接均质化形成的D-24851悬浮体制剂批料
    批号  表面活性剂1 表面活性剂2 紧张剂 缓冲液     10  磷脂E80，1.2％ - 甘油，2.2％ Na2HPO4，0.142％     11  磷脂E80，1.2％ 脱氧胆酸钠，0.1％ 甘油，2.2％ Na2HPO4，0.142％     12  Poloxamer 188(0.1％) 脱氧胆酸钠，0.1％ 甘油，2.2％ Na2HPO4，0.142％     13  Solutol HS-15(1.5％) - 甘油，2.2％ Na2HPO4，0.142％     14  E80，1.2％ 羟乙基淀粉，1％ 甘油，2.2％ TRIS，0.06％
实施例10：
比较研究组合物4，5和6的生物利用度和药代动力学
在交叉设计中，对6只猕猴(3只雄性和3只雌性)进行研究。口服 和静脉给予测试药物组合物。
剂量方案如下：
A：组合物6，p.o.，5mg/kg/剂量
B：组合物4，p.o.，5mg/kg/剂量
C：组合物4，i.v.，5mg/kg/剂量
D：组合物5，i.v.，0.2mg/kg/剂量
在以下时间采集所有动物的血液样品：
口服：之前以及给予之后0.5，1，2，4，6，8，10，12，16，20， 24，30，36，42，48和54h。在给予后60h采集额外的血液样品(组合 物4)。
静脉：之前以及给予之后0.033，0.083，0.17，0.25，0.5，0.75， 1，2，3，4，5和6h。在给予后10，16，24，36，48和60h采集额 外的血液样品(组合物4)。
样品收集：在含有Li-肝磷脂的管中收集血液样品，并离心得到血 浆。对于静脉给予组合物4的动物，样品分成两个相似的等份试样。 一个样品离心得到血浆，全血液的另一个样品与测试血浆样品在约-20° 下一起保存。通过有效的HPLC方法测定Indibulin的血浆和血液浓度。 定量限(LOQ)是2ng/ml。得到的测试样品体积约100-300μl。得到的血 浆和血液浓度用于非区分性药代动力学评价。
口服和静脉给予之后，D-24851的中值血浆和血液浓度-时间分布 在表1和表2中给出：
表3
  静脉或口服给予之后D-24851的药代动力学参数   血浆浓度   平均geo   (95％CIin)     中值     (Min-Max)   组成     途径   Cmax   [ng/ml]   AUCo-t持续   [ng·h/ml]     AUC     [ng·h/ml]     CL     [ml/min/kg]     Vss     [l/kg]   Vz   [l/kg]     MRT     [h]     tmax     [h]     t1/2     [h]   solu/丙二醇1)   0.2mg/kg     i.v.   401   (279-576)   287   (228-360)     319     (249-409)     10.5     (8.16-13.4)     1.14     (0.82-1.59)   1.73   (1.06-2.80)     1.82     0.18-2.80)     0.06     (0.03-0.08)     1.85     (1.01-3.47)   组合物4-D-24851纳   米悬浮体2)   5mg/kg     i.v.   586   (349-985)   5501   (3947-7666)     6374    (4357-9325)      -     -   27.4*   (15.5-48,2)     25.8     (17.8-37.6)     0.06     (0.03-0.08)     26.7     (23.7-50.0)   乳酸3)   5mg/kg     p.o.   59.1   (22.2-157)   676   (356-1284)     803    (405-1592)      -     -   10.3   (4.05-26.3)     15.2     (8.73-26.6)     4.00     (2.00-16.0)     12.8     (6.18-15.3)   组合物4-D-24851纳   米悬浮体2)   5mg/kg     p.o.   27.8   (15.3-50.4)   182   (119-281)     -      -     -   -     -     6.00     (4.00-6.00)     -
表3静脉或口服给予后D-24851的药代动力学参数(血浆浓度)
1)n＝6，2)n＝5，3)n＝4
*血浆浓度表现出具有吸收相的非典型性曲线进展。因此通过使用全身性可用的给予剂量分数计算表观分布容 积。
表4
    静脉或口服给予之后D-24851的药代动力学参数     血液浓度     平均geo     (95％CIin)     中值     (Min-Max)     配方   途   径     Cmax     [ng/ml]   AUCo-t持续   [ng·h/ml]     AUC     [ng·h/ml]     CL     [ml/min/kg]     Vss     [l/kg]     Vz     [l/kg]   MRT   [h]     tmax     [h]     t1/2     [h]     组合物     4-D-24851纳米     悬浮体2)     5mg/kg   i.v.     47516     (35571-63472)   13375   (9233-19374)     14023     (9736-20198)     5.94     (4.13-8.56)     2.60     (1.02-6.65)     11.6     (5.93-22.7)   7.30   (3.27-16.3)     0.03     (0.03-0.03)     20.0     (11.2-41.8)     组合物     4-D-24851纳米     悬浮体1)     5mg/kg   p.o.     17.2     (12.0-24.6)   131.5   (81.5-212)     -     -     -     -   -     6.00     (4.00-12.0)     -
1)n＝5；2)n＝6
表4静脉或口服给予后D-24851的药代动力学参数(血液浓度)
在实施例10所述的方案中，D-24851的纳米悬浮体制剂，优选组 合物4，其特征是I.V.注射之后的缓释药代动力学。如表1和表2以及 图1所示，与组合物5相比，组合物4的静脉注射没有产生典型i.v.血 浆曲线。代替D-24851血浆浓度的高cmax值和快速指数下降的是，得 到缓释分布。当D-24851的有效浓度预期超过100mg/ml时，纳米悬浮 体(组合物4)的效力将超过15小时，而solutol溶液(组合物5)的效力将 仅小于2小时。
假设0.2-5mg/kg的剂量线性，基于相对于静脉给予组合物5的0.2 mg/kg剂量的Solutol/丙二醇溶液的血浆AUC值，对不同组合物计算绝 对生物利用度。
单次口服给予5mg/kg的10％水性乳酸溶液之后，组合物4的绝 对生物利用度计算为11.5％。
由于乳酸含量高，因此乳酸溶液(组合物6)极苦，引起呕吐，忍受 性差。另一方面，纳米悬浮体(组合物4)提供了有吸引力的选择，因为 所有乳酸都被除去，因此纳米悬浮体忍受性更好。
由于i.v.注射组合物4之后，所示的药代动力学性能和因此 D-24851的血浆半衰期增大，在注射后由于更低的Cmax值，获得了了 更好的耐受性。组合物4的总耐受性也提高，因为给予至哺乳动物的 D-24851的总剂量在整个治疗循环中下降。此外，由于组合物4的有效 血浆水平比组合物5长几倍，所以得到了更长的给药间隔；给予至哺 乳动物的频率在整个治疗周期中下降，并仍实现了肿瘤抑制的同样功 效，但与更频繁给予溶液相比，副作用明显降低。
实施例11：比较组合物4的毒性分布
为评价组合物4的亚慢性毒性，在4周的时间方案内治疗狗(3只 雄性和3只雌性)。组合物4以不同剂量水平静脉注射：2.61mg/kg，5.62 mg/kg和12.1mg/kg。
在以下时间采集所有动物的血液样品：
应用后1h，2h，4h，8h，16h，24h，36h和48小时。使用 HPLC测量D-24851的浓度水平。
如表3和表4所示，D-24851血浆浓度与剂量有关。血浆分布与 第1天和第27天给予的量级相似。
表5
D-24851的药代动力学参数 平均ar(n＝3对于每种性别) (min-max) 第1天 剂量 [mg/kg] 性别 Cmax，sd [ng/ml] tmax，sd [h] AUCsd [ng·h/ml] AUCτ，sd [ng·h/ml] t1/2 [h] CL/f [ml/(min·kg)] 2.61 雄性 147 (130-166) 1.67 (1.00-2.00) nc nc nc nc 雌性 210 (183-258) 1.67 (1.00-2.00) nc 3403 (2945-3705) 41.0* (19.7-81.7) nc 5.62 雄性 241 (190-267) 2.00 (2.00-2.00) 2468 (2347-2654) 2593 (2488-2784) 6.63 (6.04-7.28) 38.1 (35.3-39.9) 雌性 279 (271-289) 2.00 (2.00-2.00) nc 3543 (2855-4633) 20.00* (4.49-45.4) nc 12.1 雄性 592 (552-618) 2.67 (2.00-4.00) 6981 (5994-8338) 6874 (5914-7937) 8.74 (5.26-12.0) 29.5 (24.2-33.6) 雌性 860 (414-1483) 2.33 (1.00-4.00) 8254 (3873-13082) 7666 (4054-11217) 11.6 (4.70-22.3) 31.1 (15.4-52.1)
*由于不充分的曲线拟合，这些值仅用于定向
表5 D-24851的药代动力学参数(第1天)
表6
  D-24851的药代动力学参数   平均ar(n＝3对于每种性别)   (min-max)   第27天   剂量   [mg/kg] 性别    Cmax，md    [ng/ml]     tmax，md     [h]   AUCO-t持续，md   [ng·h/ml]   AUCτ，md   [ng·h/ml]     t1/2     [h]     CL/f     [ml/(min·kg)     ]   2.61 雄性    224    (147-290)     1.33     (1.00-2.00     )   1447   (1240-1586)   1736   (1574-1865   )     40.7     (35.0-46.7     )     nc 雌性    148    (138-164)     2.33     (1.00-4.00     )   1104   (1049-1178)   1413   (1356-1485   )     28.3*     (22.3-31.7     )     nc   5.62 雄性    186    (176-200)     2.33     (1.00-4.00     )   1323   (1065-1460)   1852**   (1840-1864   )     5.10′*     (4.99-5.22     )     38.1     (35.3-39.9) 雌性    315    (271-376)     2.33     (1.00-4.00     )   2737   (2265-3085)   2963   (2616-3189   )     14.8     (7.02-30.3     )     nc   12.1 雄性    435    (396-460)     2.67     (2.00-4.00     )   5558   (4935-6738)   5621   (4935-6738   )     11.9     (10.1-12.9     )     29.5     (24.2-33.6) 雌性    329    (286-390)     2.67     (2.00-4.00     )   4853   (4059-5564)   4853   (4059-5564   )     24.2     (22.4-27.6     )     31.1     (15.4-52.1)
*由于不充分的曲线拟合，这些值仅用于定向
表5 D-24851的PK参数(第27天)
得到的缓释分布由于其作用模式，对于D-24851和本发明的其他 微管蛋白抑制剂是特别有益的。对于微管蛋白抑制剂，重要的是在增 殖细胞的特异循环中提供有效药物浓度。由于在同一时间并不是所有 细胞都处于同一细胞循环中，因此需要在长时间内提供足够血浆浓度， 以尽可能对多种癌症细胞有治疗效果。本发明特别用于高毒性抗肿瘤 剂如D-24851，因为能够降低总剂量，并因此可以提供变化的治疗方案。 因此，肠胃外给予组合物4的药代动力学分布优点应比传统组合物具 有更高的药物功效。
本发明还涉及治疗哺乳动物、优选人类的方法，包括给予哺乳动 物治疗有效量的本发明的组合物。通常，这种量为约0.01mg/kg～约100 mg/kg的微管蛋白抑制剂，以大丸药给予或通过可控速率给予。优选地， 剂量为约0.1mg/kg～约10mg/kg。
本领域临床医生基于诸如待治疗病症的精确性质、病症的严重程 度、患者的年龄和一般身体条件等因素，可以确定给予途径(例如，局 部、肠胃外或口服)和剂量方案。选择的具体制剂类型取决于各种因素， 如化合物、给予频率和待治疗的疾病。
如上所述，本发明的组合物用于治疗癌症的用途是本发明特别重 要的方面。待治疗的癌症类型包括但不限于转移性癌，包括转移性癌 的扩散，耐抗癌剂的肿瘤，对微管蛋白抑制剂敏感的肿瘤，或其组合。 可以治疗的其他医学病症包括但不限于自体免疫疾病，哮喘和过敏性 反应和炎性疾病，包括但不限于胰腺炎，脓毒性休克，过敏性鼻炎， 和风湿性关节炎。也可以给予本发明的组合物作为免疫抑制剂和用于 其他免疫调节活性。
实施例12：在大鼠中组合物4&5的IV药代动力学比较研究
在大鼠中研究D-24851纳米悬浮体(组合物4)静脉药代动力学。通 过改变YoshidaAH13肉瘤移植的SC在大鼠模型中的剂量和频率，监 视随后的肿瘤生长，来优化剂量方案。尾静脉中的IV治疗在0.1g肿 瘤重量开始。在1个月的研究中测定大鼠中的药代动力学，剂量IV q2d 2、5和10mg/kg，通过HPLC分析血浆和全血液样品。在雄性大鼠(n＝3) 中10mg/kg IV给予14C-D-24851之后，测定组织分布，与0.25mg/kg IV 有机溶液中的D-24851(n＝4)作比较，也用于PK比较。
纳米悬浮体的平均粒径为260nm，其中99％＜0.540μm。给药频率 可降低到每周两次，同时提高剂量水平，结果产生98％的肿瘤抑制， 表7。在优化的方案中，药物水平的重要性示于图6。
表7
    方案     剂量     总剂量     肿瘤抑制     给予/14d     (mg/kg)     (mg/kg)     (％)     14     5     70     66     7     10     70     100     6     10     60     88     4     15     60     98
表7.肿瘤抑制与给予频率和剂量的相关性。
单次给予后的静脉药代动力学揭示出，血浆浓度上升，在2小时 的tmax得到Cmax，然后在数小时内缓释水平，然后开始排泄相，图7。 当AUC增加到很大程度时，观察到与Cmax的剂量比例性，可能反映了 代谢酶的饱和，表8。有机溶液中的微小浓度大大地降低了AUC，tmax， 和t1/2。
表8
 剂型    剂量   Cmax  tmax   AUC   t1/2    (mg/kg)   (ng/ml)  (h)   (ng·h/ml)   (h)   M   F  M   F   M   F   M   F  D-24851纳米悬  浮体(组合物4)    2   80.4   90.8  2   2   517   663   12   6.4  D-24851纳米悬  浮体(组合物4)    5   155   172  2   2   921   1775   3.6   7.2  D-24851纳米悬  浮体(组合物4)    10   297   373  2   2   2729   5016   5.7   9.5  Solutol/丙二醇  溶液(组合物5)    0.25   83.5   92.8  0.2   0.1   80.6   73   1.1   0.7
表8.单次给药IV给予D-24851纳米悬浮体(组合物4)和Solutol/ 丙二醇溶液(组合物5)至大鼠的PK参数
在大鼠中重复IV给予10mg/kg q2d，第15天之后表明可与第1天 之后相比的AUC和Cmax，图8。因此，没有观察到可测量的药物累积。 相对于雄性大鼠，雌性大鼠表相出增大的AUC和t1/2。通常，高加载 的延长药代动力学支持了观察的方案相关性，包括频繁给予高药物量。 相比而言，Solutol/丙二醇溶液制剂(组合物5)提供了有限的剂量，具有 极短时间的药物水平。
延长的PK与14C ADME研究观察到的组织分布结果一致。初始 IV给予之后，在MPS的器官肝和脾中观察到高水平，随后下降。相比 而言，使用药物的Solutol/丙二醇溶液(组合物5)，肝水平随时间变化缓 慢增加。随着D-24851纳米悬浮体配制的药物(组合物4)从MPS组织 的缓慢释放，其他器官如脂肪和肠中的水平增加。对于组合物5，相比 而言，药物水平起初在这些其他组织中到达峰值，随后下降，表9。在 Solutol/丙二醇溶液载体中，由于毒性原因，仅有0.25mg/kg药物可被 输送到大鼠。相比而言，D-24851纳米悬浮体中的10mg/kg药物被给 予。
表9
    14C-D-24851 ADME组织分布(％)     组合物4     组合物5     组织     6h     18h     30h     48h     4h     8h     24h     48h     肝     33     18     24     17     11     11     13     20     脾     6.7     3.2     2.7     2.6     1.2     1.2     1.3     1.6     小肠     4.8     4.4     6.7     4.7     9.9     4.4     3.8     3.1     脂肪     5.9     18     11     24     19     22     15     11
表9.IV给予后的组织分布：D-24851vs.Solutol/丙二醇溶液
对于D-24851观察剂量相关性抗癌效果，需要IV输送的足够加载 制剂。使用晶体纳米悬浮体可以满意地完成这一点。组织分布表明， 纳米悬浮体起初以MPS的器官肝和脾为靶。随后，药物明显释放，药 物的组织水平在预期对疏水性药物具有亲合性的其他器官中例如脂肪 上升。药代动力学表明，在IV给予之后，血浆中水平上升，与可溶解 药物从开始贮存的释放一致，得到延长的药物水平，这是功效所需要 的。
与组合物5的Solutol/丙二醇溶液制剂相比，组合物4的D-24851 纳米悬浮体允许相当高的剂量(15vs.0.25mg/kg)，并得到延长的血浆浓 度水平。基于细胞循环敏感性溶癌的作用机理，如初步功效研究所示， 这种缓释活性预期具有高功效。组织分布研究与药代动力学表明的IV 贮存效果一致。
通过利用本发明的组合物，发现之前被认为存在生物利用度问题 的药物在剂型中具有优异的生物利用度。