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包含偶联至pH触发的多肽的荧光团的荧光化合物

阅读：163发布：2020-05-17

专利汇可以提供包含偶联至pH触发的多肽的荧光团的荧光化合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明主旨为提供用于鉴定、监控、治疗、和移除疾病组织的化合物、组合物、和方法。还提供用于鉴定、监控、和检测循环体液如血液的化合物、组合物、和方法。，下面是包含偶联至pH触发的多肽的荧光团的荧光化合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种pHLIP-荧光团化合物，包含
(a)pH触发的多肽(pHLIP肽)；以及
(b)荧光团，其中，该荧光团是近红外(NIR)荧光团、花青荧光团、或光声造影剂。
2.如权利要求1所述的化合物，具有下述结构：
3.如权利要求1所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含序列LFPTXTLL(SEQ ID NO:1)中的
氨基酸，其中，X是可质子化的氨基酸，且该荧光团包含NIR荧光团。
4.如权利要求3所述的化合物，其中，X是D。
5.如权利要求1所述的化合物，其中，该荧光团包含吲哚菁绿(ICG)。
6.如权利要求1所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含下述序列：XnYm；YmXn；XnYmXj；YmXnYi；
YmXnYiXj；XnYmXjYi；YmXnYiXjYl；XnYmXjYiXl；YmXnYiXjYlXh；XnYmXjYiXhYg；YmXnYiXjYlXhYg；
XnYmXjYiXhYgXf；(XY)n；(YX)n；(XY)nYm；(YX)nYm；(XY)nXm；(YX)nXm；Ym(XY)n；Ym(YX)n；Xn(XY)m；Xn(YX)m；(XY)nYm(XY)i；(YX)nYm(YX)i；(XY)nXm(XY)i；(YX)nXm(YX)i；Ym(XY)n；Ym(YX)n；Xn(XY)m；Xn(YX)m，其中，
i)Y是溶剂化能的非极性氨基酸，或Gly；
ii)X是可质子化的氨基酸，以及
iii)n、m、i、j、l、h、g、f是1至8的整数。
7.如权利要求1所述的化合物，其中，该pHLIP肽在pH约为7.5或7.75的水中具有净负电
荷。
8.如权利要求1所述的化合物，其中，该pHLIP肽的酸解离常数对数(pKa)小于约4.0、
4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7。
9.如权利要求1所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含至少一个可质子化的人工氨基酸。
10.如权利要求1所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或
40个遗传编码的氨基酸。
11.如权利要求1所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或
40个非遗传编码的氨基酸。
12.如权利要求1所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或
40个D-氨基酸。
13.如权利要求1所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含至少8个氨基酸，其中，该pHLIP肽
的该8个氨基酸中至少2、3或4个是非极性的，且该pHLIP肽的该8个氨基酸中至少1、2、3或4个是可质子化的。
14.如权利要求1所述的化合物，其中，该荧光团是花青荧光团。
15.如权利要求1所述的化合物，其中，该荧光团是NIR荧光团。
16.如权利要求1所述的化合物，其中，该荧光团包含光声造影剂。
17.如权利要求1所述的化合物，其包含
(a)氨基酸的pHLIP肽，包含序列LFPTXTLL(SEQ ID NO:1)中的，其中，X是可质子化的氨
基酸，且其中该pHLIP肽在pH5.0时对于膜脂质双层的亲和性高于在pH8.0时的亲和性，
(b)吲哚菁绿(ICG)，
其中，该ICG共价附接至从该pHLIP肽的N端计数的第一个或第二个氨基酸。
18.如权利要求17所述的化合物，其中，X是D。
19.如权利要求 1 7 所述的化合物，其中，该 p H L I P 肽包含序列
ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)或ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ
ID NO:9)中的氨基酸，且其中该ICG共价附接至其半胱氨酸。
20.如权利要求19所述的化合物，包含下述结构：
21.如权利要求 1 7 所述的化合物，其中，该 p H L I P 肽包含序列
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:5)或ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID
NO:2)中的氨基酸，且其中该ICG共价附接至其N端丙氨酸。
22.如权利要求21所述的化合物，包含下述结构：
23.如权利要求 1 7 所述的化合物，其中，该 p H L I P 肽包含序列
AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:8)或AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ
ID NO:3)中的氨基酸，且其中该ICG共价附接至其赖氨酸。
24.如权利要求23所述的化合物，包含下述结构：
25.如权利要求 1 7 所述的化合物，其中，该 p H L I P 肽包含序列
ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)中的氨基酸，且该ICG共价附接至其半胱氨
酸。
26.如权利要求25所述的化合物，包含下述结构：
27.如权利要求17所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含可质子化的人工氨基酸。
28.如权利要求27所述的化合物，其中，该可质子化的人工氨基酸包含至少1、2、3、4或5
个羧基。
29.如权利要求17所述的化合物，其中，该可质子化的氨基酸包含天冬氨酸或γ-羧基
谷氨酸。
30.如权利要求17所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含序列LLFPTDTLLL(SEQ ID NO:
25)中的氨基酸。
31.如权利要求30所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含序列LDLLFPTDTLLLD(SEQ ID
NO:26)中的氨基酸。
32.如权利要求31所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含序列AYLDLLFPTDTLLLDLL(SEQ
ID NO:27)中的氨基酸。
33.如权利要求 3 2 所述的化合物，其中，该 p H L I P 肽包含序列
DDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:28)中的氨基酸。
34.如权利要求33所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含下述序列中的氨基酸：
ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)、
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:2)、
AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:3)、
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:5)、
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCA(SEQ ID NO:6)、
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKA(SEQ ID NO:7)、
AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:8)、
ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:9)、
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:10)、
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKG(SEQ ID NO:11)、
ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKG(SEQ ID NO:12)、
AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:13)、或
ACKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:14)。
35.如权利要求17所述的化合物，其中，该pHLIP肽的氨基酸序列与作为SEQ ID NO:15
至SEQ ID NO:24所陈述的各氨基酸序列的一致性低于100％、99％或95％。
36.如权利要求17所述的化合物，其中，该pHLIP肽包含20至30个氨基酸。
37.一种组合物，包含如权利要求1所述的化合物和药学可接受的载剂。
38.如权利要求37所述的组合物，进一步包含D-葡萄糖。
39.如权利要求38所述的组合物，其中，所述组合物包含漱口水。
40.一种检测受试者体内患病或受损组织的方法，包含:
(a)将如权利要求1所述的化合物给药至该受试者；
(b)令该受试者与包含该荧光团的激发波长的电磁辐射接触；以及
(c)检测从该化合物发射的电磁辐射，其中，检测到该辐射指示该患病组织的存在。
41.如权利要求40所述的方法，其中，该患病或受损组织是癌组织、癌前组织、发炎的组
织、局部缺血的组织、关节炎患者的组织、囊性纤维化的组织、被微生物感染的组织、或动脉粥样硬化患者的的组织。
42.如权利要求41所述的方法，其中，该患病组织是癌组织，且该癌组织位于该受试者
的膀胱、上呼吸道、肾脏、前列腺、乳腺、头、颈、口腔、胰腺、肺、肝脏、子宫颈、卵巢、或脑内。
43.如权利要求40所述的方法，其中，从癌前组织或癌组织发射的辐射的水平比从正常
非癌组织发射的辐射水平高至少20％。
44.如权利要求40所述的方法，其中，该身体器官包括肾脏或膀胱。
45.一种检测受试者体内体液移动的方法，包含:
(a)将如权利要求1所述的化合物给药至该受试者；
(b)令该受试者与包含该荧光团的激发波长的电磁辐射接触；以及
(c)检测从该化合物发射的电磁辐射，其中，检测到该辐射指示该体液的存在。
46.如权利要求45所述的方法，其中，该体液包含血液。
47.如权利要求46所述的方法，其中，该血液在循环中，或位于体腔内、血管腔内、毛细
血管腔内、静脉腔内、动脉腔内、或实体肿瘤内。
48.如权利要求45所述的方法，其中，该体液包含淋巴。
49.如权利要求40所述的方法，其中，该化合物通过血管滴注、静脉给药、腹腔给药、外
用给药、黏膜给药、口服给药、动脉给药、脑内给药、脑室内给药、鞘内给药、心内给药、海绵窦内给药、骨内给药、眼内给药、玻璃体内给药、肌肉给药、皮内给药、透皮给药、跨黏膜给药、病灶内给药、皮下给药、皮试给药、羊膜外给药、阴道内给药、膀胱内给药、或鼻内给药而给药至该受试者。
50.如权利要求40所述的方法，其中，该化合物通过将包含该化合物的液体、粉末或喷
雾施加至该受试者的体表而给药。
51.如权利要求50所述的方法，其中，该体表包含经由外科手术取出的该受试者的体内
的部位。
52.如权利要求40所述的方法，其中，在体内检测从该化合物发射的电磁辐射。
53.如权利要求40所述的方法，其中，间接体内检测从该化合物发射的电磁辐射。
54.如权利要求40所述的方法，进一步包含经外科手术移除癌细胞或癌前细胞或通过
步骤(c)鉴定的组织。
55.如权利要求47所述的方法，其中，该方法包含荧光血管造影术。
56.如权利要求47所述的方法，其在眼科过程、心胸外科手术、冠状动脉架桥术、神经外
科、肝胆外科手术、修复外科手术、胆囊切除手术、结直肠切除手术、脑外科手术、肌肉灌流、外伤或创伤外科手术、或腹腔镜手术过程中实施。
57.一种用于间接体内检测生物学样品中荧光团的方法，
(a)令来自受试者的生物学样品与如权利要求1所述的化合物接触；
(b)令该生物学样品与包含该荧光团的激发波长的电磁辐射接触；以及
(c)检测从该荧光团发射的电磁辐射。
58.如权利要求58所述的方法，其中，该生物学样品包含组织活检标本、液体活检标本、
经外科手术移除的组织、经外科手术移除的液体、或血液。

说明书全文

包含偶联至pH触发的多肽的荧光团的荧光化合物

[0001] 相关申请

[0002] 基于35 U.S.C.§119(e)，本申请主张2016年9月22日提交的美国临时申请第62/398,448号的优先权，该临时申请的整体内容通过引用而并入本文。

[0003] 联邦资助研究的声明

[0004] 本发明在政府支持下完成，由美国国立卫生研究院资助(项目编号：R01GM073857)。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

[0005] 本发明涉及癌症治疗和诊断，包括，例如，荧光图像引导下的过程。

背景技术

[0006] 膀胱癌是第五常见的癌症，占美国所有新发癌症病例中的4.5％。2016年估计有76,960例新发病例，且目前预计膀胱癌的死亡率为21％(16,390例)。大约2.4％的男性和女
性在其生命的某一时间点被诊断患有膀胱癌。2012年，在美国估计有577,403人与膀胱癌患
者共同生活。几乎所有这些患者均需要持续监察，并间或进行治疗。所有阶段总计的5年相
对生存率为77％。在诊断10年后，生存率下降至70％，15年后，降至65％。膀胱癌可以是非肌
肉浸润性的或肌肉浸润性的。所有膀胱癌患者中的一半被诊断为该肿瘤是非肌肉浸润性
的，他们的5年生存率为96％。大多数(高达98％)恶性膀胱肿瘤出现在上皮细胞中，这些膀
胱癌中的90％至92％是尿路上皮癌(Siegel et al.(2012)CA Cancer J Clin 62(1):10-
29；Pasin et al.(2008)Rev Urol 10(1):31-43)。膀胱癌中不常见的是鳞状细胞癌或腺
癌。大约20％至25％的患者具有肌肉浸润性疾病，且依据该进展的中度风险或高风险，非肌
肉浸润性疾病患者将在5年内发展为肌肉浸润性疾病(Anastasiadis&de Reijke(2012)
Ther Adv Urol 4(1):13-32；Kamat et al.(2014)J Urol 192(2):305-315)。

发明内容

[0007] 本发明主旨为，尤其是提供荧光化合物，该化合物包含pH触发的多肽(“pHLIP肽)和荧光团，或主要由或由pH触发的多肽(“pHLIP肽”)和荧光团组成。本文中，此类化合物可
称为“pHLIP-荧光团化合物”。还提供包含此类荧光化合物的方法和组合物。例如，非限制性
实施涉及荧光图像引导下的医疗过程，如荧光成像和光声成像。

[0008] 多个具体实施例中，该pHLIP肽具有下述序列：XnYm；YmXn；XnYmXj；YmXnYi；YmXnYiXj；XnYmXjYi；YmXnYiXjYl；XnYmXjYiXl；YmXnYiXjYlXh；XnYmXjYiXhYg；YmXnYiXjYlXhYg；XnYmXjYiXhYgXf；
(XY)n；(YX)n；(XY)nYm；(YX)nYm；(XY)nXm；(YX)nXm；Ym(XY)n；Ym(YX)n；Xn(XY)m；Xn(YX)m；(XY)nYm(XY)i；(YX)nYm(YX)i；(XY)nXm(XY)i；(YX)nXm(YX)i；Ym(XY)n；Ym(YX)n；Xn(XY)m；Xn(YX)m，其中，i)Y是溶剂化能的非极性氨基酸，或Gly(见，如，表1)，ii)X是可质子化的氨基
酸，以及iii)n、m、i、j、l、h、g、f是1至8的整数。

[0009] 一些具体实施例中，该pHLIP肽具有下述序列：

[0010] NH2-ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA-COOH(SEQ ID NO:4)，其中，“NH2-”是该肽的氨基末端(且是N端丙氨酸的一部分)，而“-COOH”是该肽的羧基末端(且是该C端丙氨酸的一
部分)。在本文中(如，正文、、结构、列举或别处)揭露的氨基酸序列中，肽的“NH2-”及/或“-COOH”可酌情省略或未显示。

[0011] 某些具体实施例中，该荧光团共价附接至具有下述序列的pHLIP的半胱氨酸：

[0012] NH2-ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA-COOH(SEQ ID NO:4)。多个具体实施例中，该pHLIP-荧光团化合物具有下述结构：

[0013]

[0014] 在上述序列中，该pHLIP肽序列是NH2-ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA-COOH(SEQ ID NO:4)，但是显示了该肽的N端的丙氨酸和半胱氨酸的结构。

[0015] 一些具体实施例中，该pHLIP肽在pH约为7.5或7.75的水中具有净负电荷。

[0016] 某些具体实施例中，该pHLIP肽的酸解离常数对数(pKa)小于约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7。

[0017] 多个具体实施例中，该pHLIP肽包含至少一个可质子化的人工氨基酸。本文中，“人工”氨基酸是未经遗传编码的氨基酸。

[0018] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或40个遗传编码的氨基酸。

[0019] 某些具体实施例中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或40个非遗传编码的氨基酸。

[0020] 多个具体实施例中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或40个D-氨基酸。

[0021] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含至少8个氨基酸，其中，该pHLIP肽的该8个氨基酸中至少2、3或4个是非极性的，且该pHLIP肽的该8个氨基酸中至少1、2、3或4个是可质子化
的。

[0022] 某些具体实施例中，该pHIP肽包含可附接荧光团的官能团。例如，在该pHLIP肽称为该pHLIP-荧光化合物之前，该pHLIP肽包含一官能团，且该荧光团经由牵涉该官能团的化
学相互作用而共价附接至该pHLIP肽。一些具体实施例中，该pHLIP肽包含官能团，且该荧光
团非共价地附接(如，经由非共价结合如静电相互作用)至该官能团。在pHLIP肽与荧光团附
接的语境中，“官能团”是化合物(如pHLIP肽)的一部分，用于将该化合物附接至另一化合物
(如将pHLIP肽附接至荧光团)。“官能团”可视情况称为“附接基”。多个具体实施例中，官能团是化学反应性的。一些具体实施例中，pHLIP肽上的官能团与荧光团上的官能团反应，以
留下将该pHLIP肽连接至该荧光团的共价键，得到pHLIP-荧光团化合物。官能团的非限制性
实例包括氨基酸侧链(如，半胱氨酸的-SH侧链或赖氨酸的–NH2侧链)；巯基(如，包含-SH的
基团，或主要由或由-SH组成的基团)；酯类，如马来酰亚胺酯类；包含–she的基团；以及可能被牵涉入链接反应(click reaction)反应的基团(如，叠氮化物、炔、应变二氟辛炔
(strained difluorooctynes)、二芳基-应变-环辛炔、1硝酮、环辛烯、反式环辛烯、氧杂降
冰片二烯、四嗪、四唑、活化烯烃、和氧杂降冰片二烯)。

[0023] 本文中，术语“荧光团”包括任何发射能量的化合物。该能量可以是例如声能(如，声波)、热、或电磁辐射的形式。多个具体实施例中，该电测辐射可以是眼可见或不可见的。
一些具体实施例中，该电测辐射是红外线或近红外线。荧光团的非限制性实例包括冷发光
化合物、荧光化合物、磷光化合物、化学发光化合物、光声化合物、和淬灭剂化合物(如，荧光淬灭剂化合物)。荧光团可包含，例如，小分子化合物(如，分子量小于约2000、1000或500道
尔顿的有机化合物)、蛋白质、或金属螯合物(如，经由共价或非共价配位键附接至金属的螯
合剂，其中，该螯合剂与该金属的组合是荧光性的)。某些具体实施例中，能量(如，电磁辐射
如冷发光、声能如声波、或热)的发射不牵涉该吸收以及随后的能量发射。一些具体实施例
中，该能量的发射牵涉该吸收以及随后的能量发射。

[0024] 本文中，将超过50％的所吸收的光能转化为热的化合物，被称为“淬灭剂”。一些具体实施例中，淬灭剂将所吸收的光能全部转化为热。多个具体实施例中，淬灭剂可发射一定
量的光，但多吸收的能量大多数(如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％所吸收能量)被转化为热。淬灭剂的非限制性实例包括：i)
Dabsyl(二甲氨基偶氮苯磺酸)；ii)黑洞淬灭剂(可在实际上整个可见光谱范围内淬灭)；以
及iii)IRDye QC-1[可在可见至NIR(500-900nm)范围内淬灭]。光声成像的主要原理如下：
通过荧光团或淬灭剂吸收光，将光能转化为热能，导致热膨胀和声波的生成，而这些被检测
到。通常，荧光团将一定量，如少量的能量转化为热；而荧光团的大部分能量被以光的形式
发射。某些与冷发光荧光团(如，发射电磁辐射如光的荧光团)相关的优选具体实施例中，荧
光团将较多的能量以电磁辐射(如，光)的形式发射，而将较少的能量转化为热。某些与淬灭
剂相关的优选具体实施例中，淬灭剂将较少的能量以电磁辐射(如，光)的形式发射，而将较
多的能量转化为热。因此，ICG由于其将一些能量转化为热的特性，可作为荧光团而用于荧
光成像以及光声成像中。

[0025] 多个具体实施例中，1、2、3、4、5或更多个荧光团被附接至该pHLIP肽。

[0026] 一些具体实施例中，可(或已经)附接有该荧光团的pHLIP肽的该官能团包含氨基酸、叠氮修饰的氨基酸、或炔基修饰的氨基酸。某些具体实施例中，该pHLIP肽经由酰胺键而
共价附接至该荧光团。

[0027] 某些具体实施例中，该pHLIP肽的该官能团包含游离的巯基或伯胺，或由游离的巯基或伯胺组成。

[0028] 多个具体实施例中，该pHLIP肽被附接至一个或多个荧光团(如，荧光团、淬灭剂如荧光淬灭剂、或包含荧光团-淬灭剂对的组合)以形成pHLIP-荧光团化合物，而该化合物作
为诊断剂、成像剂、间接体内成像剂、或研究工具而使用。多个具体实施例中，该pHLIP肽包
含一个或多个附接至官能团荧光团，作为诊断剂、成像剂、间接体内成像剂、或研究工具而
使用。

[0029] 一些具体实施例中，该荧光团包含荧光染料、或荧光淬灭剂、或两者的组合。

[0030] 一些具体实施例中，荧光团-淬灭剂系统用于荧光引导下的成像中。对于此类系统的非限制性实例，见，例如，www.bachem.com/service-support/newsletter/peptide-
trends-july-2016/。荧光团-淬灭剂系统的用途的非限制性实例揭示于Karabadzhak et
al.(2014)ACS Chem Biol.

[0031] 9(11):2545-53中，其整体内容通过引用而并入本文。某些具体实施例中，当荧光团与淬灭剂之间的距离增加[如，因为构型改变或由于连接该荧光团与该淬灭剂的键(如，
肽键或其它键)断裂]时，则荧光团的发射强度增加。某些具体实施例中，当该荧光团与该淬
灭剂之间的距离增加时，荧光的效率增加，导致荧光强度的增加。

[0032] 一些具体实施例中，包含荧光团或淬灭剂的pHLIP化合物(如，pHLIP-淬灭剂)被用于光声成像。多个具体实施例中，光声成像包含吸收光并将光转化为热(如，使用光声成像
剂)的化合物或基团，与荧光相反，其使用超声波测量。多个具体实施例中，荧光包含吸收光
并将光以荧光或磷光的形式发射的化合物或基团。一些具体实施例中，荧光团(如，以光的
形式发射的能量多于以热的形式发射的能量的荧光团)被用于光声成像。某些具体实施例
中，ICG-pHLIP肽被用于光声成像。包含pHLIP肽和荧光染料作为多光谱光声X射线断层摄影
术(MSOT)成像剂的化合物的用途的非限制性实例揭示于Kimbrough et al.(2015)Clin
Cancer Res.21(20):4576-85中，其整体内容通过引用而并入本文。

[0033] 某些具体实施例中，该荧光团包含在近红外(NIR)波长下操作(如，在NIR内具有峰值发射波长)的NIR荧光染料，如吲哚菁绿(ICG)。红外辐射从700纳米(nm)的可见光谱的正
常红色边缘延伸至1mm。NIR辐射包含750nm至1.4μm的波长。一些具体实施例中，该ICG的峰
值发射波长介于810nm与880nm之间(如，在pHLIP-荧光团化合物的情境中)。某些具体实施
例中，该ICG的峰值发射波长介于810nm与860nm之间。多个具体实施例中，该ICG的峰值发射
波长为约800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、或880nm。
一些具体实施例中，使用805nm激光进行ICG激发。某些实例中，使用801、802、803、804、804、
805、806、807、808、809、810、800至805、804至806、或802至807nm激光进行ICG激发。

[0034] NIR成像系统(可能在例如临床应用和诊断应用中有用)的非限制性实例包括可从蔡司公司(Carl Zeiss Meditec AG)购得的INFRARED 800TM；可从探索医学成像BV(Quest
Medical Imaging BV)购得的可胸瑞穗医疗公司(Mizuho Medical Co.Ltd.)购得
的HyperEye Medical 可从滨松光学(Hamamatsu Photonics K.K.)购得的近红外荧
光成像仪 C9830；可从Spectropath Inc.购得的影响引导下的手术系
统；可从NOVADAQTechnologies Inc.购得的下列系统：SPY (开放外科成像)、
(内窥镜荧光成像)、 (用于伤口护理的荧光血管造影术)；可从直觉外科
公司(Intuitive Surgical Inc.)购得的用于da Vinci Si的荧光成像系统；可从莱
卡微系统(Leica Microsystems)购得的NIR FL800；可从Fluoptics Minatec-BHT购
得的可从史托斯公司(Karl Storz GmbH&Co.)购得的KG、Storz Karl Storz-
(近红外/吲哚菁绿)；以及可从斯特赖克公司(Stryker Corporation)购得的
InfraVisionTM成像系统。

[0035] 多个具体实施例中，该荧光团包含在从约670nm至约750nm的波长下操作(如，峰值发射波长在此范围内)的试剂，如亚甲蓝。

[0036] 某些具体实施例中，该荧光团包含花青染料。多个具体实施例中，花青染料在550至620nm、590至700nm、650至730nm、680至770nm、750至820nm、或770至850nm的波长下操作
(如，峰值发射波长在此范围内)。花青染料的非限制性实例包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、和Cy7.5。一些具体实施例中，该花青染料是Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、或
Cy7.5。某些具体实施例中，该Cy3的峰值发射波长介于550nm与620nm之间(如，在pHLIP-荧
光团化合物的情境中)。多个具体实施例中，该Cy3.5的峰值发射波长介于590nm与700nm之
间(如，在pHLIP-荧光团化合物的情境中)。一些具体实施例中，该Cy5的峰值发射波长介于
650nm与730nm之间(如，在pHLIP-荧光团化合物的情境中)。某些具体实施例中，该Cy5.5的
峰值发射波长介于680nm与770nm之间(如，在pHLIP-荧光团化合物的情境中)。多个具体实
施例中，该Cy7的峰值发射波长介于750nm与820nm之间(如，在pHLIP-荧光团化合物的情境
中)。某些具体实施例中，该Cy7.5的峰值发射波长介于770nm与850nm之间(如，在pHLIP-荧
光团化合物的情境中)。

[0037] 一些具体实施例中，荧光团的峰值发射波长可基于环境及/或环绕该荧光团的溶剂而改变(如，改变约5％、6％、7％、8％、9％或10％)。

[0038] 一些具体实施例中，该荧光团包含荧光造影剂或光声造影剂。某些具体实施例中，光声成像剂是荧光性的。多个些具体实施例中，光声成像剂不是荧光性的。某些具体实施例
中，光声成像剂吸收光，并将该光能的大部分(如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％所吸收能量)转化为热。多个具体实施例中，通过超声检测该热。一些具体实施例中，淬灭剂是具有非常低量子产率的荧光团，如此，该
淬灭剂所吸收能量的大部分被转化为热而非电磁辐射(如，光)。

[0039] 光声造影剂的非限制性实例包括ICG(可用于荧光成像以及光声成像)、Alexa Fluor 750、伊文思蓝、BHQ3(Black Hole -3，可从例如生物研究技术公司
(Biosearch Technologies、California、United States)购买)、 680(可从例如剑桥
生物科学公司(Cambridge Bioscience、Cambridge、United Kingdom)购买)、 800CW
(可从例如LI-COR公司(LI-COR、Nebraska、United States)购买)、MMPSenseTM750FAST(可胸
例如铂金埃尔默公司(PerkinElmer Inc.、Texas、United States)购买)、二酮吡咯并吡咯
花青、花菁类(cypate)-C18、Au 纳米粒子(如，Au纳米球、Au纳米壳、Au 纳米棒、Au纳米笼、Au纳米簇、Au纳米星、和Au纳米信标)、包含以拉曼分子标签反-1,2-双(4-吡啶基)-乙烯覆盖
的金核的纳米粒子、Ag纳米片、Ag纳米系统、量子点、纳米钻石、聚吡咯纳米粒子、硫化铜、石墨烯纳米片、氧化铁-金核壳、Gd2O3、单壁碳纳米管、载有染料的全氟碳系纳米粒子、AuMBs、触发性纳米滴、钴纳米包覆体(namowontons)、纳米玫瑰形物(nanorose)、金-氧化硅核壳纳
米棒、超顺磁氧化铁、和亚甲蓝。光声造影剂的非限制实例和说明揭示与Wu et al.(2014)
Int.J.Mol.Sci.,15、23616-23639(见，如表1)中，其整体内容通过引用而并入本文。

[0040] 多个具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团化合物在外科手术前、手术中和手术后设定中用作试剂。

[0041] 一些具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团化合物在间接体内成像和间接体内诊断中用作试剂。

[0042] 多个具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团被用来检测患病组织或对其成像。患病组织的非限制性实例包括癌组织、发炎的组织、局部缺血的组织、关节炎患者的组
织、囊性纤维化的组织、被微生物感染的组织、和动脉粥样硬化患者的组织。

[0043] 一些具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团化合物在荧光血管造影术中用作试剂。荧光血管造影术是一种过程，在该过程中，荧光化合物(如，本文中提供的pHLIP-荧光
团化合物)被注射入血流中。该荧光化合物令该血管突出显示。多个具体实施例中，该血管
位于眼睛后面。一些具体实施例中，对该血管成像或拍照。多个非限制性实例中，使用荧光
血管造影术来鉴定、检测图像、或管理眼部病变。某些与眼科相关的具体实施例中，可使用
荧光血管造影术来观察例如视网膜和脉络膜中的血液流动。

[0044] 多个具体实施例中，荧光血管造影术提供对血管的实时成像，以遵循外科手术过程中的改变。一些非限制性实例包括荧光的下述用途：在眼科用来评估脉络膜视网膜脉管
系统；在心胸外科脑血管再形成过程中用来评价冠状动脉架桥术的有效性；在神经与血管
外科中用来评价颞浅动脉-大脑中动脉旁路移植在脑血管再生过程中的效果；在肝胆外科
中用来鉴定用于解剖性肝脏切除的触觉段(haptic segment)和子段；用于重建外科中；以
及用于胆囊切除术和结直肠切除中。诊断应用的非限制性实例中，荧光血管造影术被用来
对下述进行成像：脑中血液动力学、类风湿性关节炎的循环特征、肌肉灌注、烧伤，并用来评
价对于创伤的多个其它效果。

[0045] 某些具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团化合物用于眼科、心胸外科手术、冠状动脉架桥术、神经外科手术、肝胆外科手术、重建外科手术、胆囊切除术、结直肠切除手
术、脑外科手术、肌肉灌注、外伤和创伤外科、和腹腔镜手术中血液循环的可视化。

[0046] 多个具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团用于淋巴结的可视化。

[0047] 一些具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团化合物用于癌前组织或癌病灶的可视化或检测。

[0048] 某些具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团化合物用于膀胱、上泌尿道、肾脏、前列腺、乳腺、头颈、口腔、胰腺、肺、肝脏、子宫颈、卵巢、或脑肿瘤的癌前组织或癌病灶的可视化或检测。

[0049] 多个具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团化合物用于在手术过程中对血液流动和组织灌注进行实时评价。

[0050] 一方面，本文提供一种用于肠胃外给药、局部给药或全身给药的组合物，该组合物包含pHLIP-荧光团化合物。

[0051] 一方面，本文包括一种用于pHLIP-荧光团化合物的静脉给药、动脉给药、腹膜给药、脑内给药、脑室内给药、鞘内给药、心内给药、海绵窦内给药、骨内给药、眼内给药、玻璃体内给药的组合物。

[0052] 一方面，本发明提供一种用于pHLIP-荧光团化合物的肌肉给药、皮内给药、透皮给药、跨粘膜给药、病灶内给药、皮下给药、外用给药、皮试给药、羊膜外给药、阴道内给药、膀胱内给药、鼻内给药、或口腔给药的组合物。

[0053] 一方面，本发明包括用于包含pHLIP-荧光团化合物的活检标本、液体活检标本、经外科手术移除的组织、经外科手术移除的液体、或血液的间接体内治疗的组合物。

[0054] 一方面，受试者的血液与该pHLIP-荧光团化合物(如，在体内或间接体内)接触。

[0055] 多个具体实施例中，当荧光团是pHLIP荧光团组合物如偶联物的一部分时，低于游离荧光团如非偶联荧光团的有效剂量(如，用于成像或检测)的剂量的荧光团(如，ICG)是有
效的。一些具体实施例中，以较低有效剂量给药作为pHLIP荧光团化合物的一部分的该荧光
团，造成较低的副作用。某些具体实施例中，荧光团可令受试者在给药后对于太阳辐射更为
敏感，因此，该受试者在曝露于太阳辐射后，发展出比未给药荧光团如ICG的受试者更高程
度的晒伤。多个具体实施例中，将低于以游离形式给药荧光团所需的剂量的作为pHLIP荧光
团化合物一部分的该荧光团输送至受试者，从而与给药游离形式的该荧光团相比，降低或
最小化曝露于太阳辐射而导致的光毒性(如，对于皮肤的毒性/晒伤)。

[0056] 一些具体实施例中，该pHLIP-荧光团化合物包含pHLIP和ICG(如，ICG-pHLIP肽，如ICG-Var3)。某些具体实施例中，该pHLIP-荧光团化合物以约0.01至0.5mg/kg的剂量给药至
受试者。多个具体实施例中，该pHLIP-荧光团化合物以约0.02至0.2mg/kg的剂量给药至受
试者。一些具体实施例中，该pHLIP-荧光团化合物以约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、
0.07、0.08、0.09、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.25、或0.5mg/kg的剂量给药至受试者。某些具体实施例中，该pHLIP-荧光团化合物以至少约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、
0.07、0.08、0.09、0.1、0.125、0.15、0.175、或0.2mg/kg，但低于约0.25、0.5、1、2、3、4、或
5mg/kg的剂量给药至受试者。多个具体实施例中，将1至10mg的该pHLIP-荧光团化合物给药
至受试者。一些具体实施例中，将约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或15mg的该pHLIP-荧光团化合物给药至受试者。某些些具体实施例中，将至少0.5、1、2、或3mg，但低于10或1mg的该
pHLIP-荧光团化合物给药至受试者。多个具体实施例中，将0.3至3μmol的该pHLIP-荧光团
化合物给药至受试者。一些具体实施例中，将约0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5μmol的该pHLIP-荧光团化合物给药至受试者。某些些具体实施例中，将至少0.1、0.5、或1μ
mol，但低于3、4、或5μmol的该pHLIP-荧光团化合物给药至受试者。多个具体实施例中，该
pHLIP-荧光团化合物通过静脉注射给药约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、1至10、1至15、5至10、5至15、5至20、10至15、10至20、或15至20分钟。

[0057] 一些具体实施例中，将约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或15mg的该pHLIP-荧光团化合物徐徐滴入器官或组织(如，膀胱)内。某些具体实施例中，将约0.5、1、2、或3mg，但低于10或1mg的该pHLIP-荧光团化合物徐徐滴入器官或组织(如，膀胱)内。多个具体实施例中，
将约0.3至3μmol的该pHLIP-荧光团化合物徐徐滴入器官或组织(如，膀胱)内。一些具体实
施例中，将约0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5μmol的该pHLIP-荧光团化合物徐徐滴入器官或组织(如，膀胱)内。某些具体实施例中，将约0.1、0.5、或1μmol，但低于3、4、或5μmol的该pHLIP-荧光团化合物徐徐滴入器官或组织(如，膀胱)内。多个具体实施例中，将该
pHLIP-荧光团化合物徐徐滴入器官或组织(如，膀胱)内，滴入时间为约1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1至10、1至15、5至10、5至15、5至20、10至15、10至
20、或15至20分钟。

[0058] 某些具体实施例中，该pHLIP-荧光团化合进一步包含聚乙二醇。一些具体实施例中，该pHLIP-看荧光团化合物进一步包含一个或多个聚乙二醇亚单元(如，3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、3至10、10至20,或3至20个亚单元)。

[0059] 本文中包括一种检测(成像)受试者体内血液流动的方法，包含(a)将本文中揭露的包含荧光团(如ICG)的pHLIP-荧光团化合物给药至该受试者；(b)令该受试者(如，该受试
者的体表、细胞、组织、或器官，如可能包含被给药的pHLIP-荧光团化合物的一部分的体表
或组织)与包含该荧光团的激发波长的电磁辐射接触；以及(c)检测从该受试者体内的该
pHLIP-荧光团化合物发射的电磁辐射。多个具体实施例中，检测到该辐射表明该受试者体
内血液的存在(如，位置或在某一位置的量)。多个具体实施例中，产生该受试者体内血液的
图像。

[0060] 还提供一种检测(成像)受试者体内pHLIP-荧光团的方法，包含(a)将本文中揭露的包含荧光团(如ICG)的pHLIP-荧光团化合物给药至该受试者；(b)令该受试者(如，该受试
者的体表或组织，如可能包含被给药的pHLIP-荧光团化合物的一部分的体表、细胞、组织、
或器官)与包含该荧光团的激发波长的电磁辐射接触；以及(c)检测从该受试者体内的该
pHLIP-荧光团化合物发射的电磁辐射。多个具体实施例中，检测到该辐射表明该受试者体
内体液如血液的存在(如，位置或在某一位置的量)。多个具体实施例中，产生该受试者体内
血液的图像。

[0061] 本文中包括一种对受试者体内的血液流动进行光声检测或成像的方法，包含(a)给药pHLIP-荧光团化合物，其中该荧光团是光声成像剂如冷发光荧光团或淬灭剂；(b)令该
受试者(如，该受试者的体表、细胞、组织、或器官，如可能包含被给药的pHLIP-荧光团化合
物的一部分的体表或组织)与包含该荧光团的激发波长的电磁辐射接触；以及(c)检测能量
如声能(如，声波)。多个具体实施例中，检测到该能量射表明该受试者体内血液的存在(如，
位置或在某一位置的量)。多个具体实施例中，产生该受试者体内血液的图像。一些具体实
施例中，通过超声(如，热被释放，并创建膨胀、产生可检测的声波)检测声能的存在。

[0062] 本发明主旨还提供一种检测(成像)受试者体内pHLIP-荧光团的方法，其中该荧光团是成像剂如冷发光荧光团或淬灭剂，该方法包含(a)将该pHLIP-荧光团化合物给药至该
受试者；(b)令该受试者(如，该受试者的体表或组织，如可能包含被给药的pHLIP-荧光团化
合物的一部分的体表、细胞、组织、或器官)与包含该荧光团的激发波长的电磁辐射接触；以
及(c)检测能量如声能(如，声波)。多个具体实施例中，检测到该能量表明该受试者体内体
液如血液的存在(如，位置或在某一位置的量)。多个具体实施例中，产生该受试者体内血液
的图像。多个具体实施例中，通过超声检测声能的存在。

[0063] 依据情境，“激发波长”可与“吸收波长”同义使用。

[0064] 多个具体实施例中，该方法包含在手术过程中或看医生的过程中实施的荧光引导成像过程。一些具体实施例中，该方法包含荧光血管造影术。某些具体实施例中，该方法包
含对组织和器官灌注的评价。多个具体实施例中，该方法包含对肝功能的评价。一些具体实
施例中，该荧光引导成像过程包含对癌前组织、癌组织、发炎的组织、局部缺血的组织、关节
炎患者的组织、被微生物感染的组织、及/或动脉粥样硬化患者的组织的靶向、标记、检测、
或可视化。某些具体实施例中，该方法包含评价心胸外科手术过程中冠状动脉旁路的通畅
度。一些具体实施例中，该方法包含评价神经与血管外科手术过程中或术后，如脑血管再形
成过程中，颞浅动脉-大脑中动脉旁路移植物的效果。某些具体实施例中，该方法包含在肝
胆外科手术过程中鉴定用于解剖学肝脏切除的触觉段和子段。一些具体实施例中，该方法
包含在重建外科手术过程中对组织或血液成像。某些具体实施例中，该方法包含在胆囊切
除术或结直肠切除手术过程中对组织或血液成像。一些具体实施例中，该方法包含对脑肿
瘤如恶性神经胶质瘤的手术中鉴定。

[0065] 多个具体实施例中，该方法包含诊断性成像过程。一些具体实施例中，该方法包含视网膜血管造影术。某些具体实施例中，该方法包含对脉络膜视网膜脉管系统的检测和成
像。

[0066] 一些具体实施例中，该方法包含对淋巴结的映射(mapping)和可视化。某些具体实施例中，该方法包含对癌前组织、癌病灶的靶向和标记(如，可视化或检测)，及/或对肿瘤浸
润的评价。

[0067] 多个具体实施例中，该pHLIP-荧光团化合物被肠胃外给药、局部给药或全身给药。某些具体实施例中，pHLIP-荧光团化合物被静脉给药、动脉给药、腹膜给药、脑内给药、脑室
内给药、鞘内给药、心内给药、海绵窦内给药、骨内给药、眼内给药、或玻璃体内给药。多个具体实施例中，pHLIP-荧光团化合物被肌肉给药、皮内给药、透皮给药、跨粘膜给药、病灶内给
药、皮下给药、外用给药、皮试给药、羊膜外给药、阴道内给药、膀胱内给药、鼻内给药、或口腔给药。

[0068] 一方面，本文中提供一种用于将人类标本进行间接体内染色和间接体内诊断的方法，包含(a)令来自受试者的生物学样品与本文中揭露的包含荧光团(如ICG)的pHLIP-荧光
团化合物接触；(b)令该生物学样品与包含该荧光团激发波长的电磁辐射接触；以及(c)检
测从该pHLIP-荧光团化合物发射的电磁辐射。多个具体实施例中，该生物学样品包含组织
活检标本、液体活检标本、经外科手术移除的组织、经外科手术移除的液体、或血液。

[0069] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含任一下述序列中存在的至少8至25个接续氨基酸(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个接续氨基酸)：

[0070] WARYADWLFTTPLLLLDLALL(SEQ ID NO:36)、

[0071] YARYADWLFTTPLLLLDLALL(SEQ ID NO:37)、

[0072] WARYSDWLFTTPLLLYDLGLL(SEQ ID NO:38)、

[0073] WARYTDWFTTPLLLYDLALLA(SEQ ID NO:39)、

[0074] WARYTDWLFTTPLLLYDLGLL(SEQ ID NO:40)、

[0075] WARYADWLFTTPLLLLDLSLL(SEQ ID NO:41)、

[0076] LLALDLLLLPTTFLWDAYRAW(SEQ ID NO:42)、

[0077] LLALDLLLLPTTFLWDAYRAY(SEQ ID NO:43)、

[0078] LLGLDYLLLPTTFLWDSYRAW(SEQ ID NO:44)、

[0079] ALLALDYLLLPTTFWDTYRAW(SEQ ID NO:45)、

[0080] LLGLDYLLLPTTFLWDTYRAW(SEQ ID NO:46)、

[0081] LLSLDLLLLPTTFLWDAYRAW(SEQ ID NO:47)、

[0082] GLAGLLGLEGLLGLPLGLLEGLWLGL(SEQ ID NO:48)、

[0083] LGLWLGELLGLPLGLLGELGLLGALG(SEQ ID NO:49)、

[0084] WRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:50)、

[0085] WLLDLLLTDTPFLLDLYARW(SEQ ID NO:51)、

[0086] WARYLEWLFPTETLLLEL(SEQ ID NO:52)、

[0087] WAQYLELLFPTETLLLEW(SEQ ID NO:53)、

[0088] LELLLTETPFLWELYRAW(SEQ ID NO:54)、

[0089] WELLLTETPFLLELYQAW(SEQ ID NO:55)、

[0090] WLFTTPLLLLNGALLVE(SEQ ID NO:56)、

[0091] WLFTTPLLLLPGALLVE(SEQ ID NO:57)、

[0092] WARYADLLFPTTLAW(SEQ ID NO:58)、

[0093] EVLLAGNLLLLPTTFLW(SEQ ID NO:59)、

[0094] EVLLAGPLLLLPTTFLW(SEQ ID NO:60)、

[0095] WALTTPFLLDAYRAW(SEQ ID NO:61)、

[0096] NLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIE(SEQ ID NO:62)、

[0097] EGFFATLGGEIALWSDVVLAIE(SEQ ID NO:63)、

[0098] EGFFATLGGEIPLWSDVVLAIE(SEQ ID NO:64)、

[0099] EIALVVLSWLAIEGGLTAFFGELN(SEQ ID NO:65)、

[0100] EIALVVDSWLAIEGGLTAFFGE(SEQ ID NO:66)、

[0101] EIALVVDSWLPIEGGLTAFFGE(SEQ ID NO:67)、

[0102] ILDLVFGLLFAVTSVDFLVQW(SEQ ID NO:68)、以及

[0103] WQVLFDVSTVAFLLGFVLDLI(SEQ ID NO:69)。

[0104] 多个具体实施例中，pHLIP肽包含氨基酸序列WRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ IDNO:50)和视情况加至任一侧的额外氨基酸(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个氨基酸)。

[0105] 某些具体实施例中，该pHLIP肽具有下述序列：

[0106] WARYADWLFTTPLLLLDLALL(SEQ ID NO:70)、

[0107] YARYADWLFTTPLLLLDLALL(SEQ ID NO:71)、

[0108] WARYSDWLFTTPLLLYDLGLL(SEQ ID NO:72)、

[0109] WARYTDWFTTPLLLYDLALLA(SEQ ID NO:72)、

[0110] WARYTDWLFTTPLLLYDLGLL(SEQ ID NO:74)、

[0111] WARYADWLFTTPLLLLDLSLL(SEQ ID NO:75)、

[0112] LLALDLLLLPTTFLWDAYRAW(SEQ ID NO:76)、

[0113] LLALDLLLLPTTFLWDAYRAY(SEQ ID NO:77)、

[0114] LLGLDYLLLPTTFLWDSYRAW(SEQ ID NO:78)、

[0115] ALLALDYLLLPTTFWDTYRAW(SEQ ID NO:79)、

[0116] LLGLDYLLLPTTFLWDTYRAW(SEQ ID NO:80)、

[0117] LLSLDLLLLPTTFLWDAYRAW(SEQ ID NO:81)、

[0118] GLAGLLGLEGLLGLPLGLLEGLWLGL(SEQ ID NO:82)、

[0119] LGLWLGELLGLPLGLLGELGLLGALG(SEQ ID NO:83)、

[0120] WRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:84)、

[0121] WLLDLLLTDTPFLLDLYARW(SEQ ID NO:85)、

[0122] WARYLEWLFPTETLLLEL(SEQ ID NO:86)、

[0123] WAQYLELLFPTETLLLEW(SEQ ID NO:87)、

[0124] LELLLTETPFLWELYRAW(SEQ ID NO:88)、

[0125] WELLLTETPFLLELYQAW(SEQ ID NO:89)、

[0126] WLFTTPLLLLNGALLVE(SEQ ID NO:90)、

[0127] WLFTTPLLLLPGALLVE(SEQ ID NO:91)、

[0128] WARYADLLFPTTLAW(SEQ ID NO:92)、

[0129] EVLLAGNLLLLPTTFLW(SEQ ID NO:93)、

[0130] EVLLAGPLLLLPTTFLW(SEQ ID NO:94)、

[0131] WALTTPFLLDAYRAW(SEQ ID NO:95)、

[0132] NLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIE(SEQ ID NO:96)、

[0133] EGFFATLGGEIALWSDVVLAIE(SEQ ID NO:97)、

[0134] EGFFATLGGEIPLWSDVVLAIE(SEQ ID NO:98)、

[0135] EIALVVLSWLAIEGGLTAFFGELN(SEQ ID NO:99)、

[0136] EIALVVDSWLAIEGGLTAFFGE(SEQ ID NO:100)、

[0137] EIALVVDSWLPIEGGLTAFFGE(SEQ ID NO:101)、

[0138] ILDLVFGLLFAVTSVDFLVQW(SEQ ID NO:102)、或

[0139] WQVLFDVSTVAFLLGFVLDLI(SEQ ID NO:103)。

[0140] 某些具体实施例中，该pHLIP肽包含任一下述序列中存在的至少8至25个接续氨基酸(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个接续氨基酸)：

[0141] WARYAXWLFTTPLLLLXLALL(SEQ ID NO:104)、

[0142] YARYAXWLFTTPLLLLXLALL(SEQ ID NO:105)、

[0143] WARYSXWLFTTPLLLYXLGLL(SEQ ID NO:106)、

[0144] WARYTXWFTTPLLLYXLALLA(SEQ ID NO:107)、

[0145] WARYTXWLFTTPLLLYXLGLL(SEQ ID NO:108)、

[0146] WARYAXWLFTTPLLLLXLSLL(SEQ ID NO:109)、

[0147] LLALXLLLLPTTFLWXAYRAW(SEQ ID NO:110)、

[0148] LLALXLLLLPTTFLWXAYRAY(SEQ ID NO:111)、

[0149] LLGLXYLLLPTTFLWXSYRAW(SEQ ID NO:112)、

[0150] ALLALXYLLLPTTFWXTYRAW(SEQ ID NO:113)、

[0151] LLGLXYLLLPTTFLWXTYRAW(SEQ ID NO:114)、

[0152] LLSLXLLLLPTTFLWXAYRAW(SEQ ID NO:115)、

[0153] GLAGLLGLXGLLGLPLGLLXGLWLGL(SEQ ID NO:116)、

[0154] LGLWLGXLLGLPLGLLGXLGLLGALG(SEQ ID NO:117)、

[0155] WRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:118)、

[0156] WLLXLLLTXTPFLLXLYARW(SEQ ID NO:119)、

[0157] WARYLXWLFPTXTLLLXL(SEQ ID NO:120)、

[0158] WAQYLXLLFPTXTLLLXW(SEQ ID NO:121)、

[0159] LXLLLTXTPFLWXLYRAW(SEQ ID NO:122)、

[0160] WXLLLTXTPFLLXLYQAW(SEQ ID NO:123)、

[0161] WLFTTPLLLLNGALLVX(SEQ ID NO:124)、

[0162] WLFTTPLLLLPGALLVX(SEQ ID NO:125)、

[0163] WARYAXLLFPTTLAW(SEQ ID NO:126)、

[0164] XVLLAGNLLLLPTTFLW(SEQ ID NO:127)、

[0165] XVLLAGPLLLLPTTFLW(SEQ ID NO:128)、

[0166] WALTTPFLLXAYRAW(SEQ ID NO:129)、

[0167] NLXGFFATLGGXIALWSLVVLAIX(SEQ ID NO:130)、

[0168] XGFFATLGGXIALWSXVVLAIX(SEQ ID NO:131)、

[0169] XGFFATLGGXIPLWSXVVLAIX(SEQ ID NO:132)、

[0170] XIALVVLSWLAIXGGLTAFFGXLN(SEQ ID NO:133)、

[0171] XIALVVXSWLAIXGGLTAFFGX(SEQ ID NO:134)、

[0172] XIALVVXSWLPIXGGLTAFFGX(SEQ ID NO:135)、

[0173] ILXLVFGLLFAVTSVXFLVQW(SEQ ID NO:136)、以及

[0174] WQVLFXVSTVAFLLGFVLXLI(SEQ ID NO:137)，其中，每一X独立为D、E、Gla、或Aad。

[0175] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含下述序列：

[0176] WARYAXWLFTTPLLLLXLALL(SEQ ID NO:138)、

[0177] YARYAXWLFTTPLLLLXLALL(SEQ ID NO:139)、

[0178] WARYSXWLFTTPLLLYXLGLL(SEQ ID NO:140)、

[0179] WARYTXWFTTPLLLYXLALLA(SEQ ID NO:141)、

[0180] WARYTXWLFTTPLLLYXLGLL(SEQ ID NO:142)、

[0181] WARYAXWLFTTPLLLLXLSLL(SEQ ID NO:143)、

[0182] LLALXLLLLPTTFLWXAYRAW(SEQ ID NO:144)、

[0183] LLALXLLLLPTTFLWXAYRAY(SEQ ID NO:145)、

[0184] LLGLXYLLLPTTFLWXSYRAW(SEQ ID NO:146)、

[0185] ALLALXYLLLPTTFWXTYRAW(SEQ ID NO:147)、

[0186] LLGLXYLLLPTTFLWXTYRAW(SEQ ID NO:148)、

[0187] LLSLXLLLLPTTFLWXAYRAW(SEQ ID NO:149)、

[0188] GLAGLLGLXGLLGLPLGLLXGLWLGL(SEQ ID NO:150)、

[0189] LGLWLGXLLGLPLGLLGXLGLLGALG(SEQ ID NO:151)、

[0190] WRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:152)、

[0191] WLLXLLLTXTPFLLXLYARW(SEQ ID NO:153)、

[0192] WARYLXWLFPTXTLLLXL(SEQ ID NO:154)、

[0193] WAQYLXLLFPTXTLLLXW(SEQ ID NO:155)、

[0194] LXLLLTXTPFLWXLYRAW(SEQ ID NO:156)、

[0195] WXLLLTXTPFLLXLYQAW(SEQ ID NO:157)、

[0196] WLFTTPLLLLNGALLVX(SEQ ID NO:158)、

[0197] WLFTTPLLLLPGALLVX(SEQ ID NO:159)、

[0198] WARYAXLLFPTTLAW(SEQ ID NO:160)、

[0199] XVLLAGNLLLLPTTFLW(SEQ ID NO:161)、

[0200] XVLLAGPLLLLPTTFLW(SEQ ID NO:162)、

[0201] WALTTPFLLXAYRAW(SEQ ID NO:163)、

[0202] NLXGFFATLGGXIALWSLVVLAIX(SEQ ID NO:164)、

[0203] XGFFATLGGXIALWSXVVLAIX(SEQ ID NO:165)、

[0204] XGFFATLGGXIPLWSXVVLAIX(SEQ ID NO:166)、

[0205] XIALVVLSWLAIXGGLTAFFGXLN(SEQ ID NO:167)、

[0206] XIALVVXSWLAIXGGLTAFFGX(SEQ ID NO:168)、

[0207] XIALVVXSWLPIXGGLTAFFGX(SEQ ID NO:169)、

[0208] ILXLVFGLLFAVTSVXFLVQW(SEQ ID NO:170)、或

[0209] WQVLFXVSTVAFLLGFVLXLI(SEQ ID NO:171)，其中，每一X独立为D、E、Gla、或Aad。

[0210] 某些具体实施例中，该pHLIP肽包含任一下述序列中存在的至少8至25个接续氨基酸(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个接续氨基酸)：

[0211] X2X2RX2X2X1X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2(SEQ ID NO:447)、

[0212] X2X2RX2X3X1X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2X1X2GX2X2(SEQ ID NO:448)、

[0213] X2X2RX2X3X1X2X2X3X3X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2(SEQ ID NO:449)、

[0214] X2X2RX2X2X1X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2X1X2X3X2X2(SEQ ID NO:450)、

[0215] X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X3X3X2X2X2X1X2X2RX2X2(SEQ ID NO:451)、

[0216] X2X2GX2X1X2X2X2X2X2X3X3X2X2X2X1X3X2RX2X2(SEQ ID NO:452)、

[0217] X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X3X3X2X2X1X3X2RX2X2(SEQ ID NO:453)、

[0218] X2X2X3X2X1X2X2X2X2X2X3X3X2X2X2X1X2X2RX2X2(SEQ ID NO:454)、

[0219] GX2X2GX2X2GX2X1GX2X2GX2X2X2GX2X2X1GX2X2X2GX2(SEQ ID NO:455)、

[0220] X2GX2X2X2GX1X2X2GX2X2X2GX2X2GX1X2GX2X2GX2X2G(SEQ ID NO:456)、

[0221] X2RX2X2X2X1X2X2X2X2X3X1X3X2X2X2X1X2X2X2(SEQ ID NO:457)、

[0222] X2X2X2X1X2X2X2X3X1X3X2X2X2X2X1X2X2X2RX2(SEQ ID NO:458)、

[0223] X2X2RX2X2X1X2X2X2X2X3X1X3X2X2X2XX2(SEQ ID NO:459)、

[0224] X2X2QX2X2X1X2X2X2X2X3X1X3X2X2X2X1X2(SEQ ID NO:460)、

[0225] X2X1X2X2X2X3X1X3X2X2X2X2X1X2X2RX2X2(SEQ ID NO:461)、

[0226] X2X1X2X2X2X3X1X3X2X2X2X2X1X2X2QX2X2(SEQ ID NO:462)、

[0227] X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2NGX2X2X2X2X1(SEQ ID NO:463)、

[0228] X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2X2GX2X2X2X2X1(SEQ ID NO:464)、

[0229] X2X2RX2X2X1X2X2X2X2X3X3X2X2X2(SEQ ID NO:465)、

[0230] X1X2X2X2X2GNX2X2X2X2X2X3X3X2X2X2(SEQ ID NO:466)、

[0231] X1X2X2X2X2GX2X2X2X2X2X2X3X3X2X2X2(SEQ ID NO:467)、

[0232] X2X2X2X3X3X2X2X2X2X1X2X2RX2X2(SEQ ID NO:468)、

[0233] GNX2X1GX2X2X2X3X2GGX1X2X2X2X2X3X2X2X2X2X2X2X1(SEQ ID NO:469)、

[0234] X1GX2X2X2X3X2GGX1X2X2X2X2X3X1X2X2X2X2X2X1(SEQ ID NO:470)、

[0235] X1GX2X2X2X3X2GGX1X2X2X2X2X3X1X2X2X2X2X2X1(SEQ ID NO:471)、

[0236] X1X2X2X2X2X2X2X3X2X2X2X2X1GGX2X3X2X2X2GX1X2NG(SEQ ID NO:472)、

[0237] X1X2X2X2X2X2X1X3X2X2X2X2X1GGX2X3X2X2X2GX1(SEQ ID NO:473)、

[0238] X1X2X2X2X2X2X1X3X2X2X2X2X1GGX2X3X2X2X2GX1(SEQ ID NO:474)、

[0239] X2X2X1X2X2X2GX2X2X2X2X2X3X3X2X1X2X2X2QX2(SEQ ID NO:475)、以及

[0240] X2QX2X2X2X1X2X3X3X2X2X2X2X2GX2X2X2X1X2X2(SEQ ID NO:476)，其中每一X1独立为D、E、Gla、或Aad，每一X2独立为A、I、L、M、F、P、W、Y、V、或G，以及，每一X3独立为S、T、或G。

[0241] 多个具体实施例中，该pHLIP肽包含下述序列：

[0242] X2X2RX2X2X1X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2(SEQ ID NO:477)、

[0243] X2X2RX2X3X1X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2X1X2GX2X2(SEQ ID NO:478)、

[0244] X2X2RX2X3X1X2X2X3X3X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2(SEQ ID NO:479)、

[0245] X2X2RX2X2X1X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2X1X2X3X2X2(SEQ ID NO:480)、

[0246] X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X3X3X2X2X2X1X2X2RX2X2(SEQ ID NO:481)、

[0247] X2X2GX2X1X2X2X2X2X2X3X3X2X2X2X1X3X2RX2X2(SEQ ID NO:482)、

[0248] X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X3X3X2X2X1X3X2RX2X2(SEQ ID NO:483)、

[0249] X2X2X3X2X1X2X2X2X2X2X3X3X2X2X2X1X2X2RX2X2(SEQ ID NO:484)、

[0250] GX2X2GX2X2GX2X1GX2X2GX2X2X2GX2X2X1GX2X2X2GX2(SEQ ID NO:485)、

[0251] X2GX2X2X2GX1X2X2GX2X2X2GX2X2GX1X2GX2X2GX2X2G(SEQ ID NO:486)、

[0252] X2RX2X2X2X1X2X2X2X2X3X1X3X2X2X2X1X2X2X2(SEQ ID NO:487)、

[0253] X2X2X2X1X2X2X2X3X1X3X2X2X2X2X1X2X2X2RX2(SEQ ID NO:488)、

[0254] X2X2RX2X2X1X2X2X2X2X3X1X3X2X2X2XX2(SEQ ID NO:489)、

[0255] X2X2QX2X2X1X2X2X2X2X3X1X3X2X2X2X1X2(SEQ ID NO:490)、

[0256] X2X1X2X2X2X3X1X3X2X2X2X2X1X2X2RX2X2(SEQ ID NO:491)、

[0257] X2X1X2X2X2X3X1X3X2X2X2X2X1X2X2QX2X2(SEQ ID NO:492)、

[0258] X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2NGX2X2X2X2X1(SEQ ID NO:493)、

[0259] X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2X2GX2X2X2X2X1(SEQ ID NO:494)、

[0260] X2X2RX2X2X1X2X2X2X2X3X3X2X2X2(SEQ ID NO:495)、

[0261] X1X2X2X2X2GNX2X2X2X2X2X3X3X2X2X2(SEQ ID NO:496)、

[0262] X1X2X2X2X2GX2X2X2X2X2X2X3X3X2X2X2(SEQ ID NO:497)、

[0263] X2X2X2X3X3X2X2X2X2X1X2X2RX2X2(SEQ ID NO:498)、

[0264] GNX2X1GX2X2X2X3X2GGX1X2X2X2X2X3X2X2X2X2X2X2X1(SEQ ID NO:499)、

[0265] X1GX2X2X2X3X2GGX1X2X2X2X2X3X1X2X2X2X2X2X1(SEQ ID NO:500)、

[0266] X1GX2X2X2X3X2GGX1X2X2X2X2X3X1X2X2X2X2X2X1(SEQ ID NO:501)、

[0267] X1X2X2X2X2X2X2X3X2X2X2X2X1GGX2X3X2X2X2GX1X2NG(SEQ ID NO:502)、

[0268] X1X2X2X2X2X2X1X3X2X2X2X2X1GGX2X3X2X2X2GX1(SEQ ID NO:503)、

[0269] X1X2X2X2X2X2X1X3X2X2X2X2X1GGX2X3X2X2X2GX1(SEQ ID NO:504)、

[0270] X2X2X1X2X2X2GX2X2X2X2X2X3X3X2X1X2X2X2QX2(SEQ ID NO:505)、以及

[0271] X2QX2X2X2X1X2X3X3X2X2X2X2X2GX2X2X2X1X2X2(SEQ ID NO:506)，其中每一X1独立为D、E、Gla、或Aad，每一X2独立为A、I、L、M、F、P、W、Y、V、或G，以及，每一X3独立为S、T、或G。

[0272] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含任一下述序列中存在的至少8至25个接续氨基酸(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个接续氨基酸)：

[0273] AEQNPIYWARYAEWLFTTPLLLLELALLVEAEET(SEQ ID NO:172)、

[0274] ADDQNPWRAYLDLLFPDTTDLLLLDLLWDADET(SEQ ID NO:173)、

[0275] AEEQNPWRAYLELLFPETTELLLLELLWEAEET(SEQ ID NO:174)、

[0276] AEQNPIYWARYAGlaWLFTTPLLLLGlaLALLVDADET(SEQ ID NO:175)、

[0277] AEQNPIYWARYAAadWLFTTPLLLLAadLALLVDADET(SEQ ID NO:176)、

[0278] AEQNPIYWARYAAadWLFTTPLLLLGlaLALLVDADET(SEQ ID NO:177)、

[0279] CEQNPIYWARYADWHFTTPLLLLDLALLVDADE(SEQ ID NO:178)、

[0280] ADNNPWIYARYADLTTFPLLLLDLALLVDFDD(SEQ ID NO:179)、

[0281] ADNNPFIYARYADLTTWPLLLLDLALLVDFDD(SEQ ID NO:180)、

[0282] ADNNPFIYARYADLTTFPLLLLDLALLVDWDD(SEQ ID NO:181)、

[0283] ADNNPFPYARYADLTTWILLLLDLALLVDFDD(SEQ ID NO:182)、

[0284] ADNNPFIYAYRADLTTFPLLLLDLALLVDWDD(SEQ ID NO:183)、

[0285] ADNNPFIYATYADLRTFPLLLLDLALLVDWDD(SEQ ID NO:184)、

[0286] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWDADE(SEQ ID NO:185)、

[0287] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:186)、

[0288] ADDQNPWRAYLDLLFPTGlaTLLLDLLW(SEQ ID NO:187)、

[0289] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:188)、

[0290] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTGlaTLLLDLLW(SEQ ID NO:189)、

[0291] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTDTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:190)、

[0292] ADDQNPWRAYLDLLFPTGlaTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:191)、

[0293] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTGlaTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:192)、

[0294] ADDQNPWRAYLAadLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:193)、

[0295] ADDQNPWRAYLDLLFPTAadTLLLDLLW(SEQ ID NO:194)、

[0296] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLAadLLW(SEQ ID NO:195)、

[0297] ADDQNPWRAYLAadLLFPTAadTLLLDLLW(SEQ ID NO:196)、

[0298] ADDQNPWRAYLAadLLFPTDTLLLAadLLW(SEQ ID NO:197)、

[0299] ADDQNPWRAYLDLLFPTAadTLLLAadLLW(SEQ ID NO:198)、

[0300] ADDQNPWRAYLAadLLFPTAadTLLLAadLLW(SEQ ID NO:199)、

[0301] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTAadTLLLDLLW(SEQ ID NO:200)、

[0302] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTDTLLLAadLLW(SEQ ID NO:201)、

[0303] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTGlaTLLLAadLLW(SEQ ID NO:202)、

[0304] ADDQNPWRAYLAadLLFPTGlaTLLLDLLW(SEQ ID NO:203)、

[0305] ADDQNPWRAYLAadLLFPTDTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:204)、

[0306] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTAadTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:205)、

[0307] GEEQNPWLGAYLDLLFPLELLGLLELGLW(SEQ ID NO:206)、

[0308] EQNPIYILDLVFGLLFAVTSVDFLVQWDDAGD(SEQ ID NO:207)、NNEGFFATLGGEIALWSDVVLAIE(SEQ ID NO:208)、以及

[0309] DNNEGFFATLGGEIPLWSDVVLAIE(SEQ ID NO:209)。

[0310] 某些具体实施例中，该pHLIP肽包含下述序列：

[0311] AEQNPIYWARYAEWLFTTPLLLLELALLVEAEET(SEQ ID NO:210)、

[0312] ADDQNPWRAYLDLLFPDTTDLLLLDLLWDADET(SEQ ID NO:211)、

[0313] AEEQNPWRAYLELLFPETTELLLLELLWEAEET(SEQ ID NO:212)、

[0314] AEQNPIYWARYAGlaWLFTTPLLLLGlaLALLVDADET(SEQ ID NO:213)、

[0315] AEQNPIYWARYAAadWLFTTPLLLLAadLALLVDADET(SEQ ID NO:214)、

[0316] AEQNPIYWARYAAadWLFTTPLLLLGlaLALLVDADET(SEQ ID NO:215)、

[0317] CEQNPIYWARYADWHFTTPLLLLDLALLVDADE(SEQ ID NO:216)、

[0318] ADNNPWIYARYADLTTFPLLLLDLALLVDFDD(SEQ ID NO:217)、

[0319] ADNNPFIYARYADLTTWPLLLLDLALLVDFDD(SEQ ID NO:218)、

[0320] ADNNPFIYARYADLTTFPLLLLDLALLVDWDD(SEQ ID NO:219)、

[0321] ADNNPFPYARYADLTTWILLLLDLALLVDFDD(SEQ ID NO:220)、

[0322] ADNNPFIYAYRADLTTFPLLLLDLALLVDWDD(SEQ ID NO:221)、

[0323] ADNNPFIYATYADLRTFPLLLLDLALLVDWDD(SEQ ID NO:222)、

[0324] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWDADE(SEQ ID NO:223)、

[0325] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:224)、

[0326] ADDQNPWRAYLDLLFPTGlaTLLLDLLW(SEQ ID NO:225)、

[0327] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:226)、

[0328] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTGlaTLLLDLLW(SEQ ID NO:227)、

[0329] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTDTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:228)、

[0330] ADDQNPWRAYLDLLFPTGlaTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:229)、

[0331] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTGlaTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:230)、

[0332] ADDQNPWRAYLAadLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:231)、

[0333] ADDQNPWRAYLDLLFPTAadTLLLDLLW(SEQ ID NO:232)、

[0334] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLAadLLW(SEQ ID NO:233)、

[0335] ADDQNPWRAYLAadLLFPTAadTLLLDLLW(SEQ ID NO:234)、

[0336] ADDQNPWRAYLAadLLFPTDTLLLAadLLW(SEQ ID NO:235)、

[0337] ADDQNPWRAYLDLLFPTAadTLLLAadLLW(SEQ ID NO:236)、

[0338] ADDQNPWRAYLAadLLFPTAadTLLLAadLLW(SEQ ID NO:237)、

[0339] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTAadTLLLDLLW(SEQ ID NO:238)、

[0340] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTDTLLLAadLLW(SEQ ID NO:239)、

[0341] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTGlaTLLLAadLLW(SEQ ID NO:240)、

[0342] ADDQNPWRAYLAadLLFPTGlaTLLLDLLW(SEQ ID NO:241)、

[0343] ADDQNPWRAYLAadLLFPTDTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:242)、

[0344] ADDQNPWRAYLGlaLLFPTAadTLLLGlaLLW(SEQ ID NO:243)、

[0345] GEEQNPWLGAYLDLLFPLELLGLLELGLW(SEQ ID NO:244)、

[0346] EQNPIYILDLVFGLLFAVTSVDFLVQWDDAGD(SEQ ID NO:245)、

[0347] NNEGFFATLGGEIALWSDVVLAIE(SEQ ID NO:246)、或

[0348] DNNEGFFATLGGEIPLWSDVVLAIE(SEQ ID NO:247)。

[0349] 某些具体实施例中，该pHLIP肽包含任一下述序列中存在的至少8至25个接续氨基酸(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个接续氨基酸)：

[0350] AXQNPIYWARYAXWLFTTPLLLLXLALLVXAXXT(SEQ ID NO:248)、

[0351] AXXQNPWRAYLXLLFPXTTXLLLLXLLWXAXXT(SEQ ID NO:249)、

[0352] AXXQNPWRAYLXLLFPXTTXLLLLXLLWXAXXT(SEQ ID NO:250)、

[0353] AXQNPIYWARYAXWLFTTPLLLLXLALLVXAXXT(SEQ ID NO:251)、

[0354] AXQNPIYWARYAXWLFTTPLLLLXLALLVXAXXT(SEQ ID NO:252)、

[0355] AXQNPIYWARYAXWLFTTPLLLLXLALLVXAXXT(SEQ ID NO:253)、

[0356] CXQNPIYWARYAXWHFTTPLLLLXLALLVXAXX(SEQ ID NO:254)、

[0357] AXNNPWIYARYAXLTTFPLLLLXLALLVXFXX(SEQ ID NO:255)、

[0358] AXNNPFIYARYAXLTTWPLLLLXLALLVXFXX(SEQ ID NO:256)、

[0359] AXNNPFIYARYAXLTTFPLLLLXLALLVXWXX(SEQ ID NO:257)、

[0360] AXNNPFPYARYAXLTTWILLLLXLALLVXFXX(SEQ ID NO:258)、

[0361] AXNNPFIYAYRAXLTTFPLLLLXLALLVXWXX(SEQ ID NO:259)、

[0362] AXNNPFIYATYAXLRTFPLLLLXLALLVXWXX(SEQ ID NO:260)、

[0363] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLWXAXX(SEQ ID NO:261)、

[0364] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:262)、

[0365] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:263)、

[0366] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:264)、

[0367] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:265)、

[0368] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:266)、

[0369] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:267)、

[0370] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:268)、

[0371] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:269)、

[0372] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:270)、

[0373] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:271)、

[0374] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:272)、

[0375] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:273)、

[0376] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:274)、

[0377] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:275)、

[0378] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:276)、

[0379] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:277)、

[0380] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:278)、

[0381] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:279)、

[0382] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:280)、

[0383] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:281)、

[0384] GXXQNPWLGAYLXLLFPLXLLGLLXLGLW(SEQ ID NO:282)、

[0385] XQNPIYILXLVFGLLFAVTSVXFLVQWXXAGX(SEQ ID NO:283)、

[0386] NNXGFFATLGGXIALWSXVVLAIX(SEQ ID NO:284)、以及

[0387] XNNXGFFATLGGXIPLWSXVVLAIX(SEQ ID NO:285)，其中，每一X独立为D、E、Gla、或Aad。

[0388] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含下述序列：

[0389] AXQNPIYWARYAXWLFTTPLLLLXLALLVXAXXT(SEQ ID NO:286)、

[0390] AXXQNPWRAYLXLLFPXTTXLLLLXLLWXAXXT(SEQ ID NO:287)、

[0391] AXXQNPWRAYLXLLFPXTTXLLLLXLLWXAXXT(SEQ ID NO:288)、

[0392] AXQNPIYWARYAXWLFTTPLLLLXLALLVXAXXT(SEQ ID NO:289)、

[0393] AXQNPIYWARYAXWLFTTPLLLLXLALLVXAXXT(SEQ ID NO:290)、

[0394] AXQNPIYWARYAXWLFTTPLLLLXLALLVXAXXT(SEQ ID NO:291)、

[0395] CXQNPIYWARYAXWHFTTPLLLLXLALLVXAXX(SEQ ID NO:292)、

[0396] AXNNPWIYARYAXLTTFPLLLLXLALLVXFXX(SEQ ID NO:293)、

[0397] AXNNPFIYARYAXLTTWPLLLLXLALLVXFXX(SEQ ID NO:294)、

[0398] AXNNPFIYARYAXLTTFPLLLLXLALLVXWXX(SEQ ID NO:295)、

[0399] AXNNPFPYARYAXLTTWILLLLXLALLVXFXX(SEQ ID NO:296)、

[0400] AXNNPFIYAYRAXLTTFPLLLLXLALLVXWXX(SEQ ID NO:297)、

[0401] AXNNPFIYATYAXLRTFPLLLLXLALLVXWXX(SEQ ID NO:298)、

[0402] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLWXAXX(SEQ ID NO:299)、

[0403] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:300)、

[0404] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:301)、

[0405] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:302)、

[0406] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:303)、

[0407] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:304)、

[0408] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:305)、

[0409] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:306)、

[0410] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:307)、

[0411] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:308)、

[0412] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:309)、

[0413] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:310)、

[0414] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:311)、

[0415] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:312)、

[0416] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:313)、

[0417] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:314)、

[0418] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:315)、

[0419] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:316)、

[0420] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:317)、

[0421] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:318)、

[0422] AXXQNPWRAYLXLLFPTXTLLLXLLW(SEQ ID NO:319)、

[0423] GXXQNPWLGAYLXLLFPLXLLGLLXLGLW(SEQ ID NO:320)、

[0424] XQNPIYILXLVFGLLFAVTSVXFLVQWXXAGX(SEQ ID NO:321)、

[0425] NNXGFFATLGGXIALWSXVVLAIX(SEQ ID NO:322)、或

[0426] XNNXGFFATLGGXIPLWSXVVLAIX(SEQ ID NO:323)，其中，每一X独立为D、E、Gla、或Aad。

[0427] 某些具体实施例中，该pHLIP肽包含任一下述序列中存在的至少8至25个接续氨基酸(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个接续氨基酸)：

[0428] X2X1QNX2X2X2X2X2RX2X2X1X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X1X1X3(SEQ ID NO:507)、

[0429] X2X1X1QNX2X2RX2X2X2X1X2X2X2X2X1X3X3X1X2X2X2X2X1X2X2X2X1X2X1X1X3(SEQ ID NO:508)、[0430] CX1QNX2X2X2X2X2RX2X2X1X2HX2X3X3X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X1X1(SEQ ID NO:509)、[0431] X2X1NNX2X2X2X2X2RX2X2X1X2X3X3X2X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X1X1(SEQ ID NO:510)、[0432] X2X1NNX2X2X2X2X2X2RX2X1X2X3X3X2X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X1X1(SEQ ID NO:511)、[0433] X2X1NNX2X2X2X2X2X3X2X2X1X2RX3X2X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X1X1(SEQ ID NO:512)、[0434] X2X1X1QNX2X2RX2X2X2X1X2X2X2X2X3X1X3X2X2X2X1X2X2X2X1X2X1X1(SEQ ID NO:513)、

[0435] X2X1X1QNX2X2RX2X2X2X1X2X2X2X2X3X1X3X2X2X2X1X2X2X2(SEQ ID NO:514)、

[0436] X2X1X1QNX2X2X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2(SEQ ID NO:515)、

[0437] X1QNX2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X2X2X2X2X3X3X2X1X2X2X2QX2X1X1X2X2(SEQ ID NO:516)、[0438] NNX1X2X2X2X2X3X2X2X2X1X2X2X2X2X3X1X2X2X2X2X2X1(SEQ ID NO:517)、以及

[0439] X1NNX1X2X2X2X2X3X2X2X2X1X2X2X2X2X3X1X2X2X2X2X2X1(SEQ ID NO:518)，其中每一X1独立为D、E、Gla、或Aad，每一X2独立为A、I、L、M、F、P、W、Y、V、或G，以及，每一X3独立为S、T、或G。

[0440] 多个具体实施例中，该pHLIP肽包含下述序列：

[0441] X2X1QNX2X2X2X2X2RX2X2X1X2X2X2X3X3X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X1X1X3(SEQ ID NO:519)、

[0442] X2X1X1QNX2X2RX2X2X2X1X2X2X2X2X1X3X3X1X2X2X2X2X1X2X2X2X1X2X1X1X3(SEQ ID NO:520)、[0443] CX1QNX2X2X2X2X2RX2X2X1X2HX2X3X3X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X1X1(SEQ ID NO:521)、[0444] X2X1NNX2X2X2X2X2RX2X2X1X2X3X3X2X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X1X1(SEQ ID NO:522)、[0445] X2X1NNX2X2X2X2X2X2RX2X1X2X3X3X2X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X1X1(SEQ ID NO:523)、[0446] X2X1NNX2X2X2X2X2X3X2X2X1X2RX3X2X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X1X1(SEQ ID NO:524)、[0447] X2X1X1QNX2X2RX2X2X2X1X2X2X2X2X3X1X3X2X2X2X1X2X2X2X1X2X1X1(SEQ ID NO:525)、

[0448] X2X1X1QNX2X2RX2X2X2X1X2X2X2X2X3X1X3X2X2X2X1X2X2X2(SEQ ID NO:526)、

[0449] X2X1X1QNX2X2X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X1X2X2X2X2(SEQ ID NO:527)、

[0450] X1QNX2X2X2X2X2X1X2X2X2X2X2X2X2X2X2X3X3X2X1X2X2X2QX2X1X1X2X2(SEQ ID NO:528)、[0451] NNX1X2X2X2X2X3X2X2X2X1X2X2X2X2X3X1X2X2X2X2X2X1(SEQ ID NO:529)、以及

[0452] X1NNX1X2X2X2X2X3X2X2X2X1X2X2X2X2X3X1X2X2X2X2X2X1(SEQ ID NO:530)，其中每一X1独立为D、E、Gla、或Aad，每一X2独立为A、I、L、M、F、P、W、Y、V、或G，以及，每一X3独立为S、T、或G。

[0453] 一些具体实施例中，pHLIP肽包含至少8个接续氨基酸，其中，(i)该8个接续氨基酸中的至少4个是非极性氨基酸，(ii)该至少8个接续氨基酸中的至少1个是可质子化的，以及
(iii)该至少8个接续氨基酸包含与天然出现的人类蛋白质中8个接续氨基酸序列一致的序
列中的8个接续氨基酸。某些具体实施例中，该pHLIP肽在pH 5.0、5.5、6、6.0、6.5、6.6、6.7、
6.8、6.9、或7.0时对膜脂质双侧的亲和性高于pH 7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、或8.0时的亲和
性。

[0454] 多个具体实施例中，该至少8个接续氨基酸包含以序列，该序列与下述序列的一致性为至少85％、90％、或95％(如，100％一致)：(i)出现在天然出现的人类蛋白质中的至少8
个接续氨基酸的序列；或(ii)出现在天然出现的人类蛋白质中的至少8个接续氨基酸的反
序列。一些具体实施例中，该天然出现的人类蛋白质是人类视紫红质蛋白。某些具体实施例
中，该人类视紫红质蛋白中出现的8 个接续氨基酸位于下述序列中：
NLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIE(SEQ ID NO:531)。这一序列的反序列是
EIALVVLSWLAIEGGLTAFFGELN(SEQ ID NO:532)。

[0455] 多个具体实施例中，该pHLIP肽的序列包含8至20(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8至15、8至20、10至15、10至20、或15至20)个接续氨基酸，该接续氨基酸具有一个序列，该序列与人类视紫红质蛋白中出现的8至20(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、8至15、8至20、10至15、10至20、或15至20)个接续氨基酸序列的一致性为至少
85％、90％、或95％，其中，与人类视紫红质蛋白中出现的8至20(如，8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、8至15、8至20、10至15、10至20、或15至20)个接续氨基酸的序列相比，该pHLIP肽的8至20(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8至15、8至20、10至15、
10至20、或15至20)个接续氨基酸具有1、2、或3个氨基酸替换。一些具体实施例中，与人类视
紫红质蛋白中出现的8至20(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8至15、8至20、
10至15、10至20、或15至20)个接续氨基酸相比，该序列具有下述替换：L替换为D、L替换为E、A替换为P、或C替换为G。某些具体实施例中，该pHLIP肽的序列包含20个接续氨基酸，该接续
氨基酸具有一序列，该序列与人类视紫红质蛋白中出现的8至20(如，8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、8至15、8至20、10至15、10至20、或15至20)个接续氨基酸序列的一致性为至少85％、90％、或95％，其中，与人类视紫红质蛋白中出现的8至20(如，8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、8至15、8至20、10至15、10至20、或15至20)个接续氨基酸的反序列相比，该pHLIP肽的8至20(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8至15、8至20、
10至15、10至20、或15至20)个接续氨基酸具有1、2、或3个氨基酸替换。一些具体实施例中，
与人类视紫红质蛋白中出现的8至20(如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、8至
15、8至20、10至15、10至20、或15至20)个接续氨基酸的反序列相比，该序列具有下述替换：L替换为D、L替换为E、A替换为P、或C替换为G。

[0456] 编码人类视紫红质的基因组核苷酸序列的非限制性实例可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)参考序列号NC_000003.12下获得，NCBI参考序列号NC_000003.12下的所有
信息通过引用而并入本文。可从NCBI参考序列号NC_000003.12获得的核苷酸序列如下：

[0457] AGAGTCATCCAGCTGGAGCCCTGAGTGGCTGAGCTCAGGCCTTCGCAGCATTCTTGGGTGGGAGCAGCCACGGGTCAGCCACAAGGGCCACAGCCATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACG
GGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTA
CATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGC
GCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACC
CTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGG
CGGTATGAGCCGGGTGTGGGTGGGGTGTGCAGGAGCCCGGGAGCATGGAGGGGTCTGGGAGAGTCCCGGGCTTGGCG
GTGGTGGCTGAGAGGCCTTCTCCCTTCTCCTGTCCTGTCAATGTTATCCAAAGCCCTCATATATTCAGTCAACAAAC
ACCATTCATGGTGATAGCCGGGCTGCTGTTTGTGCAGGGCTGGCACTGAACACTGCCTTGATCTTATTTGGAGCAAT
ATGCGCTTGTCTAATTTCACAGCAAGAAAACTGAGCTGAGGCTCAAAGAAGTCAAGCGCCCTGCTGGGGCGTCACAC
AGGGACGGGTGCAGAGTTGAGTTGGAAGCCCGCATCTATCTCGGGCCATGTTTGCAGCACCAAGCCTCTGTTTCCCT
TGGAGCAGCTGTGCTGAGTCAGACCCAGGCTGGGCACTGAGGGAGAGCTGGGCAAGCCAGACCCCTCCTCTCTGGGG
GCCCAAGCTCAGGGTGGGAAGTGGATTTTCCATTCTCCAGTCATTGGGTCTTCCCTGTGCTGGGCAATGGGCTCGGT
CCCCTCTGGCATCCTCTGCCTCCCCTCTCAGCCCCTGTCCTCAGGTGCCCCTCCAGCCTCCCTGCCGCGTTCCAAGT
CTCCTGGTGTTGAGAACCGCAAGCAGCCGCTCTGAAGCAGTTCCTTTTTGCTTTAGAATAATGTCTTGCATTTAACA
GGAAAACAGATGGGGTGCTGCAGGGATAACAGATCCCACTTAACAGAGAGGAAAACTGAGGCAGGGAGAGGGGAAGA
GACTCATTTAGGGATGTGGCCAGGCAGCAACAAGAGCCTAGGTCTCCTGGCTGTGATCCAGGAATATCTCTGCTGAG
ATGCAGGAGGAGACGCTAGAAGCAGCCATTGCAAAGCTGGGTGACGGGGAGAGCTTACCGCCAGCCACAAGCGTCTC
TCTGCCAGCCTTGCCCTGTCTCCCCCATGTCCAGGCTGCTGCCTCGGTCCCATTCTCAGGGAATCTCTGGCCATTGT
TGGGTGTTTGTTGCATTCAATAATCACAGATCACTCAGTTCTGGCCAGAAGGTGGGTGTGCCACTTACGGGTGGTTG
TTCTCTGCAGGGTCAGTCCCAGTTTACAAATATTGTCCCTTTCACTGTTAGGAATGTCCCAGTTTGGTTGATTAACT
ATATGGCCACTCTCCCTATGGAACTTCATGGGGTGGTGAGCAGGACAGATGTCTGAATTCCATCATTTCCTTCTTCT
TCCTCTGGGCAAAACATTGCACATTGCTTCATGGCTCCTAGGAGAGGCCCCCACATGTCCGGGTTATTTCATTTCCC
GAGAAGGGAGAGGGAGGAAGGACTGCCAATTCTGGGTTTCCACCACCTCTGCATTCCTTCCCAACAAGGAACTCTGC
CCCACATTAGGATGCATTCTTCTGCTAAACACACACACACACACACACACACACAACACACACACACACACACACAC
ACACACACACACAAAACTCCCTACCGGGTTCCCAGTTCAATCCTGACCCCCTGATCTGATTCGTGTCCCTTATGGGC
CCAGAGCGCTAAGCAAATAACTTCCCCCATTCCCTGGAATTTCTTTGCCCAGCTCTCCTCAGCGTGTGGTCCCTCTG
CCCCTTCCCCCTCCTCCCAGCACCAAGCTCTCTCCTTCCCCAAGGCCTCCTCAAATCCCTCTCCCACTCCTGGTTGC
CTTCCTAGCTACCCTCTCCCTGTCTAGGGGGGAGTGCACCCTCCTTAGGCAGTGGGGTCTGTGCTGACCGCCTGCTG
ACTGCCTTGCAGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCC
ATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGC
CGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTAATGGCACTGAGCAGAAGGGAAGAAGCTCCGGGGGCTCTTTGTAGGGT
CCTCCAGTCAGGACTCAAACCCAGTAGTGTCTGGTTCCAGGCACTGACCTTGTATGTCTCCTGGCCCAAATGCCCAC
TCAGGGTAGGGGTGTAGGGCAGAAGAAGAAACAGACTCTAATGTTGCTACAAGGGCTGGTCCCATCTCCTGAGCCCC
ATGTCAAACAGAATCCAAGACATCCCAACCCTTCACCTTGGCTGTGCCCCTAATCCTCAACTAAGCTAGGCGCAAAT
TCCAATCCTCTTTGGTCTAGTACCCCGGGGGCAGCCCCCTCTAACCTTGGGCCTCAGCAGCAGGGGAGGCCACACCT
TCCTAGTGCAGGTGGCCATATTGTGGCCCCTTGGAACTGGGTCCCACTCAGCCTCTAGGCGATTGTCTCCTAATGGG
GCTGAGATGAGACACAGTGGGGACAGTGGTTTGGACAATAGGACTGGTGACTCTGGTCCCCAGAGGCCTCATGTCCC
TCTGTCTCCAGAAAATTCCCACTCTCACTTCCCTTTCCTCCTCAGTCTTGCTAGGGTCCATTTCTTACCCCTTGCTG
AATTTGAGCCCACCCCCTGGACTTTTTCCCCATCTTCTCCAATCTGGCCTAGTTCTATCCTCTGGAAGCAGAGCCGC
TGGACGCTCTGGGTTTCCTGAGGCCCGTCCACTGTCACCAATATCAGGAACCATTGCCACGTCCTAATGACGTGCGC
TGGAAGCCTCTAGTTTCCAGAAGCTGCACAAAGATCCCTTAGATACTCTGTGTGTCCATCTTTGGCCTGGAAAATAC
TCTCACCCTGGGGCTAGGAAGACCTCGGTTTGTACAAACTTCCTCAAATGCAGAGCCTGAGGGCTCTCCCCACCTCC
TCACCAACCCTCTGCGTGGCATAGCCCTAGCCTCAGCGGGCAGTGGATGCTGGGGCTGGGCATGCAGGGAGAGGCTG
GGTGGTGTCATCTGGTAACGCAGCCACCAAACAATGAAGCGACACTGATTCCACAAGGTGCATCTGCATCCCCATCT
GATCCATTCCATCCTGTCACCCAGCCATGCAGACGTTTATGATCCCCTTTTCCAGGGAGGGAATGTGAAGCCCCAGA
AAGGGCCAGCGCTCGGCAGCCACCTTGGCTGTTCCC

[0458] AAGTCCCTCACAGGCAGGGTCTCCCTACCTGCCTGTCCTCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCA
CTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGTACGGGCCGGG
GGGTGGGCGGCCTCACGGCTCTGAGGGTCCAGCCCCCAGCATGCATCTGCGGCTCCTGCTCCCTGGAGGAGCCATG
GTCTGGACCCGGGTCCCGTGTCCTGCAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAG
GAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCT
ACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGC
CATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGGTGCCTACTGCGGGTGGGAGGGCCCCAGTGCCCCAG
GCCACAGGCGCTGCCTGCCAAGGACAAGCTACTTCCCAGGGCAGGGGAGGGGGCTCCATCAGGGTTACTGGCAGCA
GTCTTGGGTCAGCAGTCCCAATGGGGAGTGTGTGAGAAATGCAGATTCCTGGCCCCACTCAGAACTGCTGAATCTC
AGGGTGGGCCCAGGAACCTGCATTTCCAGCAAGCCCTCCACAGGTGGCTCAGATGCTCACTCAGGTGGGAGAAGCT
CCAGTCAGCTAGTTCTGGAAGCCCAATGTCAAAGTCAGAAGGACCCAAGTCGGGAATGGGATGGGCCAGTCTCCAT
AAAGCTGAATAAGGAGCTAAAAAGTCTTATTCTGAGGGGTAAAGGGGTAAAGGGTTCCTCGGAGAGGTACCTCCGA
GGGGTAAACAGTTGGGTAAACAGTCTCTGAAGTCAGCTCTGCCATTTTCTAGCTGTATGGCCCTGGGCAAGTCAAT
TTCCTTCTCTGTGCTTTGGTTTCCTCATCCATAGAAAGGTAGAAAGGGCAAAACACCAAACTCTTGGATTACAAGA
GATAATTTACAGAACACCCTTGGCACACAGAGGGCACCATGAAATGTCACGGGTGACACAGCCCCCTTGTGCTCAG
TCCCTGGCATCTCTAGGGGTGAGGAGCGTCTGCCTAGCAGGTTCCCTCCAGGAAGCTGGATTTGAGTGGATGGGGC
GCTGGAATCGTGAGGGGCAGAAGCAGGCAAAGGGTCGGGGCGAACCTCACTAACGTGCCAGTTCCAAGCACACTGT
GGGCAGCCCTGGCCCTGACTCAAGCCTCTTGCCTTCCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCA
AGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAAGA
CCTGCCTAGGACTCTGTGGCCGACTATAGGCGTCTCCCATCCCCTACACCTTCCCCCAGCCACAGCCATCCCACCA
GGAGCAGCGCCTGTGCAGAATGAACGAAGTCACATAGGCTCCTTAATTTTTTTTTTTTTTTTAAGAAATAATTAAT
GAGGCTCCTCACTCACCTGGGACAGCCTGAGAAGGGACATCCACCAAGACCTACTGATCTGGAGTCCCACGTTCCC
CAAGGCCAGCGGGATGTGTGCCCCTCCTCCTCCCAACTCATCTTTCAGGAACACGAGGATTCTTGCTTTCTGGAAA
AGTGTCCCAGCTTAGGGATAAGTGTCTAGCACAGAATGGGGCACACAGTAGGTGCTTAATAAATGCTGGATGGATG
CAGGAAGGAATGGAGGAATGAATGGGAAGGGAGAACATATCTATCCTCTCAGACCCTCGCAGCAGCAGCAACTCAT
ACTTGGCTAATGATATGGAGCAGTTGTTTTTCCCTCCCTGGGCCTCACTTTCTTCTCCTATAAAATGGAAATCCCA
GATCCCTGGTCCTGCCGACACGCAGCTACTGAGAAGACCAAAAGAGGTGTGTGTGTGTCTATGTGTGTGTTTCAGC
ACTTTGTAAATAGCAAGAAGCTGTACAGATTCTAGTTAATGTTGTGAATAACATCAATTAATGTAACTAGTTAATT
ACTATGATTATCACCTCCTGATAGTGAACATTTTGAGATTGGGCATTCAGATGATGGGGTTTCACCCAACCTTGGG
GCAGGTTTTTAAAAATTAGCTAGGCATCAAGGCCAGACCAGGGCTGGGGGTTGGGCTGTAGGCAGGGACAGTCACA
GGAATGCAGAATGCAGTCATCAGACCTGAAAAAACAACACTGGGGGAGGGGGACGGTGAAGGCCAAGTTCCCAATG
AGGGTGAGATTGGGCCTGGGGTCTCACCCCTAGTGTGGGGCCCCAGGTCCCGTGCCTCCCCTTCCCAATGTGGCCT
ATGGAGAGACAGGCCTTTCTCTCAGCCTCTGGAAGCCACCTGCTCTTTTGCTCTAGCACCTGGGTCCCAGCATCTA
GAGCATGGAGCCTCTAGAAGCCATGCTCACCCGCCCACATTTAATTAACAGCTGAGTCCCTGATGTCATCCTTATC
TCGAAGAGCTTAGAAACAAAGAGTGGGAAATTCCACTGGGCCTACCTTCCTTGGGGATGTTCATGGGCCCCAGTTT
CCAGTTTCCCTTGCCAGACAAGCCCATCTTCAGCAGTTGCTAGTCCATTCTCCATTCTGGAGAATCTGCTCCAAAA
AGCTGGCCACATCTCTGAGGTGTCAGAATTAAGCTGCCTCAGTAACTGCTCCCCCTTCTCCATATAAGCAAAGCCA
GAAGCTCTAGCTTTACCCAGCTCTGCCTGGAGACTAAGGCAAATTGGGCCATTAAAAGCTCAGCTCCTATGTTGGT
ATTAACGGTGGTGGGTTTTGTTGCTTTCACACTCTATCCACAGGATAGATTGAAACTGCCAGCTTCCACCTGATCC
CTGACCCTGGGATGGCTGGATTGAGCAATGAGCAGAGCCAAGCAGCACAGAGTCCCCTGGGGCTAGAGGTGGAGGA
GGCAGTCCTGGGAATGGGAAAAACCCCA(SEQ ID NO:31)。

[0459] 人类视紫红质氨基酸序列的非限制性实例可从UniProt登记号P08100下获得。可从UniProt登记号P08100下获得的全部信息通过引用而并入本文。可从UniProt登记号
P08100下获得的氨基酸序列如下(下划线的氨基酸可能用于pHLIP的非限制性实例中，尤其
是用作涉及pHLIP肽的起始点)：

[0460] MNGTEGPNFYVPFSNATGVVRSPFEYPQYYLAEPWQFSMLAAYMFLLIVLGFPINFLTLYVTVQHKKLRTPLNYILLNLAVADLFMVLGGFTSTLYTSLHGYFVFGPTGCNLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIERYVVVCKPMS
NFRFGENHAIMGVAFTWVMALACAAPPLAGWSRYIPEGLQCSCGIDYYTLKPEVNNESFVIYMFVVHFTIPMIIIF
FCYGQLVFTVKEAAAQQQESATTQKAEKEVTRMVIIMVIAFLICWVPYASVAFYIFTHQGSNFGPIFMTIPAFFAK
SAAIYNPVIYIMMNKQFRNCMLTTICCGKNPLGDDEASATVSKTETSQVAPA(SEQ ID NO:32)。

[0461] 例如，包含序列DNNEGFFATLGGEIPLWSDVVLAIE(SEQ ID NO:209)的pHLIP肽是一种可用的pHLIP肽，与NLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIE(SEQ ID NO:62)相比，该pHLIP肽包含3个替
换突变(下划线)和一个额外的氨基酸(N端的D)。也见，例如，表11中的Hum pHLIP，以及表5
和表6中的序列。

[0462] 编码人类视紫红质的cDNA序列的非限制性实例可在NCBI参考序列号NM_000539.3下获得，可从NCBI参考序列号NM_000539.3下获得的全部信息通过引用而并入本文。可从
NCBI参考序列号NM_000539.3获得的核苷酸序列如下：

[0463] AGAGTCATCCAGCTGGAGCCCTGAGTGGCTGAGCTCAGGCCTTCGCAGCATTCTTGGGTGGGAGCAGCCACGGGTCAGCCACAAGGGCCACAGCCATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGA
CGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGC
CTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAG
CTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCA
GCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCAC
CCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATG
AGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCG
CACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCT
CAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATC
TTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGA
AGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAG
CGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCC
AAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCA
TCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGC
CCCGGCCTAAGACCTGCCTAGGACTCTGTGGCCGACTATAGGCGTCTCCCATCCCCTACACCTTCCCCCAGCCACA
GCCATCCCACCAGGAGCAGCGCCTGTGCAGAATGAACGAAGTCACATAGGCTCCTTAATTTTTTTTTTTTTTTTAA
GAAATAATTAATGAGGCTCCTCACTCACCTGGGACAGCCTGAGAAGGGACATCCACCAAGACCTACTGATCTGGAG
TCCCACGTTCCCCAAGGCCAGCGGGATGTGTGCCCCTCCTCCTCCCAACTCATCTTTCAGGAACACGAGGATTCTT
GCTTTCTGGAAAAGTGTCCCAGCTTAGGGATAAGTGTCTAGCACAGAATGGGGCACACAGTAGGTGCTTAATAAAT
GCTGGATGGATGCAGGAAGGAATGGAGGAATGAATGGGAAGGGAGAACATATCTATCCTCTCAGACCCTCGCAGCA
GCAGCAACTCATACTTGGCTAATGATATGGAGCAGTTGTTTTTCCCTCCCTGGGCCTCACTTTCTTCTCCTATAAA
ATGGAAATCCCAGATCCCTGGTCCTGCCGACACGCAGCTACTGAGAAGACCAAAAGAGGTGTGTGTGTGTCTATGT
GTGTGTTTCAGCACTTTGTAAATAGCAAGAAGCTGTACAGATTCTAGTTAATGTTGTGAATAACATCAATTAATGT
AACTAGTTAATTACTATGATTATCACCTCCTGATAGTGAACATTTTGAGATTGGGCATTCAGATGATGGGGTTTCA
CCCAACCTTGGGGCAGGTTTTTAAAAATTAGCTAGGCATCAAGGCCAGACCAGGGCTGGGGGTTGGGCTGTAGGCA
GGGACAGTCACAGGAATGCAGAATGCAGTCATCAGACCTGAAAAAACAACACTGGGGGAGGGGGACGGTGAAGGCC
AAGTTCCCAATGAGGGTGAGATTGGGCCTGGGGTCTCACCCCTAGTGTGGGGCCCCAGGTCCCGTGCCTCCCCTTC
CCAATGTGGCCTATGGAGAGACAGGCCTTTCTCTCAGCCTCTGGAAGCCACCTGCTCTTTTGCTCTAGCACCTGGG
TCCCAGCATCTAGAGCATGGAGCCTCTAGAAGCCATGCTCACCCGCCCACATTTAATTAACAGCTGAGTCCCTGAT
GTCATCCTTATCTCGAAGAGCTTAGAAACAAAGAGTGGGAAATTCCACTGGGCCTACCTTCCTTGGGGATGTTCAT
GGGCCCCAGTTTCCAGTTTCCCTTGCCAGACAAGCCCATCTTCAGCAGTTGCTAGTCCATTCTCCATTCTGGAGAA
TCTGCTCCAAAAAGCTGGCCACATCTCTGAGGTGTCAGAATTAAGCTGCCTCAGTAACTGCTCCCCCTTCTCCATA
TAAGCAAAGCCAGAAGCTCTAGCTTTACCCAGCTCTGCCTGGAGACTAAGGCAAATTGGGCCATTAAAAGCTCAGC
TCCTATGTTGGTATTAACGGTGGTGGGTTTTGTTGCTTTCACACTCTATCCACAGGATAGATTGAAACTGCCAGCT
TCCACCTGATCCCTGACCCTGGGATGGCTGGATTGAGCAATGAGCAGAGCCAAGCAGCACAGAGTCCCCTGGGGCT
AGAGGTGGAGGAGGCAGTCCTGGGAATGGGAAAAACCCCA(SEQ ID NO:33)。

[0464] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含下述序列：XnYm、YmXn、XnYmXj、YmXnYi、YmXnYiXj、XnYmXjYi、YmXnYiXjYl、XnYmXjYiXl、YmXnYiXjYlXh、XnYmXjYiXhYg、YmXnYiXjYlXhYg、XnYmXjYiXhYgXf、(XY)n、(YX)n、(XY)nYm、(YX)nYm、(XY)nXm、(YX)nXm、Ym(XY)n、Ym(YX)n、Xn(XY)m、Xn(YX)m、(XY)nYm(XY)i、(YX)nYm(YX)i、(XY)nXm(XY)i、(YX)nXm(YX)i、Ym(XY)n、Ym(YX)n、Xn(XY)m、或Xn(YX)m，其中，(i)每一独立为溶剂化能的非极性氨基酸，或Gly；(ii)每一X独立为可质子化的氨基酸；(iii)n、m、i、j、l、h、g、f各自独立为1至8的整数。

[0465] 一些具体实施例中，该pHLIP肽在pH约为6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、或7.5的水中具有净负电荷。

[0466] 多个具体实施例中，该pHLIP肽的酸解离常数的基于10的对数(pKa)小于约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0。某些具体实施例中，该pHLIP肽的pKa为至少约6.5、6.6、6.7、
6.8、6.9、或7.0。一些具体实施例中，该pHLIP肽的pKa为介于约6.5与约7.0之间，如约6.6与
约7.0之间、约6.7与约7.0之间、约6.8与约7.0之间、或约6.9与约7.0之间。某些具体实施例
中，该pHLIP肽的pKa为约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、或7.0。

[0467] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含(a)1个可质子化的氨基酸，它是天冬氨酸、谷氨酸、α-胺基己二酸、或γ-羧基谷氨酸；或(b)至少2、3、或4个可质子化的氨基酸，其中，该可质子化的氨基酸包含天冬氨酸、谷氨酸、α-胺基己二酸、γ-羧基谷氨酸、或其组合。

[0468] 某些具体实施例中，该pHLIP肽包含至少一个非天然的可质子化的氨基酸。多个具体实施例中，该非天然的可质子化的氨基酸包含至少1、2、3、4或4个羧基。一些具体实施例
中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16个羧基。某些具体实施例中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或40个遗传编码的氨基酸。

[0469] 多个具体实施例中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或40个非遗传编码的氨基酸。一些具体实施例中，该pHLIP肽的氨基酸是非天然氨基酸。某些具体实施
例中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或40个D-氨基酸。

[0470] 多个具体实施例中，该pHLIP肽包含至少1个非遗传编码的安吉斯，其中，该非遗传编码的氨基酸是天冬氨酸衍生物或谷氨酸衍生物。

[0471] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含至少8个接续氨基酸，其中，该至少8个接续氨基酸中至少2、3或4个是非极性的，且该至少8个接续氨基酸中至少1、2、3或4个是可质子化
的。

[0472] 多个具体实施例中，该pHLIP经由键直接共价附接至荧光团，或经由链接基共价附接至荧光团。

[0473] 一些具体实施例中，pHLIP肽通过共价键附接至荧光团，其中，该共价键是酯键、二硫键、位于两个硒原子之间的键、位于硫原子与硒原子之间的键、或酸-不稳定的键。一些具
体实施例中，该pHLIP肽通过共价键附接至荧光团，其中，该共价键是已经通过链接化学反
应形成的键。某些具体实施例中，该共价键是已经通过下述之间的反应形成的键：(i)叠氮
化物与炔；(ii)炔与应变二氟辛炔；(iii)二芳基-应变-环辛炔与1,3-硝酮；(iv)环辛烯、反
式环烯、或氧杂降冰片二烯与叠氮化物、四嗪、或四唑；(v)活化的烯烃或氧杂降冰片二烯与
叠氮化物；(vi)应变环辛烯与其它活化烯烃与四嗪；或(vii)已经通过紫外光活化的四唑与
烯烃。某些具体实施例中，该共价键是肽键。多个具体实施例中，该共价键不是肽键。

[0474] 多个具体实施例中，pHLIP-荧光团化合物包含通过共价键附接至该链接基的pHLIP肽。一些具体实施例中，该共价键是肽键。某些具体实施例中，该共价键是二硫键、位
于两个硒原子之间的键、或位于硫原子与硒原子之间的键。多个具体实施例中，该共价键是
已经通过链接化学反应形成的键。一些具体实施例中，该共价键是已经通过下述之间的反
应形成的键：(i)叠氮化物与炔；(ii)炔与应变二氟辛炔；(iii)二芳基-应变-环辛炔与1,3-
硝酮；(iv)环辛烯、反式环烯、或氧杂降冰片二烯与叠氮化物、四嗪、或四唑；(v)活化的烯烃或氧杂降冰片二烯与叠氮化物；(vi)应变环辛烯与其它活化烯烃与四嗪；或(vii)已经通过
紫外光活化的四唑与烯烃。某些具体实施例中，该共价键是肽键。多个具体实施例中，该共
价键不是肽键。

[0475] 一些具体实施例中，该链接基包含具有天然存在聚合物的结构的人工聚合物或合成生产的聚合物。某些具体实施例中，该链接基包含多肽、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、
聚天冬氨酸、聚半胱氨酸、或聚核酸。多个具体实施例中，该链接基并不包含氨基酸。一些具
体实施例中，该链接基包含多糖、壳聚糖、或藻朊酸盐。某些具体实施例中，该链接基包含聚
乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙丙交酯、聚苹果酸、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷
酮、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸、聚酰胺基胺、聚酐、或聚氰基丙烯酸酯。多个具体实施例中，该链接基包含聚乙二醇。某些具体实施例中，该聚乙二醇的
分子量为60至100000道尔顿，如，至少约60、100、200、300、400、500、600、700、800、900、
1000、5000、10000、15000、20000、25000道尔顿，但低于约100000、90000、70000、60000、
50000、40000、或30000道尔顿。多个具体实施例中，该链接基包含线性聚合物或支链聚合
物。一些具体实施例中，该链接基包含有机化合物结构。某些具体实施例中，该有机化合物
结构的分子量低于约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0.5kDa。

[0476] 一些具体实施例中，该链接基经由共价键链接至荧光团(如，冷发光荧光团或淬灭剂)。某些具体实施例中，该共价键是酯键、二硫键、位于两个硒原子之间的键、位于硫原子
与硒原子之间的键、或酸不稳定的键。多个具体实施例中，该共价键是已经通过链接化学反
应形成的键。一些具体实施例中，该共价键是已经通过下述之间的反应形成的键：(i)叠氮
化物与炔；(ii)炔与应变二氟辛炔；(iii)二芳基-应变-环辛炔与1,3-硝酮；(iv)环辛烯、反
式环烯、或氧杂降冰片二烯与叠氮化物、四嗪、或四唑；(v)活化的烯烃或氧杂降冰片二烯与
叠氮化物；(vi)应变环辛烯与其它活化烯烃与四嗪；或(vii)已经通过紫外光活化的四唑与
烯烃。某些具体实施例中，该共价键是肽键。多个具体实施例中，该共价键不是肽键。

[0477] 一些具体实施例中，该荧光团是荧光染料或荧光蛋白。荧光团的非限制性实例包括荧光染料、磷光染料、量子点、氧杂蒽衍生物、花青衍生物、萘衍生物、香豆素衍生物、恶二唑衍生物、芘衍生物、吖啶衍生物、芳基次甲基衍生物、或四吡咯衍生物。氧杂蒽衍生物包
括，但不限于，荧光黄、若丹明、俄勒冈绿、曙红、德州红、和Cal Fluor染料。花青衍生物包括，但不限于，花青、吲哚羰花青(indocarbocyanine)、吲哚菁绿(ICG)、氧杂羰花青
(oxacarbocyanine)、硫杂羰花青(thiacarbocyanine)、部花青、和Quasar染料。萘衍生物包
括，但不限于，丹酰衍生物和普罗丹(prodan)衍生物。恶二唑衍生物包括，但不限于，吡啶基
恶唑、硝基苯并恶二唑和苯并恶二唑。芘衍生物的非限制性实例是瀑布蓝(cascade blue)。
恶啶(Oxadine)衍生物包括，但不限于，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、和恶嗪170。吖啶衍生物包
括，但不限于，原黄素、吖啶橙、和吖啶黄。芳基次甲基衍生物包括，但不限于，金胺、结晶紫、和孔雀石绿。四吡咯衍生物包括，但不限于，卟吩、酞菁和胆红素。

[0478] 多个具体实施例中，本文中包括的pHLIP-荧光团被用作诊断剂、成像剂。一些具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团化合物作为试剂用于体内成像和体内诊断方法中。
某些具体实施例中，本文中提供的pHLIP-荧光团化合物作为试剂用于间接体内成像和间接
体内诊断方法中。

[0479] 某些实作包含用于肠胃外给药、局部给药或全身给药的包含本文中揭露的pHLIP-荧光团化合物的制剂。

[0480] 还提供包含pHLIP-荧光团化合物的用于静脉给药、动脉给药、腹膜给药、脑内给药、脑室内给药、鞘内给药、心内给药、海绵窦内给药、骨内给药、眼内给药、或玻璃体内给药的制剂。

[0481] 本发明主旨还包括用于膀胱内滴注的包含本文中提供的pHLIP-荧光团化合物的制剂。

[0482] 多个具体实施例中，该荧光团经由链结如硫醇链结或酯链结或酸不稳定的链结而共价附接至该膜插入肽。也使用其它类型的链结、化学键、或结合关联。例示性的链结或关
联是以下列为中介：二硫键、及/或具有蛋白质结合基序的肽、及/或蛋白激酶共有序列、及/
或蛋白磷酸酶共有序列、及/或蛋白酶反应活性序列、及/或肽酶反应活性序列、及/或转移
酶反应活性序列、及/或水解酶反应活性序列、及/或异构酶反应活性序列、及/或连接酶反
应活性序列、及/或细胞外金属蛋白酶反应活性序列、及/或溶酶体蛋白酶反应活性序列、
及/或β-内酰胺酶反应活性序列、及/或氧化还原酶反应活性序列、及/或酯酶反应活性序
列、及/或糖苷酶反应活性序列、及/或核酸酶反应活性序列。

[0483] 某些具体实施例中，该荧光团经由非裂解性链结而共价附接至该膜插入肽。多个具体实施例中，非裂解性链结是不被由哺乳动物细胞所表达的酶裂解的共价键、及/或不被
谷胱甘肽裂解的共价键、及/或不在低pH条件下被裂解的共价键。非裂解性链结的非限制性
实例包括马来酰亚胺链结、作为N-羟基琥珀酰亚胺酯与伯胺(如，赖氨酸侧链的伯胺)反应
结果的链结、作为链接反应结果的链结、硫醚链结、或作为伯胺或巯基官能团与
琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)反应结果的链结。例示性
的非裂解性链结包括包含马来酰亚胺烷链接基的链结，和包
含马来酰亚胺环己烷链接基的链结。

[0484] 如上所述，该组合物可用于，例如，用于人类和动物(如，陪伴动物如狗和猫以及家畜如马、牛、山羊、绵羊、美洲驼)的诊断性和治疗性应用的临床环境中。包含此类基团的膜
插入化合物可用于多个临床诊断方法中，包括实时图像引导下的介入疗法。

[0485] 本文包括给药至身体以例如使用该领域已知方法进行诊断的用途的组合物。例如，通过输注如静脉(如，经由颈静脉、外周静脉或血管周空间)输注入血管内腔而完成该方
法。一些具体实施例中，将该组合物作为例如气雾剂或灌洗剂而输注入哺乳动物的肺内。多
个具体实施例中，通过膀胱内滴注将该组合物给药至人类或动物的膀胱、口腔、肠腔、食道、
或气管内。一些具体实施例中，可经由真皮下注射或皮下注射将药物注射入该哺乳动物的
腹腔。

[0486] 本文中包括药物组合物，其包含pH触发的化合物和药学可接受的载剂。

[0487] 一些具体实施例中，受试者是人类。某些具体实施例中，该哺乳动物是啮齿动物(如，小鼠或大鼠)、灵长动物(如，黑猩猩、大猩猩、猴、长臂猿、狒狒)、牛、骆驼、狗、猫、马、美洲驼、绵羊、山羊、鸡、火鸡、或鸭。某些具体实施例中，该受试者是人类。

[0488] 本发明主旨为提供用于检测患病组织的化合物和组合物。例如，本发明主旨的多个方面涉及对癌组织(肿瘤或转移病灶的癌组织)及/或癌前组织(如，异型增生的组织)的
检测。该化合物包括共价链接至吲哚菁绿(ICG)的pHLIP肽。该pHLIP肽包含序列LFPTXTLL
(SEQ ID NO:1)中的氨基酸，其中，X是可质子化的氨基酸。在优选的具体实施例中，X是除谷
氨酸之外的可质子化的氨基酸，如天冬氨酸。此外，该pH触发的肽在pH 5.0时对膜脂质双层
的亲和性高于在pH 8.0时的亲和性。多个实作中，该ICG共价附接至从该pHLIP肽的N端计数
的第一个或第二个氨基酸。

[0489] 本公开的多个方面，提供链接至ICG化合物的pHLIP肽。多个实作中，该pHLIP肽通过共价键而直接链接至ICG。一些非限制性实例中，该共价键是酯键、二硫键、位于两个硒原
子之间的键、位于硫原子与硒原子之间的键、或酸不稳定的键。

[0490] 一些具体实施例中，位于该pHLIP肽与该ICG之间的共价键是已经通过链接反应形成的键。链接反应的非限制性实例包括下述之间的反应：叠氮化物与炔；炔与应变二氟辛
炔；二芳基-应变-环辛炔与1,3-硝酮；环辛烯、反式环烯、或氧杂降冰片二烯与叠氮化物、四
嗪、或四唑；活化的烯烃或氧杂降冰片二烯与叠氮化物；应变环辛烯与其它活化烯烃与四
嗪；或已经通过紫外光活化的四唑与烯烃。

[0491] 一些实作提供通过共价键附接至链接基化合物的pHLIP肽，其中，该链接基化合物通过共价键而附接至该ICG。多个非限制性实例中，位于该pHLIP肽与该链接基化合物之间
的共价键及/或位于该链接基化合物与该ICG之间的共价键是二硫键、位于两个硒原子之间
的键、位于硫原子与硒原子之间的键、或已经通过链接反应形成的键。

[0492] 多个具体实施例中，该ICG经由链结如硫醇链结或硫代酯链结或酯链结或酸不稳定的链结而共价附接至该pHLIP肽。也可使用其它类型的链结、化学键、或结合关联。例示性
的链结或关联是以下列为中介：二硫键、及/或具有蛋白质结合基序的肽、及/或蛋白激酶共
有序列、及/或蛋白磷酸酶共有序列、及/或蛋白酶反应活性序列、及/或肽酶反应活性序列、
及/或转移酶反应活性序列、及/或水解酶反应活性序列、及/或异构酶反应活性序列、及/或
连接酶反应活性序列、及/或细胞外金属蛋白酶反应活性序列、及/或溶酶体蛋白酶反应活
性序列、及/或β-内酰胺酶反应活性序列、及/或氧化还原酶反应活性序列、及/或酯酶反应
活性序列、及/或糖苷酶反应活性序列、及/或核酸酶反应活性序列。

[0493] 某些具体实施例中，该荧光团经由非裂解性链结而共价附接至该pHLIP肽。多个具体实施例中，非裂解性链结是不被由哺乳动物细胞所表达的酶裂解的共价键、及/或不被谷
胱甘肽裂解的共价键、及/或不在低pH条件下被裂解的共价键。非裂解性链结的非限制性实
例包括马来酰亚胺链结[如，作为马来酰亚胺酯与硫醇(如，半胱氨酸侧链的巯基)反应结果
的链结]、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)链结[如，作为NHS酯与伯胺(如，赖氨酸侧链的伯胺)反应
结果的链结]、作为链接反应结果的链结、硫代酯链结、硫醚链结、或作为伯胺或巯基
官能团与琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)反应结果
的链结。例示性的非裂解性链结包括马来酰亚胺烷链接基如
和马来酰亚胺环己烷链接基如

[0494] 多个具体实施例中，该pHLIP肽包含序列ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:9)中的氨基酸，其中，所述ICG共价附接至其半胱氨酸。某些具体实施例中，ICG共价键结
至该半胱氨酸。一些具体实施例中，该N端及/或C端未键结至任何化合物。非限制性实例中，
该化合物包含下述结构：

[0495]

[0496] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含序列ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:2)中的氨基酸，其中，所述ICG共价附接至该pHLIP肽的N端丙氨酸。非限制性实例中，该
化合物包含下述结构：

[0497]

[0498] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含序列AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:3)中的氨基酸，其中，所述ICG共价附接至该pHLIP肽的赖氨酸。此化合物的非限制性实
例包括结构：

[0499]

[0500] 某些具体实施例中，该pHLIP肽包含序列ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)中的氨基酸，其中，所述ICG共价附接至该pHLIP肽的半胱氨酸。非限制性实例中，该化
合物包含下述结构：

[0501]

[0502] 多个具体实施例中，该pHLIP肽包含序列ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)中的氨基酸，其中，所述ICG共价附接至其半胱氨酸。某些具体实施例中，ICG共价键结
至该半胱氨酸。一些具体实施例中，该N端及/或C端未键结至任何化合物。非限制性实例中，
该化合物包含下述结构：

[0503]

[0504] 。这一结构视情况可绘制如下：

[0505]

[0506] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含序列ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:5)中的氨基酸，其中，所述ICG共价附接至该pHLIP肽的N端丙氨酸。非限制性实例中，该
化合物包含下述结构：

[0507]

[0508] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含序列AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:8)中的氨基酸，其中，所述ICG共价附接至该pHLIP肽的赖氨酸。此化合物的非限制性实
例包括结构：

[0509]

[0510] 可质子化的氨基酸包括具有酸性侧链(如，包含一个或多个羧基的侧链)的氨基酸。例如，可质子化的氨基酸可具有25℃下pKa低于约7.0、6.75、6.5、6.25、6、5.75、5.5、
5.25、5.0、4.75、4.5、4.25、4.0、3.75、3.5、3.25、或3.0的侧链。可质子化的氨基酸的非限制性实例包括天冬氨酸、谷氨酸、和γ-羧基谷氨酸。多个具体实施例中，该pHLIP肽包含可质
子化的人工氨基酸。一些具体实施例中，该可质子化的人工氨基酸包含至少1、2、3、4或5个
羧基。

[0511] 标准α-氨基酸中，除甘氨酸外，全部可以两种光学异构体中的任一者存在，该光学异构体称为L-氨基酸或D-氨基酸，它们互为彼此的镜像。虽然L-氨基酸表示在核糖体翻译
过程中在蛋白质中发现的所有氨基酸，但在一些通过在翻译和易位至内质网后的酶翻译后
修饰产生的蛋白质中发现了D-氨基酸。D-氨基酸是细菌的肽聚糖细胞壁中含量丰富，且D-
丝氨酸在脑中作为神经递质而发挥作用。对氨基酸构型的L和D的俗称并不指代该氨基酸自
身的光学活性，而是指该氨基酸可自其合成的甘油醛异构体的光学活性(D-甘油醛是右旋
的，而L-甘油醛是左旋的)。一些具体实施例中，pHLIP肽中的全部或部分氨基酸是D-氨基
酸。例如，pHLIP肽可仅包含L-氨基酸或仅包含D-氨基酸，或包含D-氨基酸与L-氨基酸的组
合。

[0512] 多个具体实施例包括包含序列LLFPTDTLLL(SEQ ID NO:25)中的氨基酸的pHLIP肽。一些具体实施例中，该pHLIP肽包含序列LDLLFPTDTLLLD(SEQ ID NO:26)中的氨基酸。某
些具体实施例中，该pHLIP肽包含序列AYLDLLFPTDTLLLDLL(SEQ ID NO:27)中的氨基酸。多
个具体实施例中，该pHLIP肽包含序列DDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:28)中的氨
基酸。一些具体实施例中，该pHLIP肽包含序列WRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:29)或
WRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:30)中的氨基酸。视情况，该pHLIP肽包含位于本文中揭
露的氨基酸序列的N端及/或C端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20或更多个氨基酸。

[0513] 多个具体实施例中，该pHLIP肽包含下述序列中的氨基酸：

[0514] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:2)、

[0515] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:3)、

[0516] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)、

[0517] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:5)、

[0518] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCA(SEQ ID NO:6)、

[0519] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKA(SEQ ID NO:7)、

[0520] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:8)、

[0521] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:9)、

[0522] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:10)、

[0523] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKG(SEQ ID NO:11)、

[0524] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKG(SEQ ID NO:12)、

[0525] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:13)、

[0526] ACKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:14)、

[0527] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:15)、

[0528] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWC(SEQ ID NO:16)、

[0529] ACDDQNPWARYLDWLFPTDTLLLDL(SEQ ID NO:17)、

[0530] CDNNNPWRAYLDLLFPTDTLLLDW(SEQ ID NO:18)、

[0531] ACEEQNPWARYLEWLFPTETLLLEL(SEQ ID NO:19)、

[0532] ACEEQNPWRAYLELLFPTETLLLELLW(SEQ ID NO:20)、

[0533] CEEQQPWAQYLELLFPTETLLLEW(SEQ ID NO:21)、

[0534] CEEQQPWRAYLELLFPTETLLLEW(SEQ ID NO:22)、

[0535] AAEEQNPWARYLEWLFPTETLLLEL(SEQ ID NO:23)、或

[0536] AKEEQNPWARYLEWLFPTETLLLEL(SEQ ID NO:24)。

[0537] 一些具体实施例中，该pHLIP肽的氨基酸序列与作为SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24所陈述的各氨基酸序列的一致性低于100％、99％或95％。一些具体实施例中，该pHLIP肽的氨基酸序列与作为SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、和24所陈述的各氨基酸序列的一致性低于100％、99％或95％。某些具体实施例中，该pHLIP肽的氨基
酸序列与作为SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、和24所陈述的各氨基酸序列的一致性为95％至100％、95％至99％、或90％至95％。一些具体实施例中，该pHLIP肽的氨基酸
序列与SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24一致。

[0538] 某些具体实施例中，该pHLIP肽包含20至30个氨基酸。例如，该pHLIP肽包含约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸。一些具体实施例中，当将该pHLIP肽插入细胞膜内时，该pHLIP肽的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个、或1至3个、1至5个、或5至10个N端氨基酸位于该细胞外(即，不在该细胞膜的脂质双层之内)。多个具体实施例中，当将该化
合物插入细胞膜内时，则其ICG部分与该细胞膜脂质双层的相距至少约1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1至5、5至10、5至15、或10至15埃

[0539] 本发明主旨的多个方面提供一种组合物，其包含本文中揭露的化合物和药学可接受的载剂。一些具体实施例中，该组合物进一步包含D-葡萄糖，如，约5至25mM的D-葡萄糖，
或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或25mM的D-葡萄糖。一些具体实施例中，该组合物包含缓冲剂，如，令该组合物缓冲化，因此其pH约为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.8、7.9、或
8.0。某些具体实施例中，该组合物包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

[0540] 本发明主旨的多个方面涉及对口腔癌症的检测，如通过将包含本文中揭露的化合物的组合物喷洒或给药至该口腔而进行检测。例如，该组合物可包含漱口水或口腔喷雾。

[0541] 还提供用于检测身体器官或组织中的癌症组织或癌前组织的方法，包含(a)令该身体器官或组织与本文中揭露的化合物接触；(b)令该化合物与包含ICG激发波长的电磁辐
射接触；以及(c)检测从该化合物发射的电磁辐射，其中，检测到该辐射表明癌组织或癌前
组织的存在。多个具体实施例中，从癌前组织及/或癌症组织发射的辐射水平比从正常非癌
组织(如，相应的身体器官或组织内的响应的正常非癌组织)发射的辐射水平高至少5％、
10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2-倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、或20被、25倍或更高。

[0542] 本文中提供的化合物、组合物、和方法可用于检测多个身体器官和组织中的癌组织或癌前组织。一些具体实施例中，该身体器官是肾脏或膀胱。可在其中检测癌组织或癌前
组织的组织的非限制性实例包括：骨、关节、韧带、肌肉、腱、唾腺、牙齿、牙龈、腮腺、颌下腺、舌下腺、咽、食道、胃、小肠(如，十二指肠、空肠、及/或回肠)、大肠、肝、胆囊、胰腺、鼻腔、咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜、肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、子宫、输卵管、子宫、子宫颈、阴道、睾丸、附睾、输精管、精囊、前列腺、尿道球腺、脑下垂体、松果体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、心、动脉、静脉、毛细血管、淋巴管、淋巴结、骨髓、胸腺、脾、脑、大脑半球、间脑、脑干、中脑、脑桥、延髓、小脑、脊髓、脑室、脉络丛、神经、眼、耳、嗅觉器官、乳房、及皮肤组织。一些具体实施例中，所检测的患病癌症组织是肉瘤或癌组织。可使用本文中揭露的化合物、组合物和
方法检测的非限制类型的癌症包括：膀胱癌、肺癌、脑癌、黑素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾上腺癌、食道癌、上消化道癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、卡斯尔曼(Castleman)病、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃肠道良性肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、卡波西(Kaposi)肉瘤、肾癌、喉癌、下咽癌、肝癌、恶性间皮瘤、鼻腔癌、副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、胰腺癌、阴茎癌、脑垂体肿瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾腺癌、肉瘤、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、和肾母细胞瘤(Wilms tumor)。多个具体实施例中，该癌症包含实体肿瘤。

[0543] 一些具体实施例中，该癌组织或癌前组织位于膀胱、上泌尿道、淋巴结、乳房、前列腺、头、精、脑、胰腺、肺、肝、或肾内。

[0544] 本文中提供的化合物、组合物和方法也可用于检测组织如淋巴结内的癌细胞(如，转移性癌细胞)。一些具体实施例中，该淋巴结位于罹患癌症的受试者体内。多个具体实施
例中，该淋巴结位于罹患膀胱癌、上泌尿道癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈癌、脑癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、或肾癌的受试者体内。

[0545] 可在从受试者获得、移除或提供的组织样品或活检样品中检测患病组织(如，癌前组织或癌组织)。多个具体实施例中，该组织包含组织活检样品。或者或此外，在体内或原位
的生物学表面如皮肤表面、黏膜表面上或内部位点(如膀胱内表面、结肠表面、食道表面、或
该受试者体内手术部位表面)上检测患病组织的存在。例如，待检查的组织包含内腔，如导
管(如，肾导管)、输尿管、肠组织(大肠或小肠)、食道、或气道内腔如气管支气管或肺泡管。
一些具体实施例中，本文中提供的化合物被用来检测黑素瘤组织的存在。一些具体实施例
中，该身体器官或组织存在于受试者体内。

[0546] 视情况，本文中揭露的方法可包括步骤，例如，洗涤步骤，以移除过量的未结合或未附接化合物，即未经由将pHLIP肽构造插入细胞膜内而附接至低pH组织的化合物。例如，
可在检测ICG荧光(如，成像)之前，洗涤或灌洗器官样品或组织活检样品。在已经令体腔或
体表与化合物(如，液体形式或喷雾形式)接触的非限制性实例中，可在检测/成像之前冲洗
或洗涤该体腔或体表以移除过量的ICG。一些具体实施例中，使用例如水溶液如盐水或水来
实施冲洗/洗涤。一些具体实施例中，使用被用来输送该ICG-pHLIP肽的载剂来实施冲洗/洗
涤。

[0547] 一些具体实施例中，令身体器官、组织或体液(如，血液)与本文中提供的化合物接触包含将该化合物给药至受试者。例如，在体内检测该化合物。某些具体实施例中，经由血
管内滴注、静脉注射、腹腔内注射、外用给药、黏膜给药、或口服给药将该化合物给药至该受
试者。例如，可经由插入该受试者体内的管将该化合物给药至该受试者体内的部位(如，喷
洒、施加在其上，或作为液体输送)。该部位可以是，例如，现有的、以前的或存疑的肿瘤部
位，及/或正在评估癌组织或癌前组织存在的正常组织。一些具体实施例中，使用管或其它
装置(如，导管、针、吸引器、吸入器、内窥镜、膀胱镜、喷雾器、喷嘴、探针、注射器、移液管、或雾化器)将该化合物输送至例如食道、膀胱或结肠。某些具体实施例中，使用内窥镜或膀胱
镜检测(如，成像)该化合物的荧光。例如，可配置该内窥镜或膀胱镜，以(i)发射包含ICG的
激发波长的电磁辐射，及/或(ii)检测从该化合物(即，该化合物的该ICG组分)发射的电磁
辐射。一些具体实施例中，该化合物通过将包含所述化合物的液体、粉末或喷雾施加至该受
试者体表而给药。一些具体实施例中，该体表包含经由外科手术取出及/或暴露的该受试者
的体内部位。一些具体实施例中，该外科手术包含内窥镜手术或膀胱镜手术。某些具体实施
例中，将该化合物给药至该受试者的口腔。

[0548] 多个具体实施例中，间接体内检测从所述化合物发射的电磁辐射。一些具体实施例中，使用包含本文中化合物的组合物灌洗、浸泡、喷洒、培养、及/或注射来自受试者的组
织样品(如，活检样品或器官)，之后洗涤，随后进行ICG荧光成像。

[0549] 本发明主旨的多个方面涉及，经由外科手术移除癌组织或癌前组织如使用本文中揭露的化合物、组合物或方法检测的癌症组织或癌前组织的方法。例如，本文中提供的化合
物的荧光可用来引导外科手术，因此得以移除全部癌组织及/或癌前组织，即，实现该外科
手术部位的清晰边界(不含癌症)。

[0550] 本发明主旨为提供比现有病理学方法更快地鉴定癌前组织和癌症/肿瘤组织的方法。例如，可令外科手术过程中移除的组织与ICG-pHLIP肽接触，洗涤，随后快速成像，以确
定诸如所移除的全部组织是否是癌前组织或癌组织及/或癌前组织或癌组织是否留在体
内。或者或此外，该外科手术部位可与化合物接触(如，通过局部给药或全身给药)，以确定
任何患病组织是否留在该部位。本文中提供的方法不需要例如耗时的免疫组化染色或通过
训练有素的病理学家进行分析。本文中提供的方法可借以实施的速度(如，30分钟或更短)，
令临床医生能够在不间断的手术过程中测试癌前组合或癌组织存在或不存在(如，受试者
体内或来自该受试者的样品内)，例如以确定手术是否应继续进行或在何处进行(如，以移
除更多组织)。

[0551] 也可检测并监控癌症的发展、复发和治疗。例如，可使用本文中揭露的化合物和方法测试已经通过外科手术移除或治疗(如，使用化疗剂或放疗)移除癌症的受试者体内的癌
症。例如，可令膀胱、结肠、食道、或口腔的内侧、及/或粘膜/皮肤表面与本文中提供的化合
物接触，随后检测以确定癌前组织及/或癌组织是否正在发展或已经发展。例如，若例如化
疗或放疗取得疗效，则可监控癌症组织的量。因此，本文中体用的ICG-pH触发的化合物可用
来辅助决定是否应启动或继续癌症治疗，及/或是否应采取不同的治疗方案(如，如果先前
给药的剂量/方案没有如所希望的减少癌症组织的量)。

[0552] 可使用本文中提供的化合物、组合物和方法来评估及/或治疗罹患不同阶段癌症的多个不同类型的受试者。但是，多个具体实施例涉及在批准或建议移除大量组织(如，器
官如膀胱或肾脏，或例如器官如结肠的一部分)之前对癌症的检测和治疗。多个具体实施例
中，该受试者不包含浸润性癌症或转移性癌症。某些具体实施例中，关于罹患尿路上皮癌的
受试者，该受试者不包含高级别尿路上皮癌。一些具体实施例中，该受试者不包含浸润性高
级别尿路上皮癌。

[0553] 本文中揭露的各具体实施例预期可用于所揭露的其它各具体实施例中。因此，本文中揭示的各种元素的全部组合均处于本发明的范畴内。

[0554] 从下述对本发明优选具体实施例的说明和权利要求书可明了本发明的其它特征和优点。除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语均具有与本发明所属领域技术人
员所一般理解者相同的意义。尽管与本文中揭示者类似或等效的方法和材料可用于实践或
测试本发明，但适当的方法和材料揭示如下。
附图说明

[0555] 本文中，关于附图和实施例1至3中提供的数据，术语“ICG-Var3”、“ICG-Var3肽”、“ICG-Var3化合物”和“ICG-Var3构造”指的是包含具有氨基酸序列

[0556] NH2-ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA-COOH(SEQ ID NO:4)且具有共价键结至其半胱氨酸上的pHLIP肽的pHLIP-荧光团化合物

[0557] [A-Cys(ICG)-DDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA]，具有下述结构：

[0558]

[0559] 术语“ICG-pHLIP肽”比“ICG-Var3”更为通用，且包括任何包含ICG和pHLIP肽的pHLIP-荧光团化合物。

[0560] 图1A至1B是显示在含有10mM D-葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4中测量的ICG-Var3化合物的归一化的吸收谱(A)和荧光谱(B)。与在缓冲液中的发射相比，在1-棕榈
酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(POPC)脂质体的存在下，ICG-Var3化合物的荧光(激发波
长为790nm)增加了约25倍。

[0561] 图2A至2L是显示膀胱标本的代表性的白光(A、D、G、J)、NIR荧光(B、E、H、K)间接体内成像以及溶血素和曙红(HE)染色的肿瘤切片(C、F、I、L)，表明ICG-Var3成像剂对于浸润
性高级别尿路上皮癌(A、B、C)、非浸润性高级别尿路上皮癌(D、E、F)、原位癌(G、H、I)和异型增生(J、K、L)的靶向性。通过病理学分析证实诊断。标记例#11中的荧光病灶，以检定用于病
理分析的位置。

[0562] 图3A至3B是显示(A)pHLIP将所运载的分子拴系在患病组织中的细胞表面和(B)pHLIP将所运载的分子输送至患病组织中的细胞内的非限制性实例的示意图。

[0563] 图4A至4F是一系列显示ICG-Var3化合物对于膀胱组织中癌病灶的靶向性的图像；显示了白光(A、D)、NIR荧光(B、E)、和白光图像与荧光图像的叠加(C、F)。

[0564] 图5A至5I是一系列显示使用ICG-Var3化合物对于膀胱组织中癌病灶的靶向性的图像；显示了白光(A、D、G)、NIR荧光(B、E、H)、和白光图像与荧光图像的叠加(C、F、I)。

[0565] 图6A至6F是一系列显示使用ICG-Var3化合物对于膀胱组织中癌病灶的靶向性的图像；显示了白光(A、D)、NIR荧光(B、E)、和白光图像与荧光图像的叠加(C、F)。

[0566] 图7A至7C是一系列显示使用ICG-Var3化合物对于膀胱组织中癌病灶的靶向性的图像；显示了白光(A)、NIR荧光(B)、和白光图像与荧光图像的叠加(C)。

[0567] 图8A至8G是一系列显示ICG-Var3化合物对于膀胱组织中癌病灶的靶向性的图像；显示了白光(A、D、F)、NIR荧光(B、E、G)、和白光图像与荧光图像的叠加(C)。图7F和7G中对于正常组织的成像显示，ICG-Var3不以正常组织为靶向。

[0568] 图9A至9C是一系列显示ICG-Var3化合物对于膀胱组织中癌病灶的靶向性的图像；显示了白光(A)、NIR荧光(B)、和白光图像与荧光图像的叠加(C)。

[0569] 图10是一组图像，显示ICG-Var3化合物对于肾组织中癌病灶的靶向性，左图显示肾的NIR荧光图像，而右图显示白光图像。使用ICG-Var3化合物将在根治性肾切除术后收集
的肾脏通过动脉灌洗30分钟，以模拟该化合物的IV给药，之后以盐水洗涤，并进行间接体内
成像。

[0570] 图11是显示ICG-Var3化合物对于4T1鼠科动物乳腺癌的靶向性的图像。通过静脉(IV)注射(40μM、100μL)给药该ICG-Var3化合物，并在注射后16小时(h)成像。高浸润性4T1
乳腺癌模型模拟人类乳腺癌IV期。

[0571] 图12是显示ICG-Var3化合物对于裸鼠体内AY27大鼠膀胱癌的靶向性的图像。通过静脉(IV)注射(40μM、100μL)给药该ICG-Var3化合物，并在注射后16h成像。

[0572] 图13是显示ICG-Var3化合物对于4T1肿瘤的靶向性的图像。通过静脉(IV)注射(20、10和5μM，如标注)给药该ICG-Var3化合物，并在注射后16h成像。荧光信号随着所注射
ICG-Var3化合物剂量的减少而减少。

[0573] 图14是显示ICG-Var3化合物(浓度为20、10和5μM，静脉注射，在16h成像)对于4T1肿瘤的靶向性的图像。随着ICG-pHLIP化合物浓度的下降，肿瘤、肝和肾中的荧光强度下降。
使用标准内窥镜光源/成像系统，在功率2且增益3的激光下记录的图像中获得荧光值。

[0574] 图15是显示静脉和腹膜(IP)注射的10μM ICG-Var3化合物对于4T1肿瘤的靶向性的图像。在注射后16h实施成像。

[0575] 图16是一图像，其显示，与20μM的IR800-pHLIP化合物相比，20μM的ICG-Var3化合物对于4T1肿瘤的靶向性。该化合物通过静脉注射给药，并在注射后16h实施成像。对于通过
内窥镜(如，标准内窥镜光源/成像系统)检测到的肿瘤中的荧光信号，ICG-Var3化合物高于
IR800-pHLIP化合物。

[0576] 图17是比较20μM的ICG-Var3化合物与20μM的IR800-pHLIP化合物对于4T1肿瘤的靶向性的图。该化合物通过静脉注射给药，并在注射后16h实施成像。对于通过内窥镜检测
到的肿瘤中的荧光信号，ICG-Var3化合物高于IR800-pHLIP化合物。该ICG-Var3化合物由肝
清除，而该IR800-pHLIP化合物由肾清除。

[0577] 图18是一组显示使用ICG-Var3化合物将肿瘤边界可视化的图像。该ICG-Var3化合物非常清晰地界定了肿瘤边界。此外，该ICG-Var3化合物不以肌肉组织为靶向。

[0578] 图19显示该BLOSUM62矩阵。

[0579] 图20是一组小鼠腿部的NIR荧光图片，是在静脉给药ICG-Cys(ICG马来酰亚胺偶联至Cys残基)后5分钟和30分钟获得的。

[0580] 图21是一组小鼠腿部的NIR荧光图片，是在静脉给药ICG-Var3 pHLIP(ICG-Var3 pHLIP是具有Var3 pHLIP肽的ICG-Var3化合物，见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)
后5、30、60、90和120分钟获得的。

[0581] 图22是一组小鼠腿部的NIR荧光图片，是在静脉给药ICG-WT pHLIP(ICG-WT pHLIP是具有WT pHLIP肽的ICG-Var3化合物，见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)后5、30、
60、90和120分钟获得的。

[0582] 图23是一组小鼠腿部的NIR荧光图片，是在静脉给药ICG-Hum pHLIP(ICG-Hum pHLIP是具有Hum pHLIP肽的ICG-Var3化合物，见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)后
5、30、60、90和120分钟获得的。

[0583] 图24是一组小鼠腿部的NIR荧光图片，是在静脉给药ICG-NpHLIP(ICG-NpHLIP是具有NpHLIP肽的ICG-Var3化合物，见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)后5、30、60、90和
120分钟获得的。

[0584] 图25是一组小鼠耳部的NIR荧光图片，是在静脉给药ICG-Cys(ICG马来酰亚胺偶联至Cys残基)后5分钟和30分钟获得的。

[0585] 图26是一组小鼠耳部的NIR荧光图片，是在静脉给药ICG-Var3 pHLIP后5、30、60、90和120分钟获得的。

[0586] 图27是一组小鼠耳部的NIR荧光图片，是在静脉给药ICG-WT pHLIP后5、30、60、90和120分钟获得的。

[0587] 图28是一组小鼠耳部的NIR荧光图片，是在静脉给药ICG-Hum pHLIP后5、30、60、90和120分钟获得的。

[0588] 图29是一组小鼠耳部的NIR荧光图片，是在静脉给药ICG-NpHLIP后5、30、60、90和120分钟获得的。

[0589] 图30是一组在静脉给药ICG-Cys、ICG-WT pHLIP、ICG-Var3 pHLIP、ICG-NpHLIP和ICG-Hum pHLIP后5、30、60、90和120分钟采集的小鼠血液的NIR荧光图片。

[0590] 图31是一组小鼠腿部的NIR荧光图片，是在静脉给药IR800-Cys(IR800马来酰亚胺偶联至Cys残基)后5分钟和30分钟获得的。

[0591] 图32是一组小鼠腿部的NIR荧光图片，是在静脉给药IR800-Var3 pHLIP(见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)后5、30、60、90和120分钟获得的。

[0592] 图33是一组小鼠腿部的NIR荧光图片，是在静脉给药IR800-WT pHLIP(见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)后5、30、60、90和120分钟获得的。

[0593] 图34是一组小鼠耳部的NIR荧光图片，是在静脉给药IR800-Cys(IR800马来酰亚胺偶联至Cys残基)后5分钟和30分钟获得的。

[0594] 图35是一组小鼠耳部的NIR荧光图片，是在静脉给药IR800-Var3 pHLIP(见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)后5、30、60、90和120分钟获得的。

[0595] 图36是一组小鼠耳部的NIR荧光图片，是在静脉给药IR800-WT pHLIP(见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)后5、30、60、90和120分钟获得的。

[0596] 图37是一组在静脉给药IR800-Cys、IR800-WT pHLIP和IR800-Var3 pHLIP(见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)后5、30、60、90和120分钟采集的小鼠血液的NIR荧光图
片。

[0597] 图38A至38C是一系列显示ICG-Var3化合物对于人类膀胱组织中癌病灶的靶向性的图片，显示了(A)膀胱的彩色图像，(B)膀胱的荧光图像，(C)具有鉴别肿瘤边界等高线的
膀胱的彩色图像[轮廓/等高线显示浸润性高级别移行细胞癌(TCC)]。通过病理学调查研究
证实诊断。将处于含葡萄糖的PBS中的4μM的80mL(1.34mg)ICG-Var3滴注入在膀胱移除手术
后获得的人类膀胱内，滴注时间为15分钟，之后以盐水洗涤，切割，并使用NIR内窥镜成像
(见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)。对荧光组织样品和非荧光组织样品实施标准
病理学分析(溶血素和曙红染色)。

[0598] 图39A至39C是一系列显示ICG-Var3化合物对于人类膀胱组织中癌病灶的靶向性的图片，显示了(A)膀胱的彩色图像，(B)膀胱的荧光图像，(C)具有鉴别肿瘤边界等高线的
膀胱的彩色图像(轮廓/等高线显示原位癌)。通过病理学调查研究证实诊断。将处于含葡萄
糖的PBS中的4μM的80mL(1.34mg)ICG-Var3滴注入在膀胱移除手术后获得的人类膀胱内，滴
注时间为15分钟，之后以盐水洗涤，切割，并使用NIR内窥镜成像(见表11中关于pHLIP肽氨
基酸序列的说明)。对荧光组织样品和非荧光组织样品实施标准病理学分析(溶血素和曙红
染色)。

[0599] 图40A至40C是一系列显示ICG-Var3化合物对于人类膀胱组织中癌病灶的靶向性的图片，显示了(A)膀胱的彩色图像，(B)膀胱的荧光图像，(C)具有鉴别肿瘤边界等高线的
膀胱的彩色图像。通过病理学调查研究(轮廓/等高线显示浸润性高级别TCC)证实诊断。将
处于含葡萄糖的PBS中的4μM的80mL(1.34mg)ICG-Var3滴注入在膀胱移除手术后获得的人
类膀胱内，滴注时间为15分钟，之后以盐水洗涤，切割，并使用NIR内窥镜成像(见表11中关
于pHLIP肽氨基酸序列的说明)。对荧光组织样品和非荧光组织样品实施标准病理学分析
(溶血素和曙红染色)。

[0600] 图41A至41D是一系列显示ICG-Var3化合物(4μM的80mL或1.34mg)对于人类膀胱组织中癌病灶的靶向性的图片，显示了(A)膀胱的彩色图像，(B)膀胱的荧光图像，(C和D)使用
不同激发激光功率获得的膀胱的荧光图像。

[0601] 图42A和42B是一系列显示ICG-Var3化合物对于人类膀胱组织中癌病灶的靶向性的图片，显示了(A)膀胱的彩色图像，(B)从充满眼熟的膀胱中获得的荧光图像，以膀胱镜途
径进行。将处于含葡萄糖的PBS中的4μM的80mL(1.34mg)ICG-Var3滴注入在膀胱移除手术后
获得的人类膀胱内，滴注时间为15分钟，之后以盐水洗涤，切割，并使用NIR内窥镜的5mm针
头对充满盐水的膀胱成像(见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)。

[0602] 图43A至43C是一系列显示IR800-pHLIP化合物对于人类膀胱组织中癌病灶的靶向性的图片，显示了(A)膀胱的彩色图像，(B)膀胱的荧光图像，(C)具有鉴别肿瘤边界等高线
的膀胱的彩色图像(轮廓/等高线显示坏死和治疗效果)。通过病理学调查研究证实诊断。将
处于含葡萄糖的PBS中的4μM的80mL(1.34mg)IR800-Var3滴注入在膀胱移除手术后获得的
人类膀胱内，滴注时间为15分钟，之后以盐水洗涤，切割，并使用NIR内窥镜成像(见表11中
关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)。对荧光组织样品和非荧光组织样品实施标准病理学分析
(溶血素和曙红染色)。

[0603] 图44A至44C是一系列显示IR800-pHLIP化合物对于人类膀胱组织中癌病灶的靶向性的图片，显示了(A)膀胱的彩色图像，(B)膀胱的荧光图像，(C)具有鉴别肿瘤边界等高线
的膀胱的彩色图像[轮廓/等高线显示具有鳞状细胞癌(SCC)的高级别TCC]。通过病理学调
查研究证实诊断。将处于含葡萄糖的PBS中的4μM的80mL(1.34mg)IR800-Var3滴注入在膀胱
移除手术后获得的人类膀胱内，滴注时间为15分钟，之后以盐水洗涤，切割，并使用NIR内窥
镜成像(见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)。对荧光组织样品和非荧光组织样品实
施标准病理学分析(溶血素和曙红染色)。

[0604] 图45是显示ICG-Var3化合物(4μM的80mL和1.34mg)(见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)对于上泌尿道中癌病灶的靶向性的彩色图像和荧光图像的叠加。

[0605] 图46是显示ICG-Var3化合物(4μM的80mL和1.34mg)(见表11中关于pHLIP肽氨基酸序列的说明)对于上泌尿道中癌病灶的靶向性的彩色图像和荧光图像的叠加。

[0606] 图47A至47C是一系列显示ICG-Var3化合物对于人类上泌尿道组织中癌病灶的靶向性的图片，显示了(A)彩色图像，(B)荧光图像，(C)具有鉴别肿瘤边界等高线的膀胱的彩
色图像(轮廓/等高线显示浸润性高级别TCC)。通过病理学调查研究证实诊断。

具体实施方式

[0607] 荧光成像可在医疗中用于多个图像引导下的过程中。一个长期存在的实例是，用于在手术前、手术中和手术后环境中评价血液流动和组织灌注的荧光血管造影术。荧光血
管造影术提供对血管的实时成像，以遵循外科手术过程中的改变。一些实例包括荧光的下
述用途：在眼科用来评估脉络膜视网膜脉管系统(Jia et al.2015 Proc Natl Acad Sci U
S A 112(18):E2395-2402；Campagnoli et al.2016 Retin Cases Brief Rep 10(2):175-
182)；在心胸外科手术中用来评价冠状动脉架桥术的有效性(Desai et al.2005 J Am
Coll Cardiol 46(8):1521-1525；Unno et al.2008 Eur J Vasc Endovasc Surg 35(2):
205-207；Handa et al.2009 Interact Cardiovasc Thorac Surg 9(2):150-154)；在神经
与血管外科中用来评价颞浅动脉-大脑中动脉旁路移植在脑血管再生过程中的效果
(Woitzik et al.2005 J Neurosurg 102(4):692-698)；在肝胆外科中用来鉴定用于解剖
性肝脏切除的触觉段(haptic segment)和子段(Aoki et al.2008 World J Surg 32(8):
1763-1767；Ishizawa et al.2009 J Am Coll Surg 208(1):e1-4)；用于重建外科中
(Azuma et al.2008Plast Reconstr Surg 122(4):1062-1067；Lee et al.2010 Plast
Reconstr Surg 126(5):1472-1481；Lee et al.2010 J Reconstr Microsurg 26(1):59-
65；Murray et al.2010 Plast Reconstr Surg 126(1):33e-34e)；以及用于胆囊切除术和
结直肠切除中(Boni et al.2015 Surg Endosc 29(7):2046-2055)。诊断应用中，荧光血管
造影术被用来对下述进行成像：脑中血液动力学(Kohl-Bareis et al.2002 J Biomed Opt
7(3):464-470；Leung et al.2007 Appl Opt 46(10):1604-1614)；类风湿性关节炎的循环
特征(Fischer et al.2010 Acad Radiol 17(3):375-381；Gompels et al.2010
Rheumatology(Oxford)49(8):1436-1446)；肌肉灌注(Habazettl et al.2010 J Appl
Physiol(1985)108(4):962-967)；烧伤(Griffiths et al.2016 Gland Surg 5(2):133-
149)，以评价对于创伤的多种其它效果(Schomacker et al.1997 J Trauma 43(5):813-
819)。再者，荧光图像引导下的过程用于，对淋巴结的映射和可视化、对癌病灶的靶向性和
标记(如，可视化或检测)和通过体内和间接体内成像而对肿瘤边界的评价(Jacobs 2008
Ann Surg Oncol 15(5):1271-1272；Ankersmit et al.2011 Colorectal Dis 13 Suppl
7:70-73；Ferroli et al.2011 Acta Neurochir Suppl 109:251-257；Cahill et al.2012
Surg Endosc 26(1):197-204；Mondal et al.2014 Adv Cancer Res 124:171-211；
Burggraaf et al.2015 Nat Med 21(8):955-961)。

[0608] 大量美国食品药品监督管理局(FDA)批准的荧光染料已经被用于临床：荧光素，其发射波长为500至600nm的裸眼可见的光，传统上用于视网膜血管造影术中；以及NIR荧光染
料，包括ICG和IR800(一种专有的Li-COR生物科学荧光染料)。NIR染料在从650nm至1350nm
的所谓组织光学窗内发挥功用，该范围内的光具有其最大的组织渗透性。选择渗透NIR光进
行激发(750至805nm)，且在该窗内的较长发射波长观察到荧光，令最深组织成像成为可能。

[0609] ICG是最广泛使用的NIR荧光染料(Desai et al.2005 J Am Coll Cardiol 46(8):1521-1525；Woitzik et al.2005 J Neurosurg 102(4):692-698；Unno et al.2008
Eur J Vasc Endovasc Surg 35(2):205-207；Marshall et al.2010 Open Surg Oncol J
2(2):12-25；Polom et al.2011 Cancer 117(21):4812-4822；Alander et al.2012 Int J
Biomed Imaging 2012:940585；Zelken and Tufaro 2015 Ann Surg Oncol 22 Suppl 3:
S1271-1283；Griffith et al.2016 Gland Surg 5(2):133-149)。ICG由柯达研究实验室在
1955年研发用于拍照，且已经在1956内被批准用于临床用途(Bjornsson et
al.1982Experientia 38(12):1441-1442；Bjornsson et al.1983 J Clin Chem Clin
Biochem 21(7):453-458)。ICG血管造影术是ICG最早的临床应用(Choromokos et al.1969
J Biol Photogr Assoc 37(2):100-104；Kogure and Choromokos 1969 J Appl Physiol
26(1):154-157；Kogure et al.1970 Arch Ophthalmol 83(2):209-214)。从1970年代早期
开始，ICG被用于在眼科学中用于对视网膜血管成像，即视网膜血管造影术(Flower 1973
Invest Ophthalmol 12(12):881-895)。

[0610] 在静脉注射后，ICG快速键结至血浆蛋白，极少量渗漏入间隙组织中。半衰期为2.5分钟(Benson and Kues 1978 Phys Med Biol 23(1):159-163；Desmettre et al.2000
Surv Ophthalmol 45(1):15-27)。没有已知的代谢产物。ICG不经任何修饰而被肝脏快速提
取且几乎唯独被肝脏排泄，依据肝脏血管化和功能，在注射后8分钟以未偶联的形式出现在
胆汁内(Alander et al.2012 Int J Biomed Imaging 2012:940585)。当在血管外注射时，
ICG结合至蛋白质并在淋巴中被发现，通常在15分钟内到达最近的引流淋巴结，在1至2小时
后，它结合至区域淋巴结，沉积在巨噬细胞内(Tajima et al.2010 Ann Surg Oncol 17
(7):1787-1793；Korn et al.2014 Plast Reconstr Surg 133(4):914-922)。ICG的静脉注
射剂量典型在0.5mg/ml/kg体重至2.0mg/ml/kg体重的范围内变化。在5mg/kg体重的高剂量
下，在人体内没有观察到显着的毒性效应(Alander et al.2012 Int J Biomed Imaging
2012:940585)，且由于在多年的临床经验中毒性不明显，因此慢性毒性一定是轻微的。

[0611] 除了FDA批准的荧光素和NIR染料外，含有FDA批准的其它荧光分子用于具体应用中，如亚甲蓝(Winer et al.2010 Ann Surg Oncol 17(4):1094-1100；van der Vorst et
al.2012 World J Gastrointest Surg 4(7):180-184；Verbeek et al.2013 J Urol 190
(2):574-579)、和5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)及其衍生物。5-ALA和在美国被称为Cysview的盐
酸六氨基乙酰丙酸酯，是诱导发荧光的原卟啉——PpIX——生产和细胞内积累的血红素前
体。5-ALA用于神经外科领域，主要用以在手术过程中鉴定脑肿瘤如恶性神经胶质瘤
(Stummer et al.2006 Lancet Oncol 7(5):392-401；Roberts et al.2011 J Neurosurg
114(3):595-603)。Cysview用于使用蓝光膀胱镜检查进行的膀胱中癌病灶的荧光可视化，
其中典型使用溶解于50ml(400μmol)的100mg Cysview剂，通过静脉滴注约1小时而应用。已
经显示，蓝光膀胱镜检查比白光膀胱镜检查改善了癌病灶的可视化和患者的无复发生存率
(Jocham et al.2008 Eur Urol 53(6):1138-1148；Santos Cortes et al.2011 Arch Esp
Urol 64(1):18-31；Lerner et al.2012 Urol Oncol 30(3):285-289；Burger et al.2013
Eur Urol 64(5):846-854；Rink et al.2013 Eur Urol 64(4):624-638)。

[0612] 本文提供，尤其是包含膜插入肽和荧光团(如，ICG)的pHLIP-荧光团化合物，即，其中，该荧光团共价附接至该膜插入肽。包含ICG的pHLIP-荧光团化合物也可以成为“ICG-
pHLIP肽”。多个具体实施例中，pHLIP-荧光团化合物插入循环细胞和/或作为体腔(如血管、
动脉、静脉、毛细血管、泌尿道、尿道、肾小管、气道、或肺泡)衬垫的细胞内。一些具体实施例中，pHLIP-荧光团化合物一旦插入细胞膜内，其荧光强度即增加。本发明主旨的非限制性方
面涉及膜插入肽的用途，该膜插入肽在中性pH(如，pH 7.0)或体液如血液的pH(如，正常血
液的pH为7.35与7.45之间)插入细胞膜内。

[0613] 本文中包括ICG-pHLIP肽，即，包含ICG和pHLIP肽的化合物，其中，该ICG共价附接至该pHLIP肽。本发明主旨的多个方面涉及ICG-pHLIP肽化合物的非预期性质。令人惊奇的
是，(i)ICG-pHLIP肽选择性地以患病(如肿瘤)组织为靶向并标记该组织，以及(ii)一旦插
入细胞膜内其荧光强度即增加。

[0614] 一些具体实施例中，该荧光团是ICG。尽管游离ICG(即，未偶联至另一分子的ICG)可能具有对于细胞膜的疏水性脂质双层的亲和性，但当将游离ICC注射入受试者的血液中
时，游离ICG被快速清除。因此，对于诊断性成像技术，需要高及/或重复剂量的游离ICG。然
而，当偶联至膜插入肽时，ICG在循环中的存留时间长得多。多个具体实施例中，作为pHLIP-
荧光团化合物的一部分而给药的ICG的比作为游离ICG给药的ICG的量(以游离ICG摩尔数
计)少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。一些具体实施例中，当在相应条件下以相同的量(以游离ICG摩尔数计)给药时，作为pHLIP-荧光团化合物的一部分的ICG在
血液中可检测的时间比游离ICG长至少25％、50％、75％、100％、200％、300％、400％、
500％、600％、700％、800％、900％、或1000％。

[0615] 不受缚于任何科学理论，通过将ICG拴系在循环细胞如红血球和作为循环系统衬垫的细胞的细胞膜上，包含ICG的膜插入化合物降低ICG借以从循环中移除(如，通过肾及/
或肝)的速率。ICG至该细胞膜的拴系是非共价的和可逆的。而且，如上所述，当ICG很靠近脂
质双层(如细胞膜)时，其荧光增加，使得以较少的ICG实现较强的荧光成为可能。因此，与典
型使用的游离ICG的剂量相比，可使用较低剂量的膜插入肽偶联ICG(如，用于诊断性途径)。
本文中提供的膜插入化合物也可提供比游离ICG更高的信噪比。关于涉及血液和心血管的
具体实施例，可使用在中性或接近中性pH下插入细胞膜的膜插入肽。因此，可在最低限度的
酸性、中性、或弱碱性pH下插入且可能不适用于检测酸性组织的pH触发的化合物，可用于本
文中揭露的多个具体实施例中。一些具体实施例中，包含ICG的膜插入化合物的半衰期是游
离ICG的半衰期(如，在血液中)的至少约5、10、20、25、50、或100倍。

[0616] 在诊断性方法中仅使用ICG的优点包括，快速结合至血液中的蛋白质(如白蛋白)和循环磷脂质、低组织渗透性、和以癌组织为靶向的能力。然而，ICG-pHLIP肽轻易地渗透癌
组织，以特异性地且有效地标记肿瘤组织以进行诸如手术移除。令人惊奇的是，ICG-pHLIP
肽构造中ICG的存在并不破坏pHLIP肽在肿瘤组织中累积并特异性地插入该肿瘤细胞的膜
中的能力。

[0617] 当将ICG-pHLIP肽插入细胞(如，肿瘤或酸性组织内的细胞，或循环细胞如红血球)内时，其ICG组分被保持与该细胞膜的表面具有一定距离(即，该细胞膜的脂质双层外)，其
中该ICG的荧光可用以与单独使用ICG对比而检测肿瘤细胞的存在，而单独使用的ICG与该
膜直接关联。由于该ICG组分被附接至该ICG-pHLIP肽的pHLIP肽组分，该ICG组分不直接与
细胞膜或周边分子自由地相互作用，而在其它情况下，ICG将直接与细胞膜或周边分子相互
作用。因此，该ICG相对于诸如细胞膜的定位和取向是人工的和间接的。令人惊奇的是，当被
拴系在癌细胞(如，肿瘤内或转移病症内)的表面时，ICG-pHLIp肽的ICG组分展现急剧增加
的荧光。例如，与未拴系的ICG相比，实现了至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、
17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、50％、75％、100％、2倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍或更高的荧光强度增加。某些具体实施例中，当ICG-pHLIP肽结合至细胞膜
时，其荧光的增加显着增加了肿瘤/背景信号。

[0618] 虽然ICG可具有对于细胞膜的疏水性脂质双层的亲和性，但这一亲和性不是pH特异性的。令人惊奇的是，ICG对于细胞膜(如，沿着血管和在正常组织内)的非特异亲和性并
不阻止pHLIP肽浸润并特异性和选择性地标记癌前组织和癌组织。

[0619] ICG经由其粘附至pH触发的肽而与细胞膜之间的连接，是非天然的也是间接的。多个具体实施例中，该pH触发的肽可将ICG与细胞膜分离，例如，通过氨基酸的伸展而完成。例
如，实施例1中使用的非限制性ICG-pHLIP(ICG-Var3化合物)包含具有将ICG与细胞膜分离
的N端氨基酸的pHLIP肽。

[0620] 该分离可包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸的多肽系带。SEQID NO:3包含7个N端氨基酸，将ICG与细胞膜隔开约下述序列下划线的部分对应于潜在的跨膜部分，而斜体的氨基酸指出该7个N端氨基酸：

[0621] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:3)。

[0622] 假设该脂质双层外的该7个N端氨基酸为随机螺旋构型，且每一残基的伸直长度取(Dietz,H.Rief,M.Proc Natl Acad Sci U S A 2006,103,1244-1247；Carrion-
Vazquez et al.,Nat Struct Biol 2003,10,738-743；Oesterhelt et al.,Science
2000,288,143-146)，则该螺旋的平均端至端长度估计为因此，当ICG附接至序列SEQ
ID NO:3中的氨基酸时，则该ICG处于长度约为的柔性氨基酸链接基的末端。令人惊奇
的是，当将偶联至pHLIP肽的N端的ICG插入细胞膜内时，发现该ICG的荧光增加了约25倍。

[0623] 但是不需要将ICG与细胞膜分离。一些具体实施例中，该pHLIP肽不将ICG与细胞膜分离。某些具体实施例中，该pHLIP肽的N端氨基酸序列具有一长度或结构，从而偶联的ICG
与细胞膜的距离短于约 1至 1至或5至
或与该细胞膜接触。或者，该pHLIP肽的N端氨基酸序列具有一长度或结构，从而偶联的
ICG与细胞膜的距离短于约
或当ICG与细胞膜间接关联(无论ICG与细胞膜的距离如何)
时，荧光增加是令人惊奇的。

[0624] 膀胱癌是第五常见的癌症。及时的诊断和适宜的早期管理策略对于改善患者结局具有重要意义。本发明主旨的多个方法涉及本文中呈现的非限制性数据，该数组在首次研
究中生成，以显示不以正常组织为靶向的对膀胱恶性肿瘤的有效的pH依赖性近红外成像。
本文中呈现的数据显示，包含ICG和pHLIP肽(pHLIP肽)的偶联物结合至癌组织和癌前组织
并鉴定。偶联至近红外染料(ICG)的pH低插入肽(pHLIP肽)(ICG-pHLIP肽，如ICG-Var3)构造
适合作为预测性临床标记物使用，在静脉给药后对人类膀胱肿瘤进行特异性地间接体内染
色。该靶向性使得多种成像探针的输送成为可能，该探针可提供早期诊断并改善尿路上皮
癌的内窥镜和根治性手术切除的结局。此外，通过pHLIP肽如pHLIP将治疗分子输送至癌症
组织，可能打开了对膀胱癌的新颖靶向治疗的大门。

[0625] 一个重要的医疗目的是检定早期病灶如癌前组织或原位癌，这是因为预计这一阶段的诊断将降低治疗的频率、增加患者健康并减少费用。每一类型和阶段的膀胱癌均需要
不同类型的治疗。高复发频率、治疗过程的花费、和对于长期主动监控的需要，令膀胱癌称
为美国最为耗钱的癌症之一，终生内窥镜随访和治疗给微升系统带来沉重的经济负担。患
者苦于高迁移率和与化疗、放疗和根治性手术相关的并发症(Mariotto et al.(2011)J
Natl Cancer Inst 103(2):117-128)。因此，正如本文指出的，对肿瘤的及时诊断和适宜的
管理策略对于减少治疗费用和改善患者生活格调具有最为显着的意义。对膀胱癌病灶的早
期检测的进展有可能增加及时成功治疗、预防复发、以及保留膀胱功能的机会。

[0626] 癌症，包括尿路上皮癌，与基因组的多个改变相关，该改变包括表观遗传调控、点突变、基因缺失、重复和染色体重排的变化。这些变化是不均匀的，在肿瘤内和肿瘤之间导
致特定生物标记物在癌细胞表面的过度表达的不均匀性。不均匀性显着限制了用于治疗剂
靶向输送的细胞表面生物标记物的成功使用。另一方面，多个研究已经表明，赘生性细胞由
于增加的新陈代谢活性而产生酸性环境(Damaghi et al.(2013)Front Physiol 4:370)。
对高酸性微环境的适应是从无血管的浸润性肿瘤向恶性浸润性癌转化的关键步骤
(Gillies et al.(2012)Nat Rev Cancer 12(7):487-493；Estrella et al.(2013)Cancer
Res 73(5):1524-1535；Gatenby et al.(2006)Cancer Res 66(10):5216-5223)。因此，酸
性可提供用于肿瘤靶向的通用生物标记物，而该生物标记物不必进行耐药细胞系的选择
(Bailey et al.(2012)Adv Pharmacol 65:63-107)。pHLIP肽(如pHLIP肽)是一类膜结合
肽，通过在细胞外pH低时插入跨越细胞膜(Weerakkody et al.(2013)Proc Natl Acad Sci
U S A 110(15):5834-5839)而在体外和体内特异性地以酸性细胞为靶点(Andreev et al.
(2014)Front Physiol 5:97)。与荧光染料偶联的pHLIP肽(如pHLIP肽)已经用以在多种动
物肿瘤模型中((Weerakkody et al.(2013)Proc Natl Acad Sci U S A 110(15):5834-
5839；Reshetnyak et al.(2011)Mol Imaging Biol 13(6):1146-1156；Adochite et al.
(2014)Mol Pharm 11(8):2896-2905；Cruz-Monserrate et al.(2014)Sci Rep 4:4410)和
人类头颈活检样品中将正常组织与赘生性组织区分开来(Luo et al.(2014)Cancer Prev
Res(Phila)7(10):1035-1044；Luo et al.(2012)J Biomed Opt 17(10):106006)。

[0627] 多种实作中，ICG-pHLIp肽(如ICG-Var3或ICG-pHLIP)以令人类膀胱癌的恶性病灶的间接体内可视化成为可能的细胞外低pH为靶点。在下述非限制性实例中，在根治性外科
手术后获得的膀胱切除标本立即以非缓冲盐水灌洗，并滴注ICG-Var3构造的溶液，培养，并
冲洗。随后打开膀胱并成像，标记荧光点，并进行标准病理学分析以建立ICG-Var3成像与白
光病理学评价之间的关联。实现了对膀胱病灶的精确成像，灵敏度为97％。特异性为100％，
但如果认为对来自先前经尿道切除术或化疗的赘生组织的靶向性是假阳性，则特异性降低
至80％。ICG-Var3成像剂标记肌肉浸润性和非肌肉浸润性两种高级别尿路上皮癌。精确诊
断出了1例原位癌，而使用白光则仅见4例，因此，使用ICG-Var3化合物成像提供了改善的对
膀胱癌的早期诊断，也可令新的治疗选择称为可能。

[0628] 对于无论何种子类型的尿路上皮癌的早期检测，该ICG-Var3化合物都是具有高灵敏度和特异性的有前途的工具。该检测可用于监控疾病状态及/或标记用于外科手术移除
的病灶。

[0629] 监控及/或诊断受试者体内的癌症可对多种癌症实施，例如通过评价ICG-pHLIP肽是否特异性地结合至待测试瘤形成的组织而实施。一些具体实施例中，该组织处于受试者
体内，且该化合物直接应用至该组织或进行全身注射(或，例如，皮下注射或腹膜注射)。非
限制性实例中，使用管子如导管将本文中揭露的化合物输送至膀胱、食道、胃和结肠组织。
该化合物可以例如喷雾、雾、液滴、液体或粉末形式给药。一些具体实施例中，化合物经口服
给药，随后使用例如内窥镜或膀胱将检测。包含本发明主旨化合物的漱口书和喷雾剂可用
以检测口腔的癌症或癌前病灶。本文中揭露的化合物可直接施加至子宫颈以检测例如宫颈
癌组织。关于例如皮肤癌，可将该化合物施加至皮肤表面。某些具体实施例中，该组织是样
品如活检样品及/或已经通过手术移除的器官或其部分。

[0630] ICG-pHLIP肽，如ICG-Var3成像剂，改善对膀胱内癌病灶的诊断和切除。本文中提供的方法、化合物、组合物、系统和试剂盒将降低复发率，改善患者结局，并减少膀胱癌的医
疗护理费用。此外，靶向成像的成功导致将治疗分子pHLIP肽(如pHLIP)输送至膀胱中路细
胞，创造了膀胱癌的靶向治疗机会。多个具体实施例中，由于ICG-pHLIP肽构造(如ICG-Var3
构造)以肿瘤微环境的通用性质——肿瘤酸性——为靶点，因此是可通用的成像剂。在包括
淋巴瘤、黑素瘤、胰腺肿瘤、乳腺肿瘤和前列腺肿瘤在内的超过15种人类、鼠和大鼠肿瘤转
基因鼠模型和人类组织(间接体内染色的膀胱、肾、乳腺和头颈)中，已经显示了荧光pHLIP
肽对于原发肿瘤和转移病灶的靶向性。尚未尝试使用ICG，已知其具有极差的组织渗透性且
结合至血液中的蛋白质。令人惊奇的是，包含ICG和pHLIP肽的偶联物(如，pHLIP肽)能特异
性地以癌症组织为靶点。此外，包含ICG和pHLIP肽的偶联物具有预料之外的性质，尤其是与
包含其它荧光团的偶联物相比。例如，当pHLIP肽经其拴系在膜上时，ICG荧光增强约25倍。
这不仅促进了对于肿瘤的检测，还促进了对癌组织与非癌组织之间的边界的鉴别。当将已
经附接至pHLIP肽的其它染料/荧光团拴系在细胞膜上时，并未观察到荧光强度的增加，而
该荧光强度的增加可提升肿瘤/正常组织的荧光比。

[0631] 本文中非限制性实例中呈现的数据显示，ICG-Var3和ICG-WT(ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT)(SEQ ID NO:444)可用于多种临床过程中的荧光造影术。与游离
ICG相比，优点显着。多个具体实施例中，成像时间从目前使用游离ICG的2至5分钟延长为使
用ICG-Var3(或ICG-WT)的2至3小时。当下，在一些过程中，游离ICG注射10次或更多次。

[0632] 一些具体实施例中，ICG-pHLIP(如ICG-Var3)仅注射一次，且可贯穿整个过程成像而不造成对临床流程的任何中断(例如在再次注射游离CG时出现的流程中断)。因此，使用
ICG-pHLIP时临床过程中步骤或动作的流程或顺序比使用游离ICG时少。在荧光造影术和其
它临床过程中，ICG-pHLIP具有显着优点，并提供与使用游离ICG相比的改善。

[0633] 潜在的ICG-pHLIP(如ICG-Var3)用途的三种非限制性实例如下：

[0634] 1.在静脉给药ICG-pHLIP(如ICG-Var3)后的荧光造影术：在静脉注射ICG-pHLIP后，在5分钟到2至3小时的时间内实施成像，以将血管和血液灌注可视化。ICG-Var3可用于
多种临床过程中。

[0635] 2.在静脉给药ICG-pHLIP(如ICG-Var3)后，对于酸性患病组织的靶向性(如，鉴别该组织以用于后续手术切除)：在静脉注射ICG-pHLIP后，在较晚的时间点如>4小时或次日
实施成像，以将对酸性患病组织如癌前病灶、肿瘤、淋巴结中的癌细胞、局部缺血的心肌、动
脉粥样硬化斑块、感染部位等的靶向性可视化。多个具体实施例中，有更长的来自ICG-
pHLIP时间进行血液清除和相邻非患病组织的清除，以观察患病组织与非患病组织之间的
最佳对比(如，在最优时间点)。

[0636] 3.在外用给药ICG-pHLIP(如ICG-Var3)后，对于酸性患病组织的靶向性(如，鉴别该组织以用于后续手术切除)：成像将在外用给药ICG-pHLIP后实施，例如输注入膀胱以检
测膀胱癌、冲洗口腔以检测口腔癌、喷在皮肤上以检测皮肤癌、喷在子宫颈以检测宫颈癌、
喷在结肠内以检测结肠癌、以及喷入或吸入肺气道通路中以检测肺癌。该试剂也可用于非
癌性应用，如对伤口或感染部位(其组织也是酸性的)的可视化。例如，该试剂可用于与将多
种装置例如整形外科装置、假体、药物缓释贴剂、植入物、和心血管装置如支架植入体内相
关的感染部位的可视化中为。某些包含ICH-pHLIP的外用应用的具体实施例中，在外用施加
ICG-pHLIP后的10至60分钟内实施成像。

[0637] pH-触发的多肽

[0638] pH-触发的多肽(pHLIP肽，也称“pH-触发的pH(低)插入肽”)是一种水溶性膜肽，其在中性pH下与细胞膜的相互作用若且不插入该脂质双层内，但在酸性pH下(如，在低于约
7.0、6.75、6.5、6.25、6、5.75、5.5、5.25、5.0、4.75、4.5、4.25、4.0、3.75、3.5、3.25、或3.0的pH下)插入该细胞膜内并形成稳定的跨膜α-螺旋。

[0639] 一些具体实施例中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个遗传编码的氨基酸。或者或此外，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、或30个非遗传编码的氨基酸。一些具体实施例中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、或30个D-氨基酸。

[0640] 某些具体实施例中，该pHIP肽包含附接有该荧光团的官能团。多个具体实施例中，该pHLIP肽的该官能团包含氨基酸、叠氮修饰的氨基酸、或炔基修饰的氨基酸。一些具体实
施例中，该pHLIP肽的该官能团包含游离的巯基或伯胺。某些具体实施例中，一个或多个荧
光团附接至该官能团。

[0641] 多个具体实施例中，pHLIP肽(如，处于包含pHLIP肽和荧光团的化合物内的该pHLIP肽)在低pH具有净中性电荷，而在中性或高pH具有净负电荷。一些具体实施例中，
pHLIP肽在pH低于约7、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、或4.0的水中具有净中性电荷，而在pH为约7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、或7.75的水如蒸馏水中具有净负电荷。某些具体实施例中，pHLIP肽在pH低于约7的水中具有净中性电荷，而在pH约7的水中具有净负电荷。
一些具体实施例中，pHLIP肽在pH低于约6.9的水中具有净中性电荷，而在pH约7的水中具有
净负电荷。一些具体实施例中，pHLIP肽在pH低于约6.8的水中具有净中性电荷，而在pH约7
的水中具有净负电荷。一些具体实施例中，pHLIP肽在pH低于约6.7的水中具有净中性电荷，
而在pH约7的水中具有净负电荷。一些具体实施例中，pHLIP肽在pH低于约6.6的水中具有净
中性电荷，而在pH约7的水中具有净负电荷。一些具体实施例中，pHLIP肽在pH低于约6.5的
水中具有净中性电荷，而在pH约7的水中具有净负电荷。多个具体实施例中，pHLIP肽在pH低
于约6.0的水中具有净中性电荷，而在pH约7的水中具有净负电荷。一些具体实施例中，
pHLIP肽在pH低于约5.5的水中具有净中性电荷，而在pH约7的水中具有净负电荷。某些具体
实施例中，pHLIP肽在pH低于约5.0的水中具有净中性电荷，而在pH约7的水中具有净负电
荷。多个具体实施例中，pHLIP肽在pH低于约4.5中具有净中性电荷，而在pH约7的水中具有
净负电荷。一些具体实施例中，pHLIP肽在pH低于约4.0中具有净中性电荷，而在pH约7的水
中具有净负电荷。

[0642] 一些具体实施例中，pHLIP肽(如，处于包含pHLIP肽和荧光团的化合物内的该pHLIP肽)在pH为约7、7.25、7.5、或7.75的水中具有净负电荷。或者或此外，该pHLIP肽的酸
解离常数对数(pKa)可为小于约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、或7。

[0643] 多个具体实施例中，可质子化的氨基酸是pKa小于约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7的氨基酸。某些具体实施例中，可质子化的氨基酸是pKa小于约6.5的氨基酸。一些具体
实施例中，可质子化的氨基酸是pKa小于约5.5的氨基酸。某些具体实施例中，可质子化的氨
基酸是pKa小于约4.5的氨基酸。多个具体实施例中，可质子化的氨基酸是pKa小于约4.0的
氨基酸。一些具体实施例中，可质子化的氨基酸包含羧基。

[0644] pHLIP-荧光团化合物可包含多个大小的pHLIP肽。例如，pHLIP肽可具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50或更多个氨基酸；8至15个氨基酸；8至50个氨基酸；8至40个氨基酸；8至30个氨基酸；8至20个氨基酸；8至10个氨基酸；少于约20个氨基
酸；少于9、10、11、12、13、14、或15个氨基酸；10个氨基酸；9个氨基酸、或8个氨基酸。一些具体实施例中，该pHLIP肽中少于1、2、3、4或5个氨基酸在pH为7、7.25、7.5或7.75的水中具有
净正电荷。某些具体实施例中，该pHLIP肽包含0个在pH约为7、7.25、7.5或7.75的水中具有
净正电荷的氨基酸。

[0645] 某些具体实施例中，pHLIP肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个芳香族氨基酸。例如，该芳香族氨基酸可以是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、和人工芳香族氨基酸。

[0646] 多个具体实施例中，本发明主旨的pHLIP肽具有至少1个可质子化的氨基酸。例如，pHLIP肽可包含1个可质子化的氨基酸，该氨基酸可以是天冬氨酸、谷氨酸、或γ-羧基谷氨
酸；或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个可质子化的氨基酸，其中，该可质子化的氨基酸包含天冬氨酸、谷氨酸、和γ-羧基谷氨酸中的一种或多种。一些具体实施例中，该可质子化的
氨基酸是人工氨基酸。非限制性实例中，pHLIP肽具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个可质子化的氨基酸，其中，该可质子化的氨基酸包含天冬氨酸、谷氨酸、γ-羧基谷氨酸、或其
任意组合。

[0647] 本发明的主旨为提供pHLIP肽，其具有人工氨基酸如至少1个可质子化的人工氨基酸。多个具体实施例中，该可质子化的人工氨基酸包含至少1、2、3、4或5个羧基，及/或该
pHLIP肽可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个羧基。一些具体实施例中，pHLIP肽具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个人工氨基酸。一个非限制性实例中，该pHLIP肽的每个氨基酸均为人工氨基酸。某些具体实施例中，
pHLIP肽可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个D-氨基酸。

[0648] 本发明主旨的多种实作涉及具有至少一个人工氨基酸的pHLIP肽，该人工氨基酸是半胱氨酸衍生物、天冬氨酸衍生物、谷氨酸衍生物、苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、或色
氨酸衍生物。例如，pHLIP肽可含有选自D-乙硫氨酸、硒代-L-半胱氨酸、S-(2-噻唑基)-L-半
胱氨酸和S-(4-甲苯基)-L-半胱氨酸所组成的组的半胱氨酸衍生物；天冬氨酸衍生物，是天
冬氨酸的N-苯基(苄基)胺基衍生物；选自γ-羧基-DL-谷氨酸、4-氟-DL-谷氨酸和(4S)-4-
(4-三氟甲基-苄基)-L-谷氨酸所组成的组的谷氨酸衍生物；选自(S)-N-乙酰基-4-溴苯丙
氨酸、N-乙酰基-2-氟-DL-苯丙氨酸、N-乙酰基-4-氟-DL-苯丙氨酸、4-氯-L-苯丙氨酸、DL-
2,3-二氟苯丙氨酸、DL-3,5-二氟苯丙氨酸、3,4-二羟基-L-苯丙氨酸、3-(3,4-二甲氧基苯
基)-L-丙氨酸、4-(羟甲基)-D-苯丙氨酸、N-(3-吲哚基乙酰基)-L-苯丙氨酸、p-碘-D-苯丙
氨酸、α-甲基-DL-苯丙氨酸、4-硝基-DL-苯丙氨酸和4-(三氟甲基)-D-苯丙氨酸所组成的组
的苯丙氨酸衍生物；选自α-甲基-DL-酪氨酸、3-氯-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸和DL-o-酪
氨酸所组成的组的酪氨酸衍生物；及/或选自5-氟-L-色氨酸、5-氟-DL-色氨酸、5-羟基-L-
色氨酸、5-甲氧基-DL-色氨酸或5-甲基-DL-色氨酸所组成的组的色氨酸衍生物。

[0649] 多个具体实施例中，pHLIP肽具有至少8个接续氨基酸，其中，该pHLIP肽的该8个接续氨基酸中至少2、3、4、5或6个是非极性的，且该pHLIP肽的该8个接续氨基酸中至少1或2个
是可质子化的。例如，该pHLIP肽可具有8-10个接续氨基酸，包括该8至10个接续氨基酸中至
少2、3、4、5或6个是非极性的，且至少1或2个是可质子化的。

[0650] 本公开的多个方面提供链接至荧光团的pHLIP肽。多种实作中，该pHLIP肽通过共价键而直接链接至链接基团及/或荧光团。一些非限制性实例中，该共价键是酯键、二硫键、
位于两个硒原子之间的键、位于硫原子与硒原子之间的键、或酸不稳定的键。

[0651] 一些具体实施例中，位于该pHLIP肽与链接基团及/或荧光团之间的共价键是已经通过click反应形成的键。Click反应的非限制性实例包括下述之间的反应：叠氮化物与炔；
炔与应变二氟辛炔；二芳基-应变-环辛炔与1,3-硝酮；环辛烯、反式环烯、或氧杂降冰片二
烯与叠氮化物、四嗪、或四唑；活化的烯烃或氧杂降冰片二烯与叠氮化物；应变环辛烯与其
它活化烯烃与四嗪；或已经通过紫外光活化的四唑与烯烃。

[0652] 一些实作提供通过共价键附接至链接基化合物的pHLIP肽，其中，该链接基化合物附接至该荧光团或通过共价键而附接至该荧光团。多个非限制性实例中，位于该pHLIP肽与
链接基化合物之间的共价键及/或位于链接基化合物与荧光团之间的共价键是二硫键、位
于两个硒原子之间的键、位于硫原子与硒原子之间的键、或已经通过Click反应形成的键。

[0653] 多个具体实施例中，该荧光团的重量为(a)至少约0.5、1、1.5、2、2.5、5、6、7、8、9或10千道尔顿(kDa)；或(b)低于约0.5、1、1.5、2、5、6、7、8、9或10kDa。一个非限制性实例中，pHLIP链接至重量为至少约15kDa的荧光团。该荧光团可以是例如极性的或非极性的。

[0654] 多个非限制性实例中，该荧光团包含荧光染料或荧光蛋白。

[0655] 多个具体实施例中，pHLIP-荧光团化合物(或处于pHLIP-荧光团化合中的pHLIP肽)在低pH具有的对于膜脂质双层的亲和性比在正常pH下高。例如，在pH 5.0的亲和性比在
pH 8.0下高至少5倍。一些具体实施例中，在pH 5.0的亲和性比在pH 8.0下高至少10倍。一
些具体实施例中，pH触发的化合物与膜脂质双层的结合/关联/隔开在低pH(如，pH<6.5或
7.0)比在较高pH(如，pH≥6.5或7.0)下更高。

[0656] 一些具体实施例中，一种或多种非极性氨基酸包含丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。一些具体实施例中，一种或多种极性氨基酸包含
丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。一些具体实施例中，该极性氨基酸是人工氨基酸如
1-甲基色氨酸。

[0657] 多个具体实施例中，非极性氨基酸定义为测量溶剂化能≥0.5kcal/mol的氨基酸。20种常见天然氨基酸的溶剂化能(GXcorr)的数值是已知的，如Wimley WC,Creamer TP&White
SH(1996)Biochemistry 35,5109-5124(后文中记为Wimley et al.1996)或Moon and
Fleming,(2011)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101:10174-10177确定的，其整体内容通过引用
而并入本文。下表提供例示性的天然出现的氨基酸的侧链溶剂化能。

[0658] 表1：AcWL-X-LL中20种天然氨基酸侧链(X)的溶剂化自由能。非极性残基加粗显示并定义为的残基。

[0659]

[0660] 20种天然氨基酸相对于甘氨酸的残基溶剂化自由能是从Wimley et al.1996中第5116页表1中的数据计算的。对自由能进行相邻残基面积封锁的纠正(见正文)和甘氨酸异
常性质的纠正(见正文)。残基溶剂化能使用摩尔分数单位计算。在AcWL-X-LL肽的情境中，X
残基的残基溶剂化自由能是从Wimley et al.1996第5116页表1中的自由能使用虚拟甘氨
酸(GLY*)作为参考标准(见Wimley et al.1996正文)而计算的。

[0661]

[0662] Ahost(X)＝ATnp(WLXLL)-AXnp(WLXLL)

[0663] 这些“纠正的”数值解释了该主体肽的非极性ASA中X-依赖性变化。Arg和Lys的数值是从在pH 1下测量的实验自由能计算的，在该pH下不出现该侧链与羧基之间的离子反
应。是被中等大小的相邻残基遮挡的残基的溶剂化能的最佳估计值。

[0664] 经遗传编码的氨基酸和例示性的非遗传编码的氨基酸列在下表2中。

[0665] 一些具体实施例中，pHLIP肽包含一个或多个半胱氨酸残基。该半胱氨酸残基用作例如使用硫醇链结与所运载的化合物偶联的点。将所运载的化合物链接至pHLIP肽的其它
手段酯链结及/或酸不稳定的链接。也可作成非裂解性共价化学链结，以将荧光团永久地束
缚在膜插入肽(如，pHLIP肽)上。

[0666] 本文中提供的膜插入化合物可用于诊断或成像，或用作研究试剂/工具(如，以评估血管组织或肾组织的结构或功能)。本发明主旨的多种实作涉及诊断性偶联物，其包含pH
触发的化合物和链接至该pH触发的化合物的药学可接受的可检测的标记物。例示性的可检
测的标记物包括成像剂、染料、纳米颗粒、或其它可检测的标记。多个具体实施例中，该膜插
入化合物本身是无毒的，尤其是当使用有效量的该膜插入肽时。

[0667] 作为单体，pHLIP肽插入并横跨细胞膜而不形成孔。该pHLIP肽-纳米技术平台可用于，例如，治疗剂或成像剂对实体肿瘤的pH选择性的靶向性，其中，它们被拴系在肿瘤细胞
的表面；及/或使用对经由可裂解的键附接至该pHLIP肽C端的所运载分子的细胞质输送而
对肿瘤细胞的pHxuanzexing的靶向性。一个非限制性实例中，经由S-S键附接至该pHLIP肽C
端的所运载的分子在细胞质中被裂解。被成功注射的分子中包括有机染料、鬼笔环肽(一种
大于1kDa的极性的环状肽)、以及12元和18元肽核酸(PNA)。如果所运载的分子经由非裂解
性键附接至该pHLIP肽的N端，则pHLIP肽可将所运载的分子拴系在酸性组织内的细胞表面
上。pHLIP肽进入膜内的pH选择性插入和折叠已经被用来在体内以酸性组织为靶点，该酸性
组织包括肿瘤和炎性部位。pHLIP肽进入该膜和分子移位至细胞内的通道不是以内吞作用
为中介，而是以与细胞受体的相互作用或在细胞膜内形成孔为中介。一些具体实施例中，
pHLIP肽插入与残基如Asp残基的脂质化关联，其导致pHLIP肽疏水性增加，而该增加立即
(几秒内)触发该肽插入至细胞膜内。该插入伴随有能量的释放，该能量可用来令无法渗透
细胞的所运载分子移动通过该膜的脂质双层而进入该细胞内。

[0668] 肽与蛋白质尤其是血浆蛋白、以及膜的之间的相互作用，影响该肽在中性pH下的药代动力学。pHLIP肽表现出延长的血液循环，这与它们在中性和高pH下弱结合至膜表面并
防止被肾脏像清除小肽一样快速清除的能力相一致。

[0669] 本发明主旨的多个方面涉及“变体3”或“Var3”pHLIP肽。Var3 pHLIP肽包括序列LFPTXTLL中的氨基酸的伸展，其中，X是天冬氨酸。Var3 pHLIP肽序列的非限制性实例包括

[0670] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:2)、

[0671] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:3)、

[0672] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)、

[0673] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:5)、

[0674] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCA(SEQ ID NO:6)、

[0675] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKA(SEQ ID NO:7)、

[0676] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:8)、

[0677] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:9)、

[0678] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:10)、

[0679] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKG(SEQ ID NO:11)、

[0680] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKG(SEQ ID NO:12)、

[0681] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:13)、以及

[0682] ACKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:14)。

[0683] 本文中例示的或另做揭露的pHLIP肽变体可使用该领域中周知的替换技术进行设计。本文中例示的pHLIP肽或下文中讨论的变体无一限制本文中揭露的主旨的整体范畴。

[0684] 非限制性例示肽的非限制性变体

[0685] 本文中提供的膜插入化合物可包括膜插入肽(如，pHLIP肽或不是pH触发的肽)，如本文中提供的pHLIP或其变体的任意非限制性实例。本文中例示的或另做揭露的膜插入肽
变体可使用该领域中周知的替换技术进行设计。本文中例示的膜插入肽或下文中讨论的变
体无一限制本文中揭露的主旨的整体范畴。本文中揭露的具体膜插入肽变体的非限制性实
例包括，具有所揭露的具体膜插入肽的反向氨基酸序列的肽。例如，对包含序列WARYADWL
(SEQ ID NO:34)的膜插入肽的揭露也提供对包含序列LWDAYRAW(SEQ ID NO:35)的膜插入
肽的揭露。

[0686] 本发明主旨的多个方面涉及从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守氨基酸替换而得的膜插入肽。“保守氨基酸替换”是将一个氨基酸残基替代为具有相似侧链的另一氨基酸残基的氨基酸替换。该领域中已经界定了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包
括具有碱性侧链的氨基酸(如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如，天冬
氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨
酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，pH触发的肽序列中的残基(如，对应于关于本文中揭露的SEQ ID NO的位置)可替代为来自相同侧
链家族的另一氨基酸残基。某些具体实施例中，可使用天然氨基酸或非天然氨基酸作成保
守的氨基酸替换。

[0687] 表2：经遗传编码和例示性的非遗传编码的氨基酸，包括L-异构体、D-异构体、α-异构体、β-异构体、二醇修饰和甲基修饰。

[0688]

[0689]

[0690]

[0691] 表3：可质子化的残基的非限制性实例及其包括L-异构体、D-异构体、α-异构体和β-异构体的替换

[0692]

[0693] 表4：经遗传编码的氨基酸替换的实例

[0694]

[0695] 表5：属于不同组别pHLIP肽的假定膜插入序列的非限制性实例。每一可质子化的残基(以下划线显示)将会被来自表3的其替换物所替代。每一非极性残基将会被来自表4的
其经遗传编码的氨基酸替换物及/或来自表2的非遗传编码的氨基酸替换物所替代。

[0696]

[0697]

[0698] 表6：pHLIP序列的非限制性实例。半胱氨酸、赖氨酸、叠氮修饰的氨基酸或炔基修饰的氨基酸可并入该用于与所运载的化合物和链接基偶联的肽的N端(最开始6个残基)或C
端(最末6个残基)部分。

[0699]

[0700]

[0701]

[0702] 上述表中，“Am”意为C端酰胺化，其保护C端，即，在C端没有游离的COOH基团且在C端没有电荷。“Ac”意为N端酰化，其保护N端，即，在N端没有游离的NH2基团且在N端没有电
荷。

[0703] 表7：链接基及其组成的非限制性实施例

[0704]

[0705]

[0706] 或者或此外，以天然氨基酸替换可以使用模块替换矩阵(BLOSUM矩阵)为特征。BLOSUM矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵，其解释在Styczynski et al.(2008)“BLOSUM62
miscalculations improve search performance”Nat Biotech 26(3):274–275中，其整体
内容通过引用而并入本文。BLOSUM62矩阵显示在图19中。

[0707] 在BLOSUM62矩阵上评分至少为4的替换在本文中称为“I类替换”；在BLOSUM62矩阵上评分为3的替换在本文中称为“II类替换”；在BLOSUM62矩阵上评分为2或1的替换在本文
中称为“III类替换”；在BLOSUM62矩阵上评分为0或-1的替换在本文中称为“IV类替换”；在
BLOSUM62矩阵上评分为-2、-3或-4的替换在本文中称为“V类替换”。

[0708] 主旨应用的多个具体实施例包括膜插入肽(如，pHLIP肽)，与本文中例示的膜插入肽相比，该具体实施例中的膜插入肽具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个I类、II类、III类、IV类或V类替换，或具有任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个I类、II类、III类、IV类及/或V类替换的任何组合。

[0709] 本发明主旨的多个方面也涉及膜插入肽，与本文中例示的膜插入肽相比，该多个方面的膜插入肽具有1、2、3、4、5或更多个氨基酸插入或删除。

[0710] D-氨基酸

[0711] 标准α-氨基酸中，除甘氨酸外，全部可以两种光学异构体中的任一者存在，该光学异构体称为L-氨基酸或D-氨基酸，它们互为彼此的镜像。虽然L-氨基酸表示在核糖体翻译
过程中在蛋白质中发现的所有氨基酸，但在一些通过在翻译和易位至内质网后的酶翻译后
修饰产生的蛋白质中发现了D-氨基酸。D-氨基酸是细菌的肽聚糖细胞壁中含量丰富，且D-
丝氨酸在脑中作为神经递质而发挥作用。对氨基酸构型的L和D的俗称并不指代该氨基酸自
身的光学活性，而是指该氨基酸可自其合成的甘油醛异构体的光学活性(D-甘油醛是右旋
的，而L-甘油醛是左旋的)。

[0712] 与L-膜插入肽相比，完全或部分地由D-氨基酸构建的膜插入肽具备优势。例如，D-膜插入肽的生物降解比其左旋副本更慢，导致增强的活性和更长的生物半衰期(Sela and
Zisman,1997FASEB J,11:449-456，通过引用并入本文)。因此，D-膜插入肽可用于本文中揭
露的方法中。本文中包括膜插入肽，其仅包含L-氨基酸或仅包含D-氨基酸，或包含D-氨基酸
与L-氨基酸的组合。

[0713] 吲哚菁绿

[0714] 非浸润性近红外(NIR)荧光成像染料ICG已经获美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于眼科血管造影术以确定心输出量和肝血液流动和功能。这一染料也用于癌症患者体
内，用于检测实体肿瘤、淋巴结的位置，以及用于重建外控手术中的血管造影、肾和脉络膜
脉管系统的可视化、以及光动力疗法中。在癌症诊断和治疗中，ICG可用作成像染料和高热
剂。

[0715] ICG是具有NIR吸收性质(吸收峰约为800nm)并在可见范围内吸收极小的三羰花青型染料，因此，其展现低的自荧光、组织吸收、并在NIR波长(700至900nm)散射。

[0716] 未偶联的ICG可包含下述结构：

[0717]

[0718] ICG的CAS登记号是3599-32-4。

[0719] ICG可经改性以例如促进其附接至肽如本文中揭露的pHLIP。可商购(如，从瑞士Intrace医疗公司(Intrace Medical SA,Lausanne,Switzerland)商购)的改性ICG化合物
的非限制性实例包括ICG N-琥珀酰亚胺基酯(ICG-NHS酯)、ICG-CBT,ICG-马来酰亚胺、ICG-
叠氮化物、ICG-炔、和ICG-PEG-NHS酯。

[0720] 该ICG染料的琥珀酰亚胺基酯(NHS)提供了研发最优偶联物的机会。琥珀酰亚胺基酯活性基团提供了将ICG选择性地链接至多种物质(抗体、肽、蛋白质、核酸、小分子药物等)
上的伯胺(R-NH2)的有效且便利的途径。琥珀酰亚胺基酯与包括酪氨酸和组氨酸在内的芳
香族胺、醇和酚的反应活性非常低。ICG-NHS酯的实例包含下述结构：

[0721] 激发级别：近红外，NIR

[0722] 最大激发/发射(nm)：790/830

[0723] 分子量：828.04g.mol-1

[0724] 分子式：C49H53N3O7S

[0725] 结构：

[0726]

[0727] 上述结构的环状部分表示该链接基团。

[0728] 马来酰亚胺活性基团提供了在中性(生理学)pH下不经任何激活而将ICG染料选择性地链接至多种物质(抗体、肽、蛋白质、核酸、小分子药物等)上的硫氢基(游离硫醇，R-SH)
的有效且便利的途径。马来酰亚胺与氨、醇和酚(如酪氨酸和组氨酸)的反应活性非常低，且
不与组氨酸和蛋氨酸反应，通过非常高的标记选择性。ICG-马来酰亚胺的实例包含下述特
征：

[0729] 激发级别：近红外，NIR

[0730] 最大激发/发射(nm)：790/830

[0731] 分子量：853.09g.mol-1

[0732] 分子式：C51H56N4O6S

[0733] 结构：

[0734]

[0735] 上述结构的环状部分表示该链接基团。

[0736] 该2-氰基苯并噻唑标记过程基于2-氰基苯并噻唑基团与任何1,2-氨基硫醇或1,3-氨基硫醇(如，游离的或N端的半胱氨酸)之间的生物相容性链接反应。这一链接反应比常
用的施陶丁格连接(Staudinger ligation)快3个数量级，且可提供有用的偶联物。氰基苯
并噻唑(CBT)活性基团提供了不经任何额外激活而将ICG选择性地链接至多种物质(抗体、
肽、蛋白质、核酸、小分子药物等)上的硫氢基(游离硫醇，R-SH)的有效且便利的途径。与使
用简单硫醇相比，使用氨基硫醇进行的标记反应是选择性的。由于该CBT化学链接的选择性
非常高，可与所有其它生物相容的链接反应(如，叠氮化物、炔、三苯基膦、四嗪等)一起使
用。此外，由于没有离去基(与NHS酯不同)，ICG-CBT标记过程中没有副产物形成。ICG-CBT的
实例包含下述特征：

[0737] 激发级别：近红外，NIR

[0738] 最大激发/发射(nm)：790/830

[0739] 分子量：931.38g.mol-1

[0740] 分子式：C55H57N5O5S2

[0741] 结构：

[0742]

[0743] 上述结构的环状部分表示该链接基团。

[0744] ICG-叠氮化物可用来经由化学链接来化学选择性地标记炔标签化的生物分子(如蛋白质、脂质、核酸、糖)。ICG-叠氮化物的实例包含下述特征：

[0745] 激发级别：近红外，NIR

[0746] 最大激发/发射(nm)：790/830

[0747] 分子量：931.21g.mol-1

[0748] 分子式：C53H66N6O7S

[0749]

[0750] 上述结构的环状部分表示该链接基团。

[0751] ICG-炔可用来经由Cu(II)催化的链接反应来标记叠氮化物标签化的分子。该反应是化学选择性的和生物相容性的。ICG-炔的实例包含下述特征：

[0752] 激发级别：近红外，NIR

[0753] 最大激发/发射(nm)：790/830

[0754] 溶解性：DMSO、DMF、乙腈、甲醇

[0755] 分子量：767.38g.mol-1

[0756] 分子式：C48H53N3O4S

[0757] 花青荧光团

[0758] 本文中，花青荧光团可酌情称为“花青染料”。花青染料是含有位于两个具有非定域电荷的氮原子之间的聚甲炔桥的分子。

[0759]

[0760] 花青由于它们的结构而具有杰出的高消光系数，往往超过100,000Lmol-1cm-1。不同的取代基令控制该发色团的性质如吸收波长、光稳定性和荧光成为可能。例如，可通过选
择聚甲炔桥的长度来控制吸收和荧光波长：较长的花青具备较高的吸收和发射波长，该波
长可长达近红外区域。花青染料的非限制性实例包括非磺化的花青和经磺化的花青。

[0761] 可获得的非磺化花青包括，例如，Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5。表示“花青”，且第一个数字代表假吲哚基团之间的碳原子数。作为恶唑衍生物而非假吲哚的Cy2是
这一规则的例外。对于苯并稠合的花青，则加入后缀.5。某些具体实施例中，对结构的改变
令该分子的荧光性质发生变化，并令通过几个荧光团覆盖可见和NIR光谱中最重要的部分
成为可能。

[0762] Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5的结构如下：

[0763]

[0764]

[0765] 经磺化的花青包括额外的磺基，在一些具体实施例中，该磺基促进染料分子在水相中的溶解。多个具体实施例中，带电的磺基降低染料分子和重标记偶联物的聚集。

[0766] 经磺化的花青的非限制性实例包括sulfo-Cy3、sulfo-Cy5和sulfo-Cy7。

[0767]

[0768]

[0769] IR800

[0770] IR800马来酰亚胺的结构如下：

[0771]

[0772] IR800也称 800CW红外染料，可从LI-COR生物科学公司(LI-COR Biosciences(Nebraska,United States))获得。

[0773] 链接反应

[0774] 本文中揭示的化合物(如，pHLIP肽和包含多个pHLIP肽的化合物)可包括位于该化合物和所运载化合物之间、位于链接基与所运载化合物之间、位于pHLIP肽与链接基之间、
和位于两个pHLIP肽之间的共价键。多个具体实施例中，已经通过生物正交反应如环加成反
应(如，“链接(click)”反应)形成共价键。适用于制备此类化合物的例示性生物正交反应揭
示在例如Zheng et al.,“Development of Bioorthogonal Reactions and Their
Applications in Bioconjugation,”Molecules,2015,20,3190-3205中。对于构建本文中
揭示的多功能整体，肽前体的多样性和可商购性是有吸引力的。本文中揭示适用于诸如制
备pH触发的肽化合物的例示性、非限制性链接反应，其中该pH触发的肽化合物包括位于该
肽与所运载化合物之间的共价键。

[0775] Huisgen环加成

[0776] 链接反应的策略包括乙炔至叠氮化物的Huisgen 1,3-偶极加成。见，例如，反应式1。

[0777] 反应式1

[0778]

[0779] 多个具体实施例中，CARGO对应于本文中揭示的任何所运载的化合物(如荧光团)。

[0780] 多个具体实施例中，L1独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L1与R1组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L1包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0781] 多个具体实施例中，R1是氢、经取代或未取代的烷基，或R1与L1组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L1包含一个或多个本文中揭示的氨基酸。

[0782] 多个具体实施例中，或L1与R1组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环。多个具体实施例中，该8元亚环炔基环是未取代的。多个具体实施例中，该8元亚环炔基环包含两
个氟取代基(如，该炔基的α位置)。

[0783] 多个具体实施例中，L2独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L2与R2组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L2包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0784] 多个具体实施例中，RA和RB独立为氢、经取代或未取代的烷基、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的环烷基、经取代或未取代的杂环烷基、经取代或未取代的芳基、
或经取代或未取代的杂芳基。

[0785] 多个具体实施例中，该Huisgen环加成揭示在反应式2和反应式3中。

[0786] 反应式2

[0787]

[0788] 多个具体实施例中，CARGO对应于本文中揭示的任何所运载的化合物(如荧光团)。

[0789] 多个具体实施例中，L1独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L1与R1组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L1包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0790] 多个具体实施例中，L2独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L2与R2组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L2包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0791] 反应式3

[0792]

[0793] 多个具体实施例中，CARGO对应于本文中揭示的任何所运载的化合物(如荧光团)。

[0794] 多个具体实施例中，L1独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L1与R1组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L1包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0795] 多个具体实施例中，R3、R4和R5为所运载的化合物，其它两个变量独立为氢、经取代或未取代的烷基、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的环烷基、经取代或未取代的
杂环烷基、经取代或未取代的芳基、或经取代或未取代的杂芳基。

[0796] 多个具体实施例中，R3、R4和R5为pH触发的肽化合物，其它两个变量独立为氢、经取代或未取代的烷基、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的环烷基、经取代或未取代
的杂环烷基、经取代或未取代的芳基、或经取代或未取代的杂芳基。

[0797] 与烯烃的环加成

[0798] 多个具体实施例中，某些活化的烯烃(如，直链烯烃如顺式或反式环辛烯或氧杂降冰片二烯)，可表示为化合物F或化合物F’,可进行与诸如叠氮化物(反应式4)、四嗪(反应式
5)或四唑(反应式6)的环加成反应。

[0799] 反应式4

[0800]

[0801] 多个具体实施例中，CARGO对应于本文中揭示的任何所运载的化合物(如荧光团)。

[0802] 多个具体实施例中，L1独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L1与R1组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L1包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0803] 多个具体实施例中，L2独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L2与R2组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L2包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0804]

[0805] 多个具体实施例中，CARGO对应于本文中揭示的任何所运载的化合物(如荧光团)。

[0806] 多个具体实施例中，L1独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L1与R1组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L1包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0807] 多个具体实施例中，L2独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L2与R2组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L2包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0808]

[0809] 多个具体实施例中，CARGO对应于本文中揭示的任何所运载的化合物(如荧光团)。

[0810] 多个具体实施例中，L1独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L1与R1组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L1包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0811] 多个具体实施例中，L2独立为键、 O、S、经取代或未取代的亚烷基、经取代或未取代的亚烯基、经取代或未取代的亚炔基、经取代或未取代的亚杂烷基、经取代或未取代
的亚环烷基、经取代或未取代的亚杂环烷基、经取代或未取代的亚芳基及、或经取代或未取
代的亚杂芳基，或L2与R2组合以形成经取代或未取代的8元亚环炔基环，或L2包含一个或多
个本文中揭示的氨基酸。

[0812] 多个具体实施例中，R6独立为氢、经取代或未取代的烷基、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的环烷基、经取代或未取代的杂环烷基、经取代或未取代的芳基、或经
取代或未取代的杂芳基。

[0813] 多个具体实施例中，本发明提出本文中揭示的任何化合物(如，化合物A、A’、B、B’、C、C’、D、D’、E、E’、F、F’、G、G’、H或H’中的任何化合物；根据式(I-A)、(I-B)、(I-C)、(I-D)、(II-A)、(II-B)、(II-C)、(II-D)、 (III-B)、(IV-A)、(IV-B)、(IV-C)、(IV-C’)、(IV-D)、(IV-D’)、(IV-E)或(IV-F)中任一式的化合物；根据式(A)如式(A4)至(A20)中任一式的
化合物；或根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4任一个的化合物)；或其药学可接受的盐。

[0814] 多个具体实施例中，本发明提出一种组合物(如药物组合物)，该组合物包含本文中揭示的任何化合物(如，化合物A、A’、B、B’、C、C’、D、D’、E、E’、F、F’、G、G’、H或H’中的任何化合物；根据式(I-A)、(I-B)、(I-C)、(I-D)、(II-A)、(II-B)、(II-C)、(II-D)、 (III-
B)、(IV-A)、(IV-B)、(IV-C)、(IV-C’)、(IV-D)、(IV-D’)、(IV-E)或(IV-F)中任一式的化合物；根据式(A)如式(A4)至(A20)中任一式的化合物；或根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4任
一个的化合物)；或其药学可接受的盐。

[0815] 除非明确排除，否则独立使用或作为其它取代基的一部分的术语“烷基”意为非环状的直链(即，不分支)或支链或其组合，烷基可以是饱和的、单或多不饱和的，且可包括二
价或多价自由基，具有所标注的碳原子数(即，C1-C10意为1至10个碳)。饱和烃基的实例包
括，但不限于，下述基团，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基甲基、同系物和异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。不饱和的烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括，但不限于，乙烯基、2-丙烯
基、巴豆基、2-异戊烯基、2-丁二烯基、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔
基、3-丙炔基、3-丁炔基、及高级同系物和异构体。烷氧基是经由氧链接基附接至该分
子剩余部分的烷基。

[0816] 除非明确排除，否则术语“亚烷基”单独使用或作为另一取代基的一部分时意为源自烷基的二价基，例如但不限于，典型地，烷基(或亚烷基)将具有1至24
个碳原子。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基，通常具有8个或更少的碳原子。

[0817] 除非明确排除，否则术语“杂烷基”单独使用或与另一术语组合时意为稳定的直链或支链或其组合，由至少一个碳原子和至少一个杂原子(如，选自O、N、P、S、Se和Si所组成的组，其中，该氮、硒和硫原子可酌情被氧化，且该氮杂原子可酌情季胺化)组成。该杂原子O、
N、P、S、Se和Si可置于该杂烷基的任何内部位置，或置于烷基借以附接至该分子剩余部分的
位置。实例包括，但不限于，：
和最多可连续出现2个杂原子，如，

[0818] 同样，除非明确排除，否则术语“亚杂烷基”单独使用或作为另一取代基的一部分时意为源自杂烷基的二价基，例如但不限于，和
对于亚杂烷基，杂原子也可占据链的一端或两端(如，亚烷基
氧、亚烷基二氧、亚烷基胺基、亚烷基二胺基等)。更进一步，对于亚烷基和亚杂烷基链接基
团，不通过该链接基团分子式的书写而暗示该链接基团的取向。例如，式表示
和两者。如上所述，本文中使用的杂烷基包括那些通过杂原子附接至该
分子剩余部分的基团，如及/或若
在具体杂烷基的描述后引用“杂烷基”如等，应理解为术语“杂烷基”和不是多
余的或不相互排斥。尤其是当引用具体的杂烷基以更清晰地理解时。因此，术语“杂烷基”在
本文中不应解释为排除具体的杂烷基，如等。

[0819] 除非明确排除，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”单独使用或与其它术语组合时分别意为环状的“烷基”和环状的“杂烷基”。此外，对于杂环烷基，杂原子可占据该杂环借以附接至该分子剩余部分的位置。环烷基的实例包括，但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己
基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括，但不限于，
1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、 3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、
四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、 2-哌嗪基等。“亚环烷基”和“亚
杂环烷基”单独使用或作为另一取代基的一部分时分别意为源自环烷基和杂环烷基的二价
基。

[0820] 除非明确排除，否则术语“芳基”意为多不饱和的芳香族烃取代基，其可以是单环、或稠合在一起(如，稠环芳基)或共价链接的多个环(优选1至3个环)。稠环芳基指的是稠合
在一起的多个环，其中该稠合的环中的至少一个是芳环。术语“杂芳基”指的是含有1至4个
杂原子(如，选自N、O和S所组成的组，其中，该氮和硫原子可酌情被氧化，且该氮原子可酌情
季胺化)的芳基(或环)。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(稠合在一起的多个环，其中该
稠合的环中的至少一个是杂芳基环)。5,6-稠环亚杂芳基指代是稠合在一起的两个环，其中
一个环具有5个成员，另一个环具有6个成员，且至少一个环是杂芳基环。6,6-稠环亚杂芳基
指代是稠合在一起的两个环，其中一个环具有6个成员，另一个环具有6个成员，且至少一个
环是杂芳基环。而6,5-稠环亚杂芳基指代是稠合在一起的两个环，其中一个环具有6个成
员，另一个环具有5个成员，且至少一个环是杂芳基环。杂芳基可通过碳或杂原子附接至该
分子的剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、 2-萘基、4-联苯基、1-吡
咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、哌嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、 2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶
基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、 5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-
喹恶啉基、5-喹恶啉基、和6-喹啉基。上述每一芳基和杂芳基环系统的取代基选自
下述可接受的取代基所组成的组。“亚芳基”和“亚杂芳基”单独使用或作为另一取代基的一
部分时分别意为源自芳基和杂芳基的二价基。

[0821] 稠环杂环烷基-芳基是稠合至杂环烷基的芳基。稠环杂环烷基-杂芳基是稠合至杂环烷基的杂芳基。稠环杂环烷基-环烷基是稠合至环烷基的杂环烷基。稠环杂环烷基-杂环
烷基是稠合至另一杂环烷基的杂环烷基。稠环杂环烷基-芳基、稠环杂环烷基-杂芳基、稠环
杂环烷基-环烷基、或稠环杂环烷基-杂环烷基可各自独立为未取代的或经一个或多个本文
中揭示的取代基取代。螺环是其中相邻的环通过一个原子附接的两个或更多个环。螺环内
的个体环可以是相同的或不同的。螺环内的个体环可以是经取代的或未取代的，且可具有
与一组螺环状内内其它个体环不同的取代基。用于螺环内个体环的可能的取代基是用于不
作为螺环的一部分的相同环的可能的取代基(如，用于环烷基环或杂环烷基环的取代基)。
螺环可以是经取代或未取代的环烷基、经取代或未取代的亚环烷基、经取代或未取代的杂
环烷基、或经取代或未取代的亚杂环烷基，且螺环基内的个体环可以是紧邻本段的上文中
列举的任何环，包括所有环为相同类型的环(如，所有环均为经取代的亚杂环烷基，其中，每
一环可以是相同或不同的经取代的亚杂环烷基)。当指的是螺环系统时，杂环状螺环意为其
中至少一个环是杂环状环且每个环均为不同的环的螺环。当指的是螺环系统时，经取代的
螺环意为其中至少一个环是经取代的且每个取代基可酌情为不同的螺环。

[0822] 上述每一术语(如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)包括所指明的基团的经取代形式和未取代形式。用于每一类型的基团的优选取代基提供于下。

[0823] 用于烷基和杂烷基(包括那些一般称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是选自但不限于下列的多种基团
中的一种或多种：＝O、＝NR'、
和
取代基数目为0至(2m'+1)，其中m’是该基团中碳原子的总数。R'、R”、R”'和R””各自优
选独立指的是氢、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的环烷基、经取代或未取代的
杂环烷基、经取代或未取代的芳基(如，经1至3个卤素取代的芳基)、经取代或未取代的烷
基、经取代或未取代的烷氧基、经取代或未取代的硫烷氧基、或芳基烷基。当本发明的化合
物包括超过一个R基团时，例如，每一R基团独立选择为当存在超过一个这些基团时的R'、
R”、R”'和R”'’基。当R'和R”附接至相同的氮原子时，它们可与该氮原子组合以形成4元、5元、6元或7元环。例如，包括，但不限于，1-吡咯烷基及4-吗啉基。基于上述对取代基
的讨论，该领域技术人员将会理解，术语“烷基”意为包括具有键结至除氢以外的基团的碳
原子的基团，如卤烷基(如，和 )和酰基(如，
等)。

[0824] 与所描述的用于该烷基的取代基相似，用于该芳基及杂芳基的取代基是可变的且选自例如：
氟(C1-C4)烷氧基、以及
氟(C1-C4)烷基，其数目为0至该芳环系统上开放价态的总数；以及，其中。R'、R”、R”'和R”'’优选独立选自氢、经取代或未取代的烷基、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的环
烷基、经取代或未取代的杂环烷基、经取代或未取代的芳基、以及经取代或未取代的杂芳
基。当本发明的化合物包括超过一个R基团时，例如，每一R基团独立选择为当存在超过一个
这些基团时的R'、R”、R”'和R”'’基。

[0825] 用于环(如，环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基)的取代基可说明为位于该换上而非位于具体环原子上的取代基(一般称为浮动取
代基)。此情形中，该取代基可附接至任意环原子(遵守化学价态规则)；而在稠环或螺环的
情形中，取代基说明为与该稠环或螺环的一个成员相关(位于一个环上的浮动取代基)，可
以是位于该稠环或螺环的任意换上的取代基(位于多个环上的浮动取代基)。当取代基附接
至环而非具体原子(浮动取代基)且该取代基的下表是大于1的整数时，该多个取代基可以
位于相同的原子上、相同的环上、不同的稠环上、不同的螺环上，且每个取代基可酌情为不
同。若环附接至分子剩余部分的附接点不限于一个原子(浮动取代基)，则该附接点可以是
该环的任意原子；而在稠环或螺环的情形中，该附接点是该稠环或螺环的任意环的任意原
子，但须遵守化学价态规则。若环、稠环或螺环含有一个或多个环杂原子且该环、稠环或螺
环显示具有一个或多个浮动取代基(包括，但不限于，附接至该分子剩余部分的附接点)，则
该浮动取代基可以键结至该杂原子。在具有该浮动取代基的结构或式找那个，若该环杂原
子显示为键结至一个或多个氢(如，环氮具有两个结合至环原子的键，且第三个键结合至
氢)，当该杂原子键结至该浮动取代基时，该取代基将被理解为替代该氢，但须遵守化学价
态规则。

[0826] 本文中，术语“杂原子”或“环杂原子”意为包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。

[0827] 实例提供于下，以促进更完全地理解本发明。下述实施例举例说明制作和实践本发明的例示性模式。但是，本发明的范畴并不限于这些实施例中揭露的具体具体实施例，由
于可使用其它替代方法来获得相似的结果，这些具体具体实施例仅用作例示性说明的目
的。

[0828] 一般定义

[0829] 除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语均具有与本发明所属领域(如，医药、细胞培养、分子遗传学和生物化学领域)技术人员所一般理解的相同的意义。

[0830] 本文中，数值或范围语境中的术语“约”意为所引用或主张的数值或范围的±10％，除非该语境需要更为受限的范围。

[0831] 在上述说明书和权利要求书中，短语如“的至少一种”或“的一种或多种”可出现在一连串元件或特征之后。术语“及/或”也可出现在两个或更多个元件或特征的列举中。除非
被其所应用的语境含蓄或明确地排除，否则这一短语试图意指所列举的元件或特征中的单
独一个或任一所引用元件或特征与任一其它所应用元件或特征的组合。例如，短语“A和B中
的至少一种”、“A和B中的一种或多种”、以及“A及/或B”各自试图意指“仅A、仅B、或A和B一起”。相似的解释也应用于包括三个或更多个项目的列举。例如，短语“A、B和C中的至少一
种”、“A、B和C中的一种或多种”、以及“A、B及/或C”各自试图意指“仅A、仅B、仅C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、或A和B和C一起”。此外，上文和权利要求书中术语“基于”的使用试图意指“至少部分地基于”，因此未引用的特征或元件也是允许的。

[0832] 应理解，若提供参数范围，则该范围内的所有整数及其小数点后一位也为本发明所提供。例如，“0.2至5mg”是对0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg等直至包括5.0mg的公开。

[0833] 小分子是质量小于2000道尔顿的化合物。小分子的分子质量优选小于1000道尔顿，更优选小于600道尔顿，如该化合物的分子质量小于500道尔顿、400道尔顿、300道尔顿、
200道尔顿或100道尔顿。

[0834] 本文中，“分离的”或“纯化的”化合物、核酸分子、多核苷酸、多肽或蛋白质，当通过重组技术生产时，是基本上不含其它培养材料或培养基的；当化学合成时，是基本上不含化学前体或其它化学品的。纯化的化合物至少含有，60重量％(干重)的该感兴趣的化合物。优
选该制剂含有至少75重量％、更优选至少90重量％、最优选99重量％的该该兴趣的化合物。
例如，纯化的化合物含有，以重量计，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或or 100％(w/w)的所希望的化合物。通过任何适宜的标准方法，例如，柱层析、薄层层析或高
效液相色谱(HPLC)分析来测量纯度。纯化的或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖
核酸(DNA))不含在其天然状态下位于其侧翼的基因或序列。纯化也定义了对于给药至人类
受试者为安全的无菌程度，如，缺少感染性或毒性剂。

[0835] 同样，“基本上纯的化合物”意为已经与其天然伴随组分分离的化合物。典型地，以重量计，当化合物的至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％不含该化合物天然关联的
蛋白质和天然出现的有机分子时，则该化合物是基本上纯的。

[0836] 连词“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包含或开放性的，且并不排除额外的未引用的元件或方法步骤。相比之下，连词“由...组成”排除未在该主张中具体指出的任何元件、步骤或成分。连词“主要由...组成”将所主张的范畴限制为具体的材料或步
骤，以及“那些不在材料上影响本发明主张的基本特征和新颖特征的材料或步骤”。

[0837] 典型地且依据情境，本文中使用的术语“受试者”、“患者”、“个体”等一般可互换。换言之，描述为“患者”的个体并不必罹患给定的疾病，而可以是仅仅寻求医疗建议。

[0838] 本文中，术语“受试者”包括任何动物，包括脊椎动物如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。因此，本文中揭露方法的受试者可以是人类、非人类灵长动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。一些具体实施例中，该受试者是哺乳动物。某些具体实施例中，该受试者是人类。

[0839] 本文中，除非预警中明确排除，否则单数形式“一”和“该”包括复数个对象。因此，例如，对“疾病”、“疾病状态”或“核酸”的描述是参考一个或多个此类具体实施例的，且包括该领域技术人员所知的等效物等等。

[0840] 本文中，“治疗”涵盖如对病变进展状态的抑制、逆转。治疗也涵盖对该病变的任何一种或多种症候的阻止或改善。本文中，对受试者疾病进程或并发症的“抑制”意为，阻止或
减轻该受试者的疾病进展及/或并发症。

[0841] 本文中，与病变相关的“症候”包括与该病变相关的任何临床表现和实验室表现，且并不限于该受试者可感觉到或观察到的表现。

[0842] 本文中，当称治疗化合物或成像化合物的量是“有效的”，则指的是，当以本公开的模式使用时，该化合物的数量足以得到所希望的结果(如，治疗结局或成像信号强度)而没
有过度的副作用(如毒性、刺激或过敏反应)，同时具有合理的效益/风险比。

[0843] 本文中，“药学可接受的”载剂或赋形剂指的是，适用于人类及/或动物的没有过度的副作用(如毒性、刺激和过敏反应)同时具有合理的效益/风险比的载剂或赋形剂。它可以
是，例如，药学可接受的溶剂、悬浮剂或媒介物，用于将即时化合物输送至该受试者。

[0844] 本发明的多个具体实施例涉及pHLIP-荧光团化合物，该pHLIP-荧光团化合物包含附接至“所运载的化合物”如“荧光团”的pHLIP。依据情境，所运载的化合物也可以该未偶联形式的该化合物的名称和特征称呼，而不管所运载的化合物是否偶联至pHLIP肽。例如，本
文中，当以未偶联的形式存在时被称为“荧光团X”的荧光团键结至pHLIP肽时，该荧光团也
可以称为“荧光团X”。

[0845] 实施例和具体实施例提供于下，以促进更完全地理解本发明。下述实施例和具体实施例举例说明制作和实践本发明的例示性模式。但是，本发明的范畴并不限于所公开的
实施例和具体实施例，由于可使用其它替代方法来获得相似的结果，这些实施例和具体实
施例仅用作例示性说明的目的。

[0846] 具体实施例

[0847] 具体实施例包括下列具体实施例P1至P35。

[0848] 具体实施例P1.一种化合物，包含：

[0849] (a)pH触发的多肽，包含序列LFPTXTLL(SEQ ID NO:1)中的氨基酸，其中，X是可质子化的氨基酸，且该pH触发的多肽在pH 5.0时对于膜脂质双层的亲和性高于在pH 8.0时的
亲和性；以及

[0850] (b)吲哚菁绿(ICG)，

[0851] 其中，所述ICG共价附接至从该pH触发的多肽的N端计数的第一个或第二个氨基酸。

[0852] 具体实施例P2.具体实施例P1的化合物，其中，所述pH触发的多肽包含序列ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:2)中的氨基酸，其中，所述ICG共价附接至其N
端的丙氨酸。

[0853] 具体实施例P3.具体实施例P2的化合物，包含下述结构：

[0854]

[0855] 具体实施例P4.具体实施例P1的化合物，其中，所述pH触发的多肽包含序列AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:3)中的氨基酸，其中，所述ICG共价附接至其
赖氨酸。

[0856] 具体实施例P5.具体实施例P4的化合物，包含下述结构：

[0857]

[0858] 具体实施例P6.具体实施例P1的化合物，其中，所述pH触发的多肽包含序列ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)中的氨基酸，其中，所述ICG共价附接至其
半胱氨酸。

[0859] 具体实施例P7.具体实施例P6的化合物，包含下述结构：

[0860]

[0861] 具体实施例P8.具体实施例P1的化合物，其中，所述pH触发的多肽包含可质子化的人工氨基酸。

[0862] 具体实施例P9.具体实施例P8的化合物，其中，该可质子化的人工氨基酸包含至少1、2、3、4或5个羧基。

[0863] 具体实施例P10.具体实施例P1、P8或P9的化合物，其中，该可质子化的氨基酸包含天冬氨酸或γ-羧基谷氨酸。

[0864] 具体实施例P11.具体实施例P1至P10中任一项的化合物，其中，所述pH触发的多肽包含序列LLFPTDTLLL(SEQ ID NO:25)中的氨基酸。

[0865] 具体实施例P12.具体实施例P11的化合物，其中，所述pH触发的多肽包含序列LDLLFPTDTLLLD(SEQ ID NO:26)中的氨基酸。

[0866] 具体实施例P13.具体实施例P12的化合物，其中，所述pH触发的多肽包含序列AYLDLLFPTDTLLLDLL(SEQ ID NO:27)中的氨基酸。

[0867] 具体实施例P14.具体实施例P13的化合物，其中，所述pH触发的多肽包含序列DDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:28)中的氨基酸。

[0868] 具体实施例P15.具体实施例P14的化合物，其中，所述pH触发的多肽包含下列序列中的氨基酸：

[0869] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:2)、

[0870] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:3)、

[0871] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)、

[0872] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:5)、

[0873] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCA(SEQ ID NO:6)、

[0874] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKA(SEQ ID NO:7)、

[0875] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:8)、

[0876] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:9)、

[0877] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:10)、

[0878] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKG(SEQ ID NO:11)、

[0879] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKG(SEQ ID NO:12)、

[0880] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:13)、或

[0881] ACKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:14)。

[0882] 具体实施例P16.具体实施例P1或P8至P11中任一项的化合物，其中，所述pH触发的多肽的氨基酸序列与作为SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:24所陈述的各氨基酸序列的一致性
低于100％、99％或95％。

[0883] 具体实施例P17.具体实施例P1至P16中任一项的化合物，其中，所述pH触发的多肽包含20至30个氨基酸。

[0884] 具体实施例P18.一种组合物，其包含具体实施例P1至P17中任一项所述的化合物和药学可接受的载剂。

[0885] 具体实施例P19.具体实施例18的组合物，进一步包含D-葡萄糖。

[0886] 具体实施例P20.具体实施例P18或P19的组合物，其中，所述组合物包含漱口水。

[0887] 具体实施例P21.一种检测身体器官或组织内的癌症组织或癌前组织的方法，包含：

[0888] (a)令该身体器官或组织与具体实施例P1至P17中任一项的化合物接触；

[0889] (b)令所述化合物与包含ICG激发波长的电磁辐射接触；以及

[0890] (c)检测从所述化合物发射的电磁辐射，其中，检测到所述辐射指示所述癌组合或所述癌前组织的存在。

[0891] 具体实施例P22.具体实施例P21的方法，其中，从癌前组织或癌症组织发射的辐射的水平比从正常非癌组织发射的辐射水平高至少20％。

[0892] 具体实施例P23.具体实施例P21或P22的方法，其中，所述身体器官包含肾脏或膀胱。

[0893] 具体实施例P24.具体实施例P21至P23中任一项的方法，进一步包含经外科手术移除所述癌组织或所述癌前组织。

[0894] 具体实施例P25.具体实施例P21的方法，其中，所述组织已经从受试者获得、移除或提供。

[0895] 具体实施例P26.具体实施例P21或P25的方法，其中，所述组织包含组织活检样品。

[0896] 具体实施例P27.具体实施例P21至P24的方法，其中，所述身体器官或组织存在于受试者体内。

[0897] 具体实施例P28.具体实施例P21至P24中任一项的方法，其中，令该身体器官或组织与具体实施例P1至P17中任一项的化合物接触包含将该化合物给药至受试者。

[0898] 具体实施例P29.具体实施例P28的方法，其中，经由血管内滴注、静脉注射、腹腔内注射、外用给药、黏膜给药、或口服给药将该化合物给药至该受试者。

[0899] 具体实施例P30.具体实施例P28或P29的方法，其中，所述化合物通过将包含所述化合物的液体、粉末或喷雾施加至所述受试者体表而给药。

[0900] 具体实施例P31.具体实施例P30的方法，其中，所述体表包含经由外科手术确定的所述受试者的体内部位。

[0901] 具体实施例P32.具体实施例P28或P29的方法，其中，将所述化合物给药至所述受试者的口腔。

[0902] 具体实施例P33.具体实施例P21至P32中任一项的方法，其中，在体内检测从所述化合物发射的电磁辐射。

[0903] 具体实施例P34.具体实施例P21至P32中任一项的方法，其中，间接体内检测从所述化合物发射的电磁辐射。

[0904] 具体实施例P35.一种从身体器官或组织移除癌症组织或癌前组织的方法，包含经外科手术移除根据具体实施例P21至P24或P27至P34中任一项的方法检测的癌症细胞或癌
前细胞。

[0905] 进一步的具体实施例包括下列具体实施例1至55。

[0906] 具体实施例1.一种pHLIP-荧光团化合物，包含

[0907] (a)pH触发的多肽(pHLIP肽)；以及

[0908] (b)荧光团，其中，该荧光团是近红外(NIR)荧光团、花青荧光团、或光声造影剂。

[0909] 具体实施例2.具体实施例1的化合物，具有下述结构：

[0910]

[0911] 具体实施例3.具体实施例1或2的化合物，其中，该pHLIP肽包含序列LFPTXTLL(SEQ ID NO:1)中的氨基酸，其中，X是可质子化的氨基酸，且该荧光团包含NIR荧光团。

[0912] 具体实施例4.具体实施例1至3中任一项的化合物，其中，X是D。

[0913] 具体实施例5.具体实施例1至4中任一项的化合物，其中，该荧光团包含吲哚菁绿(ICG)。

[0914] 具体实施例6.具体实施例1至5中任一项的化合物，其中，该pHLIP肽包含下述序列：XnYm；YmXn；XnYmXj；YmXnYi；YmXnYiXj；XnYmXjYi；YmXnYiXjYl；XnYmXjYiXl；YmXnYiXjYlXh；
XnYmXjYiXhYg；YmXnYiXjYlXhYg；XnYmXjYiXhYgXf；(XY)n；(YX)n；(XY)nYm；(YX)nYm；(XY)nXm；(YX)nXm；
Ym(XY)n；Ym(YX)n；Xn(XY)m；Xn(YX)m；(XY)nYm(XY)i；(YX)nYm(YX)i；(XY)nXm(XY)i；(YX)nXm(YX)i；
Ym(XY)n；Ym(YX)n；Xn(XY)m；Xn(YX)m，其中，

[0915] i)Y是溶剂化能的非极性氨基酸，或Gly；

[0916] ii)X是可质子化的氨基酸，以及

[0917] iii)n、m、I、j、l、h、g、f是1至8的整数。

[0918] 具体实施例7.具体实施例1至6中任一项的化合物，其中，该pHLIP肽在pH约为7.5或7.75的水中具有净负电荷。

[0919] 具体实施例8.具体实施例1至7中任一项的化合物，其中，该pHLIP肽的酸解离常数对数(pKa)小于约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7。

[0920] 具体实施例9.具体实施例1至8中任一项的化合物，其中，该pHLIP肽包含至少一个可质子化的人工氨基酸。

[0921] 具体实施例10.具体实施例1至9中任一项的化合物，其中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30、31、32、33、34、35、36、或40个遗传编码的氨基酸。

[0922] 具体实施例11.具体实施例3至10中任一项的化合物，其中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30、31、32、33、34、35、36、或40个非遗传编码的氨基酸。

[0923] 具体实施例12.具体实施例1或3至11中任一项的化合物，其中，该pHLIP肽包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、或40个D-氨基酸。

[0924] 具体实施例13.具体实施例1至12中任一项的化合物，其中，该pHLIP肽包含至少8个氨基酸，该pHLIP肽的该8个氨基酸中至少2、3或4个是非极性的，且该pHLIP肽的该8个氨
基酸中至少1、2、3或4个是可质子化的。

[0925] 具体实施例14.具体实施例1、3、4、或6至13中任一项的化合物，其中，该荧光团是花青荧光团。

[0926] 具体实施例15.具体实施例1至14中任一项的化合物，其中，该荧光团是NIR荧光团。

[0927] 具体实施例16.具体实施例1至15中任一项的化合物，其中，该荧光团包含光声造影剂。

[0928] 具体实施例17.具体实施例1至16中任一项的化合物，包含

[0929] (a)包含序列LFPTXTLL(SEQ ID NO:1)中的氨基酸的pHLIP肽，其中，X是可质子化的氨基酸，且该pHLIP肽在pH 5.0时对于膜脂质双层的亲和性高于在pH 8.0时的亲和性；以
及(b)吲哚菁绿(ICG)，

[0930] 其中，所述ICG共价附接至从该pHLIP肽的N端计数的第一个或第二股氨基酸。

[0931] 具体实施例18.具体实施例17的化合物，其中，X是D。

[0932] 具体实施例19.具体实施例17或18的化合物，其中，所述pHLIP肽包含ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)或ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ
ID NO:9)中的氨基酸，且所述ICG共价附接至其半胱氨酸。

[0933] 具体实施例20.具体实施例19的化合物，包含下述结构：

[0934]

[0935]

[0936] 具体实施例21.具体实施例17或18的化合物，其中，所述pHLIP肽包含序列ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:5)或ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID
NO:2)中的氨基酸，且所述ICG共价附接至其N端丙氨酸。

[0937] 具体实施例22.具体实施例21的化合物，包含下述结构：

[0938]

[0939]

[0940] 具体实施例23.具体实施例17或18的化合物，其中，所述pHLIP肽包含序列AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:8)或AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ
ID NO:3)中的氨基酸，且所述ICG共价附接至其赖氨酸。

[0941] 具体实施例24.具体实施例23的化合物，包含下述结构：

[0942]

[0943]

[0944] 具体实施例25.具体实施例17或18的化合物，其中，所述pHLIP肽包含序列ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)中的氨基酸，且所述ICG共价附接至其半胱
氨酸。

[0945] 具体实施例26.具体实施例25的化合物，包含下述结构：

[0946]

[0947] 具体实施例27.具体实施例17或18的化合物，其中，所述pHLIP肽包含可质子化的人工氨基酸。

[0948] 具体实施例28.具体实施例27的化合物，其中，该可质子化的人工氨基酸包含至少1、2、3、4或5个羧基。

[0949] 具体实施例29.具体实施例17的化合物，其中，该可质子化的氨基酸包含天冬氨酸或γ-羧基谷氨酸。

[0950] 具体实施例30.具体实施例17至29中任一项的化合物，其中，所述pHLIP包含序列LLFPTDTLLL(SEQ ID NO:25)中的氨基酸。

[0951] 具体实施例31.具体实施例30的化合物，其中，所述pHLIP肽包含序列LDLLFPTDTLLLD(SEQ ID NO:26)中的氨基酸。

[0952] 具体实施例32.具体实施例31的化合物，其中，所述pHLIP肽包含序列AYLDLLFPTDTLLLDLL(SEQ ID NO:27)中的氨基酸。

[0953] 具体实施例33.具体实施例32的化合物，其中，所述pHLIP肽包含序列DDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:28)中的氨基酸。

[0954] 具体实施例34.具体实施例33的化合物，其中，所述pHLIP肽包含下列序列中的氨基酸：

[0955] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)、

[0956] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:2)、

[0957] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:3)、

[0958] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:5)、

[0959] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCA(SEQ ID NO:6)、

[0960] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKA(SEQ ID NO:7)、

[0961] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:8)、

[0962] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:9)、

[0963] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:10)、

[0964] ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKG(SEQ ID NO:11)、

[0965] ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWKG(SEQ ID NO:12)、

[0966] AKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:13)、或

[0967] ACKDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWG(SEQ ID NO:14)。

[0968] 具体实施例35.具体实施例17至34中任一项的化合物，其中，所述pHLIP肽的氨基酸序列与作为SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:24所陈述的各氨基酸序列的一致性低于100％、
99％或95％。

[0969] 具体实施例36.具体实施例17至35中任一项的化合物，其中，所述pHLIP肽包含20至30个氨基酸。

[0970] 具体实施例37.一种组合物，其包含具体实施例1至36中任一项所述的化合物和药学可接受的载剂。

[0971] 具体实施例38.具体实施例37的组合物，进一步包含D-葡萄糖。

[0972] 具体实施例39.具体实施例37或38的组合物，其中，所述组合物包含漱口水。

[0973] 具体实施例40.一种检测受试者体内患病或受损组织的方法，包含

[0974] (a)将具体实施例1至36中任一项的化合物给药至该受试者；

[0975] (b)令该受试者与包含该荧光团激发波长的电磁辐射接触；以及

[0976] (c)检测从该化合物发射的电磁辐射，其中，检测到该辐射指示患病组织的存在。

[0977] 具体实施例41.具体实施例40的方法，其中，该患病或受损组织是癌组织、癌前组织、发炎的组织、局部缺血的组织、关节炎患者的组织、囊性纤维化的组织、被微生物感染的
组织、或动脉粥样硬化患者的的组织。

[0978] 具体实施例42.具体实施例41或42的方法，其中，该患病组织是癌组织，且该癌组织位于该受试者的膀胱、上呼吸道、肾脏、前列腺、乳腺、头、颈、口腔、胰腺、肺、肝脏、子宫颈、卵巢、或脑内。

[0979] 具体实施例43.具体实施例40至42中任一项的方法，其中，从癌前组织或癌症组织发射的辐射的水平比从正常非癌组织发射的辐射水平高至少20％。

[0980] 具体实施例44.具体实施例40至43中任一项的方法，其中，所述身体器官包含肾脏或膀胱。

[0981] 具体实施例45.一种检测受试者体内体液移动的方法，包含

[0982] (a)将具体实施例1至36中任一项的化合物给药至该受试者；

[0983] (b)令该受试者与包含该荧光团激发波长的电磁辐射接触；以及

[0984] (c)检测从该化合物发射的电磁辐射，其中，检测到该辐射指示体液的存在。

[0985] 具体实施例46.具体实施例45的方法，其中，该体液包含血液。

[0986] 具体实施例47.具体实施例46的方法，其中，该血液在循环中，或位于体腔内、血管腔内、毛细血管腔内、静脉腔内、动脉腔内、或实体肿瘤内。

[0987] 具体实施例48.具体实施例45的方法，其中，该体液包含淋巴。

[0988] 具体实施例49.具体实施例40至48中任一项的方法，其中，该化合物通过血管滴注、静脉给药、腹腔给药、外用给药、黏膜给药、口服给药、动脉给药、脑内给药、脑室内给药、鞘内给药、心内给药、海绵窦内给药、骨内给药、眼内给药、玻璃体内给药、肌肉给药、皮内给药、透皮给药、跨黏膜给药、病灶内给药、皮下给药、皮试给药、羊膜外给药、阴道内给药、膀胱内给药、或鼻内给药而给药至该受试者。

[0989] 具体实施例50.具体实施例40至49的方法，其中，所述化合物通过将包含所述化合物的液体、粉末或喷雾施加至所述受试者体表而给药。

[0990] 具体实施例51.具体实施例50的方法，其中，所述体表包含经由外科手术确定的所述受试者的体内部位。

[0991] 具体实施例52.具体实施例40至51中任一项的方法，其中，在体内检测从所述化合物发射的电磁辐射。

[0992] 具体实施例53.具体实施例40至51中任一项的方法，其中，在体内检测从所述化合物发射的电磁辐射。

[0993] 具体实施例54.具体实施例40至53中任一项的方法，进一步包含经外科手术移除癌细胞或癌前细胞或通过步骤(c)鉴定的组织。

[0994] 具体实施例55.具体实施例40至54中任一项的化合物，其中，该方法包含荧光血管造影术。

[0995] 具体实施例56.具体实施例40至55中任一项的方法，其在眼科过程、心胸外科手术、冠状动脉架桥术、神经外科、肝胆外科手术、修复外科手术、胆囊切除手术、结直肠切除
手术、脑外科手术、肌肉灌流、外伤或创伤外科手术、或腹腔镜手术过程中实施。

[0996] 具体实施例57.一种用于间接体外检测生物学样品中荧光团的方法，

[0997] (a)令来自受试者的生物学样品与具体实施例1至36中任一项的化合物接触；

[0998] (b)令该生物学样品与包含该荧光团激发波长的电磁辐射接触；以及

[0999] (c)检测从该荧光团发射的电磁辐射。

[1000] 具体实施例58.具体实施例57的方法，其中，该生物学样品包含组织活检标本、液体活检标本、经外科手术移除的组织、经外科手术移除的液体、或血液。

[1001] 实施例

[1002] 实施例1：通过ICG-PHLIP肽(ICG-VAR3)进行的人类膀胱中尿路上皮癌的间接体内靶向成像

[1003] 膀胱癌是发病率第五高的癌症，且是治疗费用最贵的癌症之一。早期检测极大地改善了生存和膀胱保留的机会。

[1004] 本报导是首次使用ICG-Var3偶联物以间接体内方式对新鲜的人类根治性膀胱切除术样品中的尿路上皮癌和癌前病灶进行诊断的研究，并指出了朝向宽范围诊断和治疗性
候选的路径。

[1005] 以近红外荧光染料ICG标记的pHLIP肽被用来监控对于人类膀胱中肿瘤的靶向性。ICG-Var3的吸收光谱显示在图1A中。在POPC脂质体的存在下，ICG-Var3的荧光增加了约25
倍(图1B)。因此，将ICG-Var3结合至癌细胞膜的脂质双层显着提升了ICG的发射。

[1006] 22位根治性膀胱切除术患者进行了该研究。患者年龄范围从51岁至84岁(平均年龄67.7岁)，且性别比例：M/F为19/3。表8含有患者人口统计信息、术前诊断、疾病的临床分
期和成像研究的结果。使用ICG-Var3培养这些标本后，该标本未显示任何负面的形态学发
现，且没有证据表明对于非肿瘤组织的损害或退行性效果。使用ICG-Var3没有改变对这些
根治性膀胱切除术组织的病理学评价。总体而言，通过对以ICG-Var3染色的22个膀胱标本
的病理学评价，鉴定了29个恶性病灶(以ICG-Cys对3个根治性膀胱切除术案例进行间接体
内培养而作为阴性对照)。29个病灶中不同的病理占比如下(图2A至2L)：12例高几倍肌肉浸
润性尿路上皮癌(HGI)；5例高级别非肌肉浸润性尿路上皮癌(HGN)；11例原位癌(CIS)；和1
例高级别异型增生。病理学家通过近红外荧光成像引导而确定为CIS而通过白光检查没有
观察到的有7例。在案例#2中，憩室内的坏死组织是近红外荧光阳性的。对于阴性对照案例
(案例#13、19和20)，仅单独使用ICG-Cys染料进行滴注(浓度从8至40μM，体积为80ml)，且没
有观察到特异性的肿瘤靶向。

[1007] 表格形式的灵敏度/特异性测试结果显示在表9至表10中。对癌vs正常组织实施该测试，排除对于坏死组织和先前治疗的组织(表9A和表9B)。发现对于癌组织vs正常组织的
靶向性的灵敏度和特异性分别为97％和100％。如果将ICG-Var3对于来自先前经尿路切除
膀胱肿瘤后的坏死组织和先前治疗(化疗)的坏死组织的靶向性认定为假阳性，则该特异性
从100％降至80％(表10a和表10b)。

[1008] ICG-Var3以高灵敏度和特异性区分癌细胞与正常细胞

[1009] 使用ICG- 构造而以外科手术移除后立即取得的人类膀胱标本中的尿路上皮癌为靶点。ICG是FDA批准的近红外荧光染料，并不显示任何独立的像在肾细胞癌中所见那
样以赘生组织为靶向的倾向，ICG主要通过赘生组织与正常组织间的灌注和扩散差异(洗
脱)显示靶向性。临床上，ICG用于将脉管系统或淋巴管可视化(Tobis et al.(2012)J
Endourol 26(7):797-802；Alander et al.(2012)Int J Biomed Imaging 2012:940585；
Desmettre et al.(2000)Surv Ophthalmol 45(1):15-27)。ICG在水性溶液中具有低水平
的荧光，而当ICG结合至蛋白质(如，白蛋白)或细胞膜的疏水袋时，其发射增加。该pHLIP肽
的靶向性基于低pH触发的插入爱细胞膜的脂质双层内。因此，该pHLIP将ICG拴系在该膜上，
将ICG荧光提升了约25倍。

[1010] 为了避免/最小化该ICG-Var3肽对于正常细胞的靶向性，将该构造滴注在以10mM的D-葡萄糖补充的pH 7.4PBS中以促进癌细胞对该ICG- 肽的摄取。糖分解的癌细胞表
现出高的葡萄糖摄取，这在体外和体内增加了细胞外空间的酸化(Kozin et al.(2001)
Cancer Res 61(12):4740-4743)。因此，我们的目标是选择性地促进癌细胞表面酸性的增
加，以提升pHLIP肽的插入和靶向性，同时不影响具有正常新陈代谢的正常细胞。

[1011] 使用不同子类型的尿路上皮癌的混合物，假定该疾病已经进展到不得不移除膀胱的点。这些案例包括典型的高级别尿路上皮癌，而且具有不同的伴有显着鳞状细胞分化、微
 乳头型尿路上皮癌、腺癌和浆细胞样形态的变种。发现，ICG- 肽的肿瘤靶向性的灵敏
度(97％)和特异性(100％)与肿瘤的子类型无关。所检查的该膀胱切除术标本中，半数标本
展现了坏死和先前治疗效果的证据，全部标本均展现了邻近该坏死或与该坏死相关的残留
肿瘤(浸润性的或原位的)，这些残留肿瘤被ICG- 肽作为靶点，而这种靶向性可能是坏
死区域对ICG的截留或摄取的结果。先前在动物肿瘤模型中进行的研究并未显示pHLIP肽对
于坏死组织的靶向性(Adochite et al.(2014)Mol Pharm 11(8):2896-2905)。如果将对于
坏死组织和先前治疗的组织的靶向性视为假阳性，则特异性降低至80％，但对于未扰动的
病灶未见假阳性。

[1012] 后续的病理分析表明，在异型增生的存在下，一个病灶给出近红外荧光成像的阳性信号。尿路上皮异型增生是一种偶然的显微发现，其中尿路上皮细胞显示不足以诊断为
原位癌的轻度非典型特征。这被视为癌前过程，且已有研究显示，高达19％的尿路上皮异型
增生案例发展为尿路上皮癌(Althausen et al.(1976)J Urol 116(5):575-580；Smith et
al.(1983)Br J Urol 55(6):665-669；Zuk et al.(1988)J Clin Pathol 41(12):1277-
1280)。尽管是癌前，但仍推荐具有异型增生的患者接受适宜的临床随访，以便对即将来临
的癌进行早期检测。异型增生在临床上仍是无法检测的，因此，该ICG- 肽可能是用于检
测尿路上皮中高级别异型增生的有用标记物，可用于癌前病灶的早期检测。

[1013] 证实膀胱组织发炎并感染。长期发炎和重度感染可造成黏膜样囊性膀胱炎和腺性膀胱炎的转化，而黏膜样囊性膀胱炎和腺性膀胱炎由于很常见而被认为是尿路上皮中的正
常发现。一个案例中，具备对ICG- 肽的明显摄取的区域显示伴有慢性炎症的囊性及腺
性膀胱炎，而无任何关于异型增生或恶性肿瘤的证据。值得注意的是，几乎所有22个膀胱切
除术标本均在该标本某处表现出某种程度的囊性及腺性膀胱炎。仅两个标本表现出囊性膀
胱炎而无任何其它病理：一个病灶(案例#9)显示ICG- 肽的阳性信号。当ICG-Var3肽的
滴注浓度降低至4μM时，第二个案例(案例#18)中的囊性膀胱炎不被染色。降低ICG- 肽
的浓度并不影响对于高级别浸润性癌和CIS的靶向性(案例#17)。优化该ICG-Var3滴注的浓
度并缩短该滴注时间，在发炎组织、坏死组织和癌组织之间产生清晰的信号差别。

[1014] 对于无论何种子类型的尿路上皮癌的早期检测，该ICG-Var3肽都是具有高灵敏度和特异性的有用工具。多个具体实施例中，该检测用于监控疾病状态及/或标记用于外科手
术移除的病灶。一些具体实施例中，该ICG-Var3成像剂改善对膀胱内癌病灶的诊断和切除。
某些具体实施例中，膀胱癌的复发率降低、患者结局改善、且医护费用减少。多个具体实施
例中，靶向成像的成功促进pHLIP将治疗分子输送至膀胱肿瘤细胞，使得对于膀胱癌的靶向
治疗(如，化疗剂的特异性输送)成为可能。

[1015] 不受缚于任何理论，由于ICG-Var3构造以肿瘤微环境的通用性质——肿瘤酸性——为靶点，因此是可通用的成像剂。在包括淋巴瘤、黑素瘤、胰腺肿瘤、乳腺肿瘤和前列
腺肿瘤在内的超过15种人类、鼠和大鼠肿瘤转基因鼠模型和人类组织(间接体内染色的膀
胱、肾、上泌尿道、乳腺、肝、口腔和头/颈)中，已经显示了荧光pHLIP对于原发肿瘤和转移病灶的靶向性。

[1016] 表8.人口统计信息、病理分期和诊断，通过白光和荧光成像所见的病灶

[1017]

[1018] *80mL的40μM该构造进行滴注

[1019] **80mL的4μM该构造进行滴注

[1020] 表9A.ICG-Var3肽对于人类膀胱标本中癌病灶的靶向性的灵敏度/特异性测试的结果表癌vs不包括坏死组织的正常组织和治疗效果

[1021]

[1022] TP是真阳性；TN是真阴性；FP是假阳性；FN是假阴性

[1023] 表9B.描述参数

[1024]

[1025] 表10A.ICG-Var3肽对于人类膀胱标本中癌病灶的靶向性的灵敏度/特异性测试的结果表癌vs包括坏死组织的正常组织和治疗效果

[1026]

[1027] TP是真阳性；TN是真阴性；FP是假阳性；FN是假阴性

[1028] 表10B.描述参数

[1029]

[1030]

[1031] 材料和方法

[1032] ICG与该pHLIP肽的偶联

[1033] 合成在 N 端具有单个 C y s 残基的 p H L I P变体 3 (V a r 3) 肽，ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:4)，并通过CS生物科学公司(CS Bio,Inc
(Menlo Park,California,USA))的反相色谱纯化。在DMF(二甲基甲酰胺)中，以1:1的比将
近红外染料吲哚菁绿(ICG)马来酰亚胺(Intrace Medical,Lausanne,Switzerland)偶联至
肽。通过反相(Zorbax SB-C18柱，9.4×250mm 5μm，安捷伦公司(Agilent
Technology))效液相色谱(HPLC)，使用乙腈在含0.05％三氟乙酸的水的5％至70％梯度，监
控反应进展。而且，对于阴性对照，将ICG-马来酰亚胺与游离氨基酸——赖氨酸(西格玛公
司(Sigma))偶联。通过ICG在800nm的吸收测定缓冲液中被标记的肽的浓度，ε800＝137,
000M-1cm-1。通过分析型HPLC和SELDI-TOF质谱测得该构造的纯度，该溶液中游离染料的量
低于1％。

[1034] 脂质体制备

[1035] 通过挤出制备大单层囊泡。将2.5mg POPC(阿温蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids,Inc.；Alabaster,Alabama))脂质溶解在0.5ml氯仿中，在旋转蒸发仪上去溶剂化，
并在高真空下干燥3小时。随后将该磷脂质膜在含有10mM D-葡萄糖的pH 7.4PBS中再水合，
涡旋5分钟，通过具有100nm孔径的膜重复挤出至少15次。

[1036] 吸收和荧光测量

[1037] 分别在Genesys 10S UV-Vis分光光度计(赛默科技公司(Thermo Scientific))和SpectraMax M2分光荧光计(分子装置公司(Molecular Devices))上进行吸收和荧光测量。
吸收光谱在含有10mM D-葡萄糖的PBS pH 7.4中从600nm至850nm测量。10μM的ICG-Var3肽
的荧光光谱在具有或不具有2mM POPC的含有10mM D-葡萄糖的PBS pH 7.4中从810至850nm
测量，激发波长790nm。

[1038] 膀胱标本的间接体内成像

[1039] 在12个月的期间内，选择22位计划进行根治性膀胱切除术的尿路上皮癌患者。根治性膀胱切除术后，立即移除膀胱标本并经由导尿管使用非缓冲盐水漫灌3次5分钟，以
80ml的8μM的ICG-Var3或32.8μg/ml(除非明确排除，见表8注释)的ICG-Var3构造或处于含
有10mM D-葡萄糖的PBS pH 7.4中的ICG-Cys滴注并培养60分钟。随后，以80ml的盐水溶液
冲洗3至5次以移除未结合的构造，使用缓冲盐水彻底漫灌该膀胱，并使用前臂上的Y切口打
开膀胱。使用达文西近红外荧光成像系统(FireflyR)，实施对该完整膀胱及其附件的间接
体内荧光成像和白光成像。标记荧光点，进行标准病理学分析以探索荧光成像的表现与癌
症病灶之间的关联。

[1040] 病理学分析

[1041] 根据标准机构病理学总计手册，将标本切片，在10％磷酸盐缓冲福尔马林中固定24小时后提交，重点在于该膀胱的标记区域。将切片加工为用于常规组织学的石蜡包埋块。
获得5微米厚的组织切片，并使用苏木精和曙红(H&E)染色。由泌尿生殖器(GU)病理学家实
施病理学评估，并基于美国癌症联合委员会(AJCC)癌症分期手册(第七版)(American
Joint Committee on Cancer(AJCC)Cancer Staging Manual,7th edition,2010)制作标准
报告。

[1042] 统计学分析

[1043] 根据下述等式计算统计学参数：

[1044]

[1045]

[1046]

[1047]

[1048] 其中，TP是真阳性；TN是真阴性；FP是假阳性；FN是假阴性；TRP是真阳性率或灵敏度；SPC是真阴性率或特异性；PPV是阳性预测值或精确度；NPV是阴性预测值；FPR是假阳性
率；FNR是假阴性率；FDR是错误发现率；FOR是错误遗漏率。

[1049] 实施例2：癌病灶的可视化和检测

[1050] 通过荧光成像剂或光声成像剂的全身给药对人体内爱病灶进行可视化和检测非常重要，且可用来引导肿瘤的切除以及具有转移癌细胞的淋巴及的检测/切除。下述研究的
主要目标是，探究在小鼠模型内静脉或腹膜给药荧光性ICG-Var3构造和IR800-Var3构造之
后，该些构造以多种肿瘤为靶点的能力。

[1051] Var3肽(ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA；SEQ ID NO:4)购自CS Bio Co.。通过使用Zorbax SB-C18和Zorbax SB-C8,4.6×250mm 5μm柱(Agilent Technology)的反相高效
液相色谱(RP-HPLC)表征肽。通过在280nm的吸收计算肽浓度。将ICG(吲哚菁绿，Intrace
Medical)和 800CW(IR800,Li-Cor Biosciences)的马来酰亚胺衍生物偶联至位于
Var3肽N末端的单个Cys残基。该偶联反应在DMF(二甲基甲酰胺)中以约1:1的染料：肽比率
实施，并在室温下培养约8小时，随后在4℃培养，直至偶联完全。通过反相RT-HPLC监控该反
应进程和纯度，以确保最终溶液中不存在游离染料。产物冻干，并通过SELDI-TOF质谱仪表
-1
征。通过使用下述摩尔消光系数的吸收在甲醇中测定偶联物的浓度：ε778＝300,000M ·cm
-1(对于IR800-pHLIP)和ε800＝137,000M-1·cm-1(对于ICG-pHLIP)。

[1052] 在该研究中使用体重为20至25g的成年雌性裸鼠和雌性BALB/cAnNHsd鼠(Envigo)。将小鼠乳腺癌4T1细胞经皮下移植入成年雌性BALB/cAnNHsd鼠的右侧(8x 105细
5
胞/0.1mL/侧)。将大鼠膀胱癌AY27细胞经皮下移植入成年雌性裸鼠的右侧(8x 10 细胞/
0.1mL/侧)。当肿瘤直径达到大约5至6mm时，进行荧光-pHLIP在PBS溶液中的一次尾静脉注
射或一次腹膜注射。荧光构造的用量为100μL的40μM、或100μL的20μM、或100μL的10μM、或
100μL的5μM。在给药该构造后16小时，实施对小鼠的成像。恰在成像之前，令动物处于气体
麻醉之下，同时移除肿瘤部位的皮肤，并在成像后立即对小鼠实施安乐死。收获肿瘤、肾和
肝，成像，并作用组织病理学分析。使用Stryker临床成像仪器实施成像。通过对未注射荧光
构造的小鼠成像来建立自体荧光(与给药该构造后的信号相比，自体荧光信号的水平不显
着)。

[1053] 鼠科动物4T1异种移植物模型高度模仿人类乳腺癌IV期(Yang et al.(2004)Cell 117(7):927-939；Eckhardt et al.(2005)Mol Cancer Res 3(1):1-13；Tao et al.(2008)
BMC Cancer 8:228)。也已知，4T1乳腺肿瘤产生显着水平的乳酸盐并用作侵略性酸性肿瘤
的优良模型(Serganova et al.(2011)Cancer Res 17(19):6250-6261)。4T1是三阴性乳腺
肿瘤，难以作为靶点。ICG-Var3对4T1的靶向性优异(图11)。图12显示对于裸鼠体内的大鼠
膀胱肿瘤的靶向性。肿瘤(以及肾和肝)中的ICG-Var3的荧光信号显示为浓度依赖性的(图
13和图14)。重要的是注意到，肿瘤中的信号大于肾中的信号，而类似于或略小于肝中的信
号(图14)。ICG-Var3的静脉给药和腹膜给药均导致优异的肿瘤靶向性以及在给药构造后16
小时对肿瘤的可视化(图15)。比较在静脉给药ICG-Var3和IR800-Var3后通过NIR信号进行
的肿瘤可视化(图16)。尽管事实上两种荧光构造均高度精确地以肿瘤为靶点，但使用ICG-
Var3进行的肿瘤可视化比使用IR800-Var3进行的肿瘤可视化好得多。不受缚于任何理论，
使用ICG-Var3进行肿瘤可视化的更好，可能是由于ICG荧光在接近癌细胞膜表面处的扩增
(提升)及/或临床成像仪器的使用(如，使用Stryker内窥镜或多种其它临床仪器)，而这些
均得以更好地优化以便ICG染料而非IR800染料的激发和成像。对肿瘤摄取的定量提供在图
17中。肝和肾中的ICG-Var3的荧光信号也与IR800-Var3不同。

[1054] 多个具体实施例中，该荧光化合物允许对肿瘤块可视化，以清晰地构建用于在荧光引导下的外科手术应用过程中切除肿瘤的边界。

[1055] 图18显示从该小鼠体内移除的环绕有肌肉组织的两个不同的肿瘤块。所得图像表明，荧光信号可用于鉴定肿瘤边界，这得到标准苏木精和曙红(H&E)组织病理学分析的证
实。

[1056] 实施例3：通过ICG-Var3和IR800-pHLIP对小鼠体内的血液流动进行荧光成像

[1057] 荧光血管造影术(FA)广泛用于多种过程中以令血管可视化并监控血液流动。ICG用于FA中，但由于ICG的血液清除快(半衰期仅为几分钟)，可用的成像窗口限定在给药ICG
后的几分钟内。在一些临床过程中，单次过程中ICG的注射次数高达10次。对于通过使用更
长循环的成像剂来延长成像窗口存在明显需求。早前的数据清楚地表明，pHLIP的血液中循
环时间比类似大小的肽更长(Reshetnyak et al.(2011)Mol Imaging Biol 13(6):1146-
1156；Daumar et al.(2012)Bioconjug Chem 23(8):1557-1566；Macholl et al.(2012)
Mol Imaging Biol 14(6):725-734；Adochite et al.(2014)Mol Pharm 11(8):2896-
2905；Cruz-Monserrate et al.(2014)Sci Rep 4:4410；Viola-Villegas et al.(2014)
Proc Natl Acad Sci U S A 111(20):7254-7259；Adochite et al.(2016)Mol Imaging
Biol 18(5):686-696；Demoin et al.(2016)Bioconjug Chem 27(9):2014-2023)。因此，探
索使用偶联至pHLIP肽的近红外ICG和IR800对小鼠体内血液成像的可能性，并与单独使用
ICG和IR800染料比较。

[1058] 所有的肽均购自CS Bio Co.。该研究中使用的肽列在表11中。通过使用Zorbax SB-C18和Zorbax SB-C8,4.6×250mm 5μm柱(Agilent Technology)的反相高效液相色谱
(RP-HPLC)表征肽。通过在280nm的吸收计算肽浓度。

[1059] 表11.在该研究中使用的pHLIP序列。

[1060]

[1061] 将ICG(吲哚菁绿，Intrace Medical)和 800CW(IR800,Li-Cor Biosciences)的马来酰亚胺衍生物偶联至游离Cys残基或在肽的N末端具有单个Cys残基的
pHLIP肽。该偶联反应在DMF(二甲基甲酰胺)中以约1:1的染料：肽比率实施，并在室温下培
养约8小时，随后在4℃培养，直至偶联完全。通过反相RT-HPLC监控该反应进程和纯度，以确
保最终溶液中不存在游离染料。产物冻干，并通过SELDI-TOF质谱仪表征。通过使用下述摩
尔消光系数的吸收在甲醇中测定偶联物的浓度：ε778＝300,000M-1·cm-1(对于IR800-
pHLIP)和ε800＝137,000M-1·cm-1(对于ICG-偶联物)。

[1062] 在该研究中使用体重为20g的成年雌性裸鼠(Envigo)。以100μL的PBS中的40μM溶液的量一次性尾静脉注射给药荧光构造。在将构造给药后5、30、60、90和120分钟，实施对小
鼠耳和腿的成像。在将构造给药后5、30、60、90和120分钟，令动物处于气体麻醉下，同时从
尾部抽取5μL血液(与5μL抗凝血溶液混合以保持血液)。在最后一个成像点(120分钟)之后
连接将小鼠安乐死。将从所有动物采集的血液沉积在载玻片上，干燥并成像。使用Novadaq
临床成像仪器实施成像。通过对未注射荧光构造的小鼠成像来建立自体荧光(与给药该构
造后的信号相比，自体荧光信号的水平不显着)。

[1063] 在将构造给药后不同的时间点获得的动物耳和腿的NIR荧光图像显示在图20至图37中。所有图像均辨识为具有经调节的对比度/亮度比，以最佳地呈现对血管的成像。第一
组图像是使用与pHLIP偶联的ICG以及ICG-Cys获得的。单独使用染料(ICG-Cys)进行的成像
清楚地证明了该染料的快速血液清除。在注射ICG-Cys后5分钟，已经难以观察血管。同时，
ICG-WT pHLIP和ICG-Var3 pHLIP在2小时内表现出对血管的优异的持续成像。ICG-Hum
pHLIP达到最佳成像能力条件的速度慢，而成像能力衰减快。ICG-NpHLIP未表现出优良效
能：整体信号低，且对血液流动的成像不是很明显。对血液样品的分析证实了ICG-WT pHLIP
和ICG-Var3 pHLIP的强荧光信号在2小时内的持续性，并显着降低了ICG-NpHLIP在血液样
品中的信号。也使用另一NIR荧光染料IR800测试了最佳实施的肽WT和Var3 pHLIP，以建立
荧光染料的规律。首先，单独使用IR800-Cys并未记录优良的来自血管的信号。IR800-WT和
IR800-Var3 pHLIP在对血管成像中表现较好，但不像ICG-WT和ICG-Var3 pHLIP一样好。从
耳和腿以及血液样品的图像得到证实，IR800版本的pHLIP构造从血液渗出，并在2小时期间
内开始分布在组织内。染料影响生物分布和血液清除的倾向明显。

[1064] 结果表明，由于ICG-Var3 pHLIP和ICG-WT pHLIP的使用可将成像时间从2至5分钟延长到2至3小时，ICG-Var3 pHLIP和ICG-WT pHLIP的使用在大量临床过程中导致了对血管
和血液流动的成像能力的显着改善。

[1065] 其它等效声明

[1066] 尽管已经连同说明书而揭示本发明，但前述说明书试图例示性说明本发明而非限制本发明的范畴，本发明的范畴应为所附权利要求书的范畴所界定。其它方面、优点和修饰
处于后附权利要求书的范畴内。

[1067] 本文中所指的专利和科学文献构建了该领域技术人员所能应用的知识体系。本文中引用的所有美国专利和已公开或未公开的美国专利申请通过引用而并入本文。本文中引
用的所有已公开的外国专利和专利申请通过引用而并入本文。以本文中引用的登录号指明
的GENBANK和NCBI文件通过引用而并入本文。本文中引用的所有其它已出版的参考文献、文
档、手稿和科学文献通过引用而并入本文。

[1068] 尽管本发明已经参照其优选的具体具体实施例得以部分地显示和说明，但该领域技术人员应理解，可对本发明的形式和细节进行各种改变而不悖离由所附权利要求书所涵
盖的本发明范畴。

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