基于包含多糖-维生素缀合物的颗粒的药物制剂
阅读：282发布：2020-09-06
专利汇可以提供基于包含多糖-维生素缀合物的颗粒的药物制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开提供了用于药理活性 试剂 的制剂，包括基于由与维生素或相关剂(例如叶酸)连接的可 生物 降解 聚合物 (例如，多糖诸如葡聚糖)形成的颗粒的制剂。疏 水 性药物活性剂(诸如抗癌药，例如紫杉醇)被包封在多糖-维生素缀合物中用于施用紫杉醇。活性剂位于颗粒的核部分中，而不是颗粒的表面上。还公开了制造和使用所述颗粒和包含其的组合物的方法。特别地，提供了癌症诊断和 治疗 的方法。，下面是基于包含多糖-维生素缀合物的颗粒的药物制剂专利的具体信息内容。
1.颗粒，包含：
多种多糖-维生素缀合物；和
包封在所述多种多糖-维生素缀合物中的活性剂；
其中所述多种多糖-维生素缀合物中的每一种包含多糖分子和通过接头基团共价缀合至所述多糖分子的一种或多种维生素或类似物或衍生物分子；所述活性剂与维生素或其类似物或衍生物的分子非共价结合。
2.权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒的表面基本上是亲水的。
3.权利要求1所述的颗粒，其中所述活性剂在所述颗粒的核部分中。
4.权利要求1所述的颗粒，其中所述多糖分子通过接头分子与所述一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子中的每一种缀合，所述接头分子包含与所述多糖分子或官能化多糖分子上的一个或多个官能团反应的第一化学基团，以及与所述一种或多种维生素或类似物或衍生物分子中的每一种或其官能化分子上的一个或多个官能团反应的第二化学基团。
5.权利要求1所述的颗粒，其中所述多糖-维生素缀合物包含第一维生素或其类似物或衍生物和不同于所述第一维生素或其类似物或衍生物的第二维生素或其类似物或衍生物；
所述第一维生素或其类似物或衍生物以及所述第二维生素或其类似物或衍生物分别在所述多糖的不同位置与所述多糖共价连接。
6.权利要求1所述的颗粒，其中所述维生素是叶酸、胆酸、烟酰胺、Ν,Ν-二乙基烟酰胺、生物素或水杨酸钠。
7.权利要求1所述的颗粒，其中所述多糖是可溶于水和有机溶剂的多糖。
8.权利要求5所述的颗粒，其中所述多糖是葡聚糖或其衍生物、纤维素或其衍生物、羧甲基纤维素、或透明质酸或其衍生物。
9.权利要求1所述的颗粒，其中所述多糖被琥珀酰化、羧甲基化、和/或被环酐修饰。
10.权利要求1所述的颗粒，其中所述一种或多种维生素或类似物或衍生物分子是疏水的。
11.权利要求1所述的颗粒，其中所述活性剂是疏水的。
12.权利要求1所述的颗粒，其中所述活性剂是抗肿瘤剂。
13.权利要求1所述的颗粒，其中所述活性剂是紫杉烷化合物或其类似物或喜树碱化合物或其类似物。
14.权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒的平均直径在约20nm与约1000nm之间。
15.药物组合物，包含任何前述权利要求的颗粒和药学上可接受的载体或赋形剂。
16.权利要求15所述的组合物，其中所述组合物被配制成片剂、胶囊剂、粉剂或液体。
17.权利要求15所述的组合物，进一步包含合适的溶剂或药学上可接受的注射载体。
18.权利要求17所述的组合物，其被配制成溶液、乳液、悬浮液或胶体。
19.权利要求17或权利要求18所述的组合物，其通过穿过约0.2μm的平均孔径的膜来灭菌。
20.任何前述权利要求所述的颗粒或组合物，其被配置用于通过局部、肠内/胃肠、肠胃外、硬膜外、脑内、脑室内、皮内、皮下、鼻、口、静脉内、动脉内、肌内、骨内输注、玻璃体内、膀胱内、透皮或透粘膜途径而在受试者中施用。
21.治疗受试者的方法，其包括向需要其的受试者施用有效量的权利要求1-20中任一项的所述颗粒或组合物。
22.权利要求21所述的方法，其中所述活性剂是抗肿瘤剂。
23.权利要求22所述的方法，其中所述活性剂是紫杉烷化合物或其类似物或喜树碱化合物或其类似物。
24.权利要求21所述的方法，其中将所述活性剂包封在所述颗粒中基本上不改变所述受试者对给定量的所述活性剂的响应性。
25.权利要求24所述的方法，其中所述活性剂是细胞毒性剂，并且所述受试者的响应性通过所述细胞毒性剂的细胞毒性来测量。
26.权利要求21所述的方法，与施用未包封在权利要求1-14中任一项所述的颗粒中的所述活性剂相比，所述方法增加所述受试者对所述活性剂的耐受剂量。
27.权利要求21所述的方法，其中所述受试者患有癌症或肿瘤疾病或病症。
28.权利要求27所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌或乳腺癌细胞。
29.权利要求27所述的方法，其中向所述受试者施用有效量的所述颗粒或组合物减少所述受试者中赘生性细胞的生长。
30.抑制细胞生长的方法，包括将有效量的权利要求1-20中任一项所述的颗粒或组合物递送至细胞。
31.权利要求30所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
32.权利要求30所述的方法，其中所述细胞是非小细胞肺癌细胞或乳腺癌细胞。
33.减少受试者中肿瘤生长的方法，包括用有效量的辐射治疗需要其的受试者，并用有效量的权利要求1-20中任一项所述的颗粒或组合物治疗所述受试者。
34.减少受试者中肿瘤生长的方法，包括用有效量的化学治疗剂治疗需要其的受试者，并用有效量的权利要求1-20中任一项所述的颗粒或组合物治疗所述受试者。
35.减少受试者中肿瘤生长的方法，包括用有效量的生物活性治疗剂治疗需要其的受试者，并用有效量的权利要求1-20中任一项所述的颗粒或组合物治疗所述受试者。
36.前述权利要求中任一项所述的颗粒、组合物或方法，其中所述活性剂是治疗剂或诊断剂。
基于包含多糖-维生素缀合物的颗粒的药物制剂
[0001] 相关申请的交叉引用
技术领域
[0003] 本公开总体上涉及用于药理活性试剂(包括抗癌治疗剂)的化合物、药物组合物、制剂和递送系统。在一些方面，本公开涉及包含改性多糖、治疗剂和纳米载体的组合物。在一些方面，本公开涉及制备化合物、药物组合物和制剂的方法，以及使用它们的方法，例如在癌症治疗中。
[0004] 背景
[0005] 大多数临床使用的抗癌药，如紫杉醇、多西紫杉醇、多柔比星，具有差的水溶性。通常这些药物不能直接给予患者，例如肠胃外给药。例如，紫杉醇及其许多衍生物和类似物在大多数生理上可接受的水性溶剂——将与血管内给药相容——中具有极低的溶解度。因此，作为赋形剂的表面活性剂通常是促进有效化合物的体内递送所必需的。例如，(Sanofi-Aventis)是多西紫杉醇与作为赋形剂的聚山梨酯80以及乙醇和柠檬酸的制剂。紫杉醇制剂 (Bristol-Myers Squibb)使用 EL(一种聚氧乙烯化
蓖麻油)配制。该制剂含有50％(v/v)的酒精，以及88倍过量的 EL，其具有引起
严重副作用的可能性。紫杉醇制剂的急性和常见临床副作用是严重的：列出呼吸困难、低血压、血管性水肿、全身性荨麻疹和最显著的类过敏反应，具有致命结果的风险。另外，高EL浓度促进“增塑剂”即用于制造一次性输液袋和管组件的化学品渗漏进入输
注液。患者暴露于这些化学品的长期风险是未知的。因此，这些药物制剂中的赋形剂可能导致严重的副作用，如过敏、肾毒性、神经和心脏毒性，并且在某些情况下，要求预先给药苯海拉明、H2-拮抗剂、和甚至皮质类固醇。
蓖麻油)配制。该制剂含有50％(v/v)的酒精，以及88倍过量的 EL，其具有引起
严重副作用的可能性。紫杉醇制剂的急性和常见临床副作用是严重的：列出呼吸困难、低血压、血管性水肿、全身性荨麻疹和最显著的类过敏反应，具有致命结果的风险。另外，高EL浓度促进“增塑剂”即用于制造一次性输液袋和管组件的化学品渗漏进入输
注液。患者暴露于这些化学品的长期风险是未知的。因此，这些药物制剂中的赋形剂可能导致严重的副作用，如过敏、肾毒性、神经和心脏毒性，并且在某些情况下，要求预先给药苯海拉明、H2-拮抗剂、和甚至皮质类固醇。
[0006] 因此，需要抗癌药的替代药物组合物和制剂，以减轻危险的副作用并为常规剂量治疗和高剂量化疗提供更均匀的药物供应。本公开解决了该需要。
[0007] 概述
[0008] 一方面，本公开提供了颗粒，包含多种多糖-维生素缀合物；和包封在所述多种多糖-维生素缀合物中的活性剂；其中所述多种多糖-维生素缀合物中的每一种包含多糖分子和通过接头基团共价缀合至所述多糖分子的一种或多种维生素或类似物或衍生物分子；活性剂与维生素或其类似物或衍生物分子非共价结合。
[0009] 任选地，颗粒的表面基本上是亲水的。
[0010] 任选地，活性剂在颗粒的核部分中。
[0011] 任选地，多糖分子通过接头分子与一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子中的每一种缀合，所述接头分子包含与多糖分子或官能化多糖分子上的一个或多个官能团反应的第一化学基团，以及与一种或多种维生素或类似物或衍生物分子中的每一种或其官能化分子上的一个或多个官能团反应的第二化学基团。
[0012] 任选地，多糖-维生素缀合物包含第一维生素或其类似物或衍生物和不同于第一维生素或其类似物或衍生物的第二维生素或其类似物或衍生物；第一维生素或其类似物或衍生物以及第二维生素或其类似物或衍生物分别在多糖的不同位置与多糖共价连接。
[0013] 任选地，维生素是叶酸、胆酸、烟酰胺、Ν,Ν-二乙基烟酰胺、生物素或水杨酸钠。
[0014] 任选地，多糖是可溶于水和有机溶剂的多糖。
[0016] 任选地，多糖被琥珀酰化、羧甲基化和/或被环酐修饰。
[0017] 任选地，一种或多种维生素或类似物或衍生物分子是疏水的。
[0018] 任选地，活性剂是疏水的。
[0020] 任选地，活性剂是紫杉烷化合物或其类似物或喜树碱化合物或其类似物。
[0021] 任选地，颗粒的平均直径在约20nm和约1000nm之间。
[0022] 另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含本文所述的颗粒和药学上可接受的载体或赋形剂。
[0023] 任选地，组合物配制成片剂、胶囊剂、粉剂或液体。
[0024] 任选地，药物组合物还包含合适的溶剂或药学上可接受的注射载体。
[0025] 任选地，药物组合物配制成溶液、乳液、悬浮液或胶体。
[0026] 任选地，药物组合物通过穿过平均孔径为约0.2μm的膜来灭菌。
[0027] 任选地，本文所述的颗粒或组合物被配置用于通过局部、肠内/胃肠、肠胃外、硬膜外、脑内、脑室内、皮内、皮下、鼻、口、静脉内、动脉内、肌内、骨内输注、玻璃体内、膀胱内、透皮或透粘膜途径而在受试者中施用。
[0028] 另一方面，本公开提供用于治疗受试者的方法，其包括向需要其的受试者施用有效量的本文所述的颗粒或组合物。
[0029] 任选地，活性剂是抗肿瘤剂。
[0030] 任选地，活性剂是紫杉烷化合物或其类似物或喜树碱化合物或其类似物。
[0031] 任选地，将活性剂包封在颗粒中基本上不改变受试者对给定量的活性剂的响应性。
[0032] 任选地，活性剂是细胞毒性剂，并且通过细胞毒性剂的细胞毒性来测量受试者的响应性。
[0033] 任选地，与施用未被包封在颗粒中的活性剂相比，该方法增加了受试者对活性剂的耐受剂量。
[0034] 任选地，受试者患有癌症或肿瘤疾病或病症。
[0036] 任选地，向受试者施用有效量的本文所述的颗粒或组合物减少受试者中赘生性细胞的生长。
[0037] 另一方面，本发明提供了抑制细胞生长的方法，包括将有效量的本文所述的颗粒或组合物递送至细胞。
[0038] 任选地，细胞是癌细胞。
[0039] 任选地，细胞是非小细胞肺癌细胞或乳腺癌细胞。
[0041] 另一方面，本发明提供了用于减少受试者中肿瘤生长的方法，包括用有效量的化学治疗剂治疗需要其的受试者，并用有效量的本文所述的颗粒或组合物治疗受试者。
[0042] 另一方面，本发明提供了用于减少受试者中肿瘤生长的方法，包括用有效量的生物活性治疗剂治疗需要其的受试者，并用有效量的本文所述的颗粒或组合物治疗受试者。
[0043] 任选地，活性剂是治疗剂或诊断剂。
[0044] 在一个方面，本文公开的是具有壳-核结构的颗粒(例如，微粒)，其包含：包含多糖-维生素缀合物的壳，所述多糖-维生素缀合物包含与多糖共价连接的一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子；和包含包埋在壳中的活性剂的核，其中一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子位于核和多糖之间。
[0045] 在一个实施方式中，多糖通过接头分子与一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子中的每一种缀合，所述接头分子包含与多糖上的一个或多个官能团反应的第一化学基团，和与一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子中的每一种上的一个或多个官能团反应的第二化学基团。
[0046] 在一个实施方式中，多糖-维生素缀合物包含第一维生素或其类似物或衍生物以及不同于第一维生素或其类似物或衍生物的第二维生素或其类似物或衍生物；第一维生素或其类似物或衍生物以及第二维生素或其类似物或衍生物分别在多糖的不同位置与多糖共价连接。
[0047] 在一个实施方式中，一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子可以位于本公开的颗粒(例如，微粒)的壳的内表面上。在本文公开的任何实施方式中，维生素可以是叶酸、烟酰胺、Ν,Ν-二乙基烟酰胺、生物素或水杨酸钠。在另一个实施方式中，维生素可以被修饰。在本文公开的任何实施方式中，维生素可以通过胺化修饰。
[0048] 在一个实施方式中，多糖是可溶于有机溶剂的多糖。
[0049] 一方面，多糖可以是本公开的颗粒(例如，微粒)中的葡聚糖或其衍生物、纤维素或其衍生物、羧甲基纤维素、或透明质酸或其衍生物。另一方面，在本文公开的任何实施方式中，一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子可以通过接头基团共价连接至多糖。接头可以是或包含二硫键、酯键、γ-谷氨酰-ε-赖氨酸键和/或重氮键。在又一个实施方式中，多糖可以被琥珀酰化、羧甲基化和/或通过环酐修饰。
[0050] 在本文公开的任何实施方式中，优选地，活性剂是疏水的。一方面，活性剂可以是抗肿瘤剂，例如抗癌药。另一方面，活性剂可以是紫杉醇或其衍生物、多西紫杉醇或其衍生物、或多柔比星或其衍生物。又一方面，活性剂不与多糖-维生素缀合物共价连接。
[0051] 在本文公开的任何实施方式中，本公开的颗粒可以是微粒。在本文公开的任何实施方式中，本公开的颗粒可以是纳米颗粒。在某些方面，颗粒的平均直径可以在约20nm至约1000nm之间，例如20nm至100nm、100nm至200nm、100nm至400nm或400nm至1000nm。在某些方面，颗粒的平均直径可以在约20nm和约200nm之间。在某些其他方面，颗粒的平均直径可以在约20nm与约50nm之间、约50nm与约100nm之间、约100nm与约150nm之间或约150nm与约
200nm之间。
200nm之间。
[0052] 本文还公开了包含具有壳-核结构的颗粒(例如，微粒)的组合物，所述颗粒包含：包含多糖-维生素缀合物的壳，所述多糖-维生素缀合物包含与多糖共价连接的一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子；和包含包埋在壳中的活性剂的核，其中一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子位于核和多糖之间。
[0053] 在某些实施方式中，多糖通过接头分子与一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子中的每一种缀合，所述接头分子包含与多糖上的一个或多个官能团反应的第一化学基团，与一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子中的每一种上的一个或多个官能团反应的第二化学基团。
[0054] 在某些实施方式中，多糖-维生素缀合物包含第一维生素或其类似物或衍生物以及不同于第一维生素或其类似物或衍生物的第二维生素或其类似物或衍生物；第一维生素或其类似物或衍生物以及第二维生素或其类似物或衍生物分别在多糖的不同位置与多糖共价连接。
[0055] 在某些实施方式中，一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子可以位于壳的内表面上。在某些实施方式中，一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子不位于壳的外表面上。在某些其他实施方式中，维生素可以是叶酸、烟酰胺、Ν,Ν-二乙基烟酰胺、生物素或水杨酸钠。在某些方面，维生素可以是改性维生素。在本文公开的任何实施方式中，维生素可以通过胺化修饰。
[0056] 在某些实施方式中，多糖是可溶于有机溶剂中的多糖。
[0057] 在本文公开的任何实施方式中，组合物的多糖可以是葡聚糖或其衍生物、纤维素或其衍生物、羧甲基纤维素、或透明质酸或其衍生物。一方面，本文公开的组合物的一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子可以通过接头基团与多糖共价连接，所述接头基团可以包含二硫键、酯键、γ-谷氨酰基-ε-赖氨酸键、和/或重氮键。在一个实施方式中，多糖可以被琥珀酰化、羧甲基化和/或被环酐修饰。
[0058] 在本文公开的组合物的任何实施方式中，活性剂可以是疏水的。一方面，活性剂可以是抗肿瘤剂，例如抗癌药。另一方面，活性剂可以是紫杉醇或其衍生物、多西紫杉醇或其衍生物、或多柔比星或其衍生物。在又一方面，活性剂不与多糖-维生素缀合物共价连接。
[0059] 在本文公开的任何实施例中，本公开的颗粒可以是微粒。在本文公开的组合物的任何实施方式中，颗粒可以是纳米颗粒。在某些方面，颗粒的平均直径可以在约20nm至约1000nm之间，例如20nm至100nm、100nm至200nm、100nm至400nm或400nm至1000nm。在某些方面，颗粒的平均直径可以在约20nm和约200nm之间。在某些其他方面，颗粒的平均直径可以在约20nm与约50nm之间、约50nm与约100nm之间、约100nm与约150nm之间或约150nm与约
200nm之间。
200nm之间。
[0060] 在本文公开的任何实施方式中，组合物可以进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。一方面，组合物可以配制成片剂、胶囊剂、粉剂或液体。另一方面，组合物可以进一步包含合适的溶剂或药学上可接受的注射载体。在具体的实施方式中，组合物可以配制成溶液、乳液、悬浮液或胶体。在某些方面，组合物可以通过穿过平均孔径约0.2μm的膜来灭菌，或者通过其它灭菌过程来灭菌。在某些方面，颗粒(例如，微粒)或组合物可以通过过滤、辐射、加热或环氧乙烷处理或以任何合适顺序的其任何组合来灭菌。在优选的实施方式中，穿过膜和其他灭菌过程基本不会改变颗粒的粒径。在其他优选实施方式中，灭菌方法保持粒径小于约200nm。
[0062] 在本文公开的任何实施方式中，组合物可以经受冻干。一方面，颗粒(例如，微粒)的平均直径在冻干(lyphilization)期间或之后基本不变，并且在冻干过程中、冻干后或重构后颗粒不聚集。在一个实施方式中，颗粒(例如，微粒)的平均直径在冻干过程中、冻干后或重构后小于约200nm，并且颗粒在冻干过程中、冻干后或重构后不聚集。在其他优选的实施方式中，该冻干过程保持粒径小于约200nm。在本文公开的任何实施方式中，可以将组合物在容器中配制成冻干粉末或冻干饼(lyo-cake)，用于随后将组合物重新悬浮或溶解在药学上可接受的载体或赋形剂中。
[0063] 在任何前述实施方式中，本公开的颗粒(例如，微粒)或组合物可配置用于通过局部、肠内/胃肠、肠胃外、硬膜外、脑内、脑室内、皮内、皮下、鼻、口、静脉内、动脉内、肌内、骨内输注、玻璃体内、膀胱内、透皮或透粘膜途径而在受试者中施用。
[0064] 还公开了制备包含前述任一实施方式的颗粒(例如，微粒)的组合物的方法。一方面，该方法包括：提供多糖-维生素缀合物，其包含与多糖共价连接的一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子；将多糖-维生素缀合物与活性剂在合适的溶剂中组合，或将多糖-维生素缀合物溶液与活性剂溶液组合；并使多糖-维生素缀合物和活性剂的混合物经受高剪切均化器以形成包含颗粒(例如，微粒)的组合物，所述颗粒包含多糖-维生素缀合物和活性剂，其中活性剂被包埋在由多糖-维生素缀合物形成的壳中和一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子位于活性剂和多糖之间。
[0065] 在具体的方面，可以在约10,000至约30,000psi(磅/平方英寸)范围内的压力下使多糖-维生素缀合物和活性剂的混合物经受高剪切均化器。在某些实施方式中，多糖-维生素缀合物的溶液和活性剂的溶液是不互混的。在本文公开的任何实施方式中，将多糖-维生素缀合物的溶液和活性剂的溶液组合可产生乳液，例如微乳液。
[0066] 在本文公开的方法的任何实施方式中，该方法可以进一步包括通过渗滤、过滤、溶剂蒸发或离心或以任何合适的顺序其任何组合来分离颗粒(例如，微粒)。在任何前述实施方式中，该方法可以进一步包括通过加入共溶剂然后渗滤来分离颗粒(例如，微粒)。在某些方面，共溶剂可以是去离子水。在任何前述实施方式中，该方法可以进一步包括纯化步骤和/或杀菌步骤。在某些方面，纯化步骤和/或灭菌步骤可以包括用合适的溶剂洗涤颗粒，和/或通过平均孔径为0.2μm的膜过滤颗粒。在任何前述实施方式中，该方法可以进一步包括干燥步骤和/或在冷冻保护剂存在下的冻干步骤。在具体的实施方式中，冻干步骤基本上不聚集颗粒或基本上不改变颗粒的平均直径。在一个实施方式中，颗粒的平均直径小于约200nm，并且在冻干过程中、冻干后或重构后保持小于约200nm。在本文公开的任何实施方式中，冻干步骤之后的组合物可以配制成冻干饼或冻干粉末。
[0067] 本文还公开了所述方法的任何前述实施方式的产物。
[0068] 本公开还提供了用于治疗受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的任何实施方式的颗粒(例如，微粒)或组合物。一方面，包含在颗粒或组合物中的活性剂可以是抗肿瘤剂。在具体的实施方式中，活性剂可以是紫杉醇或其衍生物、多西紫杉醇或其衍生物、或多柔比星或其衍生物。在某些方面，将活性剂包埋在颗粒中基本上不会改变受试者对给定量的活性剂的响应性。在其它方面，活性剂可以是细胞毒性剂，并且可以通过细胞毒性剂的细胞毒性来测量受试者的响应性。在其他方面，与施用未包埋在本发明的颗粒中的活性剂相比，所述用于治疗受试者的方法增加了受试者对活性剂的耐受剂量。
[0069] 在本文公开的方法的任何实施方式中，受试者可具有癌症或肿瘤疾病或病症或肿瘤综合征。在具体的实施方式中，癌症可以是非小细胞肺癌或乳腺癌。在某些方面，向受试者施用有效量的颗粒(例如，微粒)或组合物可以减少受试者中赘生性细胞的生长。
[0070] 本公开还提供了用于抑制细胞生长的方法，包括向细胞递送有效量的本文公开的任何实施方式的颗粒(例如，微粒)或组合物。在一个实施方式中，细胞可以是癌细胞。一方面，细胞可以是非小细胞肺癌细胞。
[0071] 本公开另外提供用于减少受试者中肿瘤生长的方法，包括用有效量的辐射和本文公开的任何实施方式的颗粒(例如，微粒)或组合物的组合治疗受试者。还提供了用于减少受试者中肿瘤生长的方法，包括用有效量的辐射治疗需要其的受试者，并用有效量的本文公开的任何实施方式的颗粒或组合物治疗受试者。
[0072] 在某些其他方面，本文提供了用于减少受试者中肿瘤生长的方法，包括用有效量的化学治疗剂和本文公开的任何实施方式的颗粒(例如，微粒)或组合物的组合治疗受试者。还提供了用于减少受试者中肿瘤生长的方法，其包括用有效量的化学治疗剂治疗需要其的受试者，并用有效量的本文任何实施方式公开的微粒或组合物治疗受试者。
[0073] 在其他方面，公开了用于减少受试者中肿瘤生长的方法，所述方法包括用有效量的生物活性治疗剂和本文公开的任何实施方式的颗粒(例如，微粒)或组合物的组合治疗受试者。还提供了用于减少受试者中肿瘤生长的方法，包括用有效量的生物活性治疗剂治疗需要其的受试者，并用有效量的本文公开的任何实施方式的微粒或组合物治疗受试者。
[0074] 在本文公开的颗粒、组合物、过程、产品或方法的任何实施方式中，包埋在颗粒中的活性剂可以是治疗剂或诊断剂。
[0076] 根据各种公开的实施方式，以下附图仅仅是用于说明性目的的示例，并不意图限制本发明的范围。
[0077] 图1说明根据本公开的某些实施方式的制剂的制备。图1A是显示琥珀酰化的1,6葡聚糖的合成的示意图。图1B是显示琥珀酰化的1,3-葡聚糖的合成的示意图。图1C是显示氨基叶酸合成的示意图。图1D是显示连接图1B和图1C中的产物以形成葡聚糖-叶酸缀合物的反应的示意图。
[0078] 图2是说明根据本公开的一些实施方式的用于制备包含微粒的制剂的包封过程的流程图。
[0079] 图3示出了根据本公开的具体实施方式的含有冻干饼的小瓶。
[0080] 图4A说明了根据本公开的某些实施方式的制剂的基于体重减轻的体内毒性评估。
[0081] 图4B显示在异种移植模型中使用人类非小细胞肺癌细胞，根据本公开的某些实施方式的制剂的抗肿瘤活性。
[0082] 图5说明了根据本公开的某些实施方式的制剂的制备。图5A是显示琥珀酰化葡聚糖合成的示意图。图5B是显示叶酸-NH-CH2CH2-NH2的合成的示意图。图5C是显示连接图5A和图5B中的产物以形成葡聚糖-琥珀酸与叶酸-NH-CH2CH2-NH2缀合的缀合反应的示意图。
[0083] 图6是显示用乙二胺修饰胆酸的示意图。
[0084] 图7是显示葡聚糖-琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-胆酸的合成的示意图。
[0085] 图8是显示用乙二胺修饰视黄酸的示意图。
[0086] 图9是显示葡聚糖-琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-视黄酸的合成的示意图。
[0087] 图10是显示葡聚糖-叶酸-胆酸缀合物的合成的示意图。
[0088] 图11是显示用乙二胺修饰生育酚琥珀酸的示意图。
[0089] 详细描述
[0090] 以下提供要求保护的主题的一个或多个实施方式的详细描述以及说明要求保护的主题的原理的附图。结合这样的实施方式描述要求保护的主题，但不限于任何实施方式。应该理解的是，要求保护的主题可以以各种形式来体现，并且包括许多替代、修改和等同物。因此，本文公开的具体细节不应被解释为限制，而是作为权利要求的基础和作为用于教导本领域技术人员以实际上任何适当的详细系统、结构或方式来使用所要求保护的主题的代表性基础。本文提供的这些细节是为了示例的目的，并且所要求保护的主题可以根据权利要求来实施，而没有这些具体细节中的一些或全部。应该理解的是，可以使用其他实施方式并且可以进行结构改变而不脱离所要求保护的主题的范围。为了清楚起见，在与所要求保护的主题相关的技术领域中已知的技术材料未被详细描述，以便所要求保护的主题不被不必要地模糊。
[0091] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或术语学旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括这些定义不一定被解释为表示与本领域中通常理解的实质差异。
[0092] 在该申请和参考书目和附件中引用的包括专利文件、科学文章和数据库在内的所有出版物，以其全部通过引用被并入，用于所有目的，就好像每个单独的出版物单独地通过引用并入。如果本文阐述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中阐述的定义相反或以其他方式不一致，则本文阐述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
[0093] 除非另有说明，否则所提供的实施方式的实施将采用在有机化学、聚合物化学和技术(特别是多糖化学和技术)、分子生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术和描述，其在本领域中实施的那些人的技术内。这些技术包括多糖合成和/或修饰，以及颗粒、微粒(包括纳米颗粒)的制备。参考本文的实例可以得到合适技术的具体说明。但是，当然也可以使用其他等效的常规程序。这些常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，例如Starch:Chemistry and Technology,2nd Edition,Ed.Whistler,BeMiller,and Paschall,Academic Press,1984，和Methods in Carbohydrate Chemistry,Vol.IV,Ed.Whistler,Academic Press,1964，两者的全部内容在此通过引用被并入用于所有目的。美国专利号5,
977,348、美国专利申请号20130149385和美国专利号6,689,338也公开了多糖合成和/或修饰的方法或颗粒(例如，微粒)制备。所有这三份专利公开都在此以其全部通过引用被并入用于所有目的。
977,348、美国专利申请号20130149385和美国专利号6,689,338也公开了多糖合成和/或修饰的方法或颗粒(例如，微粒)制备。所有这三份专利公开都在此以其全部通过引用被并入用于所有目的。
[0094] 如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。例如，“一(a)”或“一(an)”意思是“至少一个”或“一个或多个”。因此，提及“一种糖”可以指一种或多种类型的糖，并且提及“所述方法”包括提及对本文中公开的和/或本领域技术人员已知的等效步骤和方法等等。
[0095] 贯穿本公开，要求保护的主题的各个方面以范围格式呈现。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对所要求保护的主题的范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，在提供一定范围的值的情况下，应该理解的是，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该陈述范围中的任何其他规定值或中间值都包含在要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在要求保护的主题内，服从所述范围中的任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些所包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在所要求保护的主题中。无论范围的宽度如何，这都适用。
[0097] 如本文所用，“个体”可以是任何活的生物体，包括人类和其他哺乳动物。如本文所用，“受试者”可以是可以施用或应用所提供的组合物、方法、试剂盒、装置和系统的生物体。在一个实施方式中，受试者可以是哺乳动物或细胞、组织、器官或哺乳动物的一部分。哺乳动物包括但不限于人类和非人类动物，包括农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。在本公开的某些方面，可以获得并使用生物样品或材料，并且可以指从活体或病毒来源或其他来源的大分子和生物分子获得的任何样品或材料，并且包括可以从其获得核酸或蛋白质或其他大分子的受试者的任何细胞类型或组织。生物样品可以是直接从生物来源或被处理的样品获得的样品。例如，扩增的分离的核酸构成生物样品。生物样品包括但不限于体液，如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿和汗，来自动物和植物的组织和器官样品以及来源于其的处理的样品。
[0098] 如本文所用，“组合物”可以是两种或更多种产品或化合物的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性的或其任何组合。
[0099] 术语“水溶性差”或“疏水的”可以指在环境温度和压力下以及在约pH 7下小于约30mg/ml、小于约10mg/mL或小于约1mg/mL的水溶解度。例如，这可以对应于维生素、多糖-维生素缀合物和/治疗剂，其通过常用术语“略溶的”、“微溶性”、“非常微溶的”、“几乎不溶的”以及“不可溶的”来表征，所有这些在本文中可互换使用。
[0100] 如本文所用，“生物活性”可包括化合物或组合物的体内活性或在体内施用化合物、组合物或其他混合物时产生的生理反应。因此，生物活性可以包括这样的化合物、组合物和混合物的治疗效果和药物活性。生物活性可在设计以测试或使用此类活性的体外系统中观察到。
[0101] 术语“结合”可以指两个分子之间有吸引力的相互作用，这导致其中分子彼此非常接近的稳定缔合。分子结合可以分为以下类型：非共价的、可逆共价的和不可逆共价的。可以参与分子结合的分子包括蛋白质、核酸、碳水化合物、脂类和小有机分子如药物化合物。与其他分子形成稳定复合物的蛋白质通常称为受体，而其结合伴侣称为配体。
[0102] 如本文所用，维生素或维生素部分可以指维生素和相关的剂、其衍生物及其类似物，所有这些都具有或基本保留维生素的所需功能或活性，这取决于上下文。类似地，多糖或多糖部分可以指多糖、其衍生物、其类似物以及其他具有或基本保留多糖的所需功能或活性的相关剂，这取决于上下文。
[0103] 如本文所用，术语“接头分子”是指具有与多糖上的一个或多个官能团反应的第一化学基团和与维生素或其类似物或衍生物上的一个或多个官能团反应的第二化学基团的分子。任选地，接头分子还包含第一化学基团和第二化学基团之间的至少一个原子。任选地，接头分子还包含第一化学基团和第二化学基团之间的间隔基。
[0104] 化学疗法一直是控制和治疗癌症的主要方法之一。在常规癌症化学疗法的许多情况下，通常需要以指数方式增加施用的细胞毒性剂的量以获得癌细胞杀伤的线性增加。旁观者、健康细胞的非特异性细胞毒性的不良增加常常加剧患者的整体状况。在许多情况下，通常需要重复输送较小剂量的细胞毒素，这不可避免地导致一小部分耐药细胞的存活。另外，细胞毒性药物对癌细胞以外的细胞的非选择性作用仍然是一个主要问题。
[0105] 包封活性剂的颗粒
[0106] 一方面，本公开提供了包含多种多糖-维生素缀合物和包封在多种多糖-维生素缀合物中的活性剂的颗粒。在一些实施方式中，多种多糖-维生素缀合物中的每一种包括多糖分子以及通过接头基团共价缀合至多糖分子的一个或多个维生素或类似物或衍生物分子。活性剂与维生素或其类似物或衍生物分子非共价结合。
[0107] 在一些实施方式中，颗粒的表面基本上是亲水的。例如，颗粒可以包括具有基本上亲水的多糖分子的表面，而活性剂被包封在颗粒内部，即，活性剂不暴露在颗粒的表面上，但被掩埋在表面之下。在一些实例中，多糖-维生素缀合物自组装成颗粒，其中活性剂在自组装过程中与缀合物非共价结合。在一些缀合物中，多糖部分是亲水的，维生素部分是疏水的，并且多糖-维生素缀合物是两亲分子，其自组装成颗粒。自组装过程使水-缀合物界面自由能最小化，其中基本上亲水的表面作为颗粒的核部分和外部含水环境如体液之间的稳定界面。在基本上亲水的表面之下，缀合物分子例如通过缀合物的疏水部分之间的疏水相互作用组装在一起。任选地，颗粒核部分中的缀合物分子以无规方式排列，即缺乏任何确定的结构特征如双层结构。因此，活性剂可以随机地包封在颗粒的整个核部分。例如，在本公开的一些颗粒中，活性剂不一定在颗粒的内核内部隔离。因此，在本公开中对核-壳结构的提及通常是指具有基本上亲水的表面和以任何方式将活性剂包封于其中的核部分的颗粒结构。发现本颗粒具有活性剂的令人惊讶的大的负载能力(例如上至约30％w/w或更多的负载能力)。在一些颗粒中，颗粒的核部分具有基本上均匀的结构，即活性剂、疏水部分和亲水部分没有明显隔离成分开的或不同的子部分。结果，在本颗粒中可以实现出色的负载能力。
[0108] 颗粒可以制成各种适当的尺寸。在一些实施方式中，颗粒具有在20nm至1000nm，例如20nm至100nm、100nm至200nm、100nm至400nm或400nm至1000nm范围内的平均直径。任选地，颗粒是微粒。任选地，颗粒是纳米颗粒。
[0109] 在一些实施方式中，颗粒具有约10％w/w至约30％w/w负载能力的负载能力，例如约15％w/w至约30％、约20％w/w至约30％w/w、或约25％w/w至约30％w/w的负载能力。
[0110] 任选地，活性剂是疏水性药物。任选地，疏水性活性剂与缀合物分子的疏水部分(例如维生素部分)非共价缔合。在一些颗粒中，疏水部分和任何相关的活性剂在整个颗粒中是随机或基本均匀分布的。
[0111] 在某些方面，可以单独或与其他策略——例如使用本文公开的颗粒(例如，微粒)或组合物的那些——组合使用靶向剂如针对“肿瘤特异性抗原”的单克隆抗体，以便增加递送给癌细胞的细胞毒性剂的剂量。然而，在许多情况下，当单独使用时，针对“肿瘤特异性抗原”的单克隆抗体仍可能不能递送足够的与抗体偶联的细胞毒性剂以有效杀死癌细胞。
[0112] 2005年，FDA批准了用于晚期转移性乳腺癌的人白蛋白结合的紫杉醇制剂该制剂增加紫杉醇的临床剂量，与先前的制剂相比减少副作用，并提高患者
的存活率。表1中总结了市场上的紫杉醇制剂和相关的临床试验。在一些方面，可以使用可生物降解的聚合物来降低例如来自捐献血液的病毒引起的人白蛋白的污染的风险。
的存活率。表1中总结了市场上的紫杉醇制剂和相关的临床试验。在一些方面，可以使用可生物降解的聚合物来降低例如来自捐献血液的病毒引起的人白蛋白的污染的风险。
[0113] 表1：市场上的紫杉烷制剂和临床试验的总结。
[0114]
[0115] 表1中的制剂都没有使用多糖作为递送紫杉烷的载体。在美国专利申请公开号2007/0213393中，透明质酸用作多糖水凝胶以包埋分散在由脂质或PLGA配制的微乳液(microemulation)中的紫杉醇。聚合的紫杉醇颗粒(例如纳米颗粒)可以通过本领域已知的方法制备，如Fessi et al,Int.J.Pharm.1989所描述的界面沉积法，并特别用于Fonseca et al.,J.Control.Rel.2002的紫杉醇-PLGA纳米颗粒的制备。
[0116] 在日本专利申请JP2010126533A中，葡聚糖与紫杉醇化学连接以增加紫杉醇的溶解度。叶酸(FA)被物理吸附在缀合物的表面上以增加抗癌疗法的目标效果。然而，实验已经表明，化学缀合的紫杉醇直到从骨架释放才是活性的。而且，在药物修饰反应过程中，外消旋化难以避免。另一个缺点是靶向配体叶酸易于洗脱，因为物理吸收不强以保留配体。
[0117] 一方面，本文公开的是以颗粒形式的用于紫杉醇递送的基于多糖-维生素缀合物的制剂。在一个实施方式中，将葡聚糖与叶酸缀合，并将葡聚糖-叶酸缀合物和紫杉醇分子组装成颗粒。疏水性药物紫杉醇包封在颗粒的核部分中。在某些方面，可以修饰维生素(例如叶酸)以增加疏水性，以便更好地包封药物并稳定形成的颗粒。在某些方面，形成的颗粒中的大部分叶酸部分位于颗粒内部，而不是位于颗粒的外表面上。在其他方面，形成的颗粒中的所有叶酸部分都位于颗粒内部。在其他方面，形成的颗粒中的叶酸部分都不位于颗粒的外表面上。在一些实施方式中，活性剂不暴露在颗粒的表面上，但被掩埋在表面之下。在一些实施方式中，活性剂随机包封在颗粒的整个核部分，例如，活性剂不会在颗粒的内核内隔离。
[0118] 一方面，本文公开的是以核-壳颗粒形式的用于紫杉醇递送的基于多糖-维生素缀合物的制剂。在一个实施方式中，葡聚糖与叶酸缀合，葡聚糖-叶酸缀合物形成颗粒的壳/表面。疏水性药物紫杉醇被包埋在颗粒中。在某些方面，维生素(例如叶酸)和/或多糖可以被修饰以增加疏水性，以便更好地包埋药物并稳定形成的纳米颗粒。在某些方面，形成的核-壳纳米颗粒中的大部分叶酸部分位于纳米颗粒内部，药物和葡聚糖部分之间，而不是纳米颗粒的外表面上。在其他方面，形成的核-壳纳米颗粒中的所有叶酸部分都位于纳米颗粒内部，药物和葡聚糖部分之间。
[0119] 在某些方面，本文公开的颗粒(例如，微粒)和组合物的制备不涉及药物的化学修饰，包括将导致外消旋化的化学反应。在优选的实施方式中，可以避免制剂的复杂纯化程序。在优选的实施方式中，制造成本可以显著降低，因为在配制过程中不涉及生物材料如人蛋白质。
[0120] 在某些实施方式中，除了包封治疗剂的颗粒之外，本公开的组合物还可以包含以下中的至少一种：共溶剂溶液、脂质体、胶束、液晶、纳米晶体、乳液、微球体、纳米球、纳米胶囊、聚合物或聚合物载体、表面活性剂、悬浮剂、络合剂如环糊精或吸附分子如白蛋白(例如BSA)、表面活性颗粒和螯合剂。
[0121] 1.维生素和相关的剂
[0122] 在本公开的某些方面中，可以将用于细胞生长必需的分子例如维生素和相关的剂用于制备颗粒(例如，微粒)和组合物。可以包括在本公开的颗粒(例如，微粒)和组合物中的维生素和相关的剂的列表可以在已建立的参考指南中找到，如United States Pharmacopeia National Formulary Official Compendium of Standards(即the U.S.P.-N.F.Official Compendium of Standards)或European Directive 90/496/EEC(包括修正案)，其通过引用并入本文。
[0123] 可以包括在本公开的颗粒(例如，微粒)和组合物中的维生素和相关实体，例如维生素类似物、维生素衍生物和改性维生素包括但不限于维生素A(和维生素A前体)、硫胺素(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、吡多辛(维生素B6)、叶酸、钴胺素(维生素B12)、泛酸(维生素B5)、维生素C、维生素D、维生素E、生物素、维生素K、其他B复合维生素、B复合相关化合物如胆碱和肌醇、以及类胡萝卜素如叶黄素、番茄红素、玉米黄质和虾青素。
[0124] 应该理解，维生素的衍生物和类似物在本公开的范围内。本文考虑的类似物包括但不限于对维生素分子的环结构、官能团或侧链的修饰，包括来自任何来源——如化学合成或通过筛选过程如天然产物筛选——的保护基团和盐及其复合物的附加去除，前提是类似物对维生素受体具有一些结合活性。本领域技术人员将会理解，除肿瘤或癌细胞上的维生素受体以外的上调受体都可以被靶向。
[0125] 叶酸(也称为叶酸(folate)、维生素M、维生素B9、维生素Bc(或叶酸(folacin))、蝶酰基-L-谷氨酸、蝶酰基-L-谷氨酸(glutamate)和蝶酰基单谷氨酸)是水溶性维生素B9的形式。叶酸由与对氨基苯甲酸连接的芳香族蝶啶环和一个或多个谷氨酸残基组成。叶酸本身不具有生物活性，但其生物学重要性归因于在其转化为肝中的二氢叶酸之后的四氢叶酸和其他衍生物。叶酸对许多身体功能是必不可少的。人类不能从头合成叶酸；因此，叶酸必须通过饮食供给以满足他们的日常需求。人体需要叶酸来合成DNA，修复DNA和甲基化DNA，以及作为某些生物反应的辅因子。这对帮助快速细胞分裂和生长尤其重要，如婴儿期和怀孕期。儿童和成人都需要叶酸来产生健康的红血球和预防贫血。
[0126] 叶酸通过称为还原叶酸载体的载体蛋白或通过由叶酸受体促进的受体介导的内吞作用进入细胞。有两种叶酸受体FR-α和FR-β。叶酸受体FR-α是以高亲和力(<1nM)结合叶酸的38KD GPI-锚定蛋白。在受体结合之后，快速内吞将维生素递送到细胞中，在低pH下它在内体隔室中被卸载。重要的是，小分子、蛋白质和甚至脂质体与叶酸的共价缀合不会阻断维生素与叶酸受体结合的能力，因此，叶酸-药物缀合物可以容易地递送至细胞并通过受体介导的内吞作用可进入细胞。
[0127] 由于大多数细胞使用不相关的还原叶酸载体来获得必需的叶酸，所以叶酸受体的表达局限于少数细胞类型。除肾脏、脉络丛和胎盘以外，正常组织表达低或不可检测到的叶酸受体水平。据报道FR-β(叶酸受体的非上皮同种型)在激活的(但不是静止的)滑膜巨噬细胞上表达。因此，叶酸受体在巨噬细胞亚群(即活化的巨噬细胞)上表达。在激活的单核细胞上也发现FRβ。因此，本公开还涉及使用本文公开的微粒或组合物，如基于多糖-叶酸缀合物的微粒，用于治疗炎症或具有炎症成分的疾病和病症。
[0128] 叶酸受体在包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌和髓系造血细胞癌的大部分人癌细胞中显著过度表达。通常FR-α在上皮来源的恶性组织如卵巢癌中上调，而FR-β在非上皮来源的恶性组织中过度表达。虽然FR在参与保持和摄取维生素的正常组织中被检测到，但是这些组织处于受保护的位置，并且在血源性递送叶酸缀合物后通常不可接近。在脉络丛、肠刷状缘顶膜面和肾的近端小管中有表达。在后一种情况下，受体可能起到清除排泄的叶酸的作用，并且因此不能接近大分子量叶酸复合物。
[0129] 在本公开的某些方面，基于多糖-维生素缀合物的颗粒和组合物(例如基于叶酸的治疗制剂)可用于递送低分子量化学治疗剂、治疗性抗体、蛋白质毒素、放射成像剂、放射治疗剂、MRI造影剂、具有包埋药物的脂质体、基因、反义寡核苷酸、核酶和免疫治疗剂。具体地，基于多糖-维生素缀合物(包括葡聚糖-叶酸缀合物)的颗粒可用于将上述治疗剂或诊断剂递送至细胞，例如癌细胞。在优选的实施方式中，基于多糖-维生素缀合物的颗粒具有基本上亲水的表面，并且活性剂(例如治疗剂或诊断剂)被包封在颗粒的核部分中。在一些实施方式中，活性剂不暴露在颗粒表面上，但被掩埋在表面之下。在一些实施方式中，活性剂随机包封在颗粒的整个核部分，例如，活性剂不会在颗粒的内核内部隔离。
[0130] 在本公开的某些方面，基于多糖-维生素缀合物的颗粒(例如，微粒)和组合物(例如基于叶酸的治疗制剂)可以用于递送低分子量化学治疗剂、治疗性抗体、蛋白质毒素、放射成像剂、放射治疗剂、MRI造影剂、具有包埋药物的脂质体、基因、反义寡核苷酸、核酶和免疫治疗剂。具体地，基于多糖-维生素缀合物(包括葡聚糖-叶酸缀合物)的颗粒(例如，微粒)可用于将上述治疗剂或诊断剂递送至细胞，例如癌细胞。在优选的实施方式中，基于多糖-维生素缀合物的颗粒(例如，微粒)具有壳核结构，并且壳包含多糖-维生素缀合物，核包含包埋在壳中的上面列出的治疗剂或诊断剂。在某些方面，多糖-维生素缀合物包含与多糖共价连接的维生素或其衍生物的分子，并且维生素或其衍生物的分子位于核和多糖之间。
[0131] 在本文公开的任何实施方式中，维生素可以是叶酸、烟酰胺、Ν,Ν-二乙基烟酰胺、生物素、水杨酸钠或其任何组合。例如，多糖-叶酸缀合物和多糖-烟酰胺缀合物可以被混合以形成本公开的颗粒。在某些实施方式中，一种或多种疏水或脂溶性维生素和/或相关的剂可用于颗粒(例如，微粒)中。
[0132] 根据本公开，维生素也可以被修饰。例如，叶酸可以通过胺化，例如通过图1C所示的反应而被修饰。在某些方面，可以修饰维生素和多糖以增加疏水性，以便更好地包埋药物并稳定形成的颗粒(例如纳米颗粒)。
[0133] 2.包括多糖的聚合物
[0134] 在某些实施方式中，本公开的多糖可以包含透明质酸及其衍生物。在优选的实施方式中，本公开的多糖可以包含葡聚糖及其衍生物。在某些实施方式中，多糖可以是环糊精或环状低聚糖。
[0135] 在其他实施方式中，本公开的多糖可包含纤维素及其衍生物(例如，甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙酸琥珀酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)、壳聚糖及其衍生物、β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)、角叉菜胶、果胶、糖原、岩藻多糖、软骨素、戊聚糖、角质素、藻酸盐或环糊精、或其盐和衍生物，包括其酯和硫酸盐。可将本文公开的两种或更多种多糖的组合混合以形成与一种或多种类型的维生素或相关的剂的缀合物以形成本公开的颗粒(例如，微粒)。另外，也考虑将本文公开的两种或更多种多糖的单体之间形成的共聚物用于制备本公开的颗粒(例如，微粒)和组合物。
[0136] 在一些实施方式中，本公开的多糖是溶于有机溶剂的多糖。通过使多糖溶于有机溶剂中，可以有效地进行与维生素的缀合反应。合适的有机溶剂的例子包括二甲基亚砜、Ν,Ν-二甲基甲酰胺、四氢呋喃(THF)、二 烷、草酸等。任选地，多糖是仅具有碳、氧和氢原子的多糖。任选地，多糖是葡聚糖或其衍生物。
[0137] 在某些方面，大分子量聚合物复合物可以用于缀合维生素或相关的剂以形成聚合物-维生素缀合物，用于本公开的颗粒(例如，微粒)和/或组合物中。例如，多糖-维生素缀合物可以形成包埋待递送的剂或活性物质的颗粒。在优选的实施方式中，基于多糖-维生素缀合物的颗粒具有基本上亲水的表面，并且活性剂(例如治疗剂或诊断剂)被包封在颗粒的核部分中。在一些实施方式中，活性剂不暴露在颗粒表面上，但被掩埋在表面之下。在一些实施方式中，活性剂随机地包封在颗粒的整个核部分中，例如，活性剂不会在颗粒的内核内部隔离。任选地，多糖-维生素缀合物可以形成微粒的壳，包埋待递送的剂或活性物质。在一些实施方式中，与许多维生素分子连接的生物相容性聚合物主链形成壳，药物形成核但不共价连接至聚合物主链或维生素部分。这样的排列可以提高药物递送的效率并保持药物的生物活性。
[0138] 在某些其他方面，颗粒(例如，微粒)可以包含除多糖之外的聚合物。例如，PCT/AU00/00406公开了一种叶酸-聚合物复合物及其用途，并且美国专利号5,449,720公开了一种VB12-聚合物复合物及其用途，这两篇说明书以其全部通过引入并入本文。在PCT/AU00/00405和EP 0,531,497B1中也公开了维生素包被的颗粒(例如纳米颗粒)，这两篇说明书以其全部通过引入并入本文。适用于形成颗粒(例如微粒和纳米颗粒)的聚合物包括聚乳酸、聚(丙交酯/共-乙交酯)、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚(羟基丁酸酯/戊酸酯)、乙基纤维素、葡聚糖、多糖、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(e-己内酯)及其各种组合和共聚物等等。在某些方面，颗粒(例如纳米颗粒)由具有缀合维生素部分的聚合物通过溶剂蒸发或液体内干燥形成。
[0139] 在某些其他方面，颗粒(例如，微粒)或微球可以由具有缀合维生素部分的聚合物通过界面沉淀/聚合而形成。在某些方面，聚合物包括通过赖氨酸盐酸盐和对苯二甲酰二氯化物的反应，或通过丙烯酰化麦芽糖糊精或丙烯酰化羟乙基淀粉与过氧二硫酸铵和Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基乙二胺的反应形成的聚合物等等。适用于通过聚合物相分离形成颗粒(例如，微粒)或微球体的聚合物包括共聚(氯乙烯：乙烯醇：乙酸乙烯酯)、纤维素聚合物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚氯乙烯、天然和合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯等。合成这种颗粒(例如，微粒)或微球体的方法在美国专利号4,166,800中有充分的描述，为了所有目的将其公开内容通过引用并入。适用于形成颗粒(例如，微粒)或微球体的其它聚合物包括聚阴离子如阿拉伯树胶、藻酸盐、羧甲基纤维素、羧甲基淀粉、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚-d-葡糖醛酸、聚丙酮酸、角叉菜胶、硫酸肝素、聚磷酸盐与聚阳离子如聚赖氨酸、明胶、交联明胶、淀粉、交联白蛋白、聚丙烯酰胺的混合物，以及颗粒(例如，微粒)和/或微球体制备领域技术人员已知的其它物质等等。不受任何理论束缚，包含聚氨基酸如聚(L-谷氨酸)的均聚物的多肽、多肽、蛋白质、肽、聚氨基酸的共聚物、胶原蛋白、白蛋白、纤维蛋白或明胶也可以包括在颗粒(例如，微粒)中，例如作为组分。根据本公开可用的聚合物包括潜在的可生物降解的聚合物如葡聚糖及其衍生物，以及氨基酸聚合物如聚赖氨酸和聚谷氨酸。在某些实施方式中，使用聚合物(例如多糖)与叶酸和治疗剂组合的优点是由于聚合物的尺寸而可以避免或减少靶向肾。
[0140] 在一个实施方式中，将维生素或相关分子连接至聚合物的键可包含二硫键、酯键、γ-谷氨酰基-ε-赖氨酸键和/或重氮键。在优选的实施方式中，待递送至颗粒(例如，微粒)中的癌细胞的治疗剂本身不共价结合或缀合至聚合物。尽管如此，聚合物如多糖可以共价或非共价连接至各种酶、药物和细胞毒性剂以控制肿瘤细胞生长，例如通过组合疗法。
[0141] 3.活性剂
[0142] 在优选的实施方式中，本公开的颗粒(例如，微粒)将治疗剂和/或诊断剂或其它活性物质包埋和/或递送至需要其的受试者。剂或活性物质可以包括激素、药物、前药、酶、蛋白质、肽、毒素、免疫原、DNA和类似物以及RNA和类似物。例如，用于本公开的合适的剂包括但不限于蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、modecin、破伤风毒素、真菌毒素、蜂毒素、α-鹅膏蕈碱、商陆抗病毒蛋白、核糖体抑制蛋白，尤其是小麦、大麦、玉米、黑麦、白树毒素、美登木素的那些。
[0143] 治疗剂或活性物质还可以包括细胞毒剂，例如烷化剂(例如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、环丙烷)、蒽环类抗肿瘤抗生素(例如多柔比星、道诺霉素、阿霉素、丝裂霉素C、2-(羟甲基)蒽醌)、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、二氯甲氨蝶呤(dichloromethatrexate))、顺铂、卡铂和含有铂、铜、钒、铁、钴、金、镉、锌和镍的金属肽。其他的剂包括脱氧萎镰菌醇、胸苷、五甲基三聚氰胺(pentamethylmelamin)、环氧乳醇、5-甲基-THF、蛇形毒素
(anguidine)、美坦辛、新制癌菌素、氯脲菌素、AZQ、2'-脱氧柯福霉素、PALA、戊柔比星、m-AMSA和米索硝唑。
(anguidine)、美坦辛、新制癌菌素、氯脲菌素、AZQ、2'-脱氧柯福霉素、PALA、戊柔比星、m-AMSA和米索硝唑。
[0144] 在优选的实施方式中，治疗剂可以是疏水性药物，即水不溶性药物或水溶性差的药物。术语“疏水性药物”可以指一种药物，通常治疗药物，其表现出以下特性：通过亲脂性部分(例如脂蛋白)的吸收，或在极性介质中的降低的溶解性。疏水性药物可以包括但不限于糖皮质激素、细胞抑制剂、某些抗体、作用于亲免疫因子的药物、干扰素、阿片制剂、INF结合蛋白、霉酚酸酯、FTY720、环孢菌素(包括环孢菌素A、环孢菌素B、环孢菌素C、环孢菌素D、环孢菌素E、环孢菌素F、环孢菌素G、环孢菌素H、环孢菌素I)、他克莫司(FK506、)、西罗莫司(雷帕霉素、 )、依维莫司(RAD、 )、紫杉烷类如紫杉醇、盘皮海绵内酯(discodermolide)、秋水仙碱、长春花生物碱如长春碱或长春新碱、以及任何所列的剂的类似物或衍生物。
[0145] 在优选的实施方式中，水溶性差的药物是紫杉烷化合物或其类似物。紫杉烷化合物的实例包括紫杉醇、多西紫杉醇、7-表紫杉醇、t-乙酰紫杉醇、10-脱乙酰紫杉醇、10-脱乙酰-7-表紫杉醇、7-木糖基紫杉醇(xylosylpaclitaxel)、10-脱乙酰-7-戊二酰紫杉醇、7-Ν,Ν二甲基甘氨酰紫杉醇、7-L-丙氨酰紫杉醇、卡巴他赛或其混合物。
[0146] 在优选的实施方式中，水溶性差的药物是喜树碱化合物。喜树碱化合物的实例包括伊立替康(CAMPTOSAR；7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羰基氧喜树碱)、托泊替康(HYCAMPTIN；(S)-9-N；N-二甲基氨基乙基-10-羟基喜树碱)、9-氨基喜树碱(9-氨基-20(S)-喜树碱)、9-硝基喜树碱(也称为卢比替康)、勒托替康(7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10,11-乙二氧基-20(S)-喜树碱)、依沙替康、karenitecin和高喜树碱(homocamptothecin)。一些喜树碱化合物的结构和临床信息可以在Garcia-Carbonero,et al.,Clin.Cancer Res.(March 2002)8:641-661中找到。喜树碱化合物的实例也可在美国专利号4,604,463、6,403,569和
5,004,758中，以及在WO2004/012661、WO2003/101998、WO2003/101996、WO2003/101406、WO2003/093274、WO2003/086471、WO01/76597、WO01/64194、WO00/70275、WO00/53607、WO99/
17805、WO99/17804、WO99/05103、WO98/35969、WO97/28164、WO97/25332、WO97/16454中找到，其全部内容以其全部通过引用并入本文。
5,004,758中，以及在WO2004/012661、WO2003/101998、WO2003/101996、WO2003/101406、WO2003/093274、WO2003/086471、WO01/76597、WO01/64194、WO00/70275、WO00/53607、WO99/
17805、WO99/17804、WO99/05103、WO98/35969、WO97/28164、WO97/25332、WO97/16454中找到，其全部内容以其全部通过引用并入本文。
[0147] 在优选的实施方式中，治疗剂是紫杉醇，即通过结合微管蛋白而破坏有丝分裂(M期)以形成异常有丝分裂纺锤体的化合物，或其类似物或衍生物。紫杉醇是高度衍生的二萜类化合物(Wani et al.,J.Am.Chem.Soc.93:2325,1971)。“紫杉醇”(其在本文中应理解为包括制剂、前药、差向异构体、异构体、类似物和衍生物如例如 多西紫杉醇、紫杉醇的10-脱乙酰基类似物等)可利用本领域技术人员已知的技术(例如，Schiff et al.,Nature 277:665-667,1979；Long and Fairchild,Cancer Research 54:
4355-4361,1994；Ringel and Horwitz,JNat'l Cancer Inst.83(4):288-291,1991；
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94/07880；WO 94/07876；WO 93/23555；WO 93/10076；WO94/00156；WO 93/24476；EP
590267；WO 94/20089；美国专利号5,294,637；5,283,253；5,279,949；5,274,137；5,202,
448；5,200,534；5,229,529；5,254,580；5,412,092；5,395,850；5,380,751；5,350,866；4,
857,653；5,272,171；5,411,984；5,248,796；5,248,796；5,422,364；5,300,638；5,294,
637；5,362,831；5,440,056；4,814,470；5,278,324；5,352,805；5,411,984；5,059,699；4,
942,184；Tetrahedron Letters 35(52):9709-9712,1994；J.Med.Chem.35:4230-4237,
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J.Natural Prod.57(11):1580-1583,1994；J.Am.Chem.Soc.110:6558-6560,1988)——其全部内容以其全部通过引用并入本文——而容易地制备；或从各种商业来源获得，包括例如Sigma,St.Louis,MO。
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[0148] 4.多糖-维生素-活性剂组合
[0149] 在某些实施方式中，不同的维生素可以缀合至相同类型的多糖，或者相同的维生素可以缀合至不同类型的多糖。在其他实施方式中，具有维生素和多糖部分的不同组合的缀合物可以混合并用于制备颗粒(例如，微粒)。在某些实施方式中，含有不同维生素部分的缀合物与相同的治疗剂联合使用。施用如此产生的颗粒(例如，微粒)或组合物可导致靶向癌细胞的颗粒(例如，微粒)，其表现出维生素受体的上调的表达和/或活性，而同时不希望的颗粒(例如，微粒)堆积散布在不同的器官和组织上，这些器官和组织也碰巧被特定的维生素靶向。在这种情况下，可以增强治疗剂向靶细胞的递送而不增加治疗剂对身体其他部位的毒性。在另一个实施方式中，含有相同维生素部分的缀合物可以与不同的治疗剂联合使用，因此能够进行组合疗法。例如，不同的剂可以靶向相同的癌细胞群以增强和/或协同杀伤。
[0150] 在优选的实施方式中，特定的多糖-维生素-治疗剂组合可以基于待使用本公开的颗粒(例如，微粒)或组合物治疗的癌症的组织来源和/或基因表达谱而确定。可受益于本公开的癌症的类型包括但不限于慢性白血病、乳腺癌、肉瘤、卵巢癌、直肠癌、喉癌、黑素瘤、结肠癌、膀胱癌、肺癌、乳腺腺癌、胃肠癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或卡波西肉瘤。本文没有阐述的但本领域技术人员熟知的其他癌症也被认为是在本公开的范围内设想的。当选择多糖-维生素-治疗剂组合时，也可以考虑关于受试者对某些疗法的响应性的信息。
[0151] 5.接头分子和接头基团
[0152] 在一些实施方式中，多糖通过接头分子缀合至一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子中的每一种，所述接头分子包含与多糖上的一个或多个官能团反应的第一化学基团，和与一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子中的每一种上的一个或多个官能团反应的第二化学基团。在本公开中发现，与通过无接头分子直接缀合的多糖-维生素缀合物递送的药物的功效相比，多糖-维生素缀合物递送的药物的功效通过具有接头分子而大大增强。如本文所用，官能团可以指分子(例如，多糖、维生素或其类似物或衍生物)的固有官能团，或作为官能化的结果通过键合至分子而添加的官能团。例如，可以使用琥珀酸对多糖进行官能化以获得羧酸官能团，其能够与具有胺化学基团的接头分子反应以形成酰胺键。
[0153] 任选地，接头分子包括第一化学基团和第二化学基团，其间没有间隔基。任选地，接头分子包括第一化学基团、第二化学基团和第一化学基团与第二化学基团之间的间隔基。
[0154] 在一些实施方式中，接头分子包括第一化学基团、第二化学基团和第一化学基团与第二化学基团之间的间隔基。可选地，间隔基包括1至50个原子。任选地，间隔基包含1至50个碳原子，例如1至15个碳原子、1至20个碳原子、20至35个碳原子或35至50个碳原子。
[0155] 在一些实施方式中，接头分子是具有两个官能团的有机分子。具有两个官能团的有机分子的实例包括但不限于二胺、二羧酸等。任选地，具有两个官能团的有机分子具有带有2至20个碳原子，例如2至6个碳原子、6至10个碳原子或10至20个碳原子的直链。
[0156] 二胺接头分子的例子包括但不限于亚甲基二胺、乙二胺、1,2-二氨基丙烷、1,3-丙二胺、N-甲基-1,3-二氨基丙烷、Ν,Ν'-二甲基-1,3-丙二胺、2,2-二甲基-1,3-丙二胺、丙二胺、1,3-二氨基-2-丙醇、1,4-二氨基丁烷、1,5-二氨基戊烷、1,6-二氨基己烷、1,7-二氨基庚烷和1,8-二氨基辛烷。二羧酸接头分子的实例包括但不限于乙二酸、丙二酸、丁二酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、1,11-十一烷二羧酸、1,12-十二烷二羧酸和十六烷二酸。
[0157] 在一些实施方式中，接头分子是具有在聚合物链的第一末端处或附近的第一化学基团，以及在聚合物链的第二末端处或附近的第二化学基团的聚合物；第一末端在第二个末端的对侧。适用于制备接头分子的聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇、聚氨基酸、聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)等。
[0158] 在一些实施方式中，多糖可以在与接头分子反应之前被官能化。任选地，多糖用琥珀酸官能化。在一些实施方式中，维生素或其类似物或衍生物可以在与接头分子反应之前被官能化。
[0159] 因此，在一些实施方式中，多糖-维生素缀合物包括共价连接多糖和一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子中的每一种的接头基团。接头基团是接头分子、多糖和维生素或其类似物或衍生物之间的反应产物。例如，接头分子的第一化学基团与多糖的官能团反应，形成连接接头分子和多糖的第一共价键；接头分子的第二化学基团与维生素或其类似物或衍生物的官能团反应，形成连接接头分子和维生素或其类似物或衍生物的第二共价键。第一共价键和第二共价键的实例包括酰胺键、酯键、二硫键、γ-谷氨酰基-ε-赖氨酸键和重氮键。
[0160] 在一些实施方式中，接头基团包括在第一共价键和第二共价键之间的间隔基。任选地，间隔基包括1至50个原子。任选地，间隔基包括1至50个碳原子，例如1至15个碳原子、1至20个碳原子、20至35个碳原子或35至50个碳原子。
[0161] 在一些实施方式中，第一共价键和第二共价键中的一个或两个是可生物降解的键。可生物降解的键的实例包括酰胺键，其可以被血液中的酶如氨肽酶和胃蛋白酶分裂。在本公开中发现，具有作为第一共价键和/或第二共价键的酰胺键的多糖-维生素缀合物即使在温和条件下也经历在血液中的自发降解。
[0162] 6.缀合位点和类型
[0163] 本公开的多糖-维生素缀合物可具有任何适当数量的缀合位点。在一些实施方式中，多糖-维生素缀合物具有1至10，例如1至5、1至4、1至3或1至2个范围内的平均缀合位点数。任选地，多糖-维生素缀合物的缀合位点的平均数目为1。任选地，多糖-维生素缀合物的缀合位点的平均数目为2。缀合位点的平均数目可以通过例如缀合反应中多糖与维生素之间的比来控制。
[0164] 在一些实施方式中，多糖-维生素缀合物包括单一类型的维生素或其类似物或衍生物。在一些实施方式中，多糖-维生素缀合物在每个缀合物分子中包括多种类型的维生素或其类似物或衍生物。任选地，多糖-维生素缀合物在每个缀合物分子中包括2至10(例如2至5、2至4、2、4或5)种不同类型的维生素或其衍生物。任选地，每个缀合物分子可以包括2至5种不同类型的维生素或其衍生物(例如，叶酸、胆酸、维生素A、维生素E或其衍生物)。
[0165] 在一些实施方式中，颗粒由包括单一类型的维生素或其类似物或衍生物的多糖-维生素缀合物形成。在一些实施方式中，颗粒由每个缀合物分子中包括多种维生素或其类似物或衍生物的多糖-维生素缀合物形成。在一些实施方式中，颗粒由多糖-维生素缀合物的混合物形成，其中一些在每个缀合物分子中包括单一类型的维生素或其类似物或衍生物，并且其中一些在每个缀合物分子中包括多种类型的维生素或其类似物或衍生物。
[0166] 包封活性剂的颗粒的制备
[0167] 例如，在图2中提供了制备本公开的包含颗粒(例如，微粒)的组合物的方法。一方面，该方法包括：提供多糖-维生素缀合物，其包含与多糖共价连接的一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子；将多糖-维生素缀合物和治疗剂在合适的溶剂中组合，或将多糖-维生素缀合物溶液和治疗剂溶液组合；并且使多糖-维生素缀合物和治疗剂的混合物经受高剪切均化器以形成包含含有多糖-维生素缀合物和治疗剂的颗粒(例如，微粒)的组合物，其中治疗剂被包埋在由多糖-维生素缀合物形成的颗粒中，并且一种或多种维生素或其类似物或衍生物分子位于治疗剂和多糖之间。
[0168] 在一个实施方式中，葡聚糖-叶酸缀合物可以如下制备。葡聚糖具有1,3-键和1,6键。结果，第一步衍生化有不同的羟基。琥珀酰化葡聚糖(MW＝10-70KDa)的合成显示在下面和图1A(1,6葡聚糖)和图1B(1,3葡聚糖)中以说明。
[0169]
[0170] 一方面，氨基叶酸的合成显示在下面和图1C中
[0171]
[0172] 应该理解，多糖和维生素可以分别进行修饰。可以在下面和图1D中显示的缀合步骤之前进行任一种修饰。在某些方面，任一种修饰或两种修饰可以与缀合步骤同时或基本同时进行。在其他实施方式中，可以在部分被缀合之后进行多糖部分的修饰和/或维生素(或相关的剂)部分的修饰。在一个实施方式中，下面的反应将改性葡聚糖与改性叶酸连接以形成葡聚糖-叶酸缀合物。在某些方面，缀合叶酸或其衍生物或类似物增加了多糖(例如葡聚糖)的疏水性。应该理解的是，也可以独立地或与本文所述的方法和工艺组合地使用其他维生素或相关的剂和其他增加多糖疏水性的方法。
[0173]
[0174] 在某些实施方式中，叶酸与葡聚糖单元的比例为(0.5～2):(1.0～20)。在优选的实施方式中，叶酸与葡聚糖单元的比例为(0.8～1.2):(2.0～10)，更优选为1：5。在某些方面，碳二亚胺如Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(DCC)可用作偶联剂。作为液体，DIC比常用的DCC更容易处理。
[0175] 在一个实施方式中，将药物包埋在葡聚糖-叶酸缀合物中的制剂方法可如下进行，使用高剪切均化器以混合抗肿瘤剂(例如抗癌药)和葡聚糖-叶酸缀合物。在优选的实施方式中，抗肿瘤剂可以是紫杉醇、多西紫杉醇或多柔比星、或其衍生物或类似物，或其任何组合。
[0176] 在某些实施方式中，药物和载体的混合过程可以通过普通均化器来完成。在优选的实施方式中，使用高剪切均化器将药物包埋进葡聚糖-叶酸缀合物的核以形成具有高包封率的纳米级悬浮液。在具体的方面，多糖-维生素缀合物和治疗剂的混合物可以在约10,000至约30,000psi(磅/平方英寸)范围内的压力下经受高剪切均化器。在其他方面，可使用压力范围为约5,000至约10,000psi、约10,000至约20,000psi、约20,000至约30,000psi、约
30,000至约40,000psi、约40,000至约50,000psi、约50,000至约60,000psi、或高于约60,
000psi的高剪切均化器。
30,000至约40,000psi、约40,000至约50,000psi、约50,000至约60,000psi、或高于约60,
000psi的高剪切均化器。
[0177] 一方面，葡聚糖-叶酸缀合物可以溶解在合适的缓冲液中，例如PBS缓冲液(pH＝7.4)。可以在轮上旋转混合物直到葡聚糖-叶酸缀合物完全溶解，典型地在约5-10分钟内。
在一个实施方式中，可将药物如紫杉醇溶于合适的缓冲液或溶剂中，例如乙酸乙酯/苯甲醇(4:1)或CH2Cl2/乙醇(4:1)，并将其加入葡聚糖-叶酸缀合物水溶液以获得粗制剂/乳剂。
在一个实施方式中，可将药物如紫杉醇溶于合适的缓冲液或溶剂中，例如乙酸乙酯/苯甲醇(4:1)或CH2Cl2/乙醇(4:1)，并将其加入葡聚糖-叶酸缀合物水溶液以获得粗制剂/乳剂。
[0178] 在某些实施方式中，多糖-维生素缀合物的溶液和治疗剂溶液是可混溶的。在某些实施方式中，多糖-维生素缀合物溶液和治疗剂溶液是不混溶的。例如，多糖-维生素缀合物的溶剂是含水液体(例如，水或含有溶解的盐或其他物质的水、细胞或生物介质、乙醇等)，并且治疗剂的溶剂是有机溶剂(例如二氯甲烷、乙腈、氯仿、四氢呋喃、丙酮、甲酰胺、二甲基甲酰胺、吡啶、二 烷、二甲基亚砜(dimethysulfoxide)等)。在一些实施方式中，组合多糖-维生素缀合物溶液和治疗剂溶液可以产生乳液。
[0179] 在一个实施方式中，所述乳液可以是水包油型乳液，所述乳液包含含有颗粒(例如，微粒)的分散的非水相和包含水的连续相。在另一个实施方式中，乳液的非水相包含苯甲酸苄酯、三丁酸甘油酯、甘油三乙酸酯和油如红花油和玉米油中的至少一种。在某些实施方式中，乳液可以是微乳液。
[0180] 一方面，可以将高剪切均化器(例如，LM 20，Microfluidics Inc.)以30,000psi施加到粗乳液上约4至约6次。可以将全部粗乳液以5:1的比例(水：乳液，v/v)混合，倒入合适的溶剂，例如冷DI水中。在某些实施方式中，该方法可以进一步包括通过渗滤、过滤、溶剂蒸发或离心或其任何组合来分离颗粒(例如，微粒)。例如，乳液中的溶剂可通过渗滤除去以达到10mg/mL聚合物的最终浓度。在其他实施方式中，该方法可以进一步包括通过添加共溶剂然后渗滤来分离颗粒。在某些方面，共溶剂可以是去离子水。
[0181] 在某些方面，该方法可以进一步包括纯化步骤和/或灭菌步骤。在某些方面，纯化步骤和/或灭菌步骤可以包括通过平均孔径为0.2μm的膜过滤颗粒(例如，微粒)，和/或用合适的溶剂洗涤颗粒。例如，可以测量粒度，并且可以使用0.2μm膜在冻干之前对制剂进行灭菌。
[0182] 在某些方面，所述方法可以进一步包括在冷冻保护剂如糖例如蔗糖或海藻糖存在下的干燥步骤和/或冻干步骤。例如，可以添加冷冻保护剂(cyroprotectant)，如约10wt％的蔗糖，以在随后的冷冻-干燥循环期间保持粒度基本不变。在具体的实施方式中，冻干步骤基本上不聚集颗粒(例如，微粒)或基本上改变颗粒的平均直径。在优选实施例中，颗粒(例如，微粒)可以是纳米颗粒。在某些方面，颗粒的平均直径可以在约20nm和约200nm之间。在某些其他方面，颗粒的平均直径可以在约20nm与约50nm之间、约50nm与约100nm之间、约
100nm与约150nm之间或约150nm与约200nm之间。在一个实施方式中，颗粒的平均直径小于约200nm，并且在冻干期间和/或之后保持小于约200nm。
100nm与约150nm之间或约150nm与约200nm之间。在一个实施方式中，颗粒的平均直径小于约200nm，并且在冻干期间和/或之后保持小于约200nm。
[0183] 在优选的实施方式中，制剂的长保质期可以通过冷冻干燥过程来实现。一方面，冻干步骤之后的组合物可以配制成冻干饼或冻干粉末。另一方面，重构溶液在室温下在悬浮均匀性和药物含量方面表现出超过3天的稳定性。
[0184] 在某些实施方式中，本公开的颗粒(例如，微粒)可以是含有治疗剂的纳米颗粒、纳米球、纳米胶囊或胶束。在优选的实施方式中，在本公开的颗粒(例如，微粒)中，维生素或相关的剂部分位于颗粒内部的包埋的药物和改性多糖之间，而不是位于颗粒的外表面上，例如，以作为靶配体发挥作用。另外，在优选的实施方式中，使用可生物降解的多糖，并且与其他生物分子如白蛋白相比，成本较低。例如，修饰多糖并将其与其他分子偶联可以比人白蛋白更容易并且成本更低地实现。例如，聚合物纯化不需要凝胶渗透色谱(GPC)方法。此外，合成的聚合物可以降低其他生物材料如人白蛋白——其被用作市场上基准药物中的载体——的病毒污染风险。
[0185] 本公开的另一个优点是不同于其他聚合物-药物缀合物递送系统，药物被物理包埋入聚合物中，而不是通过化学或共价键。因此，在优选的实施方式中，释放速率可以比共价缀合至聚合物或聚合物缀合物的药物更快。在优选的实施方式中，可以完全避免或至少显著降低药物的外消旋化以保持药物的效力和/或生物学活性。
[0186] 制剂
[0187] 另一方面，本公开提供了具有本发明颗粒的稳定制剂。例如，可以通过在水溶液中重构冻干颗粒来制备稳定的制剂。重构的样品在室温下保持稳定至少3天，例如在室温下至少5天，在室温下至少7天，或在室温下至少10天。重构的样品中颗粒的平均尺寸在室温下保持基本上不变至少3天，例如在室温下至少5天，在室温下至少7天，或在室温下至少10天。此外，颗粒中的载药量在重构的样品中在室温下保持基本上相同至少3天，例如在室温下至少5天，在室温下至少7天，或者在室温下至少10天。
[0188] 另一方面，本公开提供了一种重构通过本文所述方法制备的冻干颗粒的方法。在一些实施方式中，重构方法包括将稀释剂加入冻干颗粒以形成重构溶液。任选地，稀释剂是无菌的无热原水。该重构溶液适用于皮下注射和静脉注射。
[0189] 使用颗粒进行诊断、治疗和预后的方法
[0190] 本公开提供用于治疗受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的任何实施方式的颗粒(例如，微粒)或组合物。在某些方面，颗粒(例如，微粒)或组合物可配置用于通过局部、肠内/胃肠、肠胃外、硬膜外、脑内、脑室内、皮内、皮下、鼻、口、静脉内、动脉内、肌内、骨内输注、玻璃体内、膀胱内、透皮或透粘膜途径而在受试者中施用。
[0191] 应该理解，本公开的临床应用不限于癌症或肿瘤疾病或病症。相反，任何疾病或病症可以受益于使用本文公开的颗粒(例如，微粒)和组合物，条件是存在可以包埋在微粒中的合适的剂、合适的施用途径、合适的目标受试者群体、以及监测受试者对使用颗粒递送的剂(或多个)的响应的合适方法。在具体的例子中，可以受益于使用颗粒(例如，微粒)和组合物的疾病或病症包括但不限于病毒感染，例如HIV感染或AIDS、或HBV或HCV感染；自身免疫性疾病，例如狼疮或类风湿性关节炎；神经退行性疾病，例如帕金森氏病或阿尔茨海默氏病。
[0192] 在某些实施方式中，为了诊断、治疗和/或预后的目的，优选使用颗粒(例如，微粒)以将抗肿瘤剂包埋和/或递送至需要其的受试者，其中抗肿瘤剂可以选自烷化剂、抗代谢物、天然抗癌产物、激素、金属配位络合物及其混合物。唯一的要求是这些剂可以被本公开中使用的颗粒(例如，微粒)适当地包埋，并且当组合使用时不会相互干扰。关于一种单一组或多于一种上述组的剂的施用没有限制，其当然包括本文和下文中具体公开的许多物质：浆果赤霉素III、氮芥(例如环磷酰胺、曲磷胺、异环磷酰胺和苯丁酸氮芥、亚硝基脲类(例如卡洛司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)和尼莫司汀(ACNU))、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(例如塞替派)、叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷)、嘌呤类似物(例如巯基嘌呤和硫唑嘌呤)、长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱和长春地辛)、表鬼臼毒素(例如依托泊苷和替尼泊苷)、抗生素(例如放线菌素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、博来霉素A2、丝裂霉素C和米托蒽醌)、雌激素(例如二乙基己烯雌酚)、促性腺激素释放激素类似物(例如亮丙瑞林、布舍瑞林和戈舍瑞林)、抗雌激素类(例如他莫昔芬和氨鲁米特(Ammoglutethimide))、雄激素(例如睾内酯和Drostanolonproprionate)和铂络合物(例如顺铂和卡铂)。
[0193] 一方面，包含在颗粒(例如，微粒)或组合物中的治疗剂可以是抗肿瘤剂。在具体的实施方式中，治疗剂可以是紫杉醇或其衍生物、多西紫杉醇或其衍生物、或多柔比星或其衍生物。在某些方面，将治疗剂包埋在颗粒(例如，微粒)中基本上不改变受试者对给定量治疗剂的响应性。在其它方面，治疗剂可以是细胞毒性剂，并且受试者的响应性可以通过细胞毒性剂的细胞毒性来测量。在其他方面，与施用未包埋在本发明的颗粒(例如，微粒)中的治疗剂相比，用于治疗受试者的方法增加了受试者对治疗剂的耐受剂量。在某些方面，向受试者施用有效量的颗粒(例如，微粒)或组合物可以减少受试者中赘生性细胞的生长。
[0194] 本公开另外提供了用于减少受试者中的肿瘤生长的方法，包括用有效量的辐射治疗需要其的受试者，并用有效量的本文公开的任何实施方式的颗粒(例如，微粒)或组合物治疗受试者。在某些其他方面，本文提供了用于减少受试者中的肿瘤生长的方法，包括用有效量的化学治疗剂治疗需要其的受试者，并用有效量的本文公开的任何实施方式的颗粒(例如，微粒)或组合物治疗受试者。在其他方面，公开了用于减少受试者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括用有效量的生物活性治疗剂治疗需要其的受试者，并用有效量的本文公开的任何实施方式的颗粒(例如，微粒)或组合物治疗受试者。
[0195] 根据本公开的方法，组合治疗策略的单独治疗可以在治疗过程中的不同时间，以任何合适的顺序分开施用，或者同时以分开或单一组合形式施用。例如，用有效量的辐射、化学治疗剂或生物活性治疗剂或其任何组合治疗可以在用有效量的本文公开的任何实施方式的颗粒(例如，微粒)或组合物的治疗开始之前、之后或同时开始。因此，本公开应被理解为包含同时或交替治疗的所有此类方案，并且术语“施用”应被相应地解释。
[0196] 本公开另外提供了使用本公开的颗粒来诊断疾病或病症的方法。在一些实施方式中，用于诊断疾病或病症的颗粒包括多种多糖-维生素缀合物和诊断标记。在一些实施方式中，缀合物中的维生素或其类似物或衍生物是能够结合体内组织或细胞(例如肿瘤或循环血细胞)中的受体的靶向分子。例如，多糖-叶酸缀合物可靶向叶酸受体，其在许多类型的肿瘤的表面上高度过表达。在一些实施方式中，维生素可以被衍生化以包括靶向分子如小分子配体、肽或与体内组织或细胞中的受体结合的抗体。
[0197] 诊断标记的例子包括放射性同位素、酶、染料、生物素、荧光标记和化学发光标记。在一些实施方式中，诊断方法是体外诊断方法。任选地，该方法包括从受试者获得样品(例如肿瘤样品或血液样品)；使样品与本颗粒接触；去除样品中未与受体结合的诊断标记；并确定与样品中受体结合的诊断标记的量。在一些实施例中，诊断方法是体内成像方法。任选地，该方法包括将本颗粒施用给受试者；检测结合受试者中受体的诊断标记的存在。任选地，与受试者中的受体结合的诊断标记的存在通过成像装置诸如磁共振成像装置或X射线免疫闪烁照相成像装置、正电子发射断层摄影装置等来检测。
[0198] 以下实施例旨在进一步描述和说明本公开的各个方面，但不以任何方式、形态或形式明确或隐含地限制本公开的范围。
[0199] 实施例1：葡聚糖-叶酸缀合物的合成
[0200] 在该实施例中，合成葡聚糖-叶酸缀合物有三个步骤。
[0201] 步骤(1)：琥珀酰化葡聚糖的合成。合成路线显示在图1A和图1B中。
[0202] 使用900mL无水Ν,Ν-二甲基甲酰胺(DMF)(Sigma Aldrich)——含有20mg/mL LiCl作为溶剂和26.1g(0.33mol)吡啶作为催化剂——使18.0g(0.33mol OH)葡聚糖(T-70，Sigma Aldrich)在80℃与33.0g(0.33mol)琥珀酸酐(Sigma Aldrich)反应。反应时间为30小时，聚合物通过以下来分离：在冷的2M盐酸中沉淀，用冰冷的水洗涤，溶解于NaHCO3溶液中，将钠盐沉淀在丙酮中，将聚合物溶于水中，在2M盐酸中再沉淀，用冰冷的水洗涤，溶于丙酮中，最后在乙醚中沉淀并干燥至稳定的重量。
[0203] 官能化葡聚糖的表征通过IR和1H和13C NMR技术进行。通过在酚酞存在下在具有0.1M氢氧化钠的二甲基亚砜(DMSO)溶液中滴定改性聚合物来确定取代度(DS)。该聚合物含有85.0mol％的酯基(DS＝2.55)。
[0204] 步骤(2)：合成氨基叶酸。合成路线显示在图1C中。
[0205] 将叶酸(3000mg，6.8mmol)溶于120mL加入858mg(6.8mmol)DIC和783mg(6.8mmol)NHS的干燥DMSO中。反应在室温下在黑暗中放置过夜。然后，在搅拌下加入1000mL丙酮/醚(3:7)。在烧结玻璃上收集黄色沉淀FA-NHS酯并用丙酮/醚(3/7)洗涤。干燥的FA-NHS酯立即用于下一步合成或放置在-20℃保存。
[0206] 将2.78g(50mmol)干燥的FA-NHS酯溶于20mL DMSO中。立即将6.10g(1000mmol)乙二胺加入到上述溶液中并在室温(25℃)下在黑暗中在搅拌下温育12小时。然后，在搅拌下将50mL丙酮/醚(3/7)倒入溶液中。收集黄色沉淀并在DMSO中重结晶以获得纯化的氨基叶酸。
[0207] 步骤(3)：葡聚糖-叶酸缀合物的合成。合成路线显示在图1D中。
[0208] 将2000mg琥珀酰化葡聚糖(4.9mmol糖单元)溶于40mL无水DMF中。加入315.5mg DIC和337.8mg HOBT并在室温下温育过夜。然后，加入溶解在2mL DMF中的473.8mg氨基叶酸并继续搅拌另外12小时。将全部反应物倒入Spectra/Por 3透析袋(MW＝3,500)并透析2天。将溶液冻干得到黄色固体。最终产物通过1H-MR(d-DMSO)鉴定：2.8(-CH2CH2-，琥珀酰化葡聚糖)、3.2-3.6(葡聚糖)、4.4-5.8(葡聚糖)、8.6(叶酸)。
[0209] 实施例2：用葡聚糖-叶酸缀合物包封紫杉醇
[0210] 在这个实施例中，包封过程可以如图2中的流程图所示。
[0211] 将1000mg葡聚糖-叶酸缀合物溶解于10mL 20mM PBS缓冲液(pH＝7.4)中并在轮上旋转直到完全溶解(5-10分钟)。将紫杉醇(300mg)溶于1mL乙酸乙酯/苯甲醇(4:1)或CH2Cl2/乙醇(4:1)中并加入上述水溶液中以获得粗制剂。然后，在30K Psi下将高剪切均化器(LV1低容量，Microfluidics Inc.)施加至粗乳液4-6次。之后，将全部粗乳液以5：1的比例(水：乳液)混合倒入冷DI水中。最后通过渗滤去除乳液中的溶剂以达到100mg/mL聚合物的最终浓度。测量粒度并在冻干前使用0.2μm膜对制剂进行灭菌。在随后的冷冻-干燥循环期间施加冷冻保护剂，如10wt％的蔗糖以保持粒度。
[0212] 实施例3：冻干饼的冷冻干燥过程
[0213] 在这个实施例中，为制剂设计了冷冻干燥剂型以增加其保质期。为了获得具有药物美观外观的冻干饼，将实施例2中制备的上述制剂放入30mL血清小瓶中，并且应用到冷冻干燥机(型号：Virtis Advantage Plus)中。优化周期如下所示：
[0214] 冷冻和退火：冻结至-40℃120min，升温至-22℃90min。然后，将温度降回到-40℃并保持2小时。
[0215] 一次干燥过程：温度升回至-11℃并在真空下持续48.6小时。
[0216] 二次干燥过程：在25℃真空下干燥7小时。冻干饼的水分含量低于3.5％，最终产品储存在阴凉干燥的储藏室内。图3显示了小瓶的典型图像。
[0217] 含有300mg紫杉醇的冻干饼小瓶在3分钟内通过10mL WFI重构以获得透明的散装液体(bull liquid)。通过DLS测量的粒径为120±20nm，其显示颗粒(例如纳米颗粒)在冷冻干燥过程之后不聚集。表2列出了冻干饼的所有物理化学特性。
[0218] 表2：冻干饼的物理化学特性
[0219]
[0221] 实施例4：制剂的体外评估
[0222] 在体外测试含有紫杉醇的冻干饼对人类非小细胞肺癌细胞的细胞毒性。在用WFI重构之后，将不同浓度的紫杉醇置于与 细胞培养基温育72小时的癌细胞上，根据细胞存活率计算IC50。结果显示，包埋的紫杉醇的细胞毒性与没有任何处理的紫杉醇本身相似(IC50≈10nM)。相反，葡聚糖-叶酸(FA)缀合物不显示细胞毒性，IC50>0.05mg/mL。因此，结果显示细胞毒性的贡献来自紫杉醇，而不是来自葡聚糖-FA的缀合物。
[0223] 实施例5：制剂的体内毒性评估
[0224] 对C57/BL16黑色小鼠进行 和新制剂毒性的比较研究。评估基于体重减轻，最大剂量定义为体重减轻小于10％。根据图4A， 的最大剂量为80mg/kg紫杉
醇等量。然而，新制剂的最大剂量是125mg/kg紫杉醇等量。结果表明，将紫杉醇包埋在葡聚糖-FA缀合物中可降低抗癌药的毒性并增加耐受剂量。因此，在将来的临床试验中，该制剂可以应用于更高的剂量。
醇等量。然而，新制剂的最大剂量是125mg/kg紫杉醇等量。结果表明，将紫杉醇包埋在葡聚糖-FA缀合物中可降低抗癌药的毒性并增加耐受剂量。因此，在将来的临床试验中，该制剂可以应用于更高的剂量。
[0225] 实施例6：使用该制剂抑制肿瘤生长
[0226] 在种植人非小细胞肺癌细胞的异种移植模型上评估抗肿瘤活性。以50、75、100和125mg/kg紫杉醇等量的剂量通过尾静脉注射而施用重构的冻干饼(紫杉醇/聚合物＝30/
100)。对照组为PBS、葡聚糖-FA缀合物和 (80mg/kg紫杉醇等量)。监测肿瘤生长
的抑制，结果显示在图4B中。PBS和葡聚糖-FA缀合物没有任何肿瘤抑制作用。然而，对于
75mg/kg(紫杉醇等量)的冻干饼的肿瘤生长抑制优于80mg/kg(紫杉醇等量)的
这几乎与50mg/kg的冻干饼(紫杉醇等量)相同。
100)。对照组为PBS、葡聚糖-FA缀合物和 (80mg/kg紫杉醇等量)。监测肿瘤生长
的抑制，结果显示在图4B中。PBS和葡聚糖-FA缀合物没有任何肿瘤抑制作用。然而，对于
75mg/kg(紫杉醇等量)的冻干饼的肿瘤生长抑制优于80mg/kg(紫杉醇等量)的
这几乎与50mg/kg的冻干饼(紫杉醇等量)相同。
[0227] 根据数据，可以得出结论，葡聚糖-FA缀合物无毒，但可以帮助包埋的紫杉醇抑制肿瘤生长。在一些方面，该制剂优于市场上的制剂。
[0228] 实施例7：葡聚糖-叶酸缀合物的合成
[0229] 步骤1：将葡聚糖修饰成葡聚糖-琥珀酸。合成路线显示在图5A中。
[0230] 向250mL RB中加入葡聚糖(40000D，30.0g，0.556mol-OH)和150mL无水二甲基亚砜。将混合物加热至50℃以获得澄清溶液。接着加入琥珀酸酐(5.01g，50.0mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(150mg，1.23mmol，2.5％催化剂负载)。剧烈搅拌反应混合物24小时。将所得反应混合物倒入900mL冷的无水乙醇中，形成白色沉淀。通过离心(4000rpm，4℃，10min)收集白色固体。将所得固体溶于300mL水(pH 3.25)并加入30mLNH4HCO3水溶液(0.10M)以将pH调节至中性。将所得水溶液通过0.2μm PVDF过滤器(Whatman6900-2502)过滤，然后用10mM NH4HCO3针对水透析4天。冻干以提供18.4g(53％)葡聚糖-(琥珀酸)0.270。
[0231] 步骤2：用乙二胺修饰叶酸以形成叶酸-NH-CH2CH2-NH2。合成路线如图5B所示。
[0232] 向250mL的RB中加入叶酸(3.0g，6.8mmol)和80mL无水二甲基亚砜。将该混合物加热至50℃以获得澄清的棕色溶液。随后加入在20mL干燥DMSO中的Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(930mg，4.5mmol)和在20mL干燥DMSO中的N-羟基琥珀酰亚胺(770mg，4.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌20小时。深棕色反应混合物变混浊。通过离心(4000rpm，20℃，10min)除去沉淀。将所得透明深棕色溶液倒入280mL乙醚和丙酮的80/20混合溶剂中。收集得到的棕褐色沉淀物并通过离心(4000rpm，4℃，10min)(用乙醚和丙酮的80/20混合溶剂)洗涤。将所得棕褐色半固体悬浮于50mL水中并冻干成3.08g棕色固体。将3.08g棕色固体加入配有搅拌棒和12mL干燥DMSO的20-mL闪烁瓶中。在剧烈搅拌下向混合物中加入乙二胺(6.63g，7.4mL)。将反应混合物加盖并搅拌18小时。将所得反应混合物倒入80mL乙醚和丙酮的80/20混合溶剂中。收集棕色沉淀物并通过离心(4000rpm，4℃，10min)(用乙醚和丙酮的80/20混合溶剂)洗涤。棕色固体从干燥DMSO(～10mL)中重结晶。收集来自DMSO重结晶的棕色固体并悬浮于30mL水中，冻干成3.04g 89％的产物。
[0233] 步骤3：葡聚糖-琥珀酸与叶酸-NH-CH2CH2-NH2的缀合。合成路线显示在图5C中。
[0234] 向配备有搅拌棒的20-mL闪烁瓶中加入葡聚糖-(琥珀酸)0.270(来源ZYT-WW-I-39，1.0g，5.3mmol葡萄糖部分，1.42琥珀酸部分)和10mL无水二甲基亚砜。将该混合物加热至50℃以获得澄清溶液。随后加入在5mL干燥DMSO中的Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(54.6mg，
0.267mmol，5％当量的葡萄糖部分)和N-羟基琥珀酰亚胺(30.7mg，0.267mmol，1.05当量)。
将反应混合物在室温下搅拌20小时。向反应混合物中加入叶酸-NH-CH2CH2-NH2(来源ZYT-WW-I-45，155mg，0.267mmol)与5mL干燥DMSO。将所得反应混合物在室温下再搅拌24小时。将反应混合物倒入80mL冷的无水乙醇中，形成淡黄色沉淀。通过离心(6000rpm，10℃，20min)收集淡黄色固体。所得固体溶于30mL水中。将得到的水溶液用5mM NH4HCO3在水中透析2天，超声处理5min，通过0.2μm PVDF过滤器(Whatman 6900-2502)过滤，然后用6mM NH4HCO3对水再透析1天。得到的澄清溶液的pH为7.0，并进一步用10mM HOAc在水中透析2天。在透析管内形成棕色固体，通过离心(6000rpm，10℃，20min)收集棕色固体。将得到的棕色糊悬浮于
50mL水中并冻干，以提供1.13g作为葡聚糖-(琥珀酸)0.22(琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-叶酸)0.05的淡棕色固体(产率98％)的终产物。紫外-可见光谱表明，基于叶酸摩尔差异系数，叶酸部
1
分为3.8mol％。H NMR光谱表明基于积分，叶酸部分为～3mol％。
0.267mmol，5％当量的葡萄糖部分)和N-羟基琥珀酰亚胺(30.7mg，0.267mmol，1.05当量)。
将反应混合物在室温下搅拌20小时。向反应混合物中加入叶酸-NH-CH2CH2-NH2(来源ZYT-WW-I-45，155mg，0.267mmol)与5mL干燥DMSO。将所得反应混合物在室温下再搅拌24小时。将反应混合物倒入80mL冷的无水乙醇中，形成淡黄色沉淀。通过离心(6000rpm，10℃，20min)收集淡黄色固体。所得固体溶于30mL水中。将得到的水溶液用5mM NH4HCO3在水中透析2天，超声处理5min，通过0.2μm PVDF过滤器(Whatman 6900-2502)过滤，然后用6mM NH4HCO3对水再透析1天。得到的澄清溶液的pH为7.0，并进一步用10mM HOAc在水中透析2天。在透析管内形成棕色固体，通过离心(6000rpm，10℃，20min)收集棕色固体。将得到的棕色糊悬浮于
50mL水中并冻干，以提供1.13g作为葡聚糖-(琥珀酸)0.22(琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-叶酸)0.05的淡棕色固体(产率98％)的终产物。紫外-可见光谱表明，基于叶酸摩尔差异系数，叶酸部
1
分为3.8mol％。H NMR光谱表明基于积分，叶酸部分为～3mol％。
[0235] 实施例8：用乙二胺对胆酸进行修饰
[0236] 合成路线显示在图6中。向装有搅拌棒的20-mL闪烁瓶中加入胆酸(3.0g，7.34mmol，1.0当量)和10mL无水二甲基亚砜。将混合物加热至50℃以获得澄清溶液。随后加入在10mL干燥DMSO中的Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(1.59g，7.71mmol，1.05当量)和N-羟基琥珀酰亚胺(890mg，7.7mmol，1.05当量)。将反应混合物在室温下搅拌20小时。向反应混合物中加入乙二胺(6.63g，7.4mL)。将所得反应混合物在室温下再搅拌24小时。将反应混合物倒入80mL乙醇和水的80/20混合溶剂中。收集得到的白色沉淀并通过离心(4000rpm，4℃，
10min)洗涤(用乙醇和水的80/20混合溶剂)。将粗固体产物悬浮于50mL水中并冻干成3.3g白色固体(产率100％)。
10min)洗涤(用乙醇和水的80/20混合溶剂)。将粗固体产物悬浮于50mL水中并冻干成3.3g白色固体(产率100％)。
[0237] 实施例9：葡聚糖-琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-胆酸的合成
[0238] 合成路线显示在图7中。向配备有搅拌棒的20-mL闪烁瓶中加入葡聚糖-(琥珀酸)0.270(1.0g，5.3mmol葡萄糖部分，1.42琥珀酸部分)和10mL无水二甲基亚砜。将混合物加热至50℃以获得澄清溶液。随后加入在5mL干燥DMSO中的DCC(Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺，54.6mg，0.267mmol，5％当量的葡萄糖部分)和N-羟基琥珀酰亚胺(30.7mg，0.267mmol，1.05当量)。将反应混合物在室温下搅拌20小时。向反应混合物中加入胆酸-NH-CH2CH2-NH2(120mg，0.267mmol)和5mL干燥DMSO。将所得反应混合物在室温下再搅拌24小时。将反应混合物倒入80mL冷的无水乙醇中，形成灰白色沉淀。通过离心(6000rpm，10℃，20min)收集固体并重新溶于30mL水中。将得到的水溶液用5mM NH4HCO3在水中透析2天，超声处理5min，通过0.2μm PVDF过滤器(Whatman 6900-2502)过滤，然后用6mM NH4HCO3对水再透析1天。将得到的澄清溶液在水中进一步透析并冻干以提供0.84g(产率76％)作为葡聚糖-(琥珀酸)0.22(琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-胆酸)0.05的灰白色固体的终产物。
[0239] 实施例10：用乙二胺修饰视黄酸
[0240] 合成路线显示在图8中。向配备有搅拌棒的20-mL闪烁瓶中加入视黄酸(1.5g，5.0mmol，1.0当量)和10mL无水二甲基亚砜。将该混合物加热至50℃以获得淡黄色溶液。随后加入在10mL干燥DMSO中的Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(1.08g，5.24mmol，1.05当量)和N-羟基琥珀酰亚胺(603mg，5.24mmol，1.05当量)。将反应混合物在室温下搅拌20小时。向该反应混合物中加入乙二胺(3.3g，3.7mL)。将所得反应混合物在室温下再搅拌24小时。将反应混合物倒入80mL乙醇和水的80/20混合溶剂中。收集得到的白色沉淀并通过离心(4000rpm，
4℃，10min)洗涤(用乙醇和水的80/20混合溶剂)。将粗固体产物悬浮于50mL水中并冻干成
1.55g淡黄色固体(产率91％)。
4℃，10min)洗涤(用乙醇和水的80/20混合溶剂)。将粗固体产物悬浮于50mL水中并冻干成
1.55g淡黄色固体(产率91％)。
[0241] 实施例11：葡聚糖-琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-视黄酸的合成
[0242] 合成路线显示在图9中。向配备有搅拌棒的20-mL闪烁瓶中加入葡萄糖-(琥珀酸)0.270(1.0g，5.3mmol葡萄糖部分，1.42琥珀酸部分)和10mL无水二甲基亚砜。将混合物加热至50℃以获得澄清溶液。随后加入在5mL干燥DMSO中的DCC(Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺，54.6mg，0.267mmol，5％当量的葡萄糖部分)和N-羟基琥珀酰亚胺(30.7mg，0.267mmol，1.05当量)。将反应混合物在室温下搅拌20小时。向反应混合物中加入视黄酸-NH-CH2CH2-NH2(91.5mg，0.32mmol)和5mL干燥DMSO。将所得反应混合物在室温下再搅拌24小时。将反应混合物倒入80mL冷的无水乙醇中，形成淡黄色沉淀物。通过离心(6000rpm，10℃，20min)收集固体，并重新溶于30mL水中。所得水溶液用5mM NH4HCO3在水中透析2天，超声处理5min，通过
0.2μm PVDF过滤器(Whatman 6900-2502)过滤，然后用6mM NH4HCO3对水再透析1天。将得到的澄清溶液在水中进一步透析并冻干以提供0.84g(76％产率)作为葡聚糖-(琥珀酸)0.22(琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-视黄酸)0.05的白色固体的最终产物。
0.2μm PVDF过滤器(Whatman 6900-2502)过滤，然后用6mM NH4HCO3对水再透析1天。将得到的澄清溶液在水中进一步透析并冻干以提供0.84g(76％产率)作为葡聚糖-(琥珀酸)0.22(琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-视黄酸)0.05的白色固体的最终产物。
[0243] 实施例12：葡聚糖-叶酸-胆酸缀合物的合成
[0244] 合成路线显示在图10中。在配备有搅拌棒的200-mL RB烧瓶中加入葡聚糖-(琥珀酸)0.22(1.0g，5.3mmol葡萄糖部分，1.42琥珀酸部分)与15mL无水二甲基亚砜。将该混合物加热至50℃以获得澄清溶液。随后加入在5mL干燥DMSO中的DCC(Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺，110mg，0.534mmol，10％当量的葡萄糖部分)和N-羟基琥珀酰亚胺(61mg，0.534mmol)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。制备5mL干燥DMSO中的叶酸-NH-CH2CH2-NH2(465mg，0.96mmol)溶液和5mL干燥DMSO中的胆酸-NH-CH2CH2-NH2(120mg，0.267mmol)溶液并混合。在室温下剧烈搅拌下将所得的DMSO溶液混合物加入到反应混合物中，并继续搅拌24小时。将反应混合物倒入80mL冷的无水乙醇中，形成淡黄色沉淀。通过离心(6000rpm，10℃，20min)收集淡黄色固体。将所得固体溶于30mL水中。所得水溶液用5mM NH4HCO3在水中透析2天，超声处理5min，通过0.2μm PVDF过滤器(Whatman 6900-2502)过滤，然后用6mM NH4HCO3对水再透析1天。得到的澄清溶液在水中透析2天并冻干以提供～1.0g(产率74％)作为葡聚糖-(琥珀酸)0.17(琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-叶酸)0.05(琥珀酸-NH-CH2CH2-NH-胆酸)0.05的淡棕色固体。
[0245] 实施例13：用乙二胺修饰生育酚琥珀酸
[0246] 合成路线如图11所示。向配备有搅拌棒的20-mL闪烁瓶中加入生育酚琥珀酸(3.0g，5.65mmol，1.0当量)和10mL无水二甲基亚砜。将该混合物加热至50℃以获得澄清溶液。随后加入在10mL干燥DMSO中的Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(1.22g，5.93mmol，1.05当量)和N-羟基琥珀酰亚胺(682mg，5.93mmol，1.05当量)。将反应混合物在室温下搅拌20小时。向反应混合物中加入乙二胺(6.63g，7.4mL)。将所得反应混合物在室温下再搅拌24小时。将反应混合物倒入80mL乙醇和水的80/20混合溶剂中。收集得到的白色沉淀物并通过离心(4000rpm，4℃，10min)洗涤(用80/20混合溶剂乙醇和水)。将粗固体产物悬浮于50mL水中并冻干成2.94g白色固体(产率60％)。
[0247] 实施例14：通过水混溶性溶剂用葡聚糖-叶酸缀合物包封紫杉醇
[0248] 将420mg葡聚糖-叶酸缀合物溶于70mL水中并搅拌至完全溶解(5-10分钟)。将紫杉醇(100mg)溶于3.5mL乙醇中并加入到上述水溶液中，通过转子-定子以8,000psi混合2分钟形成预混物。然后，在29K Psi下将高剪切均化器(M110P，Microfluidics Inc.)施加至粗乳液1-5次。之后，在室温下在减压下从粗乳液中蒸发乙醇。冻干之前测量粒径并使用0.22μm膜对制剂进行灭菌。在随后的冷冻-干燥循环期间施加冷冻保护剂，如10wt％的蔗糖以保持粒径。
[0249] 实施例15：通过水混溶性溶剂用葡聚糖-胆酸、葡聚糖-视黄酸或葡聚糖-叶酸-胆酸缀合物包封紫杉醇
[0250] 将420mg聚合物溶于70mL水中并搅拌至完全溶解(5-10分钟)。将紫杉醇(100mg)溶于3.5mL乙醇中并加入到上述水溶液中，通过转子-定子以8,000psi混合2分钟形成预混物。然后，在29K Psi下将高剪切均化器(LM20，Microfluidics Inc.)施加至粗乳液1-5次。之后，在室温下在减压下从粗乳液中蒸发乙醇。在冻干之前，将粒径控制在100-200nm之间，并使用0.22μm膜来对制剂进行灭菌。在随后的冷冻-干燥循环期间施加冷冻保护剂，如10wt％的蔗糖以保持粒径。
[0251] 实施例16：重构的颗粒溶液的稳定性
[0252] 将具有实施例2中制备的葡聚糖-叶酸缀合物和包封的紫杉醇的冻干颗粒样品在无菌无热原水溶液中重构。重构的样品保持在室温(23℃-35℃)10天。使用色谱分别在第1天、第7天和第10天分析重构的样品。在第7天和第10天药物浓度和纯度与第1天相比保持不变。还分析了在第1天、第7天和第10天的粒径，并显示其保持在相同的范围内。
[0253] 所有标题都是为了读者的方便，不应该用来限制标题后面的文本的含义，除非特别说明。
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[0255] 尽管以上已经描述了本公开的各种实施方式，但是应该理解的是，它们仅以实例的方式呈现，而不是通过限制的方式呈现。类似地，各种图可以描绘用于本公开的示例性架构或其他配置，其被完成以帮助理解可以被包括在本公开中的特征和功能。本公开不限于所示出的示例性体系结构或配置，而是可以使用各种替代体系结构和配置来实现。此外，虽然以上以各种示例性实施方式和实施方案的方式描述了本公开，但是应理解的是，在一个或多个单独实施方式中描述的各种特征和功能不限于它们对它们被描述的特定实施方式的适用。相反，它们可以单独或以某种组合而应用于本公开的一个或多个其他实施方式，无论这些实施例是否被描述，以及这些特征是否被呈现为描述的实施方式的一部分。因此，本公开的宽度和范围不应该被任何上述示例性实施方式限制。
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