含与聚乙二醇结合的药物的眼组织注射剂
阅读：1023发布：2020-10-10
专利汇可以提供含与聚乙二醇结合的药物的眼组织注射剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种眼组织注射剂，其含有与PEG共价结合的药物。当与PEG结合的药物被注射到眼组织中(虹膜、睫状体、玻璃体、 视网膜 、视神经等)时，该药物可以在组织中长时间维持。因此，上述注射剂使得通过一次性施用药物 治疗 或 预防 眼组织中的 疾病 成为可能。PEG可以是直链型、星型或支链型。在PEG为直链型的情况下，通常以位于两端的羟基结合药物。因此，药物与PEG的结合比例是1∶1或2∶1。在PEG是含多个羟基的星型或支链型的情况下，则能够在其上共价结合多个药物分子。，下面是含与聚乙二醇结合的药物的眼组织注射剂专利的具体信息内容。
1.一种眼组织注射剂，其包含一种药物-聚乙二醇偶联物，向眼 组织中注射的方法是玻璃体内注射，该聚乙二醇的分子量为5000～ 50000，该药物与该聚乙二醇的结合比为1∶1，提高了药物在玻璃体 内及视网膜内的保留性。
2.权利要求1的眼组织注射剂，其中药物是抗炎药、免疫抑制剂、 抗病毒药、抗菌药、抗真菌药、抗肿瘤药、神经保护药、血流改善药、 抗青光眼药、镇痛药、麻醉剂、血管生成抑制剂或诊断制剂。
3.权利要求1的眼组织注射剂，其中药物是治疗或预防眼科疾病的 药物。
4.药物-聚乙二醇偶联物在制备眼组织注射剂中的应用，其中，向 眼组织中注射的方法是玻璃体内注射，该聚乙二醇的分子量为5000～ 50000，该药物与该聚乙二醇的结合比为1∶1，提高了药物在玻璃体 内及视网膜内的保留性。
5.权利要求4的应用，其中药物是抗炎药、免疫抑制剂、抗病毒药、 抗菌药、抗真菌药、抗肿瘤药、神经保护药、血流改善药、抗青光眼药、 镇痛药、麻醉剂、血管生成抑制剂或诊断制剂。
6.权利要求4的应用，其中药物是治疗或预防眼科疾病的药物。
技术领域
本发明涉及含有可在眼组织中长时间保留的药物-聚乙二醇偶 联物的眼组织注射剂。
背景技术
眼组织例如虹膜、睫状体、视网膜、视神经或玻璃体中的疾病常 常是难以治疗的，迫切需要开发出一种有效的治疗方法。尽管治疗眼 部疾病最常用的是药物滴注法，但在一些眼组织中药物输送困难，特 别是药物几乎不能被输送到眼内组织例如玻璃体和视网膜中，使得眼 内疾病的治疗更加困难。由于通过滴注难以获得药物的维持，因此需 要频繁施用药物。
考虑到这一点，尝试了直接向眼组织施用药物的方法。例如，曾 经报导了向眼内组织如玻璃体施用含药物的脂质体或微球的技术 (PCT No.508369/1994的日文翻译公开文本，日本专利申请公开 221322/1992号等)。
但是，通过使用脂质体难以控制药物的释放。脂质体和微球具有 较大的颗粒直径。因此，当它们被施用于眼内组织如玻璃体中时，有 时不能保持玻璃体的透明度。
另一方面，已知将药物共价结合到聚乙二醇(PEG)获得的偶联 物增强了药物在体内的保持，并且药物-PEG偶联物被用作药物输送 系统。多种特定的药物-PEG偶联物已经被合成，并且胰岛素-PEG 偶联物(US 4,179,337)、紫杉醇-PEG偶联物(WO 93/24476)、 干扰素-PEG偶联物(WO 99/48535)、天门冬酰胺酶-PEG偶联物 (WO 99/39732)和尿酸氧化酶-PEG偶联物(WO 00/7629)已为公 众所知。但是，它们中没有一个是针对眼科领域的使用。
关于药物-PEG偶联物在眼科领域中的应用，有报导氢化可的松 -PEG偶联物与氢化可的松本身相比能够改善巩膜的穿透性(Int.J. Pharm.，182(1)，79-92，1999)。还有报导给大鼠静脉内施用过氧化物 歧化酶(SOD)-PEG偶联物改善了SOD的保持性，并且抑制了缺 血引起的视网膜水肿(Invest.Ophthalmol.Vis Sci.，32，1471-1478， 1991)。
但是，没有关于将药物-PEG偶联物注射到眼组织内技术的报 导。因此，向眼组织内注射引起的效果当然不为人所知。
虽然已知上述药物-PEG偶联物可以作为药物输送系统使用，但 将它们静脉内或口服或滴注施用的传统方法在治疗多种眼组织、特别 是眼内组织疾病中会引起许多问题。例如，由于静脉内施用的药物- PEG偶联物随血流全身播散，到达眼组织的药量与用量相比少得多。 因此，为了使有效量的药物到达眼组织必须施用大量药物。但是，在 这种情况下，全身性副作用将成为严重的问题。此外，由于存在静脉 内施用的药物-PEG偶联物在血中被消化的问题，在治疗中需要频繁 地施用。在口服施用的情况下，由于增加了肝脏消化的过程，到达眼 组织的药量进一步减少。即使在滴注这种局部施用的情况下，由于角 膜上皮细胞的屏障机制，通过角膜到达眼内组织例如视网膜的药量大 约是剂量的1/10,000。
考虑到这一点，尝试了直接向眼组织施用药物的方法。例如，曾 经报导了向眼内组织如玻璃体施用含药物的脂质体或微球的技术 (PCT No.508369/1994的日文翻译公开文本，日本专利申请公开 221322/1992号等)。
但是，通过使用脂质体难以控制药物的释放。脂质体和微球具有 较大的颗粒直径。因此，当它们被施用于眼内组织如玻璃体中时，有 时不能保持玻璃体的透明度。
另一方面，已知将药物共价结合到聚乙二醇(PEG)获得的偶联 物增强了药物在体内的保持，并且药物-PEG偶联物被用作药物输送 系统。多种特定的药物-PEG偶联物已经被合成，并且胰岛素-PEG 偶联物(US 4,179,337)、紫杉醇-PEG偶联物(WO 93/24476)、 干扰素-PEG偶联物(WO 99/48535)、天门冬酰胺酶-PEG偶联物 (WO 99/39732)和尿酸氧化酶-PEG偶联物(WO 00/7629)已为公 众所知。但是，它们中没有一个是针对眼科领域的使用。
关于药物-PEG偶联物在眼科领域中的应用，有报导氢化可的松 -PEG偶联物与氢化可的松本身相比能够改善巩膜的穿透性(Int.J. Pharm.，182(1)，79-92，1999)。还有报导给大鼠静脉内施用过氧化物 歧化酶(SOD)-PEG偶联物改善了SOD的保持性，并且抑制了缺 血引起的视网膜水肿(Invest.Ophthalmol.Vis Sci.，32，1471-1478， 1991)。
但是，没有关于将药物-PEG偶联物注射到眼组织内技术的报 导。因此，向眼组织内注射引起的效果当然不为人所知。
虽然已知上述药物-PEG偶联物可以作为药物输送系统使用，但 将它们静脉内或口服或滴注施用的传统方法在治疗多种眼组织、特别 是眼内组织疾病中会引起许多问题。例如，由于静脉内施用的药物- PEG偶联物随血流全身播散，到达眼组织的药量与用量相比少得多。 因此，为了使有效量的药物到达眼组织必须施用大量药物。但是，在 这种情况下，全身性副作用将成为严重的问题。此外，由于存在静脉 内施用的药物-PEG偶联物在血中被消化的问题，在治疗中需要频繁 地施用。在口服施用的情况下，由于增加了肝脏消化的过程，到达眼 组织的药量进一步减少。即使在滴注这种局部施用的情况下，由于角 膜上皮细胞的屏障机制，通过角膜到达眼内组织例如视网膜的药量大 约是剂量的1/10,000。
发明内容
本发明的发明人发现当药物-PEG偶联物被直接施用于眼组织 时，药物能够直接到达眼组织如虹膜、睫状体、玻璃体、视网膜和视 神经，并且药物能够在眼组织中长时间保持，因此该偶联物可以用于 治疗多种眼组织中的疾病。当药物-PEG偶联物被直接施用于眼组织 时，偶联物不进入体循环。因此，几乎所有的剂量都被用来治疗眼组 织中的疾病，并且减少了全身性副作用。药物以与PEG的偶联物的 形式施用。但是，在将其注射到眼组织内后药物与PEG之间的键逐 渐断裂，这样可以控制药物的释放，从而可能在长时间内显示对疾病 的治疗效果。药物-PEG偶联物在眼组织中的保持性极好。即使药物 与PEG之间的键不断裂而是保持，偶联物也能够对眼组织中的疾病 显示治疗效果。因此，本发明中向眼组织内的注射使得通过一次性施 用药物来治疗多种眼组织中的疾病、特别是那些目前为止难以治疗的 眼组织疾病成为可能。
本发明涉及眼组织注射剂，其含有药物与PEG共价结合的偶联 物。当药物-PEG偶联物被注射到眼组织内时，该偶联物在眼组织如 虹膜、睫状体、视网膜、视神经和玻璃体中长时间保持，从而使得通 过一次性施用长时间维持药效成为可能。
本发明中，PEG可以是直链、星型或支链。在直链PEG中，由 于药物通常利用PEG两端的羟基与之结合，药物与PEG的结合比例 是1∶1或2∶1。由于星型和支链型PEG含有多个羟基，药物和PEG 之间能够形成多个共价键。对PEG的分子量没有特别的限制，可以 根据形成共价键的药物的种类和特性、药物保持的时间等适宜地选 择。分子量通常为300到200,000，更优选为1,000到50,000。
具有功能基团例如羧基的药物能够用PEG两端的羟基直接与 PEG共价结合。根据药物的种类，PEG也可以被预先转化为具有功能 基团例如氨基、硫醇和羧基的衍生物，这样与药物能够容易地形成共 价键。即，根据药物的种类，用PEG的羟基将PEG转化为具有功能 基团例如氨基、硫醇和羧基的衍生物，然后药物能够被共价结合到所 获得的衍生物上。
为了形成共价键，可以使用PEG两端的羟基。当仅用一个羟基进 行结合时，另一个不参与结合的羟基可以被保护基团例如烷基或酰基 所保护。当PEG被转化为具有功能基团的衍生物时，为了形成共价 键可以使用两个功能基团或仅使用一个功能基团。
这些键合方式用示意图表示如下。(每个化学式中，X代表药物， R代表氢原子、保护基团例如烷基、酰基、羧基烷基或氨基烷基等。)
·没有药物与PEG结合的状态(仅PEG)：
·药物分子与PEG羟基的一个键：
·药物分子与PEG羟基的两个键：
·药物分子与PEG氨基衍生物的一个键：
·药物分子与PEG羧基衍生物的一个键：
·药物分子与PEG硫醇衍生物的一个键：
为了形成上述共价键，可以使用已被广泛使用的方法，例如药物 的羟基酯化PEG羧酸衍生物的方法。
对与PEG共价结合的药物的化学结构没有限制。可以使用具有能 够与PEG结合的功能基团的药物。药物的具体实例是那些具有羟基、 羧基、羰基、氨基或烯基的药物。这些药物可以预先被转化为具有功 能基团例如氨基、硫醇、羧基或异硫氰酸酯的衍生物，这样能够容易 地形成与PEG的共价键。对药物的种类没有限制，只要药物对眼病 有治疗或预防的效果。药物的实例有抗炎药、免疫抑制剂、抗病毒药、 抗菌药、抗真菌药、抗肿瘤药、神经保护药、血流改善药、抗青光眼 药、镇痛药、麻醉剂、血管生成抑制剂和诊断制剂。特别是，用于虹 膜、睫状体、视网膜、视神经、玻璃体等的眼内疾病药物的实例是那 些对于多种原因(病毒或细菌感染)引起的眼内炎症、伴有视网膜细 胞增生的增生性玻璃体视网膜病(viteoretinopathy)、视网膜新血管 形成、多种原因引起的视网膜出血、视网膜脱落或视网膜母细胞瘤有 效的药物。例如，抗炎药如磷酸倍他米松被用来治疗伴随眼内外科手 术的炎症。免疫抑制剂如环孢菌素被用来治疗自身免疫性葡萄膜炎。 抗病毒药如更昔洛韦被用来治疗病毒感染。抗菌药如氧氟沙星被用来 治疗术后感染。抗肿瘤药如盐酸多柔比星和卡莫司汀被用来治疗增生 性玻璃体视网膜病。眼科诊断试剂被用于多种检查。
将药物-PEG偶联物注射入眼组织中的方法的实例是视网膜下 注射、玻璃体内注射、巩膜内注射、前房注射和眼球筋膜腔下注射。
本发明的效果将在下文的眼内药代动力学试验和药理学试验中 详细描述。简要地说，在眼内药代动力学试验中，为了观察药物-PEG 偶联物被注射到玻璃体内后在眼内组织(玻璃体和视网膜)中的保持， 研究了荧光素-PEG偶联物。结果发现，由于本发明眼组织注射剂的 优点，药物在玻璃体和视网膜中长时间保持。此外，在药理学试验中， 倍他米松-PEG偶联物被一次性注射到玻璃体内或结膜下，并研究了 对氪激光引起的脉络膜新血管形成的效果。结果发现，由于本发明眼 组织注射剂的优点，脉络膜新血管形成被抑制，药物-PEG偶联物在 治疗眼科疾病中是有益的。
这些试验结果显示，通过适当地选择与PEG结合的药物，能够用 较少的施用次数有效地治疗眼内疾病。本发明眼组织注射剂使药物能 够有效地保持在眼内组织如虹膜、睫状体、视网膜、视神经和玻璃体 中。因此，减少药物的量成为可能，并且可以期待副作用的减少。
本发明眼组织注射剂中药物-PEG偶联物的剂型优选为液体制 剂。液体制剂可以通过例如将药物-PEG溶解于BBS(平衡盐溶液)、 甘油溶液、透明质酸溶液等中来制备。稳定剂、等渗剂、缓冲剂、pH 调节剂、缓解剂、防腐剂等可以以适当的量任选加入到液体制剂中。
稳定剂的实例是依地酸二钠等。等渗剂的实例是甘油、丙二醇、 聚乙二醇、氯化钠、氯化钾、山梨醇和甘露醇等。缓冲剂的实例是柠 檬酸、磷酸氢钠、冰醋酸和氨丁三醇等。pH调节剂的实例是盐酸、 柠檬酸、磷酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠等。缓解剂的实 例是苯甲醇等。防腐剂的实例是苯扎氯铵、苄索氯铵、对羟基苯甲酸 酯、苯甲酸钠和氯代丁醇等。
本发明还提供了治疗眼科疾病的方法，包括向患者的眼组织中施 用含治疗有效量药物-PEG的眼组织注射剂。
附图简述
图1是显示玻璃体内浓度的变化(56天)的曲线图。
图2是显示视网膜中浓度的变化(56天)的曲线图。
本发明涉及眼组织注射剂，其含有药物与PEG共价结合的偶联 物。当药物-PEG偶联物被注射到眼组织内时，该偶联物在眼组织如 虹膜、睫状体、视网膜、视神经和玻璃体中长时间保持，从而使得通 过一次性施用长时间维持药效成为可能。
本发明中，PEG可以是直链、星型或支链。在直链PEG中，由 于药物通常利用PEG两端的羟基与之结合，药物与PEG的结合比例 是1∶1或2∶1。由于星型和支链型PEG含有多个羟基，药物和PEG 之间能够形成多个共价键。对PEG的分子量没有特别的限制，可以 根据形成共价键的药物的种类和特性、药物保持的时间等适宜地选 择。分子量通常为300到200,000，更优选为1,000到50,000。
具有功能基团例如羧基的药物能够用PEG两端的羟基直接与 PEG共价结合。根据药物的种类，PEG也可以被预先转化为具有功能 基团例如氨基、硫醇和羧基的衍生物，这样与药物能够容易地形成共 价键。即，根据药物的种类，用PEG的羟基将PEG转化为具有功能 基团例如氨基、硫醇和羧基的衍生物，然后药物能够被共价结合到所 获得的衍生物上。
为了形成共价键，可以使用PEG两端的羟基。当仅用一个羟基进 行结合时，另一个不参与结合的羟基可以被保护基团例如烷基或酰基 所保护。当PEG被转化为具有功能基团的衍生物时，为了形成共价 键可以使用两个功能基团或仅使用一个功能基团。
这些键合方式用示意图表示如下。(每个化学式中，X代表药物， R代表氢原子、保护基团例如烷基、酰基、羧基烷基或氨基烷基等。)
·没有药物与PEG结合的状态(仅PEG)：
·药物分子与PEG羟基的一个键：
·药物分子与PEG羟基的两个键：
·药物分子与PEG氨基衍生物的一个键：
·药物分子与PEG羧基衍生物的一个键：
·药物分子与PEG硫醇衍生物的一个键：
为了形成上述共价键，可以使用已被广泛使用的方法，例如药物 的羟基酯化PEG羧酸衍生物的方法。
对与PEG共价结合的药物的化学结构没有限制。可以使用具有能 够与PEG结合的功能基团的药物。药物的具体实例是那些具有羟基、 羧基、羰基、氨基或烯基的药物。这些药物可以预先被转化为具有功 能基团例如氨基、硫醇、羧基或异硫氰酸酯的衍生物，这样能够容易 地形成与PEG的共价键。对药物的种类没有限制，只要药物对眼病 有治疗或预防的效果。药物的实例有抗炎药、免疫抑制剂、抗病毒药、 抗菌药、抗真菌药、抗肿瘤药、神经保护药、血流改善药、抗青光眼 药、镇痛药、麻醉剂、血管生成抑制剂和诊断制剂。特别是，用于虹 膜、睫状体、视网膜、视神经、玻璃体等的眼内疾病药物的实例是那 些对于多种原因(病毒或细菌感染)引起的眼内炎症、伴有视网膜细 胞增生的增生性玻璃体视网膜病(viteoretinopathy)、视网膜新血管 形成、多种原因引起的视网膜出血、视网膜脱落或视网膜母细胞瘤有 效的药物。例如，抗炎药如磷酸倍他米松被用来治疗伴随眼内外科手 术的炎症。免疫抑制剂如环孢菌素被用来治疗自身免疫性葡萄膜炎。 抗病毒药如更昔洛韦被用来治疗病毒感染。抗菌药如氧氟沙星被用来 治疗术后感染。抗肿瘤药如盐酸多柔比星和卡莫司汀被用来治疗增生 性玻璃体视网膜病。眼科诊断试剂被用于多种检查。
将药物-PEG偶联物注射入眼组织中的方法的实例是视网膜下 注射、玻璃体内注射、巩膜内注射、前房注射和眼球筋膜腔下注射。
本发明的效果将在下文的眼内药代动力学试验和药理学试验中 详细描述。简要地说，在眼内药代动力学试验中，为了观察药物-PEG 偶联物被注射到玻璃体内后在眼内组织(玻璃体和视网膜)中的保持， 研究了荧光素-PEG偶联物。结果发现，由于本发明眼组织注射剂的 优点，药物在玻璃体和视网膜中长时间保持。此外，在药理学试验中， 倍他米松-PEG偶联物被一次性注射到玻璃体内或结膜下，并研究了 对氪激光引起的脉络膜新血管形成的效果。结果发现，由于本发明眼 组织注射剂的优点，脉络膜新血管形成被抑制，药物-PEG偶联物在 治疗眼科疾病中是有益的。
这些试验结果显示，通过适当地选择与PEG结合的药物，能够用 较少的施用次数有效地治疗眼内疾病。本发明眼组织注射剂使药物能 够有效地保持在眼内组织如虹膜、睫状体、视网膜、视神经和玻璃体 中。因此，减少药物的量成为可能，并且可以期待副作用的减少。
本发明眼组织注射剂中药物-PEG偶联物的剂型优选为液体制 剂。液体制剂可以通过例如将药物-PEG溶解于BBS(平衡盐溶液)、 甘油溶液、透明质酸溶液等中来制备。稳定剂、等渗剂、缓冲剂、pH 调节剂、缓解剂、防腐剂等可以以适当的量任选加入到液体制剂中。
稳定剂的实例是依地酸二钠等。等渗剂的实例是甘油、丙二醇、 聚乙二醇、氯化钠、氯化钾、山梨醇和甘露醇等。缓冲剂的实例是柠 檬酸、磷酸氢钠、冰醋酸和氨丁三醇等。pH调节剂的实例是盐酸、 柠檬酸、磷酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠等。缓解剂的实 例是苯甲醇等。防腐剂的实例是苯扎氯铵、苄索氯铵、对羟基苯甲酸 酯、苯甲酸钠和氯代丁醇等。
本发明还提供了治疗眼科疾病的方法，包括向患者的眼组织中施 用含治疗有效量药物-PEG的眼组织注射剂。
附图简述
图1是显示玻璃体内浓度的变化(56天)的曲线图。
图2是显示视网膜中浓度的变化(56天)的曲线图。
具体实施方式
下文描述本发明的实施例，提供这些实施例的目的是为了更好的 理解本发明而不是为了限制本发明的范围。
合成实施例
倍他米松-PEG偶联物的合成
在氮气下将二氯甲烷(7ml)添加到甲氧基-PEG-丙酸 [Shearwater Polymers Co.，Ltd.生产，平均分子量：约5,000](1.00g； 约0.20mmol)和二环己基碳二亚胺(49.2mg；0.23mmol)的混合物 中，整个混合物在0℃下搅拌20分钟。然后，将倍他米松(59.3mg； 0.15mmol)和4-二甲基氨基吡啶(12.6mg；0.10mmol)加入其中， 将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物放入30倍量的乙醚中， 将获得的沉淀滤出并用少量冰丙酮和乙醚洗涤得到1.02mg用下式表 示的目的化合物的白色晶体。其收率约为70％。
眼内药物动力学试验
眼内药物动力学试验用荧光光度测定法在兔子中进行。
测量技术难以对上述制备的药物-PEG偶联物微小量组织转移 进行实际追踪。因此，用具有荧光性并且可以被高灵敏性测量的荧光 素作为模型药物，合成荧光素-PEG偶联物(下文中被称为 “FL-PEG”)，进行眼内药物动力学试验。荧光素钠(下文中被称为 “FL”)用作对比物质。
FL-PEG的合成
在氮气下，将NH2-PEG-丙酸[Shearwater Polymers Co.，Ltd.生产] (1.00g；约0.20mmol)和三乙胺(55.6μl；0.40mmol)溶于甲醇(100ml) 中。使用平均分子量约为5,000的PEG。然后将异硫氰酸荧光素 (233mg；0.60mmol)添加到溶液中，将混合物在室温下搅拌过夜。 将反应混合物减压浓缩至干燥，然后将所得固体物质溶解于氯仿/甲醇 (1/1，v/v)中，通过柱色谱去除未反应的异硫氰酸荧光素。将分离 的流分浓缩，将浓缩物放入30倍量的乙醚中，滤出所得沉淀物并用 少量乙醚洗涤得到0.86g以下式表示的目的化合物的灰黄色晶体。
液体制剂的制备：
将已灭菌的2.6％甘油溶液(10ml)加入FL-PEG(18mg)中，搅 拌该液体以溶解FL-PEG制备注射剂。用相似方法制备含10μg/ml FL 的注射剂。
给药方法和测量方法：
1)将以7∶3的比例含有盐酸氯胺酮水溶液(50mg/ml)和盐酸 甲苯噻嗪水溶液(50mg/ml)的混合溶液肌肉内给药对大白鼠进行麻 醉。
2)将托吡卡胺(0.5％)/盐酸苯肾上腺素(0.5％)滴眼液滴入眼 中引起瞳孔放大。
3)用盐酸奥布卡因(0.5％)滴眼液麻醉眼睛。
4)用配有30G针头的注射器将上述FL-PEG或FL液体制剂以 100μl的量通过眼睫状环分别注射到眼睛的玻璃体内。
5)眼内荧光强度在向玻璃体给药后的即刻以及第1、2、4、7、 15、18、23、28、35、42、49和56天的不同时间用荧光光度测定设 备测量。绘制校正曲线，测定玻璃体和视网膜中浓度的变化。然后， 通过力矩法由浓度的变化计算各自的半衰期。上述操作2)在眼内荧 光强度测量之前进行。
结果：
图1是显示玻璃体内浓度变化的曲线图。图1显示在给药后第二 天或以后没有检测到FL，而甚至在第56天还能检测到存在于玻璃体 内的FL-PEG。图2是显示视网膜中浓度变化的曲线图。图2显示FL 仅在给药后第一天检测到，而甚至在第56天还能检测到存在于视网 膜内的FL-PEG。
另外，表1显示FL和FL-PEG在玻璃体和视网膜中的半衰期。 FL-PEG在玻璃体中的半衰期是3.4天，而FL在玻璃体中的半衰期仅 为小于四个小时。这说明FL-PEG显著延长了在玻璃体内的保留期。 FL-PEG在视网膜中的半衰期是11.0天。由于FL仅在向视网膜给药 后的第一个时间点被检测到，无法计算其半衰期。但是很明显，该半 衰期非常短。因此，猜想FL-PEG从玻璃体移向视网膜，并在那里长 时间保持。
表1(玻璃体和视网膜中的半衰期)
试验物质 玻璃体 视网膜 FL-PEG 3.4天 11.0天 FL ＜4小时 -
表中的数值是三个样本的均数。FL-PEG在玻璃体中的半衰期用 第4到第28天测量的数值进行计算。FL-PEG在视网膜中的半衰期用 第1到第56天测量的数值进行计算。FL在玻璃体中的半衰期用给药 后即刻测量和给药后第1天测量的数值进行计算。
药理学试验
1.向氪激光引起脉络膜新血管形成的大鼠玻璃体内施用倍他米 松-PEG偶联物的效果
将根据实施例制备的倍他米松-PEG偶联物(下文中称为 “BM-PEG”)玻璃体内施用于大鼠，研究其对氪激光引起的脉络膜 新血管形成的效果。
液体制剂的制备
将灭菌的生理盐水(1ml)添加到BM-PEG(100mg)中，搅拌该 液体溶解BM-PEG以制备施用于玻璃体的注射剂。
给药方法和测量方法：
1)将以7∶1的比例含有盐酸氯胺酮水溶液(50mg/ml)和盐酸 甲苯噻嗪水溶液(50mg/ml)的混合溶液以1ml/kg肌肉内给药，对大 鼠进行全身麻醉。
2)将0.5％托吡卡胺-0.5％盐酸苯肾上腺素溶液滴入眼中引起 瞳孔放大，然后用氪激光光凝固装置(red)在点大小为100μm、输 出功率为100mW以及凝固时间为0.1秒的凝固条件下进行光凝固。
3)用观察组织的盖玻片作为接触镜，在眼底后极部分每只眼八 个点处分散地进行光凝固，避开厚的视网膜血管。为了切割布鲁赫膜， 光凝固聚焦于视网膜后部进行。光凝固后，对眼底进行照像。
4)用配有33G针头的注射器将5μl量的上述BM-PEG或赋形剂 (生理盐水)通过眼睫状环分别注射到两眼玻璃体的中心。
5)在光凝固后的第14天，将0.1ml 10％荧光素静脉内注射入尾 部，进行荧光素眼底血管造影术。
6)在荧光素眼底血管造影术中，不能观察到荧光性血细胞渗出 的光凝固位点被判断为阴性，观察到荧光性血细胞渗出的光凝固位点 被判断为阳性。当有两个观察到少量荧光性血细胞渗出的光凝固位点 时，它们被判断为阳性。根据下列方程式计算新血管形成的显示率。
新血管形成显示率(％)＝(阳性光凝固位点数/总光凝固位点数) ×100
结果：
表2显示玻璃体内施用BM-PEG对脉络膜新血管形成的效果。在 施用赋型剂的眼中新血管形成的显示率为75.0％，而在施用BM-PEG 的眼中新血管形成的显示率为3 5.4％。因此，通过在玻璃体内施用 BM-PEG抑制了新血管形成显示。
表2
试验物质 新血管形成的显示率(％) 赋型剂 75.0 BM-PEG 35.4
表中的数值分别是施用赋型剂的七只眼睛的均值和施用BM-PEG 的六只眼睛的均值。
2.给大鼠结膜下施用倍他米松-PEG偶联物对氪激光引起脉络 膜新血管形成的效果
将根据实施例制备的倍他米松-PEG偶联物(下文中称为 “BM-PEG”)结膜下施用于大鼠，研究其对氪激光引起的脉络膜新 血管形成的效果。用磷酸倍他米松(下文中称为“BP”)作为比较物。
液体制剂的制备：
将灭菌的生理盐水(1ml)添加到BM-PEG(40mg)中，搅拌该 液体溶解BM-PEG以制备结膜下给药的注射剂。用相似方法制备了含 2.8mg/ml BP的注射剂。
给药方法和测量方法：
通过对上述玻璃体内施用试验的第4)项进行如下修改，即为此 处的给药方法和测量方法。
4)用配有30G针头的注射器将50μl量的上述BM-PEG或BP 分别结膜下注射到两只眼睛中。
结果：
表3显示结膜下施用的BM-PEG对脉络膜新血管形成的效果。在 施用赋型剂的眼中新血管形成的显示率为71.9％，而在施用BM-PEG 的眼中新血管形成的显示率为35.4％。因此，结膜下施用的BM-PEG 抑制了新血管形成的显示。施用未与PEG连接的BP，新血管形成的 显示率为50.0％。虽然观察到了BP的抑制效果，但其效果小于 BM-PEG。这些结果显示通过形成PEG偶联物延长了药物在眼组织中 的保持期，并且增强了其抑制效果。
表3
试验物质 新血管形成的显示率(％) 赋型剂 71.9 BM-PEG 35.9 BP 50.0
表中的数值分别是八只眼睛的均值。
工业实用性
通过使用本发明含药物-PEG偶联物的眼组织注射剂，药物能够 在眼组织如虹膜、睫状体、玻璃体、视网膜和视神经中长时间保持。 因此，本发明眼组织注射剂使得通过一次性给药来治疗或预防多种眼 组织中的疾病成为可能。
合成实施例
倍他米松-PEG偶联物的合成
在氮气下将二氯甲烷(7ml)添加到甲氧基-PEG-丙酸 [Shearwater Polymers Co.，Ltd.生产，平均分子量：约5,000](1.00g； 约0.20mmol)和二环己基碳二亚胺(49.2mg；0.23mmol)的混合物 中，整个混合物在0℃下搅拌20分钟。然后，将倍他米松(59.3mg； 0.15mmol)和4-二甲基氨基吡啶(12.6mg；0.10mmol)加入其中， 将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物放入30倍量的乙醚中， 将获得的沉淀滤出并用少量冰丙酮和乙醚洗涤得到1.02mg用下式表 示的目的化合物的白色晶体。其收率约为70％。
眼内药物动力学试验
眼内药物动力学试验用荧光光度测定法在兔子中进行。
测量技术难以对上述制备的药物-PEG偶联物微小量组织转移 进行实际追踪。因此，用具有荧光性并且可以被高灵敏性测量的荧光 素作为模型药物，合成荧光素-PEG偶联物(下文中被称为 “FL-PEG”)，进行眼内药物动力学试验。荧光素钠(下文中被称为 “FL”)用作对比物质。
FL-PEG的合成
在氮气下，将NH2-PEG-丙酸[Shearwater Polymers Co.，Ltd.生产] (1.00g；约0.20mmol)和三乙胺(55.6μl；0.40mmol)溶于甲醇(100ml) 中。使用平均分子量约为5,000的PEG。然后将异硫氰酸荧光素 (233mg；0.60mmol)添加到溶液中，将混合物在室温下搅拌过夜。 将反应混合物减压浓缩至干燥，然后将所得固体物质溶解于氯仿/甲醇 (1/1，v/v)中，通过柱色谱去除未反应的异硫氰酸荧光素。将分离 的流分浓缩，将浓缩物放入30倍量的乙醚中，滤出所得沉淀物并用 少量乙醚洗涤得到0.86g以下式表示的目的化合物的灰黄色晶体。
液体制剂的制备：
将已灭菌的2.6％甘油溶液(10ml)加入FL-PEG(18mg)中，搅 拌该液体以溶解FL-PEG制备注射剂。用相似方法制备含10μg/ml FL 的注射剂。
给药方法和测量方法：
1)将以7∶3的比例含有盐酸氯胺酮水溶液(50mg/ml)和盐酸 甲苯噻嗪水溶液(50mg/ml)的混合溶液肌肉内给药对大白鼠进行麻 醉。
2)将托吡卡胺(0.5％)/盐酸苯肾上腺素(0.5％)滴眼液滴入眼 中引起瞳孔放大。
3)用盐酸奥布卡因(0.5％)滴眼液麻醉眼睛。
4)用配有30G针头的注射器将上述FL-PEG或FL液体制剂以 100μl的量通过眼睫状环分别注射到眼睛的玻璃体内。
5)眼内荧光强度在向玻璃体给药后的即刻以及第1、2、4、7、 15、18、23、28、35、42、49和56天的不同时间用荧光光度测定设 备测量。绘制校正曲线，测定玻璃体和视网膜中浓度的变化。然后， 通过力矩法由浓度的变化计算各自的半衰期。上述操作2)在眼内荧 光强度测量之前进行。
结果：
图1是显示玻璃体内浓度变化的曲线图。图1显示在给药后第二 天或以后没有检测到FL，而甚至在第56天还能检测到存在于玻璃体 内的FL-PEG。图2是显示视网膜中浓度变化的曲线图。图2显示FL 仅在给药后第一天检测到，而甚至在第56天还能检测到存在于视网 膜内的FL-PEG。
另外，表1显示FL和FL-PEG在玻璃体和视网膜中的半衰期。 FL-PEG在玻璃体中的半衰期是3.4天，而FL在玻璃体中的半衰期仅 为小于四个小时。这说明FL-PEG显著延长了在玻璃体内的保留期。 FL-PEG在视网膜中的半衰期是11.0天。由于FL仅在向视网膜给药 后的第一个时间点被检测到，无法计算其半衰期。但是很明显，该半 衰期非常短。因此，猜想FL-PEG从玻璃体移向视网膜，并在那里长 时间保持。
表1(玻璃体和视网膜中的半衰期)
试验物质 玻璃体 视网膜 FL-PEG 3.4天 11.0天 FL ＜4小时 -
表中的数值是三个样本的均数。FL-PEG在玻璃体中的半衰期用 第4到第28天测量的数值进行计算。FL-PEG在视网膜中的半衰期用 第1到第56天测量的数值进行计算。FL在玻璃体中的半衰期用给药 后即刻测量和给药后第1天测量的数值进行计算。
药理学试验
1.向氪激光引起脉络膜新血管形成的大鼠玻璃体内施用倍他米 松-PEG偶联物的效果
将根据实施例制备的倍他米松-PEG偶联物(下文中称为 “BM-PEG”)玻璃体内施用于大鼠，研究其对氪激光引起的脉络膜 新血管形成的效果。
液体制剂的制备
将灭菌的生理盐水(1ml)添加到BM-PEG(100mg)中，搅拌该 液体溶解BM-PEG以制备施用于玻璃体的注射剂。
给药方法和测量方法：
1)将以7∶1的比例含有盐酸氯胺酮水溶液(50mg/ml)和盐酸 甲苯噻嗪水溶液(50mg/ml)的混合溶液以1ml/kg肌肉内给药，对大 鼠进行全身麻醉。
2)将0.5％托吡卡胺-0.5％盐酸苯肾上腺素溶液滴入眼中引起 瞳孔放大，然后用氪激光光凝固装置(red)在点大小为100μm、输 出功率为100mW以及凝固时间为0.1秒的凝固条件下进行光凝固。
3)用观察组织的盖玻片作为接触镜，在眼底后极部分每只眼八 个点处分散地进行光凝固，避开厚的视网膜血管。为了切割布鲁赫膜， 光凝固聚焦于视网膜后部进行。光凝固后，对眼底进行照像。
4)用配有33G针头的注射器将5μl量的上述BM-PEG或赋形剂 (生理盐水)通过眼睫状环分别注射到两眼玻璃体的中心。
5)在光凝固后的第14天，将0.1ml 10％荧光素静脉内注射入尾 部，进行荧光素眼底血管造影术。
6)在荧光素眼底血管造影术中，不能观察到荧光性血细胞渗出 的光凝固位点被判断为阴性，观察到荧光性血细胞渗出的光凝固位点 被判断为阳性。当有两个观察到少量荧光性血细胞渗出的光凝固位点 时，它们被判断为阳性。根据下列方程式计算新血管形成的显示率。
新血管形成显示率(％)＝(阳性光凝固位点数/总光凝固位点数) ×100
结果：
表2显示玻璃体内施用BM-PEG对脉络膜新血管形成的效果。在 施用赋型剂的眼中新血管形成的显示率为75.0％，而在施用BM-PEG 的眼中新血管形成的显示率为3 5.4％。因此，通过在玻璃体内施用 BM-PEG抑制了新血管形成显示。
表2
试验物质 新血管形成的显示率(％) 赋型剂 75.0 BM-PEG 35.4
表中的数值分别是施用赋型剂的七只眼睛的均值和施用BM-PEG 的六只眼睛的均值。
2.给大鼠结膜下施用倍他米松-PEG偶联物对氪激光引起脉络 膜新血管形成的效果
将根据实施例制备的倍他米松-PEG偶联物(下文中称为 “BM-PEG”)结膜下施用于大鼠，研究其对氪激光引起的脉络膜新 血管形成的效果。用磷酸倍他米松(下文中称为“BP”)作为比较物。
液体制剂的制备：
将灭菌的生理盐水(1ml)添加到BM-PEG(40mg)中，搅拌该 液体溶解BM-PEG以制备结膜下给药的注射剂。用相似方法制备了含 2.8mg/ml BP的注射剂。
给药方法和测量方法：
通过对上述玻璃体内施用试验的第4)项进行如下修改，即为此 处的给药方法和测量方法。
4)用配有30G针头的注射器将50μl量的上述BM-PEG或BP 分别结膜下注射到两只眼睛中。
结果：
表3显示结膜下施用的BM-PEG对脉络膜新血管形成的效果。在 施用赋型剂的眼中新血管形成的显示率为71.9％，而在施用BM-PEG 的眼中新血管形成的显示率为35.4％。因此，结膜下施用的BM-PEG 抑制了新血管形成的显示。施用未与PEG连接的BP，新血管形成的 显示率为50.0％。虽然观察到了BP的抑制效果，但其效果小于 BM-PEG。这些结果显示通过形成PEG偶联物延长了药物在眼组织中 的保持期，并且增强了其抑制效果。
表3
试验物质 新血管形成的显示率(％) 赋型剂 71.9 BM-PEG 35.9 BP 50.0
表中的数值分别是八只眼睛的均值。
工业实用性
通过使用本发明含药物-PEG偶联物的眼组织注射剂，药物能够 在眼组织如虹膜、睫状体、玻璃体、视网膜和视神经中长时间保持。 因此，本发明眼组织注射剂使得通过一次性给药来治疗或预防多种眼 组织中的疾病成为可能。
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