本申请要求于2002年7月1日申请的美国临时专利申请第 60/392,455号和与2002年7月3日申请的美国临时专利申请第 60/393,423号的优先权，所述专利申请的全部内容通过引用全部结合 到本文中。

                         1.引言

本发明涉及用于保护、维持、增强或恢复哺乳动物效应细胞及 其相关细胞、组织和器官的功能或活力的具有一个或多个氨基酸取 代的突变蛋白重组组织保护性细胞因子，涉及包含所述细胞因子的 药用组合物。这包括保护诸如神经元和心脏组织等可兴奋组织免于 神经毒素、低氧和其它不利刺激，并包括增强可兴奋组织功能，例 如用于促进学习和记忆。本发明还涉及使用突变蛋白重组组织保护 性细胞因子用于转运分子或促进分子通过胞转作用穿越内皮屏障的 转运的组合物。

                       2.发明背景

多年以来，人们只清楚红细胞生成素的生理作用是控制红细胞 的产生。近年来，一些证据表明，红细胞生成素作为细胞因子超家 族成员，具有通过与红细胞生成素受体(红细胞生成素-R)相互作用介 导的其它重要生理功能。这些作用包括有丝分裂发生、钙流入平滑 肌细胞和神经细胞的调节、血管活性作用即血管收缩/血管舒张、超 活化血小板和对中间代谢的影响。据信，红细胞生成素提供用于改 善含氧量低的细胞微环境以及调节由代谢应激引起的凋亡细胞死亡 的补偿反应。虽然研究已确定，颅内注射红细胞生成素能保护神经 元免遭含氧量低的神经元伤害，但是，颅内给药对于治疗应用、尤 其是对正常个体来说是不切实际的，也是不可接受的给药途径。此 外，以前对贫血患者给予红细胞生成素的研究已有结论，即外周给 予红细胞生成素不会输送到脑部(Marti等，1997，Kidney Int.51：416-8； Juul等，1999，Pediatr.Res.46：543-547；Buemi等，2000，Nephrol.Dial. Transplant.15：422-433)。

已经描述了具有针对改进所述分子红细胞生成活性的活性的红 细胞生成素的各种修饰形式，例如在其羧基端具有改变的氨基酸的 修饰形式，描述于美国专利5,457,089和美国专利4,835,260；每个分 子中具有不同数目的唾液酸残基的红细胞生成素同种型，例如描述 于美国专利5,856,298；多肽，描述于美国专利4,703,008；激动剂， 描述于美国专利5,767,078；与红细胞生成素受体结合的肽，描述于 美国专利5,773,569和5,830,851；和小分子模拟物，描述于美国专利 5,835,382。

本发明涉及重组组织保护性细胞因子在原位和离体保护、维持、 增强或恢复效应细胞和相关细胞、组织和器官中的用途，以及为了 保护和增强离开血管系统的效应细胞和相关细胞、组织和器官的目 的而递送重组组织保护性细胞因子穿越内皮细胞屏障或者携带相关 分子穿越内皮细胞屏障的用途。

                       3.发明概述

在一个方面，本发明涉及各种形式的重组组织保护性细胞因子 在制备用于保护、维持、增强或恢复哺乳动物效应细胞及其相关细 胞、组织和器官的功能或活力的药用组合物中的用途。在一个具体 的方面，所述哺乳动物效应细胞及其相关细胞、组织或器官因为紧 密的内皮细胞屏障而远离血管系统。在另一个具体的方面，所述细 胞、组织、器官或其它机体部分是从哺乳动物体内分离的部分，例 如预期用于移植的部分。作为非限制性实例，效应细胞或组织可以 是神经元细胞、视网膜细胞、肌细胞、心细胞、肺细胞、肝细胞、 肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、肾上腺髓质细胞、毛细血管 内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、骨细胞、皮肤细胞或 子宫内膜细胞或组织。此外，效应细胞的非限制性实例包括感光细 胞(杆细胞和锥细胞)、神经节细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细 胞、米勒(Müeller)细胞、浦肯野细胞、心肌细胞、起搏细胞、窦房结 细胞、窦房结细胞、窦结细胞、结合组织细胞、房室结细胞、房室 束细胞、肝细胞、星形细胞、肝巨噬细胞、系膜细胞、肾上皮细胞、 管状肠细胞、杯状细胞、肠腺细胞(crypt)、肠内分泌细胞、肾小球细 胞、束状细胞(fasciculate)、网状细胞、嗜铬细胞、外膜细胞、间质细 胞、滋养细胞、精细胞、成熟滤泡细胞(Graffian follicles)、原始滤泡 细胞、胰岛、α-细胞、β-细胞、γ-细胞、F-细胞、骨原细胞、破骨细 胞、成骨细胞、子宫内膜基质细胞、子宫内膜细胞、干细胞和内皮 细胞。效应细胞的这些实例仅仅是说明性的。在一个方面，所述效 应细胞或其相关细胞、组织或器官既不是可兴奋细胞、组织或器官， 占优势的也不包含可兴奋细胞或组织。在一个具体的实施方案中， 使用了上述重组组织保护性细胞因子的哺乳动物细胞、组织或器官 是在至少一种不利于所述细胞、组织或器官的活力的条件下已经度 过或即将度过一段时间的细胞。在一个具体的实施方案中，使用了 上述重组组织保护性细胞因子的哺乳动物细胞、组织或器官表达EPO 受体。所述条件包括创伤性原位低氧或代谢功能障碍、手术诱导的 原位低氧或代谢功能障碍或原位毒素暴露；后者可能与化疗或放疗 有关。在一个实施方案中，所述不利条件是例如用于某些外科手术 的心肺分流术(心肺机)的结果。

本发明的重组组织保护性细胞因子可用于以下人类疾病的治疗 性治疗或预防性治疗：主要具有神经病学症状或精神病学症状的中 枢神经系统(CNS)疾病或周围神经系统疾病、以及眼病、心血管疾病、 心肺疾病、呼吸道疾病、肾病、尿道疾病和生殖道疾病、胃肠道疾 病和内分泌异常和代谢异常。

本发明也涉及包含给予哺乳动物、最好是人类的特定的上述重 组组织保护性细胞因子的药用组合物。所述药用组合物可配制成供 口服、鼻内或胃肠外给药用，或者以用于维持离体细胞、组织或器 官活力的灌注液形式。

用于上述目的的重组组织保护性细胞因子可以是突变蛋白或遗 传修饰的红细胞生成素，也就是在天然分子氨基酸骨架至少有一个 修饰的红细胞生成素。“变异蛋白”或“突变蛋白”是指包含突变 氨基酸序列的蛋白并包括因氨基酸缺失、取代或这两者而不同于天 然红细胞生成素氨基酸序列的多肽。“天然序列”是指与基因或蛋白 的野生型或天然形式相同的氨基酸序列或核酸序列。此外，在一个 实施方案中，本发明的重组组织保护性细胞因子具有细胞保护活性， 但也具有红细胞生成素对骨髓的一个或多个效应，即增加血细胞比 容(红细胞发生)、血管活性作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血小板、 增加凝血细胞的产生和促凝血活性。在另一个实施方案中，本发明 的重组组织保护性细胞因子具有细胞保护活性，但不具有红细胞生 成素对骨髓的一个或多个效应，即增加血细胞比容(红细胞发生)、血 管活性作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血小板、增加凝血细胞的产 生和促凝血活性。优选本发明的细胞保护性重组组织保护性细胞因 子缺乏红细胞生成素对骨髓的至少一个效应；更优选重组组织保护 性细胞因子缺乏红细胞生成活性；最优选重组组织保护性细胞因子 缺乏红细胞生成素对骨髓的所有效应。

作为非限制性实例，可以对天然红细胞生成素分子的一个或多 个氨基酸进行改变或缺失或向其上添加一个或多个氨基酸。在一个 优选的实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子在一个或多个以 下区具有一个或多个修饰：VLQRY(天然人红细胞生成素的氨基酸 11-15；SEQ ID NO：1)和/或TKVNFYAW(天然人红细胞生成素的氨 基酸44-51；SEQ ID NO：2)和/或SGLRSLTTL(天然人红细胞生成素 的氨基酸100-108；SEQ ID NO：3)和/或SNFLRG(天然人红细胞生成 素的氨基酸146-151；SEQ ID NO：4)。在SEQ ID NO：10的氨基酸7、 20、21、29、33、38、42、59、63、67、70、83、96、126、142、143、 152、153、155、156和161上也可提供其它突变。这些其它突变可 以是单独的，或者除了至少一个上述区的至少一个突变外还有这些 其它突变。在某些实施方案中，在TKVNFYAW的一个或多个氨基 酸的变化(天然人红细胞生成素的氨基酸44-51；SEQ ID NO：2)产生 具有部分功能(即具有比rhu-EPO更低的红细胞生成活性)的修饰红细 胞生成素分子。在其它实施方案中，SGLRSLTTL(天然人红细胞生 成素的氨基酸100-108；SEQ ID NO：3)的一个或多个氨基酸的变化产 生具有部分功能(即具有比rhu-EPO更低的红细胞生成活性)的重组组 织保护性细胞因子。上述重组组织保护性细胞因子表现出组织保护 活性或细胞保护活性。至于红细胞生成活性，上述重组组织保护性 细胞因子缺乏红细胞生成活性或表现出在一种或多种红细胞生成活 性的降低。红细胞生成活性的实例包括增加血细胞比容、血管收缩、 超活化血小板、促凝血活性和增加凝血细胞的产生。可以用本领域 的标准技术测定红细胞生成活性。例如，可以采用6.17小节描述的 UT-7细胞测定、或采用描述于Physicians′Desk Reference(Medical Economics Company，Inc.，Montvale，NJ，2000.)的技术测定血细胞比 容，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，第519-525页 和第2125-2131页公开了用于测定血细胞比容水平的方法并公开了可 用作目标以避免毒性的不同血细胞比容范围。例如，在患有慢性肾 衰竭的患者中，PDR推荐给予红细胞生成素以达到在患者中无毒目 标的血细胞比容范围从30％至36％(例如参见PDR，第523页，第1、 11栏，17-96和第2129页，第1、11栏，11.8-93，以及第2栏和第3栏 中附表)。PDR注意到，可以通过如下方法来避免红细胞增多症(以循 环红细胞数异常增加为特征的病症)形式的毒性：仔细监测血细胞比 容并调整EPO的剂量，如果红细胞比容接近目标范围的高限(对于这 一患者群体为36％)或在任何2周时间内增加达4点以上时，停止红 细胞生成素直到红细胞比容恢复到建议的目标范围(对于这一患者群 体为30％-36％；参见PDR，第523页，第1栏，以及第2129页，第1 栏，在″Dose Adjustment″下)。相比之下，对于化疗的癌症患者，PDR 建议在不同血细胞比容水平调整剂量，即如果血细胞比容超过40％ 时(参见第2129页，第2栏，在″Dose Adjustment″下)。在一个实施方 案中，所述重组组织保护性细胞因子具有一种或多种红细胞生成活 性，但其水平不足以引起副作用即超过重组组织保护性细胞因子的 细胞保护活性的治疗益处的作用。在一个实施方案中，具有一种或 多种红细胞生成活性的重组组织保护性细胞因子也可用于本发明的 方法，如果红细胞生成活性水平可测定的话。在重组组织保护性细 胞因子具有一种或多种红细胞生成活性的实施方案中，可以测定所 述红细胞生成活性并且可以调节所述细胞因子的给药量和/或给药方 案，以确保所述重组组织保护性细胞因子无毒性。在重组组织保护 性细胞因子具有一种或多种红细胞生成活性的实施方案中，可以测 定所述红细胞生成活性并且可以调节所述细胞因子的给药量和/或给 药方案以确保所述重组组织保护性细胞因子具有低毒性。在一个实 施方案中，与重组Epo相比，所述重组组织保护性细胞因子表现出 一种或多种红细胞生成活性降低约1％、2％、4％、6％、8％、10％、 15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

本发明提供缺乏至少一种选自以下活性的重组组织保护性细胞 因子：增加血细胞比容、血管收缩、超活化血小板、促凝血活性和 增加凝血细胞的产生。所述细胞因子包含至少一种选自保护、维持、 增强或恢复哺乳动物效应细胞、组织或器官的功能或活力的效应细 胞保护活性。

在本发明的一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包 含在SEQ ID NO：10的位置11-15之间[SEQ ID NO：1]、SEQ ID NO：10 的位置44-51之间[SEQ ID NO：2]、SEQ ID NO的位置100-108之间 [SEQ ID NO：3]或SEQ ID NO 10的位置146-151之间[SEQ ID NO：4] 的一个或多个改变的氨基酸残基。

在另一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含在SEQ ID NO：10的一个或多个以下位置的改变的氨基酸残基：7、20、21、 29、33、38、42、59、63、67、70、83、96、126、142、143、152、 153、155、156或161。

在又一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含具有 一个或多个下列变化的SEQ ID NO：10的氨基酸序列(每个改变的序 列都已指定一个独立的序列标识号)：SEQ ID NO：10残基6的丙氨 酸(SEQ ID NO：15)；SEQ ID NO：10残基7的丙氨酸(SEQ ID NO：16)； SEQ ID NO：10残基7的丝氨酸(SEQ ID NO：17)；SEQ ED NO：10残 基10的异亮氨酸(SEQ ID NO：18)；SEQ ID NO：10残基11的丝氨酸 (SEQ ID NO：19)；SEQ ID NO：10残基12的丙氨酸(SEQ ID NO：20)； SEQ ID NO：10残基13的丙氨酸(SEQ ID NO：21)；SEQ ID NO：10残 基14的丙氨酸(SEQ ID NO：22)；SEQ ID NO：10残基14的谷氨酸(SEQ ID NO：23)；SEQ ID NO：10残基14的谷氨酰胺(SEQ ID NO：24)；SEQ ID NO：10残基15的丙氨酸(SEQ ID NO：25)；SEQ ID NO：10残基15 的苯丙氨酸(SEQ ID NO：26)；SEQ ID NO：10残基15的异亮氨酸(SEQ ID NO：27)；SEQ ID NO：10残基20的谷氨酸(SEQ ID NO：28)；SEQ ID NO：10残基20的丙氨酸(SEQ ID NO：29)；SEQ ID NO：10残基21 的丙氨酸(SEQ ID NO：30)；SEQ ID NO：10残基24的赖氨酸(SEQ ID NO：31)；SEQ ID NO：10残基29的丝氨酸(SEQ ID NO：32)；SEQ ID NO：10残基29的酪氨酸(SEQ ID NO：33)；SEQ ID NO：10残基30 的天冬酰胺(SEQ ID NO：34)；SEQ ID NO：10残基32的苏氨酸(SEQ ID NO：35)；SEQ ID NO：10残基33的丝氨酸(SEQ ID NO：36)；SEQ ID NO：10残基33的酪氨酸(SEQ ID NO：37)；SEQ ID NO：10残基38 的赖氨酸(SEQ ID NO：38)；SEQ ID NO：10残基83的赖氨酸(SEQ ID NO：39)；SEQ ID NO：10残基42的天冬酰胺(SEQ ID NO：40)；SEQ ID NO：10残基42的丙氨酸(SEQ ID NO：41)；SEQ ID NO：10残基43 的丙氨酸(SEQ BD NO：42)；SEQ ID NO：10残基44的异亮氨酸(SEQ ID NO：43)；SEQ ID NO：10残基45的天冬氨酸(SEQ ID NO：44)；SEQ ID NO：10残基45的丙氨酸(SEQ ID NO：45)；SEQ ID NO：10残基46 的丙氨酸(SEQ ID NO：46)；SEQ ID NO：10残基47的丙氨酸(SEQ ID NO：47)；SEQ ID NO：10残基残基48的异亮氨酸(SEQ ID NO：48)； SEQ ID NO：10残基48的丙氨酸(SEQ ID NO：49)；SEQ ID NO：10残 基49的丙氨酸(SEQ ID NO：50)；SEQ ID NO：10残基49的丝氨酸(SEQ ID NO：51)；SEQ ID NO：10残基51的苯丙氨酸(SEQ ID NO：52)；SEQ ID NO：10残基51的天冬酰胺(SEQ ID NO：53)；SEQ ID NO：10残基 52的丙氨酸(SEQ ID NO：54)；SEQ ID NO：10残基59的天冬酰胺(SEQ ID NO：55)；SEQ ID NO：10残基62的苏氨酸(SEQ ID NO：56)；SEQ ID NO：10残基67的丝氨酸(SEQ ID NO：57)；SEQ ID NO：10残基70 的丙氨酸(SEQ ID NO：58)；SEQ ID NO：10残基96的精氨酸(SEQ ID NO：59)；SEQ ID NO：10残基97的丙氨酸(SEQ ID NO：60)；SEQ ID NO：10残基100的精氨酸(SEQ ID NO：61)；SEQ ID NO：10残基100 的谷氨酸(SEQ ID NO：62)；SEQ ID NO：10残基100的丙氨酸(SEQ ID NO：63)；SEQ ID NO：10残基100的苏氨酸(SEQ ID NO：64)；SEQ ID NO：10残基101的丙氨酸(SEQ ID NO：65)；SEQ ID NO：10残基101 的异亮氨酸(SEQ ID NO：66)；SEQ ID NO：10残基102的丙氨酸(SEQ ID NO：67)；SEQ ID NO：10残基103的丙氨酸(SEQ ID NO：68)；SEQ ID NO：10残基103的谷氨酸(SEQ ID NO：69)；SEQ ID NO：10残基 104的丙氨酸(SEQ ID NO：70)；SEQ ID NO：10残基104的异亮氨酸 (SEQ ID NO：71)；SEQ ID NO：10残基105的丙氨酸(SEQ ID NO：72)； SEQ ID NO：10残基106的丙氨酸(SEQ ID NO：73)；SEQ ID NO：10 残基106的异亮氨酸(SEQ ID NO：74)；SEQ ID NO：10残基107的丙 氨酸(SEQ ID NO：75)；SEQ ID NO：10残基107的亮氨酸(SEQ ID NO： 76)；SEQ ID NO：10残基108的赖氨酸(SEQ ID NO：77)；SEQ ID NO： 10残基108的丙氨酸(SEQ ID NO：78)；SEQ ID NO：10残基108的 丝氨酸(SEQ ID NO：79)；SEQ ID NO：10残基116的丙氨酸(SEQ ID NO：80)；SEQ ID NO：10残基126的丙氨酸(SEQ ID NO：81)；SEQ ID NO：10残基132的丙氨酸(SEQ ID NO：82)；SEQ ID NO：10残基133 的丙氨酸(SEQ ID NO：83)；SEQ ED NO：10残基134的丙氨酸(SEQ ID NO：84)；SEQ ID NO：10残基140的丙氨酸(SEQ ID NO：85)；SEQ ID NO：10残基142的异亮氨酸(SEQ ID NO：86)；SEQ ID NO：10残基143 的丙氨酸(SEQ ID NO：87)；SEQ ID NO：10残基146的丙氨酸(SEQ ID NO：88)；SEQ ID NO：10残基147的赖氨酸(SEQ ID NO：89)；SEQ ID NO：10残基147的丙氨酸(SEQ ID NO：90)；SEQ ID NO：10残基148 的酪氨酸(SEQ ID NO：91)；SEQ ID NO：10残基148的丙氨酸(SEQ ID NO：92)；SEQ ID NO：10残基149的丙氨酸(SEQ ID NO：93)；SEQ ID NO：10残基150的丙氨酸(SEQ ID NO：94)；SEQ ID NO：10残基150 的谷氨酸(SEQ ID NO：95)；SEQ ID NO：10残基151的丙氨酸(SEQ ID NO：96)；SEQ ID NO：10残基152的丙氨酸(SEQ ID NO：97)；SEQ ID NO：10残基152的色氨酸(SEQ ID NO：98)；SEQ ID NO：10残基153 的丙氨酸(SEQ ID NO：99)；SEQ ID NO：10残基154的丙氨酸(SEQ ID NO：100)；SEQ ID NO：10残基155的丙氨酸(SEQ ID NO：101)；SEQ ID NO：10残基158的丙氨酸(SEQ ID NO：102)；SEQ ID NO：10残基160 的丝氨酸(SEQ ID NO：103)；SEQ ID NO：10残基161的丙氨酸(SEQ ID NO：104)；或SEQ ID NO：10残基162的丙氨酸(SEQ ID NO：105)。 在一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含在SEQ ID NO： 15-105和119中具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO：10的氨基 酸序列。

在又一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含在SEQ ID NO：10氨基酸残基44-49上具有缺失的SEQ ID NO：10的氨基酸 序列。

在再一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含具有 至少一个以下变化的SEQ ID NO：10的氨基酸序列(每个改变的序列 都已指定一个独立的序列标识号)：i)SEQ ID NO：10残基45的天冬 氨酸和残基100的谷氨酸(SEQ ID NO：106)；ii)SEQ ID NO：10残基30 的天冬酰胺、残基32的苏氨酸(SEQ ID NO：107)；iii)SEQ ID NO：10 残基45的天冬氨酸、残基150的谷氨酸(SEQ ID NO：108)；iv)SEQ ID NO：10残基103的谷氨酸和残基108的丝氨酸(SEQ ID NO：109)；v) SEQ ID NO：10残基140的丙氨酸和残基52的丙氨酸(SEQID NO： 110)；vi)SEQ ID NO：10残基140的丙氨酸、残基52的丙氨酸、残 基45的丙氨酸(SEQ ID NO：111)；vii)SEQ ID NO：10残基97的丙氨 酸和残基152的丙氨酸(SEQ ID NO：112)；iix)SEQ ID NO：10残基97 的丙氨酸、残基152的丙氨酸、残基45的丙氨酸(SEQ ID NO：113)； ix)SEQ ID NO：10残基97的丙氨酸、残基152的丙氨酸、残基45 的丙氨酸和残基52的丙氨酸(SEQ ID NO：114)；x)SEQ ID NO：10残 基97的丙氨酸、残基152的丙氨酸、残基45的丙氨酸、残基52的 丙氨酸和残基140的丙氨酸(SEQ ID NO：115)；xi)SEQ ID NO：10残 基97的丙氨酸、残基152的丙氨酸、残基45的丙氨酸、残基52的 丙氨酸、残基140的丙氨酸、残基154的丙氨酸、残基24的赖氨酸、 残基38的赖氨酸、残基83的赖氨酸、残基24的赖氨酸和残基15 的丙氨酸(SEQ ID NO：116)；xii)SEQ ID NO：10残基24的赖氨酸、 残基38的赖氨酸和残基83的赖氨酸(SEQ ID NO：117)；或xiv)SEQ ID NO：10残基24的赖氨酸和残基15的丙氨酸(SEQ ID NO：118)。在一 个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含在SEQ ID NO： 106-118中具有至少一个以下氨基酸残基取代的SEQ ID NO：10的氨 基酸序列。

本发明的一个实施方案涉及上述重组组织保护性细胞因子，所 述细胞因子还包含一个或多个氨基酸的化学修饰。在另一个实施方 案中，所述化学修饰包括改变所述重组组织保护性细胞因子的电荷。 在又一个实施方案中，将正电荷或负电荷经化学方法加到氨基酸残 基上，其中带电荷的氨基酸残基被修饰成不带电荷的残基。

此外，这样的上述重组组织保护性细胞因子还可以被进一步修 饰，使其具有一个或多个氨基酸的化学修饰，例如描述于以下同时 待审的申请：2001年12月28日申请的PCT申请顺序号 PCT/US01/49479，2000年12月29日申请的美国专利申请顺序号 09/753,132，和2002年7月3日申请的美国专利申请代理公司卷号 KW00-009C02-US，这些申请中的每个都通过引用全部结合到本文 中。这些进一步的化学修饰可用于增强重组组织保护性细胞因子的 组织保护活性或者抑制重组组织保护性细胞因子对骨髓的任何效 应。在另一个实施方案中，提供额外的化学修饰以恢复所述分子的 溶解度，而该溶解度可能因上述遗传修饰而被降低，所述遗传修饰 诸如经化学方法向所述分子上添加正电荷或负电荷，如果带电荷的 氨基酸残基被修饰成不带电荷的残基的话。

作为非限制性实例，本发明的重组组织保护性细胞因子包括人 红细胞生成素突变蛋白S100E(SEQ ID NO：5)、人红细胞生成素突变 蛋白K45D(SEQ ID NO：6)和任何非红细胞生成的、仍是细胞保护性 重组组织保护性细胞因子或能有益于效应细胞、组织或器官的红细 胞生成素，它们描述于Elliott等，1997，Blood 89：493-502；Boissel等， Journal of Biological Chemistry，第268卷，第21期，第15983-15993 页(1993)；Wen等，Journal of Biological Chemistry，第269卷，第36期， 第22839-22846页(1994)；和Syed等，Nature，第395卷，第511-516 页(1998)，所述文献通过引用全部结合到本文中。本发明涉及将任何 上述重组组织保护性细胞因子用于保护、恢复和增强效应细胞、组 织和器官的使用方法。

本发明其它重组组织保护性细胞因子包括含有具有至少一个额 外修饰的至少一个遗传改变的氨基酸的上述红细胞生成素，所述额 外修饰可以是红细胞生成素分子至少一个额外氨基酸的另一个修 饰，或者是红细胞生成素分子至少一个糖的修饰。所述遗传改变的 氨基酸可以是唯一的或者这些氨基酸被进一步修饰。当然，用于本 文目的的重组组织保护性细胞因子分子与天然红细胞生成素分子相 比，可具有许多修饰，诸如所述分子的氨基酸部分的多个修饰、所 述分子的糖部分的多个修饰或所述分子的氨基酸部分的至少第二个 修饰和所述分子糖部分的至少一个修饰。所述重组组织保护性细胞 因子分子保留其保护、维持、增强或恢复哺乳动物效应细胞的功能 或活力的能力，但是与天然分子相比，重组组织保护性细胞因子与 上述无关的其它特性、想要的特性可以不存在。在一个优选的实施 方案中，所述重组组织保护性细胞因子是非红细胞生成的。

在另一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子可以被岩 藻糖基化修饰，以改变糖蛋白的糖基化模式。

本发明的一个实施方案涉及的上述重组组织保护性细胞因子是 人红细胞生成素突变蛋白。在本发明的另一个实施方案中，所述重 组组织保护性细胞因子是人苯基乙二醛红细胞生成素突变蛋白。在 本发明的另一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子是人脱 唾液酸红细胞生成素突变蛋白。

在一个实施方案中，如上所述的重组组织保护性细胞因子包含 至少一种选自保护、维持、增强或恢复哺乳动物效应细胞、组织或 器官功能或活力的效应细胞保护活性。在这样的实施方案中，哺乳 动物效应细胞包括神经元细胞、肌细胞、心细胞、肺细胞、肝细胞、 肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、肾上腺髓质细胞、毛细血管 细胞、内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、子宫内膜细胞或干细胞。 在其它实施方案中，所述细胞包括感光细胞、神经节细胞、双极细 胞、水平细胞、无长突细胞、米勒细胞、心肌细胞、起搏细胞、窦 房结细胞、窦结细胞、房室结细胞、房室束细胞、肝细胞、星形细 胞、肝巨噬细胞、系膜细胞、杯状细胞、肠腺细胞、肠内分泌细胞、 肾小球细胞、束状细胞、网状细胞、嗜铬细胞、外膜细胞、间质细 胞、滋养细胞、精细胞、成熟滤泡细胞、原始滤泡细胞、子宫内膜 基质细胞或子宫内膜细胞。

根据本发明的另一方面，如上所述的重组组织保护性细胞因子 能够穿越内皮细胞屏障。在一个相关实施方案中，所述内皮细胞屏 障包括血-脑屏障、血-眼屏障、血-睾屏障、血-卵巢屏障、血-胎屏障、 血-心屏障、血-肾屏障和血-子宫屏障。

在本发明的另一个实施方案中，上述重组组织保护性细胞因子 被进一步修饰。在一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子 选自：i)具有数目减少的唾液酸或无唾液酸部分的细胞因子；ii)具有 数目减少的N联糖或O联糖或无N联糖或O联糖的细胞因子；iii) 通过用至少一种糖苷酶处理天然细胞因子而具有至少降低糖含量的 细胞因子；iv)具有至少一个或多个氧化糖的细胞因子；v)具有至少一 个或多个氧化糖并被化学还原的细胞因子；vi)具有至少一个或多个 修饰精氨酸残基的细胞因子；vii)具有至少一个或多个修饰赖氨酸残 基或细胞因子分子的一个N端氢基修饰的细胞因子；viii)具有至少一 个修饰酪氨酸残基的细胞因子；ix)具有至少一个修饰天冬氨酸或谷 氨酸残基的细胞因子；x)具有一个修饰色氨酸残基的细胞因子；xi)至 少有一个氨基酸基团被去除的细胞因子；xii)在所述细胞因子分子内 具有至少一个胱氨酸键的至少一个口的细胞因子；xiii)截短的细胞因 子；xiv)连接至少一个聚乙二醇分子的细胞因子；xv)连接至少一个脂 肪酸的细胞因子；xvi)由于重组细胞因子在非哺乳动物细胞中表达而 具有非哺乳动物糖基化模式的细胞因子；和xvi)具有至少一个组氨酸 标记的氨基酸以便于纯化的细胞因子。

在一个实施方案中，本发明的重组组织保护性细胞因子具有数 目减少的唾液酸部分或没有唾液酸部分。在一个优选的实施方案中， 所述重组组织保护性细胞因子是红细胞生成素的脱唾液酸形式(即没 有唾液酸部分)，最优选人脱唾液酸红细胞生成素。在另一个实施方 案中，所述重组组织保护性细胞因子具有1个、2个、3个、4个、5 个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个唾液酸部 分。唾液酸化可用位置的数目可以被重组组织保护性细胞因子中存 在的一个或多个改变或修饰的氨基酸所改变。因此，本发明包括其 中所述重组组织保护性细胞因子或者被低唾液酸化(hyposialylated)或 者被高唾液酸化(hypersialylated)的实施方案。在一个优选的方面，所 述红细胞生成素突变蛋白具有天然红细胞生成素上存在的超过14个 唾液酸部分。

在一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子是不含N联 糖的红细胞生成素。在另一个实施方案中，所述重组组织保护性细 胞因子是具有数目减少的N联糖的红细胞生成素。在一个实施方案 中，所述重组组织保护性细胞因子是不含O联糖的红细胞生成素。 在另一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子是具有数目减 少的O联糖的红细胞生成素。

在另一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子可以被岩 藻糖基化修饰，以改变糖蛋白上的糖基化模式。

在又一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子用至少一 种糖苷酶处理。在另一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因 子由于用至少一种糖苷酶处理重组组织保护性细胞因子而具有至少 降低的糖含量。

在又一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子的糖部分 因重组红细胞生成素在非哺乳动物细胞中表达重组红细胞生成素而 具有至少非哺乳动物糖基化模式。在优选的实施方案中，所述重组 组织保护性细胞因子在昆虫细胞、植物细胞、细菌细胞或酵母细胞 中表达。

在又一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子还具有至 少一个或多个也可以被化学还原的氧化糖。在一个优选的实施方案 中，所述重组组织保护性细胞因子是高碘酸盐氧化的红细胞生成素。 在某些实施方案中，高碘酸盐氧化的红细胞生成素最好是被氰基硼 氢钠化学还原。

在又一个实施方案中，用于上述用途的重组组织保护性细胞因 子具有至少一个或多个修饰精氨酸残基。在一个实施方案中，所述 重组组织保护性细胞因子在一个或多个精氨酸残基上包含R-乙二醛 部分，其中R为芳基或烷基部分。在又一个实施方案中，所述重组 组织保护性细胞因子是苯基乙二醛-红细胞生成素。在又一个实施方 案中，所述重组组织保护性细胞因子是其中精氨酸残基通过与例如 但不限于2，3-丁二酮和环己二酮的连二酮反应而被修饰的红细胞生成 素。在又一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子是其中精 氨酸残基与3-脱氧葡糖醛酮反应的红细胞生成素。

在又一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含至少 一个或多个修饰赖氨酸残基或该红细胞生成素分子的一个N端氨基 修饰，所述修饰是由赖氨酸残基或N端氨基与氨基修饰试剂反应而 来。修饰的赖氨酸残基还可被化学还原。在一个优选的实施方案中， 重组组织保护性细胞因子通过一个或多个赖氨酸基团被生物素化或 氨甲酰化或酰化(例如乙酰化)。在另一个优选的实施方案中，赖氨酸 与醛或还原糖反应，形成亚胺，所述亚胺通过被氰基硼氢钠还原形 成N-烷基化赖氨酸例如葡萄糖醇基赖氨酸而稳定，或者在还原糖的 情况下可以通过Amadori或Heyns重排形成α-脱氧-α-氨基糖(例如α- 脱氧-α-果糖基赖氨酸)而稳定。在另一个优选的实施方案中，赖氨酸 基团例如通过与氰酸根离子反应而被氨甲酰化，通过分别与烷基-异 氰酸盐、芳基-异氰酸盐或芳基异硫氰酸盐反应而被烷基-氨甲酰化、 芳基-氨甲酰化或芳基-硫代氨甲酰化，或者可以例如通过与乙酸酐、 琥珀酸酐或邻苯二甲酸酐反应而被活性烷基羧酸或芳基羧酸衍生物 所酰化。至少一个赖氨酸基团也可以通过与三硝基苯磺酸、或者最 好与其盐反应而被三硝基苯基修饰。在另一个实施方案中，赖氨酸 残基可以通过与乙二醛衍生物反应(例如与乙二醛、甲基乙二醛或3- 脱氧葡糖醛酮反应)而被修饰，形成相应的α-羧基烷基衍生物。在一 个相关的实施方案中，所述氨甲酰化细胞因子包含α-N-氨甲酰红细 胞生成素；N-ε-氨甲酰红细胞生成素；α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰红细 胞生成素；α-N-氨甲酰脱唾液酸红细胞生成素；N-ε-氨甲酰脱唾液酸 红细胞生成素；α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰脱唾液酸红细胞生成素；α- N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰脱唾液酸红细胞生成素；α-N-氨甲酰低唾液酸 红细胞生成素；N-ε-氨甲酰低唾液酸红细胞生成素；和α-N-氨甲酰， N-ε-氨甲酰低唾液酸红细胞生成素。在又一个实施方案中，所述重组 组织保护性细胞因子包含至少一个酰化赖氨酸残基。在又一个实施 方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含至少一个酰化赖氨酸残 基。在又一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含至少 一个酰化赖氨酸残基。在一个相关的实施方案中，所述乙酰化细胞 因子包含α-N-乙酰红细胞生成素；N-ε-乙酰红细胞生成素；α-N-乙酰， N-ε-乙酰红细胞生成素；α-N-乙酰脱唾液酸红细胞生成素；N-ε-乙酰 脱唾液酸红细胞生成素；α-N-乙酰，N-ε-乙酰脱唾液酸红细胞生成素； α-N-乙酰低唾液酸红细胞生成素；N-ε-乙酰低唾液酸红细胞生成素； α-N-乙酰，N-ε-乙酰低唾液酸红细胞生成素；α-N-乙酰基高唾液酸红 细胞生成素；N-ε-乙酰高唾液酸红细胞生成素；α-N-乙酰基和N-ε-乙 酰高唾液酸红细胞生成素。

在又一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子具有一个 琥珀酰化的赖氨酸残基。在一个相关的实施方案中，所述琥珀酰化 细胞因子包含α-N-琥珀酰红细胞生成素；N-ε-琥珀酰红细胞生成素； α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰红细胞生成素；α-N-琥珀酰脱唾液酸红细胞 生成素；N-ε-琥珀酰脱唾液酸红细胞生成素；α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀 酰脱唾液酸红细胞生成素；α-N-琥珀酰低唾液酸红细胞生成素；N-ε- 琥珀酰低唾液酸红细胞生成素；α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰低唾液酸红 细胞生成素；α-N-琥珀酰高唾液酸红细胞生成素；N-ε-琥珀酰高唾液 酸红细胞生成素；和N-ε-琥珀酰高唾液酸红细胞生成素。

在一个实施方案中，重组组织保护性细胞因子的至少一个酪氨 酸残基可以通过亲电子试剂在芳环位置内被例如硝化或碘化修饰。 在一个相关的实施方案中，上述重组组织保护性细胞因子包含至少 一个被2，4，6-三硝基苯磺酸钠或其另一种盐修饰的赖氨酸残基。

在另一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含至少 一个被硝化和/或碘化的酪氨酸残基。

在另一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子包含一个 与碳二亚胺反应后再与胺反应的天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基。在 一个相关的实施方案中，所述胺是甘氨酰胺。

在一个实施方案中，重组组织保护性细胞因子的至少一个色氨 酸残基例如通过与正溴琥珀酰亚胺或正氯琥珀酰亚胺反应而被修 饰。

在另一个实施方案中，例如通过与茚三酮反应后再通过与硼氢 化物反应还原所得羰基，提供至少一个红细胞生成素氨基被去除的 重组组织保护性细胞因子。

在又一个实施方案中，通过与例如二硫苏糖醇等还原剂反应， 接着通过将随后产生的巯基与碘乙酰胺、碘乙酸或另一种亲电子试 剂反应以阻止二硫键重新形成，提供在所述分子中胱氨酸键具有至 少一个口的重组组织保护性细胞因子。

在又一个实施方案中，对重组组织保护性细胞因子进行靶向特 定残基的有限化学蛋白酶解(例如在色氨酸残基后切割)。所得重组组 织保护性细胞因子片段包括在本文中。

如上所述，用于本文目的的重组组织保护性细胞因子除了遗传 改变的氨基酸外，可任选具有至少一个上述化学修饰，但也可具有 不止一个以上修饰。作为实例的在其分子的糖部分具有一个修饰和 在其氨基酸部分具有一个修饰的重组组织保护性细胞因子，重组组 织保护性细胞因子是在其赖氨酸残基被生物素化、酰化(诸如乙酰化) 或氨甲酰化的脱唾液酸红细胞生成素。重组组织保护性细胞因子也 可以通过添加脂肪酸链而被修饰。在另一个实施方案中，重组组织 保护性细胞因子通过添加聚乙二醇(PEG)而被PEG化修饰，产生PEG 化组织保护性细胞因子。

根据本发明的一个方面，提供包含编码含上述重组组织保护性 细胞因子的多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子。在一个实施方案 中，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO：208载体构建体核苷酸残 基5461-6041的核苷酸序列、SEQ ID NO：209核苷酸残基5461-6041 的核苷酸序列、SEQ ID NO：210核苷酸残基5461-6041的核苷酸序 列、SEQ ID NO：211核苷酸残基5461-6041的勺核苷酸序列或SEQ ID NO：212核苷酸残基5461-6041的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，提供一种包含核苷酸序列(即 cDNA，间插或未间插内含子的核苷酸序列)的分离的核酸分子，所述 核苷酸序列编码包含上述重组红细胞生成素或由上述重组红细胞生 成素组成的多肽，条件是所述核酸分子不编码包含一个或多个如下 氨基酸取代的重组组织保护性细胞因子：I6A、C7A、K20A、P42A、 D43A、K45D、K45A、F48A、Y49A、K52A、K49A、S100E、R103A、 K116A、T132A、I133A、K140A、N147K、N147A、R150A、R150E、 G151A、K152A、K154A、G158A、C161A或R162A。在一个相关 的实施方案中，提供一种包含编码含上述重组组织保护性细胞因子 的多肽的核苷酸序列分离的核酸分子，条件是所述核酸分子不编码 含任何以下的取代组合的重组组织保护性细胞因子： N24K/N38K/N83K或A30N/H32T。在一个实施方案中，编码重组组 织保护性细胞因子的核苷酸序列是使用在特定宿主细胞中易于最佳 表达的优选密码子而合成的。所述优选密码子可以是在植物细胞、 细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞或昆虫细胞之一中 表达最佳化的。

本发明也提供包含所述核酸分子的载体。本发明也提供包含所 述核酸分子和至少一个与所述核酸分子有效连接的调节区的表达载 体。在一个实施方案中，所述载体是pCiNeo载体。在另一个实施方 案中，本发明提供包含所述表达载体的细胞。在又一个实施方案中， 提供包含所述核酸分子的基因工程细胞。

在另一个实施方案中，本发明也包括组合物，所述组合物包括 药物组合物，所述药用组合物包含一种或多种上述重组组织保护性 细胞因子。

根据本发明的另一方面，提供一种包含缺乏至少一种选自以下 的红细胞生成活性的上述重组组织保护性细胞因子的药用组合物： 增加血细胞比容、血管收缩、超活化血小板、促凝血活性和增加凝 血细胞的产生。根据本发明的另一方面，提供一种包含上述重组组 织保护性细胞因子的药用组合物，但所述细胞因子不缺乏至少一种 选自以下的红细胞生成活性：增加血细胞比容、血管收缩、超活化 血小板、促凝血活性和增加凝血细胞的产生。所述细胞因子包含至 少一种选自保护、维持、增强或恢复的哺乳动物效应细胞、组织或 器官功能或活力的效应细胞保护活性。所述药用组合物的重组组织 保护性细胞因子可以包含具有一个以下变化即取代的SEQ ID NO：10 的氨基酸序列(每个变化或所列变化的组合都已指定一个独立的序列 标识号)：i)SEQ ID NO：10残基45的天冬氨酸和残基100的谷氨酸 (SEQ ID NO：106)；ii)SEQ ID NO：10残基30的天冬酰胺、残基32的 苏氨酸(SEQ ID NO：107)；iii)SEQ ID NO：10残基45的天冬氨酸、 残基150的谷氨酸(SEQ ID NO：108)；iv)SEQ ID NO：10残基103的 谷氨酸和残基108的丝氨酸(SEQ ID NO：109)；v)SEQ ID NO：10残 基140的丙氨酸和残基52的丙氨酸(SEQ ID NO：110)；vi)SEQ ID NO： 10残基140的丙氨酸、残基52的丙氨酸、残基45的丙氨酸(SEQ ID NO： 111)；vii)SEQ ID NO：10残基97的丙氨酸和残基152的丙氨酸(SEQ ID NO：112)；iix)SEQ ID NO：10残基97的丙氨酸、残基152的丙氨酸、 残基45的丙氨酸(SEQ ID NO：113)；ix)SEQ ID NO：10残基97的丙 氨酸、残基152的丙氨酸、残基45的丙氨酸和残基52的丙氨酸(SEQ ID NO：114)；x)SEQ ID NO：10残基97的丙氨酸、残基152的丙氨 酸、残基45的丙氨酸、残基52的丙氨酸和残基140的丙氨酸(SEQ ID NO：115)；xi)SEQ ID NO：10残基97的丙氨酸、残基152的丙氨酸、 残基45的丙氨酸、残基52的丙氨酸、残基140的丙氨酸、残基154 的丙氨酸、残基24的赖氨酸、残基38的赖氨酸、残基83的赖氨酸、 残基24的赖氨酸和残基15的丙氨酸(SEQ ID NO：116)；xii)SEQ ID NO：10残基24的赖氨酸、残基38的赖氨酸和残基83的赖氨酸(SEQ ID NO：117)；或xiv)SEQ ID NO：10残基24的赖氨酸和残基15的丙氨 酸(SEQ ID NO：118)。

根据本发明的另一方面，提供一种用于保护、维持、增强或恢 复哺乳动物效应细胞及其相关细胞、组织和器官功能或活力的药用 组合物，所述组合物包含治疗有效量的含有至少一个以下氨基酸残 基取代的重组组织保护性细胞因子(每个变化或所列变化的组合都已 指定一个独立的序列标识号)：SEQ ID NO：10残基152的色氨酸(SEQ ID NO：98)；SEQ ID NO：10残基14的丙氨酸和残基15的丙氨酸(SEQ ID NO：119)；SEQ ID NO：10残基6的丙氨酸(SEQ ID NO：15)；SEQ ID NO：10残基7的丙氨酸(SEQ ID NO：16)；SEQ ID NO：10残基43的 丙氨酸(SEQ ID NO：42)；SEQ ID NO：10残基42的丙氨酸(SEQ ID NO： 41)；SEQ ID NO：10残基48的丙氨酸(SEQ ID NO：49)；SEQ ID NO：10 残基49的丙氨酸(SEQ ID NO：50)；SEQ ID NO：10残基32的苏氨酸 (SEQ ID NO：35)；SEQ ID NO：10残基133的丙氨酸(SEQ ID NO：83)； SEQ ID NO：10残基134的丙氨酸(SEQ ID NO：84)；SEQ ID NO：10 残基147的丙氨酸(SEQ ID NO：90)；SEQ ID NO：10残基148的丙氨 酸(SEQ ID NO：92)；SEQ ID NO：10残基150的丙氨酸(SEQ ID NO： 94)；SEQ ID NO：10残基151的丙氨酸(SEQ ID NO：96)；SEQ ID NO： 10残基158的丙氨酸(SEQ ID NO：102)；SEQ ID NO：10残基161的 丙氨酸(SEQ ID NO：104)；或SEQ ID NO：10残基162的丙氨酸(SEQ ID NO：105)。

在一个实施方案中，上述药用组合物配制成供口服、鼻内或胃 肠外给药用。在另一个实施方案中，所述药用组合物配制成灌注液。

在某些实施方案中，用于保护、维持、增强或恢复哺乳动物效 应细胞及其相关细胞、组织和器官功能或活力的本发明药用组合物 包含治疗有效量的重组组织保护性细胞因子，所述细胞因子包含天 然人红细胞生成素氨基酸序列氨基酸残基的至少一个取代。

在其它实施方案中，用于保护、维持、增强或恢复哺乳动物效 应细胞及其相关细胞、组织和器官功能或活力的本发明药用组合物 包含治疗有效量的重组组织保护性细胞因子，所述细胞因子包含可 缺乏一种或多种例如以下的红细胞生成活性或效应的细胞保护活 性：增加血细胞比容、血管活性作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血 小板、促凝血活性和增加凝血细胞的产生。

在其它实施方案中，用于保护、维持、增强或恢复哺乳动物效 应细胞及其相关细胞、组织和器官功能或活力的本发明药用组合物 包含治疗有效量的重组组织保护性细胞因子，所述细胞因子包含也 可具有一种或多种例如以下的红细胞生成活性或效应的细胞保护活 性：增加血细胞比容、血管活性作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血 小板、促凝血活性和增加凝血细胞的产生。

根据本发明的一个方面，提供用于保护、维持或增强从哺乳动 物体内分离的细胞、组织或器官的活力的方法，所述方法包括使所 述细胞、组织或器官接触包括含缺乏至少一种选自以下的红细胞生 成活性的红细胞生成素的重组组织保护性细胞因子的药用组合物： 增加血细胞比容、血管活性作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血小板、 促凝血活性和增加凝血细胞的产生。在某些实施方案中，所述保护 作用对骨髓无效。

本发明也提供用于保护、维持或增强从哺乳动物体内分离的细 胞、组织或器官的活力的方法，所述方法包括使所述细胞、组织或 器官接触包括含缺乏至少一种选自以下的红细胞生成活性的重组组 织保护性细胞因子的药用组合物：增加血细胞比容、血管活性作用(血 管收缩/血管舒张)、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血细胞的产 生。

本发明还提供缺乏至少一种选自以下的红细胞生成活性的上述 重组组织保护性细胞因子在制备用于防止和预防哺乳动物组织损伤 以及恢复和再生哺乳动物组织和组织功能的药用组合物中的用途： 增加血细胞比容、血管活性作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血小板、 促凝血活性和增加凝血细胞的产生。在一个实施方案中，所述损伤 是由以下引起：癫痫、多发性硬化、中风、低血压、心搏停止、局 部缺血、心肌梗塞、炎症、年龄相关认知功能减退、辐射损伤、大 脑麻痹、神经变性性疾病、早老性痴呆(Alzheimer′s disease)、帕金森 病(Parkinson′s disease)、亚急性坏死性脑脊髓病(Leigh disease)、艾滋 病性痴呆、记忆力减退、肌萎缩性侧索硬化、醇中毒、心境障碍、 焦虑症、注意力不集中的过度反应症、孤独症、传染性海绵样脑病 (Creutzfeld-Jakob disease)、脑创伤或脊髓创伤、脑缺血或脊髓缺血、 心肺分流术、慢性心力衰竭、黄斑变性、糖尿病性神经病、糖尿病 性视网膜病、青光眼、视网膜缺血或视网膜创伤。

根据本发明的另一方面，提供用于促进哺乳动物体内的分子穿 越内皮细胞屏障的胞转作用的方法，所述方法包括给予所述哺乳动 物包含与缺乏至少一种选自以下活性的上述重组组织保护性细胞因 子缔合的所述分子的组合物：增加血细胞比容、升高血压、超活化 血小板和增加凝血细胞的产生。在一个实施方案中，所述缔合是不 稳定的共价键、稳定的共价键或与所述分子结合位点的非共价缔合。 根据本发明的另一方面，提供用于促进哺乳动物体内的分子穿越内 皮细胞屏障的胞转作用的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物包 含与具有选自以下活性的上述重组组织保护性细胞因子缔合的所述 分子的组合物：增加血细胞比容、升高血压、超活化血小板和增加 凝血细胞的产生。在一个实施方案中，所述缔合是不稳定的共价键、 稳定的共价键或与所述分子结合位点的非共价缔合。在另一个实施 方案中，所述内皮细胞屏障选自血-脑屏障、血-眼屏障、血-睾屏障、 血-卵巢屏障、血-心屏障、血-肾屏障和血-胎屏障。在又一个实施方 案中，所述分子是受体激动剂或拮抗剂激素、神经营养因子、抗微 生物药物、抗病毒药、放射性药物、反义寡核苷酸、抗体、免疫抑 制剂、染料、标记物或抗癌药。

根据本发明的另一方面，提供用于通过胞转作用转运分子穿越 内皮细胞屏障的组合物，所述组合物包含与缺乏至少一种选自以下 的红细胞生成活性的上述重组组织保护性细胞因子缔合的所述分 子：增加血细胞比容、血管活性作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血 小板、促凝血活性和增加凝血细胞的产生。根据本发明的另一方面， 提供用于通过胞转作用转运分子穿越内皮细胞屏障的组合物，所述 组合物包含与具有至少一种选自以下的红细胞生成活性的上述重组 组织保护性细胞因子缔合的所述分子：增加血细胞比容、血管活性 作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血细 胞的产生。在一个实施方案中，所述缔合是不稳定的共价键、稳定 的共价键或与所述分子结合位点的非共价缔合。在另一个实施方案 中，所述分子是受体激动剂或拮抗剂激素、神经营养因子、抗微生 物药物、放射性药物、反义寡核苷酸、抗体、免疫抑制剂、染料、 标记物或抗癌药。

本发明也提供缺乏至少一种选自以下的红细胞生成活性的上述 重组组织保护性细胞因子的用途：增加血细胞比容、血管活性作用(血 管收缩/血管舒张)、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血细胞的产 生。在一个实施方案中，所述缔合是不稳定的共价键、稳定的共价 键或与所述分子结合位点的非共价缔合。在另一个实施方案中，所 述分子是受体激动剂或拮抗剂激素、神经营养因子、抗微生物药物、 放射性药物、反义寡核苷酸、抗体、免疫抑制剂、染料或标记物或 抗癌药。

因此，本发明涉及在天然红细胞生成素对应物上具有至少一个 氨基酸改变的任何重组组织保护性细胞因子的细胞保护用途，其中 所述重组组织保护性细胞因子具有如本文所述的细胞保护活性。所 述细胞保护活性包括但不限于神经保护活性。本发明还涉及任何上 述重组组织保护性细胞因子在治疗效应细胞、组织或器官、特别是 治疗包括所述效应细胞、组织或器官的病症或疾病中的用途。在一 个这样的实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子具有至少一种 选自以下的红细胞生成活性：增加血细胞比容、血管活性作用(血管 收缩/血管舒张)、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血细胞的产生。 本发明的重组组织保护性细胞因子最好保持天然红细胞生成素的三 维构象。所述重组组织保护性细胞因子可以具有或不具有红细胞生 成活性。

在本发明的一个实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子是 作为具有N端融合的His标记(6xHis残基)的重组蛋白而产生的。在 某些实施方案中，额外的氨基酸序列可作为间隔序列加入。在一个 具体的实施方案中，本发明的组氨酸标记的重组组织保护性细胞因 子突变蛋白包括但不限于K45D-6xHis和S100E-6xHis。

在本发明的另一个方面，任何上述重组组织保护性细胞因子都 可用于制备用于离体处理细胞、组织和器官以达到保护、维持、增 强或恢复哺乳动物效应细胞及其相关细胞、组织和器官功能或活力 目的的药用组合物。所述离体处理用于例如供移植用细胞、组织或 器官的保存，不管是自体移植还是异种移植。所述细胞、组织或器 官可浸在包含红细胞生成素突变蛋白或重组组织保护性细胞因子的 溶液中，或者所述灌注液可以通过血管系统或其它方式滴注到所述 器官中，在所述细胞、组织或器官不与受体或供体的血管系统整合 期间维持细胞功能。可以在器官收获之前，将灌注液给予供体，以 及给予收获的器官和受体。此外，当细胞、组织或器官与个体血管 系统分离并因此必须离体存在一段时间时，可以使用任何重组组织 保护性细胞因子的上述用途，术语分离是指限制或钳制细胞、组织、 器官或机体部分的血管系统，或通向细胞、组织、器官或机体部分 的血管系统，例如可以在手术中、尤其是在心肺分流手术中进行； 分流细胞、组织、器官或机体部分的血管系统；从哺乳动物体内取 出细胞、组织、器官或机体部分，这些可以在异种移植之前或者在 自体移植之前或期间进行；或者可以在细胞、组织、器官或机体部 分的创伤性切断术中进行。因此，本发明的该方面涉及用红细胞生 成素突变蛋白进行原位和离体灌注。可以在细胞、组织或器官保存 液中离体提供所述重组组织保护性细胞因子。对于任一方面来说， 暴露可以通过连续灌注、脉冲灌注、输注、浸泡、注射或导管插入 术的方式进行。

在又一方面，本发明涉及用于保护、维持、增强或恢复哺乳动 物细胞、组织、器官或机体部分(包括效应细胞或组织)的活力的方法， 其中所述细胞、组织、器官或机体部分是从哺乳动物体内分离的。 所述方法包括在一段时间内至少使分离的哺乳动物细胞、组织、器 官或机体部分接触一定量的红细胞生成素突变蛋白或重组组织保护 性细胞因子，以达到有效地保护、维持、增强或恢复上述活力。在 非限制性实例中，分离是指限制或钳制细胞、组织、器官或机体部 分的血管系统，或通向细胞、组织、器官或机体部分的血管系统， 例如可以在手术中、尤其是在心肺分流手术中进行；分流细胞、组 织、器官或机体部分的血管系统；从哺乳动物体内取出细胞、组织、 器官或机体部分，这些可以在异种移植之前或在自体移植之前或期 间进行；或者可以在细胞、组织、器官或机体部分的创伤性切断术 中进行。因此，本发明的该方面涉及用红细胞生成素突变蛋白或重 组组织保护性细胞因子进行原位和离体灌注。可以在细胞、组织或 器官保存液中离体提供所述重组组织保护性细胞因子。对于任一方 面来说，暴露可以通过连续灌注、脉冲灌注、输注、浸泡、注射或 导管插入术的方式进行。

作为非限制性实例，上述离体效应细胞或组织可以是或者可以 包括神经元细胞、视网膜细胞、肌细胞、心细胞、肺细胞、肝细胞、 肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、肾上腺髓质细胞、毛细血管 内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、骨细胞、骨髓细胞、 皮肤细胞、脐带血细胞或子宫内膜细胞或组织。效应细胞的这些实 例仅仅是说明性的。

所有上述方法和用途最好是用于人类，但也可用于任何哺乳动 物，例如但不限于陪伴动物、驯养动物、家畜和动物园动物。上述 药用组合物的给药途径包括口服、静脉内、鼻内、局部、管腔内、 吸入或胃肠外给药，后者包括静脉内、动脉内、皮下、肌内、腹膜 内、粘膜下或皮内给药。对于离体应用来说，最好是灌注液或浸泡 液。这包括原位灌注血管系统的分离部分。

在本发明的再一个方面，任何上述重组组织保护性细胞因子用 于制备供恢复有功能障碍的细胞、组织或器官功能用的药用组合物， 所述组合物在引起功能障碍的疾病或病症发作后给予。作为非限制 性实例，在先前具有脑损伤的动物中，给予包含重组组织保护性细 胞因子的药用组合物能恢复认知功能，甚至当最初创伤已经消退以 后很久(例如1天、3天、5天、1周、1月或更长时间)给药时。本发 明包括用于治疗(即缓解或逆转所述症状或效应)和预防(即延缓发 作、抑制或停止)由最初创伤引起级联反应而对细胞和组织的后续损 害的药用组合物。用于所述应用的重组组织保护性细胞因子包括任 何具体的上述重组组织保护性细胞因子。能有益于效应细胞的重组 组织保护性细胞因子的任何形式都包括在本发明的这一方面之内。

在又一个实施方案中，本发明提供上述重组组织保护性细胞因 子用于恢复有功能障碍的细胞、组织或器官功能的方法，所述方法 是在引起功能障碍的疾病或病症发作后给药。作为非限制性实例， 在先前具有脑损伤的动物中，给予包含重组组织保护性细胞因子的 药用组合物能恢复认知功能，甚至当所述创伤已经消退以后很久(例 如3天、5天、1周、1月或更长时间)给药时。重组组织保护性细胞 因子及其进一步修饰的所述细胞因子如上所述。能有益于效应细胞 的重组组织保护性细胞因子的任何形式都包括在本发明的这一方面 之内。

在本发明的又一方面，提供用于促进哺乳动物体内的分子穿越 内皮细胞屏障的胞转作用的方法，即通过给予哺乳动物与红细胞生 成素突变蛋白或上述重组组织保护性细胞因子缔合的所述分子的组 合物。

待转运分子和重组组织保护性细胞因子间的缔合可以是例如不 稳定的共价键、稳定的共价键或与所述分子结合位点的非共价缔合。 重组组织保护性细胞因子和待转运的蛋白可以表达为融合多肽。内 皮细胞屏障可以是血-脑屏障、血-心屏障、血-肾屏障、血-眼屏障、 血-睾屏障、血-卵巢屏障和血-胎屏障。通过本发明方法转运的合适 分子包括生长激素等激素、抗生素和抗癌药。

本发明的另一方面提供用于促进哺乳动物体内的分子穿越内皮 细胞屏障的胞转作用的组合物，所述组合物包含与上述重组组织保 护性细胞因子缔合的所述分子。

在本发明的再一方面，任何上述重组组织保护性细胞因子用于 制备用于促进哺乳动物体内的分子穿越内皮细胞屏障的胞转作用的 药用组合物，所述组合物包含与上述重组组织保护性细胞因子缔合 的所述分子。

所述缔合可以是例如不稳定的共价键、融合多肽、稳定的共价 键或与所述分子结合位点的非共价缔合。内皮细胞屏障可以是血-脑 屏障、血-眼屏障、血-睾屏障、血-卵巢屏障和血-胎屏障。通过本发 明方法转运的合适分子包括生长激素等激素、神经营养因子、抗生 素、抗病毒药、或者诸如通常被脑和其它屏障保护的器官排除在外 的抗真菌药、肽类放射性药物、反义药物、抗生物活性因子的抗体、 药用物质、染料、标记物和抗癌药。

通过参考如下附图和详述将会更好地理解本发明的这些方面和 其它方面。

                       4.附图简述

图1显示在用抗红细胞生成素抗体染色的薄切片中，红细胞生 成素受体在正常人脑中的分布。

图2是图1的更高放大倍数的图像。

图3显示使用金标记的第二抗体，红细胞生成素受体的超显微 分布。

图4，按类似图3的方法制备，显示人脑毛细血管管腔表面和反 面的高密度红细胞生成素受体。

图5描述胃肠外给予的红细胞生成素向脑脊液中的转运。

图6A和图6B显示用红细胞生成素以及重组组织保护性细胞因 子K45D和S100E对SK-N-SH成神经细胞瘤细胞神经保护测定(针对 鱼藤酮)的结果。图中Y轴表示吸光度读数，数据是平均值±重复测 定范围。图6A中的图清楚地表明在K45D和S100E样品中细胞活力 被保持，证明它们有细胞保护效果。图6B显示hEPO-6xHis标记- PciNeo的质粒图谱。

图7比较红细胞生成素和脱唾液酸红细胞生成素对血清饥饿的 P19细胞活力的体外功效。

图8是比较红细胞生成素和脱唾液酸红细胞生成素对血清饥饿 的P19细胞活力的体外功效的另一个实验。

图9显示红细胞生成素和脱唾液酸红细胞生成素在大鼠局灶性 脑缺血模型中的保护作用。

图10显示比较人红细胞生成素和人脱唾液酸红细胞生成素在局 部缺血性中风模型的中脑动脉闭塞中的功效的剂量反应。

图11显示碘化红细胞生成素在P19测定中的活性。

图12显示生物素化红细胞生成素和脱唾液酸红细胞生成素在 P19测定中的效应。

图13比较红细胞生成素和苯基乙二醛修饰的红细胞生成素对血 清饥饿的P19细胞活力的体外功效。

图14显示在水中毒测定中组织保护性细胞因子的效应。

图15显示红细胞生成素对为移植准备的心脏功能的维护。

图16显示暂时性血管闭塞后红细胞生成素保护心肌细胞防止局 部缺血性损伤。

图17A、图17B、图17C和图17D描述红细胞生成素在大鼠青 光眼模型中的治疗效果。

图18显示红细胞生成素在大鼠青光眼模型中对视网膜功能的保 护程度。

图19描述脑创伤后5天开始给予红细胞生成素对由脑创伤引起 的认知功能的恢复。

图20描述脑创伤后30天开始给予红细胞生成素对由脑创伤引 起的认知功能的恢复。

图21描述人脱唾液酸红细胞生成素在脑毒性红藻氨酸模型中的 功效。

图22描述组织保护性细胞因子在大鼠脊髓损伤模型中的功效。

图23显示组织保护性细胞因子在兔脊髓损伤模型中的功效。

图24A、图24B和图24C显示苏木精和伊红染色的大脑皮层冠 状切面。

图25A、图25B和25C显示用GFAP抗体染色的邻近梗塞区前 皮层的冠状切面。

图26A和26B显示用OX-42抗体染色的大脑皮层的冠状切面。

图27A和27B显示用OX-42抗体染色的邻近梗塞区的大脑皮层 冠状切面。

图28显示红细胞生成素在EAE模型中的抗炎效果。

图29比较了地塞米松和红细胞生成素在EAE模型中的抗炎效 果。

图30A和图30B显示红细胞生成素抑制与神经元死亡相关的炎 症。

图31显示在MNDA处理前，将人红细胞生成素和重组组织保 护性细胞因子R130E和R150E加入到原代海马神经元细胞培养物 中，有效降低由NMDA引起的细胞死亡。与溶媒对照细胞相比，用 R103E(5nM)处理的细胞表现出显著减少的细胞死亡(p＝0.01)。与溶 媒对照细胞相比，用R103E(5nM)处理的细胞表现出显著减少的细胞 死亡(p＝0.01)。与溶剂对照细胞相比，用R150E(5nM)处理的细胞在 细胞死亡上表现出约20％的减少(p＝0.001)。统计学：ANOVA加上 Tukey氏事后检验。

图32显示去除血清后P19细胞中的神经元保护。对于用Epo、 EpoWT和重组组织保护性细胞因子S100E进行预处理的细胞来说， 凋亡细胞死亡的百分率下降。与未处理的对照细胞相比，用Epo处 理的细胞在凋亡细胞死亡上表现出约20％的下降。与未处理的对照 细胞相比，用EpoWT和S100E处理的细胞在凋亡细胞死亡上都表现 出约10％的下降。

图33A和图33B显示在两个独立的实验中，在去除NGF的分 化PC12细胞中，用S100E进行预保温的效应。分化的PC12细胞用 指定浓度的S100E预处理24小时，图33A(3pM)，图33B(0.00003 pM-3pM)。在MTT测定中测定活力。NGF(100ng/ml)用作阳性对照， 而无NGF培养基(-NGF)作为阴性对照。图33所示数据是阳性对照 (+NGF)和活力的％(在这两个实验中，n＝8)。采用单向ANOVA和 Bonferroni事后检验，与阴性对照细胞(-NGF)相比，经S100E处理细 胞的活力有统计学显著性增加。***p＜0.001，*p＜0.05。对于效力和 功效来说，用S100E观察到的效果与在这样的实验系统中用Epo的 类似。

图34A、图34B和图34C显示在去除NGF的分化PC12细胞中， 与Epo一起预保温的效应。分化的PC12细胞用Epo、S100E或氨甲 酰化Epo(30pM-30nM)预处理24小时。化学修饰的Epo分子AA24496 在UT-7细胞测定中比EPO活性低10000倍。在MIT测定中测定活 力。NGF(100ng/ml)用作阳性对照，而无NGF培养基(-NGF)用作阴 性对照。

图35显示Epo、K45D和S100E在UT-7细胞中的浓度-反应曲 线。将不同浓度的Epo、EpoWT、K45D和S100E加入到UT-7细胞 中。在WST-1测定中，48小时后测定活力。数据是三次不同实验中 每次都进行两次重复测定的平均值±SD。该曲线是非线性回归曲线拟 合。

图36显示Epo、R103E和R150E在UT-7细胞中的剂量反应曲 线。将不同浓度的Epo、EpoWT、R103E和R150E加入到UT-7细 胞中。在WST-1测定中，48小时后测定活力。数据是三次不同实验 中每次都进行两次重复测定的平均值±SD。该曲线是非线性回归曲线 拟合。

图37是曲线图，证明经历42天的时间从脊髓损伤恢复的大鼠 的运动等级。由图可见，给予S100E的大鼠更容易从损伤恢复并证 明比对照鼠和给予甲泼尼龙的鼠较好的全面恢复。

图38显示对于不同治疗方案，受伤眼的潜伏期与正常眼的潜伏 期之比值。用EPO治疗的大鼠表现出潜伏期为1.2，要比用盐水处理 的大鼠好些。对这4种重组组织保护性细胞因子的每种，用R103E、 R150E和S100E产生潜伏期的等于或好于EPO，说明在统计学上比 EPO更好。

本发明涉及突变蛋白重组组织保护性细胞因子。具体地讲，本 发明提供包含编码含重组组织保护性细胞因子突变蛋白的分离的核 酸分子、以及包含所述核酸分子的分离和/或重组细胞和载体的组合 物。本发明还包括缺乏至少一种选自以下的红细胞生成活性的突变 蛋白重组组织保护性细胞因子的分离的多肽：增加血细胞比容、血 管活性作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血小板、促凝血活性和增加 凝血细胞的产生，所述细胞因子具有至少一种选自保护、维持、增 强或恢复哺乳动物效应细胞、组织或器官功能或活力的效应细胞保 护活性。本发明也包括使用本发明的重组组织保护性细胞因子突变 蛋白来保护、维持或增强从哺乳动物体内分离的细胞、组织或器官 的活力的方法，以及所述突变蛋白在疾病和病症的治疗和预防中的 用途。

“效应细胞”是指其功能或活力可以通过接触红细胞生成素而 被维持、促进、增强、再生或以其它方式受益的哺乳动物细胞。所 述细胞的非限制性实例包括神经元细胞、视网膜细胞、肌细胞、心 细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、肾 上腺髓质细胞、毛细血管内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、胰腺细 胞、骨细胞、皮肤细胞和子宫内膜细胞。具体地讲，效应细胞将包 括但不限于神经元细胞；浦肯野细胞；视网膜细胞：感光细胞(杆细 胞和锥细胞)、神经节细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞和米 勒细胞；肌细胞；心细胞：心肌细胞、起搏细胞、窦房结细胞、窦 结细胞和结合组织细胞(房室结和房室束)；肺细胞；肝细胞：肝细胞、 星形细胞和肝巨噬细胞；肾细胞：系膜细胞、肾上皮细胞和管状肠 细胞；小肠细胞：杯状细胞、肠腺细胞(crypts)和肠内分泌细胞；肾 上腺皮质细胞：肾小球细胞、束状细胞和网状细胞；肾上腺髓质细 胞：嗜铬细胞；毛细血管细胞：外膜细胞；睾丸细胞：间质细胞、 滋养细胞和精细胞及其原始细胞；卵巢细胞：成熟滤泡细胞和原始 滤泡细胞；胰腺细胞：胰岛、α-细胞、β-细胞、γ-细胞和F-细胞；骨 细胞：骨原细胞、破骨细胞和成骨细胞；皮肤细胞；子宫内膜细胞： 子宫内膜基质细胞和子宫内膜细胞；以及存在于以上列出的器官中 的干细胞和内皮细胞。此外，所述效应细胞和由重组组织保护性细 胞因子提供的益处可以扩大到为并非直接效应的其它细胞、或含有 所述非效应细胞的组织或器官提供间接的保护或增强作用。这些从 作为细胞、组织或器官中的一部分而存在的效应细胞的增强作用而 间接获益的其它细胞或组织或器官为“相关”细胞、组织和器官。 因此，组织或器官中存在少量或小比例的效应细胞可提供本文所述 的重组组织保护性细胞因子的益处，所述效应细胞例如存在于所述 组织中的可兴奋组织或神经元组织，或产生睾酮的睾丸中的间质细 胞。一方面，所述效应细胞或其相关细胞、组织或器官既不是可兴 奋细胞、组织或器官，占优势的也不包含可兴奋细胞或组织。

本发明的方法提供在各种正常和不利条件下对哺乳动物体内的 细胞、组织和器官的局部或全身保护或增强作用，或者提供对预定 移植(relocation)到另一哺乳动物体内的细胞、组织或器官的保护作 用。另外，也提供功能障碍的恢复或再生。如上所述，红细胞生成 素突变蛋白或重组组织保护性细胞因子穿越紧密的内皮细胞屏障并 对离开血管系统的效应细胞(以及其它类型的细胞)发挥积极作用的能 力，提供了预防以及治疗各种病症和疾病的潜力(否则所述病症和疾 病在包括人在内的动物中引起明显的细胞损害和组织损伤)，而且也 使得迄今为止未经尝试的、传统上认为风险大于利益的外科手术获 得成功。为了最终益处而引起的有目的的不利条件的持续时间和程 度，例如高剂量化疗和放疗、延长的离体移植存活期和延长的手术 诱导局部缺血周期，可以通过本发明的优点加以克服。然而，本发 明并不限于此，作为一方面还包括其中靶效应细胞因为内皮细胞屏 障和内皮紧密连接而离开血管系统的方法或组合物。本发明总的来 讲涉及可从通过接触重组组织保护性细胞因子而获益的任何效应细 胞和相关细胞、组织和器官。此外，细胞、组织或器官功能障碍可 以在急性不利事件(例如创伤)后通过接触重组组织保护性细胞因子而 恢复或再生。

因此，本发明总的来讲涉及重组组织保护性细胞因子在制备用 于上述目的的药用组合物中的用途，其中细胞功能被维持、促进、 增强、再生或以任何方式获益。本发明也涉及通过给予哺乳动物有 效量的如本文所述的重组组织保护性细胞因子以维持、增强、促进 或再生细胞功能的方法。本发明还涉及通过使细胞、组织或器官接 触重组组织保护性细胞因子以维持、促进、增强或再生离体细胞功 能的方法。本发明也涉及包含重组组织保护性细胞因子、用于器官 或组织保存的灌注组合物。

本发明的各种方法使用一种药用组合物，所述组合物至少包括 用于具体的暴露途径和持续时间的有效量的重组组织保护性细胞因 子，使得对哺乳动物体内或来自哺乳动物体内的效应细胞发挥积极 效应或益处。当预期治疗的靶细胞、组织或器官需要重组组织保护 性细胞因子穿越内皮细胞屏障时，所述药用组合物包括其浓度在穿 越内皮细胞屏障后能对效应细胞发挥其所需效应的重组组织保护性 细胞因子。在本文中能与红细胞生成素受体相互作用并在所述细胞 内调节细胞保护活性的分子可用于本发明。

5.1.本发明的核酸

包含本发明核酸分子的重组组织保护性细胞因子包括编码包含 缺乏至少一种选自以下的红细胞生成活性或表现出降低的所述活性 的红细胞生成素突变蛋白的组织保护性细胞因子的核酸：增加血细 胞比容、血管活性作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血小板、促凝血 活性和增加凝血细胞的产生，所述细胞因子具有至少一种选自保护、 维持、增强或恢复哺乳动物效应细胞、组织或器官功能或活力的效 应细胞保护活性。包含本发明核酸分子的组织保护性细胞因子包括 编码具有上述活性的红细胞生成素突变蛋白的核酸，所述核酸包含 在SEQ ID NO：10的位置11-15之间[SEQ ID NO：1]、SEQ ID NO：10 的位置44-51之间[SEQ ID NO：2]、SEQ ID NO的位置100-108之间 [SEQ ID NO：3]或SEQ ID NO 10的位置146-151之间[SEQ ID NO：4] 的一个或多个改变的氨基酸残基。包含本发明核酸分子的组织保护 性细胞因子包括编码具有上述活性的红细胞生成素突变蛋白的核 酸，所述核酸在以下SEQ ID NO：10中的一个或多个位置包含改变的 氨基酸残基：7、20、21、29、33、38、42、59、63、67、70、83、96、 126、142、143、152、153、155、156或161。包含本发明核酸分子 的组织保护性细胞因子包括编码具有上述活性的红细胞生成素突变 蛋白的核酸，所述核酸包含具有一个或多个以下变化的SEQ ID NO： 10的氨基酸序列：SEQ ID NO：10残基6的丙氨酸、SEQ ID NO：10 残基7的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基7的丝氨酸、SEQ ID NO：10 残基10的异亮氨酸、SEQ ID NO：10残基11的丝氨酸、SEQ ID NO：10 残基12的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基13的丙氨酸、SEQ ID NO：10 残基14的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基14的谷氨酸、SEQ ID NO：10 残基14的谷氨酰胺、SEQ ID NO：10残基15的丙氨酸、SEQ ID NO：10 残基15的苯丙氨酸、SEQ ID NO：10残基15的异亮氨酸、SEQ ID NO： 10残基20的谷氨酸、SEQ ID NO：10残基20的丙氨酸、SEQ ID NO： 10残基21的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基24的赖氨酸、SEQ ID NO： 10残基29的丝氨酸、SEQ ID NO：10残基29的酪氨酸、SEQ ID NO： 10残基30的天冬酰胺、SEQ ID NO：10残基32的苏氨酸、SEQ ID NO： 10残基33的丝氨酸、SEQ ID NO：10残基33的酪氨酸、SEQ ID NO： 10残基38的赖氨酸、SEQ ID NO：10残基83的赖氨酸、SEQ ID NO： 10残基42的天冬酰胺、SEQ ID NO：10残基42的丙氨酸、SEQ ID NO： 10残基43的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基44的异亮氨酸、SEQ ID NO： 10残基45的天冬氨酸、SEQ ID NO：10残基45的丙氨酸、SEQ ID NO： 10残基46的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基47的丙氨酸、SEQ ID NO： 10残基残基48的异亮氨酸、SEQ ID NO：10残基48的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基49的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基49的丝氨酸、SEQ ID NO：10残基51的苯丙氨酸、SEQ ID NO：10残基51的天冬酰胺、SEQ ID NO：10残基52的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基59的天冬酰胺、SEQ ID NO：10残基62的苏氨酸、SEQ ID NO：10残基67的丝氨酸、SEQ ID NO：10残基70的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基96的精氨酸、SEQ ID NO：10残基97的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基100的精氨酸、SEQ ID NO：10残基100的谷氨酸、SEQ ID NO：10残基100的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基100的苏氨酸、SEQ ID NO：10残基101的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基101的异亮氨酸、SEQ ID NO：10残基102的丙氨酸、 SEQ ID NO：10残基103的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基103的谷氨 酸、SEQ ID NO：10残基104的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基104的 异亮氨酸、SEQ ID NO：10残基105的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基 106的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基106的异亮氨酸、SEQ ID NO：10 残基107的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基107的亮氨酸、SEQ ID NO：10 残基108的赖氨酸、SEQ ID NO：10残基108的丙氨酸、SEQ ID NO：10 残基108的丝氨酸、SEQ ID NO：10残基116的丙氨酸、SEQ ID NO：10 残基126的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基132的丙氨酸、SEQ ID NO：10 残基133的丙氨酸、SEQ ED NO：10残基134的丙氨酸、SEQ ID NO： 10残基140的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基142的异亮氨酸、SEQ ID NO：10残基143的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基146的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基147的赖氨酸、SEQ ID NO：10残基147的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基148的酪氨酸、SEQ ID NO：10残基148的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基149的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基150的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基150的谷氨酸、SEQ ID NO：10残基151的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基152的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基152的色氨酸、SEQ ID NO：10残基153的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基154的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基155的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基158的丙氨酸、SEQ ID NO：10残基160的丝氨酸、SEQ ID NO：10残基161的丙氨酸或SEQ ID NO：10残基162的丙氨酸。

本发明的核酸分子还包括编码具有与上述红细胞生成素突变蛋 白之一有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高氨基酸序列同一性的重 组红细胞生成素突变蛋白的核苷酸序列。为了测定两个氨基酸序列 或编码红细胞生成素突变蛋白的两个核酸的％同一性，为了最佳比较 目的进行序列比对(例如为了与第二氨基酸序列或核酸序列进行最佳 比对，可以在第一氨基酸序列或核酸序列的序列中引入空位)。然后 比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当在第 一序列的一个位置被与第二序列相应位置上相同的氨基酸残基或核 苷酸占据时，则该分子在该位置是相同的。两个序列之间的％同一性 是所述序列共享相同位置数的函数(即％同一性＝相同重叠位置数/ 重叠位置总数×100％)。在一个实施方案中，这两个序列长度相等。

本发明的核酸分子还包括编码重组红细胞生成素突变蛋白的核 苷酸序列，其中被一个或多个取代、缺失或上述修饰改变的编码红 细胞生成素的核酸序列包含与SEQ ID NO：7有至少30％、35％、40％、 45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％ 或98％序列同一性。本发明的核酸分子也包括编码重组红细胞生成 素突变蛋白的核苷酸序列，其中被一个或多个取代、缺失或上述修 饰改变的编码红细胞生成素的核酸序列是编码非人类红细胞生成素 的核酸。

也可以运用数学算法来完成两个序列间％同一性的测定。用于 比较两个序列的数学算法的一个优选的非限制性实例是Karlin和 Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268算法并被 Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877修 改。所述算法结合到Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-410中描 述的NBLAST和XBLAST程序中。用NBLAST程序可以进行BLAST 核苷酸搜索，分值＝100，字长＝12，以得到与本发明的核酸分子同 源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白搜索，分 值＝50，字长＝3，以得到与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。 为了比较的目的得到引入空位的比对，可如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述，采用Gapped BLAST。或者，PSI-Blast 可用于进行迭代搜索，以测定分子间距离关系(Altschul等，1997，参 见上文)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使 用每个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见 http：∥www.nobi.nlm.nih.gov)。另一个用于序列比较的优选的数学算法 的非限制性实例是Myers和Miller，1988，CABIOS 4：11-17的算法。 所述算法结合到ALIGN程序(2.0版)中，所述程序是GCG序列比对 软件包的一部分。当使用ALIGN程序进行氨基酸序列比较时，可使 用PAM120权重残基表(weight residue table)，空位长度罚分为12， 空位罚分为4。

可使用上述技术类似的技术，允许或不允许有空位，测定两个 序列的％同一性。在计算％同一性时，通常只计数精确匹配。

本发明的核酸分子还包括：(a)在严格性条件下与编码上述本发 明的红细胞生成素突变蛋白或重组组织保护性细胞因子的核酸分子 杂交的核苷酸序列，例如结合滤膜的DNA在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC) 中在约45℃杂交，接着在0.2xSSC/0.1％SDS中在约50-65℃洗涤一 次或多次，或(b)在高严格性条件下，例如结合滤膜的核酸在6xSSC 中于45℃杂交，接着在0.1xSSC/0.2％SDS中在约68℃洗涤一次或 多次，或者在对本领域技术人员显而易见的其它杂交条件下(参见例 如Ausubel F.M.等主编，1989，Current Protocols in Molecular Biology， 第I卷，Green Publishing Associates，Inc.和John Wiley&sons，Inc.，New York，第6.3.1-6.3.6页和第2.10.3页)。最好在如上所述(a)和(b)的条 件下杂交的编码红细胞生成素突变蛋白的核酸分子是一种包含编码 红细胞生成素突变蛋白的核酸分子的互补核酸分子。在一个优选的 实施方案中，在以上(a)和(b)条件下杂交的核酸分子编码蛋白产物， 例如功能上与红细胞生成素突变蛋等同即具有一种或多种上述红细 胞生成素活性的蛋白产物。本发明的核酸最好是人类核酸。

本发明的核酸分子还包括与上述红细胞生成素突变蛋白或重组 组织保护性细胞因子杂交的上述核苷酸序列，并且上述红细胞生成 素突变蛋白或重组组织保护性细胞因子还缺乏至少一种选自以下红 细胞生成活性或表现出降低的所述活性：增加血细胞比容、血管活 性作用(血管收缩/血管舒张)、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血 细胞的产生，所述细胞因子或突变蛋白包含至少一种选自保护、维 持、增强或恢复哺乳动物效应细胞、组织或器官功能或活力的效应 细胞保护活性。所述降低可以是稍微减少或几乎缺乏一种红细胞生 成活性。所述减少可以通过本领域已知的标准技术测定(Gruber等， 2002，J.Biol Chem.277(81)：27581-27584；Page等，1996，Cytokine 8(1)： 66-69；Park等，1997，Mol.Cells 7(6)：699-704；Wolf等，1997，Thromb Haemost 78：1505-1509；和Dale等，2002，Nature 415：175-179。UT-7 细胞测定描述于6.17小节，是测定降低或减低的红细胞生成活性技 术的一个非限制性实例。

本发明的核酸分子还包含上述核酸的互补核酸。

红细胞生成素突变蛋白核酸分子片段是指上述红细胞生成素突 变蛋白核酸序列，其长度可以是至少10个、12个、15个、20个、30 个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300 个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1050 个或更多个连续核苷酸。或者，所述片段可以包含编码红细胞生成 素突变蛋白至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、 80个或更多个连续氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，所述红 细胞生成素突变蛋白核酸分子编码表现出红细胞生成素突变蛋白的 至少一种相应的生物学活性的基因产物。红细胞生成素突变蛋白核 酸分子片段也可以指编码红细胞生成素突变蛋白结构域或编码成熟 红细胞生成素突变蛋白的红细胞生成素突变蛋白编码区部分。

来源于其它生物的红细胞生成素可用于生产本发明的红细胞生 成素突变蛋白。至于红细胞生成素突变蛋白或重组组织保护性细胞 因子核酸和来自其它物种的同源物和直向同源物的变异体的克隆， 本文公开的分离的红细胞生成素核酸序列公开可以加上标记并用于 筛选从得自源于目标生物的合适细胞或组织的mRNA构建的cDNA 文库。当cDNA文库源自与标记序列来源不同类型的生物时，所用 的杂交条件通常是低严格性的，并能根据例如靶和参考生物的相对 关系而对cDNA文库进行常规测定。

或者，再使用合适的严格性条件，所述标记片段也可用于筛选 源自目标生物的基因组文库。合适严格性条件如上所述是本领域技 术人员众所周知的，而且预期将会根据文库和标记序列所来源的特 定生物而变化。有关所述条件的指南参见例如Sambrook等，1989， Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；和Ausubel等，1989-1999，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates和Wiley Interscience，N.Y.，这两 个文献都通过引用全部结合到本文中。

在一个优选的实施方案中，为了制备重组组织保护性细胞因子， 可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，使用从相关或同源的重组组织 保护性细胞因子的已知序列设计的引物，从基因组或cDNA(即SEQ ID NO：7)扩增DNA。PCR用于扩增DNA克隆或基因组文库或cDNA 文库中的所需序列，然后进行选择。例如通过使用热循环仪和Taq 聚合酶(GeneAmp_)，可以进行PCR。聚合酶链式反应(PCR)通常用 于获得目标基因或基因片段。使用邻接编码可读框的核苷酸序列的 PCR引物，可以产生例如编码任何所需长度的重组组织保护性细胞 因子的核苷酸序列。或者，可以在合适位点用限制性内切核酸酶切 割重组组织保护性细胞因子基因序列(如果有这样的位点的话)，释放 编码重组组织保护性细胞因子基因的DNA片段。如果没有常规限制 位点，可以通过定点诱变和/或本领域已知的DNA扩增方法，在合适 位置产生所述位点(参见例如Shankarappa等，1992，PCR Method增刊 1：277-278)。然后分离编码重组组织保护性细胞因子的DNA片段， 并连接到合适的表达载体上，小心操作以确保合适的翻译阅读框。

为了在已表达肽序列中进行氨基酸取代，或者为了产生/缺失限 制位点以便进一步操作，可以使用本领域已知的任何诱变技术，修 饰DNA序列中的单个核苷酸。所述技术包括但不限于化学诱变、体 外定点诱变(Hutchinson等，1978，J.Biol.Chem.253：6551)、寡核苷酸 定点诱变(Smith，1985，Ann.Rev.Genet.19：423-463；Hill等，1987， Methods Enzymol.155：558-568)和如6.3小节描述的基于PCR的重叠 延伸(Ho等，1989，Gene 77：51-59)、基于PCR的大引物诱变(Sarkar等， 1990，Biotechniques 8：404-407)等。通过例如双链二脱氧核苷酸DNA 测序，可以证实修饰。

本发明也包括与上述段落的核苷酸序列互补的核酸分子、最好 是DNA分子。

在某些实施方案中，本发明的核酸分子是包括含有或编码异源 (例如载体、表达载体或融合蛋白)序列的核酸序列的核酸分子部分。

5.2.本发明的重组组织保护性细胞因子

本发明的重组组织保护性细胞因子包括保持部分或全部红细胞 生成活性的红细胞生成素突变蛋白。红细胞生成素是糖蛋白激素， 在人体内的分子量约为34kDa。其成熟蛋白包含165个氨基酸，而 且糖残基约占分子量的40％。用于本发明实践的重组组织保护性细 胞因子的形式包括如下人和其它哺乳动物红细胞生成素相关分子的 天然存在形式、合成形式和重组形式的至少一个氨基酸改变：红细 胞生成素、脱唾液酸红细胞生成素、去糖基化红细胞生成素、红细 胞生成素类似物、红细胞生成素模拟物、红细胞生成素片段、杂种 红细胞生成素分子、红细胞生成素受体结合分子、红细胞生成素激 动剂、肾红细胞生成素、脑红细胞生成素、其寡聚体和多聚体及其 同类物。所述等同的重组组织保护性细胞因子包括突变型红细胞生 成素，其可含有取代、包括内部缺失在内的缺失、包括产生融化蛋 白的添加在内的添加、或在氨基酸序列内和/或附近的氨基酸残基保 守取代，但是它们却产生“沉默”变化，因为所述变化产生功能上 等同的红细胞生成素突变蛋白或重组组织保护性细胞因子。在一个 优选的实施方案中，所述重组组织保护性细胞因子是非红细胞生成 的，即缺乏红细胞生成活性或表现出减低的红细胞生成活性。可以 在涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性 类似的基础上，进行保守氨基酸取代。例如非极性(疏水性)氨基酸包 括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨 酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半 胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括 精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和 谷氨酸。或者，非保守氨基酸变化以及较大的插入和缺失可用于产 生功能改变的重组组织保护性细胞因子。所述突变体可用于以需要 的方式改变红细胞生成素的特性。例如在一个实施方案中，用于本 发明实践的红细胞生成素可以是在影响受体结合的红细胞生成素的 如下4个功能域中一个或多个氨基酸改变的重组组织保护性细胞因 子：VLQRY(SEQ ID NO：1)和/或TKVNFYAW(SEQ ID NO：2)和/或 SGLRSLTTL(SEQ ID NO：3)和/或SNFLRG(SEQ ID NO：4)。在另一 个实施方案中，可以使用在影响所述分子的动力学或受体结合特性 的分子周围区域含有突变的红细胞生成素。哪种改变或在结构域的 哪个位置将影响结合，这可以通过标准方法来确定。例如，可以通 过成对丙氨酸突变(ala扫描诱变)改变结构域，然后测定突变体的结 合动力学以确定对受体结合的影响(Bernat等，2003，PNAS 100：952- 957；Wells等，1989，Science 244：1081-1085)。

术语“重组组织保护性细胞因子”以及“重组组织保护性细胞 因子”可互换使用或结合使用，来包括本发明的重组组织保护性细 胞因子及其进一步修饰，例如重组组织保护性细胞因子的去糖基化、 脱唾液酸化和其它部分糖基化形式或者氨基酸的化学修饰。所述变 异体的非限制性实例描述于Tsuda等，1990，Eur.J.Biochem.188：405- 411，所述文献通过引用结合到本文中。细胞因子是高度柔性的，就 人生长激素而言，已知柔性是活化所需要的(Wells等，1989，Science 244：1081-1085)。因此，稳定细胞因子的三维结构、阻止红细胞生成 素受体正常活化的突变包括在本发明中。另外，各种宿主系统可用 于重组组织保护性细胞因子的表达和产生，所述系统包括但不限于 细菌细胞系统、酵母细胞系统、昆虫细胞系统、植物细胞系统和包 括人细胞在内的哺乳动物细胞系统。例如，细菌产生的没有糖基化、 脱唾液酸化或部分糖基化的重组红细胞生成素可用于生产重组组织 保护性细胞因子的非糖基化形式，或可以用本领域已知方法进一步 糖基化，所述技术包括但不限于公开于以下文献的用岩藻糖基化调 整蛋白糖基化的技术：美国专利申请号US 2003/0040037 A1和US 2003/0003529。或者，可以在其它能使表达蛋白糖基化的系统中产生 重组组织保护性细胞因子，所述系统例如植物细胞和人类细胞。

如上所述，本发明包括对效应细胞能发挥积极作用的任何和全 部红细胞生成素受体活性调节剂分子，不管所述分子与红细胞生成 素的结构关系如何。

另外，可以修饰重组组织保护性细胞因子，以定制其对特定组 织的活性。可以采取若干非限制性策略以达到这种所需组织特异性， 包括缩短循环半寿期并因此减少重组组织保护性细胞因与类红细胞 前体相互作用时间的修饰，或者对红细胞生成素突变蛋白或重组组 织保护性细胞因子分子的一级结构的修饰。缩短循环半寿期的一种 方法是去除或修饰红细胞生成素具有的三个N联糖和一个O联糖的 糖基化部分。可以以各种方式产生糖基化重组组织保护性细胞因子 的所述变异体。例如，修饰红细胞生成素一级结构以产生本发明组 织保护性细胞因子的技术是数不清的，包括一个或多个特定氨基酸 的取代即通过使N联糖或O联糖糖基化位点的氨基酸突变和/或一个 或多个氨基酸的化学修饰、或添加干扰红细胞生成素与其受体相互 作用的其它结构。使用重组组织保护性细胞因子的所述形式都包括 在本发明中。可以根据糖链末端的唾液酸与糖链的化学键合，通过 特殊的唾液酸酶，将唾液酸去除。或者，可以通过不同方式，使用 切割特定键的其它酶，去除糖基化结构。在一个优选的实施方案中， 本发明非红细胞生成的重组组织保护性细胞因子的半寿期比天然红 细胞生成素缩短约90％。

然而，这些重组组织保护性细胞因子分子中的某些在其它组织 或器官中将会模拟红细胞生成素本身的作用。例如，含有天然红细 胞生成素氨基酸序列31-47的17-mer在红细胞发生上是无活性的， 但在体外的神经细胞中却有全部活性(Campana&O′Brien，1998：Int.J. Mol.Med.1：235-41)。

此外，如本文所述用途所需的衍生的重组组织保护性细胞因子 分子可以通过如下方法产生：胍化(guanidination)、酰胺化、氨甲酰 化、三硝基苯基化、乙酰化或琥珀酰化等酰化、硝化，或者在其它 方法例如有限蛋白酶解、氨基的去除中对精氨酸、天冬氨酸、谷氨 酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基或羧基的修饰，和/或 通过分子生物学技术对精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨 酸残基进行突变取代，以产生对特定器官和组织保持适当水平(但不 对其它细胞例如红细胞保持适当水平)的红细胞生成素突变蛋白或重 组组织保护性细胞因子(例如Satake等；1990，Biochim.Biophys.Acta 1038：125-9；所述文献通过引用全部结合到本文中)。如下所述的一 个非限制性实例是通过与乙二醛诸如苯基乙二醛反应，对红细胞生 成素精氨酸残基进行修饰(按照Takahashi，1977，J.Biochem.81：395- 402的方案)。如下面将会看到的，所述重组组织保护性细胞因子分 子完全保留红细胞生成素的神经营养效应。所述重组组织保护性细 胞因子分子全都包括在本文所述的各种用途和组合物中。另外，这 些化学修饰可进一步用于增强重组组织保护性细胞因子的保护效应 或者中和由天然红细胞生成素氨基酸突变所带来的分子电荷的任何 变化。所述修饰描述于2001年12月28日申请的同时待审的申请顺 序号PCT/US01/49479；2000年12月29日申请的顺序号09/753,132 和2002年7月3日申请的代理公司卷号KW00-009C02-US，所有所 述专利申请都通过引用全部结合到本文中。

本文提供了合成分子和重组分子，诸如脑红细胞生成素和肾红 细胞生成素等，红细胞生成素的重组哺乳动物形式，及其天然同种 型、肿瘤来源同种型和重组同种型，诸如重组表达分子和通过同源 重组制备的分子。此外，本发明包括含结合红细胞生成素受体肽的 分子，以及重组构建体或其它具有红细胞生成素的部分或全部结构 和/或生物学特性的分子，包括红细胞生成素或其片段的片段和多聚 体。本发明包括具有增加的糖基化位点或减少的糖基化位点的红细 胞生成素突变蛋白或其它重组组织保护性细胞因子。如上所述，术 语“红细胞生成素”和“模拟物”以及其它术语在本文可互换使用， 都是指与红细胞生成素和能够穿越内皮细胞屏障的分子相关的效应 细胞保扩和增强分子。此外，本发明也包括由转基因动物产生的分 子。应注意的是，本文包括的红细胞生成素分子在结构或其它方式 上不一定与红细胞生成素类似，除了与红细胞生成素受体相互作用 或调节红细胞生成素受体活性或如本文所述活化红细胞生成素激活 信号级联的能力之外。

作为非限制性实例，用于本发明实践的重组组织保护性细胞因 子的形式包括重组组织保护性细胞因子，例如在其羧基端具有改变 的氨基酸的形式，描述于美国专利5,457,089和美国专利4,835,260； 脱唾液酸红细胞生成素和每个分子中具有不同数目的唾液酸残基的 红细胞生成素同种型，例如描述于美国专利5,856,298；多肽，描述 于美国专利4,703,008；激动剂，描述于美国专利5,767,078；与红细 胞生成素受体结合的肽，描述于美国专利5,773,569和5,830,851；和 小分子模拟物，描述于美国专利5,835,382；和红细胞生成素类似物， 描述于WO9505465、WO9718318和WO9818926。所有上述引用 文献在其公开内容涉及有关用于本发明的重组组织保护性细胞因子 形式的各种替代形式或制备方法的意义上通过引用结合到本文中。

红细胞生成素可市售获得，例如得自Ortho Biotech Inc.，Raritan， NJ，商标为PROCRIT，以及得自Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA， 商标为EPOGEN。

红细胞生成素(EPO)和红细胞生成素样分子的活性(以单位计)通 常根据其在啮齿动物模型中刺激红细胞产生的效力来定义(也作为红 细胞生成素的国际标准的来源)。通常红细胞生成素(MW为～30,000- 34,000)的一个单位(U)约为8ng蛋白(1mg蛋白约为125,000U)。然 而，因为对红细胞发生的效应伴随着本文所需活性，并且不一定是 本发明的重组组织保护性细胞因子的可检测特性，所以根据红细胞 生成活性来定义本发明的某些组织保护性细胞因子的活性是不适当 的。因此，本文所用的红细胞生成素或红细胞生成素相关分子的活 性单位定义为在神经细胞系统或其它效应细胞系统引起与WHO国际 标准红细胞生成素在同一系统中引起的相同活性所需的蛋白量。技 术人员根据本文的指导将会容易地确定非红细胞发生的重组组织保 护性细胞因子或相关分子的单位。

重组组织保护性细胞因子突变蛋白包括但不限于由描述于6.3小 节的红细胞生成素核酸序列编码的蛋白和多肽。本发明包括功能上 等同于描述于6.3小节的红细胞生成素基因产物的突变蛋白。所述红 细胞生成素基因产物可在由红细胞生成素核酸序列编码的氨基酸序 列内含有红细胞生成素氨基酸残基的一个或多个缺失、添加或取代， 但它们却产生沉默变化，因此产生功能上等同的红细胞生成素基因 产物。可以在涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性 和/或两亲性类似的基础上，进行氨基酸取代。

本发明的重组组织保护性细胞因子突变蛋白可以经诱变产生， 例如不连续的点突变或截短。本发明的重组组织保护性细胞因子突 变蛋白保留天然形式的细胞保护生物学活性，但可缺乏所述蛋白天 然形式的一种或多种红细胞生成活性。因此，可以通过添加有限功 能的突变蛋白引发特定生物学效应。

可以为了增强功效、稳定性或翻译后修饰等目的，进行重组组 织保护性细胞因子突变蛋白结构修饰(例如改变突变蛋白的磷酸化模 式)。所述修饰的重组组织保护性细胞因子突变蛋白，当设计以保留 所述蛋白天然形式的至少一种细胞保护活性，或产生其特异性拮抗 剂时，可考虑是重组组织保护性细胞因子突变蛋白的功能等同物。 例如可以通过氨基酸取代、缺失或添加，产生这种经修饰的重组组 织保护性细胞因子突变蛋白。

例如，有理由相信，用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨 酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸、或用结构上相关的氨基酸 取代类似氨基酸(即同配突变和/或等电突变)将不会对所得分子的生物 学活性产生重大影响。

在重组组织保护性细胞因子突变蛋白的氨基酸序列的变化是否 产生功能同系物或非功能同系物(即缺乏非突变细胞因子的一种或多 种活性)，可以通过评价变异突变蛋白以类似野生型细胞因子方式在 细胞中产生效应、或竞争性抑制所述效应的能力，来容易地确定。 其中发生不止一个取代的重组组织保护性细胞因子突变蛋白可以按 相同方式容易地检测出来。

可以通过筛选突变体组合文库，鉴定表现出改变的功能的本发 明突变蛋白，所述突变体例如具有所需活性或缺乏这些活性的本发 明重组组织保护性细胞因子的截短突变体。在一个实施方案中，通 过核酸水平上的组合诱变，产生变异体的花斑(variegated)文库，并由 花斑的基因文库编码。可以通过例如将合成寡核苷酸混合物酶促连 接到核酸序列上，产生变异体的花斑文库，使得潜在蛋白序列的简 并序列可表达为不同多肽，或者，表达为一组较大的融合蛋白(例如 用于噬菌体展示)。可使用各种方法，从简并寡核苷酸序列产生本发 明重组组织保护性细胞因子的潜在变异体文库。合成简并寡核苷酸 的方法是本领域已知的(参见例如Narang，1983，Tetrahedron 39：3； Itakura等，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等，1984，Science 198：1056；Ike等，1983，Nucleic Acids Res.11：477)。

另外，本发明的重组组织保护性细胞因子编码序列的片段文库 可用于产生重组组织保护性细胞因子的花斑群体，供筛选和其后的 突变蛋白选择用。例如，在其中缺口在每分子中仅有约一次的条件 下，可以通过用核酸酶处理目标编码序列的双链PCR片段，产生编 码序列片段的文库，变性双链DNA，复性DNA以从不同的带缺口 产物形成可包括有义/反义对的双链DNA，从重新形成的双链体通过 用S1核酸酶处理而去除单链部分，并且将所得片段文库连接到表达 载体上。通过该方法，可以得到编码不同大小的目标重组组织保护 性细胞因子突变蛋白N端和内部片段的表达文库。

一些用于筛选由点突变或截短而产生的组合文库基因产物和用 于筛选具有选定特性的基因产物的cDNA文库的技术是本领域已知 的。适用于筛选大基因文库的高通量分析的最广泛使用的技术通常 包括将基因文库克隆到复制型表达载体中，用所得载体文库转化合 适细胞，并在其中对所需活性的检测便于分离编码其产物可被检测 的基因的载体的条件下表达组合基因。增大文库中功能性突变体的 频率的递归集团诱变(Recursive ensemble mutagenesis)(REM)的技术 可以与筛选测定结合使用，以鉴定本发明的重组组织保护性细胞因 子的突变蛋白(Arkin和Yourvan，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89： 7811-7815；Delgrave等，1993，Protein Engineering6(3)：327-331)。

可以通过在红细胞生成素核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸 取代、添加或缺失，来产生编码突变蛋白的分离的核酸分子，以将 一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码的重组组织保护性细 胞因子中。可以通过诸如定点诱变和PCR介导诱变等标准技术，引 入突变。简而言之，设计PCR引物，该引物缺失有待改变的氨基酸 的三核苷酸密码子并且用欲包括的氨基酸的三核苷酸密码子取代。 该引物用于编码目标重组组织保护性细胞因子的DNA的PCR扩增。 然后分离该片段并将其插入到编码目标组织保护性细胞因子的全长 cDNA中并让其重组表达。所得重组组织保护性细胞因子即包括所述 氨基酸取代。

保守或非保守氨基酸取代可在一个或多个氨基酸残基上进行。 可以进行保守和非保守取代。保守取代是发生在它们的例链中相关 的氨基酸家族内的取代。通常可将编码的氨基酸分为4个家族：(1) 酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3) 非极性＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。以类似方式，氨基酸所 有组成成分可以分为(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、 精氨酸、组氨酸，(3)脂族＝甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、丝氨酸、苏氨酸，而丝氨酸和苏氨酸任选被分为脂族-羟基；(4) 芳族＝苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)酰胺＝天冬酰胺、谷氨酰胺； 和(6)含硫＝半胱氨酸和甲硫氨酸(参见例如Biochemistry，第4版，L. Stryer编著，WH Freeman and Co.，1995)。

或者，可以通过诸如饱和诱变将突变随机引入重组组织保护性 细胞因子全部或部分编码序列中，并且所得突变体可以根据生物学 活性进行筛选，以鉴定保留活性的突变体。诱变后，可重组表达编 码的蛋白并可测定重组组织保护性细胞因子的活性。

除了用于本文的上述红细胞生成素修饰外，以下讨论详述了各 种本发明的重组组织保护性细胞因子。如上述Elliott等、Boissel等 和Wen等所述，以下红细胞生成素突变蛋白用于本文所述目的，并 可在药用组合物中提供以用于本文的方法。在本文中采用的突变蛋 白命名法中，改变的氨基酸用首先是天然氨基酸单字母密码子、其 次是其在红细胞生成素分子上的位置、最后是取代氨基酸单字母密 码子来表示。例如，“人红细胞生成素S100E”或“重组组织保护性 细胞因子100E”是指其中氨基酸100的丝氨酸变为谷氨酸的人红细 胞生成素分子。用于本发明实践的突变蛋白包括但不限于具有至少 一个以下氨基酸变化的人红细胞生成素：

I6A，C7A，C7S，

R10L，V11S，L12A，E13A，R14A，R14E，R14Q，Y15A，Y15F，Y15I，

K20E，K20A，

E21A，

N24K，C29S，C29Y，A30N，H32T，

C33S，C33Y，N38K，N83K，

P42N，

P42A，D43A，T44I，K45D，K45A，V46A，N47A，F48I，F48A，Y49A，Y49S，44-49缺失，

W51F，W51N，K52A，

Q59N，

E62T，

L67S，

L70A，

D96R，K97A

S100R，S100E，S100A，S100T，G101A，G101I，L102A，R103A，R103E，S104A，S104I，

L105A，T106A，T106I，T107A，T107L， L108K ，L108A，L108S，

K116A，

S126A，

T132A，

I133A，T134A，

K140A，

F142I，

R143A，

S146A，N147K，N147A，F148Y，P148A，L149A，R150A，R150E，G151A，

K152A，K152W，

L153A，

K154A，

L155A，G158A，

C160S，C161A，或R162A.

在优选的实施方案中，本发明的红细胞生成素突变蛋白或重组 组织保护性细胞因子包含一个或多个以上取代。在其它实施方案中， 红细胞生成素突变蛋白或另一个本发明的重组组织保护性细胞因子 包含一个以上取代或其组合。

在一个替代实施方案中，本发明的重组组织保护性细胞因子、 药用组合物、用途和治疗方法包括一个或多个以上取代，条件是它 们不包括一个或多个以下取代：I6A、C7A、K20A、P42A、D43A、 K45D、K45A、F48A、Y49A、K52A、K49A、S100E、R103A、K116A、 T132A、1133A、K140A、N147K、N147A、R150A、R150E、G151A、 K152A、K154A、G158A、C161A或R162A。在本发明的一个相关 的实施方案中，本发明的重组组织保护性细胞因子、药用组合物、 用途和治疗方法包括一个或多个以上取代，条件是它们不包括任何 以下的取代组合：N24K/N38K/N83K或A30N/H32T。

在某些实施方案中，可以组合不止一个以上氨基酸变化，产生 突变蛋白。所述组合的实例包括但不限于：K45D/S100E、A30N/H32T、 K45D/R150E、R103E/L108S、K140A/K52A、K140A/K52A/K45A、 K97A/K152A、K97A/K152A/K45A、K97A/K152A/K45A/K52A、 K97A/K152A/K45A/K52A/K140A、K97A/K152A/K45A/K52 A/KK140A/KK154A、N24K/N38K/N83K和N24K/Y15A。在某些实施方 案中，本发明的重组组织保护性细胞因子突变蛋白不包含一个或多 个以上多取代。在某些实施方案中，包含本发明的重组组织保护性 细胞因子突变蛋白的本发明药用组合物不包含一个或多个以上多取 代。在某些实施方案中，使用本发明的重组组织保护性细胞因子突 变蛋白的本发明用途和治疗方法不包括一个或多个以上多取代。

某些修饰或修饰的组合可影响红细胞生成素突变蛋白对结合受 体效应的柔性，所述受体诸如红细胞生成素受体或者是红细胞生成 素或红细胞生成素突变蛋白结合的第二受体。用于本发明组合物和 方法的所述修饰或其组合的实例包括但不限于K152W、R14A/Y15A、 I6A、C7A、D43A、P42A、F48A、Y49A、T132A、I133A、T134A、 N147A、P148A、R150A、G151A、G158A、C161A和R162A。已知 这些相应的突变在人生长激素中是有害的(Wells等)。在某些实施方 案中，本发明的重组组织保护性细胞因子突变蛋白不包含一个或多 个上述取代。在某些实施方案中，包含本发明的重组组织保护性细 胞因子突变蛋白的本发明药用组合物不包括一个或多个上述取代。 在某些实施方案中，使用本发明的重组组织保护性细胞因子突变蛋 白的本发明用途和治疗方法不包括一个或多个上述取代。

除了一个上述氨基酸修饰外，本发明的重组组织保护性细胞因 子还可没有唾液酸部分，称为脱唾液酸红细胞生成素突变蛋白。本 发明的脱唾液酸红细胞生成素突变蛋白最好是人脱唾液酸红细胞生 成素。在替代实施方案中，本发明的重组组织保护性细胞因子可具 有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10 个、11个、12或13个唾液酸残基。它们可以用唾液酸酶用将重组 组织保护性细胞因子脱唾液酸化而制备，所述酶例如由ProZyme Inc.， San Leandro，California的唾液酸酶A生产商包装上所描述。通常， PROZYME_GLYCOPRO_测序级唾液酸酶ATM(N-乙酰神经氨酸糖 基水解酶，EC 3.2.1.18)用于从复杂糖和糖蛋白例如红细胞生成素中切 割所有非还原端唾液酸残基。它也会切割支化唾液酸(连接内部残 基)。唾液酸酶A是从产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)的克隆中 分离出来的。

糖蛋白唾液酸化的非限制性实例可参见美国专利申请号US 2003/0040037，所述文献公开了用哺乳动物唾液酸转移酶或细菌唾液 酸转移酶唾液酸化的方法。另一个唾液酸化方法的非限制性实例和 糖蛋白上唾液酸模式的改变可参见美国专利申请号US 2002/0160460 A1和US6,399,336 B1。该申请中公开了体外用于唾液酸化重组糖蛋 白的方法，其中唾液酸供体部分与具有半乳糖或N-乙酰半乳糖胺受 体部分的糖蛋白结合。按此方式，连接受体和供体的唾液酸转移酶 将唾液酸连接到糖上。

本发明的重组组织保护性细胞因子可具有至少数目减少的N联 糖。为了去除N联糖，可以按照例如Hermentin等，1996，Glycobiology 6(2)：217-30描述的方法，用肼处理重组组织保护性细胞因子。如上 所述，红细胞生成素具有3个N联糖部分；本发明包括具有2个、1 个或不含N联糖的红细胞生成素。

本发明的重组组织保护性细胞因子可因使用至少一种糖苷酶处 理重组组织保护性细胞因子而具有至少降低的糖含量。例如可以采 用Chen和Evangelista，1998，Electrophoresis 19(15)：2639-44描述的 方法。此外，可以按照Hokke等，1995，Eur.J Biochem.228(3)：981-1008 描述的方法去除O联糖。

由于在非哺乳动物细胞中表达重组红细胞生成素突变蛋白，重 组组织保护性细胞因子分子的糖部分可具有至少非哺乳动物糖基化 模式。本发明的重组组织保护性细胞因子最好在昆虫细胞或植物细 胞中表达。作为非限制性实例，可以按照Quelle等，1989，Blood 74(2)： 652-657，用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达重组组织保护性细 胞因子。另一种方法描述于美国专利5,637,477。

可以按照Matsumoto等，1993，Biosci.Biotech.Biochem.57(8)： 1249-1252的方法，在植物系统中进行表达。或者，在细菌中的表达 将产生非糖基化形式的重组组织保护性细胞因子。这些仅仅是示例 性的用于本发明的重组组织保护性细胞因子的产生方法并且决不是 限制性的。

糖基化模式修饰的一个非限制性实例是使用岩藻糖基化，如公 开于美国专利申请号US2003/0040037 A1和美国专利申请号 US2003/0003529 A1。其中公开了用于修饰糖肽的糖基化模式的方 法，即通过使具有岩藻糖供体部分的反应混合物接触具有岩藻糖基 转移酶的受体部分的糖肽，修饰糖肽的糖基化模式。也公开了使用 重组糖肽来修饰糖基化模式的方法。

本发明的重组组织保护性细胞因子可具有至少一个或多个也可 被化学还原的氧化糖。例如，重组组织保护性细胞因子可以是高碘 酸盐氧化的红细胞生成素突变蛋白；高碘酸盐氧化的红细胞生成素 突变蛋白也可用硼氢化物盐诸如硼氢化钠或氰基硼氢钠进行化学还 原。红细胞生成素突变蛋白的高碘酸盐氧化可以例如通过Linsley等， 1994，Anal.Biochem.219(2)：207-17描述的方法进行。可以按照Tonelli 和Meints，1978，J.Supramol.Struct.8(1)：67-78的方法，先进行化学 还原，接着进行高碘酸盐氧化。

应该注意的是，对天然红细胞生成素的某些上述和下述氨基酸 修饰是不可能的，因为在天然分子中用于化学修饰的特定靶氨基酸 已经改变，形成本发明的重组组织保护性细胞因子。当然，改变的 氨基酸可以凭借自身经历化学修饰，本发明包括所有这样的分子。 本领域技术人员将容易确定本发明的重组组织保护性细胞因子可用 的氨基酸残基和对其可用的修饰。

用于上述用途的重组组织保护性细胞因子可具有至少一个或多 个修饰精氨酸残基。例如，重组组织保护性细胞因子在一个或多个 精氨酸残基上可以包含R-乙二醛部分，其中R为芳基、杂芳基、低 级烷基、低级烷氧基或环烷基，或α-脱氧糖醇基。本文所用的术语低 级“烷基”是指最好含有1-6个碳原子的直链或支链饱和脂族烃基。 代表性的所述基团是甲基、乙基、异丙基、异丁基、丁基、戊基、 己基等。术语“烷氧基”是指通过氧连接所述分子其余部分的上述 低级烷基。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基 等。术语“环烷基”是指3个至至多约8个碳的环烷基，包括例如 环丙基、环丁基、环己基等。术语芳基是指苯基和萘基。术语杂芳 基是指含有4-10个环原子和1-3个选自氧、氮和硫的杂原子的杂环 基。实例包括但不限于异噁唑基、苯基异噁唑基、呋喃基、嘧啶基、 喹啉基、四氢喹啉基、吡啶基、咪唑基、吡咯烷基、1，2，4-三唑基、 噻唑基、噻吩基等。R基团可以被取代，例如3-脱氧葡糖醛酮的2，3，4- 三羟丁基。R-乙二醛化合物的典型实例是乙二醛、甲基乙二醛、3-脱 氧葡糖醛酮和苯基乙二醛。优选的R-乙二醛化合物是甲基乙二醛或 苯基乙二醛。使用苯基乙二醛进行所述修饰的示例性方法可见于 Werber等，1975，Isr.J. Med. Sci.11(11)：1169-70。

在另一个实施例中，最好在约50毫摩尔的硼酸盐缓冲液中，在 pH8-9，可以通过与例如2，3-丁二酮或环己二酮等连二酮反应，修饰 至少一个精氨酸残基。用2，3-丁二酮的后-个修饰方法可以按照 Riordan，1973，Biochemistry 12(20)：3915-3923的方法进行；而用环己 二酮的方法可以按照Patthy等，1975，J. Biol.Chem 250(2)：565-9的方 法进行。

本发明的重组组织保护性细胞因子可以包含至少一个或多个修 饰赖氨酸残基或红细胞生成素分子的一个N端氨基修饰，所述修饰 例如来自赖氨酸残基与氨基改性剂反应所得到的修饰。在另一个实 施方案中，赖氨酸残基可以通过与乙二醛反应(例如与乙二醛、甲基 乙二醛或3-脱氧葡糖醛酮反应)而被修饰，形成相应的α-羧基烷基衍 生物。与乙二醛反应以形成羧甲基赖氨酸的实例可见于Glomb和 Monnier，1995，J.Biol.Chem.270(17)：10017-26，或者与甲基乙二醛 反应以形成(1-羧乙基)赖氨酸的实例可见于Degenhardt等，1998，Cell. Mol.Biol.(Noisy-le-grand)44(7)：1139-45。修饰的赖氨酸残基还可进 一步被化学还原。例如，重组组织保护性细胞因子可以通过赖氨酸 基团被生物素化，其中D-生物素酰-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯 与红细胞生成素反应，接着按照如下文献的描述通过在Centricon 10 柱上凝胶过滤去除未反应的生物素：Wojchowski和Caslake，1989， Blood74(3)：952-8。在该文献中，作者使用了红细胞生成素生物素化 的3种不同方法，每种方法都可用来制备用于本文用途的红细胞生 成素。生物素可以加入到(1)唾液酸部分(2)羧基或(3)氨基上。

在另一个优选实施方案中，所述赖氨酸可以与醛或还原糖反应 形成亚胺，所述亚胺可以通过被氰基硼氢钠还原形成N-烷基化赖氨 酸残基例如葡萄糖醇基赖氨酸而稳定，或者在还原糖的情况下可以 通过Amadori或Heyns重排以在红细胞生成素分子中形成α-脱氧-α- 氨基糖例如α-脱氧-α-果糖基赖氨酸残基而稳定。作为一个实例，通 过与0.5M葡萄糖的磷酸钠缓冲液(pH7.4)保温60天，可以制备果糖 基赖氨酸修饰的蛋白，该方法描述于Makita等，1992，J.Biol.Chem. 267：5133-5138。在另一个实例中，赖氨酸基团可以例如通过与氰酸 根离子反应而被氨甲酰化，或者与烷基-异氰酸盐或芳基-异氰酸盐、 烷基-异硫氰酸盐或芳基-异硫氰酸盐反应而被烷基-氨甲酰化或芳基- 氨甲酰化或烷基-硫代氨甲酰化或芳基-硫代氨甲酰化，或者可以通过 活性烷基羧酸衍生物或芳基羧酸衍生物而酰化，例如通过与乙酸酐 或琥珀酸酐或邻苯二甲酸酐反应。实例是用4-磺苯基异硫氰酸盐或 乙酸酐修饰赖氨酸基团，这两者都描述于Gao等，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91(25)：12027-30。赖氨酸基团也可以通过与三硝基苯磺酸、 或者最好与其盐反应而被三硝基苯基修饰。

重组组织保护性细胞因子的至少一个酪氨酸残基可以通过亲电 子试剂在芳环位置内被例如硝化或碘化修饰。作为非限制性实例， 红细胞生成素可以与四硝基甲烷反应(Nestler等，1985，J.Biol.Chem. 260(12)：7316-21；或者如实施例4所述被碘化。

重组组织保护性细胞因子的至少一个天冬氨酸残基或一个谷氨 酸残基可以例如通过与碳二亚胺反应后再通过与胺(例如但不限于甘 氨酰胺)反应而被修饰。

在另一个实例中，重组组织保护性细胞因子的一个色氨酸残基 可以例如通过与正溴琥珀酰亚胺或正氯琥珀酰亚胺反应后再通过例 如描述于Josse等，Chem Biol Interact 1999 May 14；119-120的方法而 被修饰。

在再一个实例中，重组组织保护性细胞因子可以通过去除至少 一个氨基而制备，这可以通过与茚三酮反应后再通过与硼氢化物反 应还原随后产生的羰基而完成。

在又一个实例中，提供在红细胞生成素分子中至少一个半胱氨 酸键具有至少一个口的重组组织保护性细胞因子，其中红细胞生成 素分子通过与例如二硫苏糖醇等还原剂反应，接着通过随后产生的 巯基与碘乙酰胺、碘乙酸或另一种亲电子试剂反应以阻止二硫键重 新形成。如上所述，可以通过以下两种方法之一或两法联用来消除 二硫键，即改变参与实际交联的半胱氨酸分子、或至少一个导致红 细胞生成素突变蛋白不能形成至少一个天然分子中存在的二硫键的 其它氨基酸残基。

可以通过对红细胞生成素进行靶向特定残基的有限化学蛋白酶 解(例如在色氨酸残基后切割)而制备重组组织保护性细胞因子。所得 重组组织保护性细胞因子片段包括在本文中。

如上所述，用于本文目的的重组组织保护性细胞因子可具有至 少一个上述修饰，但也可具有不止一个以上修饰。作为实例的在其 分子的糖部分具有一个修饰和在其氨基部分具有一个修饰的重组组 织保护性细胞因子，重组组织保护性细胞因子可以是脱唾液酸红细 胞生成素并且其45位的赖氨酸残基变成天冬氨酸。

因此，包括用于本文所述用途的各种重组组织保护性细胞因子 分子和含有它们的药用组合物。如上所述，所述红细胞生成素分子 包括但不限于突变蛋白，所述突变蛋白是脱唾液酸红细胞生成素、N- 去糖基化红细胞生成素、O-去糖基化红细胞生成素、具有减少糖含 量的红细胞生成素、具有糖基化模式改变的红细胞生成素、具有氧 化后又被还原的糖的红细胞生成素、芳基乙二醛修饰的红细胞生成 素、烷基乙二醛修饰的红细胞生成素、2，3-丁二酮修饰的红细胞生成 素、环己二酮修饰的红细胞生成素、生物素化红细胞生成素、N-烷 基化赖氨酰红细胞生成素、葡萄糖醇基赖氨酸红细胞生成素、α-脱氧 -α-果糖基赖氨酸-红细胞生成素、氨甲酰化红细胞生成素、乙酰化红 细胞生成素、琥珀酰化红细胞生成素、α-羧基烷基红细胞生成素、硝 化红细胞生成素、碘化红细胞生成素，这是根据本发明的定义命名 的一些有代表性的但又是非限制性的实例。优选基于人红细胞生成 素的上述修饰形式。

此外，本发明包括上述重组组织保护性细胞因子和包含所述化 合物的药用组合物。作为非限制性实例，所述重组组织保护性细胞 因子包括高碘酸盐氧化的红细胞生成素突变蛋白、葡萄糖醇基赖氨 酸红细胞生成素突变蛋白、果糖基赖氨酸红细胞生成素突变蛋白、3- 脱氧葡糖醛酮红细胞生成素突变蛋白和氨甲酰化脱唾液酸红细胞生 成素突变蛋白。

5.3.表达系统

各种宿主表达载体系统可用于产生包括本发明的红细胞生成素 突变蛋白分子在内的重组组织保护性细胞因子。所述宿主表达系统 代表载体，通过所述载体可产生目标重组组织保护性细胞因子并在 其后可纯化，而且所述系统也代表细胞，所述细胞当用合适核苷酸 编码序列转化或转染时在原位表现出修饰的红细胞生成素基因产 物。这些包括但不限于细菌、昆虫、植物、包括人在内的哺乳动物 宿主系统，例如但不限于用含有重组组织保护性细胞因子产物编码 序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含 有重组组织保护性细胞因子编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰 菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的植物细胞系统， 或用含有重组组织保护性细胞因子编码序列的重组质粒表达载体(例 如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包括携带来自哺乳动物细胞基因 组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒启动子(例 如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的包 括人细胞系统在内的哺乳动物细胞系统(例如HT1080、COS、CHO、 BHK、293、3T3)。

本文所用的表达构建体是指与一个或多个允许重组组织保护性 细胞因子在合适宿主细胞中表达的调节区有效连接的重组组织保护 性细胞因子编码核苷酸序列。“有效连接”是指其中调节区和待表达 重组组织保护性细胞因子多肽序列按如下方式结合和定位的连接： 允许转录、并最终翻译所述重组组织保护性细胞因子序列。各种表 达载体都可用于表达重组组织保护性细胞因子，包括但不限于质粒、 粘粒、噬菌体、噬菌粒或修饰病毒。实例包括诸如λ衍生物等噬菌体， 或诸如pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene)等质 粒。通常，所述表达载体包含用于在合适宿主细胞中复制所述载体 的功能性复制起点、一个或多个用于插入重组组织保护性细胞因子 基因序列的限制内切核酸酶位点，和一个或多个选择标记。

在优选的实施方案中，pCI-neo载体用于使寡核苷酸退火到原来 的人EPO cDNA克隆中，以引入上述突变。pCI-neo载体含有新霉素 磷酸转移酶基因，该基因是用于哺乳动物细胞的选择标记。通过用 抗生素G-418选择转染细胞，pCI-neo载体可用于瞬时表达或稳定表 达。(Brondyk，1995，New Mammalian Expression Vector with a selectable marker：pCI-neo.Promega Notes 51，10-14)。

对于重组组织保护性细胞因子在哺乳动物宿主细胞中的表达， 可使用各种调节区，例如SV40早期和晚期启动子、巨细胞病毒(CMV) 立即早期启动子和劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(RSV-LTR)启动子。 可用于哺乳动物细胞的诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白II 基因、小鼠乳腺肿瘤病毒糖皮质激素效应长末端重复序列(MMTV- LTR)和α-干扰素基因连接的启动子(Williams等，1989，Cancer Res.49： 2735-42；Taylor等，1990，Mol.Cell.Biol.10：165-75)。

可以通过在表达载体中包括合适的转录增强子元件，增强在宿 主细胞中重组组织保护性细胞因子的表达功效，所述增强子元件诸 如存在于SV40病毒、乙肝病毒、巨细胞病毒、免疫球蛋白基因、金 属硫蛋白、α-肌动蛋白中的增强子元件(参见Bittner等，1987，Methods in Enzymol.153：516-544；Gorman，1990，Curr.Op.in Biotechnol 1：36- 47)。

表达载体也可含有允许所述载体在不止一种类型的宿主细胞中 保持和复制的序列，或者将所述载体整合到宿主染色体上。所述序 列可包括但不限于复制起点、自主复制序列(ARS)、着丝粒DNA和 端粒DNA。也可有利地使用在至少两种类型的宿主细胞中复制和保 持的穿梭载体。

另外，表达载体可含有用于初步分离或鉴定含有重组组织保护 性细胞因子编码DNA的宿主细胞的选择标记基因或筛选标记基因。 为了长期、高产地产生重组组织保护性细胞因子，可以使用在哺乳 动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞中稳定的表达。各种选 择系统都可用于哺乳动物细胞，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激 酶(Wigler等，1977，Cell 11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (Szybalski和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.48：2026)和 腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，1980，Cell 22：817)基因可分别用 于tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞。另外，抗代谢物抗性可用作根据 以下进行选择的基础：二氢叶酸还原酶(dhfr)，它赋予对甲氨蝶呤的 抗性(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：3567；O′Hare等，1981， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1527)；gpt，它赋予对霉酚酸的抗性 (Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：2072)；新霉 素磷酸转移酶(neo)，它赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin 等，1981，J.Mol.Biol.150：1)；和潮霉素磷酸转移酶(hyg)，它赋予对 潮霉素的抗性(Santerre等，1984，Gene 30：147)。也可使用其它选择标 记，例如但不限于组氨醇和ZeocinTM。

为了将重组组织保护性细胞因子编码序列插入到载体的克隆位 点，带有调节功能的DNA序列诸如启动子必须与编码序列连接。为 了做到这一点，提供合适相容性限制位点的接头可以通过本领域众 所周知的技术，连接到cDNA或编码重组组织保护性细胞因子的合 成DNA的末端(Wu等，1987，Methods Enzymol.152：343-349)。用限 制酶切割后连接前可进行修饰，通过反向消化或补平单链DNA末端 而产生平端。或者，可以通过使用含有所需限制酶位点的引物，通 过PCR扩增DNA，将所需限制酶位点引入到DNA片段中。

可以将包含与调节区有效连接的重组组织保护性细胞因子编码 序列的表达构建体直接导入合适的宿主细胞中，用于本发明的重组 组织保护性细胞因子的表达和产生，无需进一步克隆(参见例如美国 专利第5,580,859号)。表达构建体也可含有便于将编码序列整合到宿 主细胞基因组中的DNA序列，例如通过同源重组。在这种情况下， 不一定使用包含适于合适宿主细胞的复制起点的表达载体，以便在 宿主细胞中复制和表达重组组织保护性细胞因子。

可以通过本领域已知的各种技术，将含有克隆重组组织保护性 细胞因子编码序列的表达构建体导入哺乳动物宿主细胞中，所述技 术包括但不限于磷酸钙介导的转染(Wigler等，1977，Cell 11：223- 232)、脂质体介导的转染(Schaefer-Ridder等，1982，Science 215：166- 168)、电穿孔(Wolff等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84：3344)和微注射 (Cappechi，1980，Cell 22：479-488)。

另外，可选择以所需的特定方式调节插入序列的表达、或者修 饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的所述修饰(例如糖基化) 和加工(例如切割)对蛋白功能可能是重要的。不同宿主细胞对蛋白和 基因产物翻译后加工和修饰具有特征性的特有机制。可以选择合适 的细胞系或宿主系统，保证表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为 此，可使用对初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化和磷酸化 的细胞机器的真核宿主细胞。包括人宿主细胞在内的哺乳动物宿主 细胞包括但不限于HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、 293、3T3和WI38。

为了长期、高产地产生重组蛋白，最好是稳定地表达。例如， 可以对稳定表达重组组织保护性细胞因子相关分子基因产物的细胞 系进行工程改造。不使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用被 合适表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺 苷酸化位点等)控制的DNA和选择标记来转化宿主细胞。导入外源 DNA后，可以让工程细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后转移到 选择性培养基中。重组质粒中的选择标记赋予对选择物的抗性，并 且允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中，让其生长以形成转化灶， 随后可以被克隆并扩增成细胞系。该方法可有利地用于将表达重组 组织保护性细胞因子基因产物的细胞系进行工程改造。所述工程细 胞系在筛选和评价影响重组组织保护性细胞因子基因产物的内源活 性的化合物中特别有用。

任何所述克隆载体和表达载体都可以通过本领域众所周知的技 术，从已知DNA序列合成和装配。调节区和增强子元件可以是各种 来源的，天然和合成的都可以。某些载体和宿主细胞可市售获得。 有用的载体的非限制性实例描述于Current Protocols in Molecular Biology的附录5，1988，Ausubel等编著，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience，所述文献通过引用结合到本文中；和诸如Clontech Laboratories，Stratagene Inc.和Invitrogen，Inc等供应商的产品目录上。

或者，各种基于病毒的表达系统也可用于在哺乳动物细胞中重 组表达组织保护性细胞因子。使用DNA病毒骨架的载体来源于猿猴 病毒40(SV40)(Hamer等，1979，Cell 17：725)、腺病毒(Van Doren等， 1984，Mol.Cell Biol.4：1653)、腺伴随病毒(McLaughlin等，1988，J. Virol.62：1963)和牛乳头瘤病毒(Zinn等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.79： 4897)。在其中用腺病毒作为表达载体的情况下，供体DNA序列可 连接到腺病毒转录/翻译控制区，例如晚期启动子和三联前导序列。 该嵌合基因可以通过体外或体内重组插入到腺病毒基因组中。在病 毒基因组非必需区(例如区E1或E3)的插入将产生活的并且能在感染 宿主中表达异源产物的重组病毒(参见例如Logan和Shenk，1984，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：3655-3659)。

或者，可使用痘苗病毒7.5K启动子(参见例如Mackett等，1982， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79：7415-7419；Mackett等，1984，J.Virol. 49：857-864；Panicali等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79：4927- 4931)。在其中使用人宿主细胞的情况下，可使用基于Epstein-Barr病 毒(EBV)起点(Orip)和EBV核抗原1(EBNA-1；反式作用复制因子)的 载体。所述载体可用于各种各样的人宿主细胞，例如EBO-pCD (Spickofsky等，1990，DNA Prot.Eng.Tech.2：14-18)、pDR2和αDR2(可 得自Clontech Laboratories)。

可以通过基于逆转录病毒表达系统，进行重组组织保护性细胞 因子的表达。与转染不同，逆转录病毒可将基因有效感染和转移给 各种各样的细胞类型，包括例如原代造血细胞。在诸如莫洛尼鼠类 白血病病毒等逆转录病毒中，大多数病毒基因序列可以被去除并被 重组组织保护性细胞因子编码序列所取代，而可反过来供应其失去 的病毒功能。逆转录病毒载体感染的宿主范围也可以通过选用包装 载体的包膜来操作。

例如，逆转录病毒载体可以包含5′长末端重复序列(LTR)、3′ LTR、包装信号、细菌复制起点和选择标记。将重组组织保护性细胞 因子DNA插入到5′LTR和3′LTR之间的位置上，使得从5′LTR启 动子的转录能转录克隆化DNA。5′LTR包含启动子，依次包括但不 限于LTR启动子、R区、U5区和引物结合位点。这些LTR元件的 核苷酸序列是本领域众所周知的。异源启动子以及多药选择标记也 包括在表达载体中，以便进行感染细胞的选择(参见McLauchlin等， 1990，Prog.Nucleic Acids Res.和Molec.Biol.38：91-135；Morgenstern 等，1990，Nucleic Acids Res.18：3587-3596；Choulika等，1996，J.Virol 70：1792-1798；Boesen等，1994，Biotherapy 6：291-302；Salmons和 Gunzberg，1993，Human Gene Therapy 4：129-141；和Grossman和 Wilson，1993，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114)。

在本发明的一个实施方案中，唾液酸残基不足或完全缺乏唾液 酸残基的重组组织保护性细胞因子可由包括人细胞在内的哺乳动物 细胞产生。所述细胞可经工程化，以减少或缺乏添加唾液酸的酶， 即β-半乳糖苷-α-2，3-唾液酸转移酶(α-2，3-唾液酸转移酶@)和β-半乳糖 苷-α-2，6-唾液酸转移酶(α-2，6-唾液酸转移酶@)活性。在一个实施方 案中，使用其中α-2，3-唾液酸转移酶基因和/或α-2，6-唾液酸转移酶基 因中的一个或两个都缺失的哺乳动物细胞。可以采用本领域众所周 知的基因剔除技术构建所述缺失。在另一个实施方案中，二氢叶酸 还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用作产生重组组织保 护性细胞因子的宿主细胞。CHO细胞不表达α-2，6-唾液酸转移酶，因 此不加入以2，6键连接这些细胞产生的糖蛋白的N联寡糖的唾液酸。 结果，CHO细胞产生的重组蛋白缺乏以2，6键连接半乳糖的唾液酸 (Sasaki等，(1987；Takeuchi等，参见上文；Mutsaers等，Eur.J. Biochem. 156，651(1986)；Takeuchi等，J.Chromotgr.400，207(1987)。在一个实 施方案中，为了产生用于产生脱唾液酸红细胞生成素的宿主细胞， 使在CHO细胞中编码α-2，3-唾液酸转移酶的基因缺失。所述剔除α-2，3- 唾液酸转移酶的CHO细胞完全缺乏唾液酸转移酶活性，结果可用于 脱唾液酸红细胞生成素突变蛋白的重组表达和产生。

在另一个实施方案中，可以通过干扰唾液酸转运到高尔基体而 产生脱唾液酸糖蛋白，例如Eckhardt等，1998，J.Biol.Chem.273： 20189-95)。采用本领域技术人员众所周知的方法(例如Oelmann等， 2001，J.Biol.Chem.276：26291-300)，可以完成核苷酸糖CMP-唾液酸 转运蛋白的诱变，产生中国仓鼠卵巢细胞的突变体。这些细胞不能 向糖蛋白例如重组组织保护性细胞因子上加入唾液酸残基，所以只 能产生脱唾液酸红细胞生成素突变蛋白。

产生红细胞生成素突变蛋白的转染哺乳动物细胞也产生胞质唾 液酸酶，所述酶如果渗漏到培养基中会高效降解唾液酸红细胞生成 素突变蛋白(例如Gramer等，1995 Biotechnology 13：692-698)。采用本 领域技术人员众所周知的方法(例如由Ferrari等，1994，Glycobiology 4： 367-373提供的信息)，细胞系可以被转染、突变或其它方法以组成型 方式产生唾液酸酶。以这种方式，脱唾液酸红细胞生成素突变蛋白 可以在脱唾液酸红细胞生成素突变蛋白生产过程中产生。

重组细胞可以在温度、培养时间、光密度和培养基组成的标准 条件下进行培养。或者，改进的培养条件和培养基可用于增大重组 组织保护性细胞因子的产生。例如，重组细胞可在启动诱导型重组 组织保护性细胞因子表达的条件下生长。本领域任何已知技术都可 用于为重组组织保护性细胞因子生产建立最佳条件。包含重组组织 保护性细胞因子的细胞裂解物或提取物可用于进一步纯化，以分离 重组组织保护性细胞因子。

为了便于重组组织保护性细胞因子的纯化，标记氨基酸序列是 六组氨酸肽，诸如pQE载体中提供的标记(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)和其它标记，它们许多都是市售的。 例如，如Gentz等，1989，PNAS 86：821所述，提供用于融合蛋白的 常规纯化的六组氨酸。用于纯化的其它肽标记包括但不限于血凝素 “HA”标记，所述标记对应于来自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等， 1984，Cell 37：767)，以及“flag”标记。可使用本领域已知的任何纯 化方法(参见例如国际专利公布号WO 93/21232；EP 439,095；Naramura 等，1994，Immunol.Lett.39：91-99；美国专利5,474,981；Gillies等， 1992，PNAS 89：1428-1432；和Fell等，1991，J Immunol 146：2446- 2452)。

5.4. 重组组织保护性细胞因子组织保护特性的测定

制备重组组织保护性细胞因子并且在某些实施方案中进一步对 本发明的组织保护性细胞因子进行化学修饰后，本领域普通技术人 员可使用众所周知的测定来检测所述细胞因子的组织保护特性和对 骨髓效应的缺乏。

例如，可以通过使用TF-1测定来检验重组组织保护性细胞因子 的非红细胞发生的效应。在该测定中，让TF-1细胞在37℃ CO2培 养箱中在补充了5ng/ml GM-CSF和10％FCS的完全RPMI培养基中 培养1天。然后将所述细胞在饥饿培养基(5％FCS，没有GM-CSF) 中洗涤并以106细胞/ml的密度在饥饿培养基(5％FCS，没有GM-CSF) 中悬浮16小时。通过以下步骤准备96孔板：(1)在外围孔中加入100μl 无菌水以保持湿度；(2)向5孔中加入培养基(10％FCS，无细胞或 GM-CSF)；和(3)在其余孔中以25,000细胞/孔接种含10％FCS和所 述重组组织保护性细胞因子的培养基(每种待测细胞因子5孔)。如果 细胞增殖，则重组组织保护性细胞因子可以是红细胞发生的。然后 可以在监测由重组组织保护性细胞因子引起的血细胞比容增加的体 内测定中，测试所述化合物的体内效应。阴性结果—在TF-1体外测 定中细胞未增殖和/或在体内测定中血细胞比容未增加—表明重组组 织保护性细胞因子是非红细胞发生的。

作为上述TF-1测定的替代方法，本领域技术人员可采用本领域 已知的其它红细胞生成测定，包括但不限于UT-7细胞测定，诸如下 面实施例部分描述的测定。

可以采用P-19体外测定或者在小鼠水中毒体内测定，来检验重 组组织保护性细胞因子的组织保护特性，这两种测定在下面有更详 细地概述。替代的测定，包括但不限于以下实施例中概述的其它测 定，诸如PC-12和hypocampal slice测定。以上测定仅作为实例，确 定重组组织保护性细胞因子的组织保护性效应和/或骨髓效应的其它 合适测定是本领域普通技术人员已知的，也是本发明所预期的。

5.5.本发明的药用组合物

在本发明-方面的实践中，可以通过在血管系统中提供足够水 平的重组组织保护性细胞因子的任何途径，将上述含有重组组织保 护性细胞因子的药用组合物给予哺乳动物，以允许转运穿越内皮细 胞屏障并对效应细胞有有益影响。当用于灌注组织或器官时，可得 到类似结果。在其中红细胞生成素突变蛋白用于离体灌注的情况下， 重组组织保护性细胞因子可以是任何形式的红细胞生成素突变蛋 白，例如上述重组组织保护性细胞因子。在细胞或组织是非血管化 和/或给药是通过用本发明组合物浸泡细胞或组织的情况下，所述药 用组合物提供对效应细胞有益的有效量的重组组织保护性细胞因 子。重组组织保护性细胞因子转运所穿越的内皮细胞屏障包括紧密 连接、穿孔(perforated)连接、穿通(fenestrated)连接和哺乳动物体内存 在的其它任何类型的内皮屏障。优选的屏障是内皮细胞紧密连接， 但本发明并不限于此。

上述重组组织保护性细胞因子通常用于以下人类疾病的治疗性 治疗或预防性治疗：主要具有神经病学症状或精神病学症状的中枢 神经系统疾病或周围神经系统疾病以及眼病、心血管疾病、心肺疾 病、呼吸道疾病、肾病、尿道疾病和生殖道疾病、胃肠道疾病和内 分泌异常和代谢异常。具体地讲，所述病症和疾病包括低氧病症， 所述病症对可兴奋组织有不利影响，所述可兴奋组织例如在脑、心、 视网膜/眼等中枢神经系统组织、周围神经系统组织或心脏组织或视 网膜组织中的可兴奋组织。因此，本发明可用于治疗或预防由各种 病症和情况的低氧病症引起的对可兴奋组织的损害。所述病症和情 况的非限制性实例如下表所提供。

在按本发明可治疗的神经元组织病理病症保护的实例中，所述 病理病症包括由神经元组织氧合降低所导致的病症。可以通过本发 明的方法，治疗降低神经元组织的氧利用度而导致的应激、损伤并 最终导致神经元细胞死亡的任何病症。通常称为低氧和/或局部缺血 的这些病症是由以下疾病引起的或者包括但不限于以下疾病：中风、 血管闭塞、产前缺氧或产后缺氧、窒息(suffocation)、噎塞、近似淹 溺、一氧化碳中毒、烟雾吸入、包括外科手术和放疗在内的创伤、 窒息(asphyxia)、癫痫、低血糖、慢性阻塞性肺部疾病、肺气肿、成 人呼吸窘迫综合征、低血压休克、败血症性休克、过敏性休克、胰 岛素休克、镰状细胞危象、心搏停止、节律障碍、氮麻醉和心肺分 流手术所致神经缺陷。

在一个实施方案中，例如可以给予具体的重组组织保护性细胞 因子的组合物，以防止在例如肿瘤切除或动脉瘤切除等外科手术中 损伤或组织损伤风险所引起的损伤或组织损伤。可以通过本文所述 方法治疗的由低血糖引起或导致的其它病理病症包括胰岛素过量(也 称为医源性高胰岛素血症)、胰岛瘤、生长激素缺乏、肾上腺皮质功 能减退、药物过量和某些肿瘤。

由可兴奋神经元组织损伤引起的其它病理病症包括癫痫，例如 癫痫、惊厥或慢性癫痫。其它可治疗病症和疾病包括但不限于例如 中风、多发性硬化、低血压、心搏停止、早老性痴呆、帕金森病、 大脑麻痹、脑创伤或脊髓创伤、艾滋病性痴呆、年龄相关认知功能 减退、记忆力减退、肌萎缩性侧索硬化、癫痫、醇中毒、视网膜缺 血、由青光眼导致的视神经损害和神经元损失。

本发明具体的组合物和方法可用于治疗由病症或各种创伤引起 的炎症，例如物理或化学诱发的炎症。所述创伤可包括脉管炎、慢 性支气管炎、胰腺炎、骨髓炎、类风湿性关节炎、肾小球性肾炎、 视神经炎、颞动脉炎、脑炎、脑膜炎、横贯性脊髓炎、皮肌炎、多 肌炎、坏死性筋膜炎、肝炎和坏死性小肠结肠炎。

有证据表明，活化星形胶质细胞可以通过产生神经毒素对神经 元发挥细胞毒作用。神经胶质细胞响应脑缺血时可释放一氧化氮、 活性氧组分和细胞因子(参见Becker，K.J.2001.Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic stroke(靶向局部缺血 性中风的中枢神经系统炎症反应).Curr Opinion Neurol 14：349-353和 Mattson，M.P.，Culmsee，C.和Yu，Z.F.2000.Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in stroke(中风的细胞凋亡和抗凋亡机制).Cell Tissue Res 301：173-187.)。研究进一步表明，在神经变性模型中，神经胶质的活 化和随后产生炎性细胞因子取决于原发性神经元损伤(参见Viviam，B.， Corsini，E.，Galli，C.L.，Padovani，A.，Ciusani，E.和Marinovich，M.2000. Dying neural cell activate glia through the release of a protease product (濒死神经细胞通过释放蛋白酶产物激活神经胶质).Glia 32：84-90和 Rabuffetti，M.，Scioratti，C.，Tarozzo，G.，Clementi，E.，Manfredi，A.A.和 Beltramo，M.2000。Inhibition of caspase-l-like activity by Ac-Tyr-Val- Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinnammatory cytokines(由Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-氯甲酮引起的胱冬 蛋白酶-1样活性的抑制包括在脑缺血中通过细胞凋亡的降低和促炎 性细胞因子的减少，长时间持续性神经保护)。J Neurosci.20：4398- 4404)。炎症和神经胶质的活化对于包括脑缺血、脑创伤和实验性变 应性脑脊髓炎在内的神经变性性疾病的不同形式是常见的，在这些 疾病中红细胞生成素发挥细胞保护效应。由红细胞生成素引起的对 细胞因子产生的抑制可以至少部分介导其保护效应。然而，不同于 直接抑制肿瘤坏死因子产生的诸如IL-10和IL-13等“经典”抗炎细 胞因子，红细胞生成素看来仅在存在神经元死亡时才有活性。

虽然不希望受任何具体理论的束缚，但是似乎该抗炎活性可以 用若干非限制性理论假设性地解释。首先，因为红细胞生成素阻止 细胞凋亡，所以将阻止由细胞凋亡触发的炎性事件。此外，红细胞 生成素可阻止濒死神经元释放分子信号，所述信号可刺激神经胶质 细胞或者可以直接作用于神经胶质细胞以降低它们对这些产物的反 应。另一个可能性是红细胞生成素靶向更接近而触发细胞凋亡和炎 症的炎症级联成员(例如胱冬蛋白酶1、活性氧或氮中间产物)。

此外，红细胞生成素似乎提供抗炎保护，而没有通常与其它抗 炎化合物例如地塞米松相关的弹回效应。而且，虽然不希望受任何 具体理论的束缚，但是这似乎是因为红细胞生成素对多目标神经毒 素例如一氧化氮(NO)的效应所致。尽管活化星形胶质细胞和小胶质 细胞在响应不同创伤时产生神经毒性量的NO，但是NO在机体内有 许多用途，包括必要的生理功能的调节。因此，尽管使用抗炎药可 以通过抑制NO或其它神经毒素来缓解炎症，但如果抗炎药具有太长 半寿期，也会干扰导致炎症的由创伤引起的损伤修复中的这些化学 作用。假设本发明的重组组织保护性细胞因子能缓解炎症而不干扰 神经毒素例如NO的修复能力。

本发明具体的组合物和方法可用于治疗视网膜组织的病症和损 害。所述疾病包括但不限于视网膜缺血、黄斑变性、视网膜脱落、 色素性视网膜炎、动脉硬化性视网膜病、高血压性视网膜病、视网 膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、低血压和糖尿病性视网膜病。

在另一个实施方案中，本发明的方法和原理可用于保护或治疗 可兴奋组织的辐射损伤引起的损害。本发明方法的进一步用途是用 于治疗诸如软骨藻酸蛤贝中毒、山黧豆中毒等神经毒素中毒以及 Guam病、肌萎缩性侧索硬化和帕金森病。

如上所述，本发明也涉及增强哺乳动物可兴奋组织功能的方法， 即通过外周给予上述重组组织保护性细胞因子。各种疾病和病症都 适合用该方法进行治疗，而且该方法可用于在无任何病症或疾病时 增强认知功能。本发明这些用途在下文中有更详细的描述，包括在 人和非人类哺乳动物的学习和训练上的增强。

可以通过本发明该方面的方法治疗、涉及中枢神经系统的病症 和疾病包括但不限于心境障碍、焦虑症、抑郁症、孤独症、注意力 不集中的过度反应症和认知功能障碍。这些病症受益于神经元功能 的增强。根据本发明所述可治疗的其它障碍包括例如睡眠中断、睡 眠性呼吸暂停和旅行相关障碍；蛛网膜下出血和动脉瘤出血、低血 压休克、震荡损伤、败血症性休克、过敏性休克和各种脑炎和脑膜 炎后遗症，例如结缔组织病相关性脑炎(cerebritide)例如狼疮。其它用 途包括预防或保护作用，以免于诸如软骨藻酸蛤贝中毒、山黧豆中 毒等神经毒素中毒以及Guam病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病；栓 塞性损伤或局部缺血性损伤的术后治疗；全脑辐照；镰状细胞危象； 和惊厥。

可以通过本发明的方法治疗的其它类型的病症包括遗传性或获 得性线粒体功能障碍，所述障碍是以神经元损伤和死亡为典型特征 的各种神经病的原因。例如亚急性坏死性脑脊髓病(亚急性坏死性脑 病)的特征是进行性视觉损失和脑病，是因为神经元损失和肌病。在 这些病例中，缺陷型线粒体代谢不能供应足够高的能量底物，以给 可兴奋细胞代谢供给能量。红细胞生成素受体活性调节剂在各种线 粒体疾病中能使破坏的功能最佳化。如上所述，低氧病症负面影响 可兴奋组织。所述可兴奋组织包括但不限于中枢神经系统组织、周 围神经系统组织和心脏组织。除了上述病症之外，本发明的方法可 用于治疗吸入性中毒例如吸入一氧化碳和烟雾、严重哮喘、成人呼 吸窘迫综合征、窒息和近似淹溺。产生低氧病症或通过其它方式诱 导可兴奋组织损伤的其它病症包括可发生在不当给予胰岛素的低血 糖或产生胰岛素的肿瘤(胰岛瘤)。

认为起源于可兴奋组织损伤的各种神经精神障碍可以通过本发 明方法进行治疗。其中涉及神经元损伤并用本发明治疗的慢性障碍 包括中枢神经系统和/或周围神经系统相关障碍，包括年龄相关认知 功能减退和老年性痴呆、慢性癫痫、早老性痴呆、帕金森病、痴呆、 记忆力减退、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、结节性硬化、Wilson 病、大脑麻痹和进行性核上麻痹、Guam病、雷维小体性痴呆(Lewy body dementia)、朊病毒病例如海绵样脑病例如传染性海绵样脑病、亨廷 顿舞蹈病(Huntington′s disease)、肌强直性营养不良、弗里德赖希共济 失调(Freidrich ataxia)和其它共济失调以及图雷特综合征(Gilles de la Tourettle′s syndrome)、癫痫例如癫痫和慢性癫痫、中风、脑创伤或脊 髓创伤、艾滋病性痴呆、醇中毒、孤独症、视网膜缺血、青光眼、 自主功能障碍例如高血压和睡眠障碍，以及包括但不限于如下神经 精神障碍：精神分裂症、分裂情感障碍、注意力不集中的过度反应 症、情绪恶劣性障碍、重型忧郁性障碍、躁狂症、强迫性神经失调、 精神作用药物使用障碍、焦虑症、惊恐性障碍以及单相性和双相性 情感障碍。其它神经精神障碍和神经变性性疾病包括例如美国精神 病学协会(American Psychiatric Association)的精神障碍(DSM)诊断和 统计手册中列出的障碍，所述文献的最新版本IV通过引用全部结合 到本文中。

在另一个实施方案中，包含重组组织保护性细胞因子的重组嵌 合毒素分子可用于治疗性给予毒素，以治疗增生性疾病例如癌症， 或病毒性疾病例如亚急性硬化性全脑炎。

下表列出作为可以通过上述重组组织保护性细胞因子治疗的各 种病症和疾病的额外的示例性、非限制性适应征。 细胞、组 织或器官 功能障碍或病理学 病症或疾病 类型 心脏 局部缺血 冠状动脉疾病 急性、慢性 稳定、不稳定 心肌梗塞 心肌梗塞后综合征 心绞痛 先天性心脏病 瓣膜性心肌病 变异型心绞痛 心脏破裂 动脉瘤性隔膜穿孔 脉管炎 心律失常 快速心律失常、缓慢 心律失常、前室心室 传导异常 稳定、不稳定、超敏性颈动 脉窦房结 充血性心力衰竭 左心室、右心室、双 心室收缩、舒张 心肌病，例如特发性、家族 性、感染性、代谢性、贮积 性疾病、缺陷、结缔组织障 碍、浸润和肉芽肿、神经血 管性 心肌炎 自身免疫、感染性、特发性 肺源性心脏病 钝器创伤和穿透性创伤 毒素 可卡因 血管 高血压 原发性、继发性 减压病 纤维肌性增生 动脉瘤 分割性、破裂、扩张

肺 阻塞性 哮喘、慢性支气管炎、 肺气肿和气道阻塞 缺血性肺病 肺栓塞、肺血栓形成、 脂肪栓塞 环境性肺病 缺血性肺病 肺栓塞、肺血栓形成、 间质性肺病 特发性肺纤维化 先天性 囊性纤维化 肺源性心脏病 创伤 肺炎和pneumonitides 感染性、寄生虫性、 毒素性、创伤性、烧 伤性、吸入性 结节病 胰腺 内分泌 I型和II型糖尿病 β细胞衰竭、功能障碍、糖 尿病性神经病 胰腺其它内分泌细胞 衰竭 外分泌 外分泌胰腺衰竭 胰腺炎 骨 骨质减少 原发性、继发性 性腺机能减退、固定、绝经 后、年龄相关甲状旁腺功能 亢进、甲状腺功能亢进、钙、 镁、磷和/或维生素D缺乏 骨髓炎 无血管性坏死 创伤 佩吉特病(Paget′s disease) 皮肤 脱发 簇脱、全脱 原发性、继发性男性秃头 白癜风 局部性、全身性 原发性、继发性 糖尿病性溃疡 外周血管病 烧伤 自身免疫 病 红斑狼疮、斯耶格伦综 合征、类风湿性关节炎、 肾小球性肾炎、脉管炎 朗氏组织细胞增多症

眼 视神经炎 钝器伤和穿透伤、感染、 肉样瘤、镰状细胞病、 视网膜脱落、 颞动脉炎 视网膜缺血、黄斑变性， 视网膜脱离、色素性视 网膜炎、动脉硬化性视 网膜病、高血压性视网 膜病、视网膜动脉阻塞、 视网膜静脉阻塞、低血 压和糖尿病性视网膜病 胚胎和胎 儿病 窒息 局部缺血 CNS 慢性疲劳综合征、急性 和慢性低渗状态综合征 和高渗状态综合征、艾 滋病性痴呆、触电 脑炎 狂犬病性、疱疹性 脑膜炎 硬膜下血肿 尼古丁瘾 药物滥用和戒断综合征 可卡因、海洛因、碱 化可卡因、大麻、 LSD、PCP、多药滥 用、摇头丸、阿片类、 镇静催眠药、  苯丙 胺、咖啡因 强迫性神经失调 脊髓狭窄、横贯性脊髓 炎、急性热病性多神经 炎、创伤、神经根压迫、 肿瘤压迫、中暑 耳鼻喉 耳鸣 Meuniere综合征、听力 损失 创伤性损伤、耳气压伤

肾脏 肾衰竭 急性、慢性 血管/局部缺血性、间质病、 糖尿病性肾病、肾病综合 征、感染、损伤、影像诱发 的、化疗诱发的、CPB诱 发的或预防药性的 亨诺赫-舍恩莱因紫癜 (Henoch S.Prupura) 横纹肌 自身免疫病 重症肌无力、 皮肌炎、多肌炎 肌病 遗传代谢性、内分泌 性和毒素性 中暑 挤压伤 横纹肌溶解 线粒体病 感染 坏死性筋膜炎 性功能障 碍 中枢和外周(例如勃起功 能障碍) 药物继发性阳痿、(糖 尿病) 肝脏 肝炎 病毒性、细菌性、寄 生虫性 缺血性疾病 硬化、脂肪肝 浸润/代谢病 胃肠 缺血性肠病 炎性肠病 坏死性小肠结肠炎 器官移植 对供体和受体的处理 生殖道 不育 血管性、自身免疫、 子宫异常、植入障碍 内分泌 腺体功能亢进和功能减 退

如上所述，这些疾病、障碍或病症仅仅是说明本发明的重组组 织保护性细胞因子提供益处的范围。因此，本发明总的来讲提供对 由机械创伤或人类疾病导致的结果的治疗性治疗或预防性治疗。优 选用于CNS和/或周围神经系统的疾病、障碍或病症的治疗性治疗或 预防性治疗。提供用于具有精神病学问题的疾病、障碍或病症的治 疗性治疗或预防性治疗。提供用于包括但不限于以下疾病、障碍或 病症的治疗性治疗或预防性治疗：眼病、心血管疾病、心肺疾病、 呼吸道疾病、肾病、尿道疾病、生殖道疾病、胃肠道疾病、内分泌 异常和代谢异常。

在一个实施方案中，可以系统给予重组组织保护性细胞因子的 药用组合物，以保护或增强靶细胞、组织或器官。所述给药可以经 胃肠外、通过吸入或经粘膜给药，例如口服、经鼻腔、直肠、阴道 内、舌下、粘膜下或经皮。给药最好是经胃肠外，例如通过静脉内 或腹膜内注射，并且也包括但不限于动脉内、肌内、皮内和皮下给 药。

对于例如通过使用灌注液、注射到器官或其它局部给药途径等 其它给药途径，将提供产生如上所述的重组组织保护性细胞因子的 相似水平的药用组合物。优选水平约为0.01pM-30nM。

本发明的药用组合物可以包含治疗有效量的化合物和药学上可 接受的载体。在一个具体的实施方案中，术语“药学上可接受的”是 指由联邦政府或州政府管理部门批准的，或者列入美国药典或其它 公认外国药典、用于动物、尤其是人。术语“载体”是指与治疗剂一 起给予的稀释剂、辅料、赋形剂或溶媒。所述药用载体可以是无菌 液体，例如盐水溶液和包括石油、动物油、植物油或合成油在内的 油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药用组合物经静 脉内给药时，优选盐水溶液作为载体。盐水溶液和葡萄糖水和甘油 溶液也可用作液体载体，尤其用于注射液。合适的药用赋形剂包括 淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅 胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘 油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物也可以含有少量 润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可呈以下形式：溶液剂、 混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等。所述组 合物可与传统粘合剂和载体例如甘油三酯一起配制成栓剂。本发明 的化合物可配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括与游 离氨基形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等 的盐；和与游离羧基形成的盐，例如衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、 氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、 组氨酸、普鲁卡因等的盐。合适的药用载体的实例描述于E.W.Martin 的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”。所述组合物可含有治疗有 效量的化合物，最好以纯形式，并与适量的载体一起，以便提供适 合给予患者的形式。所述制剂应适合给药模式。

适于口服给药的药用组合物可以为胶囊剂或片剂；散剂或颗粒 剂；溶液剂、糖浆剂或混悬剂(在水或非水液体中)；食用泡沫剂或搅 打剂(whip)；或乳剂。片剂或硬明胶胶囊剂可以包含乳糖、淀粉或其 衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸或其盐。软 明胶胶囊剂可以包含植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。 溶液剂和糖浆剂可以包含水、多元醇和糖。

预期用于口服给药的活性剂可以用延迟该活性剂在胃肠道内崩 解和/或吸收的材料包衣或与所述材料混合(例如可使用甘油单硬脂酸 酯或甘油二硬脂酸酯)。因此，活性剂的持续释放可达到数小时，而 且必要时可保护所述活性剂避免在胃中被降解。可配制供口服给药 的药用组合物，以使活性剂由于特定pH或酶解条件而在具体胃肠道 部位释放。

适于经皮给药的药用组合物可以是预期保持与受体表皮长时间 密切接触的离散贴剂。适于局部给药的药用组合物可以是软膏剂、 乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、 气溶胶或油剂。对于皮肤、口腔、眼或其它外部组织的局部给药， 最好采用局部用软膏剂或乳膏剂。当配制成软膏剂时，活性成分可 以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。或者，活性成分可与水包 油基质或油包水基质一起配制在乳膏剂中。适于眼局部给药的药用 组合物包括滴眼剂。在这些组合物中，活性成分可溶于或悬浮于合 适载体例如水性溶剂中。适于口腔局部给药的药用组合物包括糖锭 剂、软锭剂和漱口剂。

适于鼻腔和肺部给药的药用组合物可以包含例如粉剂(最好粒径 范围为20-500微米)等固体载体。粉剂可以吸入(即通过将盛装粉剂 的容器靠近鼻子而快速吸入鼻腔的方式)给药。或者，适于鼻腔给药 的组合物可以包含液体载体，例如鼻腔喷雾剂或滴鼻剂。或者，可 以通过深部吸入或通过通向咽部的口腔装置，达到直接吸入到肺部。 这些组合物可以包含活性成分的水性溶液剂或油性溶液剂。吸入给 药用组合物可以以特殊合适的装置来提供，所述装置包括但不限于 加压的气溶胶、喷雾器或吹药器，可以生产出所述装置，以便提供 预定剂量的活性成分。在一个优选的实施方案中，将本发明的药用 组合物通过鼻腔或咽部直接给予鼻腔或肺部。

适于直肠给药的药用组合物可以是栓剂或灌肠剂。适于阴道给 药的药用组合物可以是阴道栓剂、棉球、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、 泡沫剂或喷雾制剂。

适于胃肠外给药的药用组合物包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、 抑菌剂以及赋予所述组合物与预期受体血液基本等渗的溶质的水性 和非水性无菌注射用溶液剂或混悬剂。所述组合物中可具有的其它 成分包括例如水、醇类、多元醇、甘油和植物油。适于胃肠外给药 的组合物可以呈单剂量容器或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶， 并且可以贮存在冷冻-干燥(冻干)条件下，只需要在临用前加入无菌 液体载体例如注射用无菌盐溶液即可。临配的注射用溶液剂和混悬 剂可从无菌粉针剂、粒剂和片剂制备。在一个实施方案中，可提供 在救护车、急诊室和战场情况下紧急使用的包含重组组织保护性细 胞因子注射液的自动注射器，甚至还可用于在家中自我给药、特别 是在可能发生创伤性切断例如割草机使用不慎的情况下。通过尽快(甚 至在医务人员到达现场之前，或者脚趾被切断的伤者到达急诊室之 前)在切断部位多位点给予重组组织保护性细胞因子，当切断的脚或 脚趾被复植后，其细胞和组织存活的可能性会提高。

在一个优选的实施方案中，所述组合物按照常规方法配制成适 于静脉内给予人的药用组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是 溶于无菌等渗水性缓冲剂中的溶液剂。如有必要，所述组合物也可 包括增溶剂和局部麻醉药例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。 通常，所述组分可单独提供或在单位剂型中混合提供，例如在指示 活性剂数量的密封容器例如安瓿或小药囊中的冻干粉剂或无水浓缩 剂。当经输注给予所述组合物时，它可配制在装有无菌药用级水或 盐水的输液瓶中。当经注射给予所述组合物时，可提供无菌盐水的 安瓿，以便所述组分在给药前可以混合。

栓剂通常含有范围在0.5％(重量)至10％(重量)的活性成分；口 服制剂最好含有10％至95％的活性成分。

可提供用于移植器官浸泡、原位灌注或在收获器官之前给予器 官供体血管的灌注液组合物。所述药用组合物可以包含不适用于急 性或慢性、局部或系统给予个体的重组组织保护性细胞因子或重组 组织保护性细胞因子的形式，但所述重组组织保护性细胞因子或重 组组织保护性细胞因子的形式可以在消除或降低其中所含重组组织 保护性细胞因子的水平之前、在将经处理的器官或组织暴露或回输 正常循环之前，在尸体、器官浸泡液、器官灌注液或原位灌注液中 发挥本文预期作用。

本发明也提供一种包含装有一种或多种本发明药用组合物的组 分的一个或多个容器的药物包装或药盒。所述容器任选带有政府部 门对药品或生物制品的生产、使用或销售要求的规定形式的通知， 该通知反映了对人用药品的生产、使用或销售的批准。

在另一个实施方案中，例如可在控释系统中给予重组组织保护 性细胞因子。例如可采用静脉内输注、可植入渗透泵、透皮贴剂、 脂质体或其它给药方式给予所述多肽。在一个实施方案中，可使用 泵(参见Langer，参见上文；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng. 14：201；Buchwald等，1980，Surgery 88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J. Med.321：574)。在另一个实施方案中，可在载体、尤其是脂质体中 给予所述化合物(参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等， Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez- Berestein和Fidler(编著)，Liss，New York，第353-365页(1989)；WO 91/04014；美国专利第4,704,355号；Lopez-Berestein，出处同上，第 317-327页；一般参见上文)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料 (参见Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(编著)， CRC Press：Boca Raton，Florida，1974；Controlled Drug Bioayailability， Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编著)，Wiley： New York(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol. Chem.23：61，1953；另见Levy等，1985，Science 228：190；During等， 1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)。

在又一个实施方案中，控释系统可放置在治疗靶即靶细胞、组 织或器官的附近，因此只需要系统给药量的一小部分(参见例如 Goodson，载于Medical Applications of Controlled Release，第2卷，第 115-138页，参见上文，1984)。有关其它控释系统的综述可参见Langer (1990，Science 249：1527-1533)。

在另一个实施方案中，可以经鼻腔、口服、直肠、阴道或舌下 给药，给予适当配制的重组组织保护性细胞因子。

在一个具体的实施方案中，希望向需要治疗的部位局部给予本 发明的重组组织保护性细胞因子组合物；这可以例如但不限于通过 手术中局部输注、局部应用例如与手术后伤口敷料一起使用、通过 注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物来完成，所述植入物是多 孔、无孔或明胶类材料，包括诸如硅橡胶膜等在内的膜或纤维。

技术人员将根据本领域普通技术人员已知的若干因素，容易地 确定优选有效剂量的选择。所述因素包括重组组织保护性细胞因子 的具体形式及其生物利用度、代谢、半寿期等药物动力学参数，这 些参数在通常用于获得药用化合物法定批准的常规开发程序中已经 建立。在考虑剂量时的其它因素包括待治疗病症或疾病或在正常个 体中想获得的益处、患者体重、给药途径(不管给药是急性还是慢性 的)、同时给予的药物和影响所给药物功效的众所周知的其它因素。 因此精确剂量将根据医生的判断和每个患者的情况例如根据每个患 者的病症和免疫状态并根据标准临床技术来决定。

在本发明的另一方面，提供用于移植器官的灌注和保存的灌注 液或灌注用溶液，所述灌注液包括保护效应细胞和相关细胞、组织 或器官有效量的重组组织保护性细胞因子。移植包括但不限于异体 移植和自体移植，所述异体移植也就是从供体收获器官(包括细胞、 组织或其它机体部分)并移植到不同受体中；所述自体移植也就是器 官从机体的一部分取出并取代另一部分，包括其中器官被取出、离 体切除、修补或进行其它操作例如肿瘤切除、然后放回原处的离体 外科手术。在一个实施方案中，所述灌注液是威斯康星大学(UW)溶 液(美国专利第4,798,824号)，所述溶液含有约1U/ml至约25U/ml 红细胞生成素、5％羟乙基淀粉(分子量为约200,000至约300,000，并 且基本上不含乙二醇、2-氯乙醇、氯化钠和丙酮)；25mM KH2PO4； 3mM谷胱甘肽；5mM腺苷；10mM葡萄糖；10mM HEPES缓冲 液；5mM葡萄糖酸镁；1.5mM CaCl2；105mM葡萄糖酸钠；200,000 单位青霉素；40单位胰岛素；16mg地塞米松；12mg酚红；并且pH 为7.4-7.5，摩尔渗透压浓度约为320mOSm/l。所述溶液用于在移植 前维持尸体的肾脏和胰脏。使用所述溶液，保存期可延长超过推荐 用于尸体肾脏保存的30小时的极限。该具体的灌注液仅仅用来说明 包含有效量的重组组织保护性细胞因子的大量溶液可适于目前的使 用。在另一个实施方案中，所述灌注液含有约0.01pg/ml至约400ng/ml 重组组织保护性细胞因子，或约40ng/ml至约300ng/ml重组组织保 护性细胞因子。如上所述，在本发明的该方面，可以使用任何形式 的重组组织保护性细胞因子。

虽然用于本文目的的重组组织保护性细胞因子的优选受体是 人，但是本文的方法可同样应用于其它哺乳动物、尤其是驯养动物、 家畜、陪伴动物和动物园动物。然而，本发明并不限于此，其益处 可应用于任何哺乳动物。

5.6.重组组织保护性细胞因子的治疗用途和预防用途

如下面实施例1所述，人脑毛细血管内皮中存在红细胞生成素 受体，表明本发明重组组织保护性细胞因子的靶存在于人脑中，而 且对本发明的这些重组组织保护性细胞因子的动物研究可直接转移 到人类的治疗或预防中。

在本发明的另一方面，提供用于增强没有因内皮细胞屏障而与 血管系统分离的细胞、组织或器官活力的方法和组合物，即通过使 所述细胞、组织或器官直接接触包含重组组织保护性细胞因子的药 用组合物，或者将包含重组组织保护性细胞因子的药用组合物给予 或接触所述细胞、组织或器官的血管系统。在被处理组织或器官中 效应细胞增强的活性是积极效应发挥作用的原因。

如上所述，本发明部分基于以下发现：红细胞生成素分子可以 从具有内皮细胞紧密连接器官的毛细血管的内皮细胞管腔表面转运 到基底膜表面，所述内皮细胞紧密连接器官包括例如脑、视网膜和 睾丸。因此，穿越屏障的效应细胞是易受重组组织保护性细胞因子 的有益影响的靶，而含有效应细胞和全部或部分依赖效应细胞的其 它细胞类型或组织或器官也是本发明方法的靶。虽然不希望受任何 具体理论的束缚，但是在重组组织保护性细胞因子的胞转作用后，重 组组织保护性细胞因子可以与如下效应细胞上的红细胞生成素受体 相互作用：例如神经元细胞、视网膜细胞、肌细胞、心细胞、肺细 胞、肝细胞、肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、肾上腺髓质细 胞、毛细血管内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、骨细胞、 皮肤细胞或子宫内膜细胞，并且受体结合可以启动信号转导级联， 导致所述效应细胞或组织内基因表达程序的激活，导致保护所述细 胞或组织或器官免遭例如毒素、化疗药、放疗、低氧等损伤。因此， 在下文中详细描述了用于保护含效应细胞的组织免遭损伤或低氧应 激反应并增强所述组织功能的方法。如上所述，本发明的方法同样 可用于人类和其它动物。

在本发明一个实施方案的实践中，哺乳动物患者经历了用于治 疗癌症的全身化疗，包括通常具有神经损害、肺损伤、心脏损伤、 卵巢损伤或睾丸损伤等副作用的放疗。在化疗和/或放疗之前和同时 给予包含上述重组组织保护性细胞因子的药用组合物，以保护各种 组织和器官免遭化疗药的损伤，例如保护睾丸。治疗可持续到化疗 药在循环中的水平降至对哺乳动物机体产生潜在危险的水平之下。

在本发明的另一个实施方案的实践中，计划从车祸的受害者收 获各种器官用于移植给多个受体，这其中有些需要长距离和长时间 的运输。在收获器官之前，给受害者输注包含如本文所述的重组组 织保护性细胞因子的药用组合物。用于运输的收获的器官用含有如 本文所述的重组组织保护性细胞因子的灌注液灌注，并贮存在包含 重组组织保护性细胞因子的浸泡液中。某些器官用脉冲式灌注设备、 用含有根据本发明的重组组织保护性细胞因子的灌注液持续灌注。 在运输和移植和器官原位再灌注过程中，器官功能发生最小限度的 衰减。

在本发明的另一个实施方案中，修补心脏瓣膜的外科手术需要 暂时的心麻痹和动脉闭塞。术前给患者输注每公斤体重4μg重组组 织保护性细胞因子。所述治疗预防低氧局部缺血性细胞损伤、尤其 是在再灌注后。

在本发明的另一个实施方案中，在任何外科手术例如心肺分流 术中，可使用本发明的重组组织保护性细胞因子。在一个实施方案 中，在分流术之前、期间和/或之后，给予包含上述重组组织保护性 细胞因子的药用组合物，以保护脑、心脏和其它器官的功能。

在其中本发明重组组织保护性细胞因子用于离体应用或者处理 效应细胞例如神经元组织、视网膜组织、心细胞、肺细胞、肝细胞、 肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、肾上腺髓质细胞、毛细血管 内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞或子宫内膜细胞或组织的上述实例 中，本发明提供这样一种药用组合物，其剂量单位形式适用于保护 或增强离开血管系统的效应细胞、组织或器官，所述组合物包含每 剂量单位的剂量范围约为0.01pg-5mg、1pg-5mg、500pg-5mg、1ng-5 mg、500ng-5mg、1μg-5mg、500μg-5mg或1mg-5mg的重组组织 保护性细胞因子，以及药学上可接受的载体。在一个优选的实施方 案中，所述重组组织保护性细胞因子的量在约1ng-5mg范围内。在 一个优选的实施方案中，上述组合物的重组组织保护性细胞因子是 非红细胞发生的。

在本发明的另一方面，发现给予经历脑创伤的动物EPO能恢复 认知功能。本发明的重组组织保护性细胞因子有望具有与EPO相同 的细胞保护效应。延迟或者5天或者30天后，与假治疗动物相比， 给予EPO仍能恢复功能，这表明EPO再生或恢复脑活动的能力。因 此，本发明也涉及重组组织保护性细胞因子在制备用于治疗脑创伤(包 括在损伤后很久例如3天、5天、1周、1月或更长时间的治疗)和其 它认知功能障碍的药用组合物中的用途。本发明也涉及用于在损伤 后通过给予有效量的重组组织保护性细胞因子来治疗认知功能障碍 的方法。如本文所述的任何重组组织保护性细胞因子都可用于本发 明的这一方面。

此外，本发明的这一恢复方面涉及本文的任何重组组织保护性 细胞因子在制备用于细胞、组织或器官功能障碍的恢复的药用组合 物中的用途，其中在导致所述功能障碍的最初伤害之后马上开始治 疗和之后很久开始治疗。此外，用本发明的重组组织保护性细胞因 子进行治疗可以在急性期以及慢性期跨过疾病或病症的病程中。

在其中本发明重组组织保护性细胞因子具有红细胞生成活性的 情况下，在一个优选的实施方案中，重组组织保护性细胞因子每次 给药可以以介于约0.01pg和约100μg/kg体重之间、优选约1-50μg/kg 体重、最优选约5-30μg/kg体重的剂量系统给药。在给予重组组织保 护性细胞因子后，该有效剂量应足以达到血清中大于约10,000 mU/ml、15,000mU/ml或20,000mU/ml的重组组织保护性细胞因子 的血清水平。所述血清水平在给药后约1小时、2小时、3小时、4 小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时可以达到。 如有必要，所述给药可以重复。例如，只要临床需要，可以每天重 复给药，或者在合适间隔后重复给药，例如每1-12周、但最好每1-3 周。在一个实施方案中，有效量的重组组织保护性细胞因子和药学 上可接受的载体可以包装成单剂量小瓶或其它容器。在另一个实施 方案中，用于本文目的的重组组织保护性细胞因子是非红细胞生成 的，即能发挥本文描述的活性、但不引起血红蛋白浓度或血细胞比 容增加。在其中预期长期提供本发明的方法的情况下，优选非红细 胞生成形式的重组组织保护性细胞因子。在另一个实施方案中，以 大于最大刺激红细胞发生所需剂量给予重组组织保护性细胞因子。 如上所述，本发明的重组组织保护性细胞因子不一定具有红细胞生 成活性，因此以用单位表示的上述剂量对重组组织保护性细胞因子 来说仅仅是示例性的；在本文中，提供用于任何重组组织保护性细 胞因子的剂量的摩尔当量。

本发明还涉及用于促进哺乳动物体内的分子转运穿越内皮细胞 屏障的方法，即通过给予包含与上文所述重组组织保护性细胞因子 缔合的特定分子的组合物。如上所述，机体的某些器官中内皮细胞 间紧密连接对某些分子的进入产生屏障。对于在屏障器官内各种病 症的治疗，需要促进药用制剂穿越的手段。本发明的重组组织保护 性细胞因子用作载体，用于传递其它分子穿越血-脑屏障或其它类似 屏障。制备包含希望穿越屏障的分子以及重组组织保护性细胞因子 的组合物，并将所述组合物外周给药，导致所述组合物穿越屏障的 胞转作用。待转运以穿越屏障的分子和重组组织保护性细胞因子之 间的缔合可以是不稳定的共价键，在这种情况下当穿越屏障后所述 分子从与重组组织保护性细胞因子的缔合中被释放出来。如果所述 分子与重组组织保护性细胞因子间的缔合仍能保持或不影响所述分 子所需药理学活性的话，可以给予所述复合物。

技术人员知道用于将分子与本发明的重组组织保护性细胞因子 和上述其它药物缔合的各种方式，即通过共价、非共价和其它方式。 此外，在实验系统中可容易地进行所述化合物功效的评价。可以通 过包括不稳定的、共价结合、交联等在内的各种方式达到分子与组 织保护性细胞因子的缔合。可使用生物素/抗生物素蛋白的相互作用。 如上所述，可以通过重组或合成方式制备杂种分子，例如包含具有 所需药理学活性的分子的结构域和导致红细胞生成素受体活性调节 的结构域。

一个分子可以通过多官能分子即多官能交联剂与重组组织保护 性细胞因子缀合。本文所用的术语“多官能分子”包括具有能不止一 次连续反应的官能团的分子例如甲醛，以及具有不止一个活性基团 的分子。本文所用的术语“活性基团”是指交联剂上与分子(例如有待 穿越内皮细胞屏障而传递的肽、蛋白、糖、核酸、尤其是激素、抗 生素或抗癌药)上的官能团反应以形成交联剂和所述分子间共价键的 官能团。术语“官能团”保留其在有机化学中的标准含义。可以使用 的所述多官能分子最好是生物相容性连接剂，即它们在体内是非致 癌的、无毒的和基本上没有免疫原性的。在动物模型中可以容易地 测试例如本领域已知的和在本文中描述的多官能交联剂，以确定它 们的生物相容性。所述多官能分子最好是双官能的。本文所用的术 语“双官能分子”是指具有两个活性基团的分子。所述双官能分子可 以是异型双官能分子或同型双官能分子。异型双官能交联剂允许矢 量结合。特别优选多官能分子在水中具有足够溶解性，因为交联反 应发生在水溶液例如pH6-8的缓冲水溶液中，而且为了更有效的生 物分布，所得缀合物保持水溶性。通常，多官能分子与氨基或巯基 官能团共价键合。然而，与其它官能团例如羧酸或羟基反应的多官 能分子也包括在本发明中。

同型双官能分子具有至少两个相同的活性官能团。同型双官能 分子上的活性官能团包括例如醛基和活性酯基团。具有醛基的同型 双官能分子包括例如戊二醛和subaraldehyde。戊二醛作为交联剂的 应用公开于Poznansky等，Science 223，1304-1306(1984)。具有至少两 个活性酯单元的同型双官能分子包括二羧酸的酯和N-羟基琥珀酰亚 胺。所述N-琥珀酰亚胺基酯的一些实例包括二琥珀酰亚胺基二琥珀 酰亚胺基辛二酸酯和二硫代-双-(琥珀酰亚胺基丙酸酯)及其可溶性双- 磺酸和双-磺酸盐例如它们的钠盐和钾盐。这些同型双官能试剂可得 自各种商业来源(Pierce，Rockford，Illinois)。

异型双官能分子具有至少两个不同的活性基团。所述活性基团 与不同官能团(例如红细胞生成素突变蛋白和所述分子)反应。与异型 双官能交联剂上活性基团反应的这两个不同官能团通常是氨基，例 如赖氨酸的ε氨基；巯基，例如半胱氨酸的巯基；羧酸，例如天冬氨 酸上的羧酸；或羟基，例如丝氨酸上的羟基。当然，本发明的重组 组织保护性细胞因子可缺乏特定氨基酸残基，这将促进天然红细胞 生成素的交联，但是本领域技术人员知道，本发明突变蛋白中可用 的残基部分和因此的交联。

此外，本发明的各种重组组织保护性细胞因子分子可以没有适 于与某种交联剂反应的基团；然而，本领域技术人员将充分理解， 根据用于与本发明红细胞生成素交联的可用基团来选择交联剂。

当异型双官能分子活性基团与氨基形成共价键时，所述共价键 通常是酰氨键或亚氨键。与氨基形成共价键的活性基团可以是例如 活化的羧酸酯基团、卤羰基或酯基。所述卤羰基最好是氯羰基。酯 基最好是例如N-羟基-琥珀酰亚胺酯基等活性酯基。

通常，其它官能团可以是巯基、能转化成巯基的基团或能与巯 基形成共价键的基团。通常，所述共价键是硫醚键或二硫键。与巯 基形成共价键的活性基团可以是例如与巯基或活化的二硫化物反应 的双键。含有能与巯基反应的双键的活性基团可以是例如马来酰亚 胺和其它基团诸如丙烯腈。活性二硫键例如2-吡啶二硫代基或5，5′- 二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)基团。含有活性二硫键的异型双官能试剂 的一些实例包括N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶-二硫代)丙酸酯(Carlsson 等，1978，Biochem J.，173：723-737)、S-4-琥珀酰亚胺基氧代羰基-α-甲 基苄基硫代硫酸钠和4-琥珀酰亚胺基氧代羰基-α-甲基-(2-吡啶二硫代) 甲苯。优选N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯。包含具有与巯 基反应的双键的活性基团的异型双官能试剂的一些实例包括琥珀酰 亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯和琥珀酰亚胺基间马 来酰亚胺苯甲酸酯。

其它异型双官能分子包括琥珀酰亚胺基3-(马来酰亚胺)丙酸酯、 硫代琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺-苯基)丁酸酯、硫代琥珀酰亚胺 基4-(N-马来酰亚胺甲基-环己烷)-1-羧酸酯、马来酰亚胺苯甲酰基-N- 羟基-琥珀酰亚胺酯。优选琥珀酰亚胺基间马来酰亚胺苯甲酸酯的磺 酸钠盐。许多上述异型双官能试剂及其磺酸盐可得自Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois USA。

技术人员可以容易地确定对上述缀合是可逆的或不稳定的需 要。可以在体外试验缀合物的重组组织保护性细胞因子和所需药理 学活性。如果所述缀合物保留两种特性，则其适宜性可以在体内进 行检验。如果所述缀合的分子需要按活性从重组组织保护性细胞因 子中分离出来，优选与重组组织保护性细胞因子的不稳定键合或可 逆缔合。在体内试验之前，用标准体外方法也可以测试不稳定特性。

有关怎样制备和使用它们以及其它多官能试剂的额外信息可从 以下出版物中或本领域其它可用信息中获得：

1.Carlsson，J.等，1978，Biochem.J.173：723-737.

2.Cumber，J.A.等，1985，Methods in Enzymology 112：207-224.

3.Jue，R.等，1978，Biochem 17：5399-5405.

4.Sun，T.T.等，1974，Biochem.13：2334-2340.

5.Blattler，W.A.等，1985，Biochem.24：1517-152.

6.Liu，F.T.等，1979，Biochem.18：690-697.

7.Youle，R.J.和Neville，D.M.Jr.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.77：5483-5486.

8.Lerner，R.A.等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3403- 3407.

9.Jung，S.M.和Moroi，M.，1983，Biochem.Biophys.Acta 761：162.

10.Caulfield，M.P.等，1984，Biochem.81：7772-7776.

11.Staros，J.V.，1982，Biochem.21：3950-3955.

12.Yoshitake，S.等，1979，Eur.J.Biochem.101：395-399.

13.Yoshitake，S.等，1982，J.Biochem.92：1413-1424.

14.Pilch，P.F.和Czech，M.P.，1979，J.Biol.Chem.254：3375-3381.

15.Novick，D.等，1987，J.Biol.Chem.262：8483-8487.

16.Lomant，A.J.和Fairbanks，G.，1976，J.Mol.Biol.104：243-261.

17.Hamada，H.和Tsuruo，T.，1987，Anal.Biochem.160：483-488.

18.Hashida，S.等，1984，J.Applied Biochem.6：56-63。

此外，交联方法综述于Means和Feeney，1990，Bioconjugate Chem. 1：2-12。

本发明的上述方法和组合物所穿越的屏障包括但不限于血-脑屏 障、血-眼屏障、血-睾屏障、血-卵巢屏障、血-心屏障、血-肾屏障和 血-子宫屏障。

用于转运穿越内皮细胞屏障的候选分子包括例如激素例如生长 激素、神经营养因子、抗生素、抗病毒药、或者通常被脑和其它屏 障保护的器官排除在外的抗真菌药、肽类放射性药物、反义药物、 抗生物活性因子的抗体和抗病毒药、药用物质和抗癌药。所述分子 的非限制性实例包括激素例如生长激素、神经生长因子(NGF)、脑衍 生神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、碱性成纤维细 胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2 (TGFβ2)、转化生长因子β3(TGFβ3)、白介素1、白介素2、白介素3 和白介素6、AZT、抗肿瘤坏死因子的抗体和免疫抑制药例如环孢菌 素。此外，染料或标记可以连接到红细胞生成素上或一种本发明的 组织保护性细胞因子上，以便诊断目的在脑和其它屏障器官内显现 细胞、组织或器官。作为一个实例，用于显现脑内病斑的标记可以 连接到红细胞生成素或组织保护性细胞因子，以便确定患者体内早 老性痴呆的进程。

本发明也涉及一种包含待通过胞转作用穿越内皮细胞紧密连接 屏障而转运的分子和上述重组组织保护性细胞因子的组合物。本发 明还涉及分子和上述重组组织保护性细胞因子间的缀合物在制备用 于递送所述分子穿越上述屏障的药用组合物中的用途。

通过参考以下作为本发明示例性的非限制性实施例，可以更好 地理解本发明。提供以下实施例是为了更充分说明本发明的优选的 实施方案。然而，它们决不应该以任何方式限制本发明的宽范围。

                       6.实施例

6.1.实施例1：红细胞生成素受体在人脑中的分布

将在外科手术中切取的正常人脑(例如在肿瘤切除术中提供无肿 瘤边缘)立即放在5％丙烯醛的0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中固定3小 时。用振动切片机切成40微米厚的切片。用自由漂浮切片并采用间 接抗体过氧化物酶-抗过氧化物酶方法，用1∶500稀释度的红细胞生 成素受体抗血清(得自Santa Cruz Biotechnology)进行免疫组织化学染 色。用过氧化氢预处理组织切片以猝灭内源过氧化物酶活性(3％过氧 化氢的甲醇溶液处理30分钟)。也通过第一抗体省略并通过使用合适 的封闭性肽(得自Santa Cruz Biotech.)处理组织对照，以证实染色对红 细胞生成素(EPO)受体是特异性的。

图1显示通过用特异性抗EPO受体的抗体进行免疫组织化学测 定，人脑毛细血管表达非常高水平的EPO受体。这提供了EPO之所 以能从体循环中穿入脑的机制，尽管有血脑屏障。

图2显示EPO受体集中位于人脑中形成血脑屏障的毛细血管中 及其周围。

图3中进行了与图1和图2类似的方案，除了10微米切片是用 石蜡切片、包埋的切片浸泡在4％低聚甲醛中固定以外。图3显示人 脑毛细血管管腔表面和反面的高密度EPO受体，构成将EPO从循环 运输到脑内的解剖学基础。

图4是得自与图3类似的方案，除了组织用超薄切片机切片后 供电镜用、第二抗体用胶体金颗粒标记外。该图显示，发现EPO受 体在人脑的内皮表面(*)上、在胞质小泡(箭头)内和在神经胶质突触小 结(+)上，提供了EPO从循环运输到脑内的解剖学基础。

6.2.实施例2：红细胞生成素穿越血-脑脊液紧密屏障

将Sprague-Dawley成年雄性大鼠麻醉，腹膜内给予5000U/kg 体重的重组人红细胞生成素。在30分钟间隔直到4小时从大池取脑 脊液样，用灵敏的特异性酶联免疫测定，测定红细胞生成素浓度。 如图5所示，CSF中基线红细胞生成素浓度为8mU/ml。在数小时延 迟后，测量的CSF中红细胞生成素水平开始上升，到2.5小时和以 后与基线浓度显著不同(p＜0.01水平)。约100mU/ml的峰水平在已 知发挥体外保护效应的范围内(0.1-100mU/ml)。峰值时间发生在约3.5 小时，该时间距峰血清水平显著延迟(小于1小时)。该实验结果表明， 红细胞生成素的显著水平可以通过大剂量胃肠外给予合适浓度的红 细胞生成素穿越紧密细胞连接而达到。

6.3.实施例3：重组组织保护性细胞因子

采用以下方法制备以下人红细胞生成素构建体。使用基于公开 的人cDNA序列(登记号NM_000799)，通过PCR从人脑cDNA克隆 人红细胞生成素的cDNA。将引物引入cDNA 5′端的Xho I位点和3′ 端的Xba I位点。引物序列是：

HEPO-5-Xho I 5’-AGCTCTCGAGGCGCGGAGATGGGGGTGCACGAATG-3’ (SEQ.ID.8)

HEPO-3-Xba I 5’-ATGCTCTAGACACACCTGGTCATCTGTCCCCTGTCC-3’ (SEQ.ID.9).

将PCR产物克隆在pCiNeo哺乳动物表达载体(Promega)的Xho I 位点和Xba I位点之间。对所述克隆进行测序，证实除了一个碱基外， 该序列与NM_000799的序列匹配。编码序列中的碱基418(自ATG 开始编号)是C而不是G，在全长EPO序列中自第一个甲硫氨酸开始 氨基酸140的Arg变为Gly。然而，这是从原始序列的正常序列变化 并存在于大多数形式的红细胞生成素中。

红细胞生成素cDNA的编码序列如下：

ATGGGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCT GTCGCTCCCTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGA CAGCCGAGTCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCA CGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAATATCACTGTCCCAGACA CCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCCGTA GAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGC CCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCACTGCATGTGGATAAA GCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAG AAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATC ACTGCTGACACTTTCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAA AGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACAGATGA(SEQ ID NO：7).

该cDNA编码如下的红细胞生成素的全长氨基酸序列：

MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENI TTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQA LLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITAD TFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO：10).

SEQ ID NO：10的前27个氨基酸残基包含前导序列。

通过设计新的寡核苷酸，将6xHis标记引入人EPO蛋白的C末 端，使得采用如下寡核苷酸，该6组氨酸与全长序列中的Asp 192连 接：

3’-6xhis-hEPO 5’-

GGTCTAGATCAATGGTGATGGTGATGATGGTCCCCTGTCCTGCAGGCC-3’(SEQ ID NO：134)

使用HEPO-5-Xho I寡聚物和6xHis-标记寡聚物，通过PCR扩 增EPO cDNA，并将其克隆在pCiNeo哺乳动物表达载体的Xho I位 点和Xba I位点之间。再对插入进行测序并证实序列。

在5.2小节中对人EPO cDNA序列描述的带有C端6xHis标记 的突变，通过该小节所述的寡聚核苷酸定点诱变引入。对突变克隆 进行测序并证实突变。

可以使用纯化本发明的重组组织保护性细胞因子的各种方法， 包括但不限于与组氨酸标记重组表达的本发明组织保护性细胞因子 结合使用的以下方案。重组细胞(CHO-K1)上清液(例如来自(Ni-CAM HC RESIN：High Capacity Nickel Chelate Affinity Matrix，Sigma，产品 目录号N 3158的树脂))彻底重新悬浮并温和翻转。然后，将100μl 树脂悬浮液(相当于50μl包装树脂)加入到微量离心管(大小1.7ml) 中。将混合物以8,000rpm于4℃离心5分钟，沉淀树脂，然后弃去 上清液。该微量离心机是Megafuge 1.0R(Heraeus Instruments)。将混 合物用1ml去离子水(0.2μm过滤)洗涤2次，去除乙醇。将树脂重 新悬浮在500μl平衡缓冲液(50mM磷酸钠、pH8.0，0.3M NaCl、10mM 咪唑)中，然后将混合物转移到50ml锥形管中。微量离心管用500μl 平衡缓冲液冲洗，然后将该数量加入到50ml锥形管内的混合物中。 将混合物以3,000rpm于4℃离心5分钟，沉淀树脂。将上清液倒出 并弃去。结合前，将样品(CHO-KI上清液)以3,800rpm于4℃离心5 分钟。将细胞上清液加入到该树脂中。将加样缓冲液(50mM磷酸钠、 pH8.0，3M NaCl、100mM咪唑)加入到1X中，并在旋转平台上于4 ℃温和混合1小时。所用平台的实例是Nutator(旋转平台)(Clay Adams Brand)。将混合物以3,000rpm于4℃离心5分钟。将上清液取出并 保留以用作SDS-PAGE分析和ELISA(未结合)用。将树脂重新悬浮 在500μl洗涤缓冲液中，然后将混合物转移到微量离心管中。将50ml 锥形管用500μl平衡缓冲液冲洗，然后将该数量加入到微量离心管中 的混合物中。然后将树脂悬浮液在旋转平台上于4℃混合10分钟。 将悬浮液以8,000rpm于4℃离心5分钟(第一次洗涤液留做ELISA 用)。将树脂重新悬浮在1ml洗涤缓冲液中，然后树脂悬浮液在旋转 平台上于4℃混合10分钟，再一次洗涤树脂。将洗涤液弃去。然后， 加入75μl洗脱缓冲液(50mM磷酸钠、pH8.0，0.3M NaCl、500mM 咪唑)。将树脂在旋转平台上于4℃混合10分钟。将混合物在8,000rpm 于4℃离心5分钟。将上清液取出并保留。组氨酸标记蛋白就在该流 分中。为了洗脱出更多蛋白，再加入75μl洗脱缓冲液(50mM磷酸 钠、pH8.0，0.3M NaCl、500mM咪唑)。将树脂在旋转平台上于4℃ 再混合10分钟。将混合物在8,000rpm于4℃再离心5分钟。将洗脱 流分作为一份合并液或分开的流分保留。

或者，采用以下方法分离纯化的组氨酸标记细胞因子。收集条 件培养基并经0.45μm滤器过滤。然后将50ml等份样品加样到用20 mM磷酸钠pH7.4平衡并用2.5ml 100mM NiSO4活化的5ml HiTrap 螯合柱(Amersham biosciences)。将柱子用20mM磷酸钠pH7.4洗涤， 并用超过25倍柱体积的0M-0.5M咪唑(溶于20mM磷酸钠pH7.4) 梯度洗脱。流速为5ml/分，流分体积为5ml。

通过SDS-PAGE和EPO ELISA分析流分中存在的重组组织保护 性细胞因子。合并阳性流分，并对10mM Tris pH7.0透析。合并液 加样到用10mM Tris pH7.0平衡的1ml HiTrap Q HP(Amersham biosciences)。用平衡缓冲液洗涤后，将样品以1ml/分的流速用超过 10倍柱体积NaCl梯度至0.5M洗脱。收集1m流分并使用针对六His 标记(抗His6，ROCHE)的抗体，通过SDS-PAGE、EPO ELISA和蛋白 质印迹进行分析。合并含有重组组织保护性细胞因子的流分，并用 centricon浓缩，截止大小为10kDa(Amicon)，终体积为1-2ml。

通过SDS-PAGE(Nupage 4-12％；Invitrogen)分析重组组织保护性 细胞因子的最终合并液，并用生产商推荐的方案，用NOVEX胶体蓝 (Invitrogen)进行显色。根据所得凝胶可判断重组组织保护性细胞因子 的纯度。凝胶的每一泳道上仅有一个条带对应于糖基化重组组织保 护性细胞因子，说明分离的细胞因子为高纯度。

使用脂转染胺，使所有质粒都转染到CHO-1细胞或COS-7细胞 中。转染后48-72小时，收集细胞的培养基。该培养基可直接或纯化 后在红细胞生成测定或神经元测定后用于通过ELISA测定来检测 EPO。

使用以下寡核苷酸，通过寡聚核苷酸定点诱变引入人EPO cDNA 序列的突变K45D、S100E和A30N/H32T：

HEPO-S100E-上链5′-

CATGTGGATAAAGCCGTCGAGGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTG-3’(SEQ ID NO：11)

HEPO-S100E-下链5′-

CAGAGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCCTCGACGGCTTTATCCACATG-3’(SEQ ID NO：12)

HEPO-K45D-上链5′-

GAGAATATCACTGTCCCAGACACCGACGTTAATTTCTATGCCTGG-3’(SEQ ID NO：13)

HEPO-K45D-下链5′-

CCAGGCATAGAAATTAACGTCGGTGTCTGGGACAGTGATATTCTC-3’(SEQ ID NO：14)

HEPO-A30N/H32T-上链5′-

GAATATCACGACGGGCTGTAATGAAACCTGCAGCTTGAATGAG-3’(SEQ ID NO： 132)

HEPO-A30N/H32T-下链5′-

CTCATTCAAGCTGCAGGTTTCATTACAGCCCGTCGTGATATTC-3’(SEQ ID NO： 133)

对于其它红细胞生成素突变蛋白和本发明重组组织保护性细胞 因子，寡聚核苷酸定点诱变中所使用的寡核苷酸序列包括：

对于R150E突变蛋白：

R150E-FGTCTACTCCAATTTCCTCGAGGGAAAGCTGAAGCTG，(SEQ ID NO：120)

R150E-R GCITCAGCTTTCCCTCGAGGAAATTGGAGTAGAC(SEQ ID NO： 121)

对于R103E突变蛋白：

R103E-F CCGTCAGTGGCCTTGAGAGCCTCACCACTCTG，(SEQ ID NO：122)

R103E-R CAGAGTGGTGAGGGCTCTCAAGGCCACTGACGG(SEQ ID NO：123)

对于R103E/L108S(103)组合突变蛋白：

R103E-F CCGTCAGTGGCCTTGAGAGCCTCACCACTCTG(SEQ ID NO：124)

R103E-R CAGAGTGGTGAGGCTCTCAAGGCCACTGACGG(SEQ ID NO：125)

L10δS(103)F CGCAGCCTCACCACTTCGCTICGGGCTCTGG，(SEQ ID NO： 126)

L10δS(103)R CCAGAGCCCGAAGCGAAGTGGTGAGGCTGCG(SEQ ID NO： 127)

对于44-49缺失：

d44-49F GAATATCACTGTCCCAGACGGTGGTGCCTGGAAGAGGATG，(SEQ ID NO：128)

d44-49R CATCCTCTTCCAGGCACCACCGTCTGGGACAGTGATATTC(SEQ ID NO：129)

对于K20A突变蛋白：

K20A-F TACCTCTTGGAGGCCGCGGAGGCCGAGAATATC，(SEQ ID NO： 130)

K20A-R GATATTCTCGGCCTCCGCGGCCTCCAAGAGGTA(SEQ ID NO：131) 对于K140A突变蛋白：

K140A-F GCTGACACTTTCCGCGCACTCTTCCGAGTCTACTC，(SEQ ID NO： 132)

K140A-R GAGTAGACTCGGAAGAGTGCGCGGAAAGTGTCAGC(SEQ ID NO：133)

对于K152A突变蛋白：

K152A-F ATTTCCTCCGGGGAGCGCTGAAGCTGTACACAG，(SEQ ID NO： 134)

K152A-R CTGTGTACAGCTTCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT(SEQ ID NO： 135)

对于K154A突变蛋白：

K154A-F CTCCGGGGAAAGCTGGCGCTGTACACAGGGGA，(SEQ ID NO： 136)

K154A-R TCCCCTGTGTACAGCGCCAGCTTTCCCCGGAG(SEQ ID NO：137) 对于K45A突变蛋白：

K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAATTTCTATGCCTG，(SEQ ID NO： 138)

K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT(SEQ ID NO： 139)

对于K52A突变蛋白：

K52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG，(SEQ ID NO： 140)

K52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT(SEQ ID NO： 141)

对于K97A突变蛋白：

K97A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC，(SEQ ID NO： 142)

K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA(SEQ ID NO： 143)

对于K116A突变蛋白：

K116A-F CTCTGGGAGCCCAGGCGGAAGCCATCTCCCCT，(SEQ ID NO：144)

K116A-R AGGGGAGATGGCTTCCGCCTGGGCTCCCAGAG(SEQ ID NO： 145)

对于K140A/K52A组合突变蛋白：

K140A-F GCTGACACTTTCCGCGCACTCTTCCGAGTCTACTC，(SEQ ID NO： 146)

K140A-R GAGTAGACTCGGAAGAGTGCGCGGAAAGTGTCAGC(SEQ ID NO：147)

K52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG，(SEQ ID NO： 148)

K52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT(SEQ ID NO： 149)

对于K140A/K52A/K45A组合突变蛋白：

K140A-F GCTGACACTTTCCGCGCACTCTTCCGAGTCTACTC，(SEQ ID NO： 150)

K140A-R GAGTAGACTCGGAAGAGTGCGCGGAAAGTGTCAGC(SEQ ID NO：151)

K52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG，(SEQ ID NO： 152)

K52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT(SEQ ID NO： 153)

K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAATTTCTATGCCTG，(SEQ ID NO： 154)

K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT(SEQ ID NO： 155)

对于K97A/K152A组合突变蛋白：

K97A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC，(SEQ ID NO： 156)

K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA(SEQ ID NO： 157)

K152A-F ATTTCCTCCGGGGAGCGCTGAAGCTGTACACAG，(SEQ ID NO： 158)

K152A-R CTGTGTACAGCTTCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT(SEQ ID NO： 159)

对于K97A/K152A/K45A组合突变蛋白：

K97A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC，(SEQ ID NO： 160)

K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA(SEQ ID NO： 161)

K152A-F ATTTCCCTCCGGGGAGCGCTGAAGCTGTACACAG，(SEQ ID NO： 162)

K152A-R CTGTGTACAGCTTCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT(SEQ ID NO： 163)

K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAATTTCTATGCCTG，(SEQ ID NO： 164)

K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT(SEQ ID NO： 165)

对于K97A/K152A/K45A/K52A组合突变蛋白：

K97A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC，(SEQ ID NO： 166)

K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA(SEQ ID NO： 167)

K152A-F ATTTCCTCCGGGGAGCGCTGAAGCTGTACACAG，(SEQ ID NO： 168)

K152A-R CTGTGTACAGCTTCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT(SEQ ID NO： 169)

K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAATTTCTATGCCTG，(SEQ ID NO： 170)

K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT(SEQ ID NO： 171)

K52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG，(SEQ ID NO： 172)

K52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT(SEQ ID NO： 173)

对于K97A/K152A/K45A/K52A/K140A组合突变蛋白：

K97A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC，(SEQ ID NO： 174)

K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA(SEQ ID NO： 175)

K152A-F ATTTCCTCCGGGGAGCGCTGAAGCTGTACACAG，(SEQ ID NO： 176)

K152A-R CTGTGTACAGCTTCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT(SEQ ID NO： 177)

K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAATTTCTATGCCTG，(SEQ ID NO： 178)

K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT(SEQ ID NO： 179)

K52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG，(SEQ ID NO： 180)

K52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT(SEQ ID NO： 181)

K140A-F GCTGACACTTTCCGCGCACTCTTCCGAGTCTACTC，(SEQ ID NO： 182)

K140A-R GAGTAGACTCGGAAGAGTGCGCGGAAAGTGTCAGC(SEQ ID NO：183)

对于K97A/K152A/45A/K52A/K140A/K154A组合突变蛋白：

K97A-F TGCAGCTGCATGTGGATGCAGCCGTCAGTGGCC，(SEQ ID NO： 184)

K97A-R GGCCACTGACGGCTGCATCCACATGCAGCTGCA(SEQ ID NO： 185)

K152A-F ATTTCCTCCGGGGAGCGCTGAAGCTGTACACAG，(SEQ ID NO： 186)

K152A-R CTGTGTACAGCTTCAGCGCTCCCCGGAGGAAAT(SEQ ID NO： 187)

K45A-F ACTGTCCCAGACACCGCAGTTAATTTCTATGCCTG，(SEQ ID NO： 188)

K45A-R CAGGCATAGAAATTAACTGCGGTGTCTGGGACAGT(SEQ ID NO： 189)

K52A-F AGTTAATTTCTATGCCTGGGCGAGGATGGAGGTCG，(SEQ ID NO： 190)

52A-R CGACCTCCATCCTCGCCCAGGCATAGAAATTAACT(SEQ ID NO： 191)

K140A-F GCTGACACTTTCCGCGCACTCTTCCGAGTCTAGTC，(SEQ ID NO： 192)

K140A-R GAGTAGACTCGGAAGAGTGCGCGGAAAGTGTCAGC(SEQ ID NO：193)

K154A(152)F CTCCGGGGAGCGCTGGCGCTGTACACAGGGGA，(SEQ ID NO：194)

154(152)R TCCCCTGTGTACAGCGCCAGCGCTCCCCGGAG(SEQ ID NO： 195)

对于N24K/N38K/N83K组合突变蛋白：

N24K-F CAAGGAGGCCGAGAAAATCACGACGGGCTGT，(SEQ ID NO：196)

N24K-R ACAGCCCGTCGTGATTTTCTCGGCCTCCTTG(SEQ ID NO：197)

N38K-F ACTGCAGCTTGAATGAGAAAATCACTGTCCCAGACAC，(SEQ ID NO：198)

N38K-R GTGTCTGGGACAGTGATTTTCTCATTCAAGCTGCAGT(SEQ ID NO：199)

N83K-F AGGCCCTGTTGGTCAAATCTTCCCAGCCGTG，(SEQ ID NO：200)

N83K-R CACGGCTGGGAAGATTTGACCAACAGGGCCT(SEQ ID NO：201)

对于K152W突变蛋白：

K152W-F ATTTCCTCCGGGGATGGCTGAAGCTGTACACAG，(SEQ ID NO： 202)

K152W-R CTGTGTACAGCTTCAGCCATCCCCGGAGGAAAT(SEQ ID NO： 203)

对于R14A/Y15A组合突变蛋白：

RY14AA-F AGCCGAGTCCTGGAGGCGGCCCTCTTGGAGGCCAA，(SEQ ID NO：204)

RY14AA-R TTGGCCTCCAAGAGGGCCGCCTCCAGGACTCGGCT(SEQ ID NO：205)

Y15A-F AGCCGAGTCCTGGAGAGGGCCCTCTTGGAGGCCAA(SEQ ID NO： 206)

Y15A-R TTGGCCTCCAAGAGGGCCCTCTCCAGGACTCGGCT(SEQ ID NO： 207)

以下是制备的构建体的实例：人EPO(hEPO)-6xHis标记-pCiNeo 序列(SEQ ID NO：208)；hEPO6xHis标记-A30N/H32T-pCiNeo(SEQ ID NO：209)；hEPO-6xHis标记-K45D-pCiNeo序列(SEQ ID NO：210)； hEPO-6xHis标记-S100E-pCiNeo序列(SEQ ID NO：211)；和hEPO- 6xHis标记-K45D/S100E-pCiNeo序列(SEQ ID NO：212)。pCI-neo哺 乳动物表达载体携带人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子 区，以启动哺乳动物细胞的克隆DNA插入片段的组成型表达。

这些寡核苷酸退火到pCiNeo中的原始人红细胞生成素cDNA克 隆上，以引入所述突变。对突变克隆进行测序并证实突变。使用脂 转染胺，使所有质粒都转染到CHO-1细胞或COS-7细胞中。转染后 48-72小时，收集细胞的培养基。该培养基可直接或纯化后在红细胞 生成测定或神经元测定后用于通过ELISA测定来检测红细胞生成 素。

然后，K45D和S100E重组组织保护性细胞因子在神经元测定 中进行检测。具体地讲，采用使用SK-N-SH成神经细胞瘤细胞的体 外神经保护测定。将SK-N-SH细胞以40,000细胞/孔的密度接种在24 孔板上达24小时。然后将重组组织保护性细胞因子以3nM的浓度加 入，再过24小时(红细胞生成素＝市售制剂；EPO＝CHO细胞表达 的红细胞生成素和重组组织保护性细胞因子；纯载体＝来自用没有 Epo构建体的载体转染的CHO细胞的细胞上清液)。预保温后，将细 胞暴露给鱼藤酮(5μM)达4小时，洗涤并使之恢复24小时。在所有 这些步骤中表明了EPO变异体的存在。在实验结束时，通过将细胞 与四氮唑染料WST-1(按照生产商说明书：Roche#1644807)一起保温 2小时，进行细胞活力定量测定，活力用吸光度读数表示。

图6A和图6B显示用红细胞生成素以及重组组织保护性细胞因 子K45D和S100E对SK-N-SH成神经细胞瘤细胞神经保护测定(针对 鱼藤酮)的结果。图中Y轴表示吸光度读数，数据是平均值±双份重 复测定范围。图6A中的图清楚地表明在K45D和S100E样品中细胞 活力被保持，证明它们的细胞保护效果。图6B显示hEPO-6xHis标 记-PciNeo的质粒图谱。

6.4.实施例4：组织保护性细胞因子

如本文所述用途所需的重组组织保护性细胞因子可以通过如下 方法进一步修饰：脱唾液酸化、胍化、氨甲酰化、酰胺化、三硝基 苯基化、乙酰化、琥珀酰化、硝化，或者在其它方法中的精氨酸残 基或羧基的修饰。或者，对天然红细胞生成素或红细胞生成素衍生 物所做的这些修饰包括但不限于在其突变引入重组组织保护性细胞 因子之前进行脱唾液酸化、胍化、氨甲酰化、酰胺化、三硝基苯基 化、乙酰化、琥珀酰化或硝化的红细胞生成素。对重组组织保护性 细胞因子的进一步修饰的一些实例描述如下。本领域普通技术人员 知道下列方法也可用于在将突变引入以产生重组组织保护性细胞因 子之前化学修饰天然红细胞生成素或其衍生物。

6.4.1.脱唾液酸重组组织保护性细胞因子

重组组织保护性细胞因子可以通过以下示例性方法进行脱唾液 酸。唾液酸酶(分离自链球菌(Streptococcacs sp)6646K.)得自 SEIKAGAKU AMERICA(编号120050)。重组组织保护性细胞因子用 唾液酸酶(0.025U/mg EPO)于37℃处理3小时以脱唾液酸。反应混合 物用Ultrafree离心过滤单元脱盐并浓缩。然后样品加样到 AKTAprimeTM系统的离子交换柱。蛋白用所选缓冲液洗脱。然后用 含有大量蛋白的洗脱流分进行IEF凝胶分析。合并只含最上两个条 带的流分(在IEF凝胶上在pI～8.5和pI～7.9迁移)，测定合并流分的 蛋白质含量，加入1/9体积的10x盐溶液(1M NaCl、0.2M柠檬酸 钠、3mM柠檬酸)。然后测定唾液酸含量。没有检测到明显的唾液 酸含量。

如图7-8所示，脱唾液酸红细胞生成素在体外神经细胞中同天 然红细胞生成素一样有效。用经历了去除血清后细胞凋亡的神经样 胚胎癌性细胞(P19)进行体外试验。在去除血清前24小时，向培养物 中加入1-1000ng/ml红细胞生成素或修饰红细胞生成素。翌日去除培 养基，用不含血清的新鲜培养基洗涤细胞，向培养物中加入含有试 验物质的培养基(无血清)，再培养48小时。为了测定活细胞数，进 行四氮唑还原试验(CellTiter96；Promega，Inc.)。如图7-8所示，脱唾 液酸红细胞生成素显示出同红细胞生成素本身在防止细胞死亡中的 同等效力。

用大鼠局灶性局部缺血模型证实体内神经保护活性的持久性， 在所述模型中可以如前所述形成中脑动脉区可逆损害(Brines等，2000， Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.97：10526-31)。在Sprague-Dawley成年雄 性大鼠动脉闭塞发作时，给予脱唾液酸红细胞生成素或红细胞生成 素(5000 U/kgBW腹膜内)或溶媒。24小时后，处死动物取脑，供研 究用。进行连续切片并用四氮唑盐染色以鉴定脑内存活区。如图9 所示，脱唾液酸红细胞生成素在1小时局部缺血时提供神经保护同 天然红细胞生成素一样有效，即缩小梗塞体积。图10显示另一个局 灶性局部缺血模型，其中用红细胞生成素和脱唾液酸红细胞生成素 进行比较剂量反应。在4μg/kg的最低剂量时，脱唾液酸红细胞生成 素提供保护，而未修饰的红细胞生成素不提供保护。每组中大鼠数n 大于或等于4。

预期本发明脱唾液酸重组组织保护性细胞因子将得到类似结 果。

6.4.2.氨甲酰化重组组织保护性细胞因子

按照如Jin Zeng(1991)描述的以下方法，重组组织保护性细胞因 子可用于制备相应的氨甲酰化分子。通过氨甲酰化和胍化反应对金 属硫蛋白进行赖氨酸修饰。Methods in Enzymology 205：433-437。将 氰酸钾重结晶。制备1M硼酸缓冲液(pH8.8)。将重组组织保护性细 胞因子溶液与等体积硼酸缓冲液混合。将氰酸钾直接加入到反应管 中，至终浓度为0.5M。将溶液混合均匀并于37℃保温6-16小时。 然后彻底透析溶液。从透析管中取出产物，收集到新的试管中。测 量体积，加入1/9体积的10X盐溶液(1M NaCl、0.2M柠檬酸钠、 3mM柠檬酸)。测定蛋白质含量，计算产物回收率。通过IEF凝胶 以及用TF-1细胞体外试验来分析产物。

6.4.3.琥珀酰化重组组织保护性细胞因子

按照如Alcalde等(2001)描述的以下方法，重组组织保护性细胞 因子可用于制备相应的琥珀酰化分子。来自热厌氧杆菌 (Thermoanaerobacter sp.)501的环糊精糖基转移酶的琥珀酰化反应用 淀粉作为供体增强其转移酶活性。J.Biotechnology 86：71-80。重组组 织保护性细胞因子(100μg)的0.5M NaHCO3(pH8.0)与15摩尔过量 的琥珀酸酐一起在15℃保温1小时。通过对蒸馏水透析终止反应。

将27mg/ml琥珀酸酐溶于无水丙酮中。反应在10mM磷酸钠缓 冲液(pH8.0)的微量离心管中进行。将重组组织保护性细胞因子蛋白 和50倍摩尔量的琥珀酸酐加入试管中。混合均匀，将试管于4℃旋 转1小时。用透析盒(Slide-A-Laze 7K，Pierce 66373)通过对10mM磷 酸钠缓冲液透析终止反应。从透析盒中取出产物，收集到新的试管 中。测量体积，加入1/9体积的10X盐溶液(1M NaCl、0.2M柠檬 酸钠、3mM柠檬酸)。测定蛋白质含量，计算产物回收率。通过IEF 凝胶以及用TF-1细胞体外试验来分析产物。

6.4.4.乙酰化重组组织保护性细胞因子

按照如Satake等(1990)描述的以下方法，重组组织保护性细胞 因子可用于制备相应的乙酰化分子。红细胞生成素的化学修饰：通 过胍化反应增加体外活性。Biochimica et Biophysica Acta.1038：125- 129。

反应在80mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)的微量离心管中进行。加入 重组组织保护性细胞因子和等摩尔量的乙酸酐。混合均匀后在冰上 保温1小时。用透析盒(Slide-A-Laze 7K，Pierce 66373)通过对水透析 终止反应。从透析盒中取出产物，收集到新的试管中。测量体积后， 加入1/9体积的10X盐溶液(1M NaCl、0.2 M柠檬酸钠、3mM柠檬 酸)。测定蛋白质含量，计算产物回收率。通过IEF凝胶以及用TF-1 细胞体外试验来分析产物。

6.4.5.羧甲基化重组组织保护性细胞因子的赖氨酸

按照如Akhtar等(1999)描述的以下方法，重组组织保护性细胞 因子可用于制备相应的Nε-(羧甲基)赖氨酸(CML)修饰分子，其中重 组组织保护性细胞因子的一个或多个赖氨酰残基被修饰： Conformational study of Nε-(carboxymethyl)lysine adducts of recombinant a-crystallins(重组α-晶体蛋白的Nε-(羧甲基)赖氨酸加合物 的构象研究).Current Eye Research，18：270-276。

新鲜制备乙醛酸(200mM)和NaBH3CN(120mM)的磷酸钠缓冲 液(50mM，pH7.5)。在微量离心管中，加入红细胞生成素(溶于磷酸 缓冲液)。计算溶液中的赖氨酸当量(约8个赖氨酸残基/mol)。向试管 中加入3倍以上的NaBH3CN和5倍以上或10倍以上的乙醛酸。每 管蜗旋震荡后，于37℃保温5小时。样品于4℃对磷酸缓冲液透析 过夜。透析后，测量各产物的体积。测定蛋白质浓度，计算产物回 收率。通过IFF凝胶以及用TF-1细胞体外试验来分析产物。

6.4.6.碘化重组组织保护性细胞因子

按照如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)提供的用于 IODO-Gen预包埋碘化管(产品目录号28601)的说明书描述的以下方 法，重组组织保护性细胞因子可用于制备相应的碘化分子。

制备0.1M的NaI，在IODO-Gen预包埋碘化管(pierce，28601)中 总反应体积为0.1ml/管，在磷酸钠缓冲液(40mM，pH7.4)中，进行碘 化反应。将蛋白底物(重组组织保护性细胞因子)与磷酸钠缓冲液混 合，然后转移到IODO-Gen预包埋碘化管中。加入NaI，使其终浓度 为1-2mM，使NaI/蛋白摩尔比为14-20。混合均匀并在室温下温和 搅拌中保温15分钟。通过除去反应混合物终止反应，加入到一支装 有3.9ml钠缓冲液(即40倍稀释)的管中。通过预先润湿的Ultrafree 离心过滤单元浓缩产物。测定浓缩液体积，加入1/9体积的10X盐 溶液(1M NaCl、0.2M柠檬酸钠、3mM柠檬酸)。测定蛋白质浓度， 然后计算产物回收率。通过IEF凝胶以及用TF-l细胞体外试验来分 析产物。

或者，重组组织保护性细胞因子可用以下方法碘化。在含有1mCi 游离Na123I的100μl PBS(20mM磷酸钠，0.15M NaCl、pH7.5)中保 温碘珠(Pierce，Rockford，Il)达5分钟。然后向混合物中加入溶于100μl PBS的100μg重组组织保护性细胞因子。在室温下保温10分钟后， 通过从反应容器中取出200μl溶液终止反应(留下碘珠)。然后通过 在Centricon 10柱上进行凝胶过滤除去过量的碘。如图11所示，按 此法产生的碘红细胞生成素在去除血清后保护P19细胞方面是有效 的。本领域普通技术人员将会认识到，预期本发明的重组组织保护 性细胞因子的碘化将得到类似结果。

又有一个用于碘化重组组织保护性细胞因子的方法如下概述。 将溶于100μl PBS的100μg重组组织保护性细胞因子加入到500uCi N125I中，然后将混合物在微量离心管中混合在一起。然后加入25止 氯胺T(2mg/ml)，将混合物在室温下保温1分钟。然后加入50μl氯 胺T终止缓冲液(2.4mg/ml偏亚硫酸氢钠、10mg/ml酪氨酸、10％甘 油、0.1％二甲苯的PBS)。然后通过用Centricon 10柱进行凝胶过滤， 将碘化酪氨酸和碘化重组组织保护性细胞因子分开。

6.4.7.生物素化重组组织保护性细胞因子

按照如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)描述用于EZ-Link NHS-LC-生物素(产品目录号21336)的以下方法，重组组织保护性细 胞因子可用于制备相应的生物素化分子。

就在反应之前，将EZ-Link NHS-LC-生物素(pierce，21336)溶于 DMSO中，浓度为2mg/ml。在盛有总体积1ml的含有50mM碳酸 氢钠(pH8.3)的试管(17×100mm)中进行反应。加入重组组织保护性 细胞因子和＜10％的EZ-Link NHS-LC-生物素，生物素/蛋白的摩尔比 约为20。混合均匀并在冰上保温2小时。用Ultrafree离心过滤单元 脱盐并浓缩反应产物。将产物收集到新的试管中。测定体积，加入1/9 体积的10X盐溶液(1M NaCl、0.2M柠檬酸钠、3mM柠檬酸)。测 定蛋白质含量，然后计算产物回收率。通过IEF凝胶以及用TF-1细 胞体外试验来分析产物。

下面公开了用于将重组组织保护性细胞因子的游离氨基生物素 化的方法。将0.2mg D-生物素酰-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯 (Boehringer Mannheim #1418165)溶于100μl DMSO中。将溶液与含 有约0.2mg重组组织保护性细胞因子的400μl PBS在铝箔盖着的试 管中混合。在室温下保温4小时后，通过在Centricon 10柱上进行凝 胶过滤分离出未反应的生物素。如图12所示，该生物素化红细胞生 成素保护来去除血清的p19细胞。本领域普通技术人员将会认识到， 预期本发明的重组组织保护性细胞因子的生物素化将得到类似结 果。

最后，在Wojchowski等“Biotinylated recombinant human erythropoietins：Bioactivity and Utility as a receptor ligand(生物素化重 组人红细胞生成素：作为受体的配体的生物活性和用途)”.Blood，1989， 74(3)：952-8中，作者采用了使红细胞生成素生物素酰化的三种不同 方法。将生物素加入到(1)唾液酸部分(2)羧基和(3)氨基上。作者使用 小鼠脾细胞增殖测定，以证明(1)将生物素加入到唾液酸部分上不会 使红细胞生成素的生物学活性失活；(2)将生物素加入到羧基上导致 红细胞生成素的生物学基本失活；(3)将生物素加入到氨基上导致红 细胞生成素的生物学完全失活。这些方法和修饰全部包括在本文中。 图12显示在血清饥饿P19测定中生物素化红细胞生成素和脱唾液酸 红细胞生成素的活性。本领域普通技术人员将会认识到，预期本发 明的重组组织保护性细胞因子的碘化将得到类似结果，参见6.15小 节。

6.5.实施例5：通过其它方法修饰重组组织保护性细胞因子

6.5.1.三硝基苯基化：

按照Plapp等(“Activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease A with modified amino groups(具有修饰氨基的牛胰腺脱氧核糖核酸酶A 的活性)”1971，J.Biol.Chem.246，939-845)描述的方法，重组组织保 护性细胞因子(100μg)用2，4，6-三硝基苯磺酸盐进行修饰。

6.5.2.精氨酸修饰

按照Riordan(“Functional arginyl residues in carboxypeptidase A. Modification with butanedione(羧肽酶A中的功能性精氨酰残基。用 丁二酮修饰).”Riordan JF，Biochemistry 1973，12(20)：3915-3923)描述 的方法，重组组织保护性细胞因子用2，3-丁二酮进行修饰。

在其中红细胞生成素的氨基酸残基被修饰的另一个修饰中，按 照Takahashi(1977，J.Biochem.81：395-402)描述的方法，用苯基乙二 醛修饰精氨酸残基，所述反应可以在室温下在0.5小时至3小时间的 可变时间范围进行。通过将反应混合物对水透析而终止反应。这类 修饰形式的红细胞生成素的应用全都包括在本发明中。用上述神经 样P19细胞测定，来测试苯基乙二醛-修饰的红细胞生成素。如图13 所示，该化学修饰的红细胞生成素完全保留其神经保护效应。同样 修饰的本发明重组组织保护性细胞因子得到类似结果。

按照Patthy等(“Identification of functional arginine residues in ribonuclease A and lysozyme(核糖核酸酶A和溶菌酶的功能性精氨酸 残基的鉴定).”Patthy，L，Smith EL，J.Biol.Chem 1975 250(2)：565-9)描 述的方法，重组组织保护性细胞因子用环己酮进行修饰。

按照Werber等(“Proceedings：Carboxypeptidase B：modification of functional arginyl residues(会议录：羧肽酶B：功能性精氨酰残基的 修饰).”Werber，MM，Sokolovsky M Isr J Med Sci 1975 11(11)：1169-70) 描述的方法，重组组织保护性细胞因子用苯基乙二醛进行修饰。

6.5.3.酪氨酸修饰

按照Nestler等“Stimulation of rat ovarian cell steroidogenesis by high density lipoproteins modified with tetranitromethane(用四硝基甲烷 修饰的高密度脂蛋白对大鼠卵巢细胞类固醇产生的刺激).”Nestler JE， Chacko GK，Strauss JF 3rd.J Biol Chem 1985 Jun 25；260(12)：7316-21) 先前描述的方法，将重组组织保护性细胞因子(100μg)与四硝基甲烷 一起保温。

6.5.4.谷氨酸(和天冬氨酸)修饰

为了修饰羧基，按照Caraway等“Carboxyl group modification in chymotrypsin and chymotrypsinogen(胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶原 的羧基修饰).”Carraway KL，Spoerl P，Koshland DE Jr.J Mol Biol 1969 May 28；42(1)：133-7描述的方法，将重组组织保护性细胞因子(100μg) 与0.02M EDC的1M甘氨酰胺于pH4.5在室温下保温60分钟。

6.5.5.色氨酸残基修饰

按照Ali等，J Biol Chem.1995 Mar 3；270(9)：4570-4描述的方 法，将重组组织保护性细胞因子(100μg与20μM正溴琥珀酰亚胺的 20mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)一起在室温下保温。按照Korotchkina (Korotchkina，LG等，Protein Expr Purif.1995 Feb；6(1)：79-90)描述的 方法，测定氧化色氨酸残基数。

6.5.6.氨基的去除

为了去除重组组织保护性细胞因子的氨基，按照Kokkini等 (Kokkini，G.等“Modification of hemoglobin by ninhydrin(茚三酮对血红 蛋白的修饰).”Blood，第556卷，第4期，1980：701-705)描述的方法， 将重组组织保护性细胞因子(100μg与含有20mM茚三酮(Pierce Chemical，Rockford，Il)的PBS(pH7.4)一起于37℃保温2小时。通过 使产物与硼氢化钠或氢化铝锂反应，完成所得醛的还原。具体地讲， 红细胞生成素(100μg)与0.1M硼氢化钠的PBS在室温下保温30分 钟。通过将样品在冰上冷却10分钟终止还原反应，并对PBS透析3 次，过夜。(Kokkini，G.，Blood，第556卷，第4期，1980：701-705)。 通过将重组组织保护性细胞因子(100μg与0.1M氢化铝锂的PBS在 室温下保温30分钟，完成用氢化铝锂的还原。通过将样品在冰上冷 却10分钟终止还原反应，并对PBS透析3次，过夜。

6.5.7.二硫键还原和稳定化

重组组织保护性细胞因子(100μg)与500mM DTT于60℃保温15 分钟。然后向混合物中加入20mM碘乙酰胺的水溶液并在室温下避 光保温25分钟。

6.5.8.有限蛋白酶解

重组组织保护性细胞因子可以经历靶向特定残基的有限化学蛋 白酶解。重组组织保护性细胞因子与2-(2-硝基苯基亚磺酰基)-3-甲基 -3′-溴假吲哚反应，所述反应在室温避光在氮气压下在有帽试管中在 50倍过量的50％乙酸中，在色氨酸残基后特异性切割48小时。通过 用色氨酸猝灭和脱盐终止反应。

如上所述，重组组织保护性细胞因子可以被修饰，但是组织保 护性细胞因子的多个修饰以及额外修饰也可在不偏离本发明的精神 下进行。

6.6.实施例6：组织保护性细胞因子具有神经保护效应

按照Manley等，2000，Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke(小鼠水通道蛋 白-4缺失降低急性水中毒和局部缺血性中风后脑水肿)，Nat Med 2000 Feb；6(2)：159-63描述的方法，用水中毒测定评价化学修饰的红细胞 生成素的神经保护效应。使用C3H/HEN雌性小鼠。腹膜内给予小鼠 其体重20％的水和400ng/kg bw DDAVP(去氨加压素)。给予小鼠红 细胞生成素(A)或组织保护性细胞因子：脱唾液酸红细胞生成素(B)、 氨甲酰化脱唾液酸红细胞生成素(C)、琥珀酰化脱唾液酸红细胞生成 素(D)、乙酰化脱唾液酸红细胞生成素(E)、碘化脱唾液酸红细胞生成 素(F)、羧甲基化脱唾液酸红细胞生成素(G)、氨甲酰化红细胞生成素 (H)、乙酰化红细胞生成素(I)、碘化红细胞生成素(J)或Nε-羧甲基红 细胞生成素(K)。在给予水前24小时和在给予水的时候，腹膜内两次 给予小鼠100微克/kg剂量的红细胞生成素或化学修饰的红细胞生成 素。来自Manley等的改良等级量表用于评价小鼠。修改的评分如下 列出：

1.探索笼子/桌子

是    0

否    1

2.视觉追踪目标

是    0

否    1

3.胡须运动

存在  0

不存在1

4.腿-尾运动

正常  0

僵硬  1

瘫痪  2

5.痛苦撤回(脚趾夹)

是    0

否    1

6.运动协调性

正常  0

异常  1

7.在桌边停止

是    0

否    1

可能的总评分：8

在以下时间点对小鼠进行评分：15分钟、30分钟、45分钟、60 分钟、75分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟。图14显 示接受红细胞生成素或化学修饰的红细胞生成素小鼠的表现，以对 照小鼠神经元缺陷实验的百分率计。图14显示组织保护性细胞因子 对由水中毒引起的神经病学创伤的小鼠的保护。预期具有类似化学 修饰的重组组织保护性细胞因子可得到类似结果。也测定了统计学 显著性。与对照相比，这些给药方案具有显著性差异，p＜0.05，用* 表示，而具有高显著性差异的，p＜0.01，用**表示。

6.7.实施例7：以备移植用心脏功能的维护

按照Delcayre等，1992，Amer.J.Physiol.263：H1537-45描述的方 案，对于体重在300-330g的Wistar雄性大鼠，在进行离体研究而取 出心脏前24小时，给予细胞生成素(5000U/kg体重)或溶媒。用戊巴 比妥(0.3mL)处死动物并在静脉内肝素化(0.2mL)。心脏开始让其平衡 15分钟。然后，使左心房囊膨胀至舒张期末压为8mm Hg的体积。 通过增加囊体积膨胀至0.02ml，构建左心室压力体积曲线。零体积 定义为其中左心室舒张期末压为零的点。在完成压力体积曲线时， 在检查冠状动脉流动后，使左心室囊缩小至舒张期末压恢复到8mm Hg而且控制周期继续15分钟。然后，心脏用50mL Celsior+分子停 止跳动，以在压力为60cm H2O下于4℃静息。然后切取心脏并于4 ℃在装满相同溶液且周围放满碎冰的塑料容器中贮存5小时。

在完成贮存后，将心脏转移到Langendorf设备上。囊导管重新 插入到左心室并重新膨胀到与缺血前期相同的体积。于37℃将心脏 再灌注至少2小时。再灌注压力设置在50cm H2O达重新流动15分 钟，然后恢复到100cm H2O再进行2小时。重新建立心博(320次/分)。 在再灌注25分钟、45分钟、60分钟和120分钟，重复3次进行收 缩指数和舒张压的等容测量。在该时间点完成压力体积曲线，并收 集45分钟再灌注期间的冠状动脉流出液，以测量肌酸激酶渗漏。用 不成对t-检验比较两组治疗组，用舒张期末压数据的线性回归用于设 计依从曲线。如图15所示，在用红细胞生成素治疗后，发生左心室 压力变化的明显改善，以及改善的体积-压力曲线、降低左心室舒张 压并降低肌酸激酶渗漏。用本发明重组组织保护性细胞因子进行治 疗，预期可得到类似结果。

6.8.实施例8：红细胞生成素保护心肌细胞免于局部缺血性损伤

在麻醉前24小时给予成年雄性大鼠重组人红细胞生成素(5000U /kg体重)，并准备进行冠状动脉闭塞。在手术开始时给予额外剂量的 红细胞生成素，并使左主冠状动脉闭塞30分钟，然后再释放。处理 后每天给予相同剂量的红细胞生成素达1周。然后研究动物的心脏 功能。如图16表明，接受假注射(盐水)的动物证明在左舒张期末压 有大的增加，表明继发心肌梗塞后扩大的、僵硬的心脏。相比之下， 与假手术对照相比，接受红细胞生成素的动物没有经历心脏功能减 退(显著性差异在p＜0.01的水平)。用本发明重组组织保护性细胞因 子进行治疗，预期可得到类似结果。

6.9.实施例9：外周给予红细胞生成素对视网膜缺血的保护

视网膜细胞对局部缺血非常敏感，所以在缺血性应激反应30分 钟后，许多细胞死亡。此外，亚急性或慢性局部缺血是伴随大量的 人类常见疾病(例如糖尿病、青光眼和黄斑变性)的变性症状的基础。 迄今为止，尚没有保护细胞免于局部缺血的有效疗法。紧密内皮屏 障存在于血和视网膜之间，所述屏障可排阻大多数大分子。为了检 测是否外周给予红细胞生成素能保护对局部缺血敏感的细胞，使用 如Rosenbaum等(1997；Vis.Res.37：3443-51)所述的急性、可逆的青 光眼大鼠模型。具体地讲，将盐水注射到成年雄性大鼠的眼前室， 给全身动脉压力加压并维持60分钟。在诱导局部缺血前24小时， 腹膜内给予动物盐水或5000U红细胞生成素/kg体重，并再连续给 予3天的日剂量。治疗后1周对适应黑暗的大鼠进行视网膜电描记 术。图17-18说明，与仅给予盐水治疗、只保留极少功能的动物(图17， 图面C)相比，给予红细胞生成素在视网膜电图(ERG)(图17，图面D) 上有着良好的保留。图18比较了红细胞生成素治疗组和盐水治疗组 的视网膜电图a-波和b-波振幅，显示出红细胞生成素提供明显保护。 用本发明重组组织保护性细胞因子进行治疗，可得到类似结果。

6.10.实施例10：红细胞生成素对由脑损伤所致减退的认知功 能的恢复效应

在证明红细胞生成素对接受脑创伤后小鼠恢复减退的认知功能 能力的研究中，如Brines等，PNAS 2000，97；10295-10672所述，让 雌性Balb/c小鼠遭受钝器脑创伤，5天后开始腹膜内每天给予5000 U/kg-bw红细胞生成素。损伤后20天，在Morris水迷宫中检查动物 的认知功能，每天4次试验。虽然在试验中治疗动物和未经治疗的 动物表现都不好(游泳时间约为80秒，而不是可能的90秒)，图19 显示在损伤后5天开始用EPO治疗脑钝器创伤的Morris水迷宫实验， 每组小鼠n＝16。第一次实验在给予EPO后1周(损伤后12天y)。两 组动物表现都不好(游泳时间约为80秒，而不是可能的90秒)。经红 细胞生成素治疗的动物表现较好(在该图中，阴性值较好)。每天4次 试验，取平均值。图19显示。即使延迟到创伤后30天才开始进行 红细胞生成素治疗(图20)，也可观察到认知功能的恢复。在图20中， 每组小鼠n＝7，在损伤后一个月开始，除了周末以外用5000U/kg EPO 治疗。实验的平均值也是每天4次实验。用本发明重组组织保护性 细胞因子进行治疗，预期可得到类似结果。

6.11.实施例11：红藻氨酸模型

在红藻氨酸神经毒性模型中，按照Brines等，Proc.Nat.Acad. Sci.U.SA.2000，97；10295-10672描述的方案，在给予25mg/kg红藻 氨酸前24小时，腹膜内给予5000U/kg-bw剂量的脱唾液酸红细胞生 成素，显示同红细胞生成素一样有效，如死亡时间所示(图21)。用本 发明组织保护性细胞因子进行治疗，预期可得到类似结果。

6.12.实施例12：脊髓损伤模型

6.12.1.大鼠脊髓压迫检测红细胞生成素和组织保护性细胞因子

在该项研究中使用重量在180-300g的Wistar大鼠(雌性)。动物 在手术前禁食12小时并被人道限制，然后腹膜内注射硫喷妥钠(40 mg/kg-bw)而麻醉。渗透到皮肤(布比卡因0.25％)后，借助解剖显微镜， 通过2cm切口进行完全单水平(T-3)椎板切除术。通过硬膜外应用暂 时动脉瘤夹对脊髓施加0.6牛顿(65克)闭合力达1分钟，诱导创伤性 脊髓损伤。去除夹子后，皮肤切口被缝合，让动物从麻醉中完全恢 复，放回笼子。每天至少2次膀胱触诊，连续监测大鼠直到自动进 行排泄为止。

将40只动物随机分成5组。接受普通盐水(通过静脉内注射)的 对照组(I)动物(n＝8)在切开后立即缝合。组(II；n＝8)接受rhEPO@16 微克/kg-bw iv，组(III)接受本发明的脱唾液酸组织保护性细胞因子(脱 唾液酸红细胞生成素)@16微克/kg-bw iv，组(IV)接受脱唾液酸组织 保护性细胞因子@30微克/kg-bw iv，和组(V)接受本发明的脱唾液酸 组织保护性细胞因子(脱唾液酸红细胞生成素)@30微克/kg-bw；所 有都是在去除动脉瘤夹子后立即进行单次大剂量静脉内注射。

大鼠的运动神经功能将通过使用Basso等的运动等级量表来评 价。在该量表中，动物的评分范围从0(没有观察到后肢运动)到21(正 常步态)。将在损伤后1小时、12小时、24小时、48小时、72小时 和1周，由不知道每只动物接受的治疗的同一检查人员检查大鼠的 功能缺陷。

图22是一幅曲线图，证明大鼠在脊髓创伤30天内恢复的运动 等级。如图所示，给予红细胞生成素(组II)或组织保护性细胞因子(组 III-组V)的大鼠很容易从损伤恢复过来，并证明比对照鼠有更好的总 体恢复。用本发明重组组织保护性细胞因子进行治疗性治疗，预期 将得到类似结果。

在第二个相关研究中，动物按同样方式注射。将40只动物随机 分成3组。接受普通盐水(通过静脉内注射)的对照组动物(n＝8)在切开 后立即缝合。第二组(n＝8)接受甲泼尼龙@30微克/kg，每天3次，然 后两周1次，甲泼尼龙是脊髓损伤的常用治疗药；第3组在损伤后 立即接受本发明的重组组织保护性细胞因子S100E，其剂量为 10μg/kg-bw，所有都是在去除动脉瘤夹子后立即进行单次大剂量静脉 内注射。

大鼠的运动神经功能将通过使用Basso等的运动等级量表来评 价。在该量表中，动物的评分范围从0(没有观察到后肢运动)到21(正 常步态)。将在损伤后1小时、12小时、24小时、48小时、72小时 和1周，由不知道每只动物接受的治疗的同一检查人员检查大鼠的 功能缺陷。

图37是一幅曲线图，证明大鼠在脊髓创伤42天内恢复的运动 等级。如图所示，给予S100E的大鼠很容易从损伤恢复过来，并证 明比对照鼠和用甲泼尼龙治疗的大鼠有更好的总体恢复。

6.12.2.兔脊髓缺血检验红细胞生成素和组织保护性细胞因子

在该项研究中使用重量在1.5-2.5kg的36只新西兰白兔(8-12月 龄，雄性)。动物禁食12小时并被人道地限制。通过吸入3％氟烷的 100％氧并维持在50％氧和50％空气混合物中的0.5-1.5％氟烷中，进 行麻醉。将静脉内导管(22号)放置在左耳静脉中。在外科手术中，以 4ml/kg体重(bw)每小时的速率输注Ringers乳酸盐。术前静脉内给予 10mg/kg-bw头孢唑林以防感染。将动物放置成右侧卧位置，用聚维 酮碘备皮，用布比卡因(0.25％)渗透并且在第12肋骨平行于脊骨开一 个胁下皮肤切口。当切开皮肤和皮下胸腰筋膜后，腰最长肌和腰髂 肋肌收缩。通过左腹膜后途径将腹部主动脉暴露并转移到左肾动脉 下。一条PE-60管环绕在离开左肾动脉的主动脉周围且两端穿过大 橡胶管。通过拉紧PE管，大动脉被无创伤地闭塞20分钟。在主动 脉闭塞前，大剂量静脉内给予肝素(400 IU)。20分钟闭塞后，去除管 子和导管，将切口缝合，监测动物直至完全恢复，然后连续评价其 神经功能。

将36只动物随机分成6组。在对照组(I)中，动物(n＝6)在主动脉 闭塞释放后立即静脉内接受普通盐水。组(II)接受rhEPO@6.5微克 /kg-bw；组(III)接受组织保护性细胞因子(氨甲酰化红细胞生成素)@ 6.5微克/kg-bw；组(IV)接受另一种组织保护性细胞因子(脱唾液酸红 细胞生成素)@6.5微克/kg-bw；组(V)接受与组(IV)相同的组织保护 性细胞因子，但为@20微克/kg-bw；和组(VI)接受又一种组织保护 性细胞因子(脱唾液酸氨甲酰化红细胞生成素)@20微克/kg-bw；所 有都是在再灌注后立即经静脉内给予(对于每组n＝6)。

按照Drummond和Moore的标准，由不知道在再灌注后1小时、 24小时和48小时治疗的调查人员评价运动功能。如下对每个动物进 行从0到4的评分：0＝没有下肢运动功能的截瘫；1＝下肢运动功 能差，仅有微弱反重力运动；2＝有良好反重力力量，但不能在身体 下迈动腿的中等下肢运动功能；3＝良好运动功能，能在身体下拖动 腿跳跃，但不正常；4＝正常运动功能。在截瘫动物中每天2次手工 给膀胱排便。

图23是一幅曲线图，描绘恢复的兔的运动功能。图上证明，甚 至在仅2天周期内，红细胞生成素和本发明的组织保护性细胞因子 就能让兔从脊髓损伤中完全恢复过来。用本发明重组组织保护性细 胞因子进行治疗性治疗，预期将得到类似结果。

6.13.实施例13：红细胞生成素的抗炎效应

体内研究：

大鼠MCAO

重量在250-280g的雄性Crl：CD(SD)BR大鼠得自Charles River， Calco，Italy。按照Brines，M.L.，Ghezzi，P.，Keenan，S.，Agnello，D.，de Lanerolle，N.C.，Cerami，C.，Itri，L.M.和Cerami，A.2000.Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury (红细胞生成素穿越血-脑屏障以防止实验性脑损伤).[In Process Citation]Proc Natl Acad Sci USA 97：10526-10531描述的方法，对这些 大鼠进行手术。简而言之，将大鼠用水合氯醛(400mg/kg-bw，i.p.)麻 醉，露出颈动脉，通过两次缝合闭塞右颈动脉并切开。邻近和朝向 右眶的锯齿孔让MCA清楚呈现，所述孔在离开鼻动脉处进行烧灼。 为了产生围绕该固定MCA损害的半影(边界)，使用细钳牵引，对侧 颈动脉闭塞1小时后再放开。MCAO后立即给予PBS或rhEPO(5,000 U/kg-bw，i.p.；先前显示在该模型(1)中有保护性)。当需要时，如前所 述(8)定量测定大脑皮层匀浆的TNF和IL-6。用市售ELISA试剂盒 (biosource，Camarillo，CA)，测定匀浆中的MCP-1。

MCAO后24小时，如上所述麻醉大鼠，并通过心脏灌注100ml 盐水，接着是250ml磷酸钠缓冲的4％低聚甲醛溶液。快速切下脑， 在磷酸钠缓冲的4％低聚甲醛溶液中固定2小时，转移到20％蔗糖溶 液的PBS过夜，然后在30％蔗糖溶液中直到它们被浸没，然后在2- 甲基丁烷中在-45℃冷冻。在-20℃，在恒冷切片机(HM 500 OM，Microm) 上以横向平面通过脑进行切片(30μm)并选择每隔5片的切片用于针 对不同抗原或苏木精-伊红染色的组织化学。分别按照Houser等所述 的方案和生产商的方案，用抗神经胶质纤维酸蛋白(GFAP)小鼠单克 隆抗体(1：250，Boehringher Mannheim，Monza，Italy)和用抗cdlllb (MRC OX-42)小鼠单克隆抗体(1：50，Serotec，UK)处理自由漂浮切片用 于免疫反应性。所有切片在包埋的玻片上在盐水中制成用于光学显 微镜的浸片，通过逐级酒精脱水，在二甲苯中固定并用DPX mountant (BDH，Poole，UK)盖上玻片。邻近切片如(10)所述用苏木精-伊红染 色。

图24显示经苏木精和伊红染色的大脑皮层冠状切面。对照大鼠 (A)、局部缺血性大鼠(B)用PBS处理，局部缺血性大鼠(C)用rhEPO (5,000U/kg-bw，i.p.，MCAO后立即给予)处理。切片B显示与对照(A) 相比，与炎症一致的组织染色的明显降低，伴随神经元成分的损失。 系统给予rhEPO极大地降低了细胞死亡部位的局部缺血性损伤或局 部区域的损伤(C)。(放大倍数2.5x.比例尺＝800μm.)

图25显示用GFAP抗体染色的邻近梗塞区前皮层的冠状切面。 对照大鼠(A)、局部缺血性大鼠用PBS处理(B)，局部缺血性大鼠用 rhEPO处理(C)。活化星形胶质细胞通过其GFAP阳性过程而显现出 来(图面B)。在数量上以及在代表性的经rhEPO处理动物中活化星形 胶质细胞的染色强度都明显下降(图面C)。(放大倍数10x.比例尺＝ 200μm.)

图26显示用OX-42抗体染色的大脑皮层的冠状切面。局部缺血 性大鼠用PBS处理(A)，局部缺血性大鼠用rhEPO处理(B)。在局部 缺血性脑半球中，在两个治疗组中围绕梗塞组织的细胞染色特别突 出，但是在盐水治疗组中更密集更广泛。(放大倍数20x；比例尺＝100 μm)。

图27显示用OX-42抗体染色的邻近梗塞区的大脑皮层冠状切 面。与用rhEPO处理的局部缺血性大鼠(B)相比，用PBS处理的局部 缺血性大鼠(A)中观察到高得多的单核炎性细胞密度。具有典型的圆 形的浸润性白细胞将扩大梗塞体积。(放大倍数10x；比例尺＝200 μm)。

用本发明重组组织保护性细胞因子进行治疗性治疗，预期将得 到类似结果。

Lewis大鼠中的急性实验性变应性脑脊髓炎(EAE)

6-8周龄的雌性Lewis大鼠购自Charles River(Calco，Italy)。通 过在轻微醚麻醉下，向大鼠的两个后足垫注射用加有热灭活结核分 枝杆菌(M.tuberculosis)H37Ra(Difco，Detroit，MI)的等体积的完全弗 氏佐剂(CFA，Sigma)乳化的50μg豚鼠MBP(Sigma，St.Louis，MO)水 溶液(使终体积为100μ)，在大鼠中引起EAE。盲法检查大鼠EAE症 状并如下评分：0，没有疾病；1，尾弛缓；2，共济失调；3，后肢 完全瘫痪并伴有小便失禁。自免疫后3天开始，腹膜内(i.p.)给予大鼠 指定剂量溶于PBS的r-Hu-EPO(EPOetin alfa，Procrit，Ortho Biotech， Raritan，NJ)，每天1次。因为临床级EPO含有人血清白蛋白，所以 通常给予对照动物含有相同数量的人血清白蛋白的PBS。每日给予 5,000U/kg-bw的EPO增加血细胞比容达30％当需要时，从3天到 18天用相当于1mg/kg-bw的地塞米松(DEX)的溶于PBS的1.3 mg/kg-bw的DEX的磷酸二钠盐(Sigma)注射(s.c.)大鼠。当需要时， 如前所述[Agnello，2000 #10]定量测定脑和脊髓匀浆中的TNF和IL- 6。

图28显示经MBP免疫后3天到18天给予不同剂量EPO对EAE 临床体征的保护效应。EPO以剂量依赖方式延迟疾病的发作并降低 疾病的严重程度，如表1概述。但是，EPO不延迟达到最大严重程 度的时间。如该表所示，EPO当其剂量为2,500和5,000 U/kg-bw时 明显降低平均累积评分。

在疾病恢复后不继续用EPO治疗并监测大鼠达2月之久的实验 中，没有观察到复发，相反在延缓其给药后用DEX导致疾病恶化(图 29)。用本发明重组组织保护性细胞因子进行治疗性治疗，预期将得 到类似结果。

体外研究：

从1-2日龄的新生Sprague-Dawley大鼠制备神经胶质细胞原代 培养物。将脑半球从脑膜剥离并机械破坏。将细胞分散在2.5％胰蛋 白酶和1％DNA酶溶液中，通过100μm尼龙网过滤并接种(140,000 细胞/35mm皿)在补充10％胎牛血清、0.6％葡萄糖、氯霉素(0.1mg/ml) 和青霉素(100UI/ml)的Eagle氏极限必需培养基上。每周2次喂养神 经胶质培养物并于37℃培养在5％CO2的增湿培养箱中。所有实验均 在2-3周龄的神经胶质细胞培养物上进行，所述培养物用GFAP和 Griffonia sirnplicifolia同工凝集素B4的免疫化学测定，其中有97％ 的星形胶质细胞和3％的小胶质细胞。从18天的大鼠胎儿海马建立 神经元培养物。移出大脑并从脑膜剥离，分离海马。通过在2.5％胰 蛋白酶溶液中于37℃保温15-20分钟，将细胞分散，然后测定浓度。 将细胞悬液在用于神经胶质细胞的培养基中稀释并以160,000细胞每 盖玻片的密度接种到聚鸟氨酸包埋的盖玻片上。接种后一天，将盖 玻片转移到含有神经胶质单层的、补充阿糖胞苷5μM的神经元维持 培养基(补充了5μg/ml胰岛素、100μg/ml转铁蛋白、100μg/ml putrescin、30nM亚硒酸钠、20nM孕酮和100U/ml青霉素的Dulbecco 氏改良Eagle氏培养基和Ham氏营养混合F12)培养皿上。翻转盖玻 片，使海马神经元面向神经胶质单层。粘在盖玻片上的石蜡点支撑 它们在神经胶质上，产生狭缝，防止两种细胞类型彼此接触，但又 允许可溶性物质扩散。这些培养条件允许分化神经元培养物生长， 所述培养物用微管相关蛋白2和GFAP的免疫化学测定具有＞98％的 同源性。然后在rhEPO(10U(80ng)/ml)存在或不存在下，用1μM 三甲基锡(TMT)将细胞处理24小时，上清液用于TNF测定，细胞活 力如上所述进行评价。当需要时，在LPS存在下，有或没有rhEPO 时，将神经胶质细胞培养24小时，测定培养上清液中的TNF。通过 3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四溴化唑(MTT)测定，测定细胞 活力。Denizot，F.和Lang，R.1986.Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.(细胞生长和存活的快速比色 测定。对四氮唑染料方法的修改以得到改善的灵敏度和可靠性).J Immunol Methods 89：271-277。简而言之，将MTT四氮唑盐溶于无 血清培养基中，使其终浓度为0.75mg/ml，并加入到处于于37℃处 理了3小时末期的细胞中。然后去除培养基，用1N HCl∶异丙醇(1∶24) 萃取甲_。在微量板读数器上读取560nm吸光度。

图30显示rhEPO在混合神经元胶质培养物中预防诱导神经元死 亡的TNF产生。图面A：有或没有rhEPO(10U/ml)时，由TMT 1μM 诱导的神经细胞死亡百分率。图面B：在神经元存在(阴影条带)或不 存在(填黑条带)、有或没有rhEPO(10U/ml)时，从暴露给TMT 1μM 的神经胶质细胞释放的TNF。用本发明重组组织保护性细胞因子进 行治疗性治疗，预期将得到类似结果。

6.14.实施例14：NMDA诱导细胞死亡测定

兴奋毒性可定义为谷氨酸受体的过度活化，诸如N-甲基-D-天冬 氨酸(NMDA)受体的过度活化。NMDA受体在响应缺血性创伤或其 它创伤时表现出增加的活性(Fauci等，1998，Harrison′s Principles of Intemal Medicine)、(Nishizawa，2001，Life Sci.69，369-381)、(White等， 2000，J.Neurol.Sci.179，1-33)。因此，该测定作为评价对细胞损伤和 死亡有效应的化合物的模型。

在原代海马神经元中NMDA兴奋毒性的方案

按照Krohn等(1998)描述的方法，从新生小鼠(小于24小时)制 备原代海马神经元培养物。简而言之，海马在含有0.02％BSA的 DMEM中切片。将组织转移到含有0.1％木瓜蛋白酶的DMEM中， 并于37℃保温20分钟。吸去含有木瓜蛋白酶的培养基并加入MEMII 而终止消化，将海马细胞用1000μl移液管吸打分散。组织碎片静置， 将含有单个细胞的上清液转移到含有1％胰蛋白酶抑制剂(typeII-O) 和1％BSA的MEMII中。吸打步骤重复3次，然后将单个细胞在600U/ 分钟离心10分钟，并重新悬浮在生长培养基(MEMII，20mM D-葡萄 糖，100U/ml青霉素，100μg链霉素，2mM L-谷氨酰胺，10％Nu-血清 (牛)，2％B27补充剂，26.2mM NaHCO3)中。来自10个海马的细胞用 于接种24孔板。接种1天后，将细胞用胞苷-阿拉伯糖-呋喃糖苷(1μM) 处理。在第2天，更换培养基，加入胞苷-阿拉伯糖-呋喃糖苷(1μM)。

兴奋毒性测定

12天龄的培养物与5nM的试验化合物(溶媒、R103E、R150E或 EPO)预保温24小时。在第13天，将培养基从细胞移出并保持，同 时用300μM NMDA在室温下攻击培养物达5分钟。兴奋毒性损害 后，将预条件培养基返回到培养物中，再保温24小时后用锥虫蓝排 除定量测定损害。每种条件都在至少4个单独孔中统计约300个神 经元，并且重复实验至少2次(Krohn，A.J.，Preis，E.和Prehn，J.H.M. (1998)J.Neurosci.18(20)：8186-8197)。

图31显示在MNDA处理前，人红细胞生成素和重组组织保护 性细胞因子R130E和R150E当加入到原代海马神经元细胞培养中， 有效降低由NMDA引起的细胞死亡。与溶媒对照细胞相比，用R103E (5nM)处理的细胞表现出显著减少的细胞死亡(p＝0.01)。与溶媒对照 细胞相比，用R103E(5nM)处理的细胞表现出显著减少的细胞死亡 (p＝0.01)。与溶剂对照细胞相比，用R150E(5nM)处理的细胞在细胞 死亡上表现出约20％的减少(P＝0.001)。统计学：ANOVA加上Tukey 氏事后检验。

6.15.实施例15：去除血清后P19细胞中的神经元保护

为了检测本发明的重组组织保护性细胞因子的神经元保护效 应，去除血清的P19细胞用作模型。克隆P19S1801A1由Dr.W.H. Fischer友好提供。在7％CO2的空气中、在增湿培养箱中，将细胞保 持在补充了2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸 链霉素和10％胎牛血清(FCS；都来自Gibco，Paisley，Scotland，LTK)并 含有1.2g/L NaHCO3、10mM Hepes缓冲液(Carlo Erba，Milano，Italy) 的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM)(这在下文称为完全培养基) 中。无血清培养基(N2)具有如上相同的组成，但缺乏血清，并加入以 下物质：5μg/ml胰岛素、100μg/ml转铁蛋白、20nM孕酮、100μM 腐胺和30nM Na2SeO3(都来自Sigma)。对于死亡实验，将细胞用10％ 胰酶制剂(Gibco)分散，用完全培养基洗涤1次，用N2培养基洗涤2 次，并接种，除非另有说明，否则接种在25cm2组织培养瓶(Falcon Becton Dickinson，Lincoln Park，New Jersey)中，在5ml无血清培养基 中终浓度为104细胞/cm2。L-乙酰肉毒碱(100μM)作为阳性对照，在 去除血清后24小时后，所述物质赋予保护性降低达50％的凋亡核的 百分率。在去除血清后24小时后，敲打培养瓶使细胞分散(不用胰蛋 白酶)，通过以600rpm旋转离心(Shandon Southern，USA)10分钟后， 接种在显微镜玻片上并用Carnoy溶液(甲醇∶乙酸，3∶1)固定10分钟， 用Hoechst 33258(0.1μg/ml PBS)于37℃染色1小时，用自来水洗涤15 分钟，风干并安装好。用荧光显微镜(Zeiss，Germany)在365nm激发 波长下观察玻片。凋亡核的百分率在至少5次检测中通过盲法在总 共100个细胞中计数来测定。

将P19细胞与3nM Epo或重组组织保护性细胞因子S100E预保 温24小时。这样的处理对由去除血清触发的细胞凋亡产生显著性(p＜ 0.001)保护。数据是1次实验中3次测定的平均值。实验进行两次， 结果类似。

图32显示去除血清后P19细胞中的神经元保护。对于用Epo、 EpoWT和重组组织保护性细胞因子S100E进行预处理的细胞来说， 凋亡细胞死亡的百分率下降。与未处理的对照细胞相比，用EPO处 理的细胞在凋亡细胞死亡上表现出约20％的下降。与未处理的对照 细胞相比，用EpoWT和S100E处理的细胞在凋亡细胞死亡上都表现 出约10％的下降。

6.16.实施例16：在分化的PC12细胞中NGF去除

为了检测本发明的重组组织保护性细胞因子的神经元保护效 应，NGF去除的分化的PC12细胞用作模型。所述测定是一个良好 建立的细胞凋亡模型。所述PC12大鼠细胞系是来自肾上腺髓质嗜铬 细胞瘤(phaeochromocytoma)，并且在NGF的存在下可分化成神经元 样细胞(Masuda等，1993，J Biol Chem 268，11208-11216)。PC12细胞 系是神经内分泌细胞系，所述细胞系在NGF存在下可分化表达神经 元样表型(Vaudry等，2002，Science 296，1648-1649)。一旦细胞完全分 化，它们就成为NGF依赖性的，并且当去除NGF会导致细胞凋亡。

PC12细胞在补充了10％热灭活马血清、5％热灭活胎牛血清、1％ 丙酮酸钠和1％青霉素-链霉素(P/S)(Invitrogen，Carlsbad，USA)的 Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中维持。

为了进行实验，在补充了1％热灭活马血清、1％丙酮酸钠、1％P/S 和100ng/ml NGF(7S神经生长因子，小鼠颌下腺，购自Calbiochem，产 品目录号480354)的DMEM中，将密度为24,000细胞/孔的细胞在胶 原G包埋的48孔板中分化7天，每隔2-3天更换培养基。在第6天， 当用RPMI1640、1％P/S替代培养基以从所有细胞中去除NGF之后， 将在氨基酸100的Epo突变体(＝S100E)以指定浓度加入到细胞中达24 小时。再加入S100E，当NGF(100ng/ml)作为阳性对照(+NGF)时。24 小时后，通过四氮唑(MTT)还原测定来测定活力。

图33A和图33B显示在两个独立的实验中，在去除NGF的分 化PC12细胞中，用S100E进行预保温的效应。分化的PC12细胞用 指定浓度的S100E预处理24小时，图33A(3pM)图33B(0.00003 pM-3pM)。在MTT测定中测定活力。NGF(100ng/ml)代表阳性对照， 而无NGF培养基(-NGF)作为阴性对照。图33所示数据是阳性对照 (+NGF)和活力的％(在两个实验中n＝8)。使用单向ANOVA和 Bonferroni事后检验，***p＜0.001，*p＜0.05，与阴性对照细胞(-NGF) 相比，经S100E处理细胞的活力有统计学显著性增加。对于效力和 功效来说，用S100E观察到的效果与在这样的实验系统中用EPO类 似。

图34显示在去除NGF的分化PC12细胞中与Epo预保温的效 应。分化的PC12细胞用Epo、S100E或氨甲酰化Epo(30pM-30nM) 预处理24小时。化学修饰的Epo分子AA24496在UT-7细胞测定中 比EPO活性低10000倍。在MIT测定中测定活力。NGF(100ng/ml) 用作阳性对照，而无NGF培养基(-NGF)作为阴性对照。

6.17.实施例17：EPO生物测定UT-7细胞增殖

UT-7是用于测定重组组织保护性细胞因子诸如K45D的红细胞 类效应的白血病Epo依赖性细胞系。UT-7细胞(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，产品目录号ACC 363) 在10％FBS和5ng/ml Epo的存在下正常生长。暴露给Epo的细胞的 增殖/存活(＝活力增加)效应通过传统的外周型Epo受体介导。定量 测定增殖效应并确定增殖效应与Epo-变异体刺激传统Epo受体能力 的关系。

用干UT-7细胞活力测定的方法

制备Epo依赖性人白血病细胞系UT7，对加入的Epo/重组组织 保护性细胞因子的增殖效应用作其生物学活性的测定。在测定的第1 天，将细胞转移到含有10％血清并含有Epo(5ng/ml)的新鲜完全RPMI 1640培养基(10％供体小牛血清，4mM L-谷氨酰胺，补充5ng/ml of rhuEPO)中。细胞在盛装有20ml培养物的75cm2培养瓶中生长。在 测定的第2天，将细胞从瓶中转移到50ml锥形管中并在室温下在 1,000rpm离心5分钟。弃去陈旧培养基并将细胞用10nl饥饿培养 基(3％供体小牛血清、4mM L-谷氨酰胺)洗涤2次。将细胞重新悬浮 在饥饿培养基中，用吸管上下抽吸以获得单细胞悬液。为了测定细 胞密度，将重新悬浮的细胞用饥饿培养基稀释，使密度为4×105细 胞/ml，培养基总体积为10ml，然后接种到25cm2培养瓶中。混合 物在5％CO2增湿培养箱中在37C保温4小时。在保温的最后1小 时，准备96孔板。在4小时保温末期，将细胞培养物从培养箱中移 出，将细胞从瓶中转移到50ml锥形管中。用手摇动将内容物混合， 保持细胞悬浮。加入50ml饥饿培养基作为没有细胞的培养基空白。 5个孔是没有试剂的对照细胞。相邻一排孔含有最低浓度的重组组织 保护性细胞因子。以后每一相邻排的孔依次加入更高浓度。在96孔 板的，将在含有3％血清和没有Epo的培养基中保温的细胞培养物中， 以200,000细胞/ml每孔接种100μl。用搅拌盘顶端的轨道振动平台将 内容物迅速和小心混合。将该板与不同浓度Epo变异体(从0.2pM-20 nM)在含有3％血清的RPMI 1640培养基中、在5％CO2的增湿培养 箱中在37C保温48小时。一天测定4次，将96孔板从培养箱中取 出，放置在室温下的层流罩中。通过测量细胞代谢四氮唑染料WSTl 形成的甲_产物(该产物与细胞活力和细胞数目相关)，立即定量测定 生物活性(450nm的光度计吸收值，减去620nm的背景吸收值)。

结果

UT7细胞在含有Epo的培养基上生长3个月，显示出稳定和可 靠的生长。

诱导活力的K45D以剂量依赖的方式诱导了Epo依赖性UT-7细 胞活力增加，其EC50为294.0。相比之下，对于Epo，EC50为58.13(图 35)，而对于His标记Epo(EpoWT)为608。在浓度＜50nM(即在可测 量范围内)时，S100E不增加Epo依赖性UT-7细胞的活力(大于50％)。 因此，K45D显示出在与Epo相同数量级的效力，而S100E显示出 比Epo至少低1000倍的效力。

在高达20nM浓度下，R103E不增加Epo依赖性UT-7细胞的存 活，即其效力与Epo相比至少低4个数量级。R150E以剂量依赖的 方式诱导Epo依赖性UT-7细胞的存活，其EC50为20nM。相比之下， 对于Epo(Epo#4)来说，EC50为66.5(图36)。因此，R150E显示出比 Epo至少低3个数量级的效力。

图35显示Epo、K45D和S100E在UT-7细胞中的浓度-反应曲 线。将不同浓度的Epo、EpoWT、K45D和S100E加入到UT-7细胞 中。在WST-1测定中，48小时后测定活力。数据是三次不同实验中 每次都进行重复测定的平均值±SD。该曲线是非线性回归曲线拟合。

图36显示Epo、R103E和R150E在UT-7细胞中的剂量反应曲 线。将不同浓度的Epo、EpoWT、R103E和R150E加入到UT-7细 胞中。在WST-1测定中，48小时后测定活力。数据是三次不同实验 中每次都进行重复测定的平均值±SD。该曲线是非线性回归曲线拟 合。

6.18.实施例18：外周给予重组组织保护性细胞因子对视网膜缺 血的保护

如6.9小节所述，视网膜细胞对局部缺血非常敏感，所以在缺血 性应激反应30分钟后，许多细胞死亡。在本实验中，使用如Rosenbaum 等(1997；Vis.Res.37：3443-51)所述的可逆性青光眼的大鼠模型。检测 了重组组织保护性细胞因子对局部缺血性应激反应的效应。

按照6.9小节提供的将盐水注射到成年雄性大鼠的眼前室的实施 例，给每只大鼠的一只眼睛进行注射。再灌注时，即当眼前室的压 力释放时，静脉内给予大鼠10μg/kg EPO的4种重组组织保护性细 胞因子R103E、R150E、S100E和S100e/K45D中的一种或盐水。损 伤后1天、3天、5天和6天，对每只大鼠的受伤眼和正常眼都进行 视网膜电描记术。每只大鼠的受伤眼的潜伏期与同一大鼠的正常眼 的潜伏期进行比较。数据记录为受伤眼潜伏期与正常眼潜伏期的比 率，当受伤眼具有正常功能时产生了一个比率。对损伤结果有两个 因素：振幅(从峰到谷的差异，示于图17，图面A，以‘b’和潜伏 期表示)，响应刺激时到达峰值所花的时间。

图38显示对于不同治疗方案的受伤眼的潜伏期与正常眼的潜伏 期的比率。用EPO治疗的大鼠表现出潜伏期为1.2，比用盐水处理 的大鼠好。对这4种重组组织保护性细胞因子的每种，用R103E、R150E 和S100E产生潜伏期的等于或好于EPO，说明在统计学上比盐水更 好。

本发明的范围并不受用来作为本发明各个方面的个别说明的具 体实施方案的限制并且功能等同的方法和组成都在本发明范围内。 甚至从上所述内容和附图中对本发明的各种修饰，除本文所示和所 述外，也将对本领域技术人员是显而易见的。所述修改全都包括在 所附权利要求书的范围内。

以上引用的所有参考文献通过引用全部结合到本文中，用于所 有目的。

                          序列表

<110>肯尼思S.沃伦协会有限公司(Kenneth S.Warren Industries，Inc. H.Lundbeck A/S)

<120>用于保护、恢复和增强效应细胞、组织和器官的重组组织保护性细胞因 子及其编码核酸

<130>10165-022-999

<140>

<141>

<150>60/392,455

<151>2002-07-01

<150>60/393,423

<151>2002-07-03

<160>212

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Val Leu Gln Arg Tyr

1               5

<210>2

<211>8

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp

1               5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu

1               5

<210>4

<211>6

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Ser Asn Phe Leu Arg Gly

1               5

<210>5

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>5

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Glu Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Ash Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>6

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>6

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Asp Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

180           185                     190

Arg

<210>7

<211>580

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>7

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct     60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag    120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc    180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg    240

atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct    300

gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcactgc    360

atgtggataa agccgtcagt ggccttcgca gcctcaccac tctgcttcgg gctctgggag    420

cccagaagga agccatctcc cctccagatg cggcctcagc tgctccactc cgaacaatca    480

ctgctgacac tttcgcaaac tcttccgagt ctactccaat ttcctccggg gaaagctgaa    540

gctgtacaca ggggaggcct gcaggacagg ggacagatga                          580

<210>8

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>8

agctctcgag gcgcggagat gggggtgcac gaatg               35

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>9

atgctctaga cacacctggt catctgtccc ctgtcc             36

<210>10

<211>193

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>11

catgtggata aagccgtcga gggccttcgc agcctcacca ctctg                    45

<210>12

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>12

cagagtggtg aggctgcgaa ggccctcgac ggctttatcc acatg                   45

<210>13

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>13

gagaatatca ctgtcccaga caccgacgtt aatttctatg cctgg           45

<210>14

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>14

ccaggcatag aaattaacgt cggtgtctgg gacagtgata ttctc           45

<210>15

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>15

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ala Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>16

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>16

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                   30

Ile Ala Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>17

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>17

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

1le Cys Asp Ser Ile Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gin Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150             155                     160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>18

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>18

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Ser Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>19

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>19

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Ala Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>20

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>20

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Ala Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75               80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>21

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>21

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Ala Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

           180                 185                 190

Arg

<210>22

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>22

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>23

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>23

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Glu Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>24

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>24

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>25

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>25

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala 1le Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>26

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>26

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Phe Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gin Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>27

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>27

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Ile Leu Leu Glu Ala Glu Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>28

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>28

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Glu Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr 1le

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>29

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>29

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Ala Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>30

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>30

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Ala

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>31

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>31

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>32

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>32

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Ser Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75               80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>33

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>33

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>34

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>34

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Asn Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>35

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>35

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

l               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu Thr Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>36

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>36

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Ser Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>37

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>37

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Tyr Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>38

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>38

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75               80

Met Glu Val Gly Gin Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>39

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>39

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Lys Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>40

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>40

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Asn Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>41

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>41

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Ala Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>42

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>42

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   l0                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Ala Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>43

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>43

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Ile Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>44

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>44

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Asp Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>45

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>45

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Ala Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>46

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>46

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Ala Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>47

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>47

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Ala Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly G1n Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>48

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>48

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

l               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Ile Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>49

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>49

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Ala Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>50

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>50

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Ala Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75               80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

            85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>51

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>51

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

l               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Ser Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val  Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>52

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>52

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Phe Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>53

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>53

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn lle Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Asn Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>54

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>54

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Ala Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val  Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                  105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>55

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>55

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Asn Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>56

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>56

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Thr Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>57

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>57

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75              80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Ser Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lle

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>58

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>58

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn lle Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Ala Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

         180                  185                  190

Arg

<210>59

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>59

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Arg Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<2l0>60

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>60

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

lle Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75               80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Ala Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>61

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>61

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            l00                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Arg Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>62

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>62

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Glu Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>63

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>63

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ala Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>64

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>64

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Thr Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

                    180                 185                 190

Arg

<210>65

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>65

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ala

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>66

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>66

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ile

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>67

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>67

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu A1a Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn 1le Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Ala Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>68

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>68

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

lle Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Ala Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>69

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>69

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Glu Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>70

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>70

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ala Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>71

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>71

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ile Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>72

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>72

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn lle Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Ala Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>73

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>73

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Ala Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>74

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>74

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn lle Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Ile Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>75

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>75

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>76

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>76

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Leu Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>77

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>77

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Lys Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>78

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>78

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75               80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Ala Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>79

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>79

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Ser Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>80

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>80

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Ala Glu

130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>81

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>81

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ala Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>82

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>82

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Ala Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>83

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>83

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

lle Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ala

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>84

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>84

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40B                 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Ala Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>85

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>85

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Ala Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>86

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>86

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Ile Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>87

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>87

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Ala Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>88

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>88

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn 1le Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lle

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ala Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>89

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>89

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Lys Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>90

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>90

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Ala Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>91

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>91

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Tyr Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>92

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>92

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Ala Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>93

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>93

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Ala

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>94

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>94

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Ala Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>95

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>95

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Glu Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>96

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>96

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Ala Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>97

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>97

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Ala Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>98

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>98

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Trp Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>99

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>99

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Ala Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>100

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>100

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Ala Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>101

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>101

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>102

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>102

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Ala Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>103

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>103

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Ser Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>104

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>104

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Ala Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>105

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>105

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Ala Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>106

<211>192

<212>PRT

<213>人工序列

<220> 

<223>人工序列的描述：突变蛋白 

<400>106

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn

    50                  55                  60

Ile Thr Val Pro Asp Thr Asp Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met

65                  70                  75                  80

Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu

                85                  90                  95

Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln

            100                 105                 110

Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Glu Gly Leu

        115                 120                 125

Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala

    130                 135                 140

Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr

145                 150                 155                 160

Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg

                165                 170                 175

Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg

            180                 185                 190

<210>107

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>107

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>108

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>108

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Asp Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Glu Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>109

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>109

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Glu Ser Leu Thr Thr Ser Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>110

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>110

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Ala Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Ala Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>111

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>111

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Ala Val Asn Phe Tyr Ala Trp Ala Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Ala Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>112

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>112

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>113

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>113

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Ala Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Ala Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>114

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>114

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Ala Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Ala Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Ala Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>115

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>115

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Ala Val Asn Phe Tyr Ala Trp Ala Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Ala Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Ala Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Ala Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>116

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>116

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Ala Val Asn Phe Tyr Ala Trp Ala Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Ala Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Ala Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Ala Leu Ala Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>117

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>117

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Lys Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>118

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>118

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>119

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变蛋白

<400>119

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Ala Ala Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Arg

<210>120

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>120 

gtctactcca atttcctcga gggaaagctg aagctg                                36

<210>121

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>121

gcttcagctt tccctcgagg aaattggagt agac                                  34

<210>122

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>122

ccgtcagtgg ccttgagagc ctcaccactc tg                                    32

<210>123

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>123

cagagtggtg aggctctcaa ggccactgac gg                                    32

<210>124

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>124

ccgtcagtgg ccttgagagc ctcaccactc tg                                    32

<210>125

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>125

cagagtggtg aggctctcaa ggccactgac gg                                    32

<210>126

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>126

cgcagcctca ccacttcgct tcgggctctg g                                     31

<210>127

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>127

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<210>128

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>128

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<210>129

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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catcctcttc caggcaccac cgtctgggac agtgatattc                            40

<210>130

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>130

tacctcttgg aggccgcgga ggccgagaat atc                                   33

<210>131

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>131

gatattctcg gcctccgcgg cctccaagag gta                                   33

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc                                 35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>137

tcccctgtgt acagcgccag ctttccccgg ag                                    32

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>138

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>139

caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt                                 35

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>140

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<211>35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>142

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<211>33

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>143

ggccactgac ggctgcatcc acatgcagct gca                                   33

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<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>147

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>148

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<211>35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>149

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>151

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact                                 35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>154

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<211>35

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<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<211>33

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<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<211>33

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>163

ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat                                   33

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>166

tgcagctgca tgtggatgca gccgtcagtg gcc                                   33

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>167

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>169

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>170

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<210>171

<211>35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<211>35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<220>

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<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<210>179

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt                                 35

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<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact                                 35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>186

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<210>187

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>187

ctgtgtacag cttcagcgct ccccggagga aat                                   33

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<211>35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>188

actgtcccag acaccgcagt taatttctat gcctg                                 35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>189

caggcataga aattaactgc ggtgtctggg acagt                                 35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>190

agttaatttc tatgcctggg cgaggatgga ggtcg                                 35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>191

cgacctccat cctcgcccag gcatagaaat taact                                 35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>192

gctgacactt tccgcgcact cttccgagtc tactc                                 35

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<211>35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>193

gagtagactc ggaagagtgc gcggaaagtg tcagc                                 35

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>194

ctccggggag cgctggcgct gtacacaggg ga                                    32

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<211>32

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>195

tcccctgtgt acagcgccag cgctccccgg ag                                    32

<210>196

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>196

caaggaggcc gagaaaatca cgacgggctg t                                     31

<210>197

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>197

acagcccgtc gtgattttct cggcctcctt g                                     31

<210>198

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>198

actgcagctt gaatgagaaa atcactgtcc cagacac                               37

<210>199

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>199

gtgtctggga cagtgatttt ctcattcaag ctgcagt                               37

<210>200

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>200

aggccctgtt ggtcaaatct tcccagccgt g                                     31

<210>201

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>201

cacggctggg aagatttgac caacagggcc t                                     31

<210>202

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>202

atttcctccg gggatggctg aagctgtaca cag                                   33

<210>203

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>203

ctgtgtacag cttcagccat ccccggagga aat                                   33

<210>204

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>204

agccgagtcc tggaggcggc cctcttggag gccaa                                 35

<210>205

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>205

ttggcctcca agagggccgc ctccaggact cggct                                 35

<210>206

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>206

agccgagtcc tggagagggc cctcttggag gccaa                                 35

<210>207

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>207

ttggcctcca agagggccct ctccaggact cggct                                 35

<210>208

<211>6059

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒

<400>208

ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg      60

ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt     120

atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa     180

gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt     240

ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct     300

ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg     360

gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag     420

cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt     480

tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt     540

ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg     600

tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt     660

taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt     720

tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca     780

aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt     840

ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc     900

ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc     960

tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta    1020

tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag    1080

caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa    1140

ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac    1200

taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt    1260

agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa    1320

cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc    1380

tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg    1440

ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac    1500

cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc    1560

cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg    1620

gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga    1680

gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg    1740

cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg    1800

tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt    1860

cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc    1920

ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg    1980

gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga    2040

gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc    2100

gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc    2160

gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt    2220

attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt    2280

atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc    2340

gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca    2400

agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg    2460

cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat    2520

ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt    2580

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct    2640

tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc    2700

cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa    2760

agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg    2820

taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt    2880

tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg    2940

catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac    3000

ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc    3060

ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa    3120

catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc    3180

aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt    3240

aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga    3300

taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa    3360

atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa    3420

gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa    3480

tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt    3540

ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt    3600

gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg    3660

agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt    3720

aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca    3780

agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac    3840

tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac    3900

atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct    3960

taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg    4020

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca    4080

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt    4140

aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta    4200

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc    4260

gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc    4320

cttttgctgg ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata    4380

ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat    4440

ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttggcat    4500

tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat    4560

atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac    4620

ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc    4680

cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg    4740

tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat    4800

tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc    4860

atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt    4920

gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac    4980

caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc    5040

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc    5100

gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca    5160

gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc    5220

agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga    5280

gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct    5340

attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat    5400

tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga    5460

gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc    5520

tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga    5580

gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg    5640

cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccaaagtt aatttctatg cctggaagag    5700

gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc    5760

tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct    5820

gcatgtggat aaagccgtca gtggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg    5880

agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat    5940

cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct    6000

gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat     6059

<210>209

<211>6059

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒

<400>209

ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg      60

ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt     120

atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa     180

gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt     240

ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct     300

ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg     360

gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag     420

cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt     480

tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt     540

ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg     600

tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt     660

taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt     720

tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca     780

aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt     840

ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc     900

ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc     960

tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta    1020

tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag    1080

caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa    1140

ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac    1200

taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt    1260

agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa    1320

cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc    1380

tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg    1440

ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac    1500

cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc    1560

cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg    1620

gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga    1680

gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg    1740

cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg    1800

tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt    1860

cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc    1920

ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg    1980

gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga    2040

gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc    2100

gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc    2160

gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt    2220

attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt    2280

atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc    2340

gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca    2400

agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg    2460

cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat    2520

ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt    2580

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct    2640

tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc    2700

cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa    2760

agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg    2820

taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt    2880

tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg    2940

catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac    3000

ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc    3060

ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa    3120

catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc    3180

aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt    3240

aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga    3300

taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa    3360

atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa    3420

gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa    3480

tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt    3540

ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt    3600

gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg    3660

agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt    3720

aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca    3780

agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac    3840

tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac    3900

atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct    3960

taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg    4020

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca    4080

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt    4140

aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta    4200

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc    4260

gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc    4320

cttttgctgg ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata    4380

ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat    4440

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gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct    5340

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tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga    5460

gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc    5520

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<210>210

<211>6059

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒

<400>210

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ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt    120

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gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt    240

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gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac    4980

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gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct    5340

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gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc    5520

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gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg    5640

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<210>211

<211>6059

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒

<400>211

ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg     60

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atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac    4620

ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc    4680

cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg    4740

tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat    4800

tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc    4860

atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt    4920

gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac    4980

caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc    5040

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc    5100

gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca    5160

gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc    5220

agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga    5280

gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct    5340

attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat    5400

tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga    5460

gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc    5520

tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga    5580

gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg    5640

cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccaaagtt aatttctatg cctggaagag    5700

gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc    5760

tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct    5820

gcatgtggat aaagccgtcg agggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg    5880

agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat    5940

cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct    6000

gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat     6059

<210>212

<211>6059

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒

<400>212

ctagagtcga cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg      60

ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt     120

atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa     180

gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt     240

ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct     300

ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg     360

gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag     420

cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt     480

tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt     540

ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg     600

tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt     660

taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt     720

tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca     780

aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt     840

ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc     900

ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc     960

tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta    1020

tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag    1080

caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa    1140

ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac    1200

taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt    1260

agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa    1320

cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc    1380

tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg    1440

ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac    1500

cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc    1560

cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg    1620

gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga    1680

gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg    1740

cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg    1800

tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt    1860

cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc    1920

ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg    1980

gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga    2040

gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc    2100

gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc    2160

gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt    2220

attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt    2280

atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc    2340

gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca    2400

agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg    2460

cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat    2520

ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt    2580

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct    2640

tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc    2700

cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa    2760

agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg    2820

taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt    2880

tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg    2940

catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac    3000

ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc    3060

ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa    3120

catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc    3180

aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt    3240

aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga    3300

taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa    3360

atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa    3420

gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa    3480

tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt    3540

ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt    3600

gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg    3660

agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt    3720

aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca    3780

agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac    3840

tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac    3900

atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct    3960

taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg    4020

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca    4080

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt    4140

aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta    4200

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc    4260

gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc    4320

cttttgctgg ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata    4380

ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat    4440

ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttggcat    4500

tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat    4560

atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac    4620

ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc    4680

cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg    4740

tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat    4800

tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc    4860

atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt    4920

gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac    4980

caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc    5040

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc    5100

gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca    5160

gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc    5220

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gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct    5340

attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat    5400

tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagcgcgga    5460

gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc    5520

tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga    5580

gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg    5640

cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccgacgtt aatttctatg cctggaagag    5700

gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc    5760

tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct    5820

gcatgtggat aaagccgtcg agggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctgcg    5880

agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat    5940

cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct    6000

gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggaccat catcaccatc accattgat     6059