PRRSV亚单位疫苗
专利汇可以提供PRRSV亚单位疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且有效对抗PRRSV的 疫苗 ，其包含至少一部分PRRSV ORF1。这种疫苗一旦给予，可在PRRSV易感的动物中诱发免疫应答。而且，本 发明 组合物提供针对PRRSV而发生且包括对抗PRRSV的保护性免疫的免疫应答，并降低PRRSV严重性和/或PRRSV发病率。可单独使用ORF1的 选定 部分，彼此组合，与其它PRRSV ORF组合，以及与其它PRRSV疫苗组合使用。，下面是PRRSV亚单位疫苗专利的具体信息内容。
1.一种能够诱导针对PRRSV的免疫应答的疫苗，所述疫苗包含：
PRRSV ORF1 DNA的第一部分，所述部分具有来自所述PRRSV ORF1 DNA的至少21个连续核苷酸；以及
合适的药物载体。
2.如权利要求1所述的疫苗，所述部分具有来自以下序列的至少150个连 续核苷酸：与SEQ ID No 1-14中任一序列具有至少85％序列相同性的序列，或 它们的组合。
3.如权利要求2所述的疫苗，所述部分选自以下序列：与SEQ ID No 1-6、 9、10中的任一序列具有至少85％序列相同性的序列，或它们的组合。
4.如权利要求1所述的疫苗，其还包含来自PRRSV的一部分DNA，其选 自：来自除ORF1以外的PRRSV ORF的至少21个连续核苷酸，来自PRRSV ORF1的至少21个连续核苷酸，或它们的组合。
5.如权利要求1所述的疫苗，其还包含有效诱导针对PRRSV感染的免疫 应答的另一种组合物。
6.如权利要求1所述的疫苗，所述PRRSV ORF1来源于PRRSV强毒株。
7.如权利要求1所述的疫苗，其还包含选自以下的成分：佐剂、赋形剂或 它们的组合。
8.一种在易受PRRSV感染的动物中诱导针对PRRSV的免疫应答的方法， 所述方法包括以下步骤：
给予所述动物一种组合物，所述组合物包含来自一部分PRRSV ORF1 DNA 的至少21个连续核苷酸；以及
引发对所述免疫应答的所述诱导。
9.如权利要求8所述的方法，其还包括第二次给予所述组合物的步骤。
10.如权利要求8所述的方法，所述部分包含选自以下序列的至少150个 连续核苷酸：与SEQ ID No 1-14中任一序列具有至少85％序列相同性的序列， 或它们的组合。
11.如权利要求10所述的方法，所述部分选自以下序列：与SEQ ID No 1-6、 9、10中的任一序列具有至少85％序列相同性的序列，或它们的组合。
11.如权利要求9所述的方法，所述组合物还包含第二DNA部分，其选 自：来自除ORF1以外的PRRSV ORF的至少21个连续核苷酸，来自ORF1的 至少21个连续核苷酸，或它们的组合。
13.如权利要求9所述的方法，所述组合物还包含有效诱导针对PRRSV 感染的免疫应答的第二组合物。
14.如权利要求9所述的方法，所述组合物还包含选自以下的成分：佐剂、 赋形剂或它们的组合。
15.一种载体，所述载体包含PRRSV ORF1 DNA的至少一部分。
16.如权利要求15所述的载体，所述载体是质粒。
17.如权利要求15所述的载体，所述PRRSV ORF1 DNA部分包含来自 PRRSV ORF1 DNA的至少21个连续核苷酸。
18.如权利要求17所述的载体，所述PRRSV ORF1 DNA部分具有来自以 下序列的至少150个连续核苷酸：与SEQ ID No 1-14中任一序列具有至少85％ 序列相同性的序列，或它们的组合。
19.如权利要求1所述的载体，所述载体还包含PRRSV DNA的第二部分， 其选自：来自除ORF1以外的PRRSV ORF的至少21个连续核苷酸，来自ORF1 的至少21个连续核苷酸，或它们的组合。
20.如权利要求15所述的载体，所述PRRSV DNA来源于PRRSV强毒株。
21.一种细胞，所述细胞包含具有来自PRRSV ORF1 DNA的至少21个连 续核苷酸的质粒。
22.如权利要求21所述的细胞，所述质粒还包含来自以下序列的至少150 个连续核苷酸：与SEQ ID No 1-14中任一序列具有至少85％序列相同性的序列， 或它们的组合。
23.如权利要求21所述的细胞，所述质粒还包含PRRSV DNA的第二部分， 其选自：来自除ORF1以外的PRRSV ORF的至少21个连续核苷酸，来自ORF1 的至少21个连续核苷酸，或它们的组合。
24.如权利要求21所述的细胞，所述PRRSV DNA来源于PRRSV强毒株。
发明领域
本发明广泛地涉及用于猪生殖和呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRS)的疫苗。具体地说，本发明涉及通过给予包 含PRRS病毒(PRRSV)DNA亚单位的疫苗在猪中预防PRRS。更具体地说， 本发明涉及DNA亚单位疫苗中开放读码框1(ORF1)的应用，ORF1为猪提供对 抗PRRSV的保护性免疫。甚至更具体地说，本发明涉及ORF1选定部分的单 独使用及其与PRRSV基因组中的其它部分联用，或与对抗PRRSV的其它疫苗 联用。
现有技术的描述
PRRS是全球猪产业中的主要疾病。PRRS是由PRRSV感染引起的。目前， 可获得修饰的活疫苗(MLV)，其正确使用可给猪提供对抗PRRSV感染引起的 临床疾病的保护。PRRS MLV疫苗需要在接受免疫接种的动物中复制，以确保 诱导有效的免疫应答(例如，参见Meng，X.J.，猪生殖和呼吸综合征病毒的异 质性：目前疫苗有效性与未来疫苗发展的预示(Heterogeneity of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus：Implications for Current Vaccine Efficacy and Future Vaccine Development)；74Vet.Micro.，309-329(2000))。 然而，这种复制的问题在于，疫苗接种后PRRS MLV可在动物中持续存在几周， 并且还可散播至其它PRRSV-阴性猪。在一些没有良好生物安全措施以防止 PRRSV MLV从接受免疫接种的动物散播到其它PRRSV-阴性群体的猪群中， PRRS MLV从接受免疫接种动物的散播是一个问题。虽然已使用了数以百万计 的PRRS MLV而没有发生问题，但文献中还是有一些关于PRRS MLV恢复成 毒力更强的野生型PRRSV强毒株的零星报道。解决PRRS MLV散播和可能恢 复毒力等问题的尝试也已通过利用由灭活PRRS病毒(即PRRS KV)构成的疫苗 进行。但是，研究发现，虽然PRRS KV可在接受免疫接种的猪中诱导强的体 液应答，但它不能有效防止PRRS-相关疾病。
因此，本领域需要能够诱导保护性免疫应答而不存在PRRS MLV相关问题 的免疫接种的方法和疫苗。优选地，给予的疫苗不会在接受免疫接种的动物中 主动复制，并可诱导强的体液和细胞介导的免疫应答。
发明概述
本发明通过提供PRRSV DNA疫苗解决了现有技术所固有的问题，并实现 了本领域的显著进展。理论上，表达PRRS抗原的DNA疫苗质粒可用作合成 PRRSV抗原的模板(即类似于PRRS MLV)，而且还具有在动物中不进行主动复 制的特征(即类似于PRRS KV)。尚不知道诱导对抗PRRSV的保护性宿主应答 所需的保护性免疫原。由于PRRS MLV可在接受免疫接种的猪中诱导保护性应 答，认为PRRS MLV在接受免疫接种的动物中的复制必将在接受免疫接种的动 物中诱导强的体液和细胞介导的免疫应答。
PRRSV的ORF1编码PRRSV复制和新的后代产生所需的复制结构。ORF1 具有称为ORF1a和ORF1b的两个区域，它们包括ORF1复制酶复合物(Dea等， 猪生殖和呼吸综合征(Prrs)病毒结构蛋白的目前进展：北美和欧洲隔离群的比较 (Current Knowledge on the Structural Proteins of Procine Reproductive and Respiratory Syndrome(Prrs)Virus：Comparison of the North American and European Isolates)；145(4)Archives of Virology，659-688(2000))。认为编码复制 酶的蛋白质在其它病毒家族中是关键的免疫原(Leitner等，基于DAN和RNA 的疫苗：原理、进展和前景)(DAN and RNA-Based Vaccines：Principles，Progress and Prospects)；18Vaccine 765-777(2000))。当细胞感染PRRSV时，由于细胞 感染期间复制酶相关抗原的表达，病毒复制酶的活性可提供有力的辅助作用。 复制酶相关抗原可用作感染细胞中产生的“危险信号”，并诱导强的宿主免疫 应答(即IFN、HSP、凋亡)。因此，复制酶相关“危险信号”可能是为何受激发 时PRRS MLV能够诱导保护作用而非复制性PRRS(即PRRS KV中的灭活抗原) 不会引起保护作用的关键因素所在。
ORF1的长度接近12,000个核苷酸，使其在真核细胞中难以转染和充分表 达。因此，采用表达文库免疫(ELI)为工具，将ORF1依序和任意地分成较小的 区段，以确定各种病原体的保护性免疫原。ELI将特定病原体的基因组剪切成 小片段，可将小片段克隆入DNA疫苗载体、然后给予宿主，以确定任意片段 是否能够诱导免疫应答(Johnston and Barry；Genetic to Genomic Vaccination；15 (8)808-809(1997))。优选地，免疫应答是保护性的。本发明是基于以下假设： 宿主针对ORF1-产生的蛋白质的免疫应答是防止PRRSV激发所必需的。在 DNA疫苗载体中设置编码PRRSV ORF 2-7的区域相对较容易，因为这些ORF 的长度为317-720个核苷酸。如上所述，PRRSV中ORF1区的大小接近12,000 个核苷酸长度。将这样大小的区域设置入DNA疫苗载体中会导致在真核细胞 中不能转录和后续表达。因此，需要使ORF1区域断裂形成较小的区段，以更 好地确保ORF1所有区域的充分表达。已采用表达文库免疫(ELI)为工具来确定 各种病原体的保护性免疫原。ELI利用将特定病原体的基因组剪切成小的片段。 这些小片段克隆入DNA疫苗载体，然后给予宿主，以确定任意片段是否能够 诱导保护性免疫应答。在这里，已改进ELI技术，用于开发由PRRSV基因组 的ORF1编码区依序组成的PRRSV DNA疫苗。该方法称为SELI(顺序表达文 库免疫，sequential expression library immunization)。这不同于采用整个ORF1 区域作为DNA疫苗的Barfoed等(具有PRRS病毒开放读码框1-7的猪DNA疫 苗(DNA Vaccination of Pigs with Open Reading Frame1-7 of PRRS Virus)；22 Vaccine，3628-3641(2004))的所述。
本发明疫苗可仅仅包含PRRSV ORF1部分、与PRRSV ORF1的其它部分 组合，并与可有效产生对抗PRRSV感染的免疫应答的其它组合物(如其它 PRRSV疫苗)一起。适用于本发明目的的ORF1部分具有足够的大小，以在接 受疫苗的动物中激发免疫应答。优选地，该部分包括高达约9,000个碱基对， 更优选地，该ORF-1部分包括约21-9,000个连续的核苷酸碱基对，更优选约 21-6,000个连续的核苷酸碱基对，甚至更优选约21-3,000个连续的核苷酸碱基 对，更优选约21-2,000个连续的核苷酸碱基对，甚至更优选约21-1,000个连续 的核苷酸碱基对，更优选约21-500个连续的核苷酸碱基对，甚至更优选约 21-300个连续的核苷酸碱基对，更优选约21-150个连续的核苷酸碱基对，甚至 更优选约21-75个连续的核苷酸碱基对，更优选约21-50个连续的核苷酸碱基 对，甚至更优选约21-25个连续的核苷酸碱基对，更优选约21-23，最优选至少 约21个连续的核苷酸碱基对。由这些优选部分中的任一种形成的蛋白质也是 本发明的一部分。可将来自任何PRRSV株的任何ORF1或其部分用于本发明 的目的，但是，优选使用具有毒力的株。
可将一个或多个选定部分克隆入合适的表达载体。合适的表达载体的例子 包括腺病毒载体、志贺氏菌属载体、pVC1650(Valentis，Inc.，Burlingame， California)、WRG720(W.R.Grace，New York，New York)和pcDNA3 (Invitrogen，Carlsbad，California)。一些优选的载体包含立即早期巨细胞病毒 启动子、内含子A和多聚a腺苷酰化部分(例如，牛生长激素(BGH)或人生长激 素(HGH))。此外，例如采用杆状病毒表达系统，可在昆虫细胞培养物中表达纯 化的PRRSV蛋白。然后可将该蛋白质与佐剂组合并给予。当然，本领域技术 人员可以选择能够在真核细胞中介导各种PRRSV ORF表达的合适的表达系统 和载体。优选地，在将各部分ORF1克隆入合适的表达载体之后，验证克隆的 方向。
在本发明的一个实施例中，选择用于本发明的PRRSV病毒VR-2332。利 用Genbank U87392产生13个ORF1的重叠克隆。该ORF1包括12,071个核苷 酸碱基对。该部分大小为773-975个bp。克隆用字母A-M表示，克隆A(SEQ ID No.2)为939个bp，克隆B(SEQ ID No.3)为957个bp，克隆C(SEQ ID No.4) 为976个bp，克隆D(SEQ ID No.5)为954个bp，克隆E(SEQID No.6)为939 个bp，克隆F(SEQ ID No.7)为957个bp，克隆G(SEQ ID No.8)为957个bp， 克隆H(SEQ ID No.9)为852个bp，克隆I(SEQ ID No.10)为917个bp，克隆 J(SEQ ID No.11)为972个bp，克隆K(SEQID No.12)为966个bp，克隆L(SEQ ID No.13)为783个bp，克隆M(SEQID No.14)为774bp。克隆A-H来自ORF1 的区域1a，克隆I-M来自ORF 1的区域1b。克隆A采用可靠(authentic)的 ORF1A ATG起始密码子。其余ORF1克隆的5起始端加有框内ATG起始密码 子。将这些克隆各自克隆入DNA表达载体pVC1650。该载体包含立即早期巨 细胞病毒启动子和内含子A，并在真核细胞中引导各种PRRSV ORF的表达。 表1提供了关于各个克隆以及各克隆来自哪个核苷酸序列区域的信息。
表1
BIV PRRSV ORF1a/1b顺序表达文库免疫(SELI)克隆 SEQ ID ORF1 SELI 克隆 大小 (碱基 对) 克隆的 区域 克隆的核苷酸跨 距(采用Genbank U87392作为对 照) 克隆入表达 载体 pVC1650的 状态和验证 的方向 使用猪抗 -PRRSV恢复 期血清转染后 的IFA反应 2 A 939 ORF1a 190-1128 √ 3 B 957 ORF1a 1126-2082 √ 4 C 976 ORF1a 2082-3057 √ 5 D 954 ORF1a 3037-3990 √ 6 E 939 ORF1a 3985-4923 √ 7 F 957 ORF1a 4924-5880 √ - 8 G 957 ORF1a 5863-6819 √ - 9 H* 852 ORF1a 6808-7659 √ 10 I* 917 ORF1b 7735-8651 √ - 11 J 972 ORF1b 8634-9605 √ 弱 12 K 966 ORF1b 9588-10553 √ - 13 L 783 ORF1b 10536-11318 √ - 14 M 774 ORF1b 11298-12071 √ -
*附注：原始H和I克隆侧接ORF1a/1b减去1个移码区域，并设计新的引物以产生 稍微较小的RT-PCR产物。
然后，将各部分用于各种组合中，以及单独用于在含有其它PRRSV ORF的疫 苗制剂中。
在另一个实施例中，将克隆A-M和ORF2-6的克隆克隆入pVC1650表达 载体，将ORF7的克隆克隆入WRG720表达载体。当然，本领域技术人员能够 选择合适的载体。此外，可通过标准技术，例如但不限于通用分子克隆、诱变 和化学核酸合成技术，产生本发明的核酸序列。为了本发明的目的，本发明涵 盖了与克隆A-M中任一个具有至少75％序列相同性，更优选至少75％，甚至 更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至 少95％，甚至更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列相同性的 DNA序列。
在本发明的一方面，将各克隆A-M作为疫苗组分单独使用。通过任何常 规方法进行的给药，用疫苗免疫动物。给予方法的例子包括：口服、经皮、静 脉内、皮下、肌内、眼内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内、 肺内、或它们的任意组合。优选的给予方式是肌内、皮下和鼻内给药。需要或 必要时，可以各种间隔进行一次或几次增强免疫接种。给予上述疫苗后，动物 中发生免疫应答，用PRRSV有毒形式激发后，PRRSV感染在发病率和/或严重 性方面的临床症状降低。
在本发明的另一方面，如上所述，给予动物克隆A-M的组合。这种组合 包含两种或多种上述克隆。因为使用猪抗-PRRSV恢复期血清转染后，这些克 隆中的某些克隆(A，B，C，D，E，H和J)可引起IFA反应，所以在本发明中 优选这些克隆的组合。
在本发明的另一方面，克隆A-M(无论单独使用或联合使用，如上所述)与 疫苗制剂中PRRSV的其它一种或多种ORF联合使用。合适的ORF包括ORF 2-7。
在本发明的另一方面，将PRRSV ORF DNA与其它PRRSV疫苗组合。优 选地，该疫苗能够在加入PRRSV ORF1 DNA之前有效诱导免疫应答。
在本发明的又一方面，提供了一种载体。本发明载体具有插入其中的包含 至少一部分PRRSV ORF1 DNA的外来DNA(并非来自载体)。在优选的形式中， 载体是质粒。优选地，该PRRSV ORF1 DNA部分具有来自PRRSV ORF1 DNA 的至少21个连续核苷酸。在一些优选的形式中，该部分具有来自以下序列的 至少150个连续核苷酸：与SEQ ID No 1-14中任一个具有至少85％序列相同 性的序列以及它们的组合。对于组合物本身而言，序列相同性的百分比和序列 长度可变化，如上所述。在其它优选的形式中，载体还包含第二部分的PRRSV DNA。第二部分选自：来自除ORF1以外的PRRSV ORF的至少21个连续核苷 酸、来自ORF1的至少21个连续核苷酸，以及它们的组合。在具有附加的来自 ORF1的21个连续核苷酸的实施方式中，该21个核苷酸与第一部分PRRSV ORF1 DNA中包含的至少21个核苷酸不同。还优选用于构建载体的PRRSV DNA来源于PRRSV强毒株。
本发明的另一方面包括含有本发明质粒的宿主细胞。这就包括通过引入上 述各ORF1片段产生的质粒。优选地，细胞包含具有来自PRRSV ORF1 DNA的 至少21个连续核苷酸的质粒。在其它优选的形式中，细胞包含具有来自以下 序列的至少150个连续核苷酸的质粒：与SEQ ID No 1-14中的任一个具有至少 85％序列相同性的序列，以及它们的组合。在另一些优选的形式中，细胞中的 质粒包含第二部分PRRSV DNA，其选自：来自除ORF1以外的PRRSV ORF 的至少21个连续核苷酸，来自ORF1的至少21个连续核苷酸，以及它们的组 合。优选地，用于构建细胞所含质粒的PRRSV DNA来源于PRRSV毒性株。
在本发明的另一方面，本发明组合物适用于在动物中诱导免疫应答以及完 全防止或降低PRRSV感染导致的病症和症状的严重性的方法中。
本发明组合物可包含药学上可接受的佐剂、载体和/或赋形剂。
如本文所用，将采用以下定义：“序列相同性”如本领域所知，指两个或 多个多肽序列或是两个或多个多核苷酸序列之间的关系，即参比序列和要与参 比序列进行比较的给定序列之间的关系。序列相同性的测定是如下进行的：使 序列最适对齐以产生最高程度的序列相似性之后，比较给定序列与参比序列来 确定序列相同性，如通过这些序列串之间的匹配所确定的那样。通过比对，基 于位置关系确定序列相同性，例如如果在某一特定位置，核苷酸或氨基酸残基 相同，则该位置处的序列是“相同”的。然后，将这种位置相同性的总数除以 参比序列中核苷酸或残基的总数，得到％序列相同性。可通过已知方法容易地 计算序列相同性，包括但不限于以下文献中所述的方法：《计算机分子生物学》 (Computational Molecular Biology)，Lesk，A.N.编，Oxford University Press， New York(1988)，《生物计算机：信息学与基因组计划》(Biocomputing： Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，Academic Press，New York (1993)；《序列数据的计算机分析》(Computer Analysis of Sequence Data)，第 一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，New Jersey(1994)； 《分子生物学中的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinge，G.，Academic Press(1987)；《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.和Devereux，J.编，M.Stockton Press，New York(1991)； 以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)，这 些文献的教导包括在此作为参考。确定序列相同性的优选方法被设计成能使待 测序列间达到最大匹配。在确定给定序列间的序列相同性的公众可获得的计算 机程序中规定了确定序列相同性的方法。这些程序的例子包括但不限于：GCG 程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research，12(1)：387(1984))、BLASTP、 BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)。 BLASTX程序可从NCBI和其它来源公开获得(BLAST Manual，Altschul，S.等， NCVI NLM NIH Bethesda，MD 20894，Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.， 215：403-410(1990)，它们的内容包括在此作为参考)。这些程序利用缺省缺口 权重(default gap weight)对序列进行最适比对，使得给定序列与参比序列之间产 生最高水平的序列相同性。作为例子，核苷酸序列与参比核苷酸序列具有至少， 例如，95％“序列相同性”的多核苷酸表示，给定多核苷酸的核苷酸序列与参 比序列相同，只是每100个参比核苷酸序列的核苷酸中，给定多核苷酸序列最 多可包含5点突变。换言之，在核苷酸序列与参比核苷酸序列具有至少95％相 同性的多核苷酸中，参比序列中最多5％的核苷酸可缺失或被其它核苷酸所取 代，或占参比序列中核苷酸总量最多5％的一定数量的核苷酸可插入参比序列 中。参比序列的这些突变可发生在参比核苷酸序列的5’或3’末端位置或末端位 置间的任意位置，这些改变可各自散布在参比序列的核苷酸间或以一个或多个 连续组散布在参比序列中。类似地，给定氨基酸序列与参比氨基酸序列具有至 少，例如95％序列相同性的的多肽表示，多肽的给定氨基酸序列与参比序列 相同，只是每100个参比氨基酸序列的氨基酸中，给定多肽序列最多可包含5 个氨基酸变化。换言之，为了获得与参比氨基酸序列具有至少95％序列相同性 的给定多肽序列，参比序列中最多5％的氨基酸残基可缺失或被其它氨基酸所 取代，或可将占参比序列中氨基酸残基总量最多5％的一定数量的氨基酸插入 参比序列中。参比序列的这些改变可发生在参比氨基酸序列氨基或羧基端位 置，或这些末端位置间的任意位置，这些可各自散布在参比序列的残基间或以 一个或多个连续组散布在参比序列中。优选地，不相同的残基位置因保守氨基 酸取代而不同。但是，当确定序列相同性时，并不将保守取代视为匹配。
类似地，如本文所用，“序列同源性”也指确定两个序列相关性的方法。 为了确定序列同源性，如上所述对两个或多个序列进行最适比对，需要时可引 入缺口。但是，与“序列相同性”不同，当测定取代序列同源性时，将保守氨 基酸取代计为匹配。换言之，为了获得与参比序列具有95％序列同源性的多肽 或多核苷酸，参比序列中的95％氨基酸残基或核苷酸必需匹配或包含用其它氨 基酸或核苷酸的保守取代，或可将占参比序列中总的氨基酸残基或核苷酸最多 5％的一定数量的氨基酸或核苷酸(不包括保守取代)插入参比序列中。
“保守取代”指氨基酸残基或核苷酸被具有相似特征或性质(包括大小、疏 水性等)的其它氨基酸残基或核苷酸所取代，使得整体功能性没有显著改变。
“分离的”指从其天然状态进行“人工手动”改变，即如果天然存在，则 从其原始环境改变或除去，或同时改变和除去。例如，活体中天然存在的多核 苷酸或多肽不是“分离的”，但从其天然状态共存物质中分离的相同多核苷酸 或多肽是“分离的”，如本文所用。
“核酸”指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，以及合适的话，核糖核 酸(RNA)。该术语还应理解为包括作为等价形式的从核苷酸类似物制备的RNA 或DNA的类似物，并且可应用于所述单链(正义或反义)和双链多核苷酸的实施 方式。
“启动子”指调节可操作地连接于启动子的选定DNA序列的表达的DNA 序列，影响选定DNA序列在细胞中的表达。该术语包括“组织特异性”启动 子，即仅在特定细胞(例如特殊组织的细胞)中影响选定DNA序列的表达。该术 语还包括所谓的“遗漏”启动子，它主要在一种组织中调节选定DNA的表达， 但在其它组织也能够引起表达。该术语还包括非组织特异性启动子，以及组成 型表达或可诱导的启动子(即可控制表达水平)。
“转染”指通过由核酸介导的基因转移而将核酸导入(即通过表达载体) 受体细胞。如本文所用，“转化”指由于细胞摄取外源性DNA或RNA而导致 的细胞基因型改变的过程，例如，转化细胞表达重组形式的多肽，或者在从转 移基因进行反义表达的情况下，天然存在形式的该蛋白质表达被打断。转染也 可使用化学试剂(即脂质)。
术语“载体”指能够转运它所连接的其它核酸的核酸分子。一种优选的载 体是游离基因，即能够染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自主复制和/ 或表达它们所连接的核酸的载体。能够指导其可操作地连接的基因的表达的载 体在本文中被称为“表达载体”。一般来说，重组DNA技术中采用的表达载 体常常是“质粒”的形式，通常指环状双链DNA，在其载体形式中不结合染色 体。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用形式 的载体。载体也可包括其它复制子，例如噬菌体或粘粒(comsmid)，其中可插入 其它DNA区段，以使插入的区段复制。本发明旨在包括上述产生等价作用的 其它形式的表达载体，它们在本领域迄今为止已知的。
核酸或多核苷酸的“扩增”指导致形成一拷贝或多拷贝核酸或多核苷酸分 子(指数扩增)或仅形成一拷贝或多拷贝核酸或多核苷酸分子互补链(线性扩增) 的任何方法。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)，该方法基于变性、寡核苷酸 引物退火以及嗜热模板依赖性多核苷酸聚合酶导致的引物延伸的重复循环，导 致与引物侧接的多核苷酸分析物的所需序列的拷贝指数级增加。对可与DNA 的相对链退火的2个不同引物进行定位，从而使得一个引物的聚合酶催化延伸 产物可用作另一个引物的模板链，导致长度为所述寡核苷酸引物5’端之间的距 离所限定的不连续双链片段的累积。引导这种扩增的试剂包括寡核苷酸引物、 核苷酸聚合酶和三磷酸核苷，例如，脱氧三磷酸腺苷(dATP)、脱氧三磷酸鸟苷 (dGTP)、脱氧三磷酸胞苷(dCTP)和脱氧三磷酸胸苷(dTTP)。其它扩增方法包括： 使用单一寡核苷酸引物的单链多核苷酸扩增、连接酶链式反应(LCR)、基于核 酸序列的扩增(NASBA)、Q-β-复制酶方法和3SR。
本文所引用的所有参考文献的教导和内容清楚地包括在此作为参考。
优选实施方案详述
以下实施例列出了本发明的优选实施方案。但是，应理解，提供这些实施 例是为了说明，而不是要限制本发明的总体范围。
实施例1
本实施例提供了关于含有PRRSV基因组各区域的DNA疫苗效力的数据。 实施例从获自Spring Prairie Colony，Hawley，MN 56549的40只PRRSV-阴性 混合性别猪开始。试验开始时猪为3-4周龄。在整个研究中为动物提供足以满 足其大小、年龄和状况的食物。随意饮水。
为得到PRRSV DNA疫苗，从PRS病毒产生19个cDNA克隆。产生的13 个cDNA克隆按顺序代表PRRSV基因组的开放读码框(ORF)1a/1b区域。克隆 A利用可靠的ORF1a ATG起始密码子。剩下的ORF 1a/1b克隆B-M具有分别 加在5’端的ATG起始密码子。将所有上述克隆分别克隆入DNA表达载体pVC 1650。pVC1650载体含有立即早期巨细胞病毒启动子和内含子A，以在真核细 胞中引导各种PRRSV ORF的表达。六种其它的cDNA克隆代表了PRRSV结 构蛋白ORF2、3、4、5、6和7。将ORF2、3、4、5和6克隆也分别克隆入上 述的DNA表达载体pVC1650。将ORF7基因克隆入称为WRG7020的类似表 达载体。WRG7020载体还包含立即早期巨细胞病毒启动子和内含子A，以在 真核细胞中引导PRRSV ORF7的表达。
产生了两组疫苗，称为“A1-19”和“T1-19”。对于A1-19疫苗，将上述 克隆克隆入Valentis，Inc.pVC1650表达质粒。分别用磷酸铝(Adju-Phos)配制 各质粒构建物(Ulmer等，用常规铝佐剂促进DNA疫苗效力，Enhancement of DNA Vaccine Potency Using Conventional Aluminum Adjuvants；18 Vaccine， 18-28(1999)，各所得1毫升剂量中含有250μg ORF克隆和1000μg计算量的 铝。最终疫苗分别由1ml IM剂量的各配制的ORF克隆构成。对于T1-19疫苗， 将上述克隆克隆入Valentis，Inc.pVC1650表达质粒。用TGV200PINC-聚合物 分别配制各质粒构建物，分别得到250μg ORF克隆/1ml剂量。最终疫苗各自 由1ml IM剂量的各配制的ORF克隆构成。
为得到对照，产生由ORF PCV2的cDNA克隆和SIV的HA基因构成的 DNA疫苗。将两种ORF各自克隆入Valentis，Inc.pVC1650表达质粒。分别用 磷酸铝(Adju-Phos)配制PCV2ORF2和SIV HA基因的质粒构建物，各所得1 毫升剂量中含有250μg ORF克隆和1000μg计算量的铝(称为A20和A21)。 此外，用TGV200 PINC-聚合物分别配制PCV2 ORF2和SIV HA基因的质粒构 建物，分别得到250μg各克隆/1ml剂量(称为T20和T21)。最终疫苗由四种 独立的1ml IM剂量的各配制的克隆构成。表2显示了所有产生的疫苗，包括 对照疫苗。
表2 质粒 克隆区域 克隆的核苷酸跨度(使用Genbank U87392作为对照) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ORF1a ORF1a ORF1a ORF1a ORF1a ORF1a ORF1a ORF1a ORF1b ORF1b 190-1128 1126-2082 2082-3057 3037-3990 3985-4923 4924-5880 5863-6819 6808-7659 7735-8651 8634-9605 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 ORF1b ORF1b ORF1b ORF2 ORF3 ORF4 ORF5 ORF6 ORF7 ORF2 SIV HA 9588-10553 10536-11318 11298-12071 NA NA NA NA NA NA NA NA
将40只猪分成四组：组1在第0、21和42天给予19×1ml剂量的A1-A19 Adju-Phos；组2在第0、21和42天给予19×1ml剂量的T1-T19 TGV200；组 3在第0、21和42天给予4×1ml各自剂量的A20、A21、T20和T21；组4 为阴性对照，不进行任何处理。
在试验的第56天，给予组1、2和3中的所有猪PRRSV的SDSU#73强毒 株。在给予猪之前，将PRRSV的SDSU#73强毒株1∶10稀释在含有4％胎牛血 清的EMEM中。将总共2ml稀释的激发病毒鼻内递送至合适的猪，每个鼻孔 给予1ml稀释的病毒。PRRSV激发病毒的激发前和激发后滴度分别为 104.59TCID50/ml和104.65TCID50/ml。
试验第0、21、42和56天取猪血以监测疫苗接种的血清转化。还在试验 第57、59、61、63、66和70天取猪血，以监测激发后血清转化和病毒血症。 从第54到第70天每天记录临床观察结果。在第70天，对猪进行尸体剖检， 将大体肺损伤记录为PRRSV导致的肺受累百分比。试验开始前以及在第56天 和第70天对猪进行称量。本实施例中该方案的总结如表3所示。
表3 组 猪/ 株 第一次免疫接 种(第0天) 第二次免疫接 种(第21天) 第三次免疫接 种(第42天) 激发(第56天) 收集样品和终止试验(第70天) 1 2 3 4 10 10 10 10 A1-A19 Adju-Phos T1-T19 TGV200 A20-A21 T20-T21 无 A1-A19 Adju-Phos T1-T19 TGV200 A20-A21 T20-T21 无 A1-A19 Adju-Phos T1-T19 TGV200 A20-A21 T20-T21 无 鼻内给予2毫升强毒 SDSU#73PRRSV 同上 同上 无 评价临床健康、直肠温度。尸体 解剖时评价动物肺损伤并收集 指定的肺组织。 同上 同上 同上
为了评价本实施例的结果，确定试验处理效力的主要标准是PRRSV特征 性肺损伤的发展。评价血清学反应、激发后ADG和直肠温度作为支持性标准。 实施例的结果总结在表4中。
表4 组 组平均 肺评分 每组中肺固结 评分之20％的 猪的百分比 激发后最高组 平均温度 () 激发后峰病毒 血症的 最高百分比 组平均激发后 ADG 1(A1-A19 Adju-Phos) 2(T1-T19 TGV200) 3(激发对照) (阴性对照) 19.84 28.42 37.68 0.0A 37.5 70.0 70.0 0.0 105.9 106.0 106.1 103.9 100％ 100％ 100％ 0％ 0.16 0.43 0.68 1.48
通过IDEXX PRRS ELISA测定，所有分别接受三次剂量A1-A19 Adju-Phos 或T1-T19 TGV200 DNA疫苗原型的猪中不存在PRRSV的血清转化。强毒 PRRSV激发后，发现组2猪的ELISA S/P比值比组1猪上升得更快。组3猪(未 免疫接种/激发的对照)为阴性S/P比，直到接触强毒PRRSV激发。组4的严格 阴性对照猪在整个试验过程中为阴性S/P比。血清学结果记录在表5中。 表5 组 猪 第0天 ELISA 第21天 ELISA 第42天 ELISA 第56天 ELISA (0dpc) VI 第59天 ELISA (3dpc) VI 第61天 ELISA (5dpc) VI 第63天 ELISA (7dpc) VI 第66天 ELISA (10dpc) VI 第70天 ELISA (14dpc) VI 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 802 808 812 814 818 826 830 832 839 842 平均值 0.14 0.00 -0.02 -0.03 0.01 0.00 -0.01 -0.02 0.01 0.02 0.01 -0.09 -0.01 0.01 0.01 -0.01 0.00 0.00 0.00 -0.05 -0.01 -0.02 0.01 -0.01 -0.02 -0.03 0.36 -0.02 0.04 -0.02 0.01 -0.01 0.03 0.22 0.02 0.00 0.02 0.23 0.01 0.02 0.03 0.08 0.17 0.08 N N N N N N N N N N 0.21 0.02 0.02 0.02 0.18 0.01 -0.01 0.04 0.06 0.19 0.07 POS POS N N POS N POS N POS N 0.97 0.08 0.10 0.13 0.83 0.10 0.06 0.18 0.13 0.92 0.35 POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS 2.29 0.66 0.60 0.54 2.74 0.37 0.39 0.93 0.36 2.30 1.12 POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS 2.66 1.01 0.92 1.15 2.97 0.45 0.97 1.39 0.72 2.48 1.47 N N N N N POS POS POS N N 2.69 1.22 1.21 1.80 3.24 ND 1.68 1.71 1.13 ND 1.84 N N N N N ND N N POS ND 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 806 813 821 822 836 844 845 846 847 849 0.01 -0.02 0.00 -0.01 -0.02 0.00 0.04 -0.01 -0.01 0.03 0.05 0.00 0.05 0.00 0.05 -0.02 0.01 -0.02 0.01 -0.02 0.11 -0.03 0.04 -0.01 0.12 0.00 0.06 -0.03 0.02 -0.01 0.31 0.05 0.07 0.03 0.22 0.05 0.32 0.09 0.04 0.11 N N N N N N N N N N 0.26 0.07 0.10 0.05 0.23 0.03 0.19 0.09 0.02 0.08 POS POS POS POS POS POS POS N POS POS 0.58 0.22 0.15 0.41 0.79 0.31 1.00 0.75 0.43 0.45 POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS 2.51 0.83 1.12 1.78 2.93 1.72 2.80 2.57 2.05 1.97 POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS 3.22 1.47 2.28 2.37 3.52 2.33 3.44 3.17 2.94 2.48 N POS N N POS POS N POS POS N 3.34 1.73 2.52 2.01 3.62 2.17 3.26 3.06 2.96 2.56 N N N POS N N N N N N
平均值 0.00 0.01 0.03 0.13 0.11 0.51 2.03 2.72 2.72 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 811 815 819 823 831 833 840 841 843 848 平均值 -0.03 0.00 -0.01 0.00 0.00 -0.02 0.00 -0.02 0.00 0.03 0.00 -0.02 -0.01 0.00 -0.01 -0.02 -0.02 -0.02 -0.01 -0.02 -0.02 -0.02 0.02 0.06 0.04 0.03 0.00 0.00 0.01 -0.02 -0.01 0.00 0.01 0.00 0.06 0.01 0.02 0.01 0.01 0.05 0.06 0.02 0.02 0.03 N N N N N N N N N N 0.01 0.03 0.02 0.01 0.01 0.01 0.12 0.06 0.02 0.05 0.03 POS POS POS POS POS POS POS POS N POS 0.05 0.07 0.08 0.04 0.07 0.03 0.18 0.14 0.11 0.10 0.09 POS POS POS N POS POS POS POS POS POS 0.55 0.57 0.25 0.44 0.78 0.15 0.41 0.71 0.41 0.30 0.46 POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS 1.44 1.32 0.87 1.13 1.48 0.43 1.30 1.33 0.84 0.74 1.09 POS POS POS POS N POS POS POS N N 1.77 1.33 1.13 1.61 1.75 0.90 2.15 1.50 0.80 1.35 1.43 N N N N POS N POS N N N 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 803 804 805 810 817 828 834 737 838 850 平均值 -0.03 0.01 0.03 0.01 0.03 -0.02 -0.01 0.00 0.00 0.04 0.01 0.00 -0.03 -0.01 -0.06 -0.02 -0.03 -0.02 -0.03 -0.01 -0.01 -0.02 0.04 0.02 -0.03 -0.03 -0.15 0.04 0.03 0.01 0.00 0.03 0.00 0.04 0.12 0.00 0.08 -0.02 0.00 0.00 0.03 0.08 0.09 0.04 N N N N N N N N N N 0.04 0.11 -0.01 0.08 -0.01 -0.01 0.00 0.03 0.11 0.06 0.04 N N N N N N N N N N 0.04 0.12 0.00 0.06 -0.01 0.01 0.00 0.05 0.11 0.07 0.05 N N N N N N N N N N 0.02 0.08 0.01 0.02 -0.04 -0.02 -0.17 0.02 0.09 0.08 0.0I N N N N N N N N N N 0.01 0.13 -0.01 0.02 -0.04 0.00 -0.02 0.03 0.07 0.07 0.03 N N N N N N N N N N -0.02 0.10 -0.03 0.02 -0.10 -0.01 -0.01 -0.02 0.01 0.06 0.00 N N N N N N N N N N
从激发前两天到激发后整14天内监测猪温度。整个激发期间，组4未免 疫接种/未激发对照的基线组平均温度为103.4。
在激发后的一些点，所有PRRSV激发组的组平均温度升高，但是，在激 发后组平均温度到达峰值的天数中存在暂时差异。所有用PRRSV激发的组中， 组平均峰温度为105.9-106.1，而阴性对照组的平均峰温度为103.9。组3显 示激发后温度梯度升高，激发后第9天达到峰值106.1。组1和2在激发后 两天时显示温度急剧升高，峰值温度各为105.9和105.6。注意，组1和 2中DNA免疫接种猪激发后温度快速升高的方式与PRRS KV免疫接种动物激 发后应答的方式相类似。观察到，用实验PRRS KV原型免疫接种的猪通常是 “体液致敏(humorally-primed)”的(即免疫接种后对PRRSV呈血清阳性)。免疫 接种这些实验PRRS KV原型的动物还显示激发后很快温度就快速升高，正如 在本实验组1和2的DNA免疫接种猪中所见。这种PRRSV激发后快速温度升 高的相似性是DNA免疫接种猪的免疫系统确实对PRRSV抗原致敏的另一种指 标。
在成功PRRSV激发中，组3猪显示特征性肺损伤。尸体解剖，组4猪没 有肺损伤。组1和2猪组的平均肺损伤分别为19.84和28.42。各个猪的肺评分 记录在表6中。
表6 组 动物 肺评分 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 802 808 812 814 818 826 830 832 839 842 平均值 2.00 0.90 55.00 0.20 1.00 ND 70.00 2.90 26.75 ND 19.84 2 2 2 2 2 2 806 813 821 822 836 844 23.00 32.50 4.00 28.95 37.50 67.00 2 2 2 2 845 846 847 849 平均值 16.70 52.50 14.00 8.00 28.42 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 811 815 819 823 831 833 840 841 843 848 平均值 2.75 33.50 51.00 72.00 75.00 15.50 39.00 37.50 9.50 41.00 37.68 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 803 804 805 810 817 828 834 837 838 850 平均值 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
由这些结果可清楚地得出，在呼吸模型中，包含PRRSV基因组各区域的 DNA疫苗可诱导对毒性激发的保护作用。
相关申请
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发明背景
<110>勃林格殷格翰动物保健有限公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.)
E.M.瓦格恩(VAUGHN，Eric M.)
R.斯塔莫(STAMMER，Richard)
<120>PRRSV亚单位疫苗
<130>35072-PR0
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>15411
<212>DNA
<213>猪生殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)
<400>1
atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60
ggcacagccc aaaacttgct gcacagaaac acccttctgt gatagcctcc ttcaggggag 120
cttagggttt gtccctagca ccttgcttcc ggagttgcac tgctttacgg tctctccacc 180
cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc cagggtgttt 240
atggcggagg gccaagtcta ctgcacacga tgcctcagtg cacggtctct ccttcccctg 300
aacctccaag tttctgagct cggggtgcta ggcctattct acaggcccga agagccactc 360
cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gttgagtgct cccccgccgg ggcctgctgg 420
ctttctgcaa tctttccaat cgcacgaatg accagtggaa acctgaactt ccaacaaaga 480
atggtacggg tcgcagctga gctttacaga gccggccagc tcacccctgc agtcttgaag 540
gctctacaag tttatgaacg gggttgccgc tggtacccca ttgttggacc tgtccctgga 600
gtggccgttt tcgccaattc cctacatgtg agtgataaac ctttcccggg agcaactcac 660
gtgttgacca acctgccgct cccgcagaga cccaagcctg aagacttttg cccctttgag 720
tgtgctatgg ctactgtcta tgacattggt catgacgccg tcatgtatgt ggccgaaagg 780
aaagtctcct gggcccctcg tggcggggat gaagtgaaat ttgaagctgt ccccggggag 840
ttgaagttga ttgcgaaccg gctccgcacc tccttcccgc cccaccacac agtggacatg 900
tctaagttcg ccttcacagc ccctgggtgt ggtgtttcta tgcgggtcga acgccaacac 960
ggctgccttc ccgctgacac tgtccctgaa ggcaactgct ggtggagctt gtttgacttg 1020
cttccactgg aagttcagaa caaagaaatt cgccatgcta accaatttgg ctaccagacc 1080
aagcatggtg tctctggcaa gtacctacag cggaggctgc aagttaatgg tctccgagca 1140
gtaactgacc taaacggacc tatcgtcgta cagtacttct ccgttaagga gagttggatc 1200
cgccatttga aactggcggg agaacccagc tactctgggt ttgaggacct cctcagaata 1260
agggttgagc ctaacacgtc gccattggct gacaaggaag aaaaaatttt ccggtttggc 1320
agtcacaagt ggtacggcgc tggaaagaga gcaagaaaag cacgctcttg tgcgactgct 1380
acagtcgctg gccgcgcttt gtccgttcgt gaaacccggc aggccaagga gcacgaggtt 1440
gccggcgcca acaaggctga gcacctcaaa cactactccc cgcctgccga agggaattgt 1500
ggttggcact gcatttccgc catcgccaac cggatggtga attccaaatt tgaaaccacc 1560
cttcccgaaa gagtgagacc tccagatgac tgggctactg acgaggatct tgtgaatgcc 1620
atccaaatcc tcagactccc tgcggcctta gacaggaacg gtgcttgtac tagcgccaag 1680
tacgtactta agctggaagg tgagcattgg actgtcactg tgacccctgg gatgtcccct 1740
tctttgctcc ctcttgaatg tgttcagggc tgttgtgggc acaagggcgg tcttggttcc 1800
ccagatgcag tcgaggtctc cggatttgac cctgcctgcc ttgaccggct ggctgaggtg 1860
atgcacctgc ctagcagtgc tatcccagcc gctctggccg aaatgtctgg cgattccgat 1920
cgttcggctt ctccggtcac caccgtgtgg actgtttcgc agttctttgc ccgtcacagc 1980
ggagggaatc accctgacca agtgcgctta gggaaaatta tcagcctttg tcaggtgatt 2040
gaggactgct gctgttccca gaacaaaacc aaccgggtca ccccggagga ggtcgcagca 2100
aagattgacc tgtacctccg tggtgcaaca aatcttgaag aatgcttggc caggcttgag 2160
aaagcgcgcc cgccacgcgt aatcgacacc tcctttgatt gggatgttgt gctccctggg 2220
gttgaggcgg caacccagac gatcaagctg ccccaggtca accagtgtcg tgctctggtc 2280
cctgttgtga ctcaaaagtc cttggacaac aactcggtcc ccctgaccgc cttttcactg 2340
gctaactact actaccgtgc gcaaggtgac gaagttcgtc accgtgaaag actaaccgcc 2400
gtgctctcca agttggaaaa ggttgttcga gaagaatatg ggctcatgcc aaccgagcct 2460
ggtccacggc ccacactgcc acgcgggctc gacgaactca aagaccagat ggaggaggac 2520
ttgctgaaac tggctaacgc ccagacgact tcggacatga tggcctgggc agtcgagcag 2580
gttgacctaa aaacttgggt caagaactac ccgcggtgga caccaccacc ccctccgcca 2640
aaagttcagc ctcgaaaaac gaagcctgtc aagagcttgc cggagagaaa gcctgtcccc 2700
gccccgcgca ggaaggttgg gtccgattgt ggcagcccgg tttcattagg cggcgatgtc 2760
cctaacagtt gggaagattt ggctgttagt agcccctttg atctcccgac cccacctgag 2820
ccggcaacac cttcaagtga gctggtgatt gtgtcctcac cgcaatgcat cttcaggccg 2880
gcgacaccct tgagtgagcc ggctccaatt cccgcacctc gcggaactgt gtctcgaccg 2940
gtgacaccct tgagtgagcc gatccctgtg cccgcaccgc ggcgtaagtt tcagcaggtg 3000
aaaagattga gttcggcggc ggcaatccca ccgtaccagg acgagcccct ggatttgtct 3060
gcttcctcac agactgaata tgaggcctct cccccagcac cgccgcagag cgggggcgtt 3120
ctgggagtag aggggcatga agctgaggaa accctgagtg aaatctcgga catgtcgggt 3180
aacattaaac ctgcgtccgt gtcatcaagc agctccttgt ccagcgtgag aatcacacgc 3240
ccaaaatact cagctcaagc catcatcgac tcgggcgggc cctgcagtgg gcatctccaa 3300
gaggtaaagg aaacatgcct tagtgtcatg cgcgaggcat gtgatgcgac taagcttgat 3360
gaccctgcta cgcaggaatg gctttctcgc atgtgggatc gggtggacat gctgacttgg 3420
cgcaacacgt ctgtttacca ggcgatttgc accttagatg gcaggttaaa gttcctccca 3480
aaaatgatac tcgagacacc gccgccctat ccgtgtgagt ttgtgatgat gcctcacacg 3540
cctgcacctt ccgtaggtgc ggagagcgac cttaccattg gctcagttgc tactgaagat 3600
gttccacgca tcctcgagaa aatagaaaat gtcggcgaga tggccaacca gggacccttg 3660
gccttctccg aggataaacc ggtagatgac caacttgtca acgacccccg gatatcgtcg 3720
cggaggcctg acgagagcac atcagctccg tccgcaggca caggtggcgc cggctctttt 3780
accgatttgc cgccttcaga tggcgcggat gcggacgggg gggggccgtt tcggacggta 3840
aaaagaaaag ctgaaaggct ctttgaccaa ctgagccgtc aggtttttga cctcgtctcc 3900
catctccctg ttttcttctc acgccttttc taccctggcg gtggttattc tccgggtgat 3960
tggggttttg cagcttttac tctattgtgc ctctttttat gttacagtta cccagccttt 4020
ggtattgctc ccctcttggg tgtgttttct gggtcttctc ggcgcgttcg aatgggggtt 4080
tttggctgct ggttggcttt tgctgttggt ctgttcaagc ctgtgtccga cccagtcggc 4140
gctgcttgtg agtttgactc gccagagtgt agaaacatcc ttcattcttt tgagcttctc 4200
aaaccttggg accctgttcg cagccttgtt gtgggccccg tcggtctcgg tcttgccatt 4260
cttggcaggt tactgggcgg ggcacgctgc atctggcact ttttgcttag gcttggcatt 4320
gttgcagact gtatcttggc tggagcttac gtgctttctc aaggtaggtg taaaaagtgc 4380
tggggatctt gtataagaac tgctcctaat gaggtcgctt ttaacgtgtt tcctttcaca 4440
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gaccccattt ttctcgccac tgggtggcgc gggtgctggg ccggccgaag ccccattgag 4560
caaccctctg aaaaacccat cgcgtttgcc caattggatg aaaagaagat tacggctagg 4620
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tcgggtgggg cgatggtggc taaggcggtc ccaaaagtgg tcaaggtttc cgctgttcca 4740
ttccgagccc ccttctttcc cactggagtg aaagttgacc ctgattgcag ggtcgtggtt 4800
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ggtgtagggg actttgccca gctgaatgga ttaaaaatca ggcaaatttc caagccttca 4920
gggggaggcc cacatctcat ggctgccctg catgttgcct gctcgatggc tctgcacatg 4980
cttgctggga tttatgtgac tgcggtgggt tcttgcggca ccggcaccaa cgacccgtgg 5040
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caagaaattg ccttggtcgt tttgattttt gtttccatcg gaggcatggc tcataggttg 5220
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accatcctat ggttggtgtt tttcttgatt tctgtgaata tgccttcagg aatcttggcc 5400
atggtgttgt tggtttctct ttggcttctt ggtcgttata ctaatgttgc tggccttgtc 5460
accccctacg acattcatca ttacaccagt ggcccccgcg gtgttgccgc cttggctacc 5520
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ctgtttaccc cgtcccagct tgggtctctt cttgagggtg ctttcagaac tcgaaagccc 5640
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cctaaggtcc cgctcggtga tgtgaaggtc ggcagccaca taattaaaga cataagcgag 6180
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cccttggttg ctgtgagttt ctttattttg aatgaggttc tcccagccgt cctggtccgg 6360
agtgttttct cctttggaat gtttgtgcta tcctggctca cgccatggtc tgcgcaagtt 6420
ctgatgatca ggcttctgac agcagctctt aacaggaaca gatggtcact tgcctttttc 6480
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aagtaccgtg gcccgcacca tatccttgtt ggcgatggag tgttctctgc ggctttcttc 6720
ttgagatact ttgccgaggg aaagttgagg gaaggggtgt cgcaatcctg cggaatgaat 6780
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caatttatcg aggctgccta tgctaaagca cttagagtag aactggccca gttggtgcag 6960
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ttctgcagaa tacaaggttt ggagacatac cttacaaaac ccccagtgac actggaagcc 8220
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gagaaaactg gcaaactgtc accccttgta ctcttaagaa acagtattgc gggaagaaga 8700
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gtggtgttac ccagggcttc atgaaaaagg cgtttaactc gcccatcgcc ctcggaaaga 8820
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cttgtttgga gtatgatcct gaatggtttg aagaacttgt agttggaata gcgcagtgcg 9540
cccgcaagga cggctacagc tttcccggca cgccgttctt catgtccatg tgggaaaaac 9600
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gtccagtcac aatctggtgt ggccatccag cgggttctgg ttcttgtagt gagtgcaaat 9780
cccctgtagg gaaaggcaca agccctttag acgaggtgct ggaacaagtc ccgtataagc 9840
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accaaactcg ccgcggatta gtctctgtca ggcgtggaat taggggaaat gaagttggac 9960
taccagacgg tgattatgct agcaccgcct tgctccctac ctgcaaagag atcaacatgg 10020
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<212>DNA
<213>猪生殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)
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