5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的结晶专利检索-镇痛疗法专利检索查询-专利查询网

5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的结晶

阅读：542发布：2023-02-28

专利汇可以提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的结晶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供5-((2-(6- 氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的新晶型，该新的结晶对于选择性抑制腺苷酸环化酶1具有更佳的效果，能够用于制备治疗神经性疼痛和/或炎性疼痛。，下面是5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的结晶专利的具体信息内容。

权利要求

1.5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的结晶，其特征在于，所述结晶用Cu-Ka测量，在粉末X射线衍射的晶面间距d为13.8°±0.2°、16.0°±0.2°、17.1°±
0.2°、21.6°±0.2°、22.1°±0.2°、22.5°±0.2°、23.7°±0.2°、24.7°±0.2°、31.7°±0.2°处显示特征峰。
2.如权利要求1所示的结晶，该结晶具有以下粉末X射线数据：
3.如权要求1或2所述的结晶，其特征是合成路线如下：
4.一种含有如权利要求1或2所述结晶的药物。
5.如权要求4所述的药物，该药物是腺苷酸环化酶1的抑制剂。
6.如权利要求5所述的药物，该药物是镇痛剂。
7.如权利要求6所述的药物，所述镇痛剂是治疗神经性疼痛和/或炎性疼痛的药物。
8.如权利要求6或7所述的药物，所述镇痛剂是治疗癌症性疼痛的药物。
9.如权要求4所述的药物，所述药物是治疗神经性疼痛导致的焦虑和其它疾病相关的焦虑和压抑的药物。
10.如权要求4所述的药物，所述药物是治疗慢性内脏疼痛及其相关的焦虑和压抑的药物。
11.权利要求1或2的结晶在制备用于治疗神经性疼痛和/或炎性疼痛药物中的用途。
12.权利要求1或2的结晶在制备用于治疗神经性疼痛导致的焦虑和其它疾病相关的焦虑和压抑的药物中的用途。
13.权利要求1或2的结晶在制备用于治疗慢性内脏疼痛及其相关的焦虑和压抑的药物中的用途。

说明书全文

5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的

结晶

技术领域

[0001] 本发明涉及一种药物化合物的多晶型，具体涉及5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的多晶型物，其能够选择性抑制腺苷酸环化酶1，可用于治疗神经性疼痛和炎性疼痛。

背景技术

[0002] 疼痛根据其原因分为炎症性疼痛、神经性疼痛(neuropathic pain)、伤害感受性疼痛、精神性(心因性)疼痛等。炎症性疼痛是伴随来自于体外的伤害性机械刺激、热刺激、化学刺激等引起的炎症而产生的疼痛。已知发生炎症性疼痛时，不仅是炎症部位，脊髓中的炎症性细胞因子、环氧合酶也起到了重要的作用。神经性疼痛是因末梢或中枢神经系统本身功能异常而导致的病态疼痛。伤害感受性疼痛是因正常组织受到损伤或者因施加了可能使正常组织受到损伤的伤害刺激而产生的疼痛，分为躯体痛、内脏痛。

[0003] 作为炎症性疼痛的治疗药，可以使用吲哚美辛等环氧合酶(C0X)抑制药、塞来考昔等环氧合酶II(C0X-II)抑制药、曲马多等中枢性镇痛药以及扑热息痛等解热镇痛药等。但若长时间使用环氧合酶抑制药，作为副作用有时会产生胃肠道功能紊乱，成为问题。另外，关于环氧合酶II抑制药，也有引起胃溃疡的报道，而且最近其对心肌梗塞、脑梗塞等心循环体系的副作用也成为问题点。

[0004] 作为神经性疼痛的治疗药，可以使用吗啡等类罂粟碱性镇痛药，加巴喷丁、普加巴林等抗惊厥药，但已知随着使用时间的延长，有时必须增大用量、会产生镇静等副作用，目前的现状是尚没有无副作用、可安全使用的药剂。

[0005] 专利文献1(WO2007/041863)描述了5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇能够选择性抑制腺苷酸环化酶1，可用于治疗神经性疼痛和炎性疼痛。但是专利文献1并没有提供适于工业应用的5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的制备方法，以及适用于药物制备的晶型。而且不同的制备和结晶方法，对于最终产品中有机溶剂残留需要考虑避免使用对哺乳动物有害的二类或二类以上的有机溶剂，减少残留有机溶剂对使用者造成的不良影响。

[0006] 对于药物的多晶型来说，不同的多晶型可以具有不同的化学和物理特性，包括熔点、化学稳定性、表观溶解度、溶解速率、光学和机械性质、蒸汽压及密度等。这些性质会直接或间接影响原料药和制剂的处理或生产，并且会影响制剂的稳定性、溶解度和生物利用度。因此，药物的多晶型对于药物制剂的质量、安全性和有效性具有重要的异议。对于5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇而言，本领域存在这样的需求：适用于工业化生产的制备方法以及理化性能优异的多晶型。

[0007] 现有技术文献

[0008] 专利文献1WO2007/041863

发明内容

[0009] 药物多晶型现象是影响药品质量与临床疗效的重要因素之一，专利文献1(WO2007/041863)虽然描述了5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇能够选择性抑制腺苷酸环化酶1，可用于治疗神经性疼痛和/或炎性疼痛，但是并没有提供可进入临床应用的5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的结晶。

[0010] 因此，本发明的目的在于提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的结晶，其在用于治疗神经性疼痛和/或炎性疼痛的治疗药物方面，该结晶在有效性和安全性方面是优异的。

[0011] 另外，本发明人经大量研究，惊奇地发现了5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的合成路径，并获得了新晶型，成功地解决了现有技术中存在的问题，所述新晶型具有理化性质优异、稳定性好、更适于工业化制备等优点。

[0012] 本发明提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的结晶，该结晶具有以下粉末X射线数据：

[0013] 所述结晶用Cu-Ka测量，在粉末X射线衍射的晶面间距d为13.8°±0.2°、16.0°±0.2°、17.1°±0.2°、21.6°±0.2°、22.1°±0.2°、22.5°±0.2°、23.7°±0.2°、24.7°±0.2°、
31.7°±0.2°处显示特征峰。

[0014] 本发明提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇的合成路线如下：

[0015]

[0016] 本发明还提供含有本发明提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇新型结晶的药物。发明提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇与优先权日本申请JP2016-中所述5-[2-[(6-氨基)-9H-嘌呤-9-基]乙氨基]-1-戊醇是同一种化合物的不同表述方法。

[0017] 本发明提供的药物是腺苷酸环化酶1的抑制剂。

[0018] 本发明提供的药物是镇痛剂。

[0019] 本发明提供的药物是治疗神经性疼痛和/或炎性疼痛的药物。

[0020] 本发明提供的药物是治疗神癌症性疼痛的药物。

[0021] 本发明提供的药物是治疗神经性疼痛导致的焦虑和其它疾病相关的焦虑和压抑的药物。

[0022] 本发明提供的药物是治疗慢性内脏疼痛及其相关的焦虑和压抑的药物。

[0023] 本发明还提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇结晶在制备用于治疗神经性疼痛和/或炎性疼痛药物中的用途。

[0024] 本发明还提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇结晶在制备用于治疗神经性疼痛导致的焦虑和其它疾病相关的焦虑和压抑的药物中的用途。

[0025] 本发明还提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇结晶在制备用于治疗慢性内脏疼痛及其相关的焦虑和压抑的药物中的用途。

[0026] 本发明还提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇结晶在治疗神经性疼痛和/或炎性疼痛中的应用。

[0027] 本发明还提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇结晶在治疗治疗神经性疼痛导致的焦虑和其它疾病相关的焦虑和压抑中的应用。

[0028] 本发明还提供5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇结晶在治疗慢性内脏疼痛及其相关的焦虑和压抑中的应用。附图说明

[0029] 图1是本发明实施例所涉及的结晶的XRPD。

[0030] 图2是本发明实施例所涉及的结晶在偏光显微镜下的照片。

[0031] 图3是本发明实施例所涉及的结晶的TGA图。

[0032] 图4是本发明实施例所涉及的结晶的DSC图。

[0033] 图5是本发明实施例所涉及的结晶的吸附解吸曲线循环1，显示出该结晶在25℃下的水吸附动力学。

[0034] 图6是本发明实施例所涉及的结晶的吸附/解吸等温循环，显示出该结晶在25℃下的水吸附动力学。

[0035] 图7是显示大鼠造模后疼痛行为学检测结果的图。

具体实施方式

[0036] 本发明的5-((2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基)胺基)戊烷-1-戊醇，具有以下结构：

[0037]

[0038] 本发明中该化合物的编号为NB001。

[0039] 本发明的化合物NB001可通过以下方法合成和提纯：

[0040]

[0041] 化合物1是9-(2-羟乙基)腺嘌呤，英文名称为2-(6-Aminopurin-9-yl)ethanol，为市售品，如百灵威科技有限公司、上海迈瑞尔化学技术有限公司、或德国INTATRADE GmbH公司的产品，本发明实施例中的化合物1购自上海珂华生物科技有限公司。

[0042] 化合物3是5-氨基-1-戊醇，英文名称为5-Amino-1-pentanol,如日本和光工业公司、或者HBCChem,Inc.公司的产品，本发明实施例中的化合物3购自TCI公司。

[0043] 按照上述方法，使用化合物1和氯化亚砜进行取代反应，制备化合物2。取代反应按照常规方法进行，或在不影响反应的溶剂中进行。

[0044] 作为不影响反应的溶剂，可以列举例如，二恶烷、四氢呋喃、1,2_二甲氧基乙烷等醚类；氯仿等卤化烃类；甲苯等芳香族烃类；N,N-二甲基甲酰胺等酰胺类；二甲基亚砜等亚砜类等。可将2种以上的这些溶剂以适当比例混合使用。相对于化合物1，这些溶剂的用量为例如1～100容量倍。

[0045] 反应温度通常为约20℃～约250℃、优选20℃～120℃。

[0046] 反应时间通常为约0.5～约36小时。

[0047] 这样得到的化合物2可通过公知的分离纯化方法来进行分离纯化，例如浓缩、减压浓缩、溶剂萃取、结晶、重结晶、相转移、层析等。需要说明的是，化合物2可不经分离直接用于后续反应中。

[0048] 接着，化合物2与化合物3进行缩合反应，得到本发明的化合物NB001。

[0049] 该反应按照常规方法、在不影响反应的溶剂中来进行。

[0050] 作为不影响反应的溶剂，可以列举例如，己烷等烃类；甲醇等醇类；四氢呋喃等醚类；乙酸乙酯等酯类；氯仿等卤化烃类；甲苯等芳香族烃类；N,N-二甲基甲酰胺等酰胺类；二甲基亚砜等亚砜类等。可将2种以上的这些溶剂以适当比例混合使用。相对于化合物2，这些溶剂的用量为例如1～100容量倍。

[0051] 反应温度通常为约20℃～约250℃、优选20℃～120℃。

[0052] 反应时间通常为约0.5～约24小时。

[0053] 这样得到的化合物NB001可通过公知的分离纯化方法来进行分离纯化，例如浓缩、减压浓缩、溶剂萃取、结晶、重结晶、相转移、层析等。需要说明的是，化合物NB001可不经分离直接用于后续实验中。

[0054] 化合物NB001的溶剂化物结晶的实例包括例如醇溶剂化物结晶诸如甲醇溶剂化物结晶、乙醇溶剂化物结晶等；具有水和有机溶剂的有机溶剂水合物结晶(例如醇溶剂化物水合物结晶，诸如甲醇水合物结晶、乙醇水合物结晶等)等。

[0055] 本发明的结晶可通过使无定形化合物NB001、或者化合物NB001的其它结晶进行晶型转变来产生。所述晶型转变是当温度或者压力超过某种水平时结晶结构发生变化的现象。

[0056] 晶型转变的方法的实例包括本身已知的方法，例如，由溶液结晶化(例如浓缩法、缓慢冷却法、反应法(扩散法、电解法)、水热生长法、熔剂法)、由蒸气结晶化(例如气化法(密封管法、气流法)、气相反应法、化学输送法)、由熔融体结晶化(例如常规冷冻法(提升法、温度梯度法、布里奇曼(Bridgman)法)、区域熔融法(区域均化法、浮动区域法)、特殊生长法(VLS法、液相外延法)、蒸散(stream fog)法(其中结晶溶于溶剂中，且在过滤后，在大气条件下蒸发溶剂)、淤浆法(slurry method)(其中结晶加入至溶剂，使得过量固体保留其中，得到混悬液，将所述混悬液在室温或者在加热或者冷却的条件下搅拌，并将固体经过滤收集)以及诸如减压干燥、研磨、粉碎、加压等的方法。

[0057] 为了获得本发明的结晶，在上述方法中，特别优选淤浆法。具体地，优选以下方法：将化合物NB001的结晶加入至溶剂，使得过量固体保留其中，得到混悬液，搅拌所述混悬液，并经过滤收集所述固体。使用的溶剂包括例如芳族烃类(例如苯、甲苯、二甲苯等)、卤代烃类(例如二氯甲烷、氯仿等)、饱和烃类(例如己烷、庚烷、环己烷等)、醚类(例如乙醚、二异丙基醚、四氢呋喃、二恶烷等)、腈类(例如乙腈等)、酮类(例如丙酮等)、亚砜类(例如二甲基亚砜等)、酰胺类(例如N，N-二甲基甲酰胺等)、酯类(例如乙酸乙酯等)、醇类(例如甲醇、乙醇、
2-丙醇等)、水等。这些溶剂可单独使用或者两种或者更多种以适当比例(例如1:1至1:100)混合来使用。优选醇类(例如2-丙醇等)、酮类(甲基乙基酮等)和酯类(例如乙酸乙酯等)，且更优选为酮类(例如甲基乙基酮等)。

[0058] 使用的溶剂的量，相对于化合物NB001的结晶(1g)，通常为约5mL～约65mL，优选约5mL～约25mL。

[0059] 混悬液优选在室温或者约30℃～约60℃、更优选约30℃～约60℃搅拌。在本说明书中，室温是指约15℃～约30℃。在约30℃～约60℃的搅拌时间通常为约30分钟～约4小时，优选约2小时～约4小时。冷却温度为室温。在冷却的条件下的搅拌时间通常为约30分钟～约24小时，优选约30分钟～约2小时。混悬液中的结晶可通过本身已知的方法诸如过滤等来分离。过滤温度为室温，优选约20℃～约30℃。

[0060] 或者，可采用在约0℃～约10℃搅拌混悬液，然后在约0℃～约10℃经过滤收集结晶的方法。

[0061] 可通过本身已知的方法干燥所获得的结晶来获得本发明的结晶。所述干燥可通过减压或者通过通风来进行。干燥温度优选不高于约60℃，更优选为约45℃～约55℃。

[0062] 本发明的结晶之外的结晶，可通过已知的其它方法进行制备。

[0063] 为了分析所获得的结晶，通常采用X射线衍射结晶分析方法。此外，结晶取向也可通过机械方法或者光学方法(例如FT-拉曼光谱、固态NMR光谱等)等来确定。

[0064] 通过上述分析方法所获得的光谱的峰，其性质上不可避免地会产生一定的测定误差。具有误差范围内的光谱峰的结晶也涵盖在本发明的结晶中。例如，粉末X射线衍射的晶面间距(d)中的“±0.2”是指该误差是可被允许的。

[0065] 实施例

[0066] 实施例1化合物NB001的合成

[0067] 按照如下合成路径合成化合物NB001

[0068]

[0069] (1)中间体2的合成和提纯：

[0070] 将化合物1(20.00g,111.62mmol,1.00eq)溶于二氧六环(600.00mL)，然后缓慢加入SOCl2(26.56g,223.24mmol,16.20mL,2.00eq)到上述的反应液中，在100℃的条件下继续搅拌4小时。LCMS检测显示原料完全反应，所期望的产物生成。将反应液中的溶剂在水泵中减压去除，将灰色的残留物加入100毫升的乙醇搅拌10分钟，用砂芯漏斗过滤，将过滤的固体中加入100毫升的饱和的碳酸钠溶液，搅拌20分钟，再用砂芯过滤，固体在水泵中减压旋干得粗品中间体2(19.60g,98.59mmol,收率88.32％,纯度99.4％)，未再进一步纯化直接进行下一步。

[0071] (2)NB001的合成和提纯：

[0072] 将化合物2(19.60g,99.18mmol,1.00eq)溶于正丁醇(390.00mL)，然后加入化合物3(30.69g,297.54mmol,3.00eq)到上述的反应液中，在110℃的条件下继续搅拌18小时。
LCMS检测显示原料完全反应，所期望的产物生成。用水泵在减压下将溶剂去除，浓缩得黄色粗品。将黄色的粗品中加入196毫升的DMF,然后在-40℃的条件下继续搅拌1小时。然后用砂芯漏斗过滤，将其过滤出的固体中加入200毫升的乙酸乙酯，再次过滤得灰白色固体NB001(19.74g,71.38mmol,收率71.97％,纯度95.587％)。

[0073] 实施例2 NB001新晶型的制备

[0074] 称取2.0mg的原料药放进7mL的小瓶里，分别加入适量的甲醇，乙醇，异丙醇，正丁醇，乙腈，丙酮，乙酸乙酯，2-甲基四氢呋喃，四氢呋喃，二氧六环，正戊醇，甲苯，异丙醇+水(质量比3:1)，乙腈+水(质量比3:1)，丙酮+水(质量比3:1)，乙醇+水(质量比3:1)快速摇晃使其化合物溶解，直至溶液变澄清。所得原料药在有机溶剂和混合溶剂中的近似溶解度如表1。

[0075] 表1原料药在有机溶剂和混合溶剂中的近似溶解度

[0076]

[0077] 按表2称取质量为50mg的原料药放进2mL的小瓶里，分别加入适量的乙腈，四氢呋喃，丙酮，异丙醇，乙酸乙酯，乙醇使其成悬浊液，在40℃的条件下混匀仪搅拌两天，其悬浊液离心后40℃烘干。甲醇，乙醇+水(质量比3:1)，异丙醇+水(质量比3:1)和乙腈+水(质量比3:1)在完全溶解后3天自然挥干。将所得固体分别做XRPD，并与原料药对比。

[0078] 所使用X射线粉末衍射器(XRPD)为荷兰帕纳科公司锐影，具体参数为：管：铜：K-Alpha 发生器:电压：40kV，电流：40mA；扫描范围：4～40度；样品旋转速度：15rpm；扫描速度：10度/min，结果如图1所示。

[0079] 表2原料药结晶时所用各种溶液配比

[0080]序号所用溶剂重量(mg) 溶剂量(mL) 加热温度
1 乙腈 52.2 1.0 40℃
2 四氢呋喃 51.7 1.0 40℃
3 丙酮 50.5 1.0 40℃
4 甲醇 51.2 1.0 40℃
5 异丙醇 52.4 1.0 40℃
6 乙酸乙酯 51.8 1.0 40℃
7 乙醇 51.2 1.0 40℃
8 乙醇+水 50.9 1.0 40℃
9 乙腈+水 51.8 1.0 40℃
10 异丙醇+水 50.1 1.0 40℃

[0081] 表3粉末X射线衍射数据

[0082]2θ D值(埃) 相对强度(％)
13.8°±0.2° 6.41 17.4
16.0°±0.2° 5.53 12.8
17.1°±0.2° 5.17 14.3
21.6°±0.2° 4.10 20.6
22.1°±0.2° 4.02 47.7
22.5°±0.2° 3.95 100.0
23.7°±0.2° 3.75 17.6
24.7°±0.2° 3.59 27.6
31.7°±0.2° 2.81 25.2

[0083] 实施例3 NB001新晶型的其它物理性质

[0084] 使用用PLM，TGA，DSC，DVS确定原料药的物理表征。结果见图1至图5。

[0085] (1)偏光显微镜(PLM)

[0086] 把固体样品分散在硅油中，在偏光显微镜下使用10倍目镜，20/50倍物镜进行观察。所用显微镜为尼康公司的Polarized Light Microscope-Nikon Eclipse LV 100POL，其20倍物镜下的图片如图2所示。

[0087] (2)热重分析仪(TGA)方法

[0088] 将2～5mg样品放置样品盘中，以10℃/min的速度从室温加热到300℃。结果如图3所示。

[0089] (3)差式扫描热量法(DSC)方法

[0090] DSC方法：适量的样品放在特定的铝盘中，以10℃/min的速度从25℃加热到300℃。其结果如图4所示。

[0091] (4)动态蒸气吸附(DVS)

[0092] 取约20mg样品至样品盘上，放入仪器进行测试。

[0093] 参数如下：

[0094] 温度：25℃

[0095] 平衡：dm/dt：0.01％/min(最短：10min，最长：180min)

[0096] 干燥：0％RH下干燥120min

[0097] RH(％)测试梯级：10％

[0098] RH(％)测试梯级范围：0％-90％-0％

[0099] 动态蒸气吸附的结果如图5和图6所示。

[0100] 实施例4 NB001晶型的稳定性

[0101] 化合物晶型的影响因素试验、长期及加速稳定性试验：

[0102] 依据《原料药与制剂稳定性试验指导原则》(中国药典2015版四部通则9001)，考察化合物的晶型在高温(60℃)，高湿(92.5％RH)，强光照(5Klx)，40℃/75％RH(加速试验)及25℃/60％RH(长期试验)条件下的稳定性。

[0103] 取本发明实施例涉及的结晶样品10mg，精密称量，置于玻璃样品瓶的底部，摊成薄薄一层。高温，高湿条件及长期试验的样品用铝箔纸封瓶口，并在铝箔纸上扎些小孔，保证样品能与环境条件充分接触；强光照及加速试验的样品用螺纹瓶盖密封。放样条件及时间点见表4。不同条件下放置的样品于第5天，10天，30天取样分析，分析结果与0天的初始检测结果进行比较，稳定性试验结果见表5。

[0104] 表4本发明实施例涉及的结晶的稳定性试验的放样条件和时间点

[0105]

[0106] *检测项目X：性状，含量及有关物质。

[0107] 表5本发明实施例涉及的结晶的稳定性试验结果

[0108]

[0109] 以上结果显示在各种测试条件下化合物晶型稳定性良好。

[0110] 实施例5、NB001结晶作为镇痛剂对大鼠癌性痛的治疗效果

[0111] (一)方法:

[0112] 1.动物：SD大鼠50只(180-220g),置于安静、温暖(22℃)、避强光的环境下饲养，自由饮水、摄食。

[0113] 2.细胞培养：SD大鼠同系癌细胞株Walker 256由第四军医大学动物中心保存，也可以使用市售品。选用RPMI 1640培养液(美国Gibco公司，含10％胎牛血清，青霉素、链霉素各100U/m1)，肿瘤细胞在37℃、5％CO2培养箱内作悬浮细胞培养，隔日换液，2d传代1次。收5
集第3代细胞，收集细胞浓度2×10/10μl。

[0114] 3.大鼠骨癌痛模型建立：大鼠麻醉后(戊巴比妥钠40mg/kg)，按无菌手术操作方法，在左侧膝关节处划开一较小切口，轻剥离肌肉并剪开髌韧带，暴露远端股骨，用1mm注射器针头由髁间窝起垂直转入骨髓腔，转入距离不超过5mm，防止转穿。然后用20μl微量进样5
器深入骨髓腔，缓慢注入10μl含有Walker 256细胞的混悬液(每10μl含2×10 个癌细胞)。
注射完毕并停留数分钟后，再迅速用无菌骨蜡封孔，并用75％的酒精杀死漏出在骨髓腔外的肿瘤细胞，逐层消毒缝合；假手术组采用同样的手术操作，但仅向骨髓腔缓慢注入同体积的无菌生理盐水。

[0115] 4.影像学检查(X-ray)：SD大鼠于术后第7、14、21天麻醉后，对其左侧下肢进行x线摄片，评估肿瘤诱发骨破坏与增生反应程度。

[0116] 5.病理组织学检查(H.E.染色)：大鼠造模术后第21天,麻醉后处死，将左侧股骨用4％多聚甲醛液固定1周，再在甲酸-盐酸复合脱钙液中脱钙1周，常规脱水，石蜡切片(Leica)，常规H.E.染色，显微镜(Olympus BX53)下观察骨结构的破坏情况。

[0117] 6.药物干预：术后第18天，手术组SD大鼠随机分为6组，分别为模型组；NB001非结晶组(20mg/kg,i.g.)；本发明的结晶组(20mg/kg,i.g.)；吗啡(2mg/kg,i.p.)；加巴喷丁(100mg/kg，i.g.)。AC1抑制剂NB001的新晶型及非结晶均由无菌生理盐水配制，吗啡，加巴喷丁作为阳性对照药物。所有药物每日给药2次，共3天，第4天末次给药后2小时内测定痛阈值。

[0118] 7.大鼠疼痛行为学评估：

[0119] 热缩足潜伏期(PWL)：采用PL-200型热痛刺激仪(8V，50W，强度为100％)测定。光照大鼠术侧足底中部，至大鼠出现抬腿回避的时间为TWL。为防止组织损伤，设置截断时间为80S，每只大鼠测定3次，每次间隔5min，取平均值。

[0120] 第7次给药(21d)后2h热缩足潜伏期(PWL)的测定：与模型组相比，NB001非结晶组(20mg/kg,i.g.)；本发明的结晶组(20mg/kg,i.g.)；吗啡(2mg/kg,i.p.)；加巴喷丁(100mg/kg，i.g.)均有较好的镇痛效果，其中，从图7所示可知本发明的结晶组(20mg/kg,i.g.)的镇痛效果极为显著(P＜0.01)。

[0121] 实施例6、NB001结晶抑制慢性疼痛和焦虑的效果

[0122] 慢性内脏疼痛模型

[0123] 通过在小鼠结肠内注射酵母多糖来又发内脏疼痛，所述酵母多糖来自酿酒酵母(Sigma公司)，其中一种葡聚糖赖在酵母细胞壁，并被鉴定为蛋白质-碳水化合物复合体。具体言之，将小鼠用1-3％异氟醚吸入麻醉，然后使用22号的24mm长的塑料喂食真，将0.1m的酵母多糖悬浮液(用生理盐水配制成30mg/ml的溶液)历时2分钟注入小鼠的结肠。对照组被注入0.1ml生理盐水。持续3天每天注入酵母多糖或生理盐水。根据莱尔德(Laird)的方法进行内脏疼痛行为测试。记录10分钟内舔腹部的次数，其中排出其它梳理行为、全身拉伸、将腹部压贴在地板上、1-2秒的拱形姿势。结肠内注射后的第1、7和14日进行旷场试验，从早上9点至下午12点，整个试验采用双盲测试。行为测试之前，小鼠在观察室先驯化30分钟。将小鼠放到一个新的开放区域(43.2×43.2×30.5cm3)的中间，其中微亮(<50lux)并有电扇。通过配有多对成套光束的活动监控系统，30分钟内记录动物的移动距离、垂直计数、移动计数、刻板行为计数、跳动计数。

[0124] 行为焦虑测试

[0125] 采用现有技术的焦虑动物模型———高架十字迷宫模型(The elevated plus maze test,EPM)。小鼠在行为观察之前室内驯化30分钟。EPM是由相向设置的两个开放臂(250lux)和两个封闭臂(350lux).对于每个测试，将单个动物置于测试位的中心并允许自由移动，测试5分钟。记录进入每个臂的次数和花费的时间。

[0126] 明/暗盒子试验：所述试验方法按照现有技术中改进的方法进行。该装置是由矩形的有机玻璃箱(44×8.5×25cm3)构成，该有机玻璃箱被分成相等尺寸的明暗隔室，并由门隔开。明室内点亮60瓦的台灯(400lux)防止在高于盒子30cm处。每个动物先放在暗室内20秒，然后打开通向明室的门。10分钟内记录每个动物留在暗室的时间以及进入明室的时间。

[0127] 结果

[0128] 对于酵母多糖处理后的小鼠，分别将生理盐水、NB001非结晶(3mg/kg)、本发明的结晶(3mg/kg)、作为阳性对照的加巴喷丁(Gabapentin 30mg/kg)作腹腔注射(IP)。在酵母多糖处理后的28天观察小鼠行为。结果如表6所示，NB001非结晶(3mg/kg)、本发明的结晶(3mg/kg)相对于阳性对照组，都有显著的治疗效果。而且本发明的结晶组的治疗效果达到了极显著。

[0129] 表6本发明结晶对于慢性疼得的治疗效果

[0130] 动物的数目内脏疼痛计分的数目
生理盐水 8 27.5±2.4
旧的NB001 7 19.6±1.2
新的NB001 8 11.0±0.7
加巴喷丁 8 20.7±1.9

[0131] 另两组试验是为了测试本发明结晶对于慢性疼痛和神经性疼痛引起的焦虑的抑制效果。

[0132] EPM试验测试了实验处理后的小鼠的焦虑行为，对于酵母多糖处理后的小鼠，分别将生理盐水、NB001非结晶(3mg/kg)、本发明的结晶(3mg/kg)、作为阳性对照的加巴喷丁(Gabapentin 30mg/kg)作腹腔注射(IP)。在酵母多糖处理后的28天观察小鼠行为。结果如表7所示，NB001非结晶(3mg/kg)、本发明的结晶(3mg/kg)相对于阳性对照组，都有显著的治疗效果。而且本发明的结晶组的治疗效果达到了极显著。

[0133] 表7 EPM试验结果

[0134]

[0135] 为了确认本发明结晶对于抑制焦虑的效果，对小鼠进行了明/暗箱试验，结果如表8所示。对于酵母多糖处理后的小鼠，分别将生理盐水、NB001非结晶(3mg/kg)、本发明的结晶(3mg/kg)、作为阳性对照的加巴喷丁(Gabapentin 30mg/kg)作腹腔注射(IP)。在酵母多糖处理后的28天观察小鼠行为。结果如表8所示，NB001非结晶(3mg/kg)、本发明的结晶(3mg/kg)相对于阳性对照组，都有显著的治疗效果。而且本发明的结晶组的治疗效果达到了极显著。

[0136] 表8明/暗箱试验结果

[0137]

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