发明背景

成熟哺乳动物的神经，如视神经，损伤后通常不会再生。视网膜 神经节细胞(RGCs)在损伤的神经末端引发萌芽反应，但此生长夭 折了，细胞很快开始死亡(Ramony Cajal，1991)。虽然如此，RGCs 可以通过周围神经移植物再生长的轴突(Aguayo等，1991)，甚至如 果晶状体损伤了，通过视神经本身(Fischer等，2000；Leon等，2000) 或者如果将周围神经片段植入玻璃体而再生(Berry等，1996)。后 面的操作导致眼内出现激活的巨嗜细胞，并且最近显示玻璃体内巨嗜 细胞活性足以允许RGCs通过视神经再生其轴突(Leon等，2000； Yin等，2003)。在培养物中，巨嗜细胞来源的蛋白与玻璃体中的组 成小分子一起，刺激成熟鼠RGCs以依赖cAMP的方式再生轴突(Yin 等，2003)。

与哺乳动物不同，鱼和两栖动物终生可以再生它们的视神经 (Jacobson，1991)。在培养物中，金鱼RGCs最强大的轴突促进因 子是由视神经的非神经元细胞分泌的亲水小分子(＜500道尔顿)。该 分子被称为AF-1(Schwalb等，1995；Schwalb等，1996)。

理解哺乳和非哺乳动物神经元再生的相关因素会帮助开发治疗神 经元疾病可能的疗法。周围和中枢神经系统疾病是广泛存在的，并且 对这些情况中的很多疾病缺乏有效的治疗干预。神经疾病可能是由于 神经元损伤引起的，例如机械损伤或毒性化合物引起的损伤，神经元 不正常的生长或发育引起，或神经元活性的错误调节(例如下调或上 调)引起。

本领域需要可以提高神经元或部分神经系统能力的方法和组合 物，以抵抗伤害、再生和维持需要功能，这可以用来治疗神经疾病。

发明概述

本发明提供对有神经学状况的个体产生神经有益作用的方法和组 合物，该作用包括提高神经元存活，轴突生长，神经元再生或使个体 神经功能正常化。

在某一方面，本发明提供包括给予个体治疗有效量的己糖(例如 甘露糖)或己糖衍生物，因此对个体产生神经有益作用的方法。

在另一实施方案中，本发明通过给予需要该治疗的个体有效量的 己糖或己糖衍生物，对个体神经疾病，包括视网膜和视神经损伤提供 治疗。

在另一实施方案中，本发明进一步包括给予个体cAMP调节剂和 /或巨嗜细胞衍生的因子。

在某一方面，根据本发明将己糖或己糖衍生物给予个体以便己糖 接触个体中枢神经系统的神经元。例如，可以通过将己糖导入脑室、 腰椎区域或小脑延髓池，将己糖给予个体的脑脊液，进入鞘内空间。 在这些情况下，可以将己糖局部给予皮层神经元或视网膜神经节细胞 以产生神经有益作用。

在某一实施方案中，药学可接受的制剂提供持续的释放，给个体 提供至少一周有效量的己糖；或在另一实施方案中，在将药学可接受 的制剂最初给予个体后至少一个月。

实现本发明制剂持续释放的方法包括使用缓慢释放的聚合物胶 囊，生物学易蚀的基质，或输送己糖或本发明其他治疗化合物的输液 泵。输液泵可以置入皮下、颅内或其他医疗需要的位置。在某些实施 方案中，可以使用输液泵通过导管将本发明的治疗因子或组合物运送 到脑脊液或局部需要输送的位置，例如神经元损伤部位或神经变性部 位。

可以将包括己糖衍生物和药学可接受载体的药物组合物按说明包 装，使用药物组合物用于治疗神经疾病。在某一实施方案中，药物组 合物进一步包括cAMP调节剂和/或巨嗜细胞衍生的因子。

本发明的其他特征和优点将在以下详细描述和权利要求中显示清 楚。

附图简述

图1A-B显示来自鼠玻璃体液的低分子因子的轴突促进作用。图 1A显示将正常鼠玻璃体中或晶状体损伤一周后玻璃体中的分子提取 到盐水中，通过超滤分离出小于3kDa的分子，使用金鱼视网膜神经 节细胞检测轴突促进作用。当为最初浓度的1.25％或5％时，低分子 量的提取物象肌苷一样诱导同样多的生长，并且与晶状体是否损伤无 关。通过减掉单独培养基中的生长水平，然后除以阳性对照的净生长 而将生长数据标准化。图1B说明细胞存活。任何操作没有改变每200X 显微镜视野中视网膜神经节细胞的数目。

图2显示低分子量玻璃体衍生因子的特点。

来自玻璃体提取物的低分子量因子(VE＜3)诱导的轴突生长被 嘌呤类似物6-巯鸟嘌呤(6-TG))完全抑制但不被嘌呤转运的抑制 物NBTI影响。这些制剂对金鱼视神经条件培养基来源的小分子因子 AF-1诱导的生长产生相似的作用。相反，肌苷刺激的生长仅被6-TG 部分抑制，而被NBTI完全阻断。

图3A-C显示玻璃体诱导因子在鼠视网膜神经节细胞中以依赖 cAMP的方式刺激轴突生长。图3A显示轴突生长。来自玻璃体的低 分子量因子自身对培养中的鼠视网膜神经节细胞具有小但是显著的轴 突促进作用。加入毛喉素(forsk)或PKA拮抗剂Sp-cAMP-s大大加 强此作用。6-TG强烈抑制此生长。将结果标准化为在单独的培养基 中生长的对照培养物中见到的生长水平(8-12％范围的细胞轴突延 长长度＞两倍细胞直径)。图3B显示细胞存活。检测的试剂中没有一 个改变RGC的存活。与阴性对照相比**p＜0.01；与PKA拮抗剂单 独处理的培养物中的生长相比[***]p＜0.001；与VE＜3加PKA拮抗剂 处理的培养物中的生长相比[++]p＜0.01。图3C显示5％浓度的VE＜3 产生接近最大的反应。与阴性对照相比**p＜0.01；与阴性对照或单 独用PKA拮抗剂处理的细胞相比***p＜0.001。

图4显示提高细胞内cAMP水平不促进金鱼RGCs的轴突生长。 毛喉素或Sp-cAMP-s单独都不不刺激金鱼RGCs的轴突生长和降低 AF-1诱导的生长水平。PKA拮抗剂Rp-cAMP-s或H-89(5μM)不 降低AF-1诱导的生长，尽管更高浓度的H89(20μM)可以。**p＜ 0.01(与单独使用AF-1引起的生长相比下降显著)。

图5A-F说明分离小的玻璃体衍生的生长因子。图5A和B显示 反相HPLC。浓缩来自牛玻璃体的低分子量因子，用95％的乙醇提取， 在C-18反相柱上进行HPLC。轴突促进活性在最早的峰洗脱。图5C 和D显示凝胶过滤层析。在G-10 Sephadex柱上，轴突促进活性作为 包含高水平214nm吸收的物质的连贯的峰洗脱。

图5E和F显示正相层析。使用HPLC在LC-NH2正相柱上分离 来自凝胶过滤柱包含轴突促进活性的峰。轴突促进活性在大多数 214nm吸收的成分之后洗脱出(箭头)。在所有病例中进行金鱼视网 膜神经节细胞生物检测。

图6A-E显示通过质谱鉴别轴突促进因子。图6A和B显示来自 LC-NH2柱的不诱导轴突生长的(6A)和相邻的刺激轴突生长的(6B) m/z范围为140到220的组分进行阴离子状态下的快速原子轰击质 谱。质谱在甘油存在下进行。只有活性组分包含m/z＝179.2(b中的 箭头)的峰。因为阴离子状态的离子质量代表减去一个质子的质量， 活性组分中物质的实际质量预计为180。图6C和D显示来自LC-NH2 不诱导轴突生长的(6C)和相邻的刺激轴突生长的(6D)m/z范围为 230到300的组分进行阳离子状态下的快速原子轰击质谱。质谱在甘 油存在下进行。只有活性组分包含m/z＝273.12和255.13的峰(箭 头)。因为阳离子状态的离子质量代表增加一个质子的质量，并且因 为这些离子可能包括甘油加合物(质量＝92)，出现在活性组分中的物 质的实际质量可能是180.13和162.12。图6E显示来自(6D)进行 了MS/MS分析，m/z＝273物质在甘油存在时阳离子状态下的质谱。 当更高电压处理时，m/z 273的物质产生一个甘油峰(m/z＝93，红色 星号)和m/z＝181的离子(双箭头)，即母体物质减去甘油；大部分 的其他离子代表从181离子连续丢失18amu(m/z＝163，145和127， 箭头)或从181物质的甘油加合物连续丢失18amu(m/z＝255，237， 箭头)。这些结果提示轴突促进因子是方程式为C6H12O6的己糖。

图7A-F显示金鱼RGCs对D-葡萄糖和D-甘露糖起反应再生它们 的轴突。图7A显示单糖引起的生长。在许多受检测的己糖中，只有 葡萄糖(glc)和甘露糖(man)诱导轴突生长。其他检测的单糖包括 myo-inositol(myo-inos)，果糖(fruc)，山梨糖(sorb)，阿卓糖(altrose)， 阿洛糖(all)，古洛糖(gul)，半乳糖(gal)和塔罗糖(tal)，都是50 或100μM并且是右旋构象。

图7B显示细胞存活。甘露糖和葡萄糖对轴突再生的作用与细胞 存活的任何变化无关。图7C显示甘露糖的剂量-反应曲线。甘露糖 对轴突生长的作用在25-50μM饱和，ED50大约是10μM。图7D显 示甘露糖的作用被一种本身无轴突促进作用的因子增强。D-glc本身 仅刺激大约70％的玻璃体提取物中见到的轴突生长水平。稍后从凝胶 过滤柱洗脱出的组分(14-17)本身无活性，但将葡萄糖的活性提高 到玻璃体提取物未分离时的水平。

图7E显示膜通透性cAMP类似物dBcAMP(1mM)不提高葡 萄糖对金鱼视网膜神经节细胞的作用。图7E显示蛋白激酶A抑制剂 KT5720对甘露糖诱导的金鱼神经节细胞生长具有很小的作用。

图8A-E显示不同葡萄糖类似物和抑制剂对轴突生长的作用。图 8A显示通过灭活左旋对映体(100μM)表现出的D-甘露糖和D-葡 萄糖作用的立体特异性。在C-2位置以氨基基团取代羟基基团的葡萄 糖类似物D-葡糖胺(25μM)活性很强，而甘露糖胺不是。2-脱氧 -D-葡萄糖(1mM)、3-O-甲基-D-葡萄糖、甲基-α-或甲基- β-葡萄糖吡喃糖、N-乙酰基-葡糖胺(N-Ac-葡糖胺)或L-海藻 糖没有活性。然而，膜不通透性的葡萄糖和甘露糖的6-磷酸盐(D- glc-6-P，D-man-6-P)诱导微小但统计学显著水平的生长。相对于在 单独的培养基中生长的对照细胞**p＜0.01；相对于阴性对照***p＜ 0.001。图8B显示毛喉素减小D-葡萄糖的作用。毛喉素(10μM)抑 制10μM葡萄糖诱导的生长。相比葡萄糖单独诱导的生长***p＜ 0.001。图8C显示一种不代谢的葡萄糖类似物和葡萄糖转运的抑制剂 3-O-MG，不能阻断葡萄糖(10μM)的作用。葡萄糖转运的另一 抑制剂2-DG，不阻断葡萄糖的作用，但这种作用可能不具备特异性， 因为它还阻断肌苷的作用。图8D显示即是葡萄糖-6-激酶又是己糖 -6激酶抑制剂的甘露庚酮糖(MH，10mM)对葡萄糖或甘露糖诱导 的生长无影响，尽管图8E显示MH降低细胞存活(c/f，每视野中存 活的RGCs)，对细胞生存有害。

图8F显示细胞外100μM的D-葡萄糖-6-磷酸盐和D-甘露糖 -6-磷酸盐刺激中等数量的生长(p＜0.01)，1mM刺激可观的生长。 Y轴和(b)中的一样。相对于在单独的培养基中生长的细胞**p＜0.01， ***p＜0.001；++p＜0.01(相比单独的葡萄糖生存率下降)。

图9A-E显示鼠视网膜神经节细胞以依赖cAMP的方式选择性地 对甘露糖起反应。图9A显示轴突生长。甘露糖诱导少量的、边缘显 著水平的长出，然而毛喉素(5μM)本身产生稍微更大的作用。在 毛喉素存在时，甘露糖诱导的生长显著增加；生理浓度的葡萄糖 (5mM)不会。甘露糖的作用至少和玻璃体低分子提取物的一样大， 并且不因葡萄糖的加入受影响。这些研究在培养基中存在5％胎牛血 清时进行。相比阴性对照p＝0.05，单尾t检验；相比阴性对照**p＜ 0.01，双尾t检验；***p＜0.001；n.s.＝不显著，相比单独毛喉素诱 导的生长。图9B显示细胞存活。甘露糖和毛喉素对轴突生长的作用 不依赖于细胞生存的任何变化。图9C显示在毛喉素存在时成熟鼠 RGCs对甘露糖反应强烈。葡萄糖无活性。除非另外说明，所有糖都 是D构象的。相比阴性对照(*)p＜0.05；相比单独的毛喉素(点线) *p＜0.05，***p＜0.001。图9D显示细胞存活不受任何碳水化合物的 影响。将每块视野存活的RGCs数目按阴性对照数值标准化。图9E 显示活化的巨嗜细胞分泌的蛋白(＞3kDa)提高甘露糖的作用。相比 其他任何条件***p＜0.001。

发明详述

本发明提供对治疗包括神经损害的神经疾病有用的方法和组合 物，对个体产生神经有益作用。方法包括给予个体治疗有效量的己糖 (例如甘露糖)或己糖衍生物。

这里所用的，术语“己糖”包括任何己糖，或其衍生物，它们能 够产生神经有益作用。优选己糖包括D-甘露糖和葡萄糖。术语“己糖 衍生物”指具有一个或更多个与一个或更多个分子羟基共价或离子连 接的残基(例如酯、醚、氨基、酰胺基、磷酸基、硫酸基、羧基、羧 -烷基及其组合物)并能产生神经有益作用的己糖分子。优选衍生物 包括葡萄糖-6-磷酸。术语己糖衍生物包括能够对个体产生神经有 益作用的己糖或己糖衍生物的右旋(D-)和左旋(L-)异构体。己糖 衍生物在本领域是熟知的和商业可获得的。

这里所用的，“神经有益作用”指对神经元、神经系统一部分或 神经系统总体的健康或功能有益的反应或结果。此作用的例子包括神 经元或神经系统的一部分抵抗损害、再生、维持需要的功能、生长或 生存能力的提高。短语“产生神经有益作用”包括在神经系统组分内 产生或实施该反应或改善功能或恢复。例如，产生神经有益作用的例 子包括神经元损伤后刺激轴突生长；使神经元抵抗调亡；使神经元抵 抗诸如β-淀粉样物、氨或其他神经毒素的有毒化合物；抵抗年龄相 关的神经元萎缩或功能丧失；或逆转年龄相关的胆碱能神经支配的丧 失。

术语“cAMP调节剂”包括任何能调节细胞内cAMP数量、生产、 浓度、活性或稳定性，或调节细胞cAMP药理学活性的化合物。CAMP 调节剂可以在腺苷酸环化酶、腺苷酸环化酶上游或下游水平作用，例 如在cAMP本身、在导致cAMP产生的信号途径水平。环化AMP调 节剂可以在细胞内作用，例如在诸如Gi、Go、Gq、Gs和Gt的G- 蛋白水平，或在细胞外作用，例如在诸如G-蛋白偶联受体的细胞外受 体水平。环化AMP调节剂包括诸如毛喉素的腺苷酸环化酶的激活剂； 包括8-溴-cAMP、8-氯-cAMP或二丁酰基cAMP(db-cAMP) 的cAMP不可水解的类似物；isoprotenol；血管活性肠肽；钙离子载 体；膜去极化；刺激cAMP的巨嗜细胞衍生的因子；诸如酵母聚糖或 IFN-γ的刺激巨嗜细胞激活的因子；诸如己酮可可豆碱和茶碱的磷酸 二酯酶抑制剂；特异性的磷酸二酯酶IV(PDE IV)抑制剂；和诸如 沙丁胺醇的β2-肾上腺素受体激动剂。术语cAMP调节剂还包括抑 制cAMP产生、功能、活性或稳定性的化合物，例如诸如环化核苷磷 酸二酯酶3B的磷酸二酯酶。抑制cAMP产生、功能、活性或稳定性 的cAMP调节剂是本领域熟知的，例如在Nano等，2000描述，其内 容在此引用作为参考。

“磷酸二酯酶IV抑制剂”指抑制磷酸二酯酶IV酶活性的制剂。 磷酸二酯酶IV抑制剂的例子是本领域熟知的，包括诸如rolipram(A. G.Scientific，Inc.)，nitraquazone，denbufylline，tibenelast，CP-80633 的4-芳基吡咯烷酮，和诸如CP-77059的喹唑啉二酮。

“β-2肾上腺素受体激动剂”指刺激β-2肾上腺素受体的制 剂。β-2肾上腺能受体激动剂的例子是本领域熟知的，包括沙美特 罗、酚丙喘宁和异丙肾上腺素。

这里所用的，术语“巨嗜细胞衍生的因子”包括任何能对个体产 生神经有益作用的巨嗜细胞衍生的因子。巨嗜细胞衍生的因子包括， 但不限于诸如肿瘤调制素和TGF-β的肽，参见WO01/091783，将 其公开引入此处作为参考。

术语“给予”一个个体包括将药物制剂中的活性成分通过任何用 于输送活性成分到个体需要位置的合适途径分发、输送或应用给个 体，包括通过肠胃外或口服途径输送、肌内注射、皮下/皮内注射、静 脉内注射、口腔内给药、经皮输送和通过直肠、结肠、阴道、鼻内或 呼吸道途径给药。例如，己糖可以通过静脉注射给予昏迷、麻醉或瘫 痪个体，或可以静脉内给予妊娠个体以在胎儿身上产生神经有益作 用。特殊的给予途径可以包括局部应用(例如通过眼药水、膏或放在 眼睑下可侵蚀的制剂、眼内注射进房水或玻璃体液，注射到眼的外层， 例如通过结膜下注射或眼球囊下注射，肠胃外给药或通过口服途径。

这里所用的，语言“接触”意指同时包括使本发明化合物与神经 元接近以便化合物能对神经元发挥神经有益作用的体内或体外方法。

这里所用的，术语“有效量”包括有效数量的、必须的剂量和时 间，以达到需要的效果的量，诸如足够对个体产生神经有益作用的量。 此处指的活性化合物的有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄和 体重以及活性化合物在个体中产生需要的反应的能力变化。可以调整 剂量方案以提供最佳治疗反应。有效量也是活性化合物的治疗有益作 用超过任何毒性或有害作用的量。

活性化合物，例如甘露糖的治疗有效浓度的非限制范围是5μM 到1mM.。在一种优选实施方案中活性化合物的治疗有效浓度是25-500 μM。

活性化合物的治疗有效量或剂量范围可以从大约0.001到30mg/kg 体重，本发明的其他范围包括大约0.01到25mg/kg体重，大约0.1到 20mg/kg体重，大约1到10mg/kg，2到9mg/kg，3到8mg/kg，4到 7mg/kg，和5到6mg/kg体重。熟练技工会知道某些因子可能影响有 效治疗个体需要的剂量，包括但不限于疾患或疾病的严重程度、之前 的治疗、个体一般健康状态和/或年龄和存在的其他疾病。此外，使用 有效量的活性化合物治疗个体可以包括单次治疗或系列治疗。在一个 实施例中，用范围大约0.1到20mg/kg体重的活性化合物治疗个体， 一周一次进行大约1到10周，另外2到8周之间，大约3到7周之 间，或者大约4、5或6周。同样可以理解的是用于治疗的活性化合 物的剂量可以在特殊治疗治疗过程中增加或减少。

术语“个体”意指包括动物。在特殊实施方案中，个体是哺乳动 物、人或非人灵长类动物，狗、猫、马、牛或啮齿动物。

“神经疾病”指包括疾患、疾病或直接或间接影响个体神经系统 正常功能或解剖的情况。可以使用本发明的化合物和方法有效治疗的 发生疾病的神经系统成分包括中枢神经、周围神经、躯体神经、自主 神经、交感和副交感神经系统成分，眼、耳、鼻、口或其他器官内的 神经感觉组织，以及与神经元细胞和结构相关的神经胶质组织。神经 疾病可以是由于诸如机械损伤或有毒化合物损伤的神经元损伤、神经 元不正常的生长或发育或神经元某一活性的错误调节(诸如下调或上 调)引起的。神经疾病可以对神经系统功能产生有害影响，例如感觉 功能(感知体内和外界环境改变的能力)；综合功能(解释变化的能 力)和运动功能(通过启动诸如肌肉收缩或腺体分泌的行动对解释起 反应的能力)。神经疾病的例子包括对周围或颅神经、脊髓或脑、颅 神经的创伤或毒害损伤、创伤性脑损伤、卒中、脑动脉瘤和脊髓损伤。 其他神经疾病包括诸如阿尔茨海默病、阿尔茨海默病相关的痴呆(诸 如皮克病)、帕金森病和其他路易体病、老年性痴呆、亨廷顿舞蹈病、 抽动秽语综合征、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、遗传性运动和感 觉神经病(进行性神经性腓骨肌萎缩)、糖尿病神经病变、进行性核 上瘫、癫痫和Jakob-Creutzfieldt病的认知和神经变性疾病。自主神 经功能性疾病包括高血压和睡眠异常。用本发明的化合物和方法治疗 的还有诸如抑郁、精神分裂、情感分裂性障碍、Korsakoff精神病、 躁狂、焦虑障碍或恐怖症、学习和记忆障碍(例如健忘症和年龄相关 的记忆丢失)、注意缺陷障碍、抑郁症、大的抑郁障碍、躁狂、强迫 观念与行为障碍、精神活性物质使用紊乱、焦虑、恐惧症、惊恐障碍、 双极情感障碍、心因性疼痛综合征和进食障碍的神经精神疾病。神经 疾病的其他例子包括因为感染性疾病(诸如脑膜炎、不同原因的高热、 HIV、梅毒或脊髓灰质炎后综合征)造成的神经系统损伤和神经系统 电损伤(包括接触电或闪电和电惊厥精神疗法的并发症)。在妊娠的 许多阶段和婴儿以及儿童的早期阶段，发育中的神经系统里正在发育 的大脑是神经毒性的目标，本发明的方法可以用于预防或治疗子宫内 胚胎或胎儿、早产婴儿，或需要该治疗的儿童，包括有神经学出生缺 陷儿童的神经学缺陷。进一步神经疾病包括例如哈里森内科学原理 (Harrison′s Principles of Internal Medicine)(Braunwald et al.， McGraw-Hill，2001)和美国精神病协会精神疾病诊断和统计手册 DSM-IV(American Psychiatric Press，2000)列出的疾病，将两者 在此全部引用作为参考。与眼科情况相关的神经疾病包括视网膜和视 神经损伤、青光眼和年龄相关的黄斑变性。

术语“卒中”是本领域所知的，指包括由脑动脉破裂或堵塞(例 如，血凝块)引起的突发意识、感觉和自发运动的下降或丧失。

“创伤性脑损伤”是本领域所知的，指包括对头的创伤性打击引 起脑或相连的脊髓受到损伤，通常未穿通颅骨的状况。通常，最初的 创伤可以导致扩大的血肿、蛛网膜下腔出血、脑水肿、颅内压升高和 脑缺氧，因为脑血流低，这些接下来可以导致严重的继发事件。

术语“生长”包括轴突或树突从神经元伸出的过程。生长可以导 致新的轴索投射或原先存在的细胞突起的延伸。轴突生长可以包括轴 突线性延伸5个细胞直径或更长。神经元生长过程，包括轴索发生， 可以通过用诸如免疫染色的方法检测到的GAP-43表达证实。“调节 轴突生长”是指刺激或抑制轴突生长以对目标神经疾病产生有益的作 用。

术语“CNS神经元”包括脑神经元、颅神经和脊神经。

以下部分进一步详细地描述了本发明的多个方面：

药学可接受的制剂

本发明还提供药物组合物和包括己糖衍生物和药学可接受的载体 的包装制剂。这些药物组合物还可以包括巨嗜细胞衍生的因子和/或 cAMP调节剂。

在本发明的一种方法中，选择性地与巨嗜细胞衍生的因子和/或 cAMP调节剂连接的己糖衍生物(例如甘露糖)，可以在药学可接受 的制剂中给予。该药学可接受的制剂可以包括己糖衍生物和药学可接 受的载体和/或赋形剂。此处所用的，“药学可接受的载体”包括任何 和所有的溶剂、分散介质、包膜、抗菌素和抗真菌剂、等张和吸收延 迟剂等生理学上相容的东西。例如，适于注射到脑脊液的载体。赋形 剂包括药理学可接受的稳定剂和崩解剂。本发明适合任何药学可接受 的制剂，包括，采取大分子复合物、纳米胶囊、微球、或珠子形式的 合成或天然聚合物，以及包括水包油乳剂、微粒、混合微粒、合成膜 囊泡和重新密封的红细胞的脂质基础的制剂。

在某一实施方案中，药学可接受的制剂包括聚合物基质。术语“聚 合物”或“聚合的”是本领域所知的，包含包括重复的单体单位的结 构框架，该单体单位能够运送己糖衍生物以便治疗诸如神经疾病的目 标情况发生。术语还包括诸如合成或天然形成的共聚物和均聚物。也 包括线性聚合物、分支聚合物和交联聚合物。

例如，本发明采用的适合形成药学可接受制剂的聚合物物质包括 天然获得的聚合物，例如白蛋白、藻酸盐、纤维素衍生物、胶原、纤 维蛋白、凝胶和多糖，还有合成聚合物，例如多酯(PLA，PLGA)、 聚乙烯乙二醇、poloxomers、聚酐和pluronics。这些聚合物和包括中 枢神经系统的神经系统是生物相容的，它们在中枢神经系统内是可生 物降解的，不产生任何降解的毒性副产物，并且通过操作聚合物的动 力学特点，它们具有改变活性化合物方式和持续时间的能力。此处所 用的，术语“可生物降解的”指聚合物随时间被酶的作用、被水解作 用和/或个体体内的其他类似机制降解。此处所用的，术语“生物相容 的”指聚合物通过无毒或无害和不引起免疫排斥而与活组织或活的生 物相容。可以使用本领域知道的方法制备聚合物。

可以象U.S.专利4,883,666所描述的那样通过在液化的聚合物中 分散活性化合物制造聚合物制剂，将该专利的教学在此引用作为参 考，或者通过描述于Odian G.，Principles of Polymerization and ring opening polymerization，2nd ed.，John Wiley&Sons，New York，1981 的诸如本体聚合、界面聚合、溶液聚合和环聚合的方法形成，该内容 在此引用作为参考。通过改变诸如反应温度、聚合物和活性化合物浓 度、使用溶剂的类型和反应时间的参数控制制剂的特性和特点。

活性治疗化合物可以包被在一个或更多药学可接受的聚合物中， 形成微囊、微球或微颗粒，此处使用的术语可以相互交换。微囊、微 球和微颗粒通常是由直径2毫米或更小的球形颗粒，直径通常500微 米或更小，组成的可以自由流动的粉末。小于1微米的颗粒通常称为 纳米胶囊、纳米颗粒和纳米球体。很大程度上，微胶囊和纳米胶囊、 微球和纳米球体、或微颗粒和纳米颗粒的差别在于大小；通常两者的 内部结构差别很小，如果有的话。在本发明的一个方面，平均直径小 于约45μm，优选小于20μm，更优选介于0.1和10μm之间。

在另一实施方案中，药学可接受的制剂包括脂质为基础的制剂。 任何已知的脂质为基础的药物运送系统可在本发明实践中应用。例 如，多囊泡脂质体、多层脂质体和单层脂质体都可以使用，只要能够 实现包被的活性化合物的持续释放速度。PCT申请公开号WO 9703652，WO 9513796，and WO 9423697中描述了制作控释多囊泡 脂质体药物运送系统的方法，其内容在此引用作为参考。

合成的膜囊泡的组成通常是磷脂的结合，通常和类固醇结合，特 别是胆固醇。也可使用其他磷脂或其他脂质。

对合成膜囊泡生产有用的脂质的例子包括磷脂酰甘油、磷脂酰胆 碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、神经鞘脂类、脑苷脂和神经节苷 脂，优选实施方案包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂 酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油和二油酰磷 脂酰甘油。

在制备包含活性化合物的脂质为基础的囊泡时应该考虑诸如活性 化合物包被的效率、活性化合物的不稳定性、产生的囊泡群的均质性 和大小、活性化合物比脂质的比例、通透性、制备物的不稳定性和制 剂的药学可接受性的变量。

在引入前，可以使用任何本领域很多可获得的技术，诸如γ射线 或电子束消毒技术将制剂消毒。

局部使用的眼科产品可以包装成多剂形式。因此需要防腐剂以防 止使用过程中微生物的污染。合适的防腐剂包括杀藻胺，硫柳汞，氯 丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、乙二胺四乙 酸二钠盐、山梨酸、polyquaternium-1或其他本领域技术工人所知道 的制剂。通常使用0.001到1.0％重量/体积(“％w/v”)水平的该防腐 剂。可以将该制备物和使用说明一起包装在适于安全应用于眼的点滴 瓶或管中。

药学可接受的制剂的给予

给予本发明药学可接受的制剂以便活性化合物与个体的神经系统 接触以产生神经有益作用。本发明试图进行制剂的局部和全身给予。 局部给予满意的特点包括活性化合物达到有效的局部浓度和避免活性 化合物全身给予的副反应。在一种实施方案中，通过导入个体的脑脊 液给予活性化合物。在本发明的某些方面，将活性成分导入脑室、腰 椎区域或小脑延髓池。在另一方面，将活性成分局部导入，诸如神经 或脊髓损伤部位，疼痛或神经变性部位，或眼内注射以接触神经视网 膜细胞。

可以将药学可接受的制剂悬浮在含水载体中，并通过常规皮下针 或使用注射泵注入。

在一种实施方案中，从中枢神经系统损伤时直到损伤发生后约100 小时内，例如自损伤起24、12、6小时内将此处描述的活性化合物制 剂给予个体。

在本发明的另一实施方案中，将活性化合物制剂通过鞘内给予个 体。此处所用的，术语“鞘内给予”指包括将活性化合物制剂直接输 送到个体的脑脊液中，通过包括经过钻孔(burrhole)或脑池或腰椎 穿刺等的技术进行的侧脑室注射(描述于Lazorthes等，1991，和 Ommaya A.K.，1984，其内容在此引用作为参考)。术语“腰椎区域” 指包括第三和第四腰椎(下腰部)之间的区域。术语“小脑延髓池” 指包括头后部颅骨终止和脊髓开始的区域。术语“脑室”指包括与脊 髓的中央管延续的脑内腔室。可以通过直接注射或使用注射泵注射将 活性化合物制剂给予上述提到的任一部位。可以使用可植入的或外部 泵和导管。

为了注射，本发明的活性化合物制剂可以在液体溶液中配制，优 选在诸如Hank溶液或林格氏液的生理相容性缓冲液中。另外，活性 化合物制剂可以配制成固体形式，并在使用前立即再溶解或悬浮。还 包括冻干形式。注射液可以是，例如丸剂注射形式或持续注射(例如 使用注射泵)活性化合物制剂。

在本发明的一种实施方案中，优选在损伤(导致以中枢神经系统 神经元轴突异常生长为特征的状况发生)发生100小时内(诸如损伤 6、12或24小时内)，通过侧脑室注射将活性化合物制剂给予个体脑 中。可以通过个体颅骨上的钻孔进行注射。在另一实施方案中，优选 在损伤发生的100小时内(诸如损伤6、12或24小时内)，通过手术 插入个体脑室的旁路给予制剂。例如，可以注射到更大的侧脑室，甚 至还可以注射到小一些的第三和第四脑室。仍在另一实施方案中，优 选在损伤发生的100小时内(诸如损伤6、12或24小时内)，通过注 射到个体的小脑延髓池或腰椎区域给予活性化合物制剂。

给予颅内组织的另一方法包括将本发明化合物应用于嗅上皮，随 后传输到嗅球并运送到大脑更近端的部分。可以通过雾化或气雾剂制 剂实现该给予。

在本发明的另一实施方案中，优选在损伤发生的100小时内(诸 如损伤6、12或24小时内)给予，在损伤部位给予活性化合物制剂。

在进一步的实施方案中，本发明的眼科组合物用于预防或降低视 网膜和视神经头部组织的损害，还有促进眼部组织损伤后的功能恢 复。可以治疗的眼科情况包括但不限于视网膜病变(包括糖尿病视网 膜病变和晶状体后纤维组织形成)、黄斑变性、眼缺血、青光眼。使 用本发明方法治疗的其他情况包括眼组织损伤造成的损害，例如缺血 性再灌注损伤、光化学损伤和眼手术相关的损伤，特别是暴露在光线 或手术器材下造成的视网膜或视神经头部损伤。眼科组合物还可以作 为眼科手术的辅助手段应用，例如通过眼科手术后玻璃体或结膜下注 射。可以将化合物用于临时情况的急性治疗，或者可以慢性注射，特 别在变性疾病中。眼科组合物还可以预防性应用，特别是在眼手术或 无创眼科操作或其他类型手术前。

给予的持续时间和水平

在本发明的优选实施方案中，将活性化合物延长时间给予个体以 产生神经有益作用，例如进行轴突生长的调节。与活性化合物的持续 接触可以通过例如在一段时间内反复给予活性化合物实现，例如一 周、几周、一月或更长。更优选的是，用于给予活性化合物的药学可 接受的制剂提供持续释放，例如将活性化合物“缓慢释放”到个体。 例如，在将药学可接受制剂给予个体后制剂可以输送活性化合物至少 一、二、三或四周。优选符合本发明的受治疗个体接受活性化合物治 疗至少30天(通过反复给予或者通过使用持续输送系统，或二者共 同使用)。

此处所用的，术语“持续输送”指包括在给予后一段时间内在体 内持续输送活性化合物，优选至少几天、一周、几周、一月或更长。 可以通过例如活性化合物随时间的持续治疗作用来说明活性化合物的 持续输送(例如可以通过对个体神经有益作用的持续产生说明巨嗜细 胞衍生的因子的持续释放)。另外，可以通过检测体内活性化合物随 时间的存在说明活性化合物的持续输送。

持续输送的优选方法包括使用聚合物胶囊、微量泵输送制剂、 bloerodible移植物或移植的转基因自体细胞(描述于美国专利 6,214,622)。本领域可获得可植入的输液泵系统(例如Infusaid；参见 诸如Zierski，J.等，1988；Kanoff，R.B.，1994)和渗透压泵(Alza 公司卖)。给予的另一模式是通过可植入的、外部可编程的输液泵。 合适的输液泵系统和储存器系统也描述于Blomquist的美国专利 5,368,562和Doan的美国专利4,731,058，由Pharmacia Deltec公司 开发。

需要注意的是剂量值可以随需要缓解的情况的严重程度改变。进 一步需要理解的是对某些特殊的个体，特殊的剂量方案应该随时间根 据个体的需要和管理或监控给予活性化合物的人员的专业判断进行调 整，并且此处设置的剂量范围仅仅是示例，并非想限制发明权利要求 的范围和实施。

在另一实施方案中，本发明提供了基本由己糖衍生物和药学可接 受的载体组成的药物组合物，还有使用它们通过中枢神经系统神经元 和组合物接触调节轴突生长的方法。术语“基本由...组成”指药物学 周围不含任何诸如，例如神经生长因子(NGF)的其他神经元生长的 调节剂。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以作为包装制剂 提供。包装制剂可以包括装在容器内的本发明药物组合物和给予组合 物以对有神经疾病的个体产生神经有益作用的印刷说明。本发明还包 含在生产调节神经元轴突生长的药物时使用己糖衍生物。

体外治疗中枢神经系统神经元

来自中枢或外周神经系统的神经元可以与己糖衍生物在体外接触 以调节体外的轴突生长。因此，使用本领域熟知的技术可以将神经元 从个体分离出来并在体外生长，然后根据本发明进行治疗以调节轴突 生长。简要地讲，通过允许神经元迁移出神经组织碎片依附到适当底 物上(诸如培养皿)获得神经元培养物或通过诸如机械或酶的方法分 散组织产生神经元悬浮液。例如可以使用胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋 白酶、透明质酸酶、DNA酶、链霉蛋白酶、分散酶或其多种组合。 分离神经元组织和分散组织获得分离细胞的方法描述于Freshney， Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique，Third Ed.， 1994(动物细胞培养，基础技术手册，第三版，1994)，将其内容在 此引用作为参考。

该细胞随后可以与如上描述的一定数量的己糖(单独或与巨嗜细 胞衍生的因子和/或cAMP调节剂结合)接触一段时间。一旦实现了 神经元轴突生长的调节，将这些细胞再给予个体，例如通过移植。

筛查检测

可以使用任何许多已知的操作和检测评价己糖对个体产生神经有 益作用的能力。例如，可以通过组织学的方法(通过将神经元组织切 片和观察神经元分叉，或者通过显示胞浆的染料转运)确定己糖衍生 物在诸如中枢神经损伤的损伤后重建神经连接和/或功能的能力。本发 明化合物在诸如中枢神经损伤的损伤后重建神经连接和/或功能的能力 还可以通过监测己糖衍生物在神经视网膜或视神经损伤后全部或部分 恢复视网膜电图的能力，或者全部或部分恢复损伤眼的瞳孔对光反射 来测定。

可以用来确定己糖对个体产生神经有益作用能力的其他检验包括 人类个体或脊髓损伤动物模型的标准神经功能检测(例如标准的反射 检测、泌尿系检测、尿动力学检测、深、浅痛觉感知检测、后肢的本 体感觉定位、行走和诱发电位检测)。另外，可以测量个体的神经冲 动传导，例如通过测量动作电位传导作为产生神经有益作用的提示。

适于本发明检测用的动物模型包括部分横断的鼠模型(描述于 Weidner等，2001)。此动物模型检验化合物如何能很好地提高生存 和促使几乎横断的脊髓剩下的未受损片断萌芽。因此，可以评价这些 动物给予己糖后某些功能的恢复，例如鼠可以如何熟练地使用前臂操 纵食物小丸(相关脊髓已经切了97％)。

另一种适于本发明检测用的动物模型包括鼠卒中模型(Kawamata 等，1997描述)。该文章详细描述了多种可以用于评价损伤后肢体感 觉运动功能和前庭运动功能的测试。将本发明的化合物给予这些动物 可以用来检测给定的化合物、给药途径或剂量是否在受测动物中产生 神经有益作用，例如提高功能水平，或提高重获功能的速度，或功能 保持程度。

用于检验卒中后人类患者进展的标准神经学评价也可用于评价已 糖在个体中产生神经有益作用的能力。该标准神经学评价在医学领域 是常规的，描述于例如Mohr和Gautier编辑的“临床神经病学指导” 中(Churchill Livingstone Inc.1995)。

评价周围神经系统功能的标准检测包括肌电图、神经传导速度测 量、诱发动作电位测量和上/下肢躯体感觉诱发电位。肌电图检测记录 肌肉的电活动，用于评价神经和肌肉的功能。将电极插入肌肉以记录 其电活动。它记录插入时、肌肉静止和收缩时的活动。神经传导速度 检测通过记录电冲动多快地通过周围神经来评价它的健康。周围神经 在脊髓和肌肉之间传导信息。许多神经系统疾病可能降低这一冲动的 速度。放置在皮肤上的电极检测和记录冲动沿神经传输后的电信号。 第二刺激电极沿神经发出一个小的电荷，记录刺激和反应间的时间以 确定冲动发放多么迅速和彻底。

神经医学领域熟练人士所知的颅神经功能的标准检测包括面神经 传导研究、眼轮匝肌反射研究(瞬目反射研究)、用于面部面神经损 伤的三叉神经-面神经反射评价、贝尔麻痹(面神经麻痹)、三叉神 经痛和不典型面部疼痛、诱发电位评价；视觉、脑干和听觉诱发电位 测量；温度诊断性小纤维检测和计算机辅助定量感觉检测。

本发明进一步通过以下实施例说明，这不应该理解为进一步的限 制。此申请引用的所有参考、专利和已公开的专利申请的内容在此处 引用作为参考。

实施例

实施例I.视网膜神经节细胞反应于己糖治疗而延伸轴突

按照其内容在此引入作为参考的PCT申请系列号 PCT/US98/03001所描述的制备金鱼视网膜神经节细胞，与诸如甘露 糖的己糖衍生物接触。按照PCT申请系列号PCT/US98/03001所描述 的监测己糖衍生物刺激金鱼视网膜神经节细胞轴突生长的能力。

实施例II方法

从大鼠鼠玻璃体提取低分子量因子。将鼠玻璃体中的分子提取到 生理盐水中(1.5ml盐水中含8个玻璃体，混合过夜，4℃)。玻璃体 来自于200-250g的正常成年雄性Fisheer鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)，或者来自晶状体损伤7天后的鼠， 该时刻我们看到晶状体损伤后RGC中GAP-43上调的明显证据(Leon 等，2000)。使用描述的30G针进行晶状体损伤(Leon等，2000)。 玻璃体提取物通过22μm的低蛋白结合滤器(Pall Life Sciences，Ann Arbor，MI)以去除细胞碎片；  经过3kDa分子量截断(MWCO) 的膜进行超滤分离低分子成分。

按生理盐水与玻璃体液体积比4∶1的比例从新生小牛眼中提取 牛玻璃体液。提取在4℃进行。同上，提取液经过22μM的低蛋白结 合滤器(Pall)，然后经过3kDa截断超滤装置以去除更高分子量的成 分。为确定来自牛玻璃体的小分子物质是否象金鱼AF-1或肌苷一样 促进生长，我们检验了对轴突生长重要的嘌呤敏感激酶的拮抗剂6- 巯鸟嘌呤(6-TG，20μM，Sigma)或嘌呤通过细胞膜转运的拮抗剂 4-(硝基苄基-6-硫代肌苷)(NBTI，20μM，Aldrich Chemicals) 存在或缺失时它的活性。

条件培养基的分步分离。为浓缩活性因子和去除无机盐，将牛玻 璃体的低分子量提取物冻干并用95％乙醇提取(原始样品体积的16 ％，4℃，频繁涡流，1小时)。将乙醇可溶部分冻干，重新溶解在400 μl水中，加样到C18反相HPLC柱(Delta Pak 5μC18 100A，Waters， Milord，MA：0.5ml/min)。缓冲液A是水溶液中0.1％的三氟醋酸 (TFA)，而缓冲液B是在比例3∶2∶2的异丙醇、乙腈、水混合液 中0.08％的TFA。洗脱梯度是0％B2分钟，然后0-100％的B42分 钟。对代表2分钟处的组分池进行生物鉴定。

使用1.6cm×48cm的Sephadex G-10柱(Sigma)通过凝胶过 滤层析进行进一步的分离。此柱分离700道尔顿以下的分子。将样品 浓缩20倍，通过离心去除不溶成分，将包含所有生物活性的可溶部 分(未显示)以0.5ml的体积加样。使用蠕动泵在0.3ml/min的压力 下走柱。收集4.5ml组分，在大约样品原始浓度5％的浓度下进行生 物鉴定。

使用正相HPLC柱(Shodex aminopropyl，Thomson Instruments， Oceanside，CA)进行最后阶段的纯化。将来自G-10柱包含轴突促 进活性的组分冻干，并在200μl 80％的乙腈中再溶解。在用75％乙 腈预平衡柱后，以1ml/min的流速加样。收集1ml的组分进行生物鉴 定。

金鱼视网膜神经节细胞培养。在使用分离的金鱼视网膜神经节细 胞(RGCs)的生物鉴定中确定最初的哺乳动物Af-1特点。简要地讲， 使金鱼彗星变种(Mt.Parnell Fisheries，PA)适应暗光，冷却到4℃， 通过颈椎横断处死。解剖视网膜并在木瓜蛋白酶中孵育分离，随后通 过一系列的研碎步骤获得富含RGC的细胞悬液(Schwartz& Agronoff；Schwalb等，1995)。每孔含大约500个RGCs，和待测 的试验样品一起放在确定好的含Leibovitz′L15培养基(Gibco BRL) 加N1和N2补加物(Bottenstein，Saito)、抗氧化剂和牛血清白蛋白 的无血清培养基中，象其他地方详细描述的那样(Schwalb等，1995)。 在每种实施方案中，每种样品含四孔，以盲法分布在24孔板中，使 评价轴突生长的人员不知道每孔中的样品类型。实施方案包括一个阳 性对照(预先验证的金鱼AF-1或肌苷)和一个阴性对照(单独的确 定好的培养基)，同样以四等份不公开的方式分布在板上。21℃下培 养6天后，在每孔大约150个连续遇到的RGC中评价轴突生长，该 轴突生长操作性地定义为轴突延伸长度＞5细胞直径的RGCs百分比。 通过将每个样品四孔中的轴突生长平均，减去阴性对照中的生长水平 (通常为3-5％)，用阳性对照中的净生长(通常为20-40％)标准 化进行数据分析。数据以标准化的均值±标准误(means±SEM)表 示。所有试验至少重复3次。

鼠视网膜神经节细胞培养。通过用Fluorogold (FG：Fluorochrome，Inc.)逆行标记鉴定视网膜神经节细胞。为此， 麻醉成年雄性Sprague-Dawley鼠，放置在立体定位仪上，通过去掉 上层的大脑后部皮质暴露上丘。将FG注射到双侧上丘的几处位置。 另外，将一小片注入FG的明胶海绵(Upjohn，Kalamazoo，MI)放 置在上丘上面，关闭头皮伤口，皮肤缝合关闭。等7天使FG沿视神 经逆行转运后，处死鼠，取出眼，解剖视网膜。使用木瓜蛋白酶处理 随后研碎分离视网膜。将每孔含100-150个FG标记的RGCs的混 合培养物放在24孔板中，在确定好的无血清培养基(含NaHCO3的 极限必需培养基)，37℃下，5％的CO2中保持3天。

象金鱼培养物一样，所有样品检测四份并以随机方式分布在培养 皿上。如上所述对数据进行统计处理。

质谱分析。在密歇根州立大学质谱分析设备处使用阳性或阴离子 状态下操作的JEOL HX-110双聚焦质谱仪(JEOL USA，Peabody， MA)获得FAB质谱。使用氙原子束(6keV)轰击产生离子。加速电 压为10kV，分辨率设在3000。对于FAB-CAD-MS/MS，使用氪作为 位于第一无场区域中细胞内的碰撞气体。调整氪压使母离子数量降低 50％。数据系统以磁场对电场(B/E)的恒定比值产生相连的扫描。 仪器从m/z50到2000扫描。显示的光谱来自单次扫描。

结果

一种小的轴突刺激因子组成型存在于哺乳动物玻璃体中。晶状体 损伤刺激视网膜神经节细胞在体内沿视神经再生受损的轴突(Leon 等，2000)。为研究可能刺激此生长的因子，我们在盐水中提取存在 于正常玻璃体或神经挤压或晶状体损伤一周后玻璃体中的分子。通过 超速离心分离小于3kDa的分子，使用金鱼视网膜神经节细胞作生物 鉴定而检测轴突促进活性(Schwalb等，1995；Benowitz等，1998)。 稀释80倍时，低分子量提取物显示全部活性，不管晶状体是否已损 伤(图1)。此浓度的十分之一无效(数据未显示)。

小的轴突促进因子存在于牛玻璃体中，行为类似金鱼XF-1。为 分离足够数量的小分子生长因子和分析其结构，我们研究它是否存在 于牛玻璃体中。当检测80倍稀释物时，牛玻璃体提取物的低分子量 成分(VE＜3)和金鱼衍生的AF-1一样诱导同样多的金鱼RGCs生长 (图2)。为确定玻璃体衍生因子是否象AF-1一样工作，我们检测它 的能力是否能被6-巯鸟嘌呤或NBTI两种制剂之一阻断，6-巯鸟嘌 呤非竞争性地阻断AF-1对生长的作用但对肌苷是竞争性的(Petrausch 等，2000)，NBTI是嘌呤通过细胞膜转运的抑制剂，阻断肌苷作用但 不降低AF-1的活性(Benowitz等，1998)。NBTI对VE＜3或AF-1 诱导的生长作用很小，但有效阻断肌苷诱导的生长。相反，6-TG使 VE＜3或AF-1诱导的生长低于基线水平，但仅部分阻断肌苷的作用(图 2)。因此，来自玻璃体的低分子量因子行为象金鱼的AF-1。

小的玻璃体衍生因子以依赖cAMP的方式刺激成年鼠RGCs的轴 突再生。分离成年鼠视网膜，按材料和方法中描述的进行培养；依靠 制备培养物之前进行Fluorogold逆行标记鉴定RGCs。在没有其他因 子的前提下，3天后大约5％-8％的RGCs轴突延伸长度大于两个细 胞直径。Forskolin或膜通透性的不能水解的cAMP类似物Sp-cAMP 引起的细胞内cAMP升高对生长影响很小。来自玻璃体的低分子量提 取物自身刺激很少但水平显著的生长(p＜0.01)，将此小分子物质和 毛喉素或Sp-cAMPs结合大大加强了此作用(图3a：将低分子量因子 加上毛喉素或Sp-cAMPs之一和任何一种独自诱导的生长相比较 p＜0.001)。象如上显示的金鱼RGCs，6-TG降低低分子量因子加毛 喉素(p＜0.01)或低分子量因子加Sp-cAMPs(p＜0.05)诱导的生 长。因此，来自玻璃体的低分子量因子刺激鼠RGCs以依赖cAMP的 方式延长轴突。象金鱼RGCs的轴突生长一样，通过嘌呤敏感机制介 导生长。低分子量片断的作用与细胞生存的任何变化无关(图3b)。 最大的作用甚至在当VE＜3稀释到玻璃体中原始浓度的4％时获得(图 3c)。

与鼠RGCs不同，即使细胞内[cAMP]I没有增加，金鱼RGCs显 示出对VE＜3具有强大的反应(图4)。毛喉素(10μM)或Sp-cAMPs (150μM)本身都不诱导生长，与以前显示的cAMP或cGMP的膜 通透性类似物不刺激金鱼RGCs延长轴突的结果一致(Benowitz， 1998)。当加入到AF-1时，毛喉素和Sp-cAMPs引起统计学不显著的 生长下降。相反，AF-1诱导的生长不被膜通透性、不能水解的PKA 拮抗剂Rp-cAMPs(100μM)或PKA抑制剂H89(5μM)减少。20 μM的H89降低AF-1的作用(p＜0.001)，尽管此浓度的H89影响 除PKA之外的其他激酶。因此，相比鼠RGCs的反应，金鱼RGCs 对低分子量因子的反应是相当少依赖cAMP的。

活性成分的分离。通过冻干法浓缩玻璃体提取物的低分子量组 分，用小体积的95％乙醇提取。去除了大约98％的无机盐导致轴突 促进活性几乎完全恢复(数据未显示)。在反相C18柱分离后，轴突 促进活性不被柱保留，作为最初几分钟大吸收峰的一部分洗脱(图5a， b)。

通过在Sephadex G-10柱上进行的凝胶过滤层析完成进一步的纯 化。轴突促进活性大部分存在于与大的吸收峰重叠的单组分中(165-180 分钟)(图5c，5d)。甚至是高浓度时，此组分仅诱导起始物质60-80 ％水平的轴突促进活性。G-10柱后来洗脱出的物质本身没有活性，当 加回到活性组分时，使它的活性恢复到起始物质的水平(数据未显 示)。当把来自G-10柱的活性组分加样到正相柱(LC-NH2)时，活 性在后面吸收很少的区域洗脱出(图5e、5f)。因此正相层析产生高 度的纯化。活性组分再次刺激相当于阳性对照(起始物质)大约80％ 的生长。浓缩此组分并在同一柱上再次操作，收集与用UV敏感度设 在最高水平的检测仪看到的吸收峰一致的组分。生物鉴定显示生物促 进活性浓缩在9.8分钟洗脱的单峰中(数据未显示)。

通过质谱鉴别活性因子。使用快速原子轰击(FAB)质谱分析阳 离子和阴离子状态下的含轴突促进活性的纯化组分和相邻的无活性 峰。主要结果在甘油存在时获得，并在四乙铵和硝基苯甲酸存在时确 认。在阴离子状态下，活性组分(#17)包含相邻非活性组分(#16) 没有的m/z＝179.2的离子(箭头记号)(图6a，b)。因为阴离子状态 下的m/z值是真实质量减去1个质子，估计活性组分中存在的分子质 量为180。在阳离子状态下，生物活性组分中出现相邻非活性组分没 有的两个峰(m/z＝273.2和255.2：图.6c，d，箭头)。因为阴离子 状态的m/z值含一个额外的质子，预计两个独特的离子质量为272.2和 254.2；然而，如果这些离子代表母体物质的甘油加合物(质量＝92)， 更大离子的质量会是180，类似于在阴离子状态下发现的，它应是162。 进一步通过MS/MS分析阳离子状态下m/z＝273的离子(图6e)证实 甘油(m/z＝93，星号)和180质量(m/z＝181，双箭头)的存在。 MS/MS还产生对应于母体物质减去18的倍数，即163、145和127 的峰(箭头)。后面的这些峰可能代表181离子丢失系列羟基(箭头)， 而m/z＝255和237的峰可能分别代表163和145离子的甘油加合物。 这些结果预示活性分子是分子式为C6HI206(质量＝180)的碳水化 合物。

特殊的碳水化合物诱导金鱼RGCs的轴突再生。根据质谱结果， 我们检测了己糖和相关化合物对培养的RGCs的轴突促进作用。肌- 肌糖、酮糖果糖和山梨糖，和醛糖D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-古洛糖、 D-塔罗糖和D-半乳糖在金鱼RGCs中都不能刺激生长(都在50或100 μM检测，图7a)。然而，两种结构上相关的醛糖，甘露糖和葡萄糖 象通过凝胶-排阻和正相层析法从牛玻璃体提取物中分离的低分子量 因子一样刺激同样多的生长(参见图5d，f)。葡萄糖和甘露糖的左 旋对映体没有活性(数据未显示)。甘露糖引起的生长在25-50μM饱 和，ED50大约是10μM(图7c)。葡萄糖具有类似的剂量-反应曲线 (数据未显示)。如上所述，通过大小-排阻和正相层析分离后，来 自牛玻璃体的生长促进因子仅保留原始活性的60-80％(图5d，f)， 通过加回本身并不引起任何生长的大小排阻柱稍后的组分可以恢复全 部活性。类似地，添加同样的来自大小排阻柱的后洗脱组分到50μM 甘露糖或葡萄糖中使活性提高到玻璃体提取物分馏前的水平(图7d)。 葡萄糖(图7e)或甘露糖(未显示)对金鱼RGCs的作用不被膜通透 性、不可水解的cAMP类似物dBcAMP提高。相反地，蛋白激酶A 抑制剂KT5720在通常有效的剂量1μM时不降低甘露糖的作用，10 μM时仅有轻微作用(图7f)。同样，PKA抑制剂Rp-cAMPs在通常 有效的剂量100μM对葡萄糖诱导的生长没有影响，但当在1mM检 测时阻断48％的生长(未显示)。

这些实施案使用的培养基已经提供了高浓度的半乳糖(5mM)和 丙酮酸(5mM)用于能量代谢并作为碳源。因此微摩尔浓度的甘露糖 或葡萄糖诱导的生长不可能与能量代谢相关。这进一步被添加5mM 用于ATP合成的丙酮酸甲酯到我们培养基中无效的事实说明(数据 未显示)。葡萄糖和甘露糖对轴突生长的作用与能量代谢无关的进一 步证据来自微摩尔浓度的这些碳水化合物对细胞存活没有影响的事实 (图7b)。

为检验观察到的效果的特异性和了解可能的结构-功能关系，我 们检查了几种相关化合物的生物活性。葡萄糖和甘露糖的左旋对映体 完全无活性(图8a)。D-葡糖胺活性很强(p＜0.001)；D-甘露糖胺无 效，2-脱氧-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-葡萄糖、甲基-α-D- 吡喃葡萄糖苷、甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷、乙酰氨基葡萄糖和果 糖也如此。D-葡萄糖和D-甘露糖-6-磷酸刺激相对温和但统计学显 著数量的生长(p＜0.01)。因为这后两种磷酸盐衍生物携带负电荷， 它们不通过细胞膜。这提示葡萄糖和甘露糖可能通过细胞外机制刺激 轴突生长。使用葡萄糖转运抑制剂3-O-甲基葡萄糖(3-O-MG)的 研究为这一可能提供了进一步的支持。在摩尔比为100∶1时，3-O-MG 不能阻断葡萄糖的作用(图8b)。我们还研究了另一种葡萄糖转运抑 制剂2-脱氧葡萄糖(2-DG)的作用。然而在浓度低到1mM时，2- DG对轴突生长具有非特异性的作用，并阻断葡萄糖和肌苷的作用； 肌苷已被显示通过细胞内机制刺激轴突生长(Benowitz等，1998)。 如上所述，AF-1对金鱼RGCs的作用不被使用毛喉素或Sp-cAMP-s 引起细胞内cAMP水平的升高而促进，实际表现为下降(图4)。同 样，添加毛喉素降低葡萄糖对金鱼RGCs的作用(图8c)。

在几种细胞类型中，葡萄糖被糖酵解途径的第一个酶：己糖激酶 的活性或下游代谢物的浓度感知(Rolland等，2001)。在金鱼RGCs 中，尽管对细胞存活有害，葡萄糖-6激酶和己糖-6激酶两者的抑 制剂甘露庚酮糖(mannoheptulose)(MH，10mM)对葡萄糖或甘露 糖诱导的生长没有影响(图8d和8e)。因此，轴突生长的葡萄糖/甘 露糖传感器(sensor)不是糖酵解第一步中相关的激酶，它也不依赖 于6-磷酸盐衍生物或任何下游代谢物的细胞内浓度。甚至当细胞存 活降低的情况下MH不能阻断生长为D-葡萄糖或D-甘露糖的轴突促 进作用与细胞存活无关提供了进一步的证据。

当引入到细胞外时100μM的D-葡萄糖-6-磷酸和D-甘露糖-6- 磷酸刺激中等数量的生长(p＜0.01)，1mM刺激可观的生长(p＜ 0.001)(图8f)。6-磷酸盐衍生物带负电，不通过细胞膜(Abeles等.， 1992)。这提示6-磷酸盐衍生物，通过自身延伸葡萄糖和甘露糖，可 以通过细胞外传感器刺激轴突生长。

鼠RGCs以依赖cAMP的方式选择性地对甘露糖起反应。象金鱼 RGCs一样，来自成熟鼠的RGCs也对微摩尔浓度的单糖起反应生长 轴突，但具有几点有趣的差异。鼠RGCs对于单独的甘露糖(p＝0.05， 单尾)或VE＜3(p＝0.05，双尾)显示边缘显著的反应性，对单独 的毛喉素显示微小但显著的反应性(图9a)。在毛喉素存在时，微摩 尔浓度的甘露糖使毛喉素诱导的轴突生长增加两倍以上(p＜0.001)。 甘露糖诱导的生长至少和未分馏的牛玻璃体提取物中低分子量组分诱 导的一样多，并且不因为添加高浓度的葡萄糖而进一步提高。在其他 研究中，观察到50μM的甘露糖达到接近最大的效应(数据未显示)。 相反地，即使是象体内那样毫摩尔浓度和毛喉素存在情况下的葡萄糖 不能诱导单独的毛喉素水平以上的生长。图9b显示此作用与细胞存 活无关。因此，尽管金鱼RGCs对葡萄糖或甘露糖起反应延长轴突长 度并不提高细胞内cAMP，鼠RGCs以依赖cAMP的方式选择性地对 甘露糖起反应。

来自成熟鼠的RGCs比金鱼RGCs显示出更大的反应选择性。D- 甘露糖本身对鼠RGCs有很小的作用(图9a和9c)，但在毛喉素存在 时，它使轴突生长比基线水平增加3倍(p＜0.001，图9a和9c)。该 作用与VE＜3的类似(参见图3)，并且同样地与细胞存活的变化无 关(图9b和图9d)。毛喉素存在时，50μM的甘露糖引起最大作用， ED50大约为10μM(数据未显示)。通过无活性的L-甘露糖显示立 体特异性(图9c)。在类似情况下，葡萄糖无论如何没有作用(图9c)， 甚至在毫摩尔浓度时(图9a)。在其他受检验的糖中，古洛糖具有某 些活性(p＜0.05)(图9c)。与金鱼RGCs不同，鼠RGCs不对葡糖 胺(图9c)或高浓度的甘露糖-6-磷酸(达10mM：数据未显示) 起反应。

鼠RGCs中巨嗜细胞衍生的因子和甘露糖的加成作用。在培养中， 当[cAMP]i升高时，10-20kDa的巨嗜细胞衍生蛋白加强鼠RGCs对 小的玻璃体衍生生长因子的反应(Yin等，2003)。在毛喉素存在时， 巨嗜细胞的条件培养基几乎使鼠RGCs对甘露糖的反应加倍，提高生 长到基线以上几乎6倍(图9e)。该生长对应于超过50％的培养RGCs 在3天内延长轴突。

讨论

我们在这里显示特异性的单糖刺激视网膜神经节细胞再生其轴 突，并且此作用不依赖于能量代谢。甚至当其他能量来源充足时，金 鱼RGCs对低微摩尔浓度的葡萄糖或甘露糖起反应，再生其轴突。对 这些碳水化合物起反应不要求细胞内cAMP升高。另一方面，鼠RGCs 更有选择性。鼠RGCs以依赖cAMP的方式对微摩尔浓度的甘露糖起 反应，但对类似体内发现的浓度水平的葡萄糖不起反应。鼠RGCs的 反应可以进一步被巨嗜细胞分泌的大分子相当大地提高。这些发现可 以帮助部分解释更低和更高等脊椎动物体内再生能力的不同。在金鱼 中，丰富的葡萄糖足可以使RGCs在损伤后再生其轴突。然而在鼠中， 尽管玻璃体液中甘露糖丰富，它对刺激轴突再生的作用可能是允许性 的而非调节性的。甘露糖本身不足以诱导体内或体外轴突再生。然而， 在细胞内升高的cAMP存在时，甘露糖加强巨嗜细胞衍生的因子的作 用，因此可能在巨嗜细胞体内激活后看到的戏剧性的轴突再生中起作 用(Yin等，已提交)。

在细胞培养中，发现金鱼视神经的非神经元细胞条件下的培养基 刺激RGCs大量的轴突再生。部分纯化揭示此活性的大部分可以归功 于一种命名为AF-1的小的亲水分子(Schwalb等，1995，1996)。另 外，在培养中显示AF-1诱导许多已知与体内轴突再生有关的基因产 物的表达(Petrausch等，2000)。如此处显示的，哺乳动物玻璃体液 包含生物物理特征和生物活性与金鱼AF-1作用类似的小分子。AF-1 和玻璃体衍生因子都是亲水的，作为连贯的峰在凝胶过滤柱洗脱出， 并以6-硫鸟嘌呤敏感和NBTI不敏感的方式诱导金鱼RGCs类似水 平的轴突生长(此研究，Schwab等，1996；和未发表的观察)。进一 步纯化后，发现来自牛玻璃体的低分子量因子包含一种携带大部分生 物活性的成分和尽管它自身不足以诱导轴突生长但提高活性因子作用 的第二种成分。通过超滤、差异溶解、凝胶-过滤层析和正相HPLC 的结合，我们分离了来自玻璃体的活性成分并通过质谱发现它是分子 式为C6H12O6的碳水化合物。检验具有此分子式的多种单糖显示刺 激长出具有高度的特异性。对于金鱼RGCs，碳原子3-5上的羟基基 团是高度强制性的，立体特异性也是如此，而在C2上，甘露糖或葡 萄糖构象之一刺激生长，替换一个酰胺基也如此。甚至在高浓度的丙 酮酸和半乳糖存在的情况下还需要低微摩尔浓度刺激生长的事实提示 单糖的轴突促进作用不依赖于能量代谢。整个研究过程中注意到的细 胞存活和轴突生长的解离进一步显示了这一点。有趣的是，尽管比单 糖自己的程度小，甘露糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸也刺激生长。 因为磷酸衍生物不能进入细胞，可能它们对细胞外传感器起作用。葡 萄糖和甘露糖对金鱼RGCs的作用不被葡萄糖转运抑制剂3-O-甲 基葡萄糖降低的观察进一步提示它们在细胞外起作用的可能性。尽管 降低细胞存活，己糖激酶的抑制剂不阻断葡萄糖或甘露糖的生轴突作 用。这些发现一起进一步支持了葡萄糖和甘露糖对生长的作用可能通 过细胞外传感器并不依赖于能量代谢或细胞内转化为另一产品的观 点。在哺乳动物RGCs中，碳水化合物的生轴突作用和能量作用的解 离更清楚，因为只有甘露糖刺激生长；达5mM水平的葡萄糖没有轴 突促进作用。

环化AMP可能在促进轴突生长方面起几个作用。在新生鼠RGCs 中，营养因子刺激细胞生存的能力需要cAMP，这至少在某些例子中 使相关受体从细胞质移位到细胞膜(Meyer-Franke等，1995；Shen 等.，1999；Goldberg等，2002)。甚至当通过bcl-2基因过度表达而 使RGCs的生存不依赖营养因子，RGCs仍然需要升高的cAMP以便 能够针对营养因子的刺激而延长轴突(Goldberg等，2002)。在生长 圆锥中(growth cones)，细胞内cAMP水平对确定多种细胞外信号是 否导致吸引或排斥具有快速作用，克服髓磷脂或特异性髓磷脂蛋白的 生长抑制对介导营养因子的“引发”作用具有延迟作用(Cai等， Neuron，ca.1999)。cAMP后者的作用是蛋白合成依赖性的，并与精 氨酸酶I和其产物，聚胺表达的增加有关，这足以克服髓磷脂的抑制 (Cai等，2002)。在我们的研究中，cAMP的作用不可能与聚胺合 成相关，因为我们的培养基中已经含有高浓度(100μM)的腐胺。 然而，需要cAMP使甘露糖能上调GAP-43的表达。对于金鱼RGCs， 提高细胞内cAMP水平不增加生长。

总而言之，我们的结果显示刺激金鱼视网膜神经节细胞轴突生长 的低分子量因子和提高成熟鼠RGCs对其他生长因子起反应的低分子 量因子是单糖。对低微摩尔浓度的葡萄糖或甘露糖，或葡糖胺，金鱼 RGCs显示相对非选择性的生长反应，并且这并不需要细胞内cAMP 的升高。因此，大量的这些糖可以帮助解释金鱼视神经在体内自发发 生的有效再生。在哺乳动物中，尽管再生失败归因于抑制性的髓磷脂 蛋白和损伤部位的神经胶质疤痕，这些障碍可以通过引起巨嗜细胞流 入眼的细胞内操作很大程度地克服(Berry等，1996；Leon等，2000； Fischer等.，2000，2001；Yin等.，2003)。我们关于在甘露糖和升 高的cAMP存在情况下成年鼠RGCs对巨嗜细胞衍生的因子起反应再 生它们的轴突的发现提示单糖也可以在更高等脊椎动物的轴突再生中 起重要作用。

下列实施例3和4是用于眼内、眼周或球后注射或输注的制剂。

实施例3

成分                           ％w/v

D-甘露糖                       0.1

磷酸氢二钠                     0.2

HPMC                           0.5

聚山梨醇酯80                   0.05

沙藻胺                         0.01

氯化钠                         0.75

乙二胺四乙酸二钠               0.01

NaOH/HCl                适量到 pH7.4

纯化水                  适量到 100％

Cremophor EL                   10

Tromethamine                   0.12

硼酸                           0.3

甘露醇                         4.6

乙二胺四乙酸二钠               0.1

沙藻铵                         0.1

NaOH/HCl                适量到 pH7.4

纯化水                  适量到 100％

实施例4

成分                           ％w/v

肿瘤调制素                     0.1

D-甘露糖                       0.1

cAMP调节剂                     0.1

磷酸氢二钠                     0.2

HPMC                           0.5

聚山梨醇酯80                   0.05

沙藻铵                         0.01

氯化钠                         0.75

乙二胺四乙酸二钠              0.01

NaOH/HCl               适量到 pH7.4

纯化水                 适量到 100％

Cremophor EL                  10

Tromethamine                  0.12

硼酸                          0.3

甘露醇                        4.6

乙二胺四乙酸二钠              0.1

沙藻铵                        0.1

NaOH/HCl               适量到 pH7.4

纯化水                 适量到 100％

等同方案

本领域的技术人员会识别或只使用常规试验就能够确定许多相当 于在此描述的本发明的特定实施方案的等同方案。以下的权利要求意 欲包括这些等同方案。

参考文献

此处和说明书中通篇引用的所有参考文献作为整体在此处引用作 为参考。

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