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神经干细胞及其用途

阅读：333发布：2020-05-14

专利汇可以提供神经干细胞及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明的实施方案涉及干细胞及其在治疗和/或预防神经性疾病或障碍中的治疗用途。本文提供了包含c-kit阳性神经干细胞的组合物以及制备和使用用于治疗和/或预防神经性疾病或障碍的c-kit阳性神经干细胞的方法。，下面是神经干细胞及其用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种治疗或预防有需要的受试者中的神经性疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者给予分离的神经干细胞，其中该神经干细胞是从神经组织样本中分离的并且是c-kit阳性的。
2.权利要求1的方法，其中该神经干细胞是成体神经干细胞。
3.权利要求1的方法，其中该神经干细胞来自该神经组织样本的齿状回。
4.权利要求1的方法，其中该神经干细胞来自该神经组织样本的脑室下区。
5.权利要求1的方法，其中该神经干细胞包括谱系阴性细胞。
6.权利要求1的方法，其中该神经干细胞包括祖细胞。
7.权利要求6的方法，其中该祖细胞表达Sox2。
8.权利要求1的方法，其中该神经干细胞包括谱系阳性细胞。
9.权利要求8的方法，其中该谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN或胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。
10.权利要求1的方法，其中使所述分离的神经干细胞在给予至该受试者之前在培养物中扩增。
11.权利要求1的方法，其中将该分离的神经干细胞在给予至该受试者之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。
12.权利要求1的方法，其中将该分离的神经干细胞在给予至该受试者之前暴露于干细胞因子(SCF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或神经生长因子(NGF)。
13.权利要求1的方法，其中该神经组织样本是从该受试者获得的。
14.权利要求1的方法，其中将该分离的神经干细胞通过血管给予至该受试者或直接给予至该组织。
15.权利要求1的方法，其中将该分离的神经干细胞通过注射和/或通过导管系统给予至该受试者。
16.权利要求1的方法，其中该神经性疾病或障碍包括卒中、脑出血、脊髓损伤和/或神经退行性疾病。
17.权利要求16的方法，其中该神经退行性疾病包括亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、巴藤病和/或共济失调性毛细血管扩张。
18.一种包含治疗有效量的分离的神经干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于修复和/或再生受损神经组织，其中所述分离的神经干细胞是c-kit阳性的。
19.权利要求18的药物组合物，其中该神经干细胞是成体神经干细胞。
20.权利要求18的药物组合物，其中该分离的神经干细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。
21.权利要求18的药物组合物，其中该神经干细胞是从神经组织的齿状回分离的。
22.权利要求18的药物组合物，其中该神经干细胞是从神经组织的脑室下区分离的。
23.权利要求18的药物组合物，其中该分离的神经干细胞是人类细胞。
24.权利要求18的药物组合物，其中该分离的神经干细胞是自体的。
25.权利要求18的药物组合物，其中该分离的神经干细胞包括谱系阴性细胞。
26.权利要求18的药物组合物，其中该分离的神经干细胞包括祖细胞。
27.权利要求26的药物组合物，其中该祖细胞表达Sox2。
28.权利要求18的药物组合物，其中该分离的神经干细胞包括谱系阳性细胞。
29.权利要求28的药物组合物，其中该谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。
30.权利要求18的药物组合物，其中该组合物包含约106个分离的神经干细胞。
31.权利要求18的药物组合物，其中将该分离的神经干细胞在体外培养和扩增。
32.权利要求31的药物组合物，其中该分离的神经干细胞能够形成神经球，并且其中每个神经球包含一个核心和一个或多个外层。
33.权利要求32的药物组合物，其中该神经球包含谱系阴性细胞。
34.权利要求33的药物组合物，其中该谱系阴性细胞位于每个神经球的该核心中。
35.权利要求32的药物组合物，其中该神经球包含祖细胞。
36.权利要求35的药物组合物，其中该祖细胞表达Sox2。
37.权利要求32的药物组合物，其中该神经球包含谱系阳性细胞。
38.权利要求37的药物组合物，其中该谱系阳性细胞位于每个神经球的一个或多个外层中。
39.权利要求37的药物组合物，其中该谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。
40.权利要求18的药物组合物，其进一步包含一种或多种细胞因子和/或生长因子。
41.权利要求18的药物组合物，其进一步包含干细胞因子(SCF)、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF。
42.权利要求18的药物组合物，其中该组合物被配制成用于导管介导的注射或直接注射。
43.一种从神经组织中分离常驻神经干细胞的方法，该方法包括：
a)在培养物中培养来自所述神经组织的组织样本，从而形成组织外植体；
b)从该培养的外植体中选择呈c-kit阳性的细胞，并且
c)分离所述c-kit阳性细胞，其中所述分离的c-kit阳性细胞是常驻神经干细胞。
44.权利要求43的方法，其中所述分离的c-kit阳性细胞来自该神经组织的齿状回。
45.权利要求43的方法，其中所述分离的c-kit阳性细胞来自该神经组织的脑室下区。
46.权利要求43的方法，其中所述分离的c-kit阳性细胞包括谱系阴性细胞。
47.权利要求43的方法，其中所述分离的c-kit阳性细胞包括祖细胞。
48.权利要求47的方法，其中该祖细胞表达Sox2。
49.权利要求43的方法，其中所述分离的c-kit阳性细胞包括谱系阳性细胞。
50.权利要求49的方法，其中该谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。
51.权利要求43的方法，其进一步包括在培养物中扩增所述分离的c-kit阳性细胞。
52.权利要求43的方法，其中所述分离的c-kit阳性细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。
53.权利要求43的方法，其进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。
54.权利要求43的方法，其进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于干细胞因子(SCF)、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF。
55.一种修复和/或再生有需要的受试者中的受损神经组织的方法，该方法包括：从健康神经组织中提取神经干细胞；培养和扩增所述神经干细胞，所述神经干细胞是c-kit阳性干细胞；并且将一个剂量的所述提取和扩增的神经干细胞给予至该受试者中的受损神经组织的区域，该剂量可有效修复和/或再生该受损神经组织。
56.权利要求55的方法，其中该提取和扩增的c-kit阳性干细胞来自该健康神经组织的齿状回。
57.权利要求55的方法，其中该提取和扩增的c-kit阳性干细胞来自该健康神经组织的脑室下区。
58.权利要求55的方法，其中该提取和扩增的c-kit阳性干细胞包括谱系阴性细胞。
59.权利要求55的方法，其中该提取和扩增的c-kit阳性干细胞包括祖细胞。
60.权利要求55的方法，其中该提取和扩增的c-kit阳性干细胞包括谱系阳性细胞。
61.权利要求60的方法，其中该谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。
62.权利要求55的方法，其中将该提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至该受损神经组织之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。
63.权利要求62的方法，其中将该提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至该受损神经组织之前暴露于干细胞因子(SCF)、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF。
64.权利要求55的方法，其中将该提取和扩增的c-kit阳性干细胞通过导管介导的注射或直接注射给予。
65.权利要求55的方法，其中该神经干细胞是自体的。
66.权利要求55的方法，其中该神经干细胞是同种异体的。

说明书全文

神经干细胞及其用途

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2016年3月9日提交的美国临时申请号62/305,734在35 U.S.C.119(e)下的优先权的权益，将其内容通过引用以其全文并入本文。

技术领域

[0003] 本公开文本涉及干细胞及其在治疗和/或预防神经性疾病或障碍中的治疗用途。本文提供了包含c-kit阳性神经干细胞的组合物以及制备和使用用于治疗和/或预防神经性疾病或障碍的c-kit阳性神经干细胞的方法。

[0004] 发明背景

[0005] 脑是一个复杂的器官，其与脊髓一起负责个体的认知、情感、社交和运动能力。胶质细胞支持专于不同类型脑功能的神经元。脑的正常功能发挥取决于神经元之间的电信号传导，并且对神经元或胶质细胞的任何损害都可能导致脑和/或脊髓的功能障碍。与受损神经组织相关的神经性疾病和障碍包括阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化、帕金森病、卒中和巴藤病(Batten disease)。

[0006] 阿尔茨海默病是由脑的几个区域中的细胞死亡引起的。这是一种导致记忆力和认知能力丧失的进行性障碍，并且目前不存在治愈方法。最终，阿尔茨海默病是致命的。脑遭受阿尔茨海默病折磨的标志是在神经细胞之间的空间中积聚的β-淀粉样蛋白斑块和在细胞内积累的τ蛋白缠结。对疗法的研究集中于减少斑块和/或缠结。

[0007] 亨廷顿病(HD)是一种遗传性退行性脑障碍，目前对其没有治愈方法。亨廷顿病是由亨廷顿基因中三核苷酸重复的扩增引起的。基因扩增以某种方式导致脑的区域(包括基底神经节和大脑皮质)中神经细胞的损伤。这导致逐渐的身体、精神和情感变化。

[0008] 在肌萎缩侧索硬化症(ALS，也称为卢·格里克病(Lou Gehrig’s disease)或运动神经元疾病)中，控制运动的位于脊髓和脑两者中的神经细胞退化并死亡。结果，那些神经细胞所连接的肌肉最终减弱并日渐衰弱。患者失去他们的力量和移动他们的手臂、腿和身体的能力。最终，隔膜和胸壁中的肌肉衰退，并且患者在没有支撑的情况下变得不能呼吸。

[0009] 多发性硬化是一种炎症性自身免疫介导的疾病，其中患者的免疫系统破坏髓鞘(包裹和保护神经的鞘)。结果，脑和脊髓中的信息流被中断。最终，实际的神经细胞受到累及并死亡。患有多发性硬化的患者表现出涉及中枢神经系统的各种症状，包括痉挛、步行困难、膀胱和肠道问题以及疲劳。

[0010] 帕金森病是由于脑中被称为黑质的区域中多巴胺能神经元逐渐丧失而发生的一种慢性和进行性运动障碍。患有帕金森病的患者由于缺乏多巴胺而难以自由移动、保持姿势、说话和书写。患有帕金森病的个体在中脑、脑干和/或嗅球中具有α突触核蛋白的团块(也称为路易体)。

[0011] 卒中是由向脑区域的血液供应受阻引起(缺血性卒中)或者当脑中的血管破裂，血液溢漏到脑细胞周围的空间中时引起(出血性卒中)。当脑细胞不再接受来自血液的氧气和营养物质或者脑中或脑周围突然出血时，脑细胞就死亡了。取决于受累及的脑的区域，可能损害若干种功能，包括步行、说话和认知能力。

[0012] 巴藤病(也称为斯皮尔梅伊尔-沃格特-肖格伦-巴藤病(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease))是一种典型地开始于儿童时期的致命的遗传性神经系统障碍。受累及的儿童患有认知损害、癫痫恶化、以及视力和运动技能逐渐丧失。巴藤病是被称为神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)的一组障碍中最常见的形式。由脂肪和蛋白质构成的脂褐质(脂质色素)在脑的细胞和眼睛中以及在皮肤、肌肉和许多其他组织中积累。迄今为止，已有
8种基因与不同形式的NCL关联。

[0013] 因此，存在各种神经性疾病和障碍，该神经性疾病和障碍将受益于将允许修复、重建、再生受损神经组织内的细胞或保护受损神经组织内的细胞免受进一步损伤的疗法。然而，从神经组织中分离和扩增足够数量的神经干细胞用于干细胞疗法仍然是一个挑战。因此，本领域中存在对鉴定神经干细胞的标志物的需求，该神经干细胞的标志物可以用于分离可以被扩增和用于神经性疾病或障碍的疗法中的此类干细胞。

[0014] 发明概述

[0015] 本发明的实施方案涉及干细胞以及制备和使用该干细胞的方法。

[0016] 本发明的实施方案是基于在神经组织中具有干细胞典型特征的c-kit阳性细胞群体的发现。干细胞的基本特性是在体外和体内自我更新、克隆形成和多能性。c-kit阳性细胞可以包含谱系阴性细胞、祖细胞和/或谱系阳性细胞。

[0017] 本发明的实施方案提供了替换受损的神经细胞和/或保护神经细胞免受神经性疾病或障碍进一步损伤的问题的解决方案，该神经性疾病或障碍是例如但不限于卒中、脑出血、脊髓损伤、亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、巴藤病和/或共济失调性毛细血管扩张。具体地，这些问题是通过以下方式来解决：将神经干细胞植入有缺陷和/或受损的神经组织以便促进神经组织修复和再生以及治疗或预防在有需要的受试者中的神经性疾病或障碍(例如但不限于卒中、脑出血、脊髓损伤、亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、巴藤病和/或共济失调性毛细血管扩张)。

[0018] 因此，在一个方面，本发明提供了治疗或预防有需要的受试者中的神经性疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者给予分离的神经干细胞，其中该神经干细胞是从神经组织样本中分离的并且是c-kit阳性的。在一个实施方案中，神经干细胞是成体神经干细胞。在另一个实施方案中，神经组织样本是从受试者获得的。在另一个实施方案中，神经干细胞来自神经组织样本的齿状回。在另外的实施方案中，神经干细胞来自神经组织样本的脑室下区。

[0019] 在有需要的受试者中治疗或预防神经性疾病或障碍的方法的一个实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阴性细胞。在另一个实施方案中，分离的神经干细胞包括祖细胞。在另一个实施方案中，祖细胞表达Sox2。在另外的实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阳性细胞。在又另一个实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。

[0020] 在有需要的受试者中治疗或预防神经性疾病或障碍的方法的一个实施方案中，将所述分离的神经干细胞在给予至受试者之前在培养物中扩增。在另一个实施方案中，将分离的神经干细胞在给予至受试者之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，将分离的神经干细胞在给予至受试者之前暴露于干细胞因子(SCF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或神经生长因子(NGF)。

[0021] 在一个实施方案中，将分离的神经干细胞通过血管给予至受试者或直接给予至组织。在另一个实施方案中，将分离的神经干细胞通过直接注射和/或通过导管系统给予至受试者。

[0022] 在有需要的受试者中治疗或预防神经性疾病或障碍的方法的一个实施方案中，神经性疾病或障碍是卒中。在另一个实施方案中，神经性疾病或障碍是脑出血。在另一个实施方案中，神经性疾病或障碍是神经退行性疾病。在又另一个实施方案中，神经退行性疾病是亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、巴藤病和/或共济失调性毛细血管扩张。

[0023] 在另一个方面，本发明提供包含治疗有效量的分离的神经干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于修复和/或再生受损神经组织，其中所述分离的神经干细胞是c-kit阳性的。在一些实施方案中，神经干细胞是成体神经干细胞。在另一个实施方案中，分离的神经干细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。

[0024] 在药物组合物的一个实施方案中，神经干细胞是从神经组织的齿状回分离的。在另一个实施方案中，神经干细胞是从神经组织的脑室下区分离的。在另一个实施方案中，分离的神经干细胞是人类细胞。在另外的实施方案中，分离的神经干细胞是自体的。

[0025] 在药物组合物的一个实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阴性细胞。在另一个实施方案中，分离的神经干细胞包括祖细胞。在另一个实施方案中，祖细胞表达Sox2。在另外的实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阳性细胞。在又另一个实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0026] 在药物组合物的一个实施方案中，组合物包含约106个分离的神经干细胞。在另一个实施方案中，将分离的神经干细胞在体外进行培养和扩增。在另一个实施方案中，组合物进一步包含一种或多种细胞因子和/或生长因子。在另外的实施方案中，组合物进一步包含SCF、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF。

[0027] 在一个实施方案中，组合物被配制用于导管介导的注射或直接注射。

[0028] 在药物组合物的一个实施方案中，分离的神经干细胞能够形成神经球，其中每个神经球包含一个核心和一个或多个外层。在另一个实施方案中，神经球包含谱系阴性细胞。在另一个实施方案中，谱系阴性细胞位于每个神经球的核心。在另外的实施方案中，神经球包含祖细胞。在一些实施方案中，祖细胞表达Sox2。在另一个实施方案中，神经球包含谱系阳性细胞。在另外的实施方案中，谱系阳性细胞位于每个神经球的一个或多个外层中。在又另一个实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0029] 在另一个方面，本发明提供了一种从神经组织中分离常驻神经干细胞的方法，该方法包括：(a)在培养物中培养来自所述神经组织的组织样本，从而形成组织外植体；(b)选择来自培养外植体的呈c-kit阳性的细胞，和(c)分离所述c-kit阳性细胞，其中所述分离的c-kit阳性细胞是常驻神经干细胞。

[0030] 在一个实施方案中，所述分离的c-kit阳性细胞来自神经组织的齿状回。在另一个实施方案中，所述分离的c-kit阳性细胞来自神经组织的脑室下区。

[0031] 在从神经组织分离常驻神经干细胞的方法的一个实施方案中，分离的c-kit阳性细胞包括谱系阴性细胞。在另一个实施方案中，分离的神经c-kit阳性细胞包括祖细胞。在另一个实施方案中，祖细胞表达Sox2。在另外的实施方案中，分离的c-kit阳性细胞包括谱系阳性细胞。在又另一个实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0032] 在一个实施方案中，从神经组织分离常驻神经干细胞的方法进一步包括在培养物中扩增所述分离的c-kit阳性细胞。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，该方法进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于SCF、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF。

[0033] 在另一个方面，本发明提供了一种修复和/或再生有需要的受试者中受损神经组织的方法，该方法包括：从健康神经组织中提取神经干细胞；培养和扩增所述神经干细胞，所述神经干细胞是c-kit阳性干细胞；并且将一个剂量的所述提取和扩增的神经干细胞给予至受试者的受损神经组织的区域，该剂量可有效修复和/或再生受损神经组织。

[0034] 在修复和/或再生有需要的受试者中的受损神经组织的方法的一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞来自健康神经组织的齿状回。在另一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞来自健康神经组织的脑室下区。

[0035] 在修复和/或再生有需要的受试者中的受损神经组织的方法的一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞包括谱系阴性细胞。在另一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞包括祖细胞。在另外的实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞包括谱系阳性细胞。在又另一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0036] 在修复和/或再生有需要的受试者中的受损神经组织的方法的一个实施方案中，在培养物中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至受损神经组织之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至受损神经组织之前暴露于SCF、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF。

[0037] 在修复和/或再生有需要的受试者中的受损神经组织的方法的一个实施方案中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞通过导管介导的注射或直接注射给予。

[0038] 在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，神经组织来自人类。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，神经组织是成体神经组织。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，分离的神经干细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，c-kit阳性细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阴性细胞。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，分离的神经干细胞包括祖细胞。在所述组合物和方法的所有方面的进一步实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阳性细胞。在所述组合物和方法的所有方面的又另一个实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，神经干细胞是自体的。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，神经干细胞是同种异体的。

[0039] 附图简述

[0040] 图1A显示了小鼠脑的齿状回的代表性原位免疫标记。c-kit标记为绿色，且GFAP标记为红色。细胞核被DAPI染色。

[0041] 图1B显示了小鼠脑组织切片的代表性原位免疫标记。c-kit标记为红色，且GFAP标记为绿色。细胞核被DAPI染色。

[0042] 图2显示了小鼠脑组织切片的代表性原位免疫标记。c-kit标记为绿色，且Sox2标记为白色。细胞核被DAPI染色。

[0043] 图3A显示了小鼠脑组织切片的代表性原位免疫标记。c-kit标记为绿色，且βIII微管蛋白标记为红色。细胞核被DAPI染色。红色箭头指向表达βIII微管蛋白和NeuN两者的c-kit阳性细胞。

[0044] 图3B显示了小鼠脑组织切片的代表性原位免疫标记。c-kit标记为绿色，且NeuN标记为白色。细胞核被DAPI染色。

[0045] 图4显示了培养7-14天后从未分选细胞起源的神经球的代表性图像。

[0046] 图5显示了用c-kit受体的配体SCF刺激后紧密且良好分离的神经球。

[0047] 图6A-图6B显示了第2代神经球的免疫标记。细胞核被DAPI染色。一个神经球表达c-kit(绿色)、NeuN(灰色)和GFAP(红色)。三种标志物的信号的合并显示于图6B中，而图6A显示了单独的标志物信号。其他神经球对所有三种标志物均呈阴性，并且可以通过DAPI染色看到细胞核。

[0048] 图7显示了第4代神经球的免疫标记。细胞核被DAPI染色。神经球的核心含有c-kit阳性(绿色)、谱系阴性细胞，而神经球的外层表达神经元标志物GFAP(红色)。

[0049] 图8显示了转移到附着型培养皿的第4代神经球。

[0050] 图9显示了已经转移到附着型培养皿的第4代神经球的免疫标记。c-kit阳性(绿色)细胞部分地共表达神经细胞的谱系标志物(GFAP，红色；NeuN，灰色)。

具体实施方式

[0051] 本发明的实施方案是基于在神经组织中具有干细胞典型特征的c-kit阳性细胞群体的发现。干细胞的基本特性是在体外和体内自我更新(即，制造更多干细胞)、克隆形成和多能性的能力。在这一发现之前，还没有识别或分离来自神经组织的展现所有三个干细胞特征的一种细胞类型。

[0052] 如众所周知，干细胞凭借其特性产生身体的所有细胞和组织。因此，干细胞可以用于修复或加速受损和/或有缺陷的神经组织的修复。如果可以获得足够量的神经干细胞(NSC)，则可以将该量的NSC用于通过在脑和/或脊髓中构建新组织来修复受损和/或有缺陷的神经组织。在有缺陷和/或受损的神经组织中，可能存在很少的NSC或不存在NSC。由于NSC自我更新，植入的NSC将定殖并栖居于有缺陷和/或受损的神经组织中的壁龛(niche)。通过克隆和多能，植入的NSC还将分裂和分化以产生所有新的神经细胞和组织。因此，分离的NSC群体或包含分离的NSC群体的组合物可以用于治疗或预防受试者的神经性疾病或障碍。

[0053] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了来自神经组织的样品的分离细胞群体，其中分离的细胞群体含有c-kit阳性NSC。可以大量富集和扩增这种c-kit阳性NSC群体。

[0054] 在一个实施方案中，本文提供了包含治疗有效量的分离和扩增的神经干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于修复和/或再生受损神经组织，其中所述分离的神经干细胞是c-kit阳性的。在一些实施方案中，神经干细胞是成体神经干细胞。在另一个实施方案中，分离的神经干细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。在一些实施方案中，神经干细胞是从神经组织的齿状回分离的。在另一个实施方案中，神经干细胞是从神经组织的脑室下区分离的。在另一个实施方案中，分离的神经干细胞是人类细胞。在另外的实施方案中，分离的神经干细胞是自体的。

[0055] 在一个实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阴性细胞。在另一个实施方案中，分离的神经干细胞包括祖细胞。在另一个实施方案中，祖细胞表达Sox2。在另外的实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阳性细胞。在又另一个实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0056] 在一个实施方案中，组合物包含约106个分离的神经干细胞。在另一个实施方案中，将分离的神经干细胞在体外进行培养和扩增。在另一个实施方案中，组合物进一步包含一种或多种细胞因子和/或生长因子。在另外的实施方案中，组合物进一步包含SCF、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF。

[0057] 在一个实施方案中，组合物被配制用于导管介导的注射或直接注射。

[0058] 在一个实施方案中，分离的神经干细胞能够形成神经球，其中每个神经球包含一个核心和一个或多个外层。在另一个实施方案中，神经球包含谱系阴性细胞。在另一个实施方案中，谱系阴性细胞位于每个神经球的核心。在另外的实施方案中，神经球包含祖细胞。在一些实施方案中，祖细胞表达Sox2。在另一个实施方案中，神经球包含谱系阳性细胞。在另外的实施方案中，谱系阳性细胞位于每个神经球的一个或多个外层中。在又另一个实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0059] 在一个实施方案中，本文提供了用于在生产用于治疗和/或预防受试者中的神经性疾病或障碍的药物中使用的组合物，该组合物包含来自神经组织样品的分离的c-kit阳性NSC的富集群体。在该组合物的另一个实施方案中，该组合物进一步包含药学上可接受的载体。

[0060] 在一个实施方案中，本发明提供了一种从神经组织中分离常驻神经干细胞的方法，该方法包括：(a)在培养物中培养来自所述神经组织的组织样本，从而形成组织外植体；(b)选择来自培养外植体的呈c-kit阳性的细胞，和(c)分离所述c-kit阳性细胞，其中所述分离的c-kit阳性细胞是常驻神经干细胞。

[0061] 在一个实施方案中，所述分离的c-kit阳性细胞来自神经组织的齿状回。在另一个实施方案中，所述分离的c-kit阳性细胞来自神经组织的脑室下区。

[0062] 在一个实施方案中，分离的c-kit阳性细胞包括谱系阴性细胞。在另一个实施方案中，分离的神经c-kit阳性细胞包括祖细胞。在另一个实施方案中，祖细胞表达Sox2。在另外的实施方案中，分离的c-kit阳性细胞包括谱系阳性细胞。在又另一个实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0063] 在一个实施方案中，从神经组织分离常驻神经干细胞的方法进一步包括在培养物中扩增所述分离的c-kit阳性细胞。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，该方法进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于SCF、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF。

[0064] 在一个实施方案中，本发明提供了获得基本上对c-kit阳性NSC富集的分离细胞的群体的方法，该方法包括冷冻保存从受试者获得的神经组织样本；在以后解冻冷冻保存的样本；从神经组织的样本中选择一个或多个c-kit阳性细胞；在培养基中增殖所选择的c-kit阳性细胞。

[0065] 在一个实施方案中，本发明提供了增殖基本上对c-kit阳性NSC富集的分离细胞的群体的方法，该方法包括从神经组织样品中选择一种或多种c-kit阳性细胞；将一种或多种c-kit阳性选择细胞引入培养基中；并在培养基中增殖所选择的c-kit阳性细胞。

[0066] 在另一个实施方案中，本发明提供了例如在修复、再生和/或治疗神经性疾病或障碍例如卒中、脑出血、脊髓损伤、亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、巴藤病和/或共济失调性毛细血管扩张中使用基本上富集c-kit阳性NSC的这种分离细胞群体或使用包含富集分离的c-kit阳性NSC的群体的药物组合物的方法。不希望受理论束缚，诸位发明人认为在神经组织中鉴定的c-kit阳性细胞可以代表脑中特化细胞的来源，例如胆碱能神经元、GABA能(γ氨基丁酸)神经元、谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元(serotonergic neuron)、运动神经元、中间神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或小胶质细胞。因此，在一个实施方案中，可以将已经在体外扩增的分离的c-kit阳性NSC的群体移植或植入受累及/受损的神经组织中。然后，c-kit阳性NSC在神经组织中驻留、生长并分化成通常在脑或脊髓中发现的各种类型的组织，并恢复和/或重建脑和/或脊髓的特化细胞。目标是在受累及组织中替换由于疾病引起的一些受损的神经组织。替换神经组织充当补充受累及的受试者中的现有或剩余的神经组织，使得总体上有足够的组织用于脑和/或脊髓的充分功能以改善、治疗和/或预防该受试者中的神经性疾病或障碍。

[0067] 在一个实施方案中，可以将分化的c-kit阳性NSC移植到特定神经性疾病或障碍的动物模型中，以确定NSC是否可以分化成健康的神经细胞，从而改善、治疗和/或预防动物中的神经性疾病或障碍。例如，可以将c-kit阳性NSC移植到例如帕金森病、ALS和卒中的动物模型中，如在Adami等人Front Cell Dev Biol.2014；2:17中所述。

[0068] 成体干细胞移植已作为刺激损伤组织和器官修复的新的替代选择而出现。在过去的十年中，在动物和人类中的一些研究已经证明了成体骨髓起源的干细胞(即造血干细胞)分化成非造血细胞类型(包括脑、骨骼肌、软骨细胞、肝脏、内皮和心脏)的扩展库的能力。

[0069] 没有文献证明真正的多能组织特异性成体c-kit阳性神经干细胞在脑中的存在，以及这些NSC治疗或预防患者中的神经性疾病或障碍的用途。本发明的优点是用于治疗或预防神经性疾病或障碍的NSC可以是自体细胞，这将大大提高治疗或预防的成功率。例如，在活组织检查期间，通过外科手术取出患者神经组织的一部分。少至一立方厘米就足够了。处理该组织片以从结缔组织中释放单个细胞。使用干细胞标志物c-kit作为干细胞的指示，选择c-kit阳性细胞。然后将c-kit阳性NSC在体外扩增以获得治疗或预防所需的足够数量的细胞。当存在足够的细胞时，收获细胞并将其注射回同一患者或相对于NSC供体遗传匹配的患者中。在每个过渡步骤，例如，在选择与扩增之间或在扩增与植入之间，可以任选地将NSC冷冻保存。在一个实施方案中，患者回收已经在体外选择和扩增的患者自身的NSC。在另一个实施方案中，患者获得从遗传匹配的供体来源的NSC。在一些实施方案中，该方法还可以扩展至任何具有神经组织的哺乳动物，例如猫、狗、马、猴等。

[0070] 因此，本发明提供了治疗或预防有需要的受试者中的神经性疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者给予分离的神经干细胞，其中该神经干细胞是从神经组织样本中分离的并且是c-kit阳性的。在一个实施方案中，神经干细胞是成体神经干细胞。在另一个实施方案中，神经组织样本是从受试者获得的。在另一个实施方案中，神经干细胞来自神经组织样本的齿状回。在另外的实施方案中，神经干细胞来自神经组织样本的脑室下区。

[0071] 在一个实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阴性细胞。在另一个实施方案中，分离的神经干细胞包括祖细胞。在另一个实施方案中，祖细胞表达Sox2。在另外的实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阳性细胞。在又另一个实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0072] 在一个实施方案中，将所述分离的神经干细胞在给予至受试者之前在培养物中扩增。在另一个实施方案中，将分离的神经干细胞在给予至受试者之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，将分离的神经干细胞在给予至受试者之前暴露于SCF、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF。

[0073] 在一个实施方案中，将分离的神经干细胞通过血管给予至受试者或直接给予至组织。在另一个实施方案中，将分离的神经干细胞通过注射和/或通过导管系统给予至受试者。

[0074] 在一个实施方案中，神经性疾病或障碍是卒中。在另一个实施方案中，神经性疾病或障碍是脑出血。在另一个实施方案中，神经性疾病或障碍是神经退行性疾病。在又另一个实施方案中，神经退行性疾病是亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、巴藤病和/或共济失调性毛细血管扩张。

[0075] 在一个实施方案中，本文提供了用于治疗和/或预防有需要的受试者中的神经性疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者给予包含本文所述的c-kit阳性NSC的群体的组合物。

[0076] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗和/或预防有需要的受试者中的神经性疾病或障碍的方法，该方法包括从受试者获得神经组织样品；从神经组织样品中提取c-kit阳性NSC群体；在体外扩增所选择的c-kit阳性NSC以增加此类NSC的数量；并且向该受试者给予扩增的c-kit阳性NSC群体以修复、重建和/或再生受试者的脑和/或脊髓中的神经细胞和组织。

[0077] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防有需要的受试者中的神经性疾病或障碍的方法，该方法包括从第一受试者中获得神经组织；从神经组织样品中提取c-kit阳性NSC群体；扩增c-kit阳性NSC的群体；并且向第二受试者给予c-kit阳性NSC群体以使c-kit NSC在脑和/或脊髓中驻留并修复、重建和/或再生第二受试者的脑和/或脊髓中的神经细胞和组织。

[0078] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种修复和/或再生有需要的受试者中受损神经组织的方法，该方法包括：从健康神经组织中提取神经干细胞；培养和扩增所述神经干细胞，所述神经干细胞是c-kit阳性干细胞；并且将一个剂量的所述提取和扩增的神经干细胞给予至受试者的受损神经组织的区域，该剂量可有效修复和/或再生受损神经组织。

[0079] 在修复和/或再生有需要的受试者中的受损神经组织的方法的一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞来自健康神经组织的齿状回。在另一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞来自健康神经组织的脑室下区。

[0080] 在修复和/或再生有需要的受试者中的受损神经组织的方法的一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞包括谱系阴性细胞。在另一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞包括祖细胞。在另外的实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞包括谱系阳性细胞。在又另一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0081] 在修复和/或再生有需要的受试者中的受损神经组织的方法的一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞能够产生一种或多种神经细胞类型。在另一个实施方案中，一种或多种神经细胞类型包括胆碱能神经元。在另一个实施方案中，一种或多种神经细胞类型包括GABA能神经元。在另一个实施方案中，一种或多种神经细胞类型包括谷氨酸能神经元。在另一个实施方案中，一种或多种神经细胞类型包括多巴胺能神经元。在另外的实施方案中，一种或多种神经细胞类型包括血清素能神经元。在另一个实施方案中，一种或多种神经细胞类型包括运动神经元。在另外的实施方案中，一种或多种神经细胞类型包括中间神经元。在另一个实施方案中，一种或多种神经细胞类型包括星形胶质细胞。在又另一个实施方案中，一种或多种神经细胞类型包括少突胶质细胞。在一些实施方案中，一种或多种神经细胞类型包括小胶质细胞。

[0082] 在修复和/或再生有需要的受试者中的受损神经组织的方法的一个实施方案中，在培养物中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至受损神经组织之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至受损组织之前，暴露于SCF、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF。

[0083] 在修复和/或再生有需要的受试者中的受损神经组织的方法的一个实施方案中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞通过导管介导的注射或直接注射给予。

[0084] 在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，主要由分离细胞的群体组成的c-kit阳性NSC具有自我更新能力、克隆形成能力和多能性。这意味着每个分离的c-kit阳性细胞可以分裂以产生更多的c-kit阳性细胞，从而在培养物中形成菌落。当在某些条件下刺激时，每个c-kit阳性细胞可以定型(即，选择特定细胞谱系以分化成)并进一步分化成特定谱系的细胞，例如GABA神经元、多巴胺神经元、运动神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞(产生髓鞘的)和/或小胶质细胞。在规范和分化时，这些细胞及其后代将表达所确定谱系特有的特定细胞标志物。此外，定型的细胞及其后代将失去c-kit的表达。

[0085] 在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，神经组织来自人类。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，人类是成年人。

[0086] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，在选择c-kit阳性细胞之前将神经组织冷冻保存。

[0087] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，使用针对c-kit的抗体进行c-kit阳性NSC的选择。

[0088] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，针对c-kit的抗体是单克隆抗体。

[0089] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，针对c-kit的单克隆抗体是针对人类c-kit的抗原表位的小鼠单克隆IgG。

[0090] 在任何所述方法的一个实施方案中，针对c-kit的抗体是荧光染料缀合的。

[0091] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，针对c-kit的抗体与磁性粒子缀合。

[0092] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，c-kit阳性细胞的选择是通过流式细胞术。

[0093] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，选择是通过荧光激活细胞分选或高梯度磁性选择。

[0094] 在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，分离的神经干细胞包括谱系阴性细胞、祖细胞和/或谱系阳性细胞。

[0095] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，进一步将c-kit阳性NSC进行离体扩增。在所述方法的所有方面的一个实施方案中，进一步将c-kit阳性NSC在体外进行扩增。目标是具有足够大量的c-kit阳性NSC用于植入以确保将植入的NSC成功植入到受损神经组织的壁龛中。基本上，必须有足够的细胞在受损神经组织中生长和繁殖，以提供修复和/或替换神经组织的受损部分所必需的所有细胞。

[0096] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，在扩增或增殖步骤后c-kit阳性NSC在数量上是至少两倍。在所述方法的所有方面的一些实施方案中，期望在扩增或增殖时c-kit阳性细胞的数量在增殖期结束时增加至少5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍或更多。培养物中细胞的数量可以通过本领域中已知的任何方法确定，例如通过使用库尔特(coulter)计数器确定。这些方法对本领域技术人员而言是熟知的。

[0097] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，将所选择的c-kit阳性NSC冷冻保存用于扩增前的储存。

[0098] 在所述方法的所有方面的另一个实施方案中，出于储存目的，将扩增的NSC冷冻保存。在需要时，将冷冻的细胞解冻并然后用于植入有需要的受试者中。

[0099] 在所述方法的所有方面的一个实施方案中，该方法进一步包括将分离的c-kit阳性NSC群体冷冻保存。

[0100] 对于最近被诊断患有神经性疾病或障碍的人，如果获得了受试者神经组织的活组织检查样品用于诊断，则可以根据这里描述的方法制备c-kit阳性NSC的群体，并且然后可以将NSC冷冻保存供将来在疾病进展到晚期使得该人需要神经干细胞疗法的情况下使用。

[0101] 类似地，处于发生神经性疾病或障碍风险的人可以得益于早期从人自身神经组织中制备c-kit NSC群体并将NSC冷冻保存。例如，有患亨廷顿病遗传倾向的人将受益。亨廷顿病(HD)是一种遗传性退行性脑障碍，目前对其没有治愈方法。亨廷顿病是被由于CAG三核苷酸序列重复而引起的亨廷顿基因的扩增引起的。平均而言，基因扩增越大，疾病发作的年龄越早。其他处于发展神经性疾病或障碍风险的人包括但不限于：家庭成员患有早发性家族性阿尔茨海默病的个体、患有阿尔茨海默病的ApoE易感基因的个体、以及家庭成员患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)的个体或携带已知导致ALS的基因的个体。

[0102] 在治疗方法的所有方面的一些实施方案中，治疗(treating和treatment)包括“恢复有需要的受试者中的受损神经组织的结构和功能完整性”。

[0103] 在所述方法的所有方面的其他实施方案中，治疗包括修复受损或功能不充分的人类神经组织。在另一个实施方案中，治疗(treating和treatment)包括修复、重建、再生受损神经组织中的神经细胞或保护受损神经组织中的神经细胞以免进一步损伤。

[0104] 恢复或修复不需要达到健康人的神经组织的100％。只要受试者的症状有所改善，恢复或修复就得以实现。熟练的医生将能够在治疗之前和之后评估症状的严重性，并且基于比较确定是否存在改善。通常，受试者将能够说出症状是否存在改善。一些症状的例子包括但不限于：记忆丧失、认知下降、运动衰退、疲劳、或膀胱和肠道问题。

[0105] 在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，预防(preventing和prevention)包括减慢由于疾病(例如，来自卒中、脑出血、脊髓损伤或神经退行性疾病)引起的神经组织的功能能力和完整性降低。

[0106] 在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，c-kit阳性NSC群体修复、重建、产生神经组织中的神经细胞或保护神经组织中的神经细胞免受进一步损伤。

[0107] 在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，治疗和/或预防神经性疾病或障碍的方法进一步包括在给予基本上富集c-kit阳性NSC细胞群体之前选择患有神经性疾病或障碍的受试者，例如患有卒中、脑出血、脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者。

[0108] 在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，治疗和/或预防神经性疾病或障碍的方法进一步包括在给予细胞之前选择对恢复受损神经组织的结构和功能完整性有需要的受试者，例如患有卒中、脑出血、脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者。

[0109] 在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，治疗和/或预防神经性疾病或障碍的方法进一步包括选择对修复、重建、产生神经组织中的神经细胞或保护神经组织中的神经细胞免受进一步损伤有需要的受试者，例如患有卒中、脑出血、脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者。

[0110] 例如，所选择的受试者是那些对传统治疗完全没有反应或具有不良反应的受试者和/或已经用尽了本领域目前已知的针对特定形式或类型的神经性疾病或障碍的所有治疗选择的受试者。

[0111] 在用于治疗或预防神经性疾病或障碍的治疗方法的所有方面的一个实施方案中，给予是通过直接注射、通过导管系统或其组合。

[0112] 在用于治疗或预防神经性疾病或障碍的治疗方法的所有方面的一个实施方案中，给予至受试者是通过血管、直接给予至组织、或其组合。

[0113] 在用于治疗或预防神经性疾病或障碍的治疗方法的所有方面的一个实施方案中，c-kit阳性NSC是自体细胞。

[0114] 在用于治疗或预防神经性疾病或障碍的治疗方法的所有方面的一个实施方案中，c-kit阳性NSC是从一个或多个供体获得的同种异体细胞。

[0115] 在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，该方法进一步包括给予至少一种治疗剂以及c-kit阳性NSC，例如用于治疗卒中、脑出血、脊髓损伤或神经退行性疾病的那些。

[0116] 在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，该至少一种治疗剂增强NSC群体的归巢、植入或存活。

[0117] 在治疗方法的所有方面的一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选人类。在另一个实施方案中，受试者是成年的人类。在一个实施方案中，c-kit阳性NSC群体是c-kit阳性人类NSC群体。

[0118] 神经发育

[0119] 神经系统来自外胚层，即胚胎的最外组织层。在发育的第三周，神经外胚层出现并沿着胚胎的背侧形成神经板。这种神经板是成熟人类中大多数神经元和胶质细胞的来源。神经元和胶质细胞是脑的主要细胞组分。

[0120] 在中枢神经系统(CNS)中发现三种类型的胶质细胞：星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。

[0121] 星形胶质细胞是异质细胞群体，其与神经元和血管相互作用。这些细胞检测神经元活动并调节神经元网络。星形胶质细胞的原型形态特征是它们表达形成细胞骨架的中间纤丝。星形胶质细胞中间纤丝蛋白的主要类型是胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和波形蛋白；GFAP的表达通常用作鉴定星形胶质细胞的特异性标志物。

[0122] 中枢神经系统中的少突胶质细胞产生髓鞘。髓鞘充当轴突区段的绝缘体，并且是神经传导速度高的先决条件。所有白质束都含有少突胶质细胞以形成髓鞘。还存在不与髓鞘直接连接的少突胶质细胞。这些卫星少突胶质细胞优先在灰质中发现，并且可以用来调节与星形胶质细胞类似的离子稳态。

[0123] 小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，并且负责针对各种类型的致病因子的CNS保护。它们可以迁移到损伤部位、增殖并变成吞噬细胞，并且它们通过抗原呈递与外周免疫系统相互作用。

[0124] 神经元是CNS的脑和脊髓以及周围神经系统(PNS)神经节的核心组分。神经元可以彼此连接以形成神经网络。特化的神经元类型包括：感觉神经元，其响应于触觉、声音、光和影响感觉器官细胞的所有其他刺激，然后该感觉器官将信号发送到脊髓和脑；运动神经元，其接收来自脑和脊髓的信号以引起肌肉收缩并影响腺体输出；以及中间神经元，其将神经元连接到脑相同区域内的其他神经元或神经网络中的脊髓。

[0125] 典型的神经元由细胞体(体细胞)、树突和轴突组成。树突是来自细胞体的薄结构，通常延伸数百微米并且多次分枝，产生复杂的“树突状树”。轴突(当有髓鞘时也称为神经纤维)是一种来自细胞体的特殊的细胞延伸，并行进一段距离，在人类中最远可达1米且在其他物种中甚至更多。

[0126] 神经元是通过电信号和化学信号处理和传递信息的可电激发的细胞。神经元之间的这些信号经由被称为突触的特化连接发生。在大多数突触中，信号从一个神经元的轴突发送到另一个神经元的树突。

[0127] 神经干细胞(NSC)

[0128] 干细胞是保留通过有丝分裂细胞分裂更新其自身种类的能力的细胞，并且它们的子细胞可以分化成各种各样的特化细胞类型。两种广泛类型的哺乳动物干细胞是：在囊胚中发现的胚胎干(ES)细胞，以及在成体组织中发现的成体干细胞。在正在发育的胚胎中，ES可以分化成所有的特化胚胎组织。在成体生物体中，成体干细胞和祖细胞充当身体的修复系统，补充特化细胞，但也维持再生器官(如血液、皮肤或肠组织)的正常更新。多能干细胞可以分化成从三个胚层中的任何一个起源的细胞。

[0129] 在一些实施方案中，如本文所使用的术语“干细胞”是指能够增殖并且产生更多祖细胞的未分化细胞，该祖细胞具有生产大量母细胞的能力，该母细胞转而又可以产生分化或可分化的子细胞(称为前体细胞)。子细胞自身可以被诱导增殖并产生后代，该后代随后分化成一种或多种成熟细胞类型，同时还保留一种或多种具有亲本发育潜力的细胞。

[0130] 在一些实施方案中，术语“干细胞”还是指在特定情况下具有分化成更特化或分化的表型的能力或潜力的祖细胞的子集，并且在某些情况下还保留增殖而基本上不分化的能力。

[0131] 本文描述的NSC是与ES相对的躯体干细胞。在优选的实施方案中，所描述的NSC是成体干细胞。

[0132] 在一个实施方案中，如本文所使用的，术语“c-kit阳性神经干细胞”或“c-kit阳性NSC”涵盖干细胞、祖细胞和前体细胞，其全部都是c-kit阳性的。

[0133] 在一个实施方案中，如本文所使用的，术语“c-kit阳性神经干细胞”或“c-kit阳性NSC”涵盖c-kit阳性细胞，该c-kit阳性细胞包括谱系阴性细胞、祖细胞和/或谱系阳性细胞。在又另一个实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0134] 细胞分化是典型地通过许多细胞分裂发生的复杂过程。分化细胞可以起源于多能细胞等，该多能细胞本身起源于多能细胞。尽管这些多能细胞中的每一种都可以被认为是干细胞，但是每种多能细胞可以产生的细胞类型的范围可以显著变化。一些分化的细胞还具有产生更大发育潜力的细胞的能力。这种能力可以是天然的或可以在用各种因素处理后人工诱导。在许多生物学例子中，干细胞是“多能的”，因为它们可以产生超过一种不同细胞类型的后代，并且如本文件中使用的那样这是必需的。自我更新是干细胞定义的另一个经典部分，并且如在本文件中使用的这是必不可少的。理论上，自我更新可以通过两种主要机制中的任何一种发生。干细胞可以不对称分裂，其中一个子细胞保留干细胞状态且另一个子细胞表达一些不同的其他特定功能和表型。可选地，群体中的一些干细胞可以对称分裂成两个干细胞，从而在群体中整体维持一些干细胞，而群体中的其他细胞仅产生分化的后代。

[0135] 在一个实施方案中，基本上富集c-kit阳性细胞的分离细胞群体主要包含NSC。因此，在一个实施方案中，基本上富集c-kit阳性细胞的分离细胞群体被称为分离的c-kit阳性NSC群体。这意味着c-kit阳性NSC群体可以包括一些c-kit阳性谱系阴性细胞、c-kit阳性祖细胞和/或c-kit阳性前体细胞。

[0136] 如本文所使用的，在一些实施方案中，术语“分离的和基本上富集c-kit阳性NSC的群体”或“分离的c-kit阳性NSC群体”涵盖异质或同质的NSC群体和/或神经祖细胞和/或神经前体细胞。NSC是多能的并且产生许多谱系的细胞类型。相反，神经祖细胞和神经前体细胞是谱系决定细胞。例如，如果神经祖细胞被确定为胶质细胞谱系，即将来会产生胶质细胞，则该神经祖细胞将不会转变并产生神经元细胞。在一些实施方案中，神经祖细胞和神经前体细胞被确定为胆碱能神经元、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、运动神经元、中间神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞或小胶质细胞。

[0137] 包含至少两种不同细胞类型的分离的c-kit阳性NSC群体在本文中被称为“异质群体”。本文还考虑在移植前离体分离和扩增神经干细胞或神经祖细胞。仅包含一种细胞类型(例如，神经元细胞)的分离的c-kit阳性NSC群体在本文中被称为“同质细胞群体”。

[0138] 在该例子中，人类神经组织中的这种细胞群体表达c-kit(也称为KIT或CD117)，其是结合细胞因子干细胞因子(SCF)的细胞因子受体。SCF向细胞发出信号以进行分裂和生长。一般来说，c-kit在干细胞以及祖细胞和前体细胞类型的表面上表达，所述祖细胞和前体细胞类型是干细胞通过有丝分裂的后代。因此，c-kit是干细胞标志物。通过对人类神经组织中的c-kit进行免疫染色，诸位发明人发现了这种c-kit阳性细胞(图1A-图1B、图2、图3A-图3B、图6A-图6B、图7、图9)。在此发现之前，尚未报道c-kit阳性干细胞在神经组织中的证据。这些c-kit阳性细胞包括谱系阴性细胞、祖细胞和/或谱系阳性细胞。在一些实施方案中，谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP。

[0139] 诸位发明人显示这些c-kit阳性NSC具有克隆形成特性。当将这些细胞分离并且铺板在超低附着板中并传代时，在每次传代时形成神经球(图4、图5)，因而证明了这些c-kit阳性神经干细胞的克隆形成特性。

[0140] 此外，在神经球内发现了单独的或与谱系标志物组合的c-kit表达(图6A-图6B、图7、图9)。

[0141] 在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，分离的c-kit阳性NSC群体包含具有长期和短期再生能力的细胞、以及定型的多能、寡能和单能祖细胞。

[0142] 因此，如本文所使用的，术语“NSC”是指具有多谱系神经分化潜能和持续自我更新活性的细胞。“自我更新”是指细胞分裂并产生至少一个具有亲本细胞的相同(例如，自我更新)特征的子细胞的能力。第二个子细胞可以定型于特定的分化途径。例如，自我更新的NSC分裂并形成一个子干细胞和另一个定型于分化成神经组织的神经元和/或胶质细胞的子细胞。定型祖细胞典型地丧失自我更新能力，并且在细胞分裂时产生两个显示更分化(即受限)表型的子细胞。

[0143] 因此，如本文所述的方法中使用的“NCS”涵盖能够分化成神经组织的几种细胞类型的所有多能细胞，包括但不限于胆碱能神经元、GABA能(γ氨基丁酸)神经元、谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、运动神经元、中间神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或小胶质细胞。

[0144] 如本文使用的术语“神经祖细胞”是指定型于特定的神经细胞谱系且通常不自我更新，并且可以例如通过细胞表面标志物或细胞内蛋白质鉴定的NSC的子集。例如，βIII微管蛋白或NeuN，其表明定型于神经元细胞谱系；或GFAP，其表明定型于胶质细胞谱系。NeuN(神经元细胞核)是神经元特异性核蛋白，其通过与单克隆抗体抗NeuN的免疫反应性来鉴定。NeuN已被鉴定为Fox-3(六核糖核苷酸结合蛋白3)，其作为剪接调节剂起作用。βIII微管蛋白(也称为III类β-微管蛋白或β-微管蛋白III)是几乎完全发现于神经元中的微管蛋白家族的微管元件。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，针对使用这些另外的细胞表面标志物中的一种或多种来选择NSC。

[0145] NSC的存在可以通过本领域已知的任何方法确定，或通过使用本领域技术人员已知的测定或在实施例中描述的那些测定法通过检测细胞表面标志物在表型上进行确定。

[0146] NSC的分离

[0147] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，NSC起源于或分离自以下来源的神经组织样品：新死亡的受试者、来自活体受试者的组织活组织检查或神经干细胞系。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，NSC离体起源于其他细胞，如诱导的多能干细胞(iPS细胞)或成体多能细胞。

[0148] 在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何方法或根据本文所述的方法(例如，从活体受试者细针抽吸小的神经组织样品)来分离NSC。

[0149] 可以通过本领域已知的任何方法从神经组织样品中分离NSC。从组织样品中解离单独细胞的方法是本领域已知的，例如，在美国专利7,547,674和美国专利申请U.S.2006/0239983、2009/0148421、和2009/0180998中。这些参考文献通过引用以其全文并入本文。

[0150] 在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，分离的NSC群体通过以下方法分离。对于来自不同来源的神经组织，本领域技术人员将能够根据需要对该方法进行微小调整。用胶原酶酶促消化一小块神经组织(最小尺寸为至少1立方厘米)以获得单个细胞。重新悬浮小的完整细胞，并且用细胞过滤器去除细胞聚集体。该细胞过滤器步骤是任选的。
然后将细胞与小鼠c-kit抗体一起孵育。分离c-kit阳性细胞并将其用包被有抗小鼠IgG的免疫磁性珠粒收集。

[0151] 在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，然后通过以下方法培养获得的分离的c-kit阳性细胞。本领域技术人员将能够根据需要对该方法进行微小调整。将培养法用于使c-kit阳性NSC生长并扩增c-kit阳性NSC的数量。在标准组织培养条件下，将分离的c-kit阳性细胞铺板在含有F12培养基(GIBCO,格兰岛(Grand Island),纽约州(NY))的补充有5％-10％FBS(GIBCO)和胰岛素-硒-转铁蛋白混合物(西格玛(SIGMA),圣路易斯(St.Louis),密苏里州(MO))的改良F12K培养基中。在达到汇合后，将细胞传代到几个其他板上以使用处理细胞的标准组织培养方案扩增培养物。

[0152] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在用于本文所述的方法之前，使用本领域技术人员可接受的任何方法离体扩增来自本文所述的神经组织的NSC。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将扩增的c-kit阳性NSC进一步分选、分级、处理以去除任何不需要的细胞，或以其他方式操作以使用本领域技术人员可接受的制备用于移植的细胞的任何程序来处理患者。不需要的细胞的例子是恶性肿瘤细胞。

[0153] 在神经组织样品中典型地存在非常少量的NSC，例如，每约一百万个细胞中可能仅存在一个或两个c-kit阳性细胞。因此，通常需要扩增所选择的c-kit阳性NSC以增加本文所述的治疗用途所必需的细胞的数量。在本文所述的治疗用途中移植的更多数量的NSC增加其中使用的疗法的成功率。将NSC用于修复、重建、产生受试者神经组织中的一些受损组织和细胞和/或防止受试者神经组织中的一些受损组织和细胞免受进一步损伤。因此，移植更多的NSC意味着更多的细胞可用于修复、重建和产生新的神经细胞和神经组织，或保护现有的神经细胞或组织免受进一步损伤。在一些实施方案中，移植疗法的成功可以通过本领域已知的任何方法和本文所述的那些方法测量，如本领域技术人员已知的受试者认知功能、运动功能和总体健康状况的改善。

[0154] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将包含NSC的神经组织样品从受试者分离并然后例如通过细胞分选(例如，FACS)进一步加工以获得基本上富集c-kit阳性NSC的群体。在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，基本上富集c-kit阳性NSC的群体是指扩增的NSC的体外或离体培养物。

[0155] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，来自各种来源的神经组织样品是冷冻样品，如在c-kit阳性NSC的提取或选择之前冷冻的或冷冻保存的。神经组织样品获自本文所述的受试者或其他来源，并然后用冷冻保护剂进行冷冻保存。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，来自神经组织样品的分离的c-kit NSC群体在使用前用冷冻保护剂进行冷冻保存。在所述组合物和方法的所有方面的又另一个实施方案中，已经在体外培养物中扩增的分离的c-kit NSC群体在使用前用冷冻保护剂进行冷冻保存。用冷冻保护剂将组织和细胞冷冻保存的方法在本领域是熟知的。用于解冻冷冻保存的组织或细胞以供使用的另外的方法在本领域也是熟知的。

[0156] 如本文所使用的，术语“分离”和“获得或制备的方法”是指一种过程，凭借该过程从受试者或从其最初被发现的神经组织样品中去除细胞或细胞群体(例如NSC群体)。如本文所使用的，术语“分离的群体”是指已经从生物样品中去除和分离的细胞群体，或在这种样品中发现的混合或异质细胞群体。这种混合群体包括例如从神经组织样品中获得的NSC群体。在一些实施方案中，如与从其分离或富集细胞的异质群体相比，分离的群体是基本上纯的细胞群体。在一些实施方案中，分离的群体是分离的c-kit阳性NSC群体。在这方面和本文所述的所有方面的的其他实施方案中，分离的群体包含基本上富集的c-kit阳性NSC群体。在一些实施方案中，将分离的细胞或细胞群体(如c-kit阳性NSC群体)进一步在体外或离体培养(例如，在生长因子或细胞因子的存在下)，以进一步扩增分离的细胞群体或基本上c-kit富集的细胞群体中的细胞的数量。在一个实施方案中，将c-kit阳性NSC群体用SCF、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF进一步在体外或离体培养。可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行这样的培养。在一些实施方案中，将通过本文所公开的方法获得的分离的或基本上富集的c-kit阳性NSC群体随后给予至第二个受试者，或者重新引入最初从其分离细胞群体的受试者中(例如，同种异体移植与自体给予)。

[0157] 关于特定细胞群体，术语“基本上富集的”是指细胞群体相对于构成总细胞群体的细胞是至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％纯的。换句话说，关于分离用于在本文所公开的方法中使用的c-kit阳性NSC群体，术语“基本上富集的”或“基本上纯化的”是指c-kit阳性NSC群体含有少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％或少于1％的不是NSC的细胞，如本文通过术语所限定的。这些方面的一些实施方案进一步涵盖扩增基本上纯的或富集的NSC群体的方法，其中所扩增的c-kit阳性NSC群体也是基本上纯的或富集的c-kit阳性NSC群体。

[0158] 关于细胞群体中的特定标志物存在，术语“基本上阴性”是指细胞群体相对于构成总细胞群体的细胞有不超过约10％、不超过约8％、不超过约6％、不超过约4％、不超过约2％、不超过约1％对该标志物呈阳性。

[0159] 术语“富集”(enriching)或“富集的”(enriched)在本文中可互换使用，并且意指一种类型的细胞(如用于在本文所述的方法中使用的NSC)的产率(分数)比该类型的细胞在起始生物样品、培养物或制品中的分数增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少
75％。最优选地获得用于在本文所述的方法中使用的c-kit阳性NSC群体是至少60％富集的c-kit阳性NSC。

[0160] 在一些实施方案中，将对NSC特异的标志物用于分离或富集这些细胞。如本文所使用的，“标志物”描述了细胞的特征和/或表型。可以将标志物用于选择包含感兴趣的特征的细胞。标志物将随特定细胞而变化。标志物是特别针对一种细胞类型的无论形态学、功能性或生物化学(酶学)的特征、或由该细胞类型表达的分子。优选地，此类标志物是蛋白质，并且更优选地，拥有本领域可获得的抗体或其他结合分子的表位。然而，标志物可以由在细胞中发现的任何分子组成，包括但不限于蛋白质(肽和多肽)、脂质、多糖、核酸和类固醇。形态学特征或性状的例子包括但不限于形状、尺寸、外观(例如，光滑、半透明)和细胞核与细胞质的比。功能性特征或性状的例子包括但不限于粘附于特定底物的能力、结合或排除特定染料的能力、在特定条件下迁移的能力、以及沿着特定谱系分化的能力。可以通过本领域技术人员可用的任何方法检测标志物。

[0161] 因此，如本文所使用的，“细胞表面标志物”是指在细胞表面上表达的任何分子。细胞表面表达通常需要分子拥有跨膜结构域。通常在细胞表面上未发现的一些分子可以通过重组技术进行工程化以在细胞表面上表达。许多天然存在的细胞表面标志物被称为“CD”或“分化簇”分子。细胞表面标志物通常提供抗体可与其结合的抗原决定簇。与本文所述的方法特别相关的细胞表面标志物是CD117或c-kit。根据组合物和方法的有用的NSC优选地表达c-kit，或者换句话说，它们是c-kit阳性的。

[0162] 对于任何细胞表面标志物或其他细胞内标志物，细胞可以被指定为“阳性”或“阴性”，并且这两种名称都可用于本文所述方法的实践。如果细胞在其细胞表面或细胞内以足以使用本领域技术人员已知的方法检测的量表达细胞表面标志物，则该细胞被认为对于该标志物是“阳性的”，该方法例如是使细胞与特异性地结合该标志物的抗体接触，并随后对这种接触细胞进行流式细胞术分析以确定抗体是否与该细胞结合。应当理解，虽然细胞可以表达细胞表面标志物的信使RNA，但是为了被认为针对本文所述的方法是阳性的，细胞必须在其表面上表达该标志物。类似地，如果细胞不以足以使用本领域技术人员已知的方法检测的量表达细胞表面标志物，则该细胞被认为对于该标志物是“阴性的”，该方法例如是使细胞与特异性地结合该标志物的抗体接触，并随后对这种接触细胞进行流式细胞术分析以确定抗体是否与该细胞结合。

[0163] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，对c-kit阳性NSC进行阴性选择，并且该选择使用对细胞表面标志物特异的药剂。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，细胞表面标志物是谱系特异性标志物，如神经元细胞谱系或胶质细胞谱系。

[0164] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在阴性选择(其中使用对谱系标志物特异的药剂)的上下文中，所有的药剂都可以包含相同的标记或标签(如荧光标签)，并因此可以排除或去除对该标记或标签呈阳性的所有细胞，从而留下谱系标志物阴性的NSC、神经祖细胞和/或神经前体细胞用于在本文所述的方法中使用。这是阴性选择，选择那些不与对谱系标志物特异的药剂接触的细胞。

[0165] 因此，如本文所定义的，“对细胞表面标志物或其他细胞内标志物特异的药剂”是指可以选择性地与该细胞表面标志物或其他细胞内标志物反应或结合，但是对另一种细胞表面标志物、其他细胞内标志物或抗原具有很少或没有可检测反应性的药剂。例如，对c-kit特异的药剂不会鉴定或结合CD49e。因此，对细胞表面标志物或其他细胞内标志物特异的药剂识别标志物的独特结构特征。在一些实施方案中，对标志物特异的药剂结合该标志物，但不导致由该标志物介导的下游信号传导事件的起始，例如，非活化的抗体。对细胞表面分子特异的药剂包括但不限于抗体或其抗原结合片段、天然或重组配体、小分子、核酸序列和核酸类似物、细胞内抗体、适配子和其他蛋白质或肽。

[0166] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，用于分离NSC的对细胞表面标志物特异的优选药剂是特异性地结合细胞表面标志物的抗体药剂，并且可以包括多克隆和单克隆抗体、以及其抗原结合衍生物或片段。所熟知的抗原结合片段包括，例如，单结构域抗体(dAb；其基本上由单个VL或VH抗体结构域组成)、Fv片段(包括单链Fv片段(scFv))、Fab片段和F(ab')2片段。用于构建此类抗体分子的方法在本领域是熟知的。因此，如本文所使用的，术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或是指具有Fc(可结晶的片段)区的单克隆或多克隆抗原结合片段或者Fc区的FcRn结合片段。抗原结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。“抗原结合片段”尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双抗体和含有免疫球蛋白的至少一部分的多肽，该至少一部分足以赋予与多肽结合的特异性抗原。术语Fab、Fc、pFc'、F(ab')2和Fv与本领域技术人员已知的标准免疫学含义结合使用，例如，在Klein,“Immunology”(John Wiley,New York,N.Y.,1982)；Clark,W.R.(1986),“The Experimental Foundations of Modern Immunology”(Wiley &Sons,Inc.,New York)中；以及Roitt,I.(1991)“Essential Immunology”,第7版,(Blackwell Scientific Publications,Oxford)中。此类抗体或抗原结合片段可从供应商如R&D Systems、BD Biosciences、e-Biosciences和Miltenyi商购获得，或者可以通过本领域技术人员已知的方法针对这些细胞表面标志物或其他细胞内标志物产生。

[0167] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将对细胞表面分子或其他细胞内标志物特异的药剂(如抗体或抗原结合片段)标记上标签，以促进神经干细胞的分离。如本文所使用的，术语“标记”或“标签”是指能够产生指示靶标的存在(如生物样品中特定细胞表面标志物的存在)的可检测信号的组合物。合适的标记包括荧光分子、放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、化学发光部分、磁性粒子、生物发光部分等。因此，标记是对分离和富集NSC、神经祖细胞和神经前体细胞的方法所必需的可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。

[0168] 如本文所使用的，术语“标记抗体”或“标签抗体”包括通过可检测手段标记的抗体，并且包括但不限于荧光、酶促、放射性和化学发光地标记的抗体。抗体还可以用可检测标签(如c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、或HIS)标记，该可检测标签可以使用对该标签特异的抗体(例如抗c-Myc抗体)检测。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本领域是已知的并且可以被使用。用于标记用于在本发明的方法中使用的抗体的荧光标记或标签的非限制性例子包括羟基香豆素、琥珀酰亚胺酯、氨基香豆素、琥珀酰亚胺酯、甲氧基香豆素、级联蓝(Cascade Blue)、酰肼、太平洋蓝(Pacific Blue)、马来酰亚胺、太平洋橙(Pacific Orange)、荧光黄、NBD、NBD-X、R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy5缀合物(Cychrome，R670，三色，量子红)、PE-Cy7缀合物、Red 613、PE-德克萨斯红(PE-Texas Red)、PerCP、多甲藻素叶绿素蛋白、TruRed(PerCP-Cy5.5缀合物)、FluorX、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、BODIPY-FL、TRITC、X-罗丹明(XRITC)、丽丝胺(Lissamine)罗丹明B、德克萨斯红(Texas Red)、别藻蓝蛋白(APC)、APC-Cy7缀合物、ALEXA 350、ALEXA 405、ALEXA 430、ALEXA488、ALEXA 500、ALEXA 514、ALEXA 532、ALEXA
546、ALEXA 555、ALEXA 568、ALEXA 594、ALEXA
610、ALEXA 633、ALEXA 647、ALEXA 660、ALEXA
680、ALEXA 700、ALEXA 750、ALEXA 790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、
Cy5、Cy5.5或Cy7。

[0169] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，技术人员可获得多种分离基本上纯的或富集的c-kit阳性NSC群体的方法，该方法包括免疫选择技术，如使用流式细胞术方法的高通量细胞分选，用标记于磁性珠粒、可生物降解珠粒、不可生物降解珠粒的抗体、和平移到包括培养皿等表面的抗体的亲和方法，以及此类方法的组合。

[0170] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，可以使用基于珠粒的分选机制(如磁性珠粒)进行NSC群体的分离和富集。在此类方法中，使消化的神经组织样品与包被有针对一种或多种特定细胞表面抗原(如c-kit)的抗体的磁性珠粒接触。这导致样品中表达相应抗原的细胞附着到磁性珠粒上。在允许c-kit阳性细胞结合珠粒一段时间后，将细胞和珠粒的混合物暴露于强磁场，如具有磁铁的柱或架子。附着于珠粒的细胞(表达细胞表面标志物)停留在柱或样品管上，而其他细胞(不表达细胞表面标志物)流过或保留在溶液中。使用该方法，细胞可以相对于特定细胞表面标志物阳性地分离或阴性地分离、或使用其组合分离。

[0171] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将磁性激活细胞分选(MACS)策略用于NSC的分离和预选择。在一些实施方案中，在人类血浆或人类血清白蛋白(HSA)(如2％HSA)的存在下分离NSC。

[0172] 在所述组合物和方法的所有方面的一些优选实施方案中，使用针对细胞表面标志物c-kit的阳性选择分离或富集NSC。

[0173] 如本文所定义的，“阳性选择”是指导致表达特定细胞表面标志物或细胞内蛋白质的细胞分离或富集的技术，而“阴性选择”是指导致不表达特定细胞表面标志物或细胞内蛋白质的细胞分离或富集的技术。可以通过本领域已知的任何方法进行阴性选择。例如，通过去除确实表达感兴趣的标志物的细胞来实施典型的阴性选择。

[0174] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，由本领域技术人员使用本领域已知的标准技术，如商业珠粒缀合试剂盒，可以用抗体包被珠粒。在一些实施方案中，进行阴性选择步骤以去除表达一种或多种谱系标志物的细胞，随后进行荧光激活细胞分选以阳性选择表达一种或多种特定细胞表面标志物的NSC。

[0175] 许多不同的细胞表面标志物在特定分化的细胞谱系上具有特异性表达，并且不被分离用于本文所述的方法中的c-kit阳性NSC表达。因此，当对这些谱系细胞标志物特异的药剂与c-kit阳性NSC接触时，细胞将是“阴性的”。

[0176] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将单独的或与基于磁性珠粒的方法组合的流式细胞术方法用于分离或富集c-kit阳性NSC。如本文所定义的，“流式细胞术”是指通过将微观粒子(如细胞和DNA)悬浮在流体流中并使它们通过电子检测装置来对该微观粒子进行计数和检查的技术。流式细胞术允许每秒同时多参数分析多达数千个粒子的物理和/或化学参数，如荧光参数。现代流式细胞术仪器通常具有多个激光器和荧光检测器。增加激光器和检测器的数量允许通过多种抗体进行标记，并且可以通过其表型标志物更精确地鉴定目标群体。某些流式细胞术仪器可以拍摄单独细胞的数字图像，从而允许对细胞表面内或表面上的荧光信号位置进行分析。

[0177] 流式细胞术技术的常见变体是基于其性质对粒子进行物理分选，以便使用“荧光激活细胞分选”来纯化感兴趣的群体。如本文所定义的，“荧光激活细胞分选”或“基于流式细胞术的分选”方法是指根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，用于将来自单个生物样品的细胞异质混合物每次一个细胞地分选到一个或多个容器中，并提供来自各个细胞的荧光信号的快速、客观和定量记录以及特别感兴趣的细胞的物理分离的流式细胞术方法。因此，在那些实施方案中，当对细胞表面标志物特异的药剂是用可以通过流式细胞仪检测的标签标记的抗体时，荧光激活细胞分选(FACS)可以用于本文所述的方法中并与该方法一起使用以分离和富集NSC群体。

[0178] NSC的扩增

[0179] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，分离的和基本上富集的c-kit阳性NSC群体在其用于本文所述的治疗方法之前进一步扩增以增加数量。

[0180] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，通过使用本文所述的方法和技术分离或富集的c-kit阳性NSC在培养物中扩增，即，在给予至有需要的受试者之前使用本领域技术人员已知的方法在受试者体外使细胞数量增加。

[0181] 在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，根据以下方法将获得的分离的c-kit阳性NSC在培养物中扩增。本领域技术人员将能够根据需要对该方法进行微小调整。在标准组织培养条件(例如，95％空气、5％CO2、37℃)下，将分离的c-kit阳性细胞铺板在含有F12培养基(GIBCO,格兰岛,纽约州)的补充有5％-10％FBS(GIBCO)和胰岛素-硒-转铁蛋白混合物(西格玛公司,圣路易斯,密苏里州)的改良F12K培养基中。在达到汇合后，将来自一个汇合板的细胞传代到几个其他板上以使用处理细胞的标准组织培养方案扩增培养物。

[0182] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，此类扩增方法可以包括，例如，在导致NSC扩增的条件下，在补充有细胞因子和/或生长因子(如SCF、IGF-1、HGF、bFGF和/或NGF)的无血清培养基中培养c-kit阳性NSC。通过基质金属蛋白酶-2的表达和激活，HGF正向地影响细胞迁移。该酶家族破坏细胞外基质中的屏障，从而促进干细胞运动、归巢和组织恢复。类似地，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是促有丝分裂的、抗凋亡的并且是神经干细胞增殖和分化所必需的。以可比较的方式，IGF-1通过增加干细胞数量和保护其活力来影响干细胞。bFGF刺激中胚层起源的所有细胞、以及神经外胚层、外胚层和内胚层起源的许多细胞的增殖。bFGF是体外内皮细胞的趋化和促有丝分裂剂，并且诱导神经分化、存活和再生。已经显示它在调节胚胎发育和分化中是至关重要的，并且它可以在体内调节血管生成、组织修复、胚胎发育和神经元功能中起作用。NGF是主要参与某些靶神经元的生长、维持、增殖和存活的调节的神经肽。已经鉴定了涉及NGF的许多生物学过程，其中两个是胰腺β细胞的存活和免疫系统的调节。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，可以进一步将c-kit阳性NSC与因子一起和/或在旨在诱导NSC分化为神经元和/或胶质细胞的条件下，如使用补充有地塞米松和/或生长因子和细胞因子的组合的无血清培养基进行培养。

[0183] 在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，通过调整不超过约0.5％的纳米技术或纳米工程方法来扩增c-kit阳性NSC，如在Lu J等人“, A Novel Technology for Hematopoietic Stem Cell Expansion using Combination of Nanofiber and Growth Factors.”Recent Pat Nanotechnol.2010 4(2):125-35中所综述的。例如，在一些实施方案中，可以进行干细胞微环境的纳米工程。如本文所使用的，分泌因子、干细胞-相邻细胞相互作用、细胞外基质(ECM)和机械性质共同组成“干细胞微环境”。干细胞微环境纳米工程可以包括使用微/纳米图案表面、纳米粒子控制释放生长因子和生化制品、纳米纤维模拟细胞外基质(ECM)、纳米级合成阵列生物材料、自组装肽系统模拟干细胞信号簇、纳米线、激光制造的纳米槽、和纳米相薄膜扩增NSC。

[0184] 在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，对c-kit阳性NSC进行遗传操作，例如用外源核酸进行转染。纳米工程可以用于NSC中的转染和遗传操作，如纳米粒子用于体内基因递送、纳米针用于基因递送至NSC、自组装肽系统用于NSC转染、纳米线用于基因递送至NSC、和微/纳米流体设备用于NSC电穿孔。

[0185] 在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，可以使用生物反应器来扩增分离或富集用于所述方法中的c-kit阳性NSC。

[0186] 当在NSC扩增的上下文中使用时，术语“增加的”(increased)、“增加”(increase)或“扩增”(expand)通常意指NSC的数量增加了统计学上显著的量；为了避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”、“扩增”或“扩增的”(expanded)意指如与参考水平相比，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至多并包括100％的增加，或者如与对照或参考水平相比，至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、至少约9倍、或至少约10倍增加、或10倍或更多倍的任何增加。本文使用对照/参考样品或水平来描述从相同生物来源获得的细胞群体，该细胞群体例如尚未使用本文所述的方法扩增，例如，处于扩增培养的开始或添加到扩增培养物中的细胞的初始数量。

[0187] 神经组织样本和/或神经干细胞的储存

[0188] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在使用之前，即在提取、分离或选择其中的c-kit阳性NSC之前储存神经组织样品。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在提取或选择其中的c-kit阳性NSC之前储存经消化的神经组织样品。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，储存分离的c-kit阳性NSC。在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，在储存之前首先分离和/或扩增c-kit阳性NSC。在一个实施方案中，储存是通过冷冻保存。当需要用于本文所述的治疗方法时，将NSC解冻。

[0189] 在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将神经组织样品或分离的c-kit阳性NSC(扩增的或其他)在其用于本文所述的方法之前冷冻。冷冻样品可以在一种或多种不同的冷冻保护剂的存在下进行，以使冻融过程期间的细胞损伤最小化。例如，可以使用二甲亚砜(DMSO)、海藻糖或蔗糖。

[0190] 在再生医学中NSC的给予和用途

[0191] 本文所述的某些实施方案是基于小鼠神经组织中躯体干细胞的发现，以及这些小鼠神经干细胞(mNSC)可以修复神经性疾病或障碍小鼠模型中的受损神经组织。当将mNSC置于具有受损神经组织的小鼠中时，可以发生给予的mNSC的长期植入并且这些mNSC可以分化成神经元，例如，其可以导致随后的神经元再生和修复。该实验可以指示分离的c-kit阳性NSC是否可以用于神经组织再生和神经性疾病或障碍的治疗。

[0192] 因此，本文提供了用于治疗和/或预防有需要的受试者中的神经性疾病或障碍的方法。如本文所使用的，术语“神经性疾病或障碍”、“神经性疾病”、“神经性病症”和“神经性障碍”可互换使用。这些方法中的一些涉及通过注射、通过导管系统或其组合向受试者给予治疗有效量的分离的c-kit阳性NSC。在这些方法的一些方面，将治疗有效量的分离的c-kit阳性NSC通过血管给予、直接给予至组织、或其组合。这些方法特别针对治疗性和预防性治疗患有神经性疾病或障碍或处于神经性疾病或障碍风险的人类受试者，例如患有阿尔茨海默病或多发性硬化的受试者。可以将本文所述的分离的或富集的c-kit阳性NSC给予至所选的受试者，该受试者具有任何神经性疾病或障碍或倾向于发生神经性疾病或障碍，该给予可以通过导致受试者的有效治疗的任何适当的途径。在本文所述的治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在给予细胞之前首先选择患有神经性疾病或障碍的受试者。

[0193] 术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如，可以从其获得用于在本文所述的方法中使用的细胞的人类(即，供体受试者)和/或使用如本文所述的细胞对其提供治疗(包括预防性治疗)的人类(即受体受试者)。为了治疗对特定动物如人类受试者特异的那些病症或失调状态，术语受试者是指该特定动物。如本文可互换使用的“非人类动物”和“非人类哺乳动物”包括哺乳动物，如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人类灵长类动物。术语“受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受试者是哺乳动物，如人类，或其他哺乳动物，如驯养的哺乳动物，例如狗、猫、马等，或食品生产哺乳动物，例如牛、绵羊、猪等。

[0194] 因此，在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，受试者是受体受试者，即，对其给予分离的c-kit阳性NSC的受试者，或供体受试者，即从其获得包含c-kit阳性NSC的神经组织样品的受试者。受体或供体受试者可以是任何年龄。在一些实施方案中，受试者是“幼年受试者”，在本文中定义为小于10岁的受试者。在其他实施方案中，受试者是“婴儿受试者”，在本文中定义为小于2岁的受试者。在一些实施方案中，受试者是“新生儿受试者”，在本文中定义为小于28日龄的受试者。在一个优选实施方案中，受试者是人类成体。

[0195] 在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，被给予的分离的c-kit阳性NSC群体包含从一个或多个供体获得的同种异体NSC。如本文所使用的，“同种异体的”是指从相同物种的一个或多个不同供体获得的NSC或包含NSC的神经组织样品，其中在一个或多个基因座处的基因不相同。例如，向受试者给予的分离的c-kit阳性NSC群体可以获自如下神经组织，该神经组织获自一个或多个不相关的供体受试者或获自一个或多个异卵同胞或其他来源。在一些实施方案中，使用同系的分离的c-kit阳性NSC群体，如从遗传上相同的动物或从同卵双胞胎获得的那些。在这方面的其他实施方案中，分离的c-kit阳性NSC是自体NSC。如本文所使用的，“自体”是指从受试者获得或分离并且给予至同一受试者的NSC或包含c-kit阳性NSC的神经组织样品，即供体和受体是相同的。

[0196] 神经性疾病或障碍是在神经组织中发生或导致神经组织不能恰当工作的任何疾病或障碍。神经性疾病或障碍可以包括但不限于卒中、脑出血、脊髓损伤、亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、巴藤病和/或共济失调性毛细血管扩张。

[0197] 本文所述的方法可以用于治疗、改善症状，预防和/或减缓许多神经性疾病或其症状的进展，例如导致神经结构的病理性损伤的那些。术语“神经性疾病或障碍”、“神经性疾病”、“神经性病症”和“神经性障碍”在本文中可互换使用，并且是指与神经组织(包括神经元和胶质细胞)的结构或功能有关的任何病症和/或障碍。此类神经性疾病包括但不限于卒中、脑出血、脊髓损伤、亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、巴藤病和/或共济失调性毛细血管扩张。

[0198] 在这些病症中的一些中，其中炎症在病症的病理学中起作用，与c-kit NSC一起使用的治疗剂可以通过减少来自炎症的损伤来改善或减缓病症的进展。在其他情况下，与c-kit NSC一起使用的治疗剂可以起到限制病原体复制或病原体相关的神经组织损伤的作用。

[0199] 如本文所使用的，在将本发明的细胞(例如，c-kit阳性NSC)通过如下方法或途径置于受试者中的上下文中，术语“给予”、“引入”、“移植”和“植入”可互换使用，该方法或途径导致所引入的细胞至少部分定位于所希望的部位(如损伤或修复部位)，使得产生所希望的效果。细胞例如c-kit阳性NSC或其分化后代(例如，胶质细胞)可以直接植入神经组织，或者可选地通过任何适当的途径给予，该途径导致递送至受试者中的所希望位置，在该位置处至少一部分的植入细胞或细胞的组分保持存活。在给予至受试者后细胞活力的时间可以短至几小时，例如二十四小时、至几天、至长达几年，即长期植入。例如，在本文所述的治疗方法的所有方面的一些实施方案中，通过直接注射将有效量的分离或富集的分离的c-kit阳性NSC群体直接给予至患有例如卒中的个体的神经组织。在本文所述的治疗方法的所有方面的其他实施方案中，分离和富集的c-kit阳性NSC群体经由间接全身给予途径如导管介导的途径进行给予。

[0200] 本发明的一个实施方案包括使用基于导管的方法来递送注射剂。导管的使用排除了更具侵入性的递送方法，如外科手术打开身体以进入神经组织。如本领域技术人员所知，通过更微创的手术将允许最佳的恢复时间，如这里所概述的，该手术包括导管方法。导管方法包括使用诸如NOGA导管或类似系统等技术。NOGA导管系统通过提供感兴趣的区域的机电定位、以及可以用于递送靶向注射或用治疗剂沐浴目标区域的可伸缩针来促进引导给予。通过使用这样的系统来递送注射剂或提供治疗剂，可以给予本发明的任何实施方案。本领域技术人员将识别替代性系统，该替代性系统还提供通过整合成像和可以与本发明一起使用的导管递送系统来提供靶向治疗的能力。有关NOGA和类似系统的使用的信息可以在例如Sherman,W.(2003)Basic Appl.Myol.13(1):11-14；Patel,A.N.等人(2005)The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 130(6):1631-1638；以及Perrin,E.C.等人(2003)Circulation 107:2294-2302中找到；其每一个的文本以其全文并入本文。

[0201] 当预防性地提供时，可以在神经性疾病或障碍的任何症状前面将分离和富集的c-kit阳性NSC给予至受试者。因此，分离或富集的c-kit阳性NSC群体的预防性给予用来预防神经性疾病或障碍，或如本文所公开的神经性疾病或障碍的进一步进展。

[0202] 当治疗性地提供时，在神经性疾病或障碍的症状或迹象发作时(或之后)，例如在阿尔茨海默病发作时，提供分离和富集的c-kit阳性NSC。

[0203] 如本文所使用的，术语“治疗”(treat、treatment、treating)或“改善”(amelioration)是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、减少、抑制或减缓与疾病或障碍相关的病症的进展或严重性。术语“治疗”(treating)包括减少或减轻与神经性疾病相关的病症、疾病或障碍(例如但不限于阿尔茨海默病)的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物降低，则治疗通常是“有效的”，如本文对该术语所定义的。可选地，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括停止或至少减缓在没有治疗的情况下预期的症状的进展或恶化。有益或希望的临床结果包括但不限于一种或多种症状减轻、疾病的程度减小、疾病状态稳定(即，不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和、和无论是可检测的还是不可检测的缓解(无论是部分还是全部)。在一些实施方案中，“治疗”(treatment和treating)还可以意指如果受试者未接受治疗，则与预期存活相比受试者的存活延长。

[0204] 如本文所使用的，术语“预防”是指预防性(prophylactic或preventative)措施，其中目的是预防或延迟疾病或障碍的发作，或延迟与疾病或障碍相关的症状的发作。在一些实施方案中，“预防”是指减缓病症的进展或严重性或与神经性疾病或障碍相关的神经性功能的恶化。

[0205] 在另一个实施方案中，神经性疾病或障碍的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的解除(包括姑息治疗)。例如，在记忆、认知能力和/或运动功能方面的任何改善，无论多么轻微，都将被认为是减轻的症状。在本文所述的方面的一些实施方案中，与对照或未治疗的受试者相比，在给予分离和富集的NSC群体后，疾病或障碍的症状或测量参数减轻了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。

[0206] 测量的或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物，例如升高或降低水平的临床或生物学标志物，以及与疾病或障碍的症状或标志物的临床上接受的规模相关的参数。然而，应当理解，如本文所公开的组合物的总用量将由主治医生在合理的医学判断范围内决定。所需的确切的量将取决于诸如所治疗的神经性疾病或障碍的类型、损伤程度、目标是治疗还是预防还是两者、受试者的年龄，可用的细胞的量等因素而变化。因此，本领域技术人员意识到治疗可以改善疾病状况，但可能不完全治愈该疾病。

[0207] 在所述治疗方法的所有方面的一个实施方案中，如本文所使用的术语“有效量”是指减轻神经性疾病或障碍的至少一种或多种症状所需的分离或富集的c-kit阳性NSC群体的量，并且涉及足以提供所希望的效果(例如治疗患有帕金森病的受试者)的药理成分的量。因此，术语“治疗有效量”是指使用如本文所公开的治疗方法在给予至典型的受试者(如患有帕金森病或处于帕金森病的风险的受试者)时足以产生特定效果的分离和富集的c-kit阳性NSC的量。

[0208] 在所述方法的所有方面的另一个实施方案中，如本文所使用的有效量还将包括足以预防或延迟疾病的症状发展、改变疾病症状的过程(例如但不限减缓疾病症状的进展)、或甚至逆转疾病症状的量。特定效果所需的c-kit阳性细胞的有效量将随每个个体而变化，并且还将随所处理的神经性疾病或障碍的类型而变化。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定适当的“有效量”。

[0209] 在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在根据本文所述的方法给予细胞之前，首先将受试者诊断为患有影响神经组织的疾病或障碍。在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在给予细胞之前，首先将受试者诊断为处于发生神经性疾病或障碍的风险，例如，个体具有阿尔茨海默病的遗传倾向或具有患有阿尔茨海默病的近亲属。

[0210] 为了在本文所述的治疗方法的所有方面中使用，有效量的分离的c-kit阳性NSC包含每次给予至少102、至少5X 102、至少103、至少5X 103、至少104、至少5X 104、至少105、至少2X 105、至少3X 105、至少4X 105、至少5X 105、至少6X 105、至少7X 105、至少8X 105、至少9X
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10 、或至少1X 10个c-kit阳性NSC或其倍数。在一些实施方案中，向受试者进行分离的c-kit阳性NSC的一次以上的给予。分离的c-kit阳性NSC的多次给予可以在一段时间内发生。
c-kit阳性NSC可以从一个或多个供体中分离或富集，或者可以从自体来源获得。

[0211] 用于在本文所述的方法中使用的NSC和其他药剂的示例性给予模式包括但不限于注射、输注、吸入(包括鼻内)、摄入和直肠给予。“注射”包括但不限于静脉内、动脉内、导管内、直接注射到组织心室内、心脏内、经气管注射和输注。如本文所使用的短语“肠胃外给予”(parenteral administration和administered parenterally)是指除肠内和局部给予以外的给予模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、心室内、心脏内、经气管注射和输注。在一些实施方案中，c-kit阳性NSC可以通过导管给予到组织中。

[0212] 在所述治疗方法的所有方面的优选实施方案中，将有效量的分离的c-kit阳性NSC通过注射给予至受试者。在其他实施方案中，将有效量的分离的c-kit阳性NSC通过导管介导的系统给予至受试者。在其他实施方案中，将有效量的分离的c-kit阳性NSC通过血管给予至受试者、直接给予至组织或其组合。

[0213] 在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，通过全身给予(如静脉内给予)将有效量的分离和富集的c-kit阳性NSC给予至受试者。

[0214] 如本文所使用的，短语“全身给予”、“全身地给予”、“外周给予”和“外周地给予”是指除直接给予以外将NSC群体给予到神经组织中，使得其代替进入受试者的循环系统。

[0215] 在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在受试者中使用一种或多种给予途径以实现不同的效果。例如，通过直接注射和导管介导的途径两者向受试者给予分离或富集的c-kit阳性NSC群体，用于治疗或修复受损神经组织。在此类实施方案中，分离或富集的c-kit阳性NSC的不同有效量可以用于每种给予途径。

[0216] 在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，该方法进一步包括给予一种或多种治疗剂，如药物或分子，该治疗剂可以增强或加强通过给予分离或富集的c-kit阳性NSC介导的作用，如增强NSC的归巢或植入、增加神经细胞的修复、或增加神经细胞的生长和再生。治疗剂可以是蛋白质(如抗体或抗原结合片段)、肽、多核苷酸、适配子、病毒、小分子、化学化合物、细胞、药物等。

[0217] 如本文所定义的，“血管再生”是指在损伤或创伤(如本文所述，包括但不限于神经性疾病)后从头形成新血管或替换受损血管(例如毛细血管)。“血管生成”是可互换地用于描述这种现象的术语。

[0218] 在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，该方法进一步包括给予c-kit阳性NSC连同本领域已知的生长、分化和血管生成剂或因子，以刺激神经组织中的细胞生长、分化和血管生成。在一些实施方案中，这些因子中的任何一种可以在给予本文所述的组合物之前或之后递送。还可以发生这些因子中的任何一种的多个后续递送以诱导和/或增强植入、分化和/或血管生成。合适的生长因子包括但不限于转化生长因子-β(TGFβ)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、促血管新生蛋白因子(angiopoietin)、表皮生长因子(EGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)。其他例子描述于Dijke等人,"Growth Factors for Wound Healing",Bio/Technology,7:793-798(1989)；Mulder GD,Haberer PA,Jeter KF,编辑Clinicians'Pocket Guide to Chronic Wound Repair.第4版Springhouse,PA:Springhouse Corporation；1998:85；Ziegler T.R.,Pierce,G.F.,和Herndon,D.N.,1997,International Symposium on Growth Factors and Wound Healing:Basic Science&Potential Clinical Applications(Boston,1995,Serono Symposia USA),出版社:Springer Verlag中，并且这些文献通过引用以其全文特此并入。

[0219] 在一个实施方案中，组合物可以包括一种或多种生物活性剂以诱导受损组织的愈合或再生，如从周围组织募集血管形成细胞以为新生血管提供连接点。合适的生物活性剂包括但不限于药学活性化合物、激素、生长因子、酶、DNA、RNA、siRNA、病毒、蛋白质、脂质、聚合物、透明质酸、促炎性分子、抗体、抗生素、抗炎剂、反义核苷酸和转化核酸或其组合。其他生物活性剂可以促进细胞生长和细胞分化的有丝分裂增加。

[0220] 本领域已知许多生长因子和分化因子用来刺激干细胞和祖细胞的细胞生长和分化。合适的生长因子和细胞因子包括能够刺激、维持和/或动员祖细胞的任何细胞因子或生长因子。它们包括但不限于干细胞因子(SCF)、粒细胞-菌落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、基质细胞衍生因子-1、青灰因子、血管内皮生长因子(VEGF)、TGFβ、血小板衍生的生长因子(PDGF)、促血管新生蛋白因子(Ang)、表皮生长因子(EGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素像生长因子(IGF-1)、神经生长因子(NGF)、白细胞介素(IL)-3、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11和IL-
13、菌落刺激因子、促血小板生成素、促红细胞生成素、fit3-配体和肿瘤坏死因子α。其他例子描述于Dijke等人,"Growth Factors for Wound Healing",Bio/Technology,7:793-798(1989)；Mulder GD,Haberer PA,Jeter KF,编辑Clinicians'Pocket Guide to Chronic Wound Repair.第4版Springhouse,PA:Springhouse Corporation；1998:85；Ziegler T.R.,Pierce,G.F.,和Herndon,D.N.,1997,International Symposium on Growth Factors and Wound Healing:Basic Science&Potential Clinical Applications(Boston,1995,Serono Symposia USA),出版社:Springer Verlag中。

[0221] 在所述治疗方法的所有方面的一个实施方案中，所描述的组合物是在合适的生理学载体溶液如盐水中的NSC悬浮液。悬浮液可以含有另外的生物活性剂，该生物活性剂包括但不限于药学活性化合物、激素、生长因子、酶、DNA、RNA、siRNA、病毒、蛋白质、脂质、聚合物、透明质酸、促炎性分子、抗体、抗生素、抗炎剂、反义核苷酸和转化核酸或其组合。

[0222] 在所述治疗方法的所有方面的某些实施方案中，生物活性剂是“促血管生成因子”，其是指直接或间接促进新血管形成的因子。促血管生成因子包括但不限于表皮生长因子(EGF)、E-钙粘素、VEGF、血管生成素(angiogenin)、促血管新生蛋白因子-1、成纤维细胞生长因子(酸性(aFGF)和碱性(bFGF))、纤维蛋白原、纤连蛋白、乙酰肝素酶、肝细胞生长因子(HGF)、促血管新生蛋白因子、低氧可诱导因子-1(HIF-1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、IGF、BP-3、血小板衍生的生长因子(PDGF)、VEGF-A、VEGF-C、色素上皮衍生的因子(PEDF)、血管通透性因子(VPF)、玻连蛋白(vitronection)、瘦素、三叶肽(TFF)、CYR61(CCN1)、NOV(CCN3)、瘦素、中期因子、胎盘生长因子、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生的生长因子-BB(PDGF-BB)、多效生长因子(PTN)、颗粒蛋白前体、多育曲菌素、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、c-Myc、粒细胞菌落刺激因子(G-CSF)、基质衍生因子1(SDF-1)、散射因子(SF)、骨桥蛋白、干细胞因子(SCF)、基质金属蛋白酶(MMP)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、多效生长因子、多育曲菌素、卵泡抑素、胎盘生长因子(PIGF)、中期因子、血小板衍生的生长因子-BB(PDGF)、和曲动蛋白(fractalkine)、以及作为血管生成和增加血管分布的诱导物的炎性细胞因子和趋化因子、例如白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-8(IL-8)、CCL2(MCP-1)、白细胞介素-8(IL-8)和CCL5(RANTES)。一种或多种治疗剂的合适剂量可以包括约0.1ng/ml至约500ng/ml、约10ng/ml至约500ng/ml、约20ng/ml至约500ng/ml、约30ng/ml至约500ng/ml、约50ng/ml至约500ng/ml、或约80ng/ml至约500ng/ml的浓度。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂的合适剂量为约10ng/ml、约25ng/ml、约45ng/ml、约60ng/ml、约75ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约425ng/ml、约450ng/ml、约475ng/ml、或约500ng/ml。在其他实施方案中，一种或多种治疗剂的合适剂量为约0.6μg/ml、约0.7μg/ml、约0.8μg/ml、约0.9μg/ml、约1.0μg/ml、约1.5μg/ml、或约2.0μg/ml。

[0223] 在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，该方法进一步包括给予一种或多种表面活性剂作为治疗剂，或者可以与一种或多种表面活性剂疗法组合使用。如本文所使用的，表面活性剂是指任何表面活性试剂，包括但不限于润湿剂、表面张力抑制剂、洗涤剂、分散剂和乳化剂。特别优选的是来自肺泡表面上的单分子层的那些，包括但不限于脂蛋白、卵磷脂、磷脂酰甘油(PG)、二棕榈酰-磷脂酰胆碱(DPPG)、脱辅基蛋白A、脱辅基蛋白B、脱辅基蛋白C、脱辅基蛋白D、棕榈酰油酰、磷脂酰甘油棕榈酸和鞘磷脂。示例性表面活性剂包括但不限于表面活性剂蛋白A、表面活性剂蛋白B、表面活性剂蛋白C、表面活性剂蛋白D、及其混合物和组合。可商购的表面活性剂包括但不限于KL-4、牛脂质提取物表面活性剂(BLES)、 HL-10、
/ALEC、和

[0224] 在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，一种或多种其他标准治疗剂的给予可以与给予富集的c-kit阳性NSC组合以治疗神经性疾病或障碍(例如卒中或帕金森病)，包括使用抗胆碱能药物、β-2-肾上腺素能受体激动剂(如福莫特罗或沙美特罗)、皮质类固醇、抗生素、抗氧化剂、抗高血压剂、一氧化氮、咖啡因、地塞米松和IL-10或其他细胞因子。在一些实施方案中，将所包括的标准治疗剂用于治疗神经性疾病的症状。

[0225] 例如，在本文所述的方法中使用c-kit阳性NSC来治疗、改善或减缓诸如帕金森病等病症的进展可以任选地与其他合适的治疗或治疗剂组合。对于帕金森病，这包括但不限于左旋多巴、卡比多巴-左旋多巴、单胺氧化酶B抑制剂、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)抑制剂、抗胆碱能药、金刚烷胺、外科手术和/或锻炼、或其中的任何组合。

[0226] 在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，标准治疗剂是已经详细描述的那些，参见例如，Harrison's Principles of Internal Medicine,增刊第15版,2001,E.Braunwald等人,编辑,McGraw-Hill,New York,N.Y.,ISBN0-07-007272-8,尤其是在第1456-1526页的第252-265章；Physicians Desk Reference增刊第54版,2000,第303-3251页,ISBN 1-56363-330-2,Medical Economics Co.,Inc.,Montvale,N.J.。使用本文所述的治疗方案可以实现任何神经性疾病或障碍的治疗。对于慢性病症，可以使用间歇给药来减少治疗频率。间歇给药方案如本文所述。

[0227] 对于本文所述的方法的临床用途，本文所述的分离或富集的富集的c-kit阳性NSC群体可以与导致在受试者中有效治疗的任何药学上可接受的化合物、材料、载体或组合物一起给予。因此，用于在本文所述的方法中使用的药物配制品可以含有分离或富集的c-kit阳性NSC群体与一种或多种药学上可接受的成分的组合。

[0228] 术语“载体”是指与治疗剂一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内给予药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果希望，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释配制品等形式。组合物可以被配制成栓剂，使用传统的粘合剂和载体如甘油三酸酯。口服配制品可以包括标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的例子描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Gennaro编(Mack Publishing Co.,1990)。配制品应该符合给予模式。

[0229] 在一个实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更特别地在人体内使用。具体地，它是指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物组织接触使用而没有过多的毒性、刺激性、过敏反应、或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

[0230] 如本文所使用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质(例如干细胞培养基)、包封材料、制造辅助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、钙或锌、或硬脂酸)或溶剂包封材料，其参与维持分离或富集的NSC群体的活性、将该分离或富集的NSC群体从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的另一部分。

[0231] 在与配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)磷酸盐缓冲溶液；(3)无热原质水；(4)等渗盐水；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(17)粉末黄蓍胶；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，如乙醇；(25)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；和(26)药物配制品中使用的其他无毒相容物质。润湿剂、着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于配制品中。术语如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。

[0232] 定义

[0233] 除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。这里收集了在本文中、在说明书、实施例和权利要求书中使用的某些术语。

[0234] 如本文所使用的，在体内(in vivo)(“活体内”(within the living)的拉丁语)是指使用整个活的生物体(如人类受试者)的那些方法。如本文所使用的，“离体”(ex vivo)(拉丁语：活体外(out of the living))是指在受试者的体外进行的那些方法，并且是指其中从活的受试者中取出器官、细胞或组织用于手术的那些程序，例如，从获自供体受试者的神经组织中分离c-kit阳性NSC，并然后将分离的c-kit阳性NSC样品给予至受体受试者。如本文所使用的，“在体外”(in vitro)是指在受试者外部进行的那些方法，如体外细胞培养实验。例如，在根据本文所述的方法使用或给予之前，可以在体外培养分离的c-kit阳性NSC以扩增或增加c-kit阳性NSC的数量，或者以将NSC直接分化成特定谱系或细胞类型，例如胶质细胞。

[0235] 如本文所使用的术语“多能的”是指细胞具有在不同的条件下定型成一种或多种特定细胞类型谱系并分化成超过一种分化细胞类型的定型谱系，并且优选地分化成所有三个生殖细胞层特有的细胞类型的能力。多能细胞的特征主要在于，使用例如裸鼠畸胎瘤形成测定法，它们能够分化成超过一种细胞类型，优选地分化成所有三个生殖层。胚胎干(ES)细胞标志物的表达也证明了多能性，但是多能性的优选测试是证明分化成三个生殖层中每一层的细胞的能力。应该注意的是，简单地培养此类细胞本身并不使它们具有多能性。相对于通常仅具有在培养物中进行有限数目的分裂的能力的原代细胞亲本，重新编程的多能细胞(例如，iPS细胞，如本文对该术语所定义的)也具有延长传代而不丧失生长潜力的能力的特征。

[0236] 本文所使用的术语“祖细胞”是指相对于其可以通过分化产生的细胞，具有更加原始的细胞表型的细胞(即，是处于沿发育途径或进展的较早期步骤，而不是完全分化或最终分化的细胞)。通常，祖细胞还具有显著的或非常高的增殖潜力。祖细胞可以产生多种不同的分化细胞类型或产生单一分化细胞类型，这取决于发育途径和取决于这些细胞发育和分化所处的环境。祖细胞产生特定确定谱系的前体细胞，例如，某些神经祖细胞分裂以产生神经元细胞谱系前体细胞。这些前体细胞分裂并产生最终分化成例如多巴胺能神经元的许多细胞。

[0237] 本文使用的术语“前体”细胞是指具有比最终分化细胞更加原始但是比沿其相同发育途径的干细胞或祖细胞较不原始的细胞表型的细胞。“前体”细胞典型地是“祖”细胞的子代细胞，该子代细胞是“干细胞”的一些子细胞。典型的不对称细胞分裂中的子细胞之一承担干细胞的作用。

[0238] 术语“胚胎干细胞”用于指胚胎囊胚的内细胞团的多能干细胞(参见美国专利号5843780、6200806)。此类细胞可以类似地获自从体细胞核移植起源的囊胚的内细胞团(参见，例如，美国专利号5945577、5994619、6235970)。胚胎干细胞的区别特征定义了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞拥有胚胎干细胞的一种或多种独特特征使得该细胞可以与其他细胞区分开，则该细胞具有胚胎干细胞的表型。示例性胚胎干细胞区别特征包括但不限于基因表达谱、增殖能力、分化能力、核型、对特定培养条件的响应性等。

[0239] 术语“成体干细胞”用于指从非胚胎组织(包括胎儿、幼体和成体组织)起源的任何多能干细胞。在一些实施方案中，成体干细胞可以是非胎儿起源的。已经从各种各样的成体组织中分离出干细胞，包括血液、骨髓、脑、嗅上皮、皮肤、神经组织、骨骼肌和心肌。可以基于基因表达、因子响应性和培养物中的形态来表征这些干细胞中的每一种。示例性成体干细胞包括神经干细胞、神经嵴干细胞、间质干细胞、造血干细胞和神经干细胞。如上所述，已经发现干细胞几乎驻留在每个组织中。因此，本发明理解到干细胞群体可以从几乎任何动物组织中分离。

[0240] 在细胞个体发育的上下文中，形容词“分化的”(differentiated或differentiating)是相对术语，意指“分化的细胞”是比与其进行比较的细胞在发育途径中进一步向下发展的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制的前体细胞(如神经干细胞)，其转而又可以分化成途径进一步往下的其他类型的前体细胞(如神经元或胶质前体)，并然后分化成在某种组织类型中起特征性作用的终末期分化细胞，并且可能保留或可能不保留进一步增殖的能力。

[0241] 术语“分化的细胞”意指在其天然形式下不是多能的任何原代细胞，如如本文对该术语所定义的。以另一种方式表述，术语“分化的细胞”是指在细胞分化过程中从较不特化的细胞类型的细胞(例如，干细胞，如神经干细胞)衍生的更加特化的细胞类型的细胞。不希望受理论限制，在正常个体发育过程中的多能干细胞可以首先分化成神经元或胶质细胞。神经干细胞的进一步分化导致各种神经细胞类型的形成，包括胆碱能神经元、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、运动神经元、中间神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或小胶质细胞。

[0242] 如本文所使用的，术语“体细胞”是指形成生物体的身体的任何细胞，与生殖细胞相反。在哺乳动物中，生殖细胞(也称为“配子”)是精子和卵子，它们在受精过程中融合以产生一种称为受精卵的细胞，整个哺乳动物胚胎从该受精卵发育。哺乳动物体内的每种其他细胞类型-除了精子和卵子以外，从其制造它们的细胞(配子体)和未分化的干细胞-是一种体细胞：内脏、皮肤、骨骼、血液和结缔组织全部都是由体细胞组成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚胎体细胞”，其意指不存在于胚胎中或不是从胚胎获得的体细胞并且不起因于这种细胞在体外的增殖。在一些实施方案中，体细胞是“成体体细胞”，其意指存在于除胚胎或胎儿以外的生物体中或从除胚胎或胎儿以外的生物体获得的细胞或者起因于这种细胞在体外的增殖。

[0243] 如本文所使用的，术语“成体细胞”是指胚胎发育后在整个身体中发现的细胞。

[0244] 术语“表型”是指在一组特定的环境条件和因子下定义细胞或生物体的一种或许多种总生物学特征，而不管实际的基因型。例如，细胞中细胞表面标志物的表达。

[0245] 如本文提及的术语“细胞培养基”(cell culture medium)(本文也称为“培养基”(culture medium)或“培养基”(medium))是用于培养细胞的含有维持细胞活力和支持增殖的营养物的培养基。细胞培养基可以包含以适当的组合的任何以下物质：一种或多种盐、一种或多种缓冲液、氨基酸、葡萄糖或一种或多种其他糖、抗生素、血清或血清替代物和其他组分如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。

[0246] 术语“更新”或“自我更新”或“增殖”在本文中可互换使用，用于指干细胞通过在长时期和/或好几个月到几年内分裂成相同的非特化细胞类型来更新它们自己的能力。

[0247] 在一些情况下，“增殖”是指通过将单个细胞重复分裂成两个相同的子细胞来扩增细胞。

[0248] 本文使用的术语“谱系”描述具有共同祖先的细胞或具有共同发育命运的细胞。

[0249] 如本文所使用的术语“分离的细胞”是指已经从最初发现其的生物体中除去的细胞或这种细胞的后代。任选地，细胞已经在体外培养，例如，在其他细胞的存在下。任选地，后来将细胞引入第二个生物体中或重新引入其被分离的生物体(或其被传下来的细胞)中。

[0250] 如本文所使用的，关于分离的细胞群体，术语“分离的群体”是指已经从混合或异质细胞群体中去除和分离的细胞群体。在一些实施方案中，如与从其分离或富集细胞的异质群体相比，分离的群体是基本上纯的细胞群体。

[0251] 术语“组织”是指一起执行某些特殊功能的一组或一层特化的细胞。术语“组织特异的”是指来自特定组织的细胞来源。

[0252] 术语“减少了”(decrease)、“降低了”(reduced)、“降低”(reduction)、“减少”(decrease)或“抑制”全部在本文中通常用于意指减少了统计学上显著的量。然而，为了避免疑问，“降低了”(reduced)、“降低”(reduction)或“减少”(decrease)或“抑制”(inhibit)典型地意指如与参考水平相比减少了至少约5％-10％，例如减少了至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％减少(即，如与参考样品相比缺少的水平)，或如与参考水平相比在10％-90％之间的任何减少。在治疗或预防的上下文中，参考水平是在没有给予c-kit阳性NSC群体的情况下受试者的症状水平。

[0253] 术语“增加了”(increased)、“增加”(increase)或“增强”(enhance)全部在本文中通常用于意指增加了统计学显著的量；为了避免任何疑问，术语“增加了”、“增加”或“增强”意指如与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％增加或更多，或如与参考水平相比在10％-90％之间的任何增加，或如与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加、或在2倍与10倍之间的任何增加或更多。在c-kit阳性NSC体外扩增的上下文中，参考水平是从神经组织样品中分离的c-kit阳性NSC的初始数量。

[0254] 术语“以最低水平表达”是指如通过qRT-PCR、FACS、免疫沉淀反应、蛋白质印迹、ELISA、微阵列、Nanostring、质谱或本领域已知的其他分子定量技术测量的，神经标志物如βIII微管蛋白、NeuN和/或GFAP在分离的c-kit阳性神经干细胞中的有限表达。神经元和/或胶质标志物的最低表达水平典型地意指相对于c-kit表达，每种标志物以对该标志物不超过约10％、不超过约8％、不超过约6％、不超过约4％、不超过约2％、不超过约1％呈阳性或更少进行表达，如通过本领域技术人员已知的分子测定法确定的。

[0255] 术语“统计学上显著的”或“显著的”是指统计学显著性，并且通常意指比标志物的正常浓度低两个标准偏差(2SD)或更低。该术语是指存在差异的统计证据。它被定义为当零假设实际为真时作出拒绝该零假设的决定的概率。通常使用p值作出该决定。

[0256] 如本文所使用的，术语“包含”(comprising或comprises)用于指对本发明必不可少的组合物、方法及其相应的一种或多种组分，但存在未指定的要素(无论是否必不可少)的可能性。

[0257] 术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其相应的一种或多种组分，其不包括在该实施方案的描述中未列举的任何要素。

[0258] 除非另外说明，否则在此使用的所有技术和科学术语具有如本公开文本所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学中常见术语的定义可以在以下文献中找到：Benjamin Lewin,Genes IX,由Jones&Bartlett Publishing出版,2007(ISBN-13:9780763740634)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。

[0259] 除非另有说明，否则使用例如在以下文献中的本领域技术人员已知的标准程序执行本发明：Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1982)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1989)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1986)；Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)(Fred M.Ausubel等人编辑,John Wiley and Sons,Inc.),Current Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan等人编辑John Wiley and Sons,Inc.),Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等人编辑,John Wiley and Sons,Inc.),Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique由R.Ian Freshney著,出版社：Wiley-Liss；第5版(2005)以及Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology,第57卷,Jennie P.Mather和David Barnes编辑,Academic Press,第1版,1998)，它们全部通过引用以其全文并入本文。

[0260] 应该理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并因此可以变化。本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。

[0261] 除了在操作实施例中以外或者在另外指明的情况下，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应该理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”将意指±1％。

[0262] 出于说明和公开的目的，所鉴定的所有专利和出版物均明确地通过引用并入本文，例如，此类出版物中描述的方法论可能与本发明结合使用。提供这些出版物仅仅是因为它们的公开在本申请的提交日期之前。在这方面的任何内容都不应被解释为承认诸位发明人无权凭借在先发明或出于任何其他原因而先于这种公开。关于日期的所有陈述或关于这些文件内容的表述均基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

[0263] 通过以下实施例进一步阐明本发明，其不应解释为限制。贯穿本申请引用的所有参考文献的内容以及附图均通过引用并入本文。

[0264] 本领域技术人员将认识或能够使用不超过常规实验确定，本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物、不同的培养基和补充物可以用于培养扩增分离的细胞。本领域技术人员将能够进行测试以评价培养基和补充剂的选择。此类等同物旨在被以下权利要求书涵盖。

[0265] 在本文和整个说明书中引用的参考文献通过引用并入本文。

[0266] 实施例

[0267] 诸位发明人已经使用干细胞抗原c-kit作为鉴定和表征神经原发细胞的标志物。使用c-kit表位帮助揭示自我更新、可形成克隆和多能的神经干细胞(NSC)的库。这些NSC能够再生成包括谱系阴性细胞、祖细胞和/或谱系阳性细胞的细胞。谱系阳性细胞表达βIII微管蛋白、NeuN或GFAP。

[0268] 材料和方法

[0269] 小鼠NSC

[0270] 干细胞获自小鼠脑样本的齿状回(DG)和脑室下区(SVZ)。选择这些区域是因为据报道在这些解剖区域中出现神经发生。

[0271] 为了分离小鼠神经干细胞(mNSC)，使用在诸位发明人的实验室中开发的用于收集和扩增人类心脏干细胞的适应方案来解离组织片段。通过重复吸移和暴露于含有蛋白酶的溶液对组织片段进行机械和酶促解离，以获得单细胞悬浮液。将细胞用针对c-kit的磁性免疫珠粒(Miltenyi公司)分选，并且在分选后，通过免疫细胞化学定义细胞表型。然后在补充有5％-10％FBS(Gibco)和胰岛素-硒-转铁蛋白混合物(西格玛公司)的F12培养基(Gibco)中培养推定的小鼠NSC。对于免疫细胞化学，当可能时，用荧光染料(Molecular Probes)直接标记第一抗体以避免交叉反应。通过共聚焦显微镜分析免疫标记。

[0272] 克隆测定

[0273] 将未分选的分离的神经细胞以有限稀释度铺板在超低附着培养皿中，以有利于形成多细胞聚集体，即神经球。然后将神经球解聚并再次将单细胞悬浮液铺板数次(亚克隆)，以获得高度富集干细胞的克隆神经球。浮球的形成表明该制品中存在祖细胞。

[0274] mNSC的分化

[0275] 通过免疫细胞化学定义亚克隆神经球中包含的细胞的表型。评价了不同神经细胞类型特异的谱系标志物的表达。

[0276] 实施例1

[0277] 鉴定小鼠脑组织切片中的c-kit阳性细胞

[0278] 将小鼠脑的组织样品进行免疫标记以确定c-kit阳性细胞是否存在于神经组织中。使用针对c-kit和针对GFAP(针对星形胶质细胞的标志物)、Sox2(祖细胞标志物)、βIII微管蛋白(神经元特异性标志物)和NeuN(神经元特异性标志物)的抗体通过免疫组织化学分析细胞。

[0279] 在体内检测在圆形形状和小尺寸的细胞中的c-kit的表达。这些细胞不表达谱系定型的标志物(图1)。图1A显示齿状回中对GFAP(红色)(针对星形胶质细胞的标志物)呈阴性的的c-kit阳性(绿色)细胞。类似地，图1B显示对GFAP(绿色)呈阴性的c-kit阳性(红色)细胞。此外，神经c-kit阳性细胞显示祖细胞标志物，这一发现支持该细胞库的原始状态的观察(图2)。图2显示了对于祖细胞标志物Sox2(白点)也呈阳性的c-kit阳性(绿色)细胞。

[0280] 有时，发现c-kit与神经细胞的谱系标志物相关。这些观察结果表明，在c-kit阳性细胞与分化的脑细胞之间存在线性关系(图3)。图3A-图3B显示c-kit(绿色)与βIII微管蛋白(红色，图3A)和NeuN(白色，图3B)一起表达。

[0281] 实施例2

[0282] 神经干细胞的克隆形成和多能性

[0283] 典型地通过实施神经球测定来证明神经干细胞的克隆形成。通过传代产生神经球的长期能力导致选择库中的真正的干细胞。在神经球内发现了单独的或与谱系标志物组合的c-kit表达。这些观察结果提供了神经c-kit阳性细胞的克隆形成和多能性的证据。

[0284] 图4提供了培养7-14天后源自未分选细胞的神经球的例子。

[0285] 在用c-kit受体的配体SCF刺激后的第2代，细胞簇显现紧密且良好分离(图5)。第2代的神经球的免疫标记揭示一个表达c-kit(绿色)、NeuN(灰色)和GFAP(红色)的神经球，而另一个神经球对所有三种标志物均为阴性(图6A，单独的标志物信号和DAPI染色；图6B，三种标志物信号和DAPI染色的合并)。

[0286] 在第4代，神经球的核心含有c-kit阳性(绿色)、谱系阴性细胞，而神经球的外层表达神经元标志物GFAP(红色)(图7)。

[0287] 在第4代，将神经球转移到附着型培养皿中(图8)，并随后进行染色。图9中的图像是部分地共表达神经元的谱系标志物(GFAP，红色；NeuN，灰色)的c-kit阳性(绿色)细胞。

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