本发明涉及通过口粘膜大剂量投用干扰素刺激哺乳动物体内针 对病理学条件的宿主防御机制的方法。具体地说，本发明可应用于 自身免疫病、肿瘤疾病、神经性变性疾病、寄生虫病和病毒病的治 疗方法。

本发明的背景技术

α干扰素广泛用于治疗包括多毛细胞白血病、慢性骨髓性白血 病、低级淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤在内的各种血液学恶性疾病， 和包括肾细胞癌、黑色素瘤、癌样肿瘤及与爱滋病相关的卡波西氏 肉瘤在内的实体瘤(Gtutterman，J.U.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994 91：1198-1205)。通常在借助胃肠外给药注射大剂量(往往是数百 万单位)的α干扰素(IFN-α)才能看到抗肿瘤作用。β干扰素(IFN- β)临床上已被批准用于治疗复发-缓解性多发硬化症及慢性乙型和 丙型病毒性肝炎。

α干扰素和β干扰素都是I型干扰素。I型干扰素是一大类天 然存在的细胞因子，包括16个以上IFN-α子类、加上IFN-β和IFN- ω。I型干扰素结合到单细胞表面受体上，刺激一系列复杂的信号 转导过程，最终导致抗病毒、抗增殖和其他免疫调节作用、细胞因 子诱导作用，以及I类和II类HLA调节作用(Pestka等人，Rev Biochem.，1987 56：727)。I型IFN的各个亚型在活性上是不同的。 借助扫描大量的IFN-α等位基因亚型已识别每个位置上最常观察到 的氨基酸，并已合成出具有共同序列的I型合成干扰素(Alton等人， “干扰素系统的物生学”，E.de Maeyer and H.Schellekens eds.Elsevier (1983)1991-128)。这种共有干扰素可从市场购得(Infergen，Amgen， Ine.)，并且最近已证明它具有比IFN-α2a或IFN-α2b高的活性 (w/w)；而且已有人提出共有(复合)IFN将在临床上优于各种天 然亚型的IFN(Blatt等人，J.Interferon and Cyfokine Rsearch，1996 16：489-499)。

尽管有大量的给药途径(包括静脉注射、皮下注射、肌肉注射、 局部注射和损伤部位内注射)通常用于I型干扰素给药，但因为干 扰素是一种可被蛋白水解酶失活的蛋白质，并且在胃肠道内大多不 能以其天然形式被吸收，所以一般不使用口服给药途径。确实有许 多研究未能在口服给药后在血液中检测到干扰素(Canttll and Pyhala， J.Gen.Virol.，1973 20：99-104；Wills等人，H.IFN Res.，1984 4：399-409； Gilson at al，J.IFN Res.，1985 5：403-408)。

普遍认为，为了获得最大治疗效果应使用可能的高剂量的干扰 素。虽然重组物的可用性意味着非常高的剂量水平是可行的，但在 实践中业已发现，干扰素用药的副作用严重地限制了可以使用的干 扰素剂量和持续治疗时间。这些副作用包括严重的不适和抑郁，在 某些病例中甚至导致自杀。Hoofnagle近年在New England Journal of Medicine上总结了这些问题(Hoofnagle，J.H.，and Lau，D.，New Eng J. Medicine，1996 334：1470-1471)。对患有乙肝炎e抗原阳性的慢性乙 型肝炎病人所作的α干扰素治疗效果的meta分析显示有25％至40％ 的缓解率，其中包括用每天5百万单位(IU)或每周3次每次1千万IU 治疗3至6个月的典型的慢性乙型肝炎病人。但这些结果都末达到治 愈的目的，因为经聚合酶链反应试验显示，大多数病人仍为肝炎表 面抗原阳性，并且带有病毒DNA。此外，这样高剂量的干扰素很难 忍受，有10％至40％的病人因不能耐受的副作用要求降低剂量。但 是每天1百万IU的可忍受剂量，缓解率只有17％(Perrillo等人，New Eng J.Medicine，1990，323：295-301)。在患有慢性丙型肝炎的病人 中，长期维持的改善与HCV RNA有关，这种情况只发生在10-20％ 的采用每周3次3百万单位的剂量治疗了6个月的病人中(Hoofnagle and lau，文献出处同上)。在患肿瘤的病人中，通常只有使用最高耐 受剂量的α干扰素才能看到有意义的反应率。因此对于多发性骨髓 瘤病人，在每天用2-3千万国际单位治疗的病人中反应率为50％，用 3百万IU治疗的病人反应率只有10-20％。但只有极少数病人能够较 长时期忍受大剂量治疗(Alre等人，Ear.J.Hematol.，1998，41：123- 130)。因此，在此领域中显然需要一种能够在不诱发严重副作用 的情况下完成大剂量干扰素给药的办法。

迄今已有许多关于在治疗各种病毒性疾病特别是在治疗流感中 作为鼻喷雾剂或口服液体配方给药的小剂量干扰素的效力的轶事 性报道。但在大多数报道中，所使用的干扰素制剂都是比较粗制的。 用较高剂量鼻内干扰素治疗鼻病毒感染的安慰剂对照试验显示治 疗是有效的，但副作用的发病率相当高(Hayden等人，J.Infect Dis.， 1983，148：914-921)。同样，虽然有许多包括随机双盲临床试验的 研究(Douglas等人，NewEngl.J.Med.，1986，314：65-80；Hayden等人， New Engl.J.Med.，1986，314：71-75)已经证明通过鼻饲给药投用高 剂量重组干扰素α2在抗鼻病毒感染中的效力，但这些研究并没有 提供有关全身作用的证据。

最近有一系列专利说明书描述了使用低剂量口服给药的异种来 源的干扰素治疗家畜的感染性鼻气管炎(“运输热”)，和猫白血 病，以及治疗其他一些病症，以增强疫苗的效力、改善食物利用的 效率、以及预防牛泰勒氏梨浆虫病。分别参阅美国专利No. 4,462,985、澳大利亚专利No.608519、澳大利专利No.583332和美国 专利No.5,215,741。另外，美国专利No.5,017,371公开了按这种方式 使用干扰素治疗恶性肿瘤化疗或放疗后的副作用。在这些说明书 中，所使用的干扰素都是按Cantell的方法制备的、加在磷酸盐缓冲 盐水中以每磅体重0.01至5IU的剂量给药的人α干扰素。虽然这些说 明书中都提出经口咽粘膜并优选以适合与口粘膜长时间接触的方 式完成如此低剂量的干扰素的给药对于治疗包括肿瘤在内的各种 病理条件可能是有效的，但除了运输热、猫白血病、犬细小病毒感 染和泰勒氏梨浆虫以外的病理条件的实验证据大都是轶事性的。具 体地说，还没有提出在任何动物模型中对人类肿瘤进行这种治疗的 适当的对照试验。

已经有人对近年来有关通过口或口咽粘膜给药的非常低剂量干 扰素的效果的研究结果进行了综述(Bocci，Clin.Pharmacokinet.， 1991，21：411-417；Critic.Reu.Therap.Drug Carrier Systems.1992，9： 91-133；Cummins and Georgiades，Archiuum.Immun.Therap.Exp.， 1993，41：169-172)。已有人提出这种类型的治疗对于治疗HIV感染 是特别有用的，并且至少可以改善爱滋病患者的生存质量(Kaiser 等人，AIDS，1992，6：563-569；Koech等人，Mol.Biol.Ther.，1990， 2：91-95)。然而，其他一些报告指出这些治疗并没有提供临床益处。 也已有人报告了使用包含低剂量干扰素的含片治疗乙型肝炎的阶 段I的研究结果(Zeilinska等人，Archiv.Immunol.Therap.Exp.，1993. 41：241-252)。

相反，Brigham和Women′s Hospital的国际专利申请No.WO 95/27499指出在充分认定的动物模型中，如果在诱导抗原之前以胃 管法投用β干扰素，至少可部分地抑制如I型糖尿病、多发性硬化 症及自身免疫性关节炎等自身免疫病的发展。借助这种途经或腹腔 内途径与胃内“旁观者”抗原结合给药的β干扰素在诱导耐受性方 面甚至更有效。这意味着β干扰素在提高口服耐受性的诱导作用中 是有效的，而不是在诱导体液或细胞对外源性抗原的反应方面有 效。

在澳大利亚临时专利申请No.PN9765中，揭示了借助口粘膜途 径向口咽腔内给药的低剂量干扰素在防止小鼠遭受高转移性肿瘤 细胞的攻击方面是有效的。这些结果异乎寻常的特征，连同目前几 乎没有物质对这些颇具侵害性的肿瘤呈现活性这一事实，都表明在 治疗癌症时向口咽腔内投用干扰素是有用的。在治疗向腹腔内注射 脑心肌炎病毒(EMCV)(该病毒通常引起以牵连中枢神经系统和 脑炎为特征的迅速恶化的致死性疾病)的小鼠时，经口粘膜给药的 低剂量干扰素也是有效的。虽然这个系统是非常严格的抗病毒活性 试验，但经口粘膜的干扰素给药途径与腹膜内给药差不多同样有 效。

本发明概述

本发明提供一种通过口粘膜完成干扰素给药刺激哺乳动物宿主 防御机制的方法，其中给药剂量高于胃肠道外给药时引发病理学反 应的剂量，即通常在人体内有高于大约20×106IU的均质干扰素-α。 对于另一种类型的干扰素，诱发病理反应的剂量可能不同于均质干 扰素α在人体内诱发这种反应的剂量。

一个方面，本发明可看作是一种通过口粘膜接触给哺乳动物投 用免疫刺激量的干扰素刺激哺乳动物体内免疫反应的方法，其中所 述剂量超过胃肠道外给药时同种干扰素诱发病理反应的剂量。

换言之，本发明提供一种借助经口粘膜完成干扰素给药的提高 干扰素治疗指数的方法。

口粘膜给药可能涉及以单一剂量完成干扰素有效剂量的给药， 或者在足以引发相当于单一剂量的免疫刺激作用的时间里以多次 较小剂量完成有效剂量的给药。类似地，可以在足以诱发相当于单 一剂量的作用的时间里完成干扰素剂量的连续给药。

在其应用方面，本发明借助口粘膜接触将有效剂量的干扰素提 供给哺乳动物治疗自身免疫病、分枝杆菌病和神经性变性疾病、肿 瘤条件及病毒感染方法，其中所述剂量超过胃肠道外给药时同种干 扰素诱发病理反应的剂量。具体地说，本发明提供治疗关节炎、I 型糖尿病、狼疮和多发性硬化症等自身免疫病、麻风和结核病等分 枝杆菌病、海绵状脑炎和Crelltzfeldt-Jakob病等神经性变性疾病、症 疾等寄生虫病、以及宫颈癌、生殖器疮疹、乙型和丙型肝炎、HIV、 HPV、HSV-1和HSV-2等病毒病的方法。

本发明还提供治疗多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病、慢性骨髓 性白血病、低级淋巴病、皮肤T细胞淋巴瘤、癌样肿瘤、宫颈癌、 包括卡波西氏肉瘤在内的肉瘤、肾肿瘤、包括肾细胞癌、肝细胞癌、 鼻咽癌、血癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤、乳头状瘤、肺癌、结 肠癌和恶性黑色素瘤在内的各种癌症、以及包括恶性脑肿瘤在内的 脑肿瘤的方法。在一个实施方案中，该方法通常可应用于治疗非病 毒病源学的肿瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供适合口粘膜给药的药物组合 物，该组合物包括治疗有效剂量的至少一种干扰素和医药上可接受 的载体，其中所述剂量超过胃肠道外给药时引发病理反应的剂量。 可以作为溶液、片剂、锭剂、凝胶、糖浆、软膏或控释口粘膜释放 系统提供该组合物。非必选的是该组合物可以包含缓冲剂、稳定剂、 增稠剂、吸收促进剂和增粘剂等。

在一个实施方案中，药物组合物是以含有大约20×106IU到大约 1000×106IU干扰素、优选大约20×106IU到大约500×106IU、最优 选大约50×106IU到大约500×106IU的单位剂量形式提供的。

该方法可以作为单独的治疗方法或作为放疗、化疗的辅助疗法 来实践，或者用诸如白介素-2、-12或-15之类的细胞因子或干扰素 诱导剂来实践。

该方法优选采用选自α-、β-、γ-、ω-和共有干扰素的I型或 II型干扰素来完成，最优选采用重组IFN-α。

本发明的详细叙述

现在将仅仅参照下面的定义和实施例详细介绍本发明。文中提 及的全部专利和出版物均特意并入，以供参考。

定义

本文使用的术语“干扰素”指的是I型或II扰素，包括通常以α、 β、γ和ω命名的干扰素以及它们的混合物(包括共有序列)。干 扰素可以通过各种商业渠道购买，并且已被批准用于治疗许多主治 病症。干扰素可以来自天然资源，但优选的是重组产品。就本发明 的目的而言，术语“干扰素”还包括具有干扰素活性的多肽或其片 段，以及在诸如美国专利第5,582,824、5,593,667和5,594,107号中公 开的为了在不影响其生物活性性质的前提下提高稳定性而引入序 列修饰的干扰素的嵌合或突变形式。

本语“高剂量”意思是高于借助诸如静脉或腹腔内之类的胃肠 道外途径给药时通常可忍受的同种干扰素的最大剂量。正象目前预 计的那样，对于70kg重的成人，干扰素的高剂量是高于大约20× 106IU的均质α干扰素。优选的剂量是高于大约30×106IU。在本发 明特别优选的形式中，总剂量从大约50×106IU到大约1000×106IU， 更优选从大约50×106IU到500×106IU。本文所说的“高剂量”通常 被看作是经口粘膜给药时的治疗有效剂量，该剂量如果经胃肠道外 给药将诱发病理反应，这种反应可由不可接受的副作用或毒性代用 标志的出现来证实。高剂量的定义必然是灵活的，因为它可以依据 病人的个体敏感性、身高、体重和年令、待治疗病症的性质及严重 程度、所用的具体干扰素以及给药的特殊载体而有所变化。用特定 的干扰素为病人治疗的医生将能迅速地确定适合待治疗的病人的 高剂量范围。

干扰素可以非必选地与干扰素合成与释放的诱导剂同时给药。 诱导剂可以与干扰素一起给药，也可以分开给药。例如，干扰素的 诱导剂包括诸如poly I:C之类的多核苷酸；优先使用低分子量可口服 给药的干扰素诱导剂。适当的诱导剂在技术上是已知的，例如双二 乙氨乙基芴酮Tilorone(美国专利No.3,592,819；Albrecht等人，J.Med. Chem.，1974，17：1150-1156)和喹诺酮衍生物Imiguimcd(Savage等 人，Brit.J.Cancer，1996 74：1482-1486)。

本发明的方法和组合物可以非必选地与一种或多种适合具体病 症的其它治疗结合使用，而且医生或兽医将能够迅速地选择在该环 境下适当的这类其它治疗。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗哺乳动物肿瘤病的方 法，该方法包括上述干扰素的给药步骤。肿瘤病症包括转移性的癌。

尽管本发明的方法可以在没有采用其他药剂进行同时治疗的情 况下使用，但预期本发明的这个实施方案在下述情况下将是特别有 用的：

(a)作为按标准方法进行外科手术、化学治疗或放射治疗后的 辅助治疗；

(b)用于治疗对干扰素敏感的肿瘤，单独利用或与常规的化疗 或放疗结合使用本发明的方法；以及

(c)用于治疗抗干扰素的肿瘤，单独利用、最优选的是与常规 的化疗或放疗结合使用本发明的方法。

上述方法的目的是诱导和/或维持缓解疾病。“与其他治疗结合” 意思是在进行放疗或其他化学治疗之前、期间和/或之后完成干扰素 给药。最适宜的方法将取决于下文讨论的各种因素。

具体地说，预期本发明的方法将优先与至少一种选自下列一组 方法的治疗结合使用，这组方法包括采用细胞生长抑制药物、一种 或多种具有抗肿瘤活性又具有不同于干扰素作用机理的细胞因子、 抗血管生成剂以及增强干扰素活性的药剂进行的化疗。优选的第二 种细胞因子是白介素-1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素12(IL-12) 或白介素15(IL-15)；优选的血管生成抑制剂是AGM-1470；增强 干扰素作用的处理优选体温升高或精氨酸丁酯。

优选的准备与干扰素结合给药的细胞生长抑制药物包括但不 只限于环磷酰胺、顺式铂氨、卡铂、卡美斯汀(BCNU；N，N-双(2- 氯基乙)-N-亚硝基脉)、氨甲喋呤、亚德里亚霉素、α-二氟甲基 乌氨酸和5-氟尿喀啶。

对这种方法敏感的肿瘤条件包括但不只限于对高剂量IFN-α胃 肠道外给药有反应的癌，例如血液恶性瘤、多发性骨髓瘤、多毛细 胞白血病，或慢性骨髓性白血病、低级淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤； 实体瘤，例如肾细胞癌和黑色素癌；类癌肿瘤；或与爱滋病有关的 卡波西氏肉瘤，特别是非病毒病原性恶性肿瘤。病毒性病症可以是 急性或暴发性感染，如鼻病毒、流感、水痘疮疹、带状疮疹、登革 热；或病毒性脑炎，包括但不只限于麻诊病毒脑炎、河谷(Murray Valley)脑炎、日本乙型脑炎、森林脑炎和疱疹(Herpes)脑炎； 出血热，例如感染埃博拉(Ebola)病毒、马尔堡(Marburg)病毒、 拉沙(Lassa)热、汉坦(Hanta)病毒以及由动物传播给人的其他 病毒(如马麻疹病毒感染)。其中许多病症目前还没有治疗办法和 /或可利用的疫苗，而且支持疗法可能是不适当的。另外，病毒病症 可能是慢性感染的结果，例如乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎或其 他类型病毒性肝炎，以及CMV、HIV、HPV以及HPV I型和II型感 染。乙型肝炎和丙型肝炎目前都用干扰素经胃肠道外给药治疗；对 于已发展成爱滋病的HIV感染的长期干扰素治疗正在临床试用之 中。

在第二个实施方案中，待治疗的疾病是疟疾，而且I型和II型 干扰素再次给药。疟疾的病原生物体可以是三日疟原虫、恶性疟原 虫、卵形疟原虫。特别期待的是本发明的方法将阻止疟疾向脑型疟 疾发展。

在第三个实施方案中，本发明提供治疗自身免疫机能紊乱(例 如复-缓解型或慢性进行性的HIV、类风湿性关节类及多发性硬化 症)或免疫缺陷(如爱滋病)的方法，其中包括上述的干扰素给药 步骤。

另外，本发明的方法和剂量形式可以与其他疗法结合使用。例 如，对于疱疹病毒感染，可以使用Acyclovir(阿若洛韦)或 Ganciclovir(更昔洛)。对于HIV感染，可以使用叠氮胸苷(阿西夫定) 或一种或多种其他HIV反转录酶抑制剂，和/或HIV蛋白酶抑制剂。

在本发明的药物组合物制剂中，可以使用各种适合IFN的载体 和赋形剂，对于本领域的技术人员这些是显而易见的。在Remington： The Science and Practice of Phanrmacy(19th ed.，Mack Publishing Co.， Easton，PA，1995)及其以前的版本中阐述了有代表性的配制技术。 在美国专利No.4,496,537中介绍的那样，IFN配方可包括诸如甘氨酸 或丙氨酸之类稳定性增强剂，和/或的一种或多种载体(如载体蛋白 质)。例如，为了治疗人的疾病，可以将药品级人血清白蛋白非必 选地与作为稀释剂的磷酸盐缓冲盐水一起使用。在IFN的赋形剂是 人血清蛋白的场合，人血清蛋白可以得自人血清，也可以是重组源 的。在使用血清蛋白时，血清蛋白通常是均质源的。

可以借助任何使IFN与受体的口粘膜腔接触的方法完成IFN的 给药。因此，应当明确地理解，本发明不限于任何具体类型的的配 方。本说明书描述深入口粘膜腔完成IFN给药；这可以用液体、固 体、或气溶胶、以及滴鼻或喷雾来实现。因此，本发明包括但不限 于液体、喷雾剂、糖浆、锭剂、含片和喷雾剂配方。熟悉此项技术 的人将承认对于气溶胶或喷雾剂配方，制剂的粒度可能很重要的， 并将知道适当的粒度调整方法。

一个方面，干扰素以单次量给药。另一方面，干扰素以多次低 剂量分布在一段时间内给药，以使总效应相当于较高的单次量给 药。实现这种给药方式的一种途径是提供一种附着在或植入到口粘 膜腔中能持续或受控释放干扰素的装置，而且该装置是为了在一段 时间内释放相当于较高的单次量的量的干扰素而设计的。

适合口粘膜使用的有代表性的干扰素配方包括下述配方(所有 的百分比均为重量百分比)：

片剂：右旋糖BP 45％；白明胶BP 30％；小麦淀粉BP 11％；羧 甲纤维素钠BP5％；卵白蛋白BPC4％；亮氨酸3％；丙二醇BP 2％； 和50×106IU IFN-α2。该片剂可以原样使用并允许在嘴里缓慢地溶 解，也可以溶解在水中并在需要时含在嘴中保持与口粘膜接触。

干扰素软膏可以象在美国专利No.4,615,184中介绍的那样由甘 油45％、羧甲纤维素钠2％、柠檬酸盐缓冲液(PH4.5)25％、加至 100％的蒸馏水和50×106IU IFN-α2来制备。干扰素软膏可粘附在口 颊粘膜上。

同样，将所需剂量的干扰素加到市售的嗽口液或止咳糖浆配方 中就可以制备嗽液或糖浆。

在上文提到的特定剂量范围内，任何个体病例的最佳治疗剂量 取决于所涉及病症的性质、疾病的阶段、以前的治疗情况、其他正 在继续的治疗、哺乳动物的一般健康状况、治疗对象对干扰素的敏 感性等因素，所以，该剂量任凭医生或兽医考虑所有这些情况后所 作的决断。疗程长短将随被治疗的病情而异，例如，治疗缓慢生长 的癌(如前列腺癌)可能涉及与快速生长的癌(如肝细胞癌)不同 的疗程。类似地，急性感染(如由Ebola病毒引起的感染)可能涉及 与慢性感染(例如肝炎)不同的疗程。

文中揭示的有效剂量是经胃肠道外给药时在哺乳动物体内可以 产生病理反应的剂量，而且在经口粘膜给药时既有效又无毒或低 毒。病理反应可以是急性的、慢性的或累积性的，并可以通过血液 化学的变化(例如白细胞减少、骨髓机能减退)或其他组织学参数 得到证实。文中所用的术语“病理反应”包括诸如发烧、不适、类 似流感的症状之类不良的副作用；诸如静脉炎之类的血管反应；以 及注射部位的局部炎性反应。从个体对干扰素敏感性的差异上看， 这些反应在病人群体中将有相当大的变化。

对于许多病人，口粘膜给药剂量超过按已批准的胃肠道外给药 方法准备耐受的已知剂量是完全可能的。在一个实施方案中、总剂 量可以在一段时间内以多次低剂量完成给药，甚至或可以从附着到 或植入到口粘膜上的控释装置连续地或以脉动方式给药。

干扰素和干扰素配方

小鼠IFN-α/β

小鼠干扰素-α/β(Mu IFN-α/β)是由新域病病毒(NDV) 诱导的C243-3细胞的培养基制备的并按以前介绍的方法提纯 (Tovey等人，Proc.Soc.Exp.Bicl.and Med.，1974，146：809-815)。 在象前面的介绍(Tovey等人，Proc.Soc.Exp.Biol.and Med.，1974， 146：809-815)那样，在受疱疹口腔炎病毒(VSV)攻击的小鼠929 细胞上检测时，这项研究中使用的制剂具有4×106国际单位(IU)/ml 的滴度和5×107IU/mg蛋白质的比活性。对照美国国立卫生研究所 (NIH)的鼠性IFN-α/β国际基准制剂(G-002-9004-5411)对该制 剂进行标准化处理。

人体干扰素-α-1-8

象以前介绍的那样(Meister等人，J.Gen.Virol.，1986，67：1633- 1643)，制备和纯化重组的人体干扰素-α1-8(HuIFN-α1-8；BDBB lot no.CGP 35269-1，Ciba Geigy，Basel，Switzerland)。象以前介绍的 那样(Tovey等人，Nature，1977 267：455-457)，这项研究所用的制 剂在受VSV攻击的均质的人体WISH细胞上具有70×106IU/ml的滴 度，而且在异质的鼠L929细胞上有1×106IU/ml的滴度。对照NIH人 体IFN-α国际基准制剂(G-023-901-527)和NIH鼠IFN-α/β标准 (G-002-9004-5411)两者完成该制剂的标准化。该IFN制剂的比活 性为2×108IU/mg蛋白质。

重组的鼠干扰素-α

重组的鼠干扰素-α购自Life Technologies公司。这项研究所用 的制剂(批号HKK404)在受VSV攻击的鼠L929细胞上检测(Tovey 等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Mled.，1974，146：406-415)时具有6× 106IU/ml的滴度和6×108IU/mg蛋白质的比活性。

重组的鼠干扰素-β

重组的鼠干扰素-β购自R&D Systems公司。这项研究所用的制 剂(批号1976-01S)在受VSV攻击的鼠L929细胞上检测(Tovey等 人，Proc.Soc.Exp.Biol.Mled.，1974，146：406-415)时具有3.2× 104IU/ml的滴度和8×106IU/mg蛋白质的比活性。

重组的鼠干扰素-γ

重组的鼠干扰素-γ购自R&D Sysyems公司。这项研究所用的制 剂(2580-03SA)在受VSV攻击的鼠L929细胞上检测(Tovey等人， Proc.Soc.Exp.Biol.Mled.，1974，146：406-415)时具有2×105IU/ml 的滴度和1×107IU/mg蛋白质的比活性。

所有的干扰素制剂在同一试验中同时滴定，并对照美国国立卫 生研究所(NIH)的鼠干扰素α/β国际基准制剂(G-002-9004-5411) 进行标准化处理。

小鼠干扰素α/β和重组小鼠干扰素两者均在给药前用 FerimmuneTM赋形剂重新配制。

赋形剂

干扰素制剂将用包含牛血清蛋白质(BSA)的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)或下述的专有赋形剂进行稀释。将牛血清血蛋白馏份V( RIA级，无疫球蛋白；药品批号A7888；Sigma，VSA)以100μg/ml 的最终浓度溶解在PBS(pH7.4)中并借助过滤(0.2μ，Millex-GV， Millipore，USA)除菌。

在本文所述的实验中，用专有赋形剂稀释干扰素制剂。所用的 赋形剂是以片剂形式(Ferimmune harma，Pacific)供应的下述 赋形剂：

    ％w/w     mg/片   右旋糖(葡萄糖)BP**     44.67***     55.84   明胶BP**     30.06     37.58   小麦淀粉BP**     11.31     14.14   羧甲纤维素钠BP**     4.96     6.20   卵白蛋白BPC**     4.03     5.04   亮氨酸USP     3.00     3.75   丙二醇BP     1.88     2.35   葡聚糖40**   (作为葡聚糖40注射BP)     0.06     0.08   磷酸钠BP     0.03     0.04   氯化钠BP     0.01     0.01   酸式磷酸钠BP     0.01     0.01   总计     100.02     125.04

**在无水基础上计算的

***推导自：

右旋糖(葡萄糖)BP(无水的)         44.46％

葡萄糖BP(作为葡聚糖40注射剂)     0.03％

将一片溶解于1.5ml磷酸盐缓冲盐水中，以16,000g离心15分钟， 然后无菌过滤(0.2μ，Millex-GV，Millipore，USA)，并在使用前在4 ℃下贮存。每天使用前制备赋形剂。

干扰素递送系统

初步的实验结果表明用P20 Eppendorf微量移液管将5μl结晶紫 施加到正常成年小鼠的每个鼻孔中，这将导致染料几乎立即分布到 口咽腔的整个表面上。在施加染料后约30分钟，口咽腔的着染仍很明 显。采用同样方式施加带125I-标记的重组干扰素α1-8，获得基本上 相似的结果。所以，这种给药方法被用在所有的后续实验中。

就本说明书中介绍的动物实验目的而言，人们将会清楚地理解， 有关IFN给药途径的表述“口粘膜”或“口咽”或“鼻内/口”或“鼻 内加口”或“in/or”都是指深入鼻腔的IFN制剂给药，以使它迅速分 布到口粘膜腔内，即受体动物的口和咽部内，以便与该腔的粘膜衬 接触。

EMCV(脑心肌炎病毒)

分批：批号095001

截止日期：1997年12月

制备：使用以前描述的方法(Gresser I.Bourali C，Thomas MT， Falcoff E.重复接种干扰素制剂对感染脑心肌炎病毒的小鼠的影响， Pro Soc Exp.Biol Med.，1968年2月，127：491-6)在小鼠L929的细胞 上增殖EMCV毒株JH。

特征：这项研究所用的病毒原液在小鼠L929细胞上的滴度为5 ×108.62TCID50。

贮存：在-70℃贮存EMCV原液。在病毒滴定的第1天断电，被 迫暂时转移到温度近似相同的备用库。材料始终保持冻结状态。在 病毒滴定的第8天，将-70℃的冰箱温度升至-60℃。即将使用前制备 稀释的EMCV，并存放在冰上或动物室冰箱内备用。

Friend红白血病细胞

E.Affabris，Rome博士获得了Friend红白血病细胞(FLC)的抗 IFN-α/β克隆3C18，并且作了详细介绍(Virology，1982，120：441- 452)。借助活体内继代移种法保留这些细胞。简单地说，借助腹 膜内注射(ip)给DBA/2小鼠接种大约100LD50的3C18细胞，一周后 从小鼠腹腔中收获肿瘤细胞并计数，然后再次用100LD50的3C18细 胞给其他小鼠接种。用这种方法重复继代移种60至100次。业已发 现，在第60至第100次活体内继代移种所用的3C18细胞对肝和脾脏 具有高转移性(Gresser等人，Int.J.Cancer，1987，39：789-792)。在 有IFN-α/β存在的条件下活体外培养活体内继代移种的细胞证实 了抗干扰素性的表型(Belardell等人，Int.J.Caner，1982 30：813-820)。 L1210R6克隆&EL4可移植的肿瘤

L1210淋巴瘤细胞的抗干扰素-α/β克隆L1210R6是在我们的实 验室分离的(Gresser等人，1974，干扰素和细胞分裂，IX.抗干扰素 的L1210细胞：特征和来源，J.Nat.Cancer Inst.，52：553-559)。

EL4可移植性肿瘤最初来源于接种化学致瘤剂1-2二甲基苯并 蒽的小鼠(Gorer，P.A.，1 950，Br.J.Cancer，4：372-381)。

借助用无特异病原体的DBA/2小鼠进行一系列活体内继代移种 保留L1210淋巴瘤细胞。

借助用无特异病原体的C57BL/6小鼠进行活体内继代移种维持 EL4肿瘤。

B16黑色素瘤

B16黑色素瘤是源于C57BL/6小鼠自发来源的可移植性肿瘤 (Fidler I.J.and Kriple，M.L.，1977，Science 197：893-897)。B16黑色 素瘤是一种迅速生长的、高度退行发育的，主要向肺转移的黑色素 生成的肿瘤。一般认为B16黑色素瘤迅速生长的，有高度攻击性的 人类肿瘤核型。

B16黑色素瘤细胞在无特异病原体的C57BL/6小鼠体内靠一系 列继代移种维持的。

动物

在这项研究中所用的小鼠是从无特异病原体的群体(IFFA CREDO，France)获得的。这些小鼠按照EEC标准圈养在无特异病原 体的动物试验室内(位于Institut Federatif CNRS，Villejuif)。

干扰素的生物检定

按照常规方法检定干扰素。简单地说，样品(20μl)用80μl包 含2％热灭活的胎牛血清(FCS)(Gibco，France)的Eagle氏极限基本培 养基MEM(Gibco，France)稀释，并且用多道移液管(Finnpipette， Labsystem，50-300ml)添加到微量滴定板(Falcon，批号3072)的每 个孔中。将WISH或L929细胞(2×104细胞/孔)添加到包含2％FCS 的100μl MEN中并在含5％CO2的空气气氛(Forma 3029 CO2孵箱) 中在37℃下孵化过夜。然后用装有10倍物镜的Olympus IM GLDW倒 置显然微镜检查细胞的毒性征象。然后，从1∶10稀释开始以包含 2％FCS的总体积为200μl的Eagle氏MEM对未呈现可检出毒性的样 品进行连续的加倍稀释，其方法是用多道移液管将100μl稀释材料 归入每孔包含100μl新鲜的含2％FCS的Eagle氏MEM的微板上。同时 还制备NIH人IFN-α的参考标准(G-023-901-527)或NIH Mu IFN- α/β的参考标准(G-002-9004-5411)的适当的连续加倍稀释液。然 后，在适当的环境中用100ml包含2％FCS的Eagle氏MEM将WISH或 L929细胞(2×104细胞/孔)添加到每块板上，并在含有5％CO2的 空气环境中在37℃下保温过夜。然后检查细胞单层的毒性征象并且 没有任何显著的毒性，将培养物抽吸出来并用200μl含有2％FCS和 100 TCID50的VSV(WISH细胞为2×10-4VSV23，或L929细胞为10-5 VSV23)的Eagle氏MEM替代。然后，将这些板在包含5％CO2的空 气气氛中在37℃下保温过夜。然后，用Olympus IM VLWD倒置显微 镜检查细胞单层有无特异病毒的细胞病变作用。干扰素的滴度是由 给出50％抗特异病毒细胞病变效应的稀释度的倒数确定的，并且以 国际参考单位/毫升(IU/ml)表示。

实施例1：用EMCV(脑心肌炎病毒)致死性攻击反高剂量干扰素 对存活率的影响

用注射了致死量的EMCV的雄性和雌性小鼠试验经口粘膜途径 完成1,000、10,000、100,000IU的IFN-α给药效果。试验不同类型的 IFN-α，并且将口粘膜途径给药的效果与经腹腔(ip)途径给药的 效果进行比较。除了在致死性攻击后监测存活率外，还使用各种临 床化学和血液学参数监测IFN疗法的毒性。

在病毒感染后开始经口粘膜途径用105IU的IFN-α给小鼠进行 治疗，每天一次治疗4天，结果所有的动物都得到完全保护。经IFN 治疗的动物全部存活，而且在未经治疗的感染病毒的对照组动物到 第7天全部死亡的条件下，在感染致死剂量的EMCV(100LD50)后 存活100天。

按体重计算，经口粘膜途径用105IU治疗小鼠相当于人的剂量为 240×106IU，据我们所知，这个剂量远远大于人的实际用药剂量。

因为用105IU的IFN-α经in/or途径治疗小鼠产生比用104IU IFN- α治疗动物可产生更大程度的保护作用，所以用更高剂量的IFN-α 可能会获得更大的效果(对抗更大的病毒或肿瘤负荷)。迄今为止， 我们尚未在剂量-反应曲线中观察到任何平台指征。

我们的结果还证明，以in/or途径给药的超高剂量的IFN具有高度 保护性抗病毒作用，并且以这种途径给药的105IU IFN-α可完全抵 御所用剂量的EMCV。尽管事实上按体重计算所用剂量远远高于对 人的给药剂量(相当于240×106IU)，但并没有观察到临床的、生 物化学的或血液学的毒性证据。相反，在临床实践中经胃肠道外给 药的IFN最大耐受剂量是在每天20-30×106IU范围内。

实施例2  高剂量IFN-α对受高转移性肿瘤细胞攻击的小鼠的影响

第0天，用105个抗干扰素克隆3C18的Friend红白血病细胞或105 个L1210淋巴瘤细胞(抗干扰素的L1210R细胞)静脉内攻击每组10 只6周令的DBA/2小鼠。接种后，这些小鼠一部分保留不作治疗，另 一部分经in/or途径进行治疗，每天治疗两次，治疗20天，其中一部 分用加在10μl赋形剂中的105IU小鼠IFN-α/β，另一部分单独采用 10μl赋形剂(对照组)。

50％经in/or途径用IFN治疗的动物存活，而且在接种高转移性 Friend红白血病细胞后存活100天以上。30％经in/or途径用IFN治疗的 动物存活，并且在用L1210淋巴瘤细胞攻击后存活100天以上。临床 观察提示，如果不杀死动物，所有经IFN治疗存活100天的动物具有 正常的寿命。对器官的组织学检查表明不存在残留的肿瘤。相反， 所有未治疗动物和对照组动物分别在受Friend红白血病细胞攻击后 的第13天死亡或在受L1210淋巴瘤细胞攻击后的第14天死亡。

这些结果是特别有意义的，因为这两种肿瘤细胞都是有高度攻 击性的，而且所用的攻击剂量相当于LD50的大约20,000倍。此外， Friend白血病和LR10淋巴瘤是完全不同的肿瘤类型，其中Friend白血 病细胞携带一种反录病毒即Friend白血病病毒，而L1210淋巴瘤则与 任何已知病毒病原学无关。用in/or IFN-α治疗已接种L1210淋巴瘤 的动物所得到的结果似乎等于甚或优于在该模型中用IFN-α系统治 疗所得到的结果(I.Gresser，来公布的结果)。在我们的澳大利亚临 时专利申请No PN 9765中所报导的我们以前的研究中，接种了Friend 白血病细胞并用100或1,000IU的IFN-α治疗的小鼠无一存活，而且 以10,000IU的剂量治疗只有10-20％的动物被认为是被治愈的。

实施例3：高剂量IFN-α对受高转移性B16黑色素瘤细胞或EL4肿瘤 细胞攻击的小鼠的影响

用105个B16黑色素瘤细胞或105个EL4肿瘤细胞静脉内攻击每组 10只6周令的C57B1/6小鼠。接种后，这些小鼠一部分留下不作治疗， 另一部分经in/or途径进行治疗，每天治疗两次，治疗20天，其中一 部分用加在10μl赋形剂中的105IU小鼠IFN-α/β而另一部分单独采 用10μl赋形剂(对照组)。

30％经in/or途径用IFN治疗的动物存活，而且在接种高转移性 B16黑色素瘤细胞或EL4肿瘤细胞之后存活100天以上。相反，未经 治疗的动物和对照组动物则分别在受B16黑色素瘤细胞攻击后第20 天和在受L4肿瘤细胞攻击后第22天死亡。临床观察提示，即使在第 20天时停止干扰素治疗，如果不杀死动物，在第100天还活着的所 有经过IFN治疗的动物仍将存活下去。对器管的组织学检查表明， 在第100天杀死的经干扰素治疗的动物体内没有残留的肿瘤。

实施例4：口粘膜给药的干扰素对抗疱疹口腔炎病毒的效果

用10μl体积100LD50的疮疹性口腔炎病毒(VSV)(tovey等人， Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1974，146：406-415)鼻内感染来自无特异 病原体繁殖群体的数组10只6周令小鼠。病毒感染后几小时一部分 小鼠留下不作治疗，另一部分经鼻内/口途径进行治疗，每天1次， 治疗4天，其中一部分用加在10μl Ferimmune赋形剂中的给定剂量的 干扰素α/β进行治疗，而另一部分只用10μl Ferimmune赋形剂(对 照组)。

用鼠干扰素α/β治疗成年鼠导致受致死剂量VSV感染的动物 存活的百分率显著提高。因此，在未治疗的或只用赋形剂进行对照 治疗的受病毒感染的动物在第10天死亡的条件下，30％经10,000IU 干扰素α/β治疗的动物在感染致死量的VSV后的第21天仍存活。临 床观察提示，大多数经干扰素治疗在第21天还活着的动物将继续存 活。

实施例5：口粘膜给药的干扰素对细胞的蛋白质表达式的影响

已知IFN-α在将蛋白质与其细胞表面受体结合后诱导许多细胞 的蛋白质表达式。有人认为这些蛋白质提供有用的IFN作用标志。

我们评价了通过in/or途径给药的IFN对三种IFN诱导的蛋白质 (即I类MHC抗原、LY 6A/E抗原和2’-5’-寡腺苷酸合成酶)表达式 的影响。

在经腹腔给药仅20IU Mu IFN-α就在外围血液单核细胞和粒细 胞上显著增加H-2-Kd抗原表达式的条件下，经in/or途径用高达 20,000IU的Mu IFN-α治疗DBA/2小鼠(H-2Kd)并不显著地增加外 围血液淋巴细胞、单核细胞或粒细胞上的H-2-Kd表达式。单核细胞 上的表达式确实略微受到抑制。

同样，通过in/or途径用高达20.000IU的Mu IFN-α治疗小鼠对 Ly6A/E抗原的表达式没有显著的影响，而该抗原表达式在经胃肠道 外途径用I型IFN治疗后在各种淋巴样细胞的表面上被显著增强 (Damout等人，J.Immuno1.，1986，137：201-210)。通过in/or途径用200 或20,000IU的Mu IFN-α或Hu IFN-α1-8获得相似的结果。

用只有20 IU的Mu IFN-α经腹腔注射治疗Swisss小鼠或DBA/2 小鼠，结果是在外围血液单核细胞或脾细胞两者中2′-5′-寡腺苷酸合 成酶的活性显著增加。相反，在同一实验中通过in/or途径用高达 20,000IU的Mu IFN-α治疗小鼠没有显著地增加2′-5′-寡腺苷酸合成 酶活性的表达式。另外，经in/or途径用200或20,000IU的Mu IFN-α 或MU IFN-α1-8进行治疗在开始IFN治疗后长达10天的时间里任何 时候对2′-5′-寡腺苷酸合成酶的活性都没有显著影响。

实施例6：口粘膜给药后干扰素的生物利用率

为了检验IFN的生物利用率和药物动力学，用125I可能标识到最 高比放射性的高单次剂量重组IFN-α来治疗药物-血液体积比最有 利于这些研究的小鼠。

将70×106IU Hu IFN-α1-8的纯制剂重新溶解在1.4ml的PBS中， 并且象Mogensen等人介绍的那样(Int.T.Cancer，1981，28：575-582) 采用Hunter和Greenwood介绍的改良氯胺T法(Nature，1962， 194：495-496)进行碘处理。

125I标记的Hu IFN-α1-8(批号CGP35269-1)在受VSV攻击的人 体WISH细胞上检测时呈现2×107IU/ml的生物学活性，而在受VSV 攻击的小鼠L929细胞上检测时呈现1×106IU/ml的生物学活性。

6至7周令的雌性Swiss鼠用相当于1×106鼠IU的2×107IU125I Hu IFN-α1-8(1.0369×107cpm/小鼠)经iv、ip注射或经in/or途径治 疗。在指定的时间点，每组杀死3只鼠，收集血液并确定体积。分 离并收集动物的肾、肝、肺、脾和胃/食管，打上印迹，并称重，精 确到±0.1μg。利用γ-计数器分别确定每个样品的放射性。然后，借 助离心(800g×10分钟，4℃)分离全血，收获血清，记数并在-80 ℃下冷冻。然后，如上所述利用标准的生物检定法在人体WISH细胞 和小鼠L929细胞上检测血清的IFN含量。然后，借助亲和层析法分 离存在于血清样品中的放射性物质，并借助SDS-PAGE法进行分析。

在每只鼠静脉注射1.0369×107cpm带125I标记的Hu IFN-α1-8之 后5分钟，在动物的外围血液中检测到非常高水平的放射性(＞2× 106cpm/ml)。在第15分钟和30分钟，存在于全血中的放射性两逐 步降低。腹腔注射1.0369×107cpm的125I HU IFN-α1-8之后5分钟， 在动物的外围血液中检测到的放射性的水平大约比静脉注射后检 测到的低20倍。在注射后第15和30分钟的放射性水平逐步增加。在 经in/or途径完成125I IFN-α1-8给药后第5、10或15分钟在动物血液中 检测到的放射性水平显著低于在腹腔注射相同剂量带放射标记的 IFN之后的给定时刻经定时间检测到的放射性水平。就所有三种给 药途径而言，经in/or完成带125I标记的IFN-α1-8给药后，在血清中检 测到的放射性水平比在全血中检测到的高。与同样体积的血清相 比，每毫升全血中检测到的放射性水平较低反映出在去掉全血中细 胞成分之后计数的血清有效体积较大。

采用上述的标准生物检定法检测研究中所有的小鼠血清样品以 确定有生物活性的IFN存在，结果表明在所有试验的时间点上，静 脉或腹腔注射125I Mu IFN-α1-8的所有动物的血清中都有容易检测 的有生物活性的IFN。反之，在经in/or途径完成IFN给药后在任何试 验的时间点在所有动物的血清中都没有检测到带生物活性的IFN， 尽管在这些动物的血清中有较高水平的放射性存在。

为了确定在经125I Mu IFN-α1-8治疗的动物血清中检测到的放 射性物质是否确实代表天然IFN，样品用蛋白质A-G琼脂糖进行免疫 沉淀，以便将存在于样品中的免疫球蛋白沉淀出来，用亲和纯化的 多克隆抗干扰素-α的抗体处理后再次进行免疫沉淀。然后，对样品 进行上述的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。

对静脉或腹腔注射125I MU IFN-α1-8后血清中放射性物质进行 的SDS-PAGE分析揭示出一条均匀的迁移带，其中电泳迁移率与未 注射125I MU IFN-α1-8的完全一致。估计该物质的表现分子量约为 20000道尔顿，它与天然的Hu IFN-α1-8的分子量完全相符。完全相 符。反之，来自经in/or用125I Mu IFN-α1-8治疗的小鼠的血清样品无 一包含任何表观分子量与天然IFN的分子量相似的物质，既使在每 个凝胶上加入完全相同量的放射性物质。

带放射标记物质的组织分布揭示：在静脉注射125I Mu IFN-α1- 8后5分钟，动物的肾脏中有非常高水平的放射性，在肝、肺和脾脏 中也有高水平的放射性。随后发现存在于这四个器官中的放射性水 平在15和30分钟逐渐降低。相反，在15和30分钟时，胃中的放射性 水平逐渐增高，达到与静脉注射后30分钟时动物血清中存在的放射 性差不多的水平。

借助腹腔注射完成125I Mu IFN-α1-8给药导致在15分钟内受检 的所有组织中放射性均达到峰值水平，接下来在第30分钟降低。类 似地，经in/or途径完成125I Hu IFN-α1-8给药导致在15分钟后被研究 的所有组织中的放射性均达到峰值水平，30分钟时存在的放射性水 平有些下降。经in/or途径完成125I Hu IFN-α1-8给药后存在于胃/食管 中的放射性水平比在任何其他器官中检测到的水平高一个数量级， 而且显著高于借助静脉或腹腔途径完成同样剂量的带放射标记的 Hu IFN-α1-8给药后存在于这些组织中的放射性水平。

实验例7经鼻内/口给药后干扰素的药物动力学

为了准确地测定Hu IFN-α1-8的药物动力学，以每只小鼠1.0369 ×107cpm的剂量用125I HU IFN-α1-8经iv、ip或in/or途径给小鼠治疗， 并在24小时期间内的一系列时间点测定在全血和血清中存在的放 射性水平。

静脉注射后存在于小鼠血液中的125I标记的Hu IFN-α1-8的药物 动力学曲线十分接近对数清除曲线。这个结果与以前利用密切相关 的分子(即重组人αA/D(Bg1))进行的小鼠研究(Bohoslawed等 人；J.IFN Res.，1986，6：207-213)的结果相符。根据浓度时间曲线 下的面积计算出的生物可利用物质的量也与人αA/D的那个量相 似。静脉注射125I HU IFN-α1-8后观察双相对程清除曲线(其为通 过肾脏清除的物质的特征)，结果与实施例6的结果一致。腹腔注 射后，带125I标记的IFN-α1-8的药物动力学与以前报导的肌肉注射 IFN的结果十分相似。

静脉或腹腔注射带125I标记的IFN-α1-8后，在所有动物的血清 中存在很容易检测到的有生物活性的IFN。

1、抗肿瘤活性的讨论

因为Friend红白血病细胞(FLC)在静脉注射后对肝和脾脏都表 现出很高的恶性程度和转移性，所以Friend红白血病模型构成非常 严格的抗肿瘤活性临床前试验。使用该模型得到的结果确实是采用 胃肠道外途径注射IFN-α治疗人类肿瘤的基础。因此，在这项研究 进行的全部试验中，所有末经治疗的和用对照制剂治疗的动物均在 10至11天死亡。如果不作治疗，仅仅注射4或5个FLC细胞就会杀死 小鼠。相反，某些经口粘膜途径用鼠IFN-α治疗的动物在接种105 个FLC后仍然存货100天以上，并且可以认为它们已被治愈。

的确，根据以前的工作判断，经口粘膜途径给药的IFN-α似乎 比经胃肠道外给药的环磷酰胺、5-氟尿嘧啶或氨甲喋呤更为有效， 后一途径仅使注射FLC的动物存活时间增加几天(Gresser等人，J. Natl.Caner Inst.，1988，80：126-131)。顺式铂氨、长春花新碱、阿霉 素、博来霉素或表鬼臼毒吡喃葡糖苷等其他药物则对这种肿瘤无效 (Gresser等人，J.Natl.Caner Inst.，1988，80：126-131)。

同样，经口粘膜途径给药的IFN-α在抗FLC方面似乎比全身给药 的IL-1β、IL-2和INF-α等其他细胞因子更为有效，这些细胞因子在 该模型中只表现出很小的活性。

以前的工作已显示，在该模型中胃肠道外给药的IFN是最有活 力的抗肿瘤药物之一，而且即使肿瘤已经转移到肝中才开始IFN治 疗也是有效的(Gresser等人；Intl.J.Caner，1987，39：789-792)。目 前的结果表明IFN经口粘膜途径给药同样甚至更有效。

在淋巴瘤确诊后开始治疗时，每天IFN-α与单次剂量的环磷酰 胺一起注射与单独用其中任何一种药剂治疗的动物相比显著地增 加了患淋巴瘤的AKR小鼠的存活期(Gresser等人；Eur.J.Cancer， 1978，14：97-99)。在各种临床前动物肿瘤模型中也已报导了成功地 用IFN-αZβ和BCNU、顺式铂氨(cis-DDP)、氨甲喋呤、阿霉素和α- 二氟甲基乌氨酸进行联合治疗。还报导了采用5-氟尿嘧啶(5-FV) 和IFN的联合疗法在治疗转移性结肠癌时是十分有益的(Ernstoff等 人；Journal of Clinical Oncology，1989，7：1764-1765)。然而，其他 一些已报导的研究则显示当IFN治疗与环磷酰胺(Marguet等人，Int，J. Cancer，1983，31：223-226；Lee等人，Biochern.Pharmacol.，1984 33： 4339-3443)、阿霉素(Blackwill等人，Cancer Res.，1984 44：904-908) 或5-FU(Marquet等人，1985 109：156-158)，即那些已证明与胃肠道 外IFN治疗联合使用可发挥有利作用的药物结合反而降低了抗肿瘤 活性。使用本文描述的方法可以很容易地试验出IFN与其他化学疗 法的组合。

白介素-1(IL-1)与IFNα/B结合的疗法对注射了FLC的小鼠可 产生协同抗肿瘤效果(Belardell等人，Int.J.Cancer，1991 49：274- 278)。同样的疗法对Eb淋巴瘤地转移性变体(p11-R-Eb)也发挥 显著的抗肿瘤效果，而单独使用其中任何一种药剂都没有效果 (Gabriele等人，Invasion Metastasis，1993 13：147-162)。在所有受试 的细胞因子中，已发现IL-1在与I型IFN胃肠道外给药治疗结合时是 最有效的。

将血管生成抑制剂AGM-1470[(氯乙酰)-氨基酸(3R-(3α，4α(2R*， 3R*)，5β，6β))-5-甲氧基-4-(2-甲基-3-(3-甲氧基-2-丁基)环氧乙基-1- 氧杂螺(2，5)辛-6-基脂]与IFN-α/β一起给药的联合疗法与单独用其 中任何一种药剂的疗法相比显著地增加了抗肿瘤效果(Brem等人，J. Pediatric Surgery，1993 28：1253-1257)。

业已发现，高体温将提高IFN-α/β对Lewis肺癌的抗肿瘤作用 (yerushalmi等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1982 169：413-415)。精氨 酸丁脂也已表明可增强IFN-α的抗肿瘤作用(Chany and Cerutti，Int，J. Cancer，1982 30：489-493)。对于给定类型和剂量的IFN比较经口粘膜 途径给药与系统给药(静脉注射)两者所获得的保护程度，结果表 明在某些病例中IFN经胃肠道外给药比口粘膜给药或多或少地更有 效一些，而在另一些病例中则不然。

2、抗病毒活性的讨论

虽然在经in/or途径完成125I IFN-α 1-8、Mu IFN-α/β和Mu IFN- α给药之后不能在动物的血清中检测到抗病毒活性，但仍可在这些 动物中观察到对抗致死量EMCV感染的统计学上有意义的保护作用 (表1)。

我们在明确定义的急性病毒感染的临床前模型中所获得的结果 提供明确的证据，以支持将高剂量口粘膜IFN治疗用于人全身性病 毒急性感染的“原理的验证”，并且表明在这个模型中多种IFN-α 子型的天然混合物和单一重组的IFN-α异型(如Mu IFN-α)两者 都发挥统计学上有意义的抗病毒活性。天然的Mu IFN-α/β和Hu IFN-α1-8经口粘膜给药时似乎是同等有效的。重组Mu IFN-β和Mu IFN-γ也显示有相似的抗病毒活性。

将经口粘膜途径完成给定类型和剂量的IFN给药时所得到保护 程度与全身给药(腹腔注射)后所得到的结果相比较，结果表明在 某些病例中IFN经胃肠道外给药在某种程度上比经口粘膜给药更有 效，而在其他病例中则不然。

                                        表1

            用125I-IFN-α单一治疗对注射EMCV的Swiss小鼠存活率的影响 治疗组       剂量           途径                          存活的动物数/组                            (注射后天数)  3      4      5      6      7      8      9      10     15     30 未治疗 Hu IFNa 1-8  1.4×105IU    in/or Mu IFN-a/b   6.4×104IU    in/or  6/6    4/6    2/6    0/6  6/6    5/6    4/6    3/6    1/6    1/6    1/6    1/6    1/6    1/6  6/6    5/6    5/6    4/6    3/6    2/6    2/6    2/6    1/6    1/6

           用Mu IFN-α单一治疗(每天一次治疗4天)对注射EMCV的Swiss小鼠存活率的影响 治疗组      剂量      途径                           存活的动物数/组                            (注射后天数) 3       4       5      6      7      8      9       10     15      30 未治疗 Mu IFN-a    2104IU   in/or 10/10   9/10    4/10   0/10 10/10   10/10   10/10  10/10  10/10  10/10  10/10   9/10   7/10    7/10

3.一般性讨论

生物标志试验研究的结果非常清楚地表明三种受试的生物 标志(I类MHC抗原、Ly6A/E抗原和2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性) 都没有充分地反映出经口粘膜途径给药的IFN-α所呈现的非常 显著的生物活性(例如，抗肿瘤和抗病毒活性)。

继腹腔内(ip)注射少至仅20IU的IFN-α之后开始的所有试 验中观察到三种IFN诱导的全部蛋白质的表达式中都有非常显 著的增加，而多达20,000IU的IFN-α经口粘膜途径给药后却没 有任何可测量的效果，两者之间的反差是显著的。

虽然我们不能排除在较早的或中间的时间点上有可能观察 到对一种或另一种生物标志的影响，但是，这种情况似乎是不 可能的，因为IFN影响这些蛋白质的基因代码的转录，因此人 们在IFN治疗后只有经过很长的时间才可能看到对这些生物标 志的影响。

另外，虽然我们不能排除在用IFN-α经口粘膜途径治疗后 观察到对许多其他IFN诱导的蛋白质之一的全身性影响，但这 似乎不可能，因为这将意味着差动调节某些IFN诱导的基因的 表达式。然而，完全有可能在IFN-α经口粘膜途径给药后在局 部(例如在鼻淋巴细胞中)观察到对IFN生物标志的影响。

与对所研究的生物标志没有可检测的影响相符，即使在用 高达20,000IU的IFN-α治疗的动物中也没有观察到对任何在 IFN经口粘膜给药治疗期间所监测的血液学或血液化学参数的 一致影响。

药物动力学-生物活性研究的结果很清楚地表明：采用比以 前所用方法敏感一个数量级的检测方法，在外围血液中没有可 检出的IFN循环的条件下，单次量的带放射性标记的Hu IFN-α 1-8经口粘膜给药后可获得统计学上有意义的抗病毒效果。与这 些结果相一致，经口粘膜给药的IFN发挥抗病毒活性的程度似 乎遵循经典的剂量-反应关系。

在带125I标记的IFN-α1-8经口粘膜给药之后在动物的全血 和血清中都发现容易检测到的带放射性标记的物质。这些结果 与以前研究的结果(即在口服大量的未带标记的IFN后在动物 的血清中仍未检测出IFN)恰好相反。但是，经口粘膜给药后 在全血和血清中检测出的放射性物质是无生物活性的。此外， SDS-PAGE分析的结果表明这种物质是低分子量的，并且很可 能反映继IFN在胃和小肠中消化之后对降解产物的吸收作用。 在口粘膜给药后带放射性标记的物质的组织分布的分析结果表 明胃中的放射性水平明显地高于受检验的任何其他器官。我们 的结果十分清楚地表明：即使口粘膜给药后带生物活性的IFN 不被吸收，这种疗法仍能在体内发挥有统计意义的抗肿瘤活性。

虽然不希望使观察到的有益作用拘泥于任何已提出的机 制，但我们的结果意味着经口粘膜给药的IFN借助目前尚不明 确的新机制发挥其抗肿瘤作用或抗病毒作用，这种机制不包括 外源给药的IFN的直接作用，或对内源性IFN的诱导作用。没有 可检水平的循环IFN或没有可检水平的受试的三种生物标志都 支持这一观点。似乎这种机制至少可以部分地借助刺激鼻咽腔 和口腔周围丰富的淋巴样组织发挥作用。因为我们已证明经口 粘膜给药的IFN在效力上至少与全身给药的IFN相差无几，所以 我们的试验结果强有力的支持在治疗肿瘤病和病毒性疾病时借 助口粘膜途径完成IFN给药。这对于IFN的临床应用可能有重要 意义。

本领域技术人员可以明确看出，虽然为了清晰和便于理解 已对本发明作了相当详尽的描述，但是不脱离说明书中公开的 本发明的精神和范围可以对本文描述的实施方案和方法作出各 种修饰和改动。