磷酸肌醇3-激酶(PI3K)是在很多细胞活性(包括细胞生长、重塑 和细胞凋亡)中发挥关键作用的信号传导酶[Wymann和Pirola， Biochem Biophys Acta.1998，1436：127-150；Anderson等，J.Biol.Chem.， 1999，274：9907-9910；Rameh等，J.Biol.Chem.，1999，274：8347-8350； Cantrell，J Cell Sci.2001，114：1439-1445；Coelho和Leevers，J Cell Sci. 2000，113：2927-2934；Vanhaesebroeck等，Ann.Rev Biochem.2001，70： 535-602；Northcott等，Circ Res.91：360-369(2002)；Yang等，Am J Physiol Heart Circ Physiol.280：H2144-H2152(2001)；Komalavilas等，J Appl Physiol.91：1819-1827(2001)]，PI3K还在许多其它细胞过程中 发挥作用，例如恶性转化、生长因子信号传导、炎症和免疫。有关 综述参见Rameh等，J.Biol.Chem.，274：8347-8350(1999)。这些不同 的活性至少部分归因于PI3K脂质和蛋白激酶活性。对PI3-激酶催化 亚基的克隆，使得将该多基因家族根据其底物特异性、序列同源性 和调节，可以分成三大类。I类PI3-激酶是最广泛深入研究的一类， 它含有两个亚基，其中一个主要起调节/衔接子的作用(p85α、p85β、 p55γ或p101同工型)，而另一个维持该酶的催化作用(p110α、p110β、 p110δ或p110γ同工型)[Wymann和Pirola，出处同上；Anderson等，出 处同上；Rameh等，出处同上；Cantrell，出处同上；Coelho和Leevers， 出处同上；Vanhaesebroeck等，出处同上]。
PI3-激酶的P110δ同工型的鉴定参见Chantry等，J.Biol.Chem.， 272：19236-41(1997)。发现了人p110δ同工型以局限于组织的方式表 达。它在淋巴细胞和淋巴组织中高水平表达。有关P110δ同工型的细 节还可参见美国专利5,858,753、5,822,910和5,985,589，所述专利结 合到本发明中作为参考。还可参见Vanhaesebroeck等，Proc Natl Acad Sci USA，94：4330-5(1997)以及国际专利申请WO97/46688。
PI3K至少部分通过催化将磷酸加到磷酸肌醇的肌醇环上而获得 细胞内信号传导[Wymann等，出处同上]。这些磷酸化产物目标之一 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(PKB或Akt)。Akt随后使若干下游目标 磷酸化，包括Bcl-2家族成员Bad和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 (caspase-9)，由此抑制它们的促细胞凋亡功能[Datta等，Cell91：231-41 (1997)；Cardone等，Science 282：1318-21(1998)]。Akt还已显示能使 分叉头型(forkhead)转录因子FKHR磷酸化[Tang等，J.Biol.Chem.， 274：16741-6(1999)]。另外，细胞凋亡机器的许多其它成员以及转录 因子都含有Akt共有磷酸化位点[Datta等，出处同上]。
Akt的磷酸化已被广泛用作多种细胞类型(包括上皮细胞)中的I 类PI3-激酶活性的间接测定法[Shiojima等，Circ.Res.，90：1243-1250 (2002)；Kandel等，Exp.Cell Res.，253：210-229(1999)；Cantley等， Science296：1655-1657(2002)]。PI3K活性是各种细胞类型生长因子 介导的存活所需要的[Fantl等，Ann.Rev.Biochem.62：453-81(1993)； Datta等，Genes & Dev.13：2905-27(1999)]。
已经证明，非选择性磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂LY294002和 渥曼青霉素(wortmannin)能使经照射的内皮细胞中肿瘤血管化的破坏 增强[Edwards等，Cancer Res.62：4671-77(2002)]，并且能部分抑制肥 大细胞脱粒[Tkaczyk等，J.Biol.Chem.，278：48474-84(2003)]。但是， LY294002和渥曼青霉素无法把I类PI3K中的四个成员区别开。例 如，渥曼青霉素对I类PI3K的各成员的IC50值范围均为1-10nM。类 似地，LY294002对这些PI3K的各成员的IC50值均约为1μM[Fruman 等，Ann.Rev.Biochem.67：481-507(1998)]。这些抑制剂不仅对I类 PI3K不具备选择性，而且还是DNA依赖性蛋白激酶、FRAP-mTOR、 平滑肌肌球蛋白轻链激酶和酪蛋白激酶2的有效抑制剂[Hartley等， Cell 82：849-56(1995)；Davies等，Biochem.J.351：95-105(2000)；Brunn 等，EMBO J.15：5256-67(1996)]。
因为p110α、pll0β、p110γ和p110δ同工型由多种不同的细胞类 型差异表达，所以给予诸如LY294002和渥曼青霉素等非选择性PI3K 抑制剂通常会影响可非靶向治疗的细胞类型。因此，这些非选择性 抑制剂的有效治疗剂量临床上是无法使用的，原因是非靶向的细胞 类型可能受到影响，尤其是当将这些非选择性抑制剂与其它免疫调 节疗法联合使用时。
肥大细胞扮演着不同且重要的角色。例如，肥大细胞参与介导 先天免疫系统中对变应原或寄生虫或细菌感染反应中所见到的一线 免疫应答。肥大细胞还能激活和募集其它的炎性细胞，例如嗜中性 粒细胞和T细胞，从而产生适应性免疫应答所需的二线免疫应答。 CD34+肥大细胞作为定型前体细胞在血液中循环，并在特定的组织部 位完全成熟。肥大细胞发育和成熟需要肥大细胞生长因子，亦称干 细胞因子(SCF)、青灰因子(steel factor)或KIT配体[Gurish等，J.Exp. Med.194：F1-F5(2001)]。KIT受体与其配体的相互作用促进肥大细胞 的增殖和分化[Féger等，Int.Arch.Allergy Immunol.127：110-14 (2002)]。
肥大细胞通过抗原结合的IgE交联细胞表面的高亲和性FcεRI IgE受体而被激活，在较小程度上通过IgG的FcγRI受体交联而被激 活[Tkaczyk等，Int Arch Allergy Immunol.133：305-15(2004)]。通过 FcεRI的激活一般见于急性变态反应和其它类型的超敏反应中，导致 对其它免疫细胞的刺激和完全传播的免疫应答。
肥大细胞中含有异染颗粒，它储存有各种通过肥大细胞激活释 放的炎症介质。这些介质包括：组胺和5-羟色胺；前列腺素D2；蛋 白水解酶，例如能破坏组织或酶解补体成分或凝固成分的类胰蛋白 酶；肝素或硫酸软骨素，它们是抗凝药；趋化因子，例如过敏毒素 反应的嗜酸性粒细胞趋化因子(一种重要的嗜酸性粒细胞功能调节剂) 和嗜中性粒细胞趋化因子。在肥大细胞激活过程中，这些介质被释 放至细胞环境中，引起急性和速发型免疫应答，例如血管通透性和 淋巴细胞募集。例如，类胰蛋白酶水平在1小时内上升，在4-6小时 内保持升高的水平，而组胺水平在约5分钟达到峰值，在15分钟内 迅速下降。组胺的释放引起血管扩张，而导致体液渗漏至周围组织 中，引起变态反应的很多初级症状。组胺和其它介质的释放还能导 致呼吸道收缩、水肿、血管充血、变态反应及哮喘的炎性细胞募集 特征[Djukanovic等，Clin Exp Allergy，26增刊3：44-51(1996)]。
在健康个体中，肥大细胞活性是必需且所需要的。然而，不需 要的肥大细胞活性或者正常或异常肥大细胞的过度增殖可能是各种 疾病和/或其症状的一种病因。在这些情况下，从治疗或预防观点来 看，通常需要降低或消除肥大细胞的活性和/或增殖。例如，大量免 疫介导的疾病都与肥大细胞释放的细胞因子、趋化因子和其它因子 有关。细胞因子、趋化因子和其它因子将淋巴细胞等其它免疫细胞(包 括嗜中性粒细胞和T细胞)募集到炎症部位。这可能会导致多种免疫 介导的疾病。例如，最近发现肥大细胞活性(例如脱粒)和类胰蛋白酶 蛋白定位于多发性硬化患者的脑脊液内，多发性硬化是一种通常认 为是由T细胞活性介导的自身免疫性疾病[Rozniecki等，Ann Neurol. 37：63-66(1995)]。另外，诱发产生多发性硬化的实验模型的肥大细 胞缺陷型小鼠(W/Wv)，证明MS样症状的延迟产生[Secor等，J.Exp. Med.191：813-22(2000)]。
类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，其特征为关节的慢性 炎症和在关节的滑液中存在炎性细胞，从而导致疼痛和衰弱性疾病。 将抗体灌输至细胞质酶后，缺乏肥大细胞的小鼠显示对诱发关节炎 样症状的抗性[Lee等，Science 297：1689-1693(2002)]。肥大细胞聚集 在胶原诱发关节炎和该病过程中脱粒所影响的小鼠肢体[Woolley等， Arthritis Res.2：65-74(2000)]，由此表明肥大细胞在介导炎症并将另 外的细胞募集至类风湿性关节炎患者关节中发挥作用。
肥大细胞群体大多数都存在于皮肤上。业已证明，大疱性类天 疱疮，一种皮肤中具有抗细胞连接蛋白的自身抗体的自身免疫性疾 病，依赖于肥大细胞活化[Chen等，J Clin Invest.108：1151-58(2001)]。 肥大细胞缺陷型W/Wv小鼠不会发生大疱性类天疱疮，虽然在皮肤中 存在类似于正常小鼠的自身抗体和补体蛋白，但是W/Wv小鼠缺乏嗜 中性粒细胞募集至皮肤。另外，有证据表明，在大疱性类天疱疮患 者中检测到肥大细胞介质[Wintroub等，New Eng.J.Med 298：417-21 (2001)]。
认为肥大细胞所致的其它免疫性疾病包括斯耶格伦综合征 (Sjogren′s syndrome)[Konttinen等，Rheumatol Int.19：141-7(2000)]、 慢性荨麻疹[Napoli等，Curr Allergy Asthma Rep.1：329-36(2001)]、甲 状腺眼病[Ludgate等，Clin Exp Immunol.2002 127：193-8(2002)]、血 管炎[Kiely等，J Immunol.159：5100-6(1997)]和腹膜炎[Malavyn等， Nature 381：77-80(1996)]。
另一大类肥大细胞相关病症或疾病被称为肥大细胞病或肥大细 胞增生病。肥大细胞增生病包括以在各种组织中肥大细胞增殖和聚 集为特征的不同类型的临床疾病，所述组织最常见的是皮肤，但也 可以是骨骼系统、造血系统、胃肠道系统、心肺系统和中枢神经系 统中的组织。肥大细胞增生病的特征为肥大细胞过度增殖，以可预 见的模式分布于整个皮肤(例如皮肤肥大细胞增生病和色素性荨麻 疹)、骨髓、胃肠道、淋巴结、肝脏和脾脏[Brockow等，Curr.Opin. Allergy Clin.Immunol.1：449-54(2001)]。
肥大细胞增生病分为家族性肥大细胞增生病或散发性肥大细胞 增生病，后者进一步被细分为皮肤肥大细胞增生病或系统性肥大细 胞增生病。系统性肥大细胞增生病还分为无痛性(慢性)肥大细胞增生 病和攻击性肥大细胞增生病，以及肥大细胞性白血病。肥大细胞增 生病的类型还在有相关血液疾病(AHD)时出现(Brockow等，出处同 上)。皮肤肥大细胞增生病(CM)有一般临床病变和组织学皮肤病变， 但却不存在与系统有关的确定体征(判别标准)。大多数CM患者为儿 童，并呈现斑丘疹样皮肤肥大细胞增生病(例如色素性荨麻疹，UP)。 其它不常见的CM形式为弥漫性皮肤肥大细胞增生病(DCM)和皮肤 肥大细胞瘤。
系统性肥大细胞增生病(SM)常见于成人，并通过骨髓(几乎广泛 表达，主要的诊断指标)或其它真皮外器官的多病灶性组织病变以及 系统性疾病(SM指标)的细胞学和生物化学迹象(次要指标)来确诊。 攻击性系统性肥大细胞增生病以器官功能削弱为特征，原因是骨髓、 肝脏、脾脏、胃肠道或骨骼系统被病理性肥大细胞(MC)浸润。肥大 细胞性白血病是“高级”白血病，通过骨髓涂片(≥20％)和外周血中 MC数量的增加、缺乏皮肤病变、多器官衰竭和生存期缩短等确诊。 在典型病例中，循环MC数量占白细胞的10％以上(典型MCL形式)。 肥大细胞肉瘤是由非典型MC构成的单病灶肿瘤，并呈现出破坏性 生长而不累及(初级)系统。这种高级恶性MC病在真皮外器官(真皮 外肥大细胞瘤)或皮肤上区别于局限性良性肥大细胞瘤。
另外，导致肥大细胞过度增殖的KIT受体中的突变已在患有以 下疾病的患者中发现：急性髓细胞性白血病(AML)[Beghini等，Cancer Genet Cytogenet.119：26-31(2000)]、慢性骨髓性白血病[Cairoli等， Hematol J.5：273-5(2004)]、慢性骨髓单核细胞性白血病[Sotlar等， Leuk Res.26：979-84(2002)]、生殖细胞肿瘤[Sakuma等，Cancer Sci.94： 486-91(2003)]和胃肠基质肿瘤(GIST)[Heinrich等，J.Clin.Oncol.20： 1692-1703(2002)]。
虽然已研制出治疗与不需要的肥大细胞活性有关的疾病(例如变 态反应和哮喘)的某些具体方法，但肥大细胞相关疾病的治疗方案一 般都采用为其它增殖性疾病或免疫性疾病所研制的非特异性治疗方 案(例如组胺受体阻断剂、前列腺素阻断剂、类固醇)，从而导致不完 全的治疗、非有效的治疗或者引起多种免疫抑制副作用的治疗。
另外，可用于治疗与不需要的肥大细胞活性有关的疾病的很多 疗法的明显缺陷，是对治疗所靶向的肥大细胞和其它类型细胞中很 多细胞酪氨酸激酶的非特异性抑制。例如，最初研制的治疗肥大细 胞增殖性疾病的两种激酶抑制剂疗法是抑制诸如以下的激酶：血小 板衍生生长因子受体(PDGF-R)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)或 Bcr/Abl突变体。这些潜在的疗法不能对所有类型的肥大细胞增生病 有效。因此，目前本领域存在对研制更特异性地靶向参与介导肥大 细胞活性的激酶的有效疗法的需求。
因此，一个重要且有意义的目的是开发和研制能治疗和预防与 变态反应和肥大细胞相关疾病有关的疾病的可利用的更安全更有效 的方法，并提供易于临床操作和延续患者依从性的疗法。本发明正 是基于此目的和其它需求。
发明概述
本发明提供有效治疗或预防至少部分与不需要的肥大细胞活性 有关或由其引起的疾病和/或疾病症状的方法。本发明的方法特别适 用于治疗或预防由肥大细胞上免疫球蛋白受体交联介导的疾病(或与 该病有关的症状)。
在一个实施方案中，本发明提供一种抑制肥大细胞活性的方法， 该方法包括给予个体磷酸肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)选择性抑制剂，其用 量有效抑制肥大细胞活性。一方面，被抑制的肥大细胞活性是肥大 细胞迁移、肥大细胞增殖、肥大细胞脱粒或者由肥大细胞表达或分 泌细胞因子、趋化因子或生长因子。另一方面，所述细胞因子是 TNF-α。在一个相关方面，所述细胞因子是IL-6。在一个相关方面， 被抑制的趋化因子是嗜伊红粒细胞趋化因子(eotaxin)、MIP-1α、MIP- 1β、MDC-1、MCP-1或淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)。
在一个相关实施方案中，本发明提供在与不需要的肥大细胞活 性有关的疾病中降低或防止淋巴细胞浸润到炎症部位的方法，该方 法包括下述步骤：给予个体磷酸肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)选择性抑制剂， 其用量有效降低或防止淋巴细胞浸润到所述炎症部位，并且有效降 低所述个体的肥大细胞引起的淋巴细胞募集信号传导。与不需要的 肥大细胞活性有关的疾病，是任何不需要的肥大细胞活性的潜在作 用引起或者与之相关的任何疾病。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗或预防个体的与不需要 的肥大细胞活性有关的疾病的方法，该方法包括下述步骤：给予磷 酸肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)选择性抑制剂，其用量有效治疗或预防与不 需要的肥大细胞活性有关的疾病。一方面，为了治疗或预防与不需 要的肥大细胞活性有关的疾病，选择性PI3Kδ抑制剂能抑制肥大细胞 活性。这样的肥大细胞活性的实例包括肥大细胞迁移、肥大细胞增 殖、肥大细胞脱粒或者由肥大细胞表达或分泌细胞因子、趋化因子 或生长因子。
本发明的方法包括治疗或预防由肥大细胞上免疫球蛋白受体交 联介导的疾病(或与疾病有关的症状)。“免疫球蛋白交联介导的”或 “Ig介导的”是指Ig与肥大细胞上的受体结合后引起或加重与不需 要的肥大细胞活性有关的疾病的能力。激活肥大细胞的免疫球蛋白 包括IgG和IgE。在一个实施方案中，与不需要的肥大细胞活性有关 的疾病是IgE介导的疾病。在另一个实施方案中，所述疾病是IgG 介导的疾病。在再一个实施方案中，所述疾病是由细胞因子、趋化 因子或其它生长因子等其它刺激物所介导的。
适合用本发明方法治疗或预防的疾病或疾病症状包括但不限于 哮喘、变态反应或自身免疫性疾病。
一方面，变态反应是I型超敏反应、变应性鼻炎、变应性结膜 炎、特应性皮炎或变应性哮喘。I型超敏反应，是抗原(变应原)与结 合于组织肥大细胞和血液嗜碱性粒细胞上的膜受体的特异性IgE抗体 相结合的反应。所述抗原-抗体反应引起有效的血管活性和炎症介质 (例如组胺、类胰蛋白酶、白三烯和前列腺素)的快速释放和促炎性细 胞因子(例如白介素-4和白介素-13)的稍后释放。所述介质产生血管 舒张、毛细管通透性增强、腺体分泌过多、平滑肌痉挛和其它炎性 细胞的组织浸润。I型超敏性疾病的实例包括变应性鼻炎、变应性结 膜炎、特应性皮炎、变应性哮喘、某些荨麻疹和GI食物反应症状和 全身性过敏反应。
另一方面，所述疾病是自身免疫性疾病。本发明涉及的自身免 疫性疾病可以是多发性硬化、类风湿性关节炎、大疱性类天疱疮、 斯耶格伦综合征、慢性荨麻疹、甲状腺眼病、血管炎和腹膜炎。
本发明提供一种给予PI3Kδ选择性抑制剂的本发明方法，所述 抑制剂的用量有效抑制所述肥大细胞中的Akt磷酸化。
术语“选择性PI3Kδ抑制剂”及其本发明中所用的诸如“PI3Kδ 选择性抑制剂”和“PI3Kδ的选择性抑制剂”等表述形式，是指能比 PI3Kδ家族的其它同工酶更有效地抑制PI3Kδ同工酶的化合物。“选 择性PI3Kδ抑制剂”化合物应理解为对PI3Kδ的选择性要比常规和一 般称为PI3Kδ抑制剂的化合物(例如渥曼青霉素或LY294002)的选择 性更高。反过来说，渥曼青霉素和LY294002被认为是“非选择性PI3Kδ 抑制剂”。
化合物作为酶活性(或其它生物活性)抑制剂的相对功效，可通过 测定各化合物抑制预定范围的活性时的浓度，然后对比结果来确定。 通常，优选的测定为在生化试验中抑制50％活性的浓度，即50％抑 制浓度或“IC50”。通过应用本领域已知的常规技术，可以测得IC50 值。一般来说，通过测量所研究的抑制剂浓度存在下的给定酶活性， 可以确定IC50。然后，将实验获得的酶活性值对所用抑制剂浓度作图。 将具有50％酶活性(与不存在任何抑制剂的活性相比)的抑制剂浓度定 义为IC50值。类似地，可通过活性的适当确定，定义其它抑制浓度。 例如，在某些情况下，可能需要建立90％抑制浓度，即IC90，等等。
因此，“选择性PI3Kδ抑制剂”可以理解为是指对PI3Kδ具有50％ 抑制浓度(IC50)的化合物，该IC50值比任何或所有的其它I类PI3K家 族成员的IC50值至少低10倍，另一方面至少低20倍，再一方面至 少低30倍。在本发明一个可选择的实施方案中，术语选择性PI3Kδ 抑制剂可以理解为是指对PI3Kδ具有IC50的化合物，该IC50值比任何 或所有的其它I类PI3K家族成员的IC50值至少低50倍，另一方面至 少低100倍，再一方面至少低200倍，又一方面至少低500倍。在 另一个实施方案中，术语选择性PI3Kδ抑制剂是指负调节p110δ表达 的寡核苷酸，与任何或所有的其它I类PI3K家族催化亚基(即p110α、 p110β和p110γ)相比，它使p110δ表达下调至少10倍，另一方面至少 20倍，再一方面至少30倍。如上所述，可以给予个体适量的PI3Kδ 选择性抑制剂，致使所述抑制剂能保留其PI3Kδ选择性。
范围在本文中可表示为“大约”或“近似”一个具体值和/或至 “大约”或“近似”另一个具体值。当这样表示范围时，另一个实 施方案包括一个具体值和/或至另一个具体值。同样，当各数值用近 似值表示并使用诸如“约”或“至少约”等先行词时，应清楚的是 具体值构成另一个实施方案。
可以使用任何选择性PI3Kδ活性抑制剂，包括但不限于小分子 抑制剂、肽抑制剂、非肽抑制剂、天然抑制剂和合成抑制剂。合适 的PI3Kδ选择性抑制剂在Sadhu等的美国专利公布第2002/161014号 中已有记载，该专利申请的全部公开内容结合到本发明中作为参考。
另一方面，可以使用任何类型的能选择性负调节p110δ表达(即 比其它PI3K家族的同工酶更有效)并具有可接受的药理性质的化合 物，来作为本发明方法中的选择性PI3Kδ抑制剂。因此，在一个实施 方案中，本发明提供通过反义寡核苷酸与编码p110δ的信使RNA (mRNA)杂交来负调节p110δ表达的应用。一方面，本发明方法中可 以使用降低p110δ表达的寡核苷酸。
可以将本发明方法应用于体内(in vivo)或离体(ex vivo)细胞群 体。“体内”是指有生命的个体内，例如动物或人体内。在该内容 中，本发明方法可以治疗性用于个体，如下所述。该方法也可以预 防性使用。
“离体”指有生命的个体外。离体细胞群体的实例包括体外(in vitro)细胞培养物和生物学样本，包括但不限于从个体获得的体液或 组织样本。这些样本可根据本领域熟知的方法获得。生物流体样本 的实例包括血液、脑脊液和唾液。组织样本的实例包括肿瘤样本和 组织活检样本。在该内容中，本发明可用于各种目的，包括治疗目 的和实验目的。例如，本发明可以离体使用，以确定对于给定适应 症、细胞类型、个体和其它参数，PI3Kδ选择性抑制剂的最佳给药方 案和/或剂量。可将从这些应用中收集的信息用于实验目的，或者用 于临床，以设计出供体内治疗用的方案。可适于本发明的其它离体 应用在下文中有描述，或者对于本领域技术人员是显而易见的。
本文所用“肥大细胞活性”是指由肥大细胞所执行的生物活性， 而这些肥大细胞是可用本发明方法中使用的化合物进行调节的。这 些活性的实例包括细胞迁移、增殖、激活、脱粒，趋化因子、细胞 因子或其它生长因子的表达或分泌，以及信号传导途径的调节，例 如AKT磷酸化的调节。
另外，本文中可以使用“肥大细胞活性的调节”。本文所用肥 大细胞活性的“调节”，是指在给予选择性PI3Kδ抑制剂后，对肥大 细胞的上述活性中的其中一种活性的降低、抑制、防止、促进或增 强作用。选择性PI3Kδ抑制剂可抑制酶本身，可抑制PI3Kδ酶的任何 下游信号传导作用，或者抑制肥大细胞的任何进一步的下游活性。 它还可发挥预防性作用，以防止上述具体的肥大细胞活性，例如脱 粒或细胞迁移。抑制剂可在降低、抑制或防止一种肥大细胞活性过 程中，促进或增强另一种肥大细胞活性。例如，可以增加第一种细 胞因子、趋化因子或生长因子的产生，同时降低或抑制不同的第二 种次级细胞因子、趋化因子或生长因子。
“不需要的肥大细胞活性”是指偏离正常、正确或预期过程的 肥大细胞活性。例如，不需要的肥大细胞脱粒可以包括在对个体引 起超敏反应的变态反应过程中的脱粒，而不需要的迁移可以包括肥 大细胞运动到或者移出具有不合需要的生物作用的组织部位。不需 要的肥大细胞增殖可以包括由不适当的高水平细胞分裂、不适当的 低水平细胞凋亡或者二者兼有而介导或引起的细胞增殖。
“抑制不需要的肥大细胞活性”是指减慢不需要的肥大细胞活 性发生的速率或者使其停止。这可由降低肥大细胞受体激活速率、 降低炎症介质或生长因子释放速率、降低细胞复制速率或者增加细 胞死亡速率来实现。细胞死亡可由任何机制引发，包括细胞凋亡和 有丝分裂崩溃。使用本发明方法可部分或完全抑制不需要的肥大细 胞活性。
“预防不需要的肥大细胞活性”是指本发明的方法可在出现不 需要的肥大细胞活性前预防性地用于防止或抑制该活性，或者防止 或抑制该活性的再次出现。因此，在所有的实施方案中，在不需要 的细胞活性未确定或者不需要的细胞活性未进行时，但分别推测或 预计要出现不需要的细胞活性情况下，可以体内或离体使用本发明。 另外，为防止或抑制不需要的肥大细胞活性的再次出现，本发明还 可用在不需要的肥大细胞活性先前已被治疗的所有情况下。
本文所用“治疗有效量”或者“有效量”是指有效抑制或逆转 所治疗的个体存在的症状的发展、或者缓解存在的症状、延长所治 疗的个体的生存期或治愈所治疗的个体的量。
本文所用“治疗指数”是毒性或不需要的作用与治疗效果或所 需效果之间的剂量比，用如下定义的LD50/ED50比值表示。本文所用 治疗指数的增加，是指达到所需效果所必需的治疗量降低，或者所 给予治疗药的疗效提高。
应清楚的是，本发明的治疗方法可用于人用药和兽用药的领域。 因此，所治疗的个体可以是哺乳动物，优选人，或者其它动物。对 于兽医用途，个体可以包括但不限于农场动物，包括牛、羊、猪、 马和山羊；陪伴动物，例如狗和猫；野外和/或动物园动物；实验室 动物，包括小鼠、大鼠、家兔、豚鼠和仓鼠；家禽，例如鸡、火鸡、 鸭和鹅。
本发明还提供按多剂量给予磷酸肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)选择性抑 制剂的方法。多剂量包括所述抑制剂或其它药物不止给予一个剂量。 本发明还提供给予选择性PI3Kδ抑制剂，其给药方案中包括共同给予 一种或多种另外的治疗化合物，一起用于治疗与不需要的肥大细胞 活性有关的疾病，所述另外的治疗化合物包括至少一种免疫调节剂 或其它用于治疗或预防所述疾病或症状的药物。
在一个实施方案中，本发明提供一种降低或防止患有与不需要 的肥大细胞活性有关的疾病的个体的肥大细胞活性的方法，该方法 包括给予所述个体治疗有效量的联合疗法，该联合疗法包括应用磷 酸肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)选择性抑制剂和免疫调节剂。本发明包括可 将所述联合药物按单一组合物形式给药，或者将各药物(例如所述抑 制剂和免疫调节剂)作为独立的组合物形式给药。必要时，本发明还 包括将各药物按多剂量形式给药。
在一个相关实施方案中，本发明提供一种降低或防止患有与不 需要的肥大细胞活性有关的疾病的个体的淋巴细胞浸润到炎症部位 的方法，该方法包括给予所述个体治疗有效量的联合疗法，该联合 疗法包括应用磷酸肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)选择性抑制剂和免疫调节 剂。
本发明所提及的免疫调节剂包括糖皮质激素或或皮质类固醇、 免疫抑制药、抗组胺药、氨基水杨酸盐、类固醇激素、非甾体抗炎 药(NSAID)、拟交感神经药和镇痛药。糖皮质激素的实例选自可的松、 地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松和布地奈德。 NSAID的实例选自布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂，例 如Vioxx(罗非考昔)和Celebrex(塞来考昔)和水杨酸盐。合适的镇 痛药包括对乙酰氨基酚、羟考酮、曲马多或盐酸丙氧芬。免疫抑制 药的实例选自硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤(6-MP))、环磷酰胺、环孢菌素、 甲氨蝶呤或青霉胺。还包括Xolair(奥马佐单抗)、白三烯拮抗剂或 其它变态反应或哮喘中的常用药物。
本发明方法可以包括将包含本发明抑制剂的制剂与具体的细胞 因子、淋巴因子或其它造血因子、溶血栓或抗血栓因子或者抗炎药 物一起给药。
更具体地讲但并不限于此，本发明方法可以包括将抑制剂与以 下的一种或多种药物一起给药：TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、 IL-16、IL-17、IL-18、IFN、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、血小板生 成素、干细胞因子和红细胞生成素。本发明的药物组合物还可以包 含其它已知的血管生成素，例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y和/ 或人血管生成素样多肽，和/或血管内皮生长因子(VEGF)。本发明药 物组合物中所用的生长因子包括血管生成素、骨形态发生蛋白-1、骨 形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发 生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白- 8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、 骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨 形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、 脑衍生神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体α、 细胞因子诱发的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱发的嗜中性粒 细胞趋化因子2α、细胞因子诱发的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内 皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、上皮衍生嗜中性粒细胞 引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细 胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成 纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因 子9、成纤维细胞生长因子10、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成 纤维细胞生长因子、胶质细胞系衍生神经营养因子受体α1、胶质细 胞系衍生神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生 长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合的表皮生长因子、肝细胞生 长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长 因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质 形成细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经 生长因子、神经生长因子受体、神经营养素-3、神经营养素-4、胎盘 生长因子、胎盘生长因子2、血小板衍生的内皮细胞生长因子、血小 板衍生生长因子、血小板衍生生长因子A链、血小板衍生生长因子 AA、血小板衍生生长因子AB、血小板衍生生长因子B链、血小板 衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子受体α、血小板衍生生长因 子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、 转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子 β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜在转 化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白 II、转化生长因子β结合蛋白III、I型肿瘤坏死因子受体、II型肿瘤坏 死因子受体、尿激酶型纤溶酶原激活物受体、血管内皮生长因子和 嵌合蛋白以及它们的生物学或免疫学活性片段。
可将治疗中所用的免疫调节剂按多剂量给药。本发明设计可根 据本发明联合疗法，将所述各药物按低剂量给药，即低于各药物单 独给药或治疗的临床情况下常规使用的剂量，原因是本发明抑制剂 的PI3Kδ选择性特性能提高本发明联合疗法的治疗指数(即特异性)。 降低给予个体的药物或疗法的剂量，能减小与高剂量有关的副作用 的发生率，由此可以改善所进行治疗的患者的生活质量。其它益处 包括改善患者依从性，降低为治疗副作用所需的高额住院费用。另 外，本发明方法特异性的优点在于它们比非选择性抑制剂(例如 LY294002和渥曼青霉素)，允许以更高剂量的PI3Kδ选择性抑制剂 进行治疗，并且还使本发明方法的治疗功效最大化。
另一方面，本发明方法可以包括将抑制剂与一种或多种其它药 物一起用药或者在治疗中同时使用，所述其它药物可以增强该抑制 剂的活性或者顺应其活性。这些其它要素和/或药物可与本发明抑制 剂产生协同作用或者使副作用最小化。
本发明方法涉及具有下式(I)结构的选择性PI3Kδ抑制剂化合物 或其药学上可接受的盐和溶剂合物的用途：

其中A是任选取代的含有至少两个氮原子的单环或双环体系， 并且该体系中的至少一个环为芳环；
X选自C(Rb)2、CH2CHRb和CH＝C(Rb)；
Y不存在，或者选自S、SO、SO2、NH、O、C(＝O)、OC(＝O)、 C(＝O)O和NHC(＝O)CH2S；
R1和R2独立选自氢、C1-6烷基、芳基、杂芳基、卤素、NHC(＝O)C1-3 亚烷基N(Ra)2、NO2、ORa、CF3、OCF3、N(Ra)2、CN、OC(＝O)Ra、 C(＝O)Ra、C(＝O)ORa、芳基ORb、Het、NRaC(＝O)C1-3亚烷基C(＝O)ORa、 芳基OC1-3亚烷基N(Ra)2、芳基OC(＝O)Ra、C1-4亚烷基C(＝O)ORa、OC1-4 亚烷基C(＝O)ORa、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(＝O)ORa C(＝O)NRaSO2Ra、C1-4亚烷基N(Ra)2、C2-6亚烯基N(Ra)2、C(＝O)NRaC1-4 亚烷基ORa、C(＝O)NRaC1-4亚烷基Het、OC2-4亚烷基N(Ra)2、OC1-4 亚烷基CH(ORb)CH2N(Ra)2、OC1-4亚烷基Het、OC2-4亚烷基ORa、OC2-4 亚烷基NRaC(＝O)ORa、NRaC1-4亚烷基N(Ra)2、NRaC(＝O)Ra、 NRaC(＝O)N(Ra)2、N(SO2C1-4烷基)2、NRa(SO2C1-4烷基)、SO2N(Ra)2、 OSO2CF3、C1-3亚烷基芳基、C1-4亚烷基Het、C1-6亚烷基ORb、C1-3 亚烷基N(Ra)2、C(＝O)N(Ra)2、NHC(＝O)C1-3亚烷基芳基、C3-8环烷基、 C3-8杂环烷基、芳基OC1-3亚烷基N(Ra)2、芳基OC(＝O)Rb、NHC(＝O)C1-3 亚烷基C3-8杂环烷基、NHC(＝O)C1-3亚烷基Het、OC1-4亚烷基OC1-4 亚烷基C(＝O)ORb、C(＝O)C1-4亚烷基Het和NHC(＝O)卤代C1-6烷基；
或者R1和R2结合在一起形成5元或6元环中3个或4个原子的 亚烷基或亚烯基链部分，该5元或6元环任选含有至少一个杂原子；
R3选自任选取代的以下基团：氢；C1-6烷基；C3-8环烷基；C3-8 杂环烷基；C1-4亚烷基环烷基；C2-6烯基；C1-3亚烷基芳基；芳基C1-3 烷基；C(＝O)Ra；芳基；杂芳基；C(＝O)ORa；C(＝O)N(Ra)2；C(＝S)N(Ra)2； SO2Ra；SO2N(Ra)2；S(＝O)Ra；S(＝O)N(Ra)2；C(＝O)NRaC1-4亚烷基ORa； C(＝O)NRaC1-4亚烷基Het；C(＝O)C1-4亚烷基芳基；C(＝O)C1-4亚烷基 杂芳基；任选被一个或多个以下基团取代的C1-4亚烷基芳基：卤素、 SO2N(Ra)2、N(Ra)2、C(＝O)ORa、NRaSO2CF3、CN、NO2、C(＝O)Ra、 ORa、C1-4亚烷基N(Ra)2和OC1-4亚烷基N(Ra)2；C1-4亚烷基杂芳基； C1-4亚烷基Het；C1-4亚烷基C(＝O)C1-4亚烷基芳基；C1-4亚烷基C(＝O)C1-4 亚烷基杂芳基；C1-4亚烷基C(＝O)Het；C1-4亚烷基C(＝O)N(Ra)2；C1-4 亚烷基ORa；C1-4亚烷基NRaC(＝O)Ra；C1-4亚烷基OC1-4亚烷基ORa； C1-4亚烷基N(Ra)2；C1-4亚烷基C(＝O)ORa；和C1-4亚烷基OC1-4亚烷 基C(＝O)ORa；
Ra选自氢、C1-6烷基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-3亚烷基 N(Rc)2、芳基、芳基C1-3烷基、C1-3亚烷基芳基、杂芳基、杂芳基C1-3 烷基和C1-3亚烷基杂芳基；
或者两个Ra结合在一起形成任选含有至少一个杂原子的5元环 或6元环；
Rb选自氢、C1-6烷基、杂C1-3烷基、C1-3亚烷基杂C1-3烷基、芳 基杂C1-3烷基、芳基、杂芳基、芳基C1-3烷基、杂芳基C1-3烷基、C1- 3亚烷基芳基和C1-3亚烷基杂芳基；
Rc选自氢、C1-6烷基、C3-8环烷基、芳基和杂芳基；和
Het是5元或6元饱和或部分或全部不饱和的杂环，该杂环含有 至少一个选自氧、氮和硫的杂原子，并且任选被C1-4烷基或者 C(＝O)ORa取代。
本文所用术语“烷基”定义为含有指定碳原子数的直链和支链 烃基，一般为甲基、乙基及直链和支链的丙基和丁基。所述烃基可 最多含有16个碳原子，例如1-8个碳原子。术语“烷基”包括“桥 连烷基”，即C6-C16双环或多环烃基，例如降冰片基、金刚烷基、 双环[2.2.2]辛基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.2.1]辛基或十氢萘基。术 语“环烷基”定义为环状C3-C8烃基，例如环丙基、环丁基、环己基 和环戊基。
术语“烯基”的定义同“烷基”，只是其中含有碳-碳双键。“环 烯基”的定义类似于环烷基，只是环中存在碳-碳双键。
术语“亚烷基”定义为具有取代基的烷基。例如，术语“C1-3亚 烷基芳基”是指含有1-3个碳原子并被芳基取代的烷基。
术语“杂C1-3烷基”定义为还含有选自O、S和NRa的杂原子的 C1-3烷基。例如，-CH2OCH3或-CH2CH2SCH3。术语“芳基杂C1-3烷 基”是指具有杂C1-3烷基取代基的芳基。
术语“卤代”或“卤素”在本文中定义为包括氟、溴、氯和碘。
术语“芳基”单用或联用时，在本文中定义为单环或多环芳族 基团，例如苯基或萘基。除非另有说明，“芳基”可以未被取代或 者被一个或多个、尤其是1-3个以下取代基取代：卤素、烷基、苯基、 羟基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷基、硝基和氨基。芳基的 实例包括苯基、萘基、联苯基、四氢萘基、氯苯基、氟苯基、氨基 苯基、甲基苯基、甲氧基苯基、三氟甲基苯基、硝基苯基、羧基苯 基等。术语“芳基C1-3烷基”和“杂芳基C1-3烷基”定义为具有C1-3 烷基取代基的芳基或杂芳基。
术语“杂芳基”在本文中定义为含有一个或两个芳环的单环或 双环体系，并且在芳环中含有至少一个氮、氧或硫原子，所述环可 以未被取代或例如被一个或多个、尤其是1-3个以下取代基取代：卤 素、烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷基、硝 基和氨基。杂芳基的实例包括噻吩基、呋喃基、吡啶基、唑基、 喹啉基、异喹啉基、吲哚基、三唑基、异噻唑基、异唑基、咪唑 基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。
术语“Het”定义为含有一个或多个选自氧、氮和硫的杂原子的 单环、双环和三环基团。“Het”基团还可含有与该环连接的氧代基 (＝O)。Het的非限制性实例包括1，3-二氧戊环、2-吡唑啉、吡唑烷、 吡咯烷、哌嗪、吡咯啉、2H-吡喃、4H-吡喃、吗啉、硫代吗啉、哌 啶、1，4-二噻烷和1，4-二烷。
另外，本发明方法包括具有下式(II)结构的PI3Kδ选择性抑制剂 化合物或其药学上可接受的盐和溶剂合物的用途：

其中R4、R5、R6和R7独立选自氢、C1-6烷基、芳基、杂芳基、 卤素、NHC(＝O)C1-3亚烷基N(Ra)2、NO2、ORa、CF3、OCF3、N(Ra)2、 CN、OC(＝O)Ra、C(＝O)Ra、C(＝O)ORa、芳基ORb、Het、NRaC(＝O)C1-3 亚烷基C(＝O)ORa、芳基OC1-3亚烷基N(Ra)2、芳基OC(＝O)Ra、C1-4 亚烷基C(＝O)ORa、OC1-4亚烷基C(＝O)ORa、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基 C(＝O)ORa、C(＝O)NRaSO2Ra、C1-4亚烷基N(Ra)2、C2-6亚烯基N(Ra)2、 C(＝O)NRaC1-4亚烷基ORa、C(＝O)NRaC1-4亚烷基Het、OC2-4亚烷基 N(Ra)2、OC1-4亚烷基CH(ORb)CH2N(Ra)2、OC1-4亚烷基Het、OC2-4亚 烷基ORa、OC2-4亚烷基NRaC(＝O)ORa、NRaC1-4亚烷基N(Ra)2、 NRaC(＝O)Ra、NRaC(＝O)N(Ra)2、N(SO2C1-4烷基)2、NRa(SO2C1-4烷基)、 SO2N(Ra)2、OSO2CF3、C1-3亚烷基芳基、C1-4亚烷基Het、C1-6亚烷基 ORb、C1-3亚烷基N(Ra)2、C(＝O)N(Ra)2、NHC(＝O)C1-3亚烷基芳基、C3-8 环烷基、C3-8杂环烷基、芳基OC1-3亚烷基N(Ra)2、芳基OC(＝O)Rb、 NHC(＝O)C1-3亚烷基C3-8杂环烷基、NHC(＝O)C1-3亚烷基Het、OC1-4 亚烷基OC1-4亚烷基C(＝O)ORb、C(＝O)C1-4亚烷基Het和NHC(＝O)卤 代C1-6烷基；
R8选自氢、C1-6烷基、卤素、CN、C(＝O)Ra和C(＝O)ORa；
X1选自CH(即连接有氢原子的碳原子)和氮；
Ra选自氢、C1-6烷基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-3亚烷基 N(Rc)2、芳基、芳基C1-3烷基、C1-3亚烷基芳基、杂芳基、杂芳基C1-3 烷基和C1-3亚烷基杂芳基；
或者两个Ra结合在一起形成任选含有至少一个杂原子的5元环 或6元环；
Rc选自氢、C1-6烷基、C3-8环烷基、芳基和杂芳基；和
Het是5元或6元饱和或部分或全部不饱和的杂环，该杂环含有 至少一个选自氧、氮和硫的杂原子，并且任选被C1-4烷基或者 C(＝O)ORa取代。
在又一个实施方案中，本发明方法包括具有下式(III)结构的 PI3Kδ选择性抑制剂化合物或其药学上可接受的盐和溶剂合物的用 途：

其中R9、R10、R11和R12独立选自氢、C1-6烷基、芳基、杂芳基、 卤素、NHC(＝O)C1-3亚烷基N(Ra)2、NO2、ORa、CF3、OCF3、N(Ra)2、 CN、OC(＝O)Ra、C(＝O)Ra、C(＝O)ORa、芳基ORb、Het、NRaC(＝O)C1-3 亚烷基C(＝O)ORa、芳基OC1-3亚烷基N(Ra)2、芳基OC(＝O)Ra、C1-4 亚烷基C(＝O)ORa、OC1-4亚烷基C(＝O)ORa、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基 C(＝O)ORa、C(＝O)NRaSO2Ra、C1-4亚烷基N(Ra)2、C2-6亚烯基N(Ra)2、 C(＝O)NRaC1-4亚烷基ORa、C(＝O)NRaC1-4亚烷基Het、OC2-4亚烷基 N(Ra)2、OC1-4亚烷基CH(ORb)CH2N(Ra)2、OC1-4亚烷基Het、OC2-4亚 烷基ORa、OC2-4亚烷基NRaC(＝O)ORa、NRaC1-4亚烷基N(Ra)2、 NRaC(＝O)Ra、NRaC(＝O)N(Ra)2、N(SO2C1-4烷基)2、NRa(SO2C1-4烷基)、 SO2N(Ra)2、OSO2CF3、C1-3亚烷基芳基、C1-4亚烷基Het、C1-6亚烷基 ORb、C1-3亚烷基N(Ra)2、C(＝O)N(Ra)2、NHC(＝O)C1-3亚烷基芳基、C3-8 环烷基、C3-8杂环烷基、芳基OC1-3亚烷基N(Ra)2、芳基OC(＝O)Rb、 NHC(＝O)C1-3亚烷基C3-8杂环烷基、NHC(＝O)C1-3亚烷基Het、OC1-4 亚烷基OC1-4亚烷基C(＝O)ORb、C(＝O)C1-4亚烷基Het和NHC(＝O)卤 代C1-6烷基；
R13选自氢、C1-6烷基、卤素、CN、C(＝O)Ra和C(＝O)ORa；
Ra选自氢、C1-6烷基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-3亚烷基 N(Rc)2、芳基、芳基C1-3烷基、C1-3亚烷基芳基、杂芳基、杂芳基C1-3 烷基和C1-3亚烷基杂芳基；
或者两个Ra结合在一起形成任选含有至少一个杂原子的5元环 或6元环；
Rc选自氢、C1-6烷基、C3-8环烷基、芳基和杂芳基；和
Het是5元或6元饱和或部分或全部不饱和的杂环，该杂环含有 至少一个选自氧、氮和硫的杂原子，并且任选被C1-4烷基或者 C(＝O)ORa取代。
更具体地讲，本发明包含选自下列的PI3Kδ选择性抑制剂及其 混合物的用途：
(1)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-(2-氯苯基)-6，7-二甲氧基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(2)2-(6-氨基嘌呤-o-基甲基)-6-溴-3-(2-氯苯基)-3H-喹唑啉-4-酮；
(3)2-(6-氨基嘌呤-o-基甲基)-3-(2-氯苯基)-7-氟-3H-喹唑啉-4-酮；
(4)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-6-氯-3-(2-氯苯基)-3H-喹唑啉-4-酮；
(5)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-(2-氯苯基)-5-氟-3H-喹唑啉-4-酮；
(6)2-(6-氨基嘌呤-o-基甲基)-5-氯-3-(2-氯苯基)-3H-喹唑啉-4-酮；
(7)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-(2-氯苯基)-5-甲基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(8)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-8-氯-3-(2-氯苯基)-3H-喹唑啉-4-酮；
(9)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-联苯-2-基-5-氯-3H-喹唑啉-4-酮；
(10)5-氯-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(11)5-氯-3-(2-氟苯基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(12)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-5-氯-3-(2-氟苯基)-3H-喹唑啉-4-酮；
(13)3-联苯-2-基-5-氯-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(14)5-氯-3-(2-甲氧基苯基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉 -4-酮；
(15)3-(2-氯苯基)-5-氟-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(16)3-(2-氯苯基)-6，7-二甲氧基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹 唑啉-4-酮；
(17)6-溴-3-(2-氯苯基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(18)3-(2-氯苯基)-8-三氟甲基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑 啉-4-酮；
(19)3-(2-氯苯基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-苯并[g]喹唑啉- 4-酮；
(20)6-氯-3-(2-氯苯基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(21)8-氯-3-(2-氯苯基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(22)3-(2-氯苯基)-7-氟-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(23)3-(2-氯苯基)-7-硝基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉- 4-酮；
(24)3-(2-氯苯基)-6-羟基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉- 4-酮；
(25)5-氯-3-(2-氯苯基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(26)3-(2-氯苯基)-5-甲基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉- 4-酮；
(27)3-(2-氯苯基)-6，7-二氟-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉 -4-酮；
(28)3-(2-氯苯基)-6-氟-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(29)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-(2-异丙基苯基)-5-甲基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(30)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4-酮；
(31)3-(2-氟苯基)-5-甲基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉- 4-酮；
(32)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-5-氯-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4-酮；
(33)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-5-氯-3-(2-甲氧基-苯基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(34)2-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3-环丙基-5-甲基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(35)3-环丙基甲基-5-甲基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉- 4-酮；
(36)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-环丙基甲基-5-甲基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(37)2-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3-环丙基甲基-5-甲基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(38)5-甲基-3-苯乙基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(39)2-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-5-甲基-3-苯乙基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(40)3-环戊基-5-甲基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(41)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-环戊基-5-甲基-3H-喹唑啉-4-酮；
(42)  3-(2-氯吡啶-3-基)-5-甲基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹 唑啉-4-酮；
(43)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-(2-氯吡啶-3-基)-5-甲基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(44)3-甲基-4-[5-甲基-4-氧代-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-4H-喹唑 啉-3-基]-苯甲酸；
(45)3-环丙基-5-甲基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(46)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-环丙基-5-甲基-3H-喹唑啉-4-酮；
(47)5-甲基-3-(4-硝基苄基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉 -4-酮；
(48)3-环己基-5-甲基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(49)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-环己基-5-甲基-3H-喹唑啉-4-酮；
(50)2-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3-环己基-5-甲基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(51)5-甲基-3-(E-2-苯基环丙基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹 唑啉-4-酮；
(52)3-(2-氯苯基)-5-氟-2-[(9H-嘌呤-6-基氨基)甲基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(53)2-[(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)甲基]-3-(2-氯苯基)-5-氟-3H-喹唑 啉-4-酮；
(54)5-甲基-2-[(9H-嘌呤-6-基氨基)甲基]-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(55)2-[(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)甲基]-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(56)2-[(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)甲基]-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(57)(2-氯苯基)-二甲氨基-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(58)5-(2-苄氧基乙氧基)-3-(2-氯苯基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)- 3H-喹唑啉-4-酮；
(59)6-氨基嘌呤-9-甲酸3-(2-氯苯基)-5-氟-4-氧代-3，4-二氢-喹唑啉- 2-基甲酯；
(60)N-[3-(2-氯苯基)-5-氟-4-氧代-3，4-二氢-喹唑啉-2-基甲基]-2-(9H- 嘌呤-6-基硫烷基)-乙酰胺；
(61)2-[1-(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(62)5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(63)2-(6-二甲氨基嘌呤-9-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(64)5-甲基-2-(2-甲基-6-氧代-1，6-二氢-嘌呤-7-基甲基)-3-邻甲苯基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(65)5-甲基-2-(2-甲基-6-氧代-1，6-二氢-嘌呤-9-基甲基)-3-邻甲苯基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(66)2-(氨基-二甲氨基嘌呤-9-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(67)2-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(68)2-(4-氨基-1，3，5-三嗪-2-基硫烷基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(69)5-甲基-2-(7-甲基-7H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3-邻甲苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(70)5-甲基-2-(2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基硫烷基甲基)-3-邻甲苯基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(71)5-甲基-2-嘌呤-7-基甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4-酮；
(72)5-甲基-2-嘌呤-9-基甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4-酮；
(73)5-甲基-2-(9-甲基-9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3-邻甲苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(74)2-(2，6-二氨基-嘧啶-4-基硫烷基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(75)5-甲基-2-(5-甲基-[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶-7-基硫烷基甲基)-3- 邻甲苯基-3H-喹唑啉-4-酮；
(76)5-甲基-2-(2-甲硫基-9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3-邻甲苯基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(77)2-(2-羟基-9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(78)5-甲基-2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基硫烷基甲基)-3-邻甲苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(79)5-甲基-3-邻甲苯基-2-(1H-[1，2，4]三唑-3-基硫烷基甲基)-3H-喹 唑啉-4-酮；
(80)2-(2-氨基-6-氯-嘌呤-9-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(81)2-(6-氨基嘌呤-7-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4-酮；
(82)2-(7-氨基-1，2，3-三唑并[4，5-d]嘧啶-3-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(83)2-(7-氨基-1，2，3-三唑并[4，5-d]嘧啶-1-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(84)2-(6-氨基-9H-嘌呤-2-基硫烷基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(85)2-(2-氨基-6-乙基氨基-嘧啶-4-基硫烷基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(86)2-(3-氨基-5-甲硫基-1，2，4-三唑-1-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(87)2-(5-氨基-3-甲硫基-1，2，4-三唑-1-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(88)5-甲基-2-(6-甲基氨基嘌呤-9-基甲基)-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(89)2-(6-苄基氨基嘌呤-9-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(90)2-(2，6-二氨基嘌呤-9-基甲基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(91)5-甲基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(92)3-异丁基-5-甲基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(93)N-{2-[5-甲基-4-氧代-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-4H-喹唑啉- 3-基]-苯基}-乙酰胺；
(94)5-甲基-3-(E-2-甲基-环己基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H- 喹唑啉-4-酮；
(95)2-[5-甲基-4-氧代-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-4H-喹唑啉-3- 基]-苯甲酸；
(96)3-{2-[(2-二甲氨基乙基)甲基氨基]苯基}-5-甲基-2-(9H-嘌呤-6- 基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4-酮；
(97)3-(2-氯苯基)-5-甲氧基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉 -4-酮；
(98)3-(2-氯苯基)-5-(2-吗啉-4-基-乙氨基)-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲 基)-3H-喹唑啉-4-酮；
(99)3-苄基-5-甲氧基-2-(9H-嘌呤-6-基硫烷基甲基)-3H-喹唑啉-4- 酮；
(100)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-(2-苄氧基苯基)-5-甲基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(101)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-(2-羟基苯基)-5-甲基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(102)2-(1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(103)5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(104)2-(1-(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)丙基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(105)2-(1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)丙基)-5-甲基-3-邻甲苯基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(106)2-(2-苄氧基-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-5-甲基-3-邻甲苯基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(107)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-5-甲基-3-{2-(2-(1-甲基吡咯烷-2-基)- 乙氧基)-苯基}-3H-喹唑啉-4-酮；
(108)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-3-(2-(3-二甲氨基-丙氧基)-苯基)-5-甲 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(109)2-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-5-甲基-3-(2-丙-2-炔基氧基苯基)-3H- 喹唑啉-4-酮；
(110)2-{2-[1-(6-氨基嘌呤-9-基甲基)-5-甲基-4-氧代-4H-喹唑啉-3- 基]-苯氧基}-乙酰胺；
(111)2-[(6-氨基嘌呤-9-基)-甲基]-5-甲基-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(112)3-(3，5-二氟苯基)-5-甲基-2-[(嘌呤-6-基氨基)-甲基]-3H-喹唑啉- 4-酮；
(113)3-(2，6-二氯苯基)-5-甲基-2-[(嘌呤-6-基氨基)-甲基]-3H-喹唑啉- 4-酮；
(114)3-(2-氟-苯基)-2-[1-(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(115)2-[1-(6-氨基嘌呤-9-基)-乙基]-3-(3，5-二氟苯基)-5-甲基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(116)2-[1-(7-氨基-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-3-基)-乙基]-3-(3，5-二氟 苯基)-5-甲基-3H-喹唑啉-4-酮；
(117)5-氯-3-(3，5-二氟-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹唑 啉-4-酮；
(118)3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(119)5-氟-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(120)3-(2，6-二氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(121)6-氟-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(122)3-(3，5-二氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(123)5-氟-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(124)3-(2，3-二氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(125)5-甲基-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(126)3-(3-氯-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑 啉-4-酮；
(127)5-甲基-3-苯基-2-[(9H-嘌呤-6-基氨基)-甲基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(128)2-[(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-甲基]-3-(3，5-二氟-苯基)-5-甲基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(129)3-{2-[(2-二乙氨基乙基)-甲基-氨基]-苯基}-5-甲基-2-[(9H-嘌呤- 6-基氨基)-甲基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(130)5-氯-3-(2-氟-苯基)-2-[(9H-嘌呤-6-基氨基)-甲基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(131)5-氯-2-[(9H-嘌呤-6-基氨基)-甲基]-3-邻甲苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(132)5-氯-3-(2-氯-苯基)-2-[(9H-嘌呤-6-基氨基)-甲基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(133)6-氟-3-(3-氟-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉- 4-酮；
(134)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-氯-3-(3-氟-苯基)-3H- 喹唑啉-4-酮；
(135)5-甲基-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(136)2-[1-(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-3-苯基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(137)3-(2，6-二氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(138)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(2，6-二氟-苯基)-5-甲 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(139)3-(2，6-二氟-苯基)-2-[1-(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(140)3-(2，6-二氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨 基)-乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(141)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-5-甲基-3-苯基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(142)5-甲基-3-苯基-2-[1-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-丙基]- 3H-喹唑啉-4-酮；
(143)2-[1-(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-5-甲基-3-苯基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(144)5-甲基-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(145)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-3-苯基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(146)2-[2-苄氧基-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-3-苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(147)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-2-苄氧基-乙基]-5-甲基-3-苯基 -3H-喹唑啉-4-酮；
(148)2-[2-苄氧基-1-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-乙基]-5-甲基- 3-苯基-3H-喹唑啉-4-酮；
(149)2-[2-苄氧基-1-(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-3-苯基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(150)3-(4-氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑 啉-4-酮；
(151)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(4-氟-苯基)-5-甲基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(152)3-(4-氟-苯基)-2-[1-(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(153)3-(4-氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-乙 基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(154)5-甲基-3-苯基-2-[1-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-乙基]- 3H-喹唑啉-4-酮；
(155)3-(3-氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑 啉-4-酮；
(156)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(3-氟-苯基)-5-甲基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(157)3-(3-氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-乙 基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(158)5-甲基-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基)-吡咯烷-2-基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(159)2-[2-羟基-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-3-苯基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(160)5-甲基-3-苯基-2-[苯基-(9H-嘌呤-6-基氨基)-甲基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(161)2-[(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-苯基-甲基]-5-甲基-3-苯基-3H-喹 唑啉-4-酮；
(162)2-[(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)-苯基-甲基]-5-甲基-3-苯基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(163)5-甲基-3-苯基-2-[苯基-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-甲基]- 3H-喹唑啉-4-酮；
(164)5-氟-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(165)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-氟-3-苯基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(166)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-氯-3-苯基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(167)[5-(5-甲基-4-氧代-3-苯基-3，4-二氢-喹唑啉-2-基)-5-(9H-嘌呤-6- 基氨基)-戊基]-氨基甲酸苄酯；
(168)[5-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-5-(5-甲基-4-氧代-3-苯基-3，4-二 氢-喹唑啉-2-基)-戊基]-氨基甲酸苄酯；
(169)[4-(5-甲基-4-氧代-3-苯基-3，4-二氢-喹唑啉-2-基)-4-(9H-嘌呤-6- 基氨基)-丁基]-氨基甲酸苄酯；
(170)[4-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-4-(5-甲基-4-氧代-3-苯基-3，4-二 氢-喹唑啉-2-基)-丁基]-氨基甲酸苄酯；
(171)3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(172)2-[5-氨基-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-戊基]-5-甲基-3-苯基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(173)2-[5-氨基-1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-戊基]-5-甲基-3-苯基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(174)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(2，6-二甲基-苯基)-5- 甲基-3H-喹唑啉-4-酮；
(175)3-(2，6-二甲基-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H- 喹唑啉-4-酮；
(176)5-吗啉-4-基甲基-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(177)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-吗啉-4-基甲基-3-苯基 -3H-喹唑啉-4-酮；
(178)2-[4-氨基-1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丁基]-5-甲基-3-苯基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(179)6-氟-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(180)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-6-氟-3-苯基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(181)2-[2-叔丁氧基-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-3-苯基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(182)3-(3-甲基-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(183)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(3-甲基-苯基)-5-甲基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(184)3-(3-氯-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑 啉-4-酮；
(185)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(3-氯-苯基)-5-甲基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(186)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-2-羟基-乙基]-5-甲基-3-苯基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(187)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(3-氟-苯基)-3H-喹唑 啉-4-酮；
(188)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(2，6-二氟-苯基)-3H-喹 唑啉-4-酮；
(189)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-5-氟-3-苯基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(190)5-氯-3-(3-氟-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉- 4-酮；
(191)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-氯-3-(3-氟-苯基)-3H- 喹唑啉-4-酮；
(192)3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-三氟甲基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(193)3-(2，6-二氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(194)3-(2，6-二氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(195)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3-(2，6-二氟-苯基)-5-甲 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(196)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(2，6-二氟-苯基)-5-甲 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(197)3-(3，5-二氯-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(198)3-(2，6-二氯-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(199)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(2，6-二氯-苯基)-5-甲 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(200)5-氯-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(201)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-5-氯-3-苯基-3H-喹唑啉- 4-酮；
(202)5-甲基-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丁基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(203)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丁基]-5-甲基-3-苯基-3H-喹唑 啉-4-酮；
(204)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(3，5-二氯-苯基)-5-甲 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(205)5-甲基-3-(3-吗啉-4-基甲基-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙 基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(206)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-3-(吗啉-4-基甲 基-苯基)-3H-喹唑啉-4-酮；
(207)2-[1-(5-溴-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-乙基]-5-甲基-3-苯 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(208)5-甲基-2-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-乙基]-3- 苯基-3H-喹唑啉-4-酮；
(209)2-[1-(5-氟-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-乙基]-5-甲基-3-苯 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(210)2-[2-羟基-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(211)3-(3，5-二氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(212)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3-(3，5-二氟-苯基)-5-甲 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(213)3-(3，5-二氟-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(214)2-[1-(5-溴-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基)-乙基]-3-(3-氟-苯 基)-5-甲基-3H-喹唑啉-4-酮；
(215)3-(3-氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基 氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(216)3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(217)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(3，5-二氟-苯基)-3H-喹 唑啉-4-酮；
(218)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3-苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(219)6，7-二氟-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(220)6-氟-3-(3-氟-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉- 4-酮；
(221)2-[4-二乙氨基-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丁基]-5-甲基-3-苯基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(222)5-氟-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(223)3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(224)6-氟-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(225)3-(3，5-二氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(226)5-氟-2-[1-(2-氟-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-苯基-3H-喹唑啉-4- 酮；
(227) 3-(3-氟-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(228)5-氯-3-(3，5-二氟-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹唑 啉-4-酮；
(229)3-(2，6-二氟-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(230)3-(2，6-二氟-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑啉-4- 酮；
(231)5-甲基-3-苯基-2-[3，3，3-三氟-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(232)3-(3-羟基-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹 唑啉-4-酮；
(233)3-(3-甲氧基-苯基)-5-甲基-2-{1-[9H-嘌呤-6-基氨基]-乙基}-3H- 喹唑啉-4-酮；
(234)3-[3-(2-二甲氨基-乙氧基)-苯基]-5-甲基-2-{1-[9H-嘌呤-6-基氨 基]-乙基}-3H-喹唑啉-4-酮；
(235)3-(3-环丙基甲氧基-苯基)-5-甲基-2-{1-[9H-嘌呤-6-基氨基]-乙 基}-3H-喹唑啉-4-酮；
(236)5-甲基-3-(3-丙-2-炔基氧基-苯基)-2-{1-[9H-嘌呤-6-基氨基]-乙 基}-3H-喹唑啉-4-酮；
(237)2-{1-[2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基]-乙基}-3-(3-羟基苯基)-5-甲基- 3H-喹唑啉-4-酮；
(238)2-{1-[2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基]-乙基}-3-(3-甲氧基苯基)-5-甲 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(239)2-{1-[2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基]-乙基}-3-(3-环丙基甲氧基-苯 基)-5-甲基-3H-喹唑啉-4-酮；
(240)2-{1-[2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基]-乙基}-5-甲基-3-(3-丙-2-炔基 氧基-苯基)-3H-喹唑啉-4-酮；
(241)3-(3-乙炔基-苯基)-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H- 喹唑啉-4-酮；
(242)3-{5-甲基-4-氧代-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-4H-喹唑啉-3- 基}-苯甲腈；
(243)3-{5-甲基-4-氧代-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-4H-喹唑啉-3- 基}-苯甲酰胺；
(244)3-(3-乙酰基-苯基)-5-甲基-2-{1-[9H-嘌呤-6-基氨基]-乙基}-3H- 喹唑啉-4-酮；
(245)2-(3-(5-甲基-4-氧代-2-{1-[9H-嘌呤-6-基氨基]-乙基}-4H-喹唑啉 -3-基-苯氧基乙酰胺；
(246)5-甲基-2-{1-[9H-嘌呤-6-基氨基]-乙基}-3-[3-(四氢吡喃-4-基氧 基)-苯基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(247)3-[3-(2-甲氧基-乙氧基)-苯基]-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)- 乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(248)6-氟-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-[3-(四氢吡喃-4-基氧基)- 苯基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(249)3-[3-(3-二甲氨基-丙氧基)-苯基]-5-甲基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨 基)-乙基]-3H-喹唑啉-4-酮；
(250)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-(3-乙炔基-苯基)-5-甲 基-3H-喹唑啉-4-酮；
(251)3-{2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-4-氧代-4H-喹 唑啉-3-基}-苯甲腈；
(252)3-{2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-4-氧代-4H-喹 唑啉-3-基}-苯甲酰胺；
(253)3-{2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-4-氧代-4H-喹 唑啉-3-基}-苯甲酰胺；
(254)5-甲基-3-(3-吗啉-4-基-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]- 3H-喹唑啉-4-酮；
(255)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-甲基-3-(3-吗啉-4-基- 苯基)-3H-喹唑啉-4-酮；
(256)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-[3-(2-甲氧基-乙氧基)- 苯基]-5-甲基-3H-喹唑啉-4-酮；
(257)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3-[3-(2-二甲氨基-乙氧 基)-苯基]-5-甲基-3H-喹唑啉-4-酮；
(258)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丁-3-炔基]-5-甲基-3-苯基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(259)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丁-3-炔基]-5-甲基-3-苯基-3H- 喹唑啉-4-酮；
(260)5-氯-3-(3，5-二氟-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑 啉-4-酮；
(261)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-5-氯-3-(3，5-二氟-苯基)- 3H-喹唑啉-4-酮；
(262)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-5-氯-3-(3，5-二氟-苯基)- 3H-喹唑啉-4-酮；
(263)3-(3，5-二氟-苯基)-6-氟-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-喹唑 啉-4-酮；
(264)5-氯-3-(2，6-二氟-苯基)-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-3H-喹唑 啉-4-酮；
(265)2-[1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基氨基)-丙基]-5-氯-3-(2，6-二氟-苯基)- 3H-喹唑啉-4-酮；
(266)5-甲基-3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氧基)-乙基]-3H-喹唑啉-4- 酮。
当存在立体中心时，可以采用所述化合物的外消旋体混合物或 特定的对映体实施本发明的方法。在优选的实施方案中，利用上述 化合物的S-对映体。因此，本发明包括上述化合物所有可能的立体 异构体和几何异构体。
“药学上可接受的盐”是指任何生理上可接受的盐，只要其与 制剂中的其它组分相容并且对其接受体不产生毒害即可。一些具体 的优选实例为乙酸盐、三氟乙酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、 柠檬酸盐、酒石酸盐、羟乙酸盐、草酸盐。
在一个实施方案中，本发明包括一种制品，它包含磷酸肌醇3- 激酶δ(PI3Kδ)选择性抑制剂和注明根据本发明任一种方法的用法的 标签。在一个相关实施方案中，本发明提供含有至少一种PI3Kδ选择 性抑制剂的组合物在制备用于治疗或预防与不需要的肥大细胞活性 有关的疾病的药物中的用途。
本发明还包括前药的给药。本文所用术语“前药”是指在体内 能通过水解迅速转化为例如具有本文所述结构式的化合物的化合 物。前药设计的一般性论述请参见Hardma等(编辑)，Goodman and Gilman′The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，第11-16 页(1996)。详细论述请参见Higuchi等，Prodrugs as Novel Delivery Systems，第14卷，ASCD Symposium Series以及Roche(主编)， Bioreversible Carriers in Drug Design，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press(1987)。简而言之，给予药物后，药 物经机体排出或进行某些生物转化，从而药物的生物活性被降低或 消除。换句话讲，生物转化过程可导致产生代谢副产物，与最初给 予的药物相比，所述副产物本身具有更强的活性，或者具有等同的 活性。对这些生物转化过程的了解加深，使得可以设计出所称的“前 药”，这样的前药在生物转化后，以其改变状态变成具有更高的生 理活性。因此，前药包括可转化为生物活性代谢物的药理上无活性 的化合物。
举例来说，前药可以通过酯或酰胺键的水解，由此在所得到的 产物上引入或暴露出官能团，从而转化为药理上的活性形式。可设 计前药能与内源性化合物反应，生成水溶性缀合物，进一步增强所 述化合物的药理性质，例如循环半寿期增加。或者，可设计前药能 在官能团上与例如葡糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽、氨基酸或乙酸盐进 行共价修饰。所得到的缀合物可以是无活性的并从尿中排出，或者 与母体化合物相比活性更强。高分子量缀合物还可能被排泄到胆汁 中，经历酶解，然后再被释放进入循环，因此有效地增加了最初给 予的化合物的生物半寿期。
另外，本发明方法中还包括将与PI3K家族的其它同工酶相比， 能更有效地选择性负调节p110δmRNA表达并且具有可接受的药理 性质的化合物，作为PI3Kδ选择性抑制剂。编码人p110δ的多核苷酸 公开于例如Genbank检索号AR255866、NM 005026、U86453、U57843 和Y10055，其所有公开内容结合到本发明中作为参考。还可参见 Vanhaesebroeck等，Proc.Natl.Acad Sci.94：4330-4335(1997)，其全 文结合到本发明中作为参考。代表性的编码小鼠p110δ的多核苷酸公 开于例如Genbank检索号BC035203、AK040867、U86587和 NM_08840，编码大鼠p110δ的多核苷酸公开于Genbank检索号 XM_345606，其全文结合到本发明中作为参考。
在一个实施方案中，本发明提供使用能与编码p110δ的信使RNA (mRNA)杂交来负调节p110δ表达的反义寡核苷酸的方法。一方面， 本发明方法中使用的反义寡核苷酸长度为至少5个至约50个核苷 酸，包括位于其间的所有长度(以核苷酸数目计)，所述反义寡核苷酸 能与编码p110δ的mRNA特异性杂交并且抑制mRNA表达，结果， 导致抑制p110δ蛋白的表达。反义寡核苷酸包括那些包含修饰核苷酸 间键合的反义寡核苷酸，和/或那些包含本领域已知的改进寡核苷酸 稳定性(即使寡核苷酸对核酸酶降解更具抗性，尤其是体内)的修饰核 苷酸的反义寡核苷酸。本领域清楚，虽然与靶多核苷酸某个区完全 互补的反义寡核苷酸具有程度最高的特异性抑制，但是那些并不完 全互补的反义寡核苷酸，即那些相对于靶多核苷酸某个区包括有限 的几个错配的反义寡核苷酸，也保留高度杂交特异性，因此也可以 抑制靶mRNA的表达。因此，本发明包括使用与编码p110δ的多核 苷酸的某个靶区完全互补的反义寡核苷酸的方法，以及使用与靶多 核苷酸的靶区不完全互补(即包括错配)、而错配并不妨碍与靶多核苷 酸内的靶区特异性杂交的反义寡核苷酸的方法。反义核苷酸的设计 及最优化方法参见Lima等(J Biol Chem，272：626-38，1997)、Kurreck 等(Nucleic Acids Res.，30：1911-8，2002)和美国专利第6,277,981号， 这些文献和专利结合到本发明中作为参考。反义化合物的实例参见 国际专利中请WO 01/05958，其结合到本发明中作为参考。
本发明还包括利用核酶抑制剂的方法，正如本领域所了解的， 核酶抑制剂包括与靶多核苷酸特异性杂交的核苷酸区以及消化靶多 核苷酸的酶部分。核酶抑制的特异性与反义区的长度有关，也与反 义区与靶多核苷酸内的靶区互补程度有关。因此，本发明的方法包 括核酶抑制剂，其中包括长度至少5个至约50个核苷酸的完全互补 的反义区，包括位于其间的所有核苷酸长度；以及包含错配的反义 区，达到的程度是错配并不妨碍与p110δ编码的靶多核苷酸内的靶区 特异性杂交。本发明方法中使用的核酶包括那些包含修饰核苷酸间 键合的核酶，和/或那些包含本领域已知的改进寡核苷酸稳定性(即使 寡核苷酸对核酸酶降解更具抗性，尤其是体内)的修饰核苷酸的核酶， 达到的程度是这些修饰并不改变核酶与靶区特异性杂交或者降低分 子的酶活性的能力。因为核酶是酶性分子，单个核酶分子就能够直 接消化多个靶分子，从而提供比非酶反义寡核苷酸更低的浓度下有 效的优点。核酶的制备及应用技术参见美国专利6,696,250、6,410,224 和5,225,347，这些专利全文结合到本发明中作为参考。
本发明还包括利用RNAi技术抑制p110δ表达的方法的应用。一 方面，本发明提供双链RNA(dsRNA)，其中一条链与编码p110δ的 靶多核苷酸内的靶区互补。一般来说，该类型的dsRNA分子长度小 于30个核苷酸，本领域将其称为短干扰RNA(siRNA)。然而，本发 明还包括长度大于30个核苷酸的dsRNA分子的应用，在本发明某 些方面，这些更长的dsRNA分子长度可以约为30个核苷酸至200 个核苷酸或者更长，并且包括位于其间的所有长度的dsRNA分子。 如同其它RNA抑制剂一样，dsRNA分子中一条链的互补性可以是与 靶多核苷酸内的靶区的完全匹配，或者在一定程度上包括错配，其 程度是错配并不妨碍与编码p110δ的靶多核苷酸内的靶区特异性杂 交。如同其它RNA抑制技术一样，dsRNA分子包括那些包含修饰核 苷酸间键合的dsRNA分子，和/或那些包含本领域已知的改进寡核苷 酸稳定性(即使寡核苷酸对核酸酶降解更具抗性，尤其是体内)的修饰 核苷酸的dsRNA分子。使用双链RNA(dsRNA)序列化合物(Fire等， Nature 391：806-811，1998)或者短干扰RNA(siRNA)序列化合物(Yu 等，Proc Natl Acad Sci USA.99：6047-52，2002)的RNAi制备及其应用 的更全面描述参见美国专利申请第20040023390号，其全文结合到 本发明中作为参考。
本发明还包括使用RNA套索(lasso)技术影响p110δ抑制的方法。 环状RNA套索抑制剂是高度结构化的分子，对降解具有固有的抗性， 因此一般不包括或需要修饰核苷酸间键合或修饰核苷酸。该环状套 索结构包括能与靶多核苷酸内的靶区杂交的区域，套索内的杂交区 具有其它RNA抑制技术的典型长度。如同其它RNA抑制技术一样， 套索内的杂交区可以与靶多核苷酸内的靶区完全匹配，或者可以在 一定程度上包括错配，其程度是错配并不妨碍与编码p110δ的靶多核 苷酸内的靶区特异性杂交。因为RNA套索是环状的并与靶区形成紧 密的拓扑键合，所以该类型的抑制剂与典型的反义寡核苷酸不同， 一般不通过解旋酶作用进行置换，因此可以使用比典型反义寡核苷 酸更低的剂量。RNA套索的制备及应用参见美国专利第6,369,038 号，其全文结合到本发明中作为参考。
本发明抑制剂可以与诸如以下的载体分子共价或非共价结合： 直链聚合物(例如聚乙二醇、多熔素、右旋糖酐等)、支链聚合物(参 见美国专利4,289,872和5,229,490；1993年10月28日公布的PCT 申请WO 93/21259)；脂质；胆固醇基团(例如类固醇)；或碳水化合物 或寡糖。本发明药物组合物中使用的载体的具体实例包括基于碳水 化合物的聚合物，例如海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、蔗糖、乳糖、 山梨糖醇、右旋糖酐(例如环糊精)、纤维素和纤维素衍生物。还包括 使用脂质体、微囊体、微球体、包合络合物或其它类型的载体。
其它的载体包括一种或多种水溶性聚合物连接体，例如聚氧乙 二醇或聚丙二醇，参见美国专利4,640,835、4,496,689、4,301,144、 4,670,417、4,791,192和4,179,337。本领域已知的另外其它有用的载 体聚合物包括单甲氧基-聚乙二醇、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二 醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元 醇(例如丙三醇)和聚乙烯醇以及这些聚合物的混合物。
双官能试剂衍生法可用于使本发明化合物与支持基质或载体交 联。一种这样的载体是聚乙二醇(PEG)。PEG基团可以具有任何常规 分子量，可以是直链，也可以是支链。PEG的平均分子量范围可以 为约2kDa至约100kDa，另一方面可以为约5kDa至约50kDa，再 一方面可以为约5kDa至约10kDa。PEG基团一般可通过酰化、还 原烷基化、迈克尔加成(Michael addition)、硫醇烷基化或者通过PEG 部分上的活性基团(例如醛基、氨基、酯基、巯基、卤代乙酰基、马 来酰亚胺基或肼基)与目标抑制剂化合物上的活性基团(例如醛基、氨 基、酯基、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)的其它化学 选择性轭合/连接方法连接到本发明化合物上。交联剂可以包括如4- 叠氮基水杨酸的酯、同双官能酰亚胺基酯，包括二琥珀酰亚胺基酯， 例如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，以及双官能马来酰亚胺， 例如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷。衍生化试剂，例如3-[(对叠氮基 苯基)二硫代]丙亚氨酸甲酯，生成具有光活性的中间体，该中间体在 有光的情况下能形成交联化合物。另外，对于抑制剂固定，可以使 用活性水不溶性基质，例如溴化氰-活化碳水化合物和活性底物，参 见美国专利3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537 和4,330,440。
本发明的药物组合物还可以包含衍生化化合物，其中包含一个 或多个抗体Fc区。抗体的Fc区包含多个单体多肽，这些单体多肽 可以是通过二硫键或非共价缔合连接而成的二聚体或多聚体形式。Fc 分子的单体亚基之间的分子间二硫键数目可以为1-4个，这取决于Fc 区所来源的抗体的类别(例如IgG、IgA、IgE)或亚类(例如IgG1、IgG2、 IgG3、IgA1、IgGA2)。本文所用术语“Fc”一般为Fc分子的单体、 二聚体和多聚体，其中Fc区为野生型结构或衍生化结构。本发明的 药物组合物还可以包含Fc分子的补救受体结合结构域(参见WO 96/32478)以及其它Fc分子(参见WO 97/34631)。
这些衍生化部分优选改进本发明抑制剂化合物的一个或多个特 征，包括例如生物活性、溶解度、吸收、生物半寿期等等。或者， 衍生化部分使得化合物具有未衍生化化合物的相同或基本相同的特 征和/或性质。或者，所述部分可消除或减轻所述化合物的任何不需 要的副作用，等等。
本发明中也使用与本文所述抑制剂化合物竞争结合PI3Kδ的化 合物。与本发明具体提供的化合物竞争性结合PI3Kδ的化合物的鉴定 方法，是本领域众所周知的。
因此，考虑到以上公开内容，本文所用术语“抑制剂”包括所 公开的化合物、与所公开的化合物竞争结合PI3Kδ的化合物、以及在 所有情况下它们的缀合物和衍生物。
本发明的方法包括将抑制剂本身或按本文所述以组合形式给予 有需要的个体，在所有情况下，还任选包括一种或多种合适的稀释 剂、填充剂、盐、崩解剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、湿润剂、控 释基质、着色剂/矫味剂、载体、赋形剂、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、 其它本领域熟知的物质和它们的组合。
可以使用本领域已知的作为药用溶媒、赋形剂或介质的任何药 学上可接受的(即无菌无毒)液体、半固体或固体稀释剂。稀释剂的实 例包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、硬脂酸镁、磷酸 钙、矿物油、可可脂、可可油、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、 滑石粉、藻酸盐、糖类，尤其是甘露糖醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维 素、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、改性右旋糖酐、阿拉伯树胶和淀粉。 某些市售的稀释剂有Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress 和Avicell。这些组合物可影响本发明抑制剂化合物的物理状态、稳 定性、体内释放速率和体内清除速率。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(1990，Mack Publishing Co.，Easton， PA 18042)，第1435-1712页，其结合到本发明中作为参考。
药学上可接受的填充剂包括例如乳糖、微晶纤维素、磷酸二钙、 磷酸三钙、硫酸钙、葡萄糖、甘露醇和/或蔗糖。
所述药物组合物中还可以使用无机盐作为填充剂，包括三磷酸 钙、碳酸镁和氯化钠。可以使用氨基酸，诸如用于药物组合物的缓 冲制剂中。
所述抑制剂的固体剂型中可以包括崩解剂。用作崩解剂的物质 包括但不限于淀粉，包括基于淀粉组分的商用崩解剂，Explotab。淀 粉乙醇酸钠、安伯莱特(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉 (ultramylopectin)、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然 海绵体、玉米淀粉、马铃薯淀粉和膨润土均可用作药物组合物的崩 解剂。其它崩解剂包括不溶性阳离子交换树脂。包括粉状树胶(例如 琼脂)、刺梧桐树胶或西黄蓍胶等在内的粉状树胶可用作崩解剂和粘 合剂。藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。
可用粘合剂将所述治疗药粘结在一起形成硬片剂，包括源自天 然产物的物质，例如阿拉伯胶、西黄蓍胶、淀粉和明胶。其它的粘 合剂包括结晶纤维素、纤维素衍生物例如甲基纤维素(MC)、乙基纤 维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)、阿拉伯树胶、玉米淀粉和/或明胶。 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可用于醇性溶 液中以将所述治疗药制粒。
在制剂过程中，为防止粘结，在治疗药的制剂中可以包括润滑 剂。可将润滑剂作为治疗药和冲模之间的一层使用，它们包括但不 限于：硬脂酸(包括其镁盐和钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、 植物油、滑石粉和蜡类。还可以使用可溶性润滑剂，例如十二烷基 硫酸钠、十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇、聚乙二醇4000 和聚乙二醇6000。
可加入助流剂，该助流剂在制剂过程中能改进药物流动性质， 并能在压片过程中帮助重新整理。合适的助流剂包括淀粉、滑石粉、 氧化硅和水合硅铝酸盐。
为帮助将所述治疗药溶解在水性环境中，可加入作为湿润剂的 表面活性剂。可以使用天然或合成的表面活性剂。表面活性剂可以 包括阴离子洗涤剂，例如十二烷基硫酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠和 磺酸二辛酯钠。可以使用阳离子洗涤剂，例如苯扎氯胺和苄索氯胺。 可用于所述药物制剂中的非离子型洗涤剂包括聚月桂乙二醇400，聚 氧乙烯(40)硬脂酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，单硬脂酸 甘油酯，聚山梨醇酯40、60、65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素 和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或者以不同比例混合物 形式存在于本发明的药物组合物中。
控释制剂可能是最好的。可将本发明抑制剂与惰性基质混合， 该基质允许通过扩散或滤取机制释放，例如树胶。还可将慢慢降解 的基质加入到所述药物制剂中，例如藻酸盐或多糖。另一种控释的 形式是基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法，即将药物包入半透膜 内，该半透膜允许水进入并由于渗透作用将抑制剂化合物通过一个 小口释放。某些肠溶衣也具有延迟释放作用。
所述药物组合物中还可以包括着色剂和矫味剂。例如，可将本 发明抑制剂制成制剂(例如通过脂质体或微球体包封)，然后再包封于 可食用产品中，例如含有着色剂和矫味剂的冷冻饮料。
还可将所述治疗药以薄膜包衣片形式给药。用于本发明药物组 合物包衣的非肠衣物质包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维 素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲 基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇。用于本发明药物组合物 包衣的肠衣物质包括邻苯二甲酸酯。可用混合物质以提供最适宜的 薄膜包衣。薄膜包衣的制备可在包衣锅中、冷流化床中或者通过压 缩包衣进行。
可将组合物以固体、半固体、液体或气体形式给药，或者组合 物可以是干粉形式，例如冻干形式。可将所述药物组合物包装为便 于给药的形式，包括例如胶囊剂、囊剂、扁囊剂、凝胶剂、纸剂、 片剂、胶囊剂、软膏剂、颗粒剂、溶液剂、吸入剂、气雾剂、栓剂、 小球剂、丸剂、药片、锭剂或其它本领域已知的形式。包装的类型 一般依据所要求的给药途径而定。还可以包括可植入的缓释制剂， 例如经皮给药制剂。
本发明的方法包括通过各种途径给予抑制剂化合物。可将这些 药物组合物经注射或者经口服、鼻内、经皮或其它给药形式给药， 包括如通过静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、气管内、鞘内、 眼内、眼球后、肺内(例如雾化药物)或皮下注射(包括供长期释放的 储库给药，例如包埋在脾囊下、脑或者角膜内)；通过舌下、肛门、 阴道或者通过手术植入给药，例如包埋在脾囊下、脑或者角膜内。 治疗可由单剂量或一段期间内的多剂量组成。一般而言，本发明方 法涉及给予有效量的本发明抑制剂以及如上所述的药学上可接受的 稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、助剂和/或载体。本领域人员清 楚，所选择的给药途径可决定所给予化合物的物理形式。
一方面，本发明提供口服给予本发明药物组合物的方法。口服 固体剂型一般参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990 (Mack Publishing Co.Easton PA 18042)，第89章。固体剂型包括片剂、 胶囊剂、丸剂、药片或锭剂。还可将脂质体或类蛋白包囊用于制备 本发明组合物的制剂(例如美国专利第4,925,673号中报告的类蛋白微 球)。脂质体包囊可以包括用各种聚合物衍生的脂质体(例如美国专利 第5,013,556号)。一般来说，所述制剂包括本发明化合物和惰性成分， 惰性成分防止在胃中降解，并使生物学活性物质在肠内的释放。
所述抑制剂可以以粒径约1mm的颗粒或小球体形式的细小多颗 粒包括在制剂中。胶囊给药的制剂物质还可以是粉末、轻压制塞或 者甚至是小片形式。胶囊剂可通过压缩制备。
本发明还包括肺部给予本发明的抑制剂。根据本发明这个方面， 可将抑制剂经吸入给予哺乳动物肺部，然后穿过肺上皮细胞内衬进 入血流。
本发明应用中包括为肺部给予治疗产品所设计的多种机械装 置，包括但不限于雾化吸入器、定量吸入器和粉末吸入器，所有这 些都是本领域技术人员所熟悉的。适于本发明实施的市售装置的某 些具体实例有Ultravent雾化吸入器，由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis， Missouri制造；Acorn H雾化吸入器，由Marquest Medical Products， Englewood，Colorado制造；Ventolin定量吸入器，由Glaxo Inc.， Research Triangle Park，North Carolina制造；Spinhaler粉末吸入器， 由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts制造。
所有这些装置都要求使用适于分配本发明化合物的制剂。通常， 用于治疗时每种制剂对于所用类型的装置都是特定的，除了稀释剂 以外，还可以包括使用适当的抛射剂、助剂和/或载体。
当在肺部给药方法中使用时，为了将本发明抑制剂最有效地给 予整个肺，最好将本发明抑制剂制成微粒形式，平均粒度小于10μm (微米)，例如0.5-5μm。
适用于使用雾化吸入器(或者是喷气式或者是超声式)的制剂一般 包括溶解于水中的本发明化合物，浓度范围约为每毫升溶液0.1- 100mg抑制剂、每毫升溶液1-50mg抑制剂或者每毫升溶液5-25mg 抑制剂。所述制剂还可以包括缓冲剂。雾化吸入器用制剂还可以包 括表面活性剂，其作用是降低或防止由在形成气雾剂时溶液雾化所 引起的抑制剂表面诱发的聚集。
定量吸入器用制剂一般包括借助表面活性剂悬浮于抛射剂中的 包含本发明抑制剂的微细粉末。抛射剂可以是为该目的所使用的任 何常规物质，例如氯氟碳、氢氯氟碳、氢氟碳或烃，包括三氯氟甲 烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或它们的组合。 合适的表面活性剂包括脱水山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸还 可用作表面活性剂。
从粉末吸入装置中分配的制剂包括含本发明化合物的微细干 粉，并且还可以包括增量剂或稀释剂，例如乳糖、山梨醇、蔗糖、 甘露醇、海藻糖或木糖醇，其用量是促进从该装置中分配粉末的量， 例如占制剂重量的50-90％。
本发明化合物的鼻内给药也包含在内。鼻内给药是在将所述治 疗产品给予鼻内后，抑制剂直接进入血流，而不必使产品在肺内停 留。鼻内给药用制剂可以包括右旋糖酐或环糊精。还可以包括通过 其它粘膜输送的给药方式。
可以通过细胞培养物或实验动物等标准药学方法，测定PI3Kδ 选择性化合物的毒性和治疗功效，例如测定LD50(使群体50％致死 的剂量)和ED50(使群体50％治疗上有效的剂量)。另外，可在再用其 它疗法(例如放射疗法、化疗药和抗血管生成药)处理的细胞培养物或 实验动物中确定这些信息。
在实施本发明方法时，所提供的药物组合物的剂量范围以日剂 量给出，或者以更长或更短的时间间隔的等剂量给出，例如隔天1 次、每周2次、每周1次或者每天2-3次，通常日剂量为每千克体重 1pg～1000mg化合物，0.1mg/kg～100mg/kg、0.1mg/kg～50mg/kg和 1mg/kg～20mg/kg。可将抑制剂组合物最初以大剂量给予，接着通过 连续输注保持药物的治疗循环水平。本领域普通技术人员根据良好 医疗实践和具体患者的临床症状，将很容易最优化有效剂量和给药 方案。给药频率将根据药物的药代动力学参数和给药途径而定。最 佳药物制剂由本领域技术人员根据给药途径和所需剂量来确定。参 见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)，第1435-1712页，其结合到本发明 中作为参考。这些制剂可影响所给予的药物的物理状态、稳定性、 体内释放速率和体内清除速率。根据给药途径，按体重、体表面积 或器官大小，可以计算出合适的剂量。本领域普通人员按照常规方 法，无需进行过多的实验，尤其是根据本发明所公开的剂量信息和 测试法、以及在上述人体临床试验中观察到的药代动力学数据，就 可以做出必要的精确计算，以确定有关上述各制剂的合适治疗剂量。 通过利用测定血浓度剂量的已建立的测试方法，并且结合适当的主 治医师在考虑各种可改变药物作用的因素，可以确定合适的剂量， 所述因素例如药物的比活、损伤的严重程度和患者的反应性、患者 的年龄、疾病、体重和饮食、任何感染的严重程度、给药时间和其 它临床因素。随着研究的进行，有关适当的剂量水平和各种疾病和 症状的治疗持续时间的进一步信息随之获得。
附图简述
图1表示从用p110δ抑制剂IC87114治疗的OVA敏化/攻击小鼠 中分离的BAL液或对照组小鼠的BAL液的炎性细胞浸润计数(总细 胞和细胞组分分类计数)。对巨噬细胞(Mac)、淋巴细胞(Lym)、嗜中 性粒细胞(Neu)和嗜酸性粒细胞(Eos)进行计数。各条柱分别表示平均 值±SEM，得自6个独立的实验。#，p＜0.05，相对于SAL+SAL；*， p＜0.05，相对于OVA+SAL。
图2表示整个肺部炎症，定义为在用IC87114治疗的OVA敏化 /攻击小鼠或对照组小鼠中，支气管周围和血管周围炎症评分的平均 值。各条柱分别表示平均值±SEM，得自6个独立的实验。#，p＜0.05， 相对于SAL+SAL；*，p＜0.05，相对于OVA+SAL。
图3表示在用IC87114治疗的无限制的意识清醒的OVA敏化/ 攻击小鼠或对照组小鼠中，最后一次攻击后72小时，所测得的呼吸 道对雾化醋甲胆碱的反应性。在测定Penh值期间，每次雾化后3分 钟读取呼吸参数。数据表示平均值±SEM，得自6个独立的实验。#， p＜0.05，相对于SAL+SAL；*，p＜0.05，相对于OVA+SAL。
实施例
提供下面的实施例用于举例说明本发明，但并不是对本发明范 围的限制。
实施例1
选择性PI3Kδ抑制剂抑制肥大细胞脱粒
肥大细胞在呼吸道的过敏性炎症中十分重要。肥大细胞活化由 FcεR1受体的抗原/IgE交联、补体成分和细胞因子活化所介导，从而 导致预形成的组胺和蛋白酶从分泌颗粒中自发地释放。然后，这些 被激活的细胞开始转录、翻译并分泌促炎细胞因子和趋化因子，导 致炎症加重。
已经表明，非特异性PI3-激酶抑制剂(例如渥曼青霉素)能抑制大 鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3)中的肥大细胞脱粒(Kitani等，Biochem Biophys Res Commun.183：48-54，1992)。但是，特异性PI3-激酶亚基 在调节肥大细胞脱粒中的作用并不清楚[Tkaczyk等，J.Bool.Chem.， 278：48474-84(2003)；Windmiller等，J.Biol Chem.，278：11874-8 (2003)]。
为测定PI3-激酶p110δ亚基在调节肥大细胞活性中的作用，评价 特异性p110δ抑制剂调节人或小鼠骨髓衍生的肥大细胞脱粒的能力。
将得自小鼠股骨的骨髓细胞在含有小鼠IL-3的RPMI1640培养 基进行培养，培养温度为37℃，在潮湿95％空气/5％CO2中，该RPMI 1640培养基补充了10％热灭活FBS(Invitrogen Lift Technologies， Carlsbad，CA)、2mM谷氨酰胺和50μM 2-ME[Saito，H.F.等，J.Immunol. 138：3927-3934(1987)]。培养5周后，得到纯度95％以上的肥大细胞 (骨髓衍生的肥大细胞(BMMC))。
BMMC与0.5-1μg/ml抗二硝基苯基(DNP)IgE mAb一起孵育过 夜使其致敏，用Tyrode缓冲液(112mM NaCl、2.7mM KCl、0.4mM NaH2PO4、1.6mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM Hepes[pH 7.5]、0.05％ 明胶、0.1％葡萄糖)洗涤1次，再重悬于Tyrode缓冲液至1×107细 胞/ml，与p110δ抑制剂或溶媒对照(0.3％DMSO)一起孵育30分钟。 然后将细胞通过多价抗原、0.1-100ng/ml人血清白蛋白的DNP缀合 物(DNP-HSA)刺激45分钟。将细胞悬液短暂离心，使Tyrode溶液与 细胞沉淀分离开来。通过酶免疫测定法(Cayman Chemical Company， Ann Arbor，MI)，测定45分钟刺激过程中分泌至Tyrode溶液中的组 胺。将抑制剂抑制组胺释放的百分率用下列公式表示：(1-(抑制剂存 在下的％组胺释放)/(对照细胞的％组胺释放))×100％。
ELISA结果表明，与溶媒对照组相比，用IC87114(5μM)预处理 的肥大细胞使细胞上清液中组胺的量减少约40％，并由此增加细胞 沉淀中所检测的组胺的量。这证明p110δ激酶的抑制降低从肥大细胞 储存颗粒中释放的组胺的量，这具有作为降低由FcεRI介导的肥大细 胞活化中释放组胺的有效疗法的效用。
实施例2
选择性PI3Kδ激酶抑制剂通过肥大细胞减少炎性细胞因子的分泌
肥大细胞FcεRI交联的一个重大作用是诱导大量炎性细胞因子， 例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-13、GM-CSF和TNF-α。现已知TNF-α 和IL-2都在诸如哮喘和变态反应中的那些晚期超敏化反应中发挥作 用[Galli等，Fundamental Immunology，第4版，Paul编著，Lippincott- Raven Publishers，Philadelphia，PA，(1998)；第1127-1174页]。为测定 p110δ激酶抑制剂对肥大细胞激活的下游作用的影响，研究选择性 p110δ抑制剂调节肥大细胞激活后炎性细胞因子分泌的能力。
BMMC与0.5-1μg/ml抗二硝基苯基(DNP)IgE mAb一起孵育过 夜使其致敏，在IL-3不存在下，用BMMC培养基洗涤1次，再以1× 107细胞/ml重悬于同一培养基中。将细胞与p110δ抑制剂或溶媒对照 (0.3％DMSO)一起孵育30分钟，然后通过多价抗原、1-100ng/ml人 血清白蛋白的DNP缀合物(DNP-HSA)刺激20小时。收集细胞上清 液，通过ELISA评价炎性细胞因子水平(BD PharMingen或Endogen)。 所测定的细胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-2和粒细胞/单核细胞-集落 刺激因子(GM-CSF)。
结果表明，用10ng/ml抗原刺激并向肥大细胞中加入仅2μM的 IC87114，能将肥大细胞分泌的TNF-α的量降低至不能检测的水平。 另外，100ng/ml抗原加上3μM抑制剂能使活化肥大细胞的TNF-α产 生抑制85％。
加入p110δ激酶抑制剂后对IL-6水平的评价证明类似的影响。 向活化肥大细胞(10ng/ml抗原)中加入IC87411，对IL-6产生呈现剂 量依赖性降低作用，从无抑制剂下的6000pg/ml降低到50μM抑制 剂存在下的大约2000pg/ml IL-6。抗原(100ng/ml)激活后，也对从p110δ 敲除小鼠中分离的骨髓肥大细胞评价IL-6分泌水平。加入p110δ抑 制剂(最高10μM)，对敲除细胞的IL-6水平无影响，表明所述抑制剂 的作用是通过抑制蛋白激酶p110δ同工型来实现的。加入p110δ抑制 剂之后，由活化肥大细胞分泌的GM-CSF也被抑制大约45％。
也可用抗原刺激的BMMC测定炎性细胞因子IL-2的水平。用 10ng/ml抗原激活的BMMC表明，在加入p110δ抑制剂时，对IL-2 分泌呈现剂量反应性抑制，在20μM抑制剂存在下，降低对照组值的 大约10pg/ml至＜4pg/ml IL-2，降低IL-2分泌的2.5倍。
趋化因子在吸引细胞进入炎症部位，从而促进炎症反应方面起 重要作用。可以使用多分析物概况分析技术(Multi-Analyte Profile Technology，Rules-Based Medicine，Inc.Austin，TX)，评价抗原激活的 BM肥大细胞在p110δ抑制剂存在和不存在下的趋化因子产生。p110δ 抑制剂(5μM)对由活化肥大细胞产生趋化因子的作用，导致嗜伊红粒 细胞趋化因子水平的约57％抑制、淋巴细胞趋化因子的约37％抑制、 巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)分泌的约60％抑制以及巨噬细胞-炎 性蛋白MIP-1α和MIP-1β水平的约35％抑制。
这些结果表明，p110δ的特异性抑制作用能降低所分泌的炎性细 胞因子和趋化因子的量，这是肥大细胞表面FcεRI与抗原交联的结 果。在这些刺激的肥大细胞中靶向并抑制p110δ活化的能力，为治疗 肥大细胞相关疾病的改进、特异性方法提供了一种方法，并且为减 量调节异常肥大细胞活化提供了一种有用的治疗药物。
实施例3
P110δ抑制剂特异性抑制抗原活化肥大细胞中的AKT磷酸化
PI3K p110δ参与复杂信号传导途径，导致磷脂酶C活化和钙流 入细胞内。Akt是PI3激酶的下游靶标，在响应PI3K激活后在丝氨 酸243处被磷酸化。该磷酸化事件对Akt的激酶活性是必不可少的。 以前一直认为Akt激活与细胞因子的分泌相关，所述细胞因子源自 激活的大鼠嗜碱性白血病细胞或从酪氨酸激酶敲除小鼠中分离的细 胞[Kitaura等，J.Exp.Med 192：729-39(2000)]。使用LY294002在某 些细胞类型(例如内皮细胞)中对Ia类PI3K的广泛抑制作用已表明， 不仅能降低Akt响应于TNF-α的磷酸化，而且能在非细胞因子刺激 细胞中起作用，而这些脂质对细胞游动性和存活均十分必要[参见 Madge等，J.Biol.Chem.，275：15458-15465(2000)]。由于Akt活化在 各种不同的生化途径中出现，测定PI3K p110δ在活化肥大细胞中触 发Akt磷酸化之中的作用显得十分必要。
为评价PI3K抑制剂对下游信号传导的作用，将BMMC用一剂 量范围的抗原刺激，并与0、2μM、5μM、20μM或50μM抑制剂的 IC87114一起按上述方法进行培养。将细胞按如上所述方法裂解，通 过蛋白质印迹测定几个p110δ下游效应物的磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸 水平。蛋白质印迹分析中所用的抗体包括：Akt pS473；3-磷酸肌醇 依赖性激酶(PDK1)pS24 1；pERK；pJNK；Lyn pY396和Bruton酪氨 酸激酶(Btk)pY223。抗体购自Cell Signaling Technology(Beverly， MA)、Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)、Zymed和Santa Cruz Biotechnology。
蛋白质印迹分析表明，抗原刺激10分钟后，低至5μM的p110δ 抑制剂就能降低Akt磷酸化，而抗原刺激30分钟后，显著抑制磷酸 化。抗原刺激2分钟后，50μM抑制剂剂量再一次显著抑制S243 Akt 磷酸化，而抗原刺激后10分钟或30分钟，能完全消除磷酸化。对 其它下游效应物的分析表明，抗原/IgE刺激诱导PDK1、ERK、JNK、 Lyn和Btk的磷酸化，但加入p110δ抑制剂并不影响任何这些分子的 磷酸化水平。另外，细胞全部的酪氨酸或丝氨酸磷酸化不受p110δ抑 制剂的影响。所测试的所有分子的蛋白质水平保持稳定，表明Akt 磷酸化的降低特殊原因是对p110δ活性的抑制。
这些结果表明，在活化肥大细胞中选择性抑制PI3K p110δ，特 异性地降低Akt磷酸化的水平，而不会影响其它相关下游酪氨酸或 丝氨酸激酶的磷酸化水平。这表明用于调节参与肥大细胞细胞因子 分泌的Akt的p110δ选择性抑制剂，通过降低细胞浸润到炎症部位， 为在已发生的肥大细胞病中调节正在出现的炎症提供了一种有效的 治疗方法，或者可在诸如变态反应或哮喘等疾病中发挥预防性作用， 以预防免疫反应的发生。
实施例4
变应原诱发的呼吸道炎症导致肺组织中P110δ活性的增加
在鼠变应性哮喘模型中，在抗原攻击后刺激PI3K活性，给予两 种广谱PI3K抑制剂渥曼青霉素或LY294002，会减轻炎症和呼吸道 超反应性(AHR)(Ezeamuzie等，Am J Respir Crit Care Med 164：1633- 39，2001；Kwak等，J Clin.Invest 111：1083-92，2003)。但是，这些抑 制剂不能区别四种I类PI3K(Davies等，Biochem J.351：95-105，2000； Sadhu等，J.Immunol.，170：2647-54，2003)，并还能广泛影响表达这些 激酶的多种类型细胞。先前研究已表明，p110δ在B和T细胞抗原受 体信号传导和激活(Okkenhaug等，Science 297：1031-34，2002；Clayton 等，J Exp Med 196：753-63，2002)以及嗜中性粒细胞迁移和激活(Puri 等，Blood 103：3448-56，2004；Sadhu等，Biochem Biophys Res Commun 308：764-69，2003)中起重要作用。另外，据报道，p110δ对变应原IgE 诱发的肥大细胞脱粒和血管通透性十分重要(Ali等，Nature 431：1007- 11，2004)。该项研究未确定阻断这种白细胞和内皮细胞特异性PI3K 同工型p110δ本身的活性是否足以减轻过敏性炎症和AHR。为测定 p110δ在哮喘发病中的作用，采用动物哮喘模型研究p110δ抑制剂给 药后作用。
无鼠特异性病原体的8-10周龄雌性BALB/c小鼠购自韩国化学 技术研究所(the Korean Research Institute of Chemistry Technology， Daejon，Korea)。整个试验中，将小鼠饲养在层流箱中，保持随意进 食标准实验食物。该项研究中使用的所有实验动物都遵循Chonbuk 国立大学医学院公共动物管理及使用委员会(the Institutional Animal Care and Use Committee of the Chonbuk National University Medical School)批准的方案。按文献所述方法(Kwak等，出处同上)，在第1 天和第14天，通过腹膜内注射在1mg氢氧化铝(Pierce Chemical Co.， Rockford，IL)中乳化的20μg卵白蛋白(OVA)(Sigma-Aldrich，St.Louis， MO)，注射总体积为200μl，使小鼠致敏。在首次敏化后第21天、 第22天和第23天，用超声雾化吸入器(NE-U12，Omron，Japan)，用 在盐水中的3％(重量/体积)OVA的气雾剂(或用盐水作为对照)，攻 击小鼠。给每只动物气管内滴注给予体积为50l的用0.9％NaCl稀 释的IC87114(0.1mg/kg体重/天或1mg/kg体重/天)或DMSO(溶媒对 照)两次，其中第一次在第21天(用OVA首次呼吸道攻击前1小时)， 第2次在第23天(用OVA最后一次呼吸道攻击后3小时)。依次采用 单因素ANOVA和Fisher检验，进行所有的统计学比较。运用非配 对学生氏t检验(unpaired Student′s t test)，求出各组间的显著性差异。 将统计学显著性设为p＜0.05。
在暴露OVA的小鼠中，按先前方法(Kwak等，出处同上)，采用 在蛋白酶抑制剂存在下制备的肺组织匀浆中的蛋白提取物，来测定I 类PI3K活性。使用Bradford试剂(Bio-Rad，Hercules，CA)，测定蛋白 质浓度，根据生产商方案(Echelon，Inc.，Salt Lake City，UT)，通过PIP3 竞争性酶免疫测定法，定量测定各组织提取物中的PI3K活性。PIP3 水平从大约15pmol/ml(预攻击)增加至约75pmol/ml(1小时)，在24 小时增加至大约100pmol/ml，在48小时和72小时增加至约160 pmol/ml，表明在吸入OVA之后，与预攻击阶段相比，I类PI3K活 性分别增加大约4.6倍、6.1倍、9.5倍和9.6倍。相比之下，在吸入 盐水之后，未发现PI3K活性显著变化。
这些激酶的激活一直与Akt的Ser-473的磷酸化关联，而所述磷 酸化是Akt酶促激活的关键事件(Alessi等，Curr.Biol.7：261-69， 1997)。通过蛋白质印迹测定Akt水平。将肺组织匀浆中的蛋白提取 物(30μg/道)进行聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen Life Technologies， Carlsbad，CA)电泳，电泳转移到PVDF膜(Immobilon-P；Millipore， Billerica，MA)上，然后与上述磷酸丝氨酸抗体于4℃孵育过夜。根 据蛋白质印迹检测结果，与接受吸入盐水的对照组动物相比，与PI3K 活性增加一致的是，吸入OVA后72小时，肺组织中的p-Akt蛋白 水平也有所增加。总Akt蛋白水平未发现显著变化。气管内给予选 择性p110δ抑制剂IC87114，能阻断Akt磷酸化。该磷酸化水平与盐 水对照水平类似，表明p110δ能对变应原诱发的Akt活化中总体I类 PI3K活性产生显著影响。
虽然PIP3形成和Akt磷酸化均表明，PI3K家族在变态反应和哮 喘中发挥作用，但给予本文所述的p110δ特异性抑制剂表明，对变态 反应和哮喘重要的PI3K是p110δ。
实施例5
P110δ对BAL液中OVA诱导的嗜酸性粒细胞募集产生影响
上述实验确定了p110δ介导变应原诱发的Akt活化。为确定p110δ 激酶对变应原攻击后嗜酸性粒细胞募集的作用，评价OVA攻击的动 物肺部的炎性细胞数量。
按以上实施例4中所述，给予小鼠卵白蛋白，在最后一次OVA 气雾剂攻击后72小时，收集支气管肺泡灌洗(BAL)液，对总的白细 胞和不同细胞分类计数。最后一次攻击后72小时，用过量戊巴比妥 钠(100mg/kg体重/腹膜内给予)处死小鼠。刺破大静脉抽取血样，离 心。将血清在液氮中急冻，然后在-70℃下储存以备IgE测定。如上 所述(Kwak等，出处同上)进行BAL。概括地讲，暴露胸腔使之扩张， 然后小心将管子插入气管内，将导管用结扎线绑紧。向肺内慢慢灌 注0.9％NaCl预热溶液，再抽出。使用血细胞计数器对总BAL细胞 计数。用细胞离心机(Shannon Scientific Ltd.，Cheshire，United Kingdom)，根据离心到载玻片上的BAL细胞，得出细胞分类计数， 然后用Diff-Quik溶液(Dade Diagnostics of Puerto Rico Inc.Aguada， Puerto Rico)处理。两名独立的不知情的研究人员用显微镜对细胞进 行计数。在四个不同的随机视野，分别数大约400个细胞。用这两 名研究人员得出的平均数目估计细胞分类。为测定细胞因子和白三 烯，将BAL上清液在液氮中急冻，在-70℃下储存备用。
与对照组盐水相比，OVA吸入显著(p＜0.05)增加嗜酸性粒细胞、 淋巴细胞和嗜中性粒细胞的绝对数目(图1)。在攻击后72小时，与用 溶媒对照处理的小鼠相比，气管内给予IC87114(0.1mg/kg)能分别使 BAL液中检测到的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞的数目 降低79.8％、63.5％和80％。相比之下，巨噬细胞的数目不受IC87114 的影响。在非敏化的对照动物中未发现嗜酸性粒细胞，而许多嗜酸 性粒细胞存在于经变应原处理的小鼠的BAL液中。与溶媒对照组相 比，经IC87114处理的小鼠中BAL液所回收的总细胞数降低，主要 是因为经IC87114处理的小鼠中嗜酸性粒细胞显著(p＜0.05)降低所 致。这些结果表明，p110δ活性对过敏炎症反应过程中嗜酸性粒细胞 募集产生影响。
为测定p110δ是否影响OVA诱导的组织嗜酸性粒细胞增多、粘 液产生和呼吸道炎症，提取肺组织，然后进行组织学分析。
最后一次OVA攻击后72小时，收集肺组织。处死小鼠，使用 结扎线，在气管周围，给肺和气管用气管内充填固定液(0.8％福尔马 林，4％乙酸)。取出肺，将肺组织用10％(体积/体积)中性缓冲福尔马 林固定。样本脱水，石蜡包埋。为进行组织学检查，用Leica 2165 型轮转切片机(Leica model 2165 rotary microtome，Leica Microsystems Nussloch GmbH，Nussloch，德国)，将经固定的包埋组织切成4μm切 片，置于载玻片上，脱蜡，用苏木精2、伊红-Y(Richard-Allan Scientific， Kalamazoo，MI)和过碘酸-Schiff(PAS)染色。三名独立的不知情的研 究人员对炎症评分进行分级。按Kwak等(同上)所述，将支气管周围 和血管周围炎症的程度按主观等级0-3进行评价。当未检测到炎症 时，判定值为0；炎性细胞偶尔成套时，判定值为1；在大多数支气 管或血管周围有炎性细胞薄层(1-5个细胞)时，判定值为2；当大多 数支气管或血管周围有炎性细胞厚层(超过5个细胞)时，判定值为3。
组织学分析揭示出，在OVA暴露小鼠中，有哮喘样炎症的典型 病理学特征。与盐水对照相比，OVA暴露小鼠显示在细支气管周围 区带有大量炎性细胞，在细支气管腔有粘液和细胞碎片聚集。相比 之下，经IC87 11 4处理的小鼠显示在细支气管周围区带，富含嗜酸 性粒细胞的白细胞浸润显著减弱，腔内存在的细胞碎片显著减少。 另外，将各组的代表性切片用过碘酸-Schiff(PAS)染色，以检测杯形 细胞。与对照组相比，OVA暴露的小鼠呈现呼吸道严重杯形细胞增 生，经IC87114处理后明显降低。与盐水吸入后评分相比，OVA吸 入后72小时，支气管周围区、血管周围区以及整个肺部的炎症评分 显著增加(p＜0.05)(图2)。给予p110δ抑制剂，可使OVA吸入后观 察到的肺部炎症增加降低50％以上。
这些结果表明，p110δ抑制剂显著降低变应原诱发的白细胞流 入、呼吸道炎症和杯形细胞增生。
实施例6
P110δ抑制剂对变应原诱发的呼吸道炎症中 细胞因子和趋化因子的影响
已知支气管组织中嗜酸性粒细胞聚集和其后的激活在变应性呼 吸道炎症的病理中发挥关键性作用(Busse等，N Engl J Med 344：35062， 2001；Humbles等，Science 305：1776-79，2004)。嗜酸性粒细胞移行到 呼吸道，是一个多步骤过程，由Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13) 协调进行，通过特异性趋化因子(例如嗜伊红粒细胞趋化因子)并且结 合粘附分子(例如VCAM-1和VLA-4(10，11))共同协调。IL-13是呼 吸道上皮细胞中嗜伊红粒细胞趋化因子表达的有效诱导物(Tigani等， Eur J Pharmacol 433：217-23，2001)。
已知Th2细胞因子在诱发过敏性炎症反应中有重要的作用，因 此对接受p110δ抑制剂或溶媒对照的BAL液以及OVA攻击的小鼠的 肺组织中的IL-4、IL-5和IL-13浓度进行测定。
IC87114对细胞因子蛋白水平的影响
根据生产商方案(IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-5；Endogen，Inc.， Woburn，MA；IL-13和RANTES；R&D Systems，Inc.，Minneapolis， MN)，通过酶免疫测定法，定量测定BAL液上清中的IL-1β、TNF-α、 IL-4、IL-5、IL-13和RANTES浓度。在这些测定中，IL-1β、TNF-α、 IL-4、IL-5、IL-13和RANTES的检出下限分别是3pg/ml、10pg/ml、 5pg/ml、5pg/ml、1.5pg/ml和2pg/ml。
在肺组织中，通过蛋白质印迹法检测到的所有三种IL-4、IL-5、 IL-13细胞因子浓度，以及通过ELISA检测BAL液，与盐水攻击后 所检测到的各浓度相比，发现OVA攻击诱导显著(p＜0.05)增加。 IC87114显著(p＜0.05)降低肺组织和BAL液中这些细胞因子的浓度 增加。
酶免疫测定法揭示出，与盐水吸入后的水平相比，OVA吸入后 72小时，BAL液中的IL-1β和TNFα水平也显著(p＜0.05)增加，从对 照组动物的大约100pg/ml TNFα和15pg/ml IL-1β增加至大约280 pg/ml TNFα和30pg/ml IL-1β。IC87114使这些促炎细胞因子的水平 增加降低50％以上，下降至大约140 pg/ml TNFα和15pg/ml IL-1β。 这些细胞因子的其中一个反应是诱导白细胞-内皮粘附分子。事实上， OVA吸入后72小时，肺组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平显著(p ＜0.05)增加，给予IC87114后，这些水平被显著降低。
IC87114对OVA敏化/攻击小鼠的肺组织和BAL液中嗜伊红粒细胞 趋化因子和RANTES蛋白水平的影响
蛋白质印迹分析揭示出，与盐水对照组相比，OVA吸入后72 小时，肺组织中趋化因子嗜伊红粒细胞趋化因子和RANTES的蛋白 质水平显著(p＜0.05)增加。给予IC87114会使这些趋化因子的水平 增加降低50％以上。另外，酶免疫测定分析揭示出，经IC87114处 理，OVA吸入后72小时，BAL液中RANTES的水平增加也被显著(p ＜0.05)降低。
IC87114对BAL液中血清IgE水平和LTC4释放的影响
IL-4和IL-13对指导B细胞生长、分化和IgE的分泌十分重要 (Emson等，J Exp Med 188：399-404，1998)。IgE的生物学活性通过肥 大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和性IgE受体(FcεRI)介导。FcεRI的 交联触发多种信号传导级联，从而导致细胞脱粒和激活(Nadler等，Adv Immunol76：325-55，2000；Kawakami等，Nat Rev Immunol 2：77386， 2002)。
为测定IC87114能否改变小鼠体内OVA特异性Th2应答，在OVA 攻击后72小时，分析循环IgE抗体水平。
按文献所述方法(MacLean等，J Immunol165：6568-75，2000)，通 过捕获ELISA测定OVA特异性IgE水平。概括地讲，微量滴定板用 2μg/ml纯化单克隆抗小鼠IgE(BD PharMingen，San Diego，CA)包被。 用PBS-10％FCS封闭后，向滴定板中加入合适的PBS-10％FCS血清 样本稀释液，室温下孵育2小时。用PBS-Tween洗涤后，向各孔中 加入生物素化OVA(10μg/ml)和HRP-缀合的链霉亲和素，然后孵育 1小时。洗涤各板，然后加入HRP底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物 (TMBS，Sigma Chemical Co.)。室温下避光孵育30分钟后，在微量培 养板读板仪(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)上，在450nm处读 板。按类似于检测OVA特异性IgE的方法，通过捕获ELISA测定总 血清IgE。使用生物素化大鼠抗小鼠IgE(PharMingen)检测所捕获的 IgE来替代生物素化OVA。
与未处理小鼠(约3ng/ml总IgE，小于1ng/ml OVA特异性IgE) 相比，在OVA攻击的小鼠(约12ng/ml总IgE，约3ng/ml OVA特异 性IgE)的血清中，观察到总IgE和OVA特异性IgE明显升高。IC87114 以剂量依赖性方式显著(p＜0.05)降低总循环IgE水平(约6ng/ml总IgE 和小于1.5ng/ml OVA特异性IgE)。与对总IgE水平抑制作用一致的 是，0.1mg/kg和1mg/kg的IC87114分别显著(p＜0.05)降低OVA特 异性IgE水平63％和72％。
最后一次OVA攻击后72小时，获取BAL液，测定LTC4。根 据生产商方案(Cayman Chemical Co.，Ann Arbor，MI)，通过酶免疫测 定法，定量测定BAL液上清中的LTC4水平。该测定法中，LTC4的 检出下限为10pg/ml。
OVA敏化/攻击小鼠中LTC4的BAL液水平(约40pg/ml)要比仅 接受盐水的小鼠中LTC4的BAL液水平(约13pg/ml)高3.1倍(p＜ 0.05，相对于盐水)。IC87114(0.1mg/kg和1mg/kg)分别显著(p＜0.05) 抑制LTC4水平37％和50％，分别使LTC4水平降低至约26pg/ml和 21pg/ml。用溶媒对照处理的OVA敏化/攻击小鼠的BAL液中LTC4 的含量，与盐水对照组的没有显著性差异。
实施例7
P110δ的抑制减弱呼吸道超反应性(AHR)
上述结果表明，给予p110δ特异性抑制剂，能有效地抑制与呼吸 道炎症有关的很多副作用。为了测定IC87114对实验动物模型中发 生AHR的影响，诱发经OVA处理的小鼠发生AHR，然后用p110δ 抑制剂进行治疗。
连续3天每天30分钟用3％OVA气雾剂攻击的敏化BALB/c小 鼠因吸入醋甲胆碱而发生AHR。最后一次卵白蛋白攻击后3天，按 文献所述方法(Kwak等，出处同上)，采用整体体积描记术(All Medicus Co.，Seoul，Korea)，测定无限制的意识清醒动物中的呼吸道反应性。
概括地讲，在整体体积描记术中，测定对关养在箱子内的意识 清醒、自由活动的小鼠的呼吸功能，即允许箱子内的动物自由活动， 同时测定它们的呼吸功能。将各箱子连接一个倾斜流量调节器，以 在试验过程中提供平稳、稳定流量的清新空气。连接各箱子的传感 器用于检测动物呼吸时出现的压力变化。当箱子压力/时间曲线过零 点时，通过确立开始吸气和结束吸气，记录吸气和呼气。通过箱子 压力信号的两个上升吸气状态水平中所画的直线外推，来确定吸气 的开始。将吸气时间(TI)定义为从吸气开始至吸气结束的时间；将呼 气时间(TE)定义为从吸气结束至下一次吸气开始的时间。将负方向或 正方向中的一个呼吸过程中出现的最大箱子压力信号分别定义为吸 气压力峰值(PIP)或呼气压力峰值(PEP)。将每10次呼吸记录外推以 确定每分钟呼吸频率。将松弛时间(Tr)定义为压力衰减至总呼气压力 信号的36％的时间(呼气时箱子压力信号下面积)。因此，这可用作体 积信号衰减至被动呼气时峰体积的36％的一种相关时间常数(RC)。 在支气管收缩过程中，信号中的主要改变出现在早期呼气过程中， 因此导致箱子压力信号波形的改变。所测的其它参数包括潮气量 (ml)、呼吸频率(每分钟呼吸次数)、分钟量(潮气量×呼吸频率，ml/ 分钟)、吸气时间(秒)、呼气时间(秒)、吸气流峰值(ml/秒)和呼气流峰 值(ml/秒)。
以Penh增加百分率评价呼吸道反应性(Helmann等，Am J Respir Crit Care Med 156：766-75，1997；Chong等，J Pharmacol Toxicol Methods 39：163-68，1998)。获得基线读数和暴露于雾化盐水或醋甲胆 碱(2.5-50mg/ml)后的读数。每次雾化后，收集3分钟数据并求平均值。 根据生产商方案，根据下列公式计算增大的停顿(Penh)：(呼吸时间/ 松弛时间-1)×(呼气流峰值/吸气流峰值)。结果表示为用各浓度醋甲 胆碱攻击后Penh增加的百分数，而将基线Penh(用盐水攻击后)表示 为100％。
与盐水攻击组相比，OVA攻击组对醋甲胆碱吸入的反应中，呼 吸道反应性明显增加(图3)。OVA攻击前，给予OVA敏化小鼠IC87114 显示，在测试的所有醋甲胆碱水平上测得的Penh显著(p＜0.05)减少， 由此表明p110δ在免疫介导的反应中发挥作用，导致体内呼吸道超反 应性。这些结果与p110δ抑制后的Th2细胞因子产生、组织嗜酸性粒 细胞增多和肥大细胞激活的降低有关。
过敏性呼吸道炎症和AHR发生与多种炎性细胞和各种各样的介 质有关。上述结果表明，在小鼠哮喘模型中，p110δ抑制作用能有效 地降低OVA诱导的Th2细胞因子产生、肺嗜酸性粒细胞增多、血清 IgE水平、杯形细胞增生和AHR。这些发现表明，p110δ在变应性哮 喘的发病机理中起重要作用，因此p110δ特异性抑制剂是用于治疗哮 喘和呼吸道超反应性的有效治疗药。
实施例8
P110δ抑制剂对大鼠肥大细胞脱粒的影响
肥大细胞和嗜碱性粒细胞均表达IgE的高亲和性受体FcεRI，并 对与IgE相关速发型超敏反应和变应性疾病起关键性作用。结合FcεRI 的IgE与多价抗原的交联启动肥大细胞和嗜碱性粒细胞的激活，导致 从这些细胞中脱粒。为确定p110δ抑制剂对肥大细胞/嗜碱性粒细胞 脱粒的影响，在p110δ特异性抑制剂存在下，测定因大鼠嗜碱性白血 病细胞(RBL-2H3)的脱粒而释放的5-羟色胺。
让RBL-2H3细胞在培养基中的单层培养物中生长。在75cm2组 织培养瓶中，让RBL细胞在25ml含有16％FCS的Eagle极限必要 培养基(EMEM-16)中生长至汇合。通过抽吸取出培养基，细胞用3ml 胰蛋白酶-EDTA洗涤，以除去血清中存在的胰蛋白酶抑制剂。然后 加入胰蛋白酶-EDTA，37℃保持5分钟，以取出贴壁细胞。从培养 瓶中取出细胞，用EMEM-16洗涤，然后以1000rpm离心5分钟进 行收集。细胞进行第二次洗涤，将细胞沉淀重悬于EMEM-16中。然 后将浓度为4×105细胞/ml的细胞接种到24孔板中，与25μl1mCi/ml 3H标记的5-羟色胺(终浓度0.5μCi/ml)和1μg/ml抗DNP IgE一起于 37℃培养过夜。吸出各孔中的细胞培养基，通过向该孔中加入500μl 的PBS洗涤细胞2次，将板倒置在一叠纸巾上。加入终体积为200μl 的PBS，细胞在37℃水浴中平衡≤2分钟，向各孔中加入10μl DNP- 白蛋白(终浓度10ng/ml)，37℃孵育10-30分钟。
取出各孔中的缓冲液，转移到液体闪烁管中，终止反应。各孔 用500μl 1％Triton X-100的PBS溶液洗涤2次，室温下孵育10分钟， 将液体转移到测量管中进行测量。向各样品管中加入10ml液体闪烁 混合液，用液体闪烁计数器对放射性水平进行计数，计算细胞所释 放的5-羟色胺百分数。加入适量的p110δ抑制剂IC87114或者适量的 第二种p110δ特异性抑制剂，然后与样品一起培养，以测定各剂量的 功效。
测得的对照组和p110δ处理细胞中的放射性水平表明，浓度为2.5 微摩尔的IC87114表现出50％的5-羟色胺释放被抑制。
这些结果表明，p110δ特异性抑制剂能有效地降低Fc-受体交联 介导的肥大细胞脱粒，从而为降低变态反应期间的这些影响提供了 一种方法。
实施例9
P110δ抑制剂对I型超敏反应的影响
如上所述，p110δ抑制剂能有效地降低由IgE交联介导的肥大细 胞脱粒水平。肥大细胞脱粒在介导体内变态反应和其它I型超敏反应 中起重要作用。为研究p110δ抑制剂对体内肥大细胞脱粒的影响，使 用皮肤超敏动物模型。
为进行敏化，剃掉Lewis大鼠背毛，真皮内注射盐水或抗DNP 单克隆IgE(1.25-25ng，50μl/部位)。IgE敏化后48小时，静脉注射1ml 含有抗原(1ng/ml DNP-BSA)和0.5％Evan蓝染料的盐水溶液，30分 钟后，给大鼠实施安乐死。使用测径器，测量注射部位疹块大小， 对皮肤水肿进行评价。切下疹块周围的皮肤，按文献所述方法(Inagaki 等，1986)，测定渗出染料的量。在给予抗原之前1小时，给大鼠口服 单剂量的IC87114(20mg/kg或60mg/kg)或PEG-400(用作溶媒对照)。 抗原攻击前30分钟，腹膜内注射酮替芬(10mg/kg)。在测量疹块大小 之后，立即抽取血样，按文献所述方法(Puri等，Blood 103：3448-3456， 2004)，通过液相色谱/质谱法，测定液-液提取物来确定IC87114的血 浆浓度。
I型超敏反应对IC87114呈现出剂量依赖性反应，在20mg/kg剂 量下，降低至对照组的约70％，在60mg/kg剂量下，降低至对照组 的约55％。阳性对照酮替芬(10mg/kg)使过敏反应降低至对照组的约 35％。
这些结果表明，在敏化动物中，p110δ在介导I型超敏反应中发 挥作用，说明给予p110δ抑制剂，可以减轻或预防I型过敏反应。
实施例10
P110δ抑制剂对人肥大细胞脱粒的影响
为测定P110δ抑制剂对人肥大细胞的影响，从人脐带血中分离 出细胞，使其分化成肥大细胞谱系，然后测定P110δ抑制剂存在下的 脱粒和组胺释放。    
在甲基纤维素存在或不存在下，按照Hsieh等(J Exp Med 193： 123-33，2001)提出的方案，分离出CD34+人脐带血细胞，然后使用干 细胞因子和IL-4使其分化(Iida等，Blood 97：1016-22，2001)。将细胞 培养约5周，然后以1000rpm离心3分钟进行收集。将细胞重悬于 含有10μg/ml IgE的新鲜培养基(RPMI、IMDM或甲基纤维素)中，浓 度为1×106细胞/ml。使细胞致敏5天，然后测定经抗IgE交联的激 活作用。
为评价经IgE交联的肥大细胞活化，以1000rpm离心2分钟收 集细胞，然后用Dulbecco-磷酸缓冲盐溶液(D-PBS)洗涤细胞2次。将 细胞重悬于D-PBS中，浓度为2.5×105细胞/ml。向95μl细胞中加 入5μl200μM的IC87114或酮洛芬的3％DMSO溶液，然后将细胞 于37℃培养30分钟。30分钟后，加入2μl按1∶20稀释的抗IgE，终 浓度为1∶1000 IgE，然后在抗IgE存在下，将细胞培养45分钟。然 后按如上所述方法对细胞进行离心，收集上清液。向细胞中加入等 量的D-PBS，将细胞冻融3次，使细胞裂解。将裂解细胞以10,000rpm 离心4分钟，通过组胺ELISA对组胺的释放进行分析。
对细胞上清液和细胞沉淀中的组胺进行测定。在该实验中， IC87114 p110δ抑制剂在10μM浓度时降低组胺释放约18％(以100％ 总对照释放的标准化为基准)。
这些结果表明，p110δ对人肥大细胞及鼠肥大细胞均有影响，说 明p110δ抑制剂是组胺释放和其它肥大细胞活性的有效调节剂，因此 可用于治疗患有由异常肥大细胞活性介导的疾病或病症的患者。
本领域技术人员知道，可以根据上述说明性实施例，对本发明 进行各种修改和改变。因此，本发明应当仅受所附权利要求书的限 制。
本申请要求于2004年6月4日申请的美国临时专利申请第 60/576,947号的优选权利益，该临时申请结合到本发明中作为参考。