关节炎用草药制剂
阅读：1028发布：2020-10-24
专利汇可以提供关节炎用草药制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种包括从青 风 藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄提取的组分的口服制剂。这种制剂具有抗关节炎、抗炎和 镇痛 的性质，并且适用于关节炎、与关节炎有关的症状和其它类似症状的 治疗 。，下面是关节炎用草药制剂专利的具体信息内容。
1.一种关节炎用中药制剂，包括植物原料青风藤(Caulis Sinomenii)、制附子(Radix Aconitii Lateralis Preparata)、白芍(Radix Paeoniae Alba)、牡丹皮(Cortex Moutan)和姜黄(Rhizoma Curcumae Longae)的提取物，其中所述植物原料的重量比例为：青风藤2-10份、制附子1-6 份、白芍3-15份、牡丹皮1-8份和姜黄1-8份，所述制剂通过以下步骤制备：
a.减小植物原料青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄的尺寸；
b.以适当的液体不止一次提取从步骤a获得的尺寸减少的植物原料以得到提取物；
c.浓缩由步骤b获得的提取物；和
d.混合以上浓缩的提取物；
其中所述提取步骤b包括：
(i)用乙醇或水提取青风藤、制附子、白芍加以制备对应的提取物；
(ii)以超临界二氧化碳萃取、或用乙醇或水提取牡丹皮以制备对应的提取物；
(iii)以超临界二氧化碳萃取、或用乙醇或水提取姜黄以制备对应的提取物。
2.如权利要求1所述的制剂，其中所述提取步骤b包括：
(i)用乙醇提取青风藤、制附子、白芍加以制备对应的提取物；
(ii)以超临界二氧化碳萃取提取牡丹皮以制备对应的提取物；
(iii)以超临界二氧化碳萃取提取姜黄以制备对应的提取物。
3.如权利要求1或2所述的制剂，其中所述植物原料的重量比例为：青风藤5份、制附 子3份、白芍6份、牡丹皮3份和姜黄3份。
4.如权利要求1或2所述的制剂，其中所述植物原料的重量比例为青风藤4份、制附子 3份、白芍5份、牡丹皮3份和姜黄2份。
5.如权利要求1或2所述的制剂，进一步包括药学上可接受的载体、稀释剂或添加剂。
6.如权利要求1或2所述的制剂，其中制剂是适于口服给药的剂型。
7.如权利要求6所述的制剂，其中剂型选自胶囊、粉剂、片剂、液体和囊片。
8.如权利要求1或2所述的制剂，其进一步包括至少一种从所述步骤b中获得的提取物 经受纯化工艺，其中纯化工艺是通过聚合吸附树脂。
9.如权利要求2所述的制剂，其中所述步骤b(ii)进一步包括用乙醇提取牡丹皮残渣以制 备另一提取物。
10.如权利要求2所述的制剂，其中所述步骤b(iii)进一步包括用乙醇提取姜黄残渣以制 备另一提取物。
11.如权利要求1或2所述的制剂，其中所述植物原料的重量比例为青风藤4份、制附子 3份、白芍5份、牡丹皮3份和姜黄2份，以及步骤b包括：
(i)用水提取青风藤得到它的水提取物作为提取物1.1；及
用乙醇提取制附子和白芍得到的它们的乙醇提取物作为提取物1.2；
(ii)以超临界二氧化碳萃取牡丹皮以得到它的超临界流体萃取物作为提取物2.1；和
用乙醇提取通过上述超临界二氧化碳萃取步骤得到的牡丹皮残渣以得到牡丹皮的乙醇提 取物作为提取物2.2；及
(iii)以超临界二氧化碳萃取姜黄以得到它的超临界流体萃取物作为提取物3.1；和
用乙醇提取通过上述超临界二氧化碳萃取步骤得到的姜黄残渣以得到姜黄的乙醇提取物 作为提取物3.2；
其中步骤c进一步包括浓缩每个通过步骤b得到的提取物以得到浓缩的提取物；
其中步骤d进一步包括用适当的赋形剂混合上述浓缩的提取物以得到制剂。
12、如权利要求1或2所述的制剂，其中步骤b(i)包括：
(1)用乙醇不止一次提取青风藤、制附子和白芍得到乙醇提取物1；及
(2)混合和过滤乙醇提取物1以得到过滤的青风藤、制附子和白芍提取物；
步骤(ii)包括：
(1)以超临界二氧化碳萃取牡丹皮以得到提取物2；
(2)用乙醇不止一次提取通过上述超临界二氧化碳萃取步骤得到的牡丹皮残渣以得到牡 丹皮的乙醇提取物；及
(3)混合和过滤所述牡丹皮的乙醇提取物以得到过滤的牡丹皮提取物；
步骤(iii)包括：
(1)以超临界二氧化碳萃取姜黄以得到提取物3；
(2)用乙醇不止一次提取通过上述超临界二氧化碳萃取步骤得到的姜黄残渣以得到姜黄 的乙醇提取物；和
(3)混合和过滤所述姜黄的乙醇提取物以得到过滤的姜黄提取物
其中步骤c包括浓缩从步骤(i)-(iii)得到的过滤的青风藤、制附子和白芍提取物、过滤的 牡丹皮提取物、过滤的姜黄提取物以分别获得浓缩的提取物1a、2a和3a；及
其中步骤d包括将浓缩的提取物1a、2a、3a和提取物2及提取物3混合以得到制剂。
13.如权利要求1所述的制剂在制备治疗哺乳动物关节炎或与关节炎相关的炎症及疼痛 药物方面的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述关节炎是类风湿性关节炎。
15.如权利要求13所述的用途，其中所述关节炎是强直性脊柱炎。
16.如权利要求13所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
17.如权利要求1所述的制剂在制备治疗性关节炎及类似症状的药物方面的用途。
18.一种包括如权利要求1所述的制剂的保健品。
19.一种确定权利要求1所述制剂的质量的方法，该方法包括：
(a)提供该制剂的提取物；
(b)提取物在某些参数下经受至少一种分离技术；
(c)至少一种已知的标志物在如上同样的参数下经受同样的分离技术；
(d)比较至少一种已知标志物和提取物中的相应标志物以确定该制剂的质量。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述分离技术选自由薄层色谱、高效液相色谱和其 组合所组成的组。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述比较步骤包括定性比较和定量比较。
技术领域
本发明广义上涉及膳食补充剂和治疗混合物领域，狭义上涉及包括用于改善关节炎和减 轻与关节炎有关的炎症和疼痛的草药提取物的制剂。
背景技术
本公开引用的参考文献不必然是现有技术。引用这些参考文献也不必定代表承认这些参 考文献是现有技术。在本文中所有出版物、专利和专利申请的引用，皆可视为整份文件的引 用。
关节炎是影响肌肉及骨骼系统，特别是关节的疾病。它不是一个单一的疾病，它实际上 涵盖了与关节受影响的100多种临床症状。按照关节炎基金会的报道，仅在美国受到关节炎 折磨的成年人和儿童分别超过七千万和三十万。
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是关节炎的一种，也是关节炎最常见的一种。 RA在工业发达国家发病率为0.5～1.0％，它是一种慢性炎症和破坏性关节疾病，通常会导致 显著的病残和随之而来的生活质量下降。RA在女性的发病率是男性的两至三倍，在任何年龄 段均可发生，40～60岁是发病高峰期。RA治疗费用高昂，如果未予适当治疗，会引起寿命的 缩短。除了炎性过程引起的关节肿胀和疼痛之外，关节外的受累，包括从类风湿性皮下小结 到对生命构成威协的结节性脉管炎，均是RA的特征，RA的最终标志是关节的破坏。
强直性脊柱炎(Ankylosis spondylitis，AS)是另一种常见的关节炎。AS是一种主要引起脊 柱和骶髂的关节发炎的风湿性疾病，也能引起眼、肺和心瓣膜的炎症。它表现出来的症状包 括终身的间歇性背部疼痛，脊柱、外周关节和内脏器官的严重慢性疾病，随着发病过程的进 行逐渐引起严重的关节及背部僵硬、运动功能受损和畸形。在美国，10万人口中约有129人 患此病，多发于青少年和青壮年男子。AS的发病与种族有关，在美国原住民(Native Americans) 中最常见。
在现有已授权的专利中，有几篇报道了用于减轻由关节炎和其它类似病引起的疼痛和炎 症的局部用药制剂。例如，US6274176(Tomer)教导了一种可食用的制剂，其组成包括小白菊、 姜、姜黄、芫荽、积雪草、月见草、缬草、风铃木、百里香和接骨木。
授权给侯氏的专利US6350476则教导了另一种制剂，其组成包括源于千金藤属、薏苡属、 半夏属、梅属、黄檗属、槐属、通脱木属、百部属、甘草属、雷公藤属、连翘属和豨莶属的 植物。令人感兴趣地的是，专利US6350476是基于侯氏早期的另一个专利US5908628，在专 利US5908628中，其组成除包括专利US6350476的所有植物外，还加入了滑石和蚕沙。但候 氏随后的研究发现滑石和蚕沙并不是必需的，在这个发现的基础上形成了专利US6350476所 保护的内容。
其它具有相似用途的发明均采用了许多草药组分。任氏的中国专利第98125678.3号报道 了一种可有效减轻疼痛和炎症的软膏，该软膏含有27味草药组分，即：石斛、熟地黄、制附 子、续断、补骨脂、雷公藤、青风藤、桂枝、羌活、独活、白芍、威灵仙、伸筋草、黄芪、 防已、防风、苍术、白术、细辛、地龙、鸡血藤、赤芍、知母、地鳖虫、乌药、甘草和牛膝。
王氏的中国专利第99120466.2号报道了一种外用药剂，它含有43种传统中药材，包括 天麻、三七、杜仲、仙灵脾、土鳖虫、川乌、草乌、全蝎、蜈蚣、何首乌、穿山甲、水蛭、 乳香、没药、当归、川芎、丹参、桃仁、赤芍、鸡血藤、红花、血竭、续断、桑寄生、牡丹 皮、姜黄、川牛膝、五加皮、乌梢蛇、象皮、血余炭、麻黄、细辛、防风、独活、白芷、天 南星、大黄、葛根、罂粟壳、冰片、芥子、铅丹和麻油。
上述现有专利均是外用药剂，这些药物在治疗关节炎中具有一定作用，但这些外用药剂 发挥药效均需穿透过皮肤组织等后进入肌肉和关节才可实现，有一定的局限性。因此，本发 明的目的之一就是针对此点开发一种能改善关节炎的草药制剂。
关节炎是影响肌肉及骨骼系统，特别是关节的疾病。它不是一个单一的疾病，它实际上 涵盖了与关节受影响的100多种临床症状。按照关节炎基金会的报道，仅在美国受到关节炎 折磨的成年人和儿童分别超过七千万和三十万。
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是关节炎的一种，也是关节炎最常见的一种。 RA在工业发达国家发病率为0.5～1.0％，它是一种慢性炎症和破坏性关节疾病，通常会导致 显著的病残和随之而来的生活质量下降。RA在女性的发病率是男性的两至三倍，在任何年龄 段均可发生，40～60岁是发病高峰期。RA治疗费用高昂，如果未予适当治疗，会引起寿命的 缩短。除了炎性过程引起的关节肿胀和疼痛之外，关节外的受累，包括从类风湿性皮下小结 到对生命构成威协的结节性脉管炎，均是RA的特征，RA的最终标志是关节的破坏。
强直性脊柱炎(Ankylosis spondylitis，AS)是另一种常见的关节炎。AS是一种主要引起脊 柱和骶髂的关节发炎的风湿性疾病，也能引起眼、肺和心瓣膜的炎症。它表现出来的症状包 括终身的间歇性背部疼痛，脊柱、外周关节和内脏器官的严重慢性疾病，随着发病过程的进 行逐渐引起严重的关节及背部僵硬、运动功能受损和畸形。在美国，10万人口中约有129人 患此病，多发于青少年和青壮年男子。AS的发病与种族有关，在美国原住民(Native Americans) 中最常见。
在现有已授权的专利中，有几篇报道了用于减轻由关节炎和其它类似病引起的疼痛和炎 症的局部用药制剂。例如，US6274176(Tomer)教导了一种可食用的制剂，其组成包括小白菊、 姜、姜黄、芫荽、积雪草、月见草、缬草、风铃木、百里香和接骨木。
授权给侯氏的专利US6350476则教导了另一种制剂，其组成包括源于千金藤属、薏苡属、 半夏属、梅属、黄檗属、槐属、通脱木属、百部属、甘草属、雷公藤属、连翘属和豨莶属的 植物。令人感兴趣地的是，专利US6350476是基于侯氏早期的另一个专利US5908628，在专 利US5908628中，其组成除包括专利US6350476的所有植物外，还加入了滑石和蚕沙。但候 氏随后的研究发现滑石和蚕沙并不是必需的，在这个发现的基础上形成了专利US6350476所 保护的内容。
其它具有相似用途的发明均采用了许多草药组分。任氏的中国专利第98125678.3号报道 了一种可有效减轻疼痛和炎症的软膏，该软膏含有27味草药组分，即：石斛、熟地黄、制附 子、续断、补骨脂、雷公藤、青风藤、桂枝、羌活、独活、白芍、威灵仙、伸筋草、黄芪、 防已、防风、苍术、白术、细辛、地龙、鸡血藤、赤芍、知母、地鳖虫、乌药、甘草和牛膝。
王氏的中国专利第99120466.2号报道了一种外用药剂，它含有43种传统中药材，包括 天麻、三七、杜仲、仙灵脾、土鳖虫、川乌、草乌、全蝎、蜈蚣、何首乌、穿山甲、水蛭、 乳香、没药、当归、川芎、丹参、桃仁、赤芍、鸡血藤、红花、血竭、续断、桑寄生、牡丹 皮、姜黄、川牛膝、五加皮、乌梢蛇、象皮、血余炭、麻黄、细辛、防风、独活、白芷、天 南星、大黄、葛根、罂粟壳、冰片、芥子、铅丹和麻油。
上述现有专利均是外用药剂，这些药物在治疗关节炎中具有一定作用，但这些外用药剂 发挥药效均需穿透过皮肤组织等后进入肌肉和关节才可实现，有一定的局限性。因此，本发 明的目的之一就是针对此点开发一种能改善关节炎的草药制剂。
发明内容
本发明一方面提供适于减轻与关节炎有关症状的口服制剂或者适于预防性改善关节炎的 口服制剂。本制剂同时还提供由草药中提取有效提取物的方法，该提取物可在上述口服制剂 中使用。
本发明的制剂包括青藤属(Sinomenium spp.)、乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)、芍药 (Paeonia lactiflora Pall.)、牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)和姜黄(Curcuma longa L.)的提取物。 本制剂包括青风藤(Caulis Sinomenii)、制附子(Radix Aconitii Lateralis Preparata)、白芍(Radix Paeoniae Alba)、牡丹皮(Cortex Moutan)和姜黄(Rhizoma Curcumae Longae)的提取物。
本发明的关节炎用中药制剂，包括植物原料青风藤(Caulis Sinomenii)、制附子(Radix Aconitii Lateralis Preparata)、白芍(Radix Paeoniae Alba)、牡丹皮(Cortex Moutan)和姜黄 (Rhizoma Curcumae Longae)的提取物，其中所述植物原料的重量比例为：青风藤2-10份、制 附子1-6份、白芍3-15份、牡丹皮1-8份和姜黄1-8份，所述制剂通过以下步骤制备：
a.减小植物原料青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄的尺寸；
b.以适当的液体不止一次提取从步骤a获得的尺寸减少的植物原料以得到提取物；
c.浓缩由步骤b获得的提取物；和
d.混合以上浓缩的提取物。
其中所述提取步骤b包括：
(i)用乙醇或水提取青风藤、制附子、白芍加以制备对应的提取物；
(ii)以超临界二氧化碳萃取，或用乙醇或水提取牡丹皮以制备对应的提取物；
(iii)以超临界二氧化碳萃取，或用乙醇或水提取姜黄以制备对应的提取物；
本发明的制剂基本上由青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄组成。
本发明的制剂由青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄组成。
在优选的实施方案中，这种制剂包括以下重量比的植物原料：青风藤2-10份，制附子1-6 份，白芍3-15份，牡丹皮1-8份和姜黄1-8份，或者在比例下各种植物相当量的新鲜植物原 料。
在本发明的一项实践中，本发明的制剂包括大约以下重量比的植物原料：青风藤5份， 制附子3份，白芍6份，牡丹皮3份和姜黄3份。
在另一实践中，本发明的制剂包括大约以下重量比的植物原料：青风藤4份，制附子3 份，白芍5份，牡丹皮3份和姜黄2份。
另一方面，本发明教导减小草药青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄的尺寸，并以适 当的溶剂进行提取，随后进行浓缩并制备成适用于口服制剂的提取物的方法。
本发明优选的第一实施方案是：减小步骤优选通过粉碎草药完成。提取步骤包括以乙醇 回流提取青风藤、制附子和白芍制备提取物1；以超临界二氧化碳萃取牡丹皮制备提取物2； 以乙醇提取牡丹皮超临界二氧化碳萃取后的残渣以制备提取物3；以超临界二氧化碳萃取姜 黄以制备提取物4；然后以乙醇提取姜黄超临界二氧化碳萃取的残渣以制备提取物5。本发明 的提取物通过混合提取物1、2、3、4和5形成。
在本发明中，这些提取方法的任何一种均可后继以纯化工艺以纯化各提取物并获得纯化 的提取物，首选的纯化工艺是聚合吸附树脂(大孔吸附树脂)。
本发明优选的另一实施方案是：减小草药青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄的尺寸； 获得青风藤的水提取物，制附子和白芍的乙醇提取物，牡丹皮的超临界流体萃取物，牡丹皮 的乙醇提取物，姜黄的超临界流体提取物，姜黄的乙醇提取物作为提取物；接着这些提取物 与适当赋形剂混合，填充胶囊，以获得便于口服给药的制剂。
又一方面，本发明提供包括从青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄提取的几种主要活 性成分的组合物。这几种主要活性成分是青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素。该组合物还进 一步包括去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素。
另一方面，本发明还提供一种治疗哺乳动物关节炎的方法，包括经口给予治疗有效量的 组合物，这些组合物由以上方案给出或者通过以上教导的方法获得。
本发明还教导以上给出的组合物在适于治疗哺乳动物关节炎的药剂中的用途。
因此，本发明进一步还涉及药剂或健康补充剂，在关节炎和关节炎症状(例如归因于类 风湿性关节炎和关节强硬性脊椎柱炎的症状)的治疗中，它可以经口或全身应用至整个身体 以在更深的组织内发挥其作用。
本发明还提供通过色谱分析控制本发明的产品质量的方法和标准。
附图说明
图1A和1B分别表示青藤碱对照品和混合物Dp内青藤碱的HPLC色谱图。
图2A和2B分别表示芍药苷对照品和混合物Dp内芍药苷的HPLC色谱图。
图3A和3B分别表示姜黄素对照品和混合物Dp内姜黄素的HPLC色谱图。
图4分别表示青藤碱对照品和组合物内青藤碱的TLC色谱图。
图5分别表示芍药苷对照品和组合物内芍药苷的TLC色谱图。
图6分别表示次乌头碱对照品和组合物内次乌头碱的TLC色谱图。
图7分别表示丹皮酚(paenonol)对照品和组合物内丹皮酚的TLC色谱图。
图8分别表示姜黄素对照品和组合物内姜黄素的TLC色谱图。
图9A表示制备的不含制附子的组合物的HPLC色谱图，而图9B和9C分别表示乌头碱、 中乌头碱和次乌头碱对照品和组合物内乌头碱、中乌头碱和次乌头碱的HPLC色谱图。
图10A表示制备的不含青风藤的组合物的HPLC色谱图，而图10B和10C分别表示青藤 碱对照品和组合物内青藤碱的HPLC色谱图。
图11A表示制备的不含白芍的组合物的HPLC色谱图，而图11B和11C分别表示芍药苷 对照品和组合物内芍药苷的HPLC色谱图。
图12A表示制备的不含牡丹皮的组合物的HPLC色谱图，而图12B和12C分别表示丹皮 酚对照品和组合物内丹皮酚的HPLC色谱图。
图13A表示制备的不含姜黄的组合物的HPLC色谱图，而图13B和13C分别表示姜黄素 对照品和组合物内姜黄素的HPLC色谱图。
图14A、14B和14C分别表示在佐剂诱导的关节炎中混合物Dp在参数足体积、关节炎 指数和体重方面的抗关节炎作用。
图15A、15B和15C分别表示在佐剂诱导的关节炎中，由包囊工艺得到的胶囊在参数脚 足体积、关节炎指数和体重方面的抗关节炎作用。
图16A、16B和16C分别表示在II型胶原诱导的关节炎中，由包囊工艺得到的胶囊在参 数脚足体积、关节炎指数和体重方面的抗关节炎作用。
图17表示由包囊工艺得到的胶囊长期给药对正常SD大鼠体重的影响。
本发明的制剂包括青藤属(Sinomenium spp.)、乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)、芍药 (Paeonia lactiflora Pall.)、牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)和姜黄(Curcuma longa L.)的提取物。 本制剂包括青风藤(Caulis Sinomenii)、制附子(Radix Aconitii Lateralis Preparata)、白芍(Radix Paeoniae Alba)、牡丹皮(Cortex Moutan)和姜黄(Rhizoma Curcumae Longae)的提取物。
本发明的关节炎用中药制剂，包括植物原料青风藤(Caulis Sinomenii)、制附子(Radix Aconitii Lateralis Preparata)、白芍(Radix Paeoniae Alba)、牡丹皮(Cortex Moutan)和姜黄 (Rhizoma Curcumae Longae)的提取物，其中所述植物原料的重量比例为：青风藤2-10份、制 附子1-6份、白芍3-15份、牡丹皮1-8份和姜黄1-8份，所述制剂通过以下步骤制备：
a.减小植物原料青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄的尺寸；
b.以适当的液体不止一次提取从步骤a获得的尺寸减少的植物原料以得到提取物；
c.浓缩由步骤b获得的提取物；和
d.混合以上浓缩的提取物。
其中所述提取步骤b包括：
(i)用乙醇或水提取青风藤、制附子、白芍加以制备对应的提取物；
(ii)以超临界二氧化碳萃取，或用乙醇或水提取牡丹皮以制备对应的提取物；
(iii)以超临界二氧化碳萃取，或用乙醇或水提取姜黄以制备对应的提取物；
本发明的制剂基本上由青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄组成。
本发明的制剂由青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄组成。
在优选的实施方案中，这种制剂包括以下重量比的植物原料：青风藤2-10份，制附子1-6 份，白芍3-15份，牡丹皮1-8份和姜黄1-8份，或者在比例下各种植物相当量的新鲜植物原 料。
在本发明的一项实践中，本发明的制剂包括大约以下重量比的植物原料：青风藤5份， 制附子3份，白芍6份，牡丹皮3份和姜黄3份。
在另一实践中，本发明的制剂包括大约以下重量比的植物原料：青风藤4份，制附子3 份，白芍5份，牡丹皮3份和姜黄2份。
另一方面，本发明教导减小草药青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄的尺寸，并以适 当的溶剂进行提取，随后进行浓缩并制备成适用于口服制剂的提取物的方法。
本发明优选的第一实施方案是：减小步骤优选通过粉碎草药完成。提取步骤包括以乙醇 回流提取青风藤、制附子和白芍制备提取物1；以超临界二氧化碳萃取牡丹皮制备提取物2； 以乙醇提取牡丹皮超临界二氧化碳萃取后的残渣以制备提取物3；以超临界二氧化碳萃取姜 黄以制备提取物4；然后以乙醇提取姜黄超临界二氧化碳萃取的残渣以制备提取物5。本发明 的提取物通过混合提取物1、2、3、4和5形成。
在本发明中，这些提取方法的任何一种均可后继以纯化工艺以纯化各提取物并获得纯化 的提取物，首选的纯化工艺是聚合吸附树脂(大孔吸附树脂)。
本发明优选的另一实施方案是：减小草药青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄的尺寸； 获得青风藤的水提取物，制附子和白芍的乙醇提取物，牡丹皮的超临界流体萃取物，牡丹皮 的乙醇提取物，姜黄的超临界流体提取物，姜黄的乙醇提取物作为提取物；接着这些提取物 与适当赋形剂混合，填充胶囊，以获得便于口服给药的制剂。
又一方面，本发明提供包括从青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄提取的几种主要活 性成分的组合物。这几种主要活性成分是青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素。该组合物还进 一步包括去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素。
另一方面，本发明还提供一种治疗哺乳动物关节炎的方法，包括经口给予治疗有效量的 组合物，这些组合物由以上方案给出或者通过以上教导的方法获得。
本发明还教导以上给出的组合物在适于治疗哺乳动物关节炎的药剂中的用途。
因此，本发明进一步还涉及药剂或健康补充剂，在关节炎和关节炎症状(例如归因于类 风湿性关节炎和关节强硬性脊椎柱炎的症状)的治疗中，它可以经口或全身应用至整个身体 以在更深的组织内发挥其作用。
本发明还提供通过色谱分析控制本发明的产品质量的方法和标准。
附图说明
图1A和1B分别表示青藤碱对照品和混合物Dp内青藤碱的HPLC色谱图。
图2A和2B分别表示芍药苷对照品和混合物Dp内芍药苷的HPLC色谱图。
图3A和3B分别表示姜黄素对照品和混合物Dp内姜黄素的HPLC色谱图。
图4分别表示青藤碱对照品和组合物内青藤碱的TLC色谱图。
图5分别表示芍药苷对照品和组合物内芍药苷的TLC色谱图。
图6分别表示次乌头碱对照品和组合物内次乌头碱的TLC色谱图。
图7分别表示丹皮酚(paenonol)对照品和组合物内丹皮酚的TLC色谱图。
图8分别表示姜黄素对照品和组合物内姜黄素的TLC色谱图。
图9A表示制备的不含制附子的组合物的HPLC色谱图，而图9B和9C分别表示乌头碱、 中乌头碱和次乌头碱对照品和组合物内乌头碱、中乌头碱和次乌头碱的HPLC色谱图。
图10A表示制备的不含青风藤的组合物的HPLC色谱图，而图10B和10C分别表示青藤 碱对照品和组合物内青藤碱的HPLC色谱图。
图11A表示制备的不含白芍的组合物的HPLC色谱图，而图11B和11C分别表示芍药苷 对照品和组合物内芍药苷的HPLC色谱图。
图12A表示制备的不含牡丹皮的组合物的HPLC色谱图，而图12B和12C分别表示丹皮 酚对照品和组合物内丹皮酚的HPLC色谱图。
图13A表示制备的不含姜黄的组合物的HPLC色谱图，而图13B和13C分别表示姜黄素 对照品和组合物内姜黄素的HPLC色谱图。
图14A、14B和14C分别表示在佐剂诱导的关节炎中混合物Dp在参数足体积、关节炎 指数和体重方面的抗关节炎作用。
图15A、15B和15C分别表示在佐剂诱导的关节炎中，由包囊工艺得到的胶囊在参数脚 足体积、关节炎指数和体重方面的抗关节炎作用。
图16A、16B和16C分别表示在II型胶原诱导的关节炎中，由包囊工艺得到的胶囊在参 数脚足体积、关节炎指数和体重方面的抗关节炎作用。
图17表示由包囊工艺得到的胶囊长期给药对正常SD大鼠体重的影响。
具体实施方式
如本说明书和权利要求所使用的，术语“包括(comprise)”、“包括comprises”、“包括 comprising”意指“包括，但不必需限于”。例如，一种包含A、B和C的方法、装置、分子 或其它项目，可准确地说包括A和B。同样，一种“包括A和B”的方法、装置、分子或其 它项目，也可包括任何数目的额外步骤、组分、原子或其它项目等。术语“基本上组成”意 指术语“包括”更窄的观点，其中额外步骤、组分、原子或其它项目受更多限制，例如，至 多一些额外的这样的步骤或项目。术语“组成”意指包含A、B和C的方法、装置、分子或 其它项目仅限于A、B和C。
同样，除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有和本发明所属的领域普通技 术人员通常理解相同的含义。
全面描述
按照中华人民共和国药典(2000年版一部)的标准和要求鉴别本发明的实验制剂和研究中 使用的所有草药组分。对规定的形态学、显微镜检查、以及化学分析等指标进行检验。本文 使用的植物学和草药命名和中华人民共和国药典(2000年版一部)中使用的相同，并且应当按 照此出版物解释。在本文中，术语“植物原料”或“草药原料”指本发明使用的草药和草药 的各种部位或组织。可交换地使用这些术语。
1 本发明的制剂的组分
1.1 组分
在以下如何制备按照本发明的制剂的说明中，植物原料是：
组分1得自草药青藤属(Sinomenium spp.)的草药青风藤(Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd. et Wils.)或者草药毛青藤(Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.var.cinereum Rehd.et Wils.)。
组分2是草药乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)。
组分3是草药芍药(Paeonia lactiflora Pall.)。
组分4是草药牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)。
组分5是草药姜黄(Curcuma longa L.)。
特别地，植物原料是：
组分1是青风藤或者草药青风藤或草药毛青藤的主干。
组分2是制附子，草药乌头的侧根。
组分3是白芍，草药芍药的根。
组分4是牡丹皮，牡丹草药牡丹的茎皮。
组分5是姜黄，草药姜黄的根茎。
所述青风藤、制附子、白芍、牡丹皮、姜黄的定义如下：
青风藤(Caulis Sinomenii)
青风藤是草药青风藤或草药毛青藤的干燥藤茎，在全国均有栽培。
制附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)
制附子是草药乌头侧根的炮制品。乌头属的植物产生各种C19非二萜类和C20二萜类化合 物。这些化合物中，某些8-乙酰基-14-芳酰基二酯C19生物碱，如乌头碱是极毒的。这种生物 碱组分和它们的浓度会随种类、采集的地点时间和炮制的方法变化而变化。尽管它们有毒， 但由于它们的药学价值，乌头根仍然是一种重要的中药。但为了用药安全，乌头的根或侧根 在干燥以便贮藏之前，均需通过在水中煮几个小时进行炮制以减毒。
白芍(Radix Paeoniae Alba)
白芍(白牡丹根；Baishao)，芍药的去皮干燥根，是中国传统滋补药材之一。它还被用作 解痉和疼痛缓解剂，并且长期被用于调节月经，治疗月经失调以及减轻腹部痉挛疼能和肌肉 强直。
牡丹皮(Cortex Moutan)
牡丹皮，芍药科牡丹草药牡丹茎和根的皮。干品称为牡丹皮(Moutan bark、tree peony bark、 Mudanpi)。通常在秋季采集，除去多纤维的部分后再干燥。
姜黄(Rizhoma Curcumae Longae)
姜黄是一种重要的中药制剂原料和染料，它含丰富的酚类化合物，即姜黄素类成分。姜 黄素[1，7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5，-二酮]，是一种常用的天然黄色颜料，广泛 用于食品染色，如酸菜和小吃。
1.2 组分的比例
本发明教导一种制剂，以干重计包括以下比例的植物原料：青风藤2-10份；制附子1-6 份；白芍3-15份；牡丹皮1-8份；和姜黄1-8份。
2 材料和方法
2.1 草药
青风藤，安徽省的野生产品，购自广东中粤药材联合公司。
制附子，成都市江油县中药材生产质量管理规范(GAP)基地的产品，姜黄，成都市双 流县姜黄GAP基地的产品，均购自四川省成都市药材市场。白芍，安徽省亳州市白芍GAP 基地的产品，牡丹皮，安徽省铜陵市牡丹皮GAP基地的产品，均购自安徽省毫州药材市场。
由于中药材通常多是经过干燥后再出售。因此，本发明中所给出的重量为各药材的干重 量。
2.2 设备
采用RT-80粉碎机(CERT-04，FARGO，台湾，中国)、中药多功能提取罐(DT-3m3，中国 温州)、减压回收罐(ZWN-1000，中国天津)和超临界二氧化碳萃取器装置(HA421-40-96，中国 南通)制备各种草药提取物。采用体积测量仪(plethymometer)(UGO Basile，意大利)和IITC 336 p甩尾痛觉测试计(IITC Inc，Woodland Hills，美国加利福尼亚)以评价各种草药提取物的抗炎 和镇活性。
2.3 提取方法
2.3.1 一般提取方法
一般提取方法包括减小草药原料的尺寸，接着以适当的溶剂回流提取。尺寸上的减小可 通过粉碎这些原料达到。
然后通过减压蒸发以浓缩或干燥提取物。为了获得药效最佳的提取物的制备方法，本发 明对水、乙醇和超临界二氧化碳提取方法进行了组合。在制备过程中的任何一点、任何步骤 的中间产物均可采用浓缩、澄清或纯化步骤。其后，部分提取物做了进一步纯化和试验，以 便改善其药效。以下介绍已经尝试过的方法。
2.3.2 具体提取方法
方法A—制备混合物A
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉。青风藤、制附子和白芍加水(草药 的6倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。水提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa) 浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物A1。牡丹皮和姜黄采用超临界流体萃取(SFE)技术以超临 界二氧化碳(21.7L/h)萃取，分别得提取物A2和A3。将提取物A1、A2和A3混合均匀得混 合物A。
方法B—制备混合物B
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉。青风藤、制附子和白芍加80％乙 醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃， 0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物B1。牡丹皮和姜黄采用SFE以超临界二氧化碳 (21.7L/h)萃取，分别得提取物B2和B3。将提取物B1、B2和B3混合均匀得混合物B。 方法C—制备混合物C
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉。青风藤、制附子和白芍加水(草药 的6倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。水提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa) 浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物C1。牡丹皮采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提 取物C2，牡丹皮在SFE之后的残渣以80％乙醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1 小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物 C3。姜黄采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物C4，姜黄在SFE之后的残渣以 80％乙醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减 压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物C5。将提取物C1、C2、C3、C4和C5 混合均匀得混合物C。
方法D—制备混合物D
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉。青风藤、制附子和白芍加80％乙 醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃， 0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物D1。牡丹皮采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h) 萃取得提取物D2，牡丹皮在SFE之后的残渣以80％乙醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次， 每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得 提取物D3。姜黄采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物D4，姜黄在SFE之后的 残渣以80％乙醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤， 再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物D5。将D1、D2、D3、D4和D5混 合均匀得混合物D。
方法E—制备混合物E
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉。青风藤以0.1％盐酸溶液(pH2.0， 草药的6倍量，w/w)浸泡提取(室温)3次，每次12小时。盐酸提取液经混合、过滤，以1％氢 氧化钠溶液调节至pH6.0，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物E1。牡 丹皮和姜黄采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取分别得提取物E2和E3。制附子、白芍 和牡丹皮在SFE之后的残渣加80％乙醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。 乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物E4。姜 黄在SFE之后的残渣以10％氢氧化钠溶液(pH10.0，草药的6倍量，w/w)浸泡提取3次，每 次1小时。提取液经混合、过滤，以1％盐酸溶液调节至pH4.0，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩 至100％(w/v)浓度，得提取物E5。将E1、E2、E3、E4和E5混合均匀得混合物E。
方法F—制备混合物F
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉，加水(草药的6倍量，w/w)回流提 取3次，每次1小时，水提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓 度，得提取物F，为五种草药的水提取物。
方法G—制备混合物G
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉，加80％乙醇(草药的4倍量，w/w) 回流提取3次，每次1小时，乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％ (w/v)浓度，得提取物G，为五种草药的乙醇提取物。
2.3.3 纯化方法
上述各种可行方法中任何一种的制剂提取物可进一步纯化。一种增加期望的纯度的方法 是使提取物经受一种或多种分离技术，通过减少不需要的组分，从而增加提取物中所需组分 的相对丰度。
一项优选的分离技术是使用聚合吸附树脂，它在一定条件下优先结合想要保留的组分但 不结合不需要保留的组分。其后，改变这些条件(例如pH、洗脱剂极性)以释放结合组分。
2.3.4 包囊方法
以下这些常规步骤教导本发明的提取物如何包装成适于口服给药的胶囊。首先将提取物 制成干粉，接着用于填充胶囊壳。另一方法是在填充胶囊壳之前，将提取物和适当的赋形剂 混匀。
2.3.5 第一实施例
本发明的第一实施例采用方法D得到提取物，接着通过纯化方法实施例以说明如何实施 本发明。
第一实践的配方包括以下重量比的草药：青风藤5份，制附子3份，白芍6份，牡丹皮 3份和姜黄3份。
以下步骤用于第一实践的配方比例提取物的制备。
五种干燥草药分别粉碎成粗粉。青风藤62.5g，制附子37.5g，和白芍75g粉碎并加上80％ 乙醇1250ml回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合和过滤，再减压(70℃，0.08Mpa) 浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物1约175ml(即，在175ml最终体积的提取物1中提取总计 175g的草药)。
牡丹皮37.5g采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物2约0.8g。SFE之后的 残渣以80％乙醇187.5ml回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃， 0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物提取物3约37.5ml。
姜黄37.5g采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物4约2.8ml。SFE之后的残 渣以80％乙醇187.5ml回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃， 0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物5约37.5ml。
将提取物1、3和5混合，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至近干燥，残渣溶于40ml的80％ 乙醇，将该乙醇溶液在Amberlite XAD-7HP聚合树脂(Rohm和Haas公司，USA.)柱(100×5cm， 树脂高度65cm)上样。该柱事先已采用蒸馏水5000ml、95％乙醇2000ml和蒸馏水2000ml顺 次冲洗预处理。上样后以5％乙醇1900ml、40％乙醇3000ml和80％乙醇3000ml顺次洗脱。 收集40％乙醇和80％乙醇的洗出液，混合，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至500ml体积，随后 进一步冻干得到纯化提取物13.1g。将纯化部分提取物(13.1g)、提取物2(0.9g)和提取物4(2.67ml) 混匀得混合物约16.1g。由于该混合物是通过对方法D得到的提取物进行纯化后得到，因而 这种混合物称为混合物Dp，这个名称在说明书的其它章节含义相同。
2.3.6 第二实施例
本发明的第二实施例说明制剂如何进一步加工成适于口服给药形式的实例，这个过程是 说明如何在述提取步骤后，加入适当的赋形剂以制成胶囊。
第二实践的配方包括以下重量比的草药：青风藤4份，制附子3份，白芍5份，牡丹皮 3份和姜黄2份。以下步骤用于第二实践的配方比例的提取物的制备。
五种干燥草药分别粉碎成粗粉。
青风藤720g以水5760ml浸泡0.5小时，回流提取3次，每次1.5小时，水提取液经混合、 过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.10～1.11(70℃)的浓缩液。待浓缩液冷至室 温后，加入鸡蛋清7.2g，混合均匀，再煮沸混合物以澄清青风藤浓缩提取液，随后离心过滤， 滤出的上清液经减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.13～1.15(70℃)，随后在连续搅拌的 情况下于浓缩液中再入乙醇至含醇量达63％(以体积计)，室温放置24小时，过滤，滤液再减 压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.13～1.15(70℃)，加入β-环糊精12.6g并调节相对密度调 节至1.10～1.11(70℃)，喷雾干燥(入口温度140℃，出口温度100℃)，得提取物1约65.7g。
制附子540g和白芍900g混合以80％乙醇7200ml浸泡0.5小时，回流提取3次，每次1.5 小时，醇提取液经合并、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.13～1.15(70℃)。 调节相对密度至1.10～1.11(70℃)，喷雾干燥(入口温度140℃，出口温度100℃)，得提取物2 约175.1g。
牡丹皮粗粉520g采用SFE以超临界二氧化碳(250L/h)萃取，得提取物3约11.6g。SFE 之后的残渣以80％乙醇2600ml浸泡0.5小时，回流提取3次，每次1小时。醇提取液经合并、 过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.09～1.11(70℃)，。待浓缩液冷至室温后， 加入鸡蛋清3.9g，混合均匀，再煮沸混合物以澄清牡丹皮浓缩提取液，随后离心过滤，滤出 的上清液经减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.13～1.15(70℃)，加入β-环糊精9.5g并调 节相对密度为1.10～1.11(70℃)，喷雾干燥，得提取物4约49.1g。
姜黄粗粉360g采用SFE以超临界二氧化碳(250L/h)萃取，得提取物5约26.7ml。SFE之 后的残渣以80％乙醇2160ml浸泡0.5小时，回流提取3次，每次1小时。醇提取液经合并、 过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.20(70℃)，加入淀粉18.0g，真空干燥(70℃， 0.09Mpa)，粉碎，得提取物6约37.3g。
将提取物3(11.6g)与β-环糊精100g混合均匀，再与提取物5(26.7ml)混合均均，随后依次 加入提取物1(65.7g)、提取物2(175.1g)、提取物4(49.1g)、提取物6(37.3g)和羧甲基淀粉钠15.3g， 用适量淀粉调节药粉总量至500g，混合均匀，干压制粒，于颗粒加入羧甲基淀粉钠8.5g和硬 脂酸镁1.5g，混合均匀，将0号胶囊，每粒胶囊调重至0.51g。
此项实践下得到的提取物用于以下质量控制节描述的分析实验。
2.4 方法A-G的比较
从上述方法A-G中确定最优提取方法的指标为已知活性成分的提取量和药理作用强度。
各种方法得到的提取物中已知主要活性成分的定量通过高效液相色谱(HPLC)测定。本发 明中使用的草药的已知活性成分分包括青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素。
用于含量测定的化学对照品为青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素，均购自中华人民共和 国国家药品生物制品检定所。去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素为自行制备并经检定。乙 腈、乙酸和三乙胺(HPLC级)购自Merck(Darmstadt，德国)。
HPLC系统为Agilent quaternary HPLC model HP1100系列(Hewlett-Packard，Palo Alto， CA)，配备有Altima C18柱(250×4.5mm，5μm)和DAD检测器。Swinnex型微孔过滤器(孔径 ＝0.45μm)购自Millipore(Millipore，香港)。
标准溶液的配制：准确称量青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素，于甲醇中溶解得每个化 合物浓度为0.2～0.5mg/ml的溶液。
样品溶液制备：干燥提取物0.1g置锥形瓶内，加甲醇20ml，精确称重，超声处理20 分钟，冷却，再称重，用甲醇补足重量，剧烈振摇，滤过(0.45μm)，得样品溶液。
色谱条件：流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，使用之前经0.45μm微孔过滤器过滤和 脱气，采用梯度洗脱，乙腈在0、30、40和50分钟的比例分别是10％、90％、10％和10％。 流速为0.8ml/分钟，在恒温条件下(25±0.1℃)分别于波长262nm、230nm、270nm和430nm进 行青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素的检测。
对混合物Dp测定的色谱图见图1-3。图1A和lB分别表示青藤碱对照品和混合物Dp内 青藤碱的HPLC色谱图；图2A和2B分别表示芍药苷对照品和混合物Dp内芍药苷的HPLC 色谱图，而图3A和3B分别表示姜黄素对照品和混合物Dp内姜黄素的HPLC色谱图。
2.5质量控制标准
为了质量控制，以下测定实验用于检测制剂内某些标志物或主要活性成分的存在(青藤碱， 芍药苷，丹皮酚，姜黄素，次乌头碱，乌头碱，中乌头碱和次乌头碱)。这些试验应用于通过以 上包囊方法得到的包装成胶囊形式的制剂的同时，它们还可应用于方法A-G生产的提取物和 混合物Dp。
通过利用以下测定实验的组合，可以进行本发明组合的植物原料的检验。
2.5.1 分析1：青风藤的鉴别
取第二实例下胶囊内容物0.25g，研细，加乙醇10ml，密塞，超声处理(270W，25kHz) 30分钟，滤过，滤液吹干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取青风藤对照药材 0.3g，同法制成对照药材溶液。再取青藤碱对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作 为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各 5μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲醇-三乙胺(7:2:0.5:0.5)为展开 剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液。供试品色谱中，分别在与对照品和对照药 材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱图见图4。结果显示提取物中含有活性成分/ 标志物青藤碱。
2.5.2 分析2：白芍的鉴别
取分析1项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取白芍对照药材0.4g，同法制成对照药 材溶液。再取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色 谱法(《中国药典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 香草醛浓硫酸试液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，分别在与对照品和对照药材 色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱图见图5。结果显示提取物中含有活性成分/标 志物芍药苷。
2.5.3 分析3：制附子的鉴别
取第二实例下胶囊内容物1g，研细，加0.05M的盐酸溶液10ml，密塞，超声(270W， 25kHz)30分钟，旋涡振荡2分钟后，以醋酸乙酯旋涡振荡提取3次，每次10ml，弃去醋酸 乙酯层。酸水溶液再以氯仿提取三次，每次10ml，合并氯仿提取液，空气吹干。残渣加乙醇 1ml使溶解，作为供试品溶液。另取附子对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液。再取次乌 头碱对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药 典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上， 以甲苯-醋酸乙酯-三乙胺(8:4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化鉍钾试液。 供试品色谱中，分别在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱图 见图6。结果显示提取物中含有活性成分/标志物次乌头碱。
2.5.4 分析4：牡丹皮的鉴别
取分析1项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取牡丹皮对照药材0.2g，同法制成对照 药材溶液。再取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层 色谱法(《中国药典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点样于同一 硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯-甲酸(10:2.5:0.05)为展开剂，展开，取出，晾干，喷 以三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，分别在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相 同颜色的斑点。色谱图见图7。结果显示提取物中含有活性成分/标志物丹皮酚。
2.5.5 分析5：姜黄的鉴别
取分析1项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取姜黄对照药材0.15g，同法制成对照药 材溶液。再取姜黄素对照品，加乙醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层 色谱法(《中国药典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点样于同一 硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸(96:4:0.7)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯 (365nm)下检视。供试品色谱中，分别在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色 的荧光斑点。色谱图见图8。结果显示提取物中含有活性成分/标志物姜黄素。
2.5.6 分析6：乌头类生物碱的限量
取第二实例下胶囊内容物0.4g，精密称定，置于50ml离心管中，加入0.05M盐酸溶液 10ml，超声处理(270W，25kHz)40分钟，旋涡振荡2分钟后，以醋酸乙酯旋涡振荡提取2 分钟，每次10ml，重复3次，弃去醋酸乙酯层。酸水溶液再以氯仿旋涡振荡提取2分钟，每 次10ml，重复3次，离心分层(3000转每分钟，5分钟)，合并提取液，挥干。残渣加0.01M 盐酸溶液超声使溶解，旋涡振荡2分钟，定容至1.0ml，滤过(0.45μm滤膜)，取续滤液， 作为供试品溶液。另取乌头碱对照品，加0.01M的盐酸溶液制成每1ml含0.05mg的溶液， 作为对照品溶液。照高效液相色谱法(《中国药典》2000版一部附录VI D)试验。以十八烷 基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-缓冲液(10mM碳酸铵溶液，加氨水调节pH至9.8)为流动 相，采用梯度洗脱(0时乙腈比例为20％，10分钟时乙腈比例线性上升到30％，20分钟时乙 腈比例线性上升到32％，50分钟时乙腈比例线性上升到35％，75分钟时乙腈比例线性上升 到44％，80分钟时乙腈比例线性上升到80％)；检测波长为240nm。理论板数按乌头碱的色 谱峰计算应不低于2500，与杂质的分离度应大于1.5。精密吸取对照液与供试液各50μl，分 别注入液相色谱仪，测定，即得。供试品色谱中，乌头碱、中乌头碱及次乌头碱的峰面积总 和应小于对照品色谱图中乌头碱的峰面积，即每1.0g组合物(约等于两个胶囊内的量)中含有 的乌头生物碱(包括中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)的峰面积不应大于50μg乌头碱(基于中乌 头碱、次乌头碱和乌头碱具有相同的吸光度)的峰面积。色谱图见图9。图9A为不含制附子 的组合物的HPLC色谱图，而图9B和9C分别表示乌头碱、中乌头碱和次乌头碱对照品和组 合物内乌头碱、中乌头碱和次乌头碱的HPLC色谱图。
2.5.7 分析7：青藤碱、芍药苷、丹皮酚、姜黄素的定量
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-缓冲液(0.1％磷 酸-0.2％三乙胺，pH3.5)为流动相，采用梯度洗脱：0时乙腈比例为8％，25分钟时乙腈比例 线性上升到20％，30分钟时乙腈比例线性上升到40％，55分钟时乙腈比例线性上升到70％； 检测波长分别为240nm(芍药苷)，262nm(青藤碱)，270nm(丹皮酚)及420nm(姜黄素)。 理论板数按丹皮酚色谱峰计算应不低于2500。青藤碱，丹皮酚，芍药苷及姜黄素与杂质的分 离度应分别大于1.5。
对照品溶液的制备精密称取青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素适量，加50％乙醇溶解， 制成每1ml含青藤碱约35μg，含芍药苷约160μg，含丹皮酚约110μg，含姜黄素约40μg的混 合对照溶液，即得。
供试品溶液的制备取装量差异项下内容物0.15g，精密称定，置25ml量瓶，加50％乙 醇20ml，超声处理(270W，25kHz)30分钟后，以50％乙醇定容至刻度，摇匀，静置，滤 过(0.45μm滤膜)，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5.0μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
每1.0g组合物(约等于两个胶囊内的量)中含有的青藤碱、芍药苷、丹皮酚、姜黄素的量 分别不应少于5.0μg，23.0μg，9.0μg和4.0μg。色谱图分别见图10-13。图10A表示不含青风藤 的组合物的HPLC色谱图，而图10B和10C分别表示青藤碱对照品和组合物内青藤碱的HPLC 色谱图。图11A表示不含白芍的组合物的HPLC色谱图，而图11B和11C分别表示芍药苷对 照品和组合物内芍药苷的HPLC色谱图。图12A表示不含牡丹皮的组合物的HPLC色谱图， 而图12B和12C分别表示丹皮酚对照品和组合物内丹皮酚的HPLC色谱图。图13A表示不含 姜黄的组合物的HPLC色谱图，而图13B和13C分别表示姜黄素对照品和组合物内姜黄素的 HPLC色谱图。
2.5.8 分析8：次乌头碱的定量
本测定使用分析6中的色谱法和制备的样品溶液。
对照品溶液精密称乌头碱适量，以0.01M的盐酸溶液溶解，稀释制成每1ml中约含 0.005mg的溶液作为对照品溶液。
每1.0g组合物(约等于两个胶囊内的量)中含有的次乌头碱的量不应少于7μg。色谱图见 图9。
从各色谱图结果可见，以上色谱分析技术适宜用于本发明制剂的质量控制。制剂的质量 通过对主要标志性或主要活性化学成分的鉴别和测定而确定。
如果配方不完整或者提取方法不正确，会导致上述分析方法的结果异常，出现需鉴别成 分的缺失或含量不合要求，这些情况下的制剂的质量均不合格，不可接受。
2.6 动物
啮齿动物(大鼠和小鼠)购自香港中文大学实验室动物服务中心和香港大学实验室动物服 务中心。动物放在不同的笼内(小鼠每笼15只动物和大鼠每笼5只)，并在实验之前适应至少 一周。自由摄取食物和饮水，但在每个具体实验之前特定的禁食期除外。动物实验室配备自 动温度(22±1℃)和照明控制(12小时光照/12小时黑暗)。
所有动物实验的步骤及动物饲养管理均得到香港浸会大学的人体及动物实验管理委员会 (HASC)和HKSAR卫生署的批准，并且遵照美国国家卫生研究院的《实验动物管理及使用 手册》的制度准则进行。
2.7 药物给药
给药前，所有草药提取物均制备成由10％花生油、10％吐温-80和80％的提取物组成的乳 剂，均采用口服给药。剂量均表示为草药重量(g)/体重(kg)。对照组动物给予由10％花生油、 10％吐温-80和80％水组成的空白乳剂。在进行药液稀释以及配制阳性对照药时，均使用空白 乳剂为溶媒。
2.8 急性炎症模型
采用角叉菜胶或者鸡蛋清诱导的急性炎症模型研究本发明以上提取物的抗炎作用。
大鼠在左后足接受跖底注射角叉菜胶(0.1ml，1％，0.85％盐水配制；SigmaChemical Co.，St Louis，MO，USA)或鸡蛋清(0.1ml，10％，0.85％盐水配制)。
动物在实验之前禁食24小时，在注射角叉菜胶1小时之前和24小时之后，或者注射鸡 蛋清3小时之前，各提取物分别灌胃给予动物，剂量见结果部分各表所示。药物以交错方式 给予动物以使每个动物之间间隔时间一致。阳性对照组动物给予消炎痛。
足肿胀实验的评估
采用足体积测量器(Plethysmometer 7150，Ugo Basile，意大利)测量每个动物足肿胀体积 (按ml)，精确度至小数点后两位。在角叉菜胶注射之前和之后2、4、6、24小时，或者鸡蛋 清注射之后1、2、3和4小时进行测量。爪的肿胀率是足体积百分比差异并由以下公式计算： 肿胀率(％)＝(A-B)×100/B，这里A表示注射后不同时间点的足体积，B表示注射之前的足体积。
结果表示为平均值+SD。数据分析采用方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD法(方差 相等)或Tamhane’s T2法(方差不等)，p<0.05为具有显著性意义。
2.9 镇痛实验
采用大鼠甩尾实验和小鼠扭体实验研究本发明以上提取物的镇痛作用。
2.9.1 甩尾实验
甩尾实验是急性疼痛的模型。此实验中，通过测定辐射热源直接作用于动物尾部产生刺 激作为开始，到动物弹开其尾巴以避开辐射热源作为结束间的时间测量潜伏期。正式实验， 需对动物进行筛选，对于体重为180g至220g的Spague-Dawley大鼠，如果反应潜伏期小于2 秒或超过6秒则应排除在实验之外。
实验之前动物禁食24小时，各提取物分别于实验前1小时灌胃给予动物，剂量见结果部 分各表所示。药物以交错方式给予动物以使每个动物之间间隔时间一致。
实验开始时，将每只大鼠轻轻放入仪器(IITC model 336甩尾痛觉测试计，IITC Inc.， Woodland Hills，California，U.S.A)的固定器内，再将动物的尾巴置于于尾槽内。启动光源以施 加辐射热至尾巴上由末梢起1/3长度处，引起甩尾反应。记录由启动光源至动物弹开其尾巴 以避开光源的时间，作为反应的潜伏期。实验同时设定截止时间，通常为12秒至15秒，如 果到达截止时间，动物仍未有反应，则以截止时间为潜伏期。截止时间的设定有助于防止动 物尾部长时间间暴露于辐射热下可能引起的组织损伤。
甩尾试验的评估
在药物给药后1、2和3小时测量甩尾反应。结果表示为平均值±SD。数据分析采用方差 分析(ANOVA)，两两比较采用LSD法(方差相等)或Tamhane’s T2法(方差不等)，p<0.05为具 有显著性意义。
2.9.2 扭体实验
扭体实验中，通过于小鼠的腹膜内腔内注射乙酸诱导急性炎症疼痛，其特征在于经后肢 牵张腹部肌肉系统的收缩波，这种活动称之为扭动反应。扭体发作的次数的多少可反映动物 对乙酸引起疼痛的反应强弱。扭体实验灵敏度较高，可用于评价非甾体抗炎药的止痛活性。
ICR小鼠雌雄各半，体重18g至25g，实验之前禁食24小时。
各提取物分别于乙酸注射前1或2小时灌胃给予动物，剂量见结果部分各表所示。药物 以交错方式给予动物以使每个动物之间间隔时间一致。随后动物被放入单独的10×15cm树脂 玻璃观察室10分钟以上以适应环境。实验时，于小腹腹腔注射用0.85％生理盐水配制的0.8％ 乙酸溶液0.1ml，注射完成后将各动物放回观察室。
2.9.3 扭体实验的评估
观察动物在注射乙酸后特定时间内(15或20分钟)扭体反应发作的次数。结果表示为平均 值±SD。数据分析采用方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD法(方差相等)或Tamhane’s T2 法(方差不等)，p<0.05为具有显著性意义。
2.10 实验性关节炎
佐剂性关节炎(AA)和II型胶原性关节炎(CIA)均是广泛使用的实验性关节炎模型，对于 研究风湿性关节炎的发病机理以及研究和开发抗关节炎药物有重要意义。
2.10.1 佐剂性关节炎
佐剂性关节炎是最经典的动物关节炎模型，它不仅广泛地用于炎症和自身免疫疾病的病 因、病理的研究，而且也大量地用于抗风湿药物的临床前研究。
结核杆菌悬浮液的制备和AA的诱导
热灭活的结核杆菌H37Ra购自Difco，Detroit，Michigan，U.S.A；矿物油购自Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，Montana，U.S.A。将热灭活的结核杆菌和矿物油在玻璃研钵里研磨，得到 0.625mg/ml的结核杆菌悬浮液。在体重为100g至130g的雄性Sprague-Dawley大鼠的尾基部 皮下注射0.10ml的悬浮液以诱导关节炎。大鼠(每组7～12只)在免疫之后开始每天口服各提取 物，以空白乳剂作阴性对照。
佐剂性关节炎的评估
从第9日开始，每天进行关节炎指数评估，每隔一天测定体重和双后足体积。关节炎指 数按照每足的红斑和关节软组组织肿胀程度评为0至4级，分别评0至4分，每只动物最大 关节炎指数为16分。后足体积采用足体积测量器(Plethysmometer 7150，Ugo Basile，意大利) 测量。结果表示为两只后足的平均体积。体重以0.1g精密度天平(Sartorius，Germany)测定。
结果表示为平均值+SD。数据分析采用SAS8.0软件的广义线性模型的重复测量，两两比 较采用SNK法(Student Newman-Keuls)，p<0.05为具有显著性意义。
2.10.2 II型胶原诱导的关节炎
II型胶原诱导的关节炎(CIA)是自身免疫性疾病的实验模型，它可通过以II型胶原免疫在 啮齿动物的易感种(大鼠和小鼠)中引起。这种模型和人类疾病有相似似处，包括疾病与组织 相容基因位点中基因的连锁，单核细胞浸润，血管翳形成，纤维蛋清沉积，软骨和骨破坏， 以及自身反应性T和B细胞。CIA模型已经成为评价关节炎治疗药物的工业标准。免疫之后， 这些动物产生自体免疫调节的多发性关节炎，它和人自身免疫性疾病风湿性关节炎共有几个 临床、组织学和免疫学特征。由于CIA和风湿性关节炎之间的重要相似，此实验模型已经是 用于研发抗炎药物的常规模型。
II型胶原(CII)的制备和关节炎的诱导
牛II型胶原的0.05M乙酸溶液(批号：082503)和弗氏不完全佐剂(批号：091003)均购自 Chondrex，LLC.Washington，U.S.A。将II型胶原与等体积的弗氏不完全佐剂(IFA)于匀浆机内 (IKA-WERKE Gmbh & Co.KG，德国)在冰浴中匀浆30秒，形成乳液。冰水浴可防止II型胶 原在匀浆期间的变性，变性的胶原不能诱导CIA的产生。
在体重为200g至380g的雌性Wistar大鼠尾基部的两个部位皮内注射0.10ml乳液(每个 部位0.05ml)。首次免疫的第7日进行同样的注射以加强免疫。从关节炎诱导当日(0日)直到 30日，动物每天口服给予提取物或消炎痛(阳性对照)(每组n＝5-6)。阴性对照组仅给予空白 乳乳液。
II型胶原诱导的关节炎的评估
从第9日开始，每天进行关节炎指数评估，每三天测定一次体重和双后足体积。关节炎 指数按照每足的红斑和关节软组组织肿胀程度评为0至4级，分别评0至4分，每只动物最 大关节炎指数为16分。后足体积采用足体积测量器(Plethysmometer7150，Ugo Basile，意大利) 测量。结果表示为两只后足的平均体积。体重以0.1g精密度天平(Sartorius，Germany)测定。
结果表示为平均值±SD。数据分析采用SAS8.0软件的广义线性模型的重复测量，两两比 较采用SNK法(Student Newman-Keuls)，p<0.05为具有显著性意义。
2.11 毒性
毒性研究包括两个内容：1)混合物D、Dp和胶囊的最大耐受剂量(MTD)；2)胶囊 的亚慢性毒性。
2.11.1 最大耐受剂量(MTD)
小鼠
ICR小鼠，雌雄各半，体重18g-26g，自由摄取食物和饮水，但在实验之前禁食16小时。 两组小鼠以交错方式给予混合物D和Dp。在0日至6日和13日观察小鼠的死亡率、毒性反 应和全身症状。
大鼠
SD大鼠，雌雄各半，体重110～140g，自由摄取食物和饮水，但在实验之前禁食16小时。 两组SD大鼠以交错方式给予胶囊和载体(0.3％羧甲基纤维素钠)。在0日至13日之间观察大 鼠的死亡率、毒性反应和全身症状。
2.11.2 亚慢性毒性
亚慢性毒性实验通常指持续给药1至2月以上观察毒性反应的研究，该时间接近实验大 鼠寿命的5％。进行亚慢性毒性实验可观察药物的毒性反应，并研究安全系数。并且设计这种 亚慢性研究以阐明异生物质，即中药制剂，对结构和功能实体的无数毒性作用的任何一种。
SD大鼠，雌雄各半，体重90～110g，自由摄取食物和饮水。三组SD大鼠(每组3只大鼠) 通过以交错方式给予51.0g/kg和76.5g/kg剂量的胶囊，或者载体(0.3％0.3％羧甲基纤维素钠)。 动物每周给药6日，每天一次。每天观察大鼠的死亡率、毒性反应。根据每周的体重计算给 药体积。
3 结果
3.1 最优提取方法的确定
通过测量其抗炎(鸡蛋清诱导的足肿胀)和镇育作用(表1-3)的实验，以及主要化学成分的 提取率(表4)，评估按照上述不同方法，即方法A-G的七种提取物的效果。
3.1.1足肿胀实验
表1 大鼠足肿胀实验中提取物抗炎作用的比较(N＝6)
注意*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组在同一时间点比较。#：P<0.05，##： P<0.01与混合物D组在同一时间点比较。
3.1.2甩尾实验
表2 大鼠甩尾实验中提取物镇痛作用的比较
注意*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组在同一时间点比较。#：P<0.05，##： P<0.01与混合物D组在同一时间点比较。
3.1.3扭体实验
表3 小鼠扭体实验中提取物镇痛作用的比较
注意*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组在同一时间点比较。#：P<0.05，##： P<0.01与混合物D组在同一时间点比较。
3.1.4各种方法的提取率
表4 各种提取方法中主要活性成分的提取率(％，N＝2)
实验结果显示，对于由注射鸡蛋清引起的大鼠急性炎症，混合物D具有最有效的抗炎作 用(表1)。对于由腹膜内乙酸注射诱导的小鼠急性疼痛反应，混合物D还显示较强的镇痛作用 (表3)。然而，对于由辐射刺激诱导的大鼠急性疼痛反应，混合物B产生最强的镇痛作用(表 2)。
与其它提取方法相比，目标活性成分，如青藤碱、芍药苷、芍药酚、姜黄素、去甲氧基 姜黄素和双去甲氧基姜黄素的提取在采用方法D时较高(表4)。因而，选择方法D得到的混 合物D用于纯化并进行随后的实验。虽然其它混合物不如混合物D一样有效，但本发明中涉 及的其它方法得到的混合物也同样显示了生物活性作用，因此也保留在本发明的范围之内。
3.2 混合物D和Dp之间的比较
混合物D和Dp的比较包括两者的收率、主要活性成分的回收率、抗炎镇痛活性及毒性 的。
3.2.1 混合物D和Dp收率的比较
测量得自方法D和Dp的提取物的重量，收率为所得提取物与原料的重量比。混合物D 和Dp的提取物1、3和5的收率分别是12.50％和5.25％(表5)。纯化率定义为混合物Dp收 率和混合物D收率之间的差相对于混合物D收率的比。纯化率显示Dp纯化方法所除去物质 的相对量。
表5 混合物D和混合物Dp的收率(N＝2)
3.2.2 活性成分回收率的比较
混合物D和Dp中青藤碱、芍药苷和姜黄素的含量采用高效液相色谱(HPLC)测定。经纯 化之后，混合物Dp保留了混合物D内85.11％的青藤碱，99.11％的芍药苷和74.22％的姜黄 素。
表6 选定的生活物性组分的回收率
3.2.3 混合物D和Dp对角叉菜胶引起的急性炎症作用的比较
阳性对照药消炎痛在给药7小时内均抑制足肿胀，但在角叉菜胶刺激后24小时未观察到 这种作用。混合物D(15.36g/kg)和Dp(0.96g/kg和15.36g/kg)在药物给药之后25小时内均产 生显著的抗炎作用。混合物D在0.96g/kg剂量条件下于给药后7小时和25小时产生显著的 抗炎作用。混合物D在15.36g/kg剂量条件下，混合物Dp在0.96g/kg和15.36g/kg剂量条件 下于给药后的3小时、5小时、7小时和25小时都显著的抗炎作用(表7)。其作用均有明显的 量效和时效关系。
表7 混合物D和Dp对由角叉菜胶引起的大鼠足肿胀的作用
注意：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，与对照组在同一时间点比较。
3.2.4 鸡蛋清诱导的大鼠足肿胀实验中混合物D和Dp抗炎作用比较
混合物D和Dp在药物给药后4小时都产生显著的抗炎作用，其作用均有明显的时效关 系。(表8)
表8 混合物D和Dp对鸡蛋清引起的足肿胀的作用
注意：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，与对照组在同一时间点比较；#，P<0.05，与混 合物Dp组在同一时间点比较。
3.2.5 辐射热刺激诱导的大鼠甩尾反应中混合物D和Dp镇痛作用的比较
给药之后1小时混合物D和Dp都显著延长了大鼠对辐射刺激的潜伏期。给药后2小时 混合物Dp仍然显著延长了潜伏期(表9)。其作用均有明显的时效关系。
表9 混合物D和Dp对大鼠关于辐射热刺激潜伏期的作用
注意：*，P<0.05，**，P<0.01与对照组在同一时间点比较。
3.2.6 由乙酸注射诱导的扭体实验
给药后两小时，混合物D和Dp对乙酸诱导的小鼠扭体活性都具有显著的抑制作用。(表 10)
表10 混合物D和Dp对小鼠扭体发作次数的作用
注意：*，P<0.05，**，P<0.01与对照组比较。
3.2.7 急性毒性
死亡率
以动物死亡数量/使用动物数量*100计算死亡率。给予混合物D和Dp的小鼠的死亡率分 别是65.2％和10.5％(表11)。在混合物D和Dp药物给药之后，第一例死亡分别发生在0.62 小时和0.46小时。
表11 ICR小鼠在接受混合物D或混合物Dp之后的死亡率
体重
单次给药后观察13日，给予混合物D和Dp且未死亡的ICR小鼠的体重在给药之后均保 持增加。在第13日，给予混合物D和Dp的动物的体重增加百分率分别是19.47％和32.30％(表 12)。
表12 ICR小鼠接受混合物D或混合物Dp之后体重增加
急性毒性：全身症状
死亡小鼠在死亡前均表现出昏迷并伴随阵挛性和强直性惊厥。此外，死亡之前还可看见 镇静、困难呼吸和鼻子肿大等现象。
存活的小鼠中，给予混合物D的小鼠分别只有13.0％和60.9％的动物出现粪便和毛发轻 度变差。给予混合物Dp的小鼠分别有38.9％和11.1％的动物出现粪便和毛发轻度变差，这些 情况保持1-2天。
3.3 混合物Dp的药理活性
3.3.1 混合物Dp对实验性关节炎的影响
胶原诱导的关节炎(CIA)
CII/IFA免疫之后，阴性对照组的所有动物在13日至16日间开始出现关节炎症状(图14)。 在18日时关节炎指数到达最高点，19日至23日稍有变化(图14A)，接着保持稳定至实验结 束，而后足体积至27日才达到坪值(图14B)。疾病动物的体重也显著减少(图14C)。与此相 反，每天口服给予23.08g草药/kg的混合物Dp则显著抑制了关节炎的发生与发展(图16A和 B)。与对照组相比，混合物Dp显著抑制II型胶原诱导的足体积增加(图14B)、逆转关节炎指 数发展的趋势(图14A)。混合物Dp还影响CIA大鼠的体重(图14C)。
3.3.2 混合物Dp对急性炎症模型的影响
混合物Dp对角叉菜胶引起的大鼠足肿胀模型的抑制作用
角叉菜胶跖底注射诱导的大鼠足肿胀持续至少24小时，峰值时间是注射后6小时。阳性 对照药物消炎痛在给药后7小时内抑制肿胀，在刺激24小时则观察不到这种作用。混合物 Dp在0.96g/kg和15.38g/kg剂量条件下给药之后25小时产生显著的抗炎作用。该作用有明显 的量效和时效关系。(表13)
表13 混合物Dp对角叉菜胶引起的大鼠足肿胀模型的作用
注意：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，与对照组在同一时间点比较
混合物Dp对鸡蛋清引起的大鼠足肿胀模型的抑制作用
鸡蛋清跖底注射诱导的大鼠足肿胀持续约4小时，峰值时间是注射后1小时。
混合物Dp以0.24g/kg、0.96g/kg和15.36g/kg剂量条件下给药后6小时产生显著抗炎作 用。但在3.85g/kg剂量条件下尽管观察到肿胀减小的趋势，但无显著的抗炎作用。该作用有 明显的量效和时效关系。(表14)
表14 混合物Dp对鸡蛋清引起的大鼠足肿胀模型的抑制作用
注意：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，与对照组在同一时间点比较
3.3.3 混合物Dp的镇痛作用
甩尾实验
混合物Dp在7.69和30.77g/kg剂量条件下给药后1小时显著延长大鼠对辐射热刺激的潜 伏期。此外，30.77g/kg混合物Dp在药物给药后2和3小时还显著延长对辐射热的潜伏期。 但是在1.92g/kg尽管观察到增加潜伏期的趋势，但无显著的镇痛作用。该作用有明显的量效 和时效关系。(表15)
表15 混合物Dp对大鼠关于辐射热刺激潜伏期的作用
注意：*，P<0.05，**，P<0.01与对照组在同一时间点比较
扭体实验
混合物Dp以15.38g/kg和30.77g/kg给药后两小时，两个剂量都引起对乙酸诱导的小鼠 扭体反应的显著抑制。该作用有明显的量效关系。(表16)
表16 混合物Dp对小鼠扭体发作次数的作用
注意：*，P<0.05，**，P<0.01与对照组比较。
3.4 第二实例下生产的胶囊的药理活性
3.4.1 胶囊对实验性关节炎的影响
佐剂性关节炎
佐剂免疫之后，阴性对照组动物于12日至21日间开始出现关节炎症状(图15)。与对照 组相比，胶囊显著抑制佐剂关节炎诱导的足体积增加(图15B)并逆转关节炎指数发展趋势(图 15A)。胶囊对AA大鼠体重无显著影响(图15C)。
II型胶原诱导的关节炎(CIA)
CII/IFA免疫之后，阴性对照组动物于13至16日间开始出现关节炎症状(图16)，在18 日关节炎指数到达峰值，19日至23日稍有变化(图16A)，接着保持稳定至实验结束，而后足 体积至27日才达到坪值(图16B)。疾病动物体重显著减少(图16C)。与此相反，每天口服给 予34.0g草药/kg的胶囊显著抑制关节炎的发展(图16A、B和C)。与对照组相比，胶囊显著 抑制II型胶原诱导的足体积增加(图16B)和逆转关节炎指数发展趋势(图16A)。胶囊还影响 CIA大鼠的体重(图16C)。
3.4.2 胶囊的镇痛作用
扭体实验
阳性对照药延胡索乙素以0.09g/kg和青藤碱以0.0375g/kg，以及胶囊以6.375g/kg、 12.750g/kg和25.50g/kg给药后一小时，所有试验药物均对乙酸诱导的小鼠扭体反应产生抑制。 与对照组相比，延胡索乙素、青藤碱和12.7g/kg和25.50g/kg的胶囊的抑制有显著性意义。胶 囊的该作用有明显的量效关系。(表17)
表17 胶囊对小鼠扭体发作次数的作用
注意：*，P<0.05，**，P<0.01与对照组比较。
3.4.3 胶囊的毒性
急性毒性
胶囊以294g草药/kg剂量单一给药后14日未发现死亡率。与对照组相比，动物体重增加 在第4和第7日有轻微减少(表18)，动物摄食量在第2和第5日有轻微降低(表19)。药物给 药后一周，这些症状均逐渐恢复正常。
表18 SD大鼠接受胶囊后体重增加(N＝10)
表19 SD大鼠接受胶囊后的摄食量(N＝10)
亚慢性毒性
以动物死亡数量/使用动物数量*100％计算死亡率。在药物以51.0和76.5g草药/kg剂量给 药之后，直至97日未发现死亡率。
给药97日，每组动物体重保持增加。在97日，0.3％CMC-Na溶液、51.0g草药/kg和76.5g 草药/kg的胶囊给药之后大鼠体重增加的百分比分别是183.7％、151.9％和154.8％(图17)。 全身症状
全身症状观察主要包括皮肤、毛皮、眼黏膜、循环系统、自主和中枢神经系统、体马达 (somatomotor)活性、行为中的任何变化。记录任何药物毒性症状例如震颤、抽搐、流涎、腹 泻、嗜睡、瞌睡、病态、成束、瞳孔放大、瞳孔缩小、粪便、排出物或张力减退。
在给予0.3％CMC-Na溶液的大鼠中未发现异常观察。在以51.0g草药/kg胶囊给药的大 鼠中，从20日至97日发现立毛现象，从30日开始发现具有轻微的湿粪便。对于以76.5g草 药/kg的胶囊给药的大鼠，从9日至97日均发现立毛和具有轻微的湿粪便。
4.讨论
4.1 七种方法的比较
通过生物活性和化学成分提取量上的比较，对提取工艺路线进行了筛选和优化。结果显 示在生物活性方面，包括对角叉菜胶诱导的足肿胀的急性抗炎作用，辐射热刺激诱导的大鼠 甩尾反应和腹膜内乙酸刺激诱导的小鼠扭体反应中的止痛作用，青藤碱、芍药苷、丹皮酚和 姜黄素、去甲氧基姜黄素及双去甲氧基姜黄素的主要活性化学成分提取量等方面，由方法D 生产的混合物D最佳。
因而，选择方法D得到的混合物D进行纯化并用于接下来的实验。尽管如此，其它方法 得到的混合物也具有药理作用，故也保留在本发明范围之内。
4.2 混合物Dp的纯化
纯化方法目的是由提取物中除去非活性物质，因此增加活性物质的相对丰度。
聚合吸附树脂是从草药提取物除去非活性物质的一种理想材料。在中药纯化方法越来越 多地采用这些树脂，这主要是因为于它们通常对糖苷、生物碱、黄酮和萜类具有选择吸附性 能，而这些成分多具有生物活性，并多被认为是中药的药效成分。Amberlite XAD-7HP是一 种具有中等极性的较理想的聚合吸附树脂，它可选择性地吸附中等极性的化合物，例如青藤 碱、芍药苷和本发明中的一些其它物质。
结果(表5)表明纯化率大约是60％，这显示混合物D内接近60％的物质已经Amberlite XAD-7HP树脂除去(以上3.2.1节给出了术语“纯化率”的定义)。虽然本发明中使用Amberlite XAD-7HP树脂，但本发明中草药混合物的进一步纯化并不限于使用这一种树脂。
主要化学成分回收率的比较(表6)和原始提取物(混合物D)及纯化物(混合物Dp)的主要药 理学活性和急性毒性上的比较(表7-10)证明这两种提取物在药理学上基本等效、在化学组成 上基本相似，同时，混合物Dp的急性毒性较低(表11)。
回收率结果表明经Amberlite XAD-7HP树脂纯化后，85.11％的青藤碱，99.11％的芍药苷 和74.22％姜黄素被保留在纯化后的提取物中(混合物Dp)(表6)。按照中国国家食品药品监 督管理局(SFDA)建议的标准，每种制剂方法中的回收率应不少于70％。我们的结果表明本发 明的主要成分的回收率高于70％，因此符合SFDA的标准。这也提示该纯化方法可能在很大 程度上保留了大多数活性成分。这是维持制剂本身的药理活性和临床作用最重要的一点。
至于抗炎活性，结果表7和8均表明混合物D和Dp具有相似作用。某些情形下，混合 物Dp甚至优于混合物D。例如，在角叉菜胶诱导的足肿胀实验中，药物以0.96g/kg的较低 剂量给药后3和5小时(表7)，以及鸡蛋清诱导的足肿胀实验药物给药后7小时(表8)，就可 以观察到这一点。至于镇痛活性，结果证明混合物D和Dp在大鼠甩尾实验及在小鼠扭体实 验中的作用比较接近(表9和10)。因此，纯化混合物Dp在抗炎作用以及镇痛作用中具有和混 合物D基本相似的药效作用强度。
动物口报混合物D和Dp之后的死亡率分别是65.2％和10.5％(表11)，这提示XAD-7柱 处理除去了混合物D中潜在的毒性成分。灌药后未死小鼠的体重在该研究期间继续保持增加， 这提示混合物D和Dp对生长都不具有明显的抑制影响。粪便出现变差的情况提示混合物D 和Dp对动物胃肠道可能有一些刺激。这些结果表明在急性毒性实验中混合物Dp比混合物D 毒性小。
这些结果表明，纯化后样品(混合物Dp)和纯化前样品(混合物D)不但化学上而且药理学 上基本相似，同时纯化步骤还减少了混合物D的急性毒性。因此，Amberlite XAD-7HP树脂 用于本品的纯化不仅可除去非活性成分，保留药理活性，还可同时降低纯化产品的毒性，所 以纯化效果是理想的、可以接受的。
4.3 混合物Dp的生物活性
实验结果表明：本发明的混合物Dp对II型胶原诱导(图14)的关节炎具有显著的抗关节 炎作用，对由角叉菜胶或鸡蛋清(表13和14)引起的足肿胀均有具有明显的抗炎作用，对由辐 射热刺激引起的大鼠疼痛反应(表15)、或由乙酸刺激小鼠(表16)诱导的疼痛反应均具有明显 的镇痛作用。在足肿胀实验中，混合物Dp在0.96g/kg剂量时即产生显著的抗炎作用，说明 其有效剂量较低。
但镇痛活性中，混合物Dp在7.69g/kg(甩尾实验)或15.38g/kg(扭体实验)时才能抑制疼痛 反应，这表明混合物Dp的抗炎活性较其镇痛作用强，这点有利于对类风湿性关节炎治疗时 通过直接作用其的病因病机起作用。通过本研究，混合物Dp的抗关节炎作用得到了明确。
4.4 胶囊的生物活性
实验结果表明：本发明的胶囊对佐剂诱导的关节炎和II型胶原诱导的关节炎均具有显著 的抗关节炎作用(图15和16)，对由乙酸刺激小鼠诱导的疼痛反应也具有明显的镇痛作用(表 17)。
4.5 胶囊的毒性
实验结果表明：本发明的胶囊在急性毒性(表18和19)和亚慢性毒性(图17)中较低。一次 性经口给药294g/kg时，在SD大鼠中未出现动物死亡。其主要的中毒症状是在给药后的第一 周出现体重增加减少和食欲降低，但这些症状在第二周即得到恢复。对SD大鼠重复给予本 胶囊，每周6日，每日一次经口给药51.0或76.5g/kg时，共给药97日，观察到相似结果。
4.6 化学组成和比例
虽然本发明所涉及到的这些主要化学成分，包括青藤碱、芍药苷、芍药酚、姜黄素、去 甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素等，以及它们的作用都是已知的，但是像本发明所提供的 范例，即从本发明中的草药组合进行提取而对他们进行使用这一点而言，对于本领域的技术 人员却并不是显而易见的。本发明的提取物可能包括许多尚未被鉴定或量化的其它成分。然 而，迄今为止尚未有其它报导将已知主要活性成分青藤碱、芍药苷、芍药酚、姜黄素、去甲 氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素组合在一个制剂中进行使用。因此，任何一种口服组合物， 只要包括上述这些在本发明内得到鉴定的主要组分，不管他们是从上述名单的草药中纯化得 到的，还是通过人工合成得到的，均属于本发明所包括的范围。
在以上实例教导本发明如何实施的同时，有一点是很清楚的，就是各组分的比例比各组 分具体的重量单位更重要。因此，在实践本发明时，本领域的熟练人员能按比例增加或减少 各组分的重量，但保持各组分的比例不变，这些也均属于本发明所包括的范围。
这里就配方指定重量单位，本发明可理解成不受使用的重量单位的限制。
4.7 本发明可适于其它人用口服制剂
除了胶囊之外，提取物可用于制备片剂，水剂或油悬浮液剂，分散性粉剂或颗粒剂，乳 剂，硬或软胶囊，糖浆剂，酊剂或饮料。上述口服制剂可按照本领域现有的任何用于制备这 种药学上可接受的制剂的已知方法制备，该制剂包含一种或多种以下添加剂：增甜剂，矫臭 剂，着色剂和防腐剂。增甜剂和矫臭剂会增加制剂的可口性。提取物与无毒的药学上可接受 的片剂用赋形剂混合后制成片剂也是可接受的。药学上可接受意指在和制剂的其它组分相容 的意义上，这种试剂应当是可接受的(以及对病人是无害的)。这样的赋形剂包括惰性稀释剂， 例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘 合剂例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；还有润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是 未包衣的，或者采用已知技术进行包衣，以迟延其在胃肠道的崩解和吸收，从而在较长时间 内产生持续的作用。例如，单独或与蜡一起，或采用延时材料如单硬脂酸甘油酯和二硬脂酸 甘油酯。
口服使用制剂还可以是硬明胶胶囊剂，其中活性组分与惰性固体稀释剂混合，例如碳酸 钙、磷酸钙或高岭土，或者是软胶囊胶囊剂，其中活性组分与水或油介质混合，例如花生油、 液体石蜡或橄榄油。某些实施方案中，水悬浮液可包含和适于水悬浮液制备的赋形剂混合的 本发明的提取物。这样的赋形剂包括悬浮剂、分散或润湿剂、一种或多种防腐剂，一种或多 种着色剂，一种或多种矫臭剂和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。油悬浮液可通过在例 如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油植物油中，或者在如液体石蜡的矿物油中，悬浮活性组 分配制。油悬浮液包含增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂，例如以上阐 明的那些，和矫臭剂，以提供可口的口服制剂。这些制剂可通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸 保存。这些制剂还可以是分散性粉剂或粒剂提供和分散或润湿剂、悬浮剂及一种或多种防腐 剂混合的一种或多种提取物，这些制剂适于通过加入水制备成水悬浮液。这些制剂还可包括 额外的赋形剂，例如甜味、矫臭和着色剂。
糖浆剂和酏剂可以甜味剂配制，例如甘油、脱水山梨糖醇或蔗糖。这样的制剂还包含缓 和剂、防腐剂、矫味或着色剂。
非肠道给药用提取制剂可以是无菌的可注射制剂，例如无菌可注射的水或油悬浮液。这 种悬浮液可按照本领域公知的方法采用适当的分散或润湿剂和悬浮剂配制。这种无菌注射制 剂还可以是无菌可注射的无毒非肠道可接受的稀释剂或溶剂的溶液或悬浮液，例如1，3-丁二 醇溶液。适当的稀释剂包括，例如，水、林格氏溶液和等张氯化钠溶液。此外，按照惯例采 用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为了这种目的，可以采用任何温和的不挥发性油， 包括合成的单或二脂酸甘油酯。此外，例如油酸的脂肪酸同样也用于该注射制剂的制备。
药物制剂还可以是水包油乳剂。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，例如液体石 蜡的矿物油，或者它们的混合物。适当的乳化剂包括天然形成的树胶例如阿拉伯胶和西黄蓍 胶，天然形成的磷脂，例如大豆卵磷脂，源自脂肪酸和己糖醇酸酐的酯类或偏酯类，例如山 梨糖醇酐单油酸酯，和这些偏酯和环氧乙烷的缩合产品，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。 乳剂还可含有甜味剂和矫臭剂。
可以与载体物质混合以产生单一剂型的提取物的数量将取决于治疗的宿主和具体给药方 式变化。
虽然本发明可以是药品，它还可以作为保健品消费，换言之，为了任何特定的临床目的 设计成营养或健康补充剂。因而，作为营养或健康补充剂它适于一般消费。
本发明范围内的变化
按照中医实践和中华人民共和国药典的约束，为了使用方便，通常优选干燥植物原料。 因此，以上说明书所有涉及草药的重量是那些草药的干重。虽然传统使用和优选干燥原料， 必须认识到干燥的植物原料有利于它们的贮藏、运输和随后的加工。干燥并不是这些草药发 挥药效等优点所必需的。因而，采用新鲜植物原料也可实施本发明。当新鲜植物原料的使用 足以符合使用的提取物的必须的质量和比例时，皆属于本发明所包括的范围内。
药典个别植物条目下在一个植物属内给出了几个种，这是可以理解的。同一属的这些种 可由药典给出的同一属的其它成员自由代替，或者一起使用。
此外，人们认识到某一植物部位可含有更高浓度的感兴趣的活性成分，本发明在药典的 标准命名法下教导使用特定的植物部位。然而这些成分还可以位于同一植物的其它部位。因 而，在当前权利要求书的范围内感兴趣的成分可从同一植物的其它部位提取。本领域熟练人 员会理解，借助于植物细胞和组织培养技术，体外培养这些草药的细胞和组织并从这些细胞 作组织提取感兴趣的活性成分是可行的。
提取方法需要减小药材的尺寸。这里，可通过许多方式，包括，但不限于，切割、剁碎、 切碎、捣碎、粉碎、碾磨和研磨，完成尺寸的减小。虽然教导了一种方式，还可以使用完成 药材尺寸减小的其它方法和手段。
尽管本说明书已经透过了实施例详细地描述了前面的发明，所列举的实施例仅为优选的 实施方案。本领域的技术人员可在不背离本发明所描述和要求保护的精神和范围之内进行变 化和修正。利用以上说明，属于中草药的制备和使用领域的技术人员应能够容易地实施本发 明。
同样，除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有和本发明所属的领域普通技 术人员通常理解相同的含义。
全面描述
按照中华人民共和国药典(2000年版一部)的标准和要求鉴别本发明的实验制剂和研究中 使用的所有草药组分。对规定的形态学、显微镜检查、以及化学分析等指标进行检验。本文 使用的植物学和草药命名和中华人民共和国药典(2000年版一部)中使用的相同，并且应当按 照此出版物解释。在本文中，术语“植物原料”或“草药原料”指本发明使用的草药和草药 的各种部位或组织。可交换地使用这些术语。
1 本发明的制剂的组分
1.1 组分
在以下如何制备按照本发明的制剂的说明中，植物原料是：
组分1得自草药青藤属(Sinomenium spp.)的草药青风藤(Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd. et Wils.)或者草药毛青藤(Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.var.cinereum Rehd.et Wils.)。
组分2是草药乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)。
组分3是草药芍药(Paeonia lactiflora Pall.)。
组分4是草药牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)。
组分5是草药姜黄(Curcuma longa L.)。
特别地，植物原料是：
组分1是青风藤或者草药青风藤或草药毛青藤的主干。
组分2是制附子，草药乌头的侧根。
组分3是白芍，草药芍药的根。
组分4是牡丹皮，牡丹草药牡丹的茎皮。
组分5是姜黄，草药姜黄的根茎。
所述青风藤、制附子、白芍、牡丹皮、姜黄的定义如下：
青风藤(Caulis Sinomenii)
青风藤是草药青风藤或草药毛青藤的干燥藤茎，在全国均有栽培。
制附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)
制附子是草药乌头侧根的炮制品。乌头属的植物产生各种C19非二萜类和C20二萜类化合 物。这些化合物中，某些8-乙酰基-14-芳酰基二酯C19生物碱，如乌头碱是极毒的。这种生物 碱组分和它们的浓度会随种类、采集的地点时间和炮制的方法变化而变化。尽管它们有毒， 但由于它们的药学价值，乌头根仍然是一种重要的中药。但为了用药安全，乌头的根或侧根 在干燥以便贮藏之前，均需通过在水中煮几个小时进行炮制以减毒。
白芍(Radix Paeoniae Alba)
白芍(白牡丹根；Baishao)，芍药的去皮干燥根，是中国传统滋补药材之一。它还被用作 解痉和疼痛缓解剂，并且长期被用于调节月经，治疗月经失调以及减轻腹部痉挛疼能和肌肉 强直。
牡丹皮(Cortex Moutan)
牡丹皮，芍药科牡丹草药牡丹茎和根的皮。干品称为牡丹皮(Moutan bark、tree peony bark、 Mudanpi)。通常在秋季采集，除去多纤维的部分后再干燥。
姜黄(Rizhoma Curcumae Longae)
姜黄是一种重要的中药制剂原料和染料，它含丰富的酚类化合物，即姜黄素类成分。姜 黄素[1，7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5，-二酮]，是一种常用的天然黄色颜料，广泛 用于食品染色，如酸菜和小吃。
1.2 组分的比例
本发明教导一种制剂，以干重计包括以下比例的植物原料：青风藤2-10份；制附子1-6 份；白芍3-15份；牡丹皮1-8份；和姜黄1-8份。
2 材料和方法
2.1 草药
青风藤，安徽省的野生产品，购自广东中粤药材联合公司。
制附子，成都市江油县中药材生产质量管理规范(GAP)基地的产品，姜黄，成都市双 流县姜黄GAP基地的产品，均购自四川省成都市药材市场。白芍，安徽省亳州市白芍GAP 基地的产品，牡丹皮，安徽省铜陵市牡丹皮GAP基地的产品，均购自安徽省毫州药材市场。
由于中药材通常多是经过干燥后再出售。因此，本发明中所给出的重量为各药材的干重 量。
2.2 设备
采用RT-80粉碎机(CERT-04，FARGO，台湾，中国)、中药多功能提取罐(DT-3m3，中国 温州)、减压回收罐(ZWN-1000，中国天津)和超临界二氧化碳萃取器装置(HA421-40-96，中国 南通)制备各种草药提取物。采用体积测量仪(plethymometer)(UGO Basile，意大利)和IITC 336 p甩尾痛觉测试计(IITC Inc，Woodland Hills，美国加利福尼亚)以评价各种草药提取物的抗炎 和镇活性。
2.3 提取方法
2.3.1 一般提取方法
一般提取方法包括减小草药原料的尺寸，接着以适当的溶剂回流提取。尺寸上的减小可 通过粉碎这些原料达到。
然后通过减压蒸发以浓缩或干燥提取物。为了获得药效最佳的提取物的制备方法，本发 明对水、乙醇和超临界二氧化碳提取方法进行了组合。在制备过程中的任何一点、任何步骤 的中间产物均可采用浓缩、澄清或纯化步骤。其后，部分提取物做了进一步纯化和试验，以 便改善其药效。以下介绍已经尝试过的方法。
2.3.2 具体提取方法
方法A—制备混合物A
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉。青风藤、制附子和白芍加水(草药 的6倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。水提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa) 浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物A1。牡丹皮和姜黄采用超临界流体萃取(SFE)技术以超临 界二氧化碳(21.7L/h)萃取，分别得提取物A2和A3。将提取物A1、A2和A3混合均匀得混 合物A。
方法B—制备混合物B
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉。青风藤、制附子和白芍加80％乙 醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃， 0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物B1。牡丹皮和姜黄采用SFE以超临界二氧化碳 (21.7L/h)萃取，分别得提取物B2和B3。将提取物B1、B2和B3混合均匀得混合物B。 方法C—制备混合物C
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉。青风藤、制附子和白芍加水(草药 的6倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。水提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa) 浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物C1。牡丹皮采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提 取物C2，牡丹皮在SFE之后的残渣以80％乙醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1 小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物 C3。姜黄采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物C4，姜黄在SFE之后的残渣以 80％乙醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减 压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物C5。将提取物C1、C2、C3、C4和C5 混合均匀得混合物C。
方法D—制备混合物D
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉。青风藤、制附子和白芍加80％乙 醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃， 0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物D1。牡丹皮采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h) 萃取得提取物D2，牡丹皮在SFE之后的残渣以80％乙醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次， 每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得 提取物D3。姜黄采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物D4，姜黄在SFE之后的 残渣以80％乙醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤， 再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物D5。将D1、D2、D3、D4和D5混 合均匀得混合物D。
方法E—制备混合物E
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉。青风藤以0.1％盐酸溶液(pH2.0， 草药的6倍量，w/w)浸泡提取(室温)3次，每次12小时。盐酸提取液经混合、过滤，以1％氢 氧化钠溶液调节至pH6.0，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物E1。牡 丹皮和姜黄采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取分别得提取物E2和E3。制附子、白芍 和牡丹皮在SFE之后的残渣加80％乙醇(草药的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小时。 乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物E4。姜 黄在SFE之后的残渣以10％氢氧化钠溶液(pH10.0，草药的6倍量，w/w)浸泡提取3次，每 次1小时。提取液经混合、过滤，以1％盐酸溶液调节至pH4.0，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩 至100％(w/v)浓度，得提取物E5。将E1、E2、E3、E4和E5混合均匀得混合物E。
方法F—制备混合物F
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉，加水(草药的6倍量，w/w)回流提 取3次，每次1小时，水提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓 度，得提取物F，为五种草药的水提取物。
方法G—制备混合物G
将青风藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黄粉碎成粗粉，加80％乙醇(草药的4倍量，w/w) 回流提取3次，每次1小时，乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至100％ (w/v)浓度，得提取物G，为五种草药的乙醇提取物。
2.3.3 纯化方法
上述各种可行方法中任何一种的制剂提取物可进一步纯化。一种增加期望的纯度的方法 是使提取物经受一种或多种分离技术，通过减少不需要的组分，从而增加提取物中所需组分 的相对丰度。
一项优选的分离技术是使用聚合吸附树脂，它在一定条件下优先结合想要保留的组分但 不结合不需要保留的组分。其后，改变这些条件(例如pH、洗脱剂极性)以释放结合组分。
2.3.4 包囊方法
以下这些常规步骤教导本发明的提取物如何包装成适于口服给药的胶囊。首先将提取物 制成干粉，接着用于填充胶囊壳。另一方法是在填充胶囊壳之前，将提取物和适当的赋形剂 混匀。
2.3.5 第一实施例
本发明的第一实施例采用方法D得到提取物，接着通过纯化方法实施例以说明如何实施 本发明。
第一实践的配方包括以下重量比的草药：青风藤5份，制附子3份，白芍6份，牡丹皮 3份和姜黄3份。
以下步骤用于第一实践的配方比例提取物的制备。
五种干燥草药分别粉碎成粗粉。青风藤62.5g，制附子37.5g，和白芍75g粉碎并加上80％ 乙醇1250ml回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合和过滤，再减压(70℃，0.08Mpa) 浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物1约175ml(即，在175ml最终体积的提取物1中提取总计 175g的草药)。
牡丹皮37.5g采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物2约0.8g。SFE之后的 残渣以80％乙醇187.5ml回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃， 0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物提取物3约37.5ml。
姜黄37.5g采用SFE以超临界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物4约2.8ml。SFE之后的残 渣以80％乙醇187.5ml回流提取3次，每次1小时。乙醇提取液经混合、过滤，再减压(70℃， 0.08Mpa)浓缩至100％(w/v)浓度，得提取物5约37.5ml。
将提取物1、3和5混合，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至近干燥，残渣溶于40ml的80％ 乙醇，将该乙醇溶液在Amberlite XAD-7HP聚合树脂(Rohm和Haas公司，USA.)柱(100×5cm， 树脂高度65cm)上样。该柱事先已采用蒸馏水5000ml、95％乙醇2000ml和蒸馏水2000ml顺 次冲洗预处理。上样后以5％乙醇1900ml、40％乙醇3000ml和80％乙醇3000ml顺次洗脱。 收集40％乙醇和80％乙醇的洗出液，混合，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至500ml体积，随后 进一步冻干得到纯化提取物13.1g。将纯化部分提取物(13.1g)、提取物2(0.9g)和提取物4(2.67ml) 混匀得混合物约16.1g。由于该混合物是通过对方法D得到的提取物进行纯化后得到，因而 这种混合物称为混合物Dp，这个名称在说明书的其它章节含义相同。
2.3.6 第二实施例
本发明的第二实施例说明制剂如何进一步加工成适于口服给药形式的实例，这个过程是 说明如何在述提取步骤后，加入适当的赋形剂以制成胶囊。
第二实践的配方包括以下重量比的草药：青风藤4份，制附子3份，白芍5份，牡丹皮 3份和姜黄2份。以下步骤用于第二实践的配方比例的提取物的制备。
五种干燥草药分别粉碎成粗粉。
青风藤720g以水5760ml浸泡0.5小时，回流提取3次，每次1.5小时，水提取液经混合、 过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.10～1.11(70℃)的浓缩液。待浓缩液冷至室 温后，加入鸡蛋清7.2g，混合均匀，再煮沸混合物以澄清青风藤浓缩提取液，随后离心过滤， 滤出的上清液经减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.13～1.15(70℃)，随后在连续搅拌的 情况下于浓缩液中再入乙醇至含醇量达63％(以体积计)，室温放置24小时，过滤，滤液再减 压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.13～1.15(70℃)，加入β-环糊精12.6g并调节相对密度调 节至1.10～1.11(70℃)，喷雾干燥(入口温度140℃，出口温度100℃)，得提取物1约65.7g。
制附子540g和白芍900g混合以80％乙醇7200ml浸泡0.5小时，回流提取3次，每次1.5 小时，醇提取液经合并、过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.13～1.15(70℃)。 调节相对密度至1.10～1.11(70℃)，喷雾干燥(入口温度140℃，出口温度100℃)，得提取物2 约175.1g。
牡丹皮粗粉520g采用SFE以超临界二氧化碳(250L/h)萃取，得提取物3约11.6g。SFE 之后的残渣以80％乙醇2600ml浸泡0.5小时，回流提取3次，每次1小时。醇提取液经合并、 过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.09～1.11(70℃)，。待浓缩液冷至室温后， 加入鸡蛋清3.9g，混合均匀，再煮沸混合物以澄清牡丹皮浓缩提取液，随后离心过滤，滤出 的上清液经减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.13～1.15(70℃)，加入β-环糊精9.5g并调 节相对密度为1.10～1.11(70℃)，喷雾干燥，得提取物4约49.1g。
姜黄粗粉360g采用SFE以超临界二氧化碳(250L/h)萃取，得提取物5约26.7ml。SFE之 后的残渣以80％乙醇2160ml浸泡0.5小时，回流提取3次，每次1小时。醇提取液经合并、 过滤，再减压(70℃，0.08Mpa)浓缩至相对密度为1.20(70℃)，加入淀粉18.0g，真空干燥(70℃， 0.09Mpa)，粉碎，得提取物6约37.3g。
将提取物3(11.6g)与β-环糊精100g混合均匀，再与提取物5(26.7ml)混合均均，随后依次 加入提取物1(65.7g)、提取物2(175.1g)、提取物4(49.1g)、提取物6(37.3g)和羧甲基淀粉钠15.3g， 用适量淀粉调节药粉总量至500g，混合均匀，干压制粒，于颗粒加入羧甲基淀粉钠8.5g和硬 脂酸镁1.5g，混合均匀，将0号胶囊，每粒胶囊调重至0.51g。
此项实践下得到的提取物用于以下质量控制节描述的分析实验。
2.4 方法A-G的比较
从上述方法A-G中确定最优提取方法的指标为已知活性成分的提取量和药理作用强度。
各种方法得到的提取物中已知主要活性成分的定量通过高效液相色谱(HPLC)测定。本发 明中使用的草药的已知活性成分分包括青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素。
用于含量测定的化学对照品为青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素，均购自中华人民共和 国国家药品生物制品检定所。去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素为自行制备并经检定。乙 腈、乙酸和三乙胺(HPLC级)购自Merck(Darmstadt，德国)。
HPLC系统为Agilent quaternary HPLC model HP1100系列(Hewlett-Packard，Palo Alto， CA)，配备有Altima C18柱(250×4.5mm，5μm)和DAD检测器。Swinnex型微孔过滤器(孔径 ＝0.45μm)购自Millipore(Millipore，香港)。
标准溶液的配制：准确称量青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素，于甲醇中溶解得每个化 合物浓度为0.2～0.5mg/ml的溶液。
样品溶液制备：干燥提取物0.1g置锥形瓶内，加甲醇20ml，精确称重，超声处理20 分钟，冷却，再称重，用甲醇补足重量，剧烈振摇，滤过(0.45μm)，得样品溶液。
色谱条件：流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，使用之前经0.45μm微孔过滤器过滤和 脱气，采用梯度洗脱，乙腈在0、30、40和50分钟的比例分别是10％、90％、10％和10％。 流速为0.8ml/分钟，在恒温条件下(25±0.1℃)分别于波长262nm、230nm、270nm和430nm进 行青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素的检测。
对混合物Dp测定的色谱图见图1-3。图1A和lB分别表示青藤碱对照品和混合物Dp内 青藤碱的HPLC色谱图；图2A和2B分别表示芍药苷对照品和混合物Dp内芍药苷的HPLC 色谱图，而图3A和3B分别表示姜黄素对照品和混合物Dp内姜黄素的HPLC色谱图。
2.5质量控制标准
为了质量控制，以下测定实验用于检测制剂内某些标志物或主要活性成分的存在(青藤碱， 芍药苷，丹皮酚，姜黄素，次乌头碱，乌头碱，中乌头碱和次乌头碱)。这些试验应用于通过以 上包囊方法得到的包装成胶囊形式的制剂的同时，它们还可应用于方法A-G生产的提取物和 混合物Dp。
通过利用以下测定实验的组合，可以进行本发明组合的植物原料的检验。
2.5.1 分析1：青风藤的鉴别
取第二实例下胶囊内容物0.25g，研细，加乙醇10ml，密塞，超声处理(270W，25kHz) 30分钟，滤过，滤液吹干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取青风藤对照药材 0.3g，同法制成对照药材溶液。再取青藤碱对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作 为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各 5μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲醇-三乙胺(7:2:0.5:0.5)为展开 剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液。供试品色谱中，分别在与对照品和对照药 材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱图见图4。结果显示提取物中含有活性成分/ 标志物青藤碱。
2.5.2 分析2：白芍的鉴别
取分析1项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取白芍对照药材0.4g，同法制成对照药 材溶液。再取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色 谱法(《中国药典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 香草醛浓硫酸试液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，分别在与对照品和对照药材 色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱图见图5。结果显示提取物中含有活性成分/标 志物芍药苷。
2.5.3 分析3：制附子的鉴别
取第二实例下胶囊内容物1g，研细，加0.05M的盐酸溶液10ml，密塞，超声(270W， 25kHz)30分钟，旋涡振荡2分钟后，以醋酸乙酯旋涡振荡提取3次，每次10ml，弃去醋酸 乙酯层。酸水溶液再以氯仿提取三次，每次10ml，合并氯仿提取液，空气吹干。残渣加乙醇 1ml使溶解，作为供试品溶液。另取附子对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液。再取次乌 头碱对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药 典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上， 以甲苯-醋酸乙酯-三乙胺(8:4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化鉍钾试液。 供试品色谱中，分别在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱图 见图6。结果显示提取物中含有活性成分/标志物次乌头碱。
2.5.4 分析4：牡丹皮的鉴别
取分析1项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取牡丹皮对照药材0.2g，同法制成对照 药材溶液。再取丹皮酚对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层 色谱法(《中国药典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点样于同一 硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯-甲酸(10:2.5:0.05)为展开剂，展开，取出，晾干，喷 以三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，分别在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相 同颜色的斑点。色谱图见图7。结果显示提取物中含有活性成分/标志物丹皮酚。
2.5.5 分析5：姜黄的鉴别
取分析1项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取姜黄对照药材0.15g，同法制成对照药 材溶液。再取姜黄素对照品，加乙醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层 色谱法(《中国药典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点样于同一 硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸(96:4:0.7)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯 (365nm)下检视。供试品色谱中，分别在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色 的荧光斑点。色谱图见图8。结果显示提取物中含有活性成分/标志物姜黄素。
2.5.6 分析6：乌头类生物碱的限量
取第二实例下胶囊内容物0.4g，精密称定，置于50ml离心管中，加入0.05M盐酸溶液 10ml，超声处理(270W，25kHz)40分钟，旋涡振荡2分钟后，以醋酸乙酯旋涡振荡提取2 分钟，每次10ml，重复3次，弃去醋酸乙酯层。酸水溶液再以氯仿旋涡振荡提取2分钟，每 次10ml，重复3次，离心分层(3000转每分钟，5分钟)，合并提取液，挥干。残渣加0.01M 盐酸溶液超声使溶解，旋涡振荡2分钟，定容至1.0ml，滤过(0.45μm滤膜)，取续滤液， 作为供试品溶液。另取乌头碱对照品，加0.01M的盐酸溶液制成每1ml含0.05mg的溶液， 作为对照品溶液。照高效液相色谱法(《中国药典》2000版一部附录VI D)试验。以十八烷 基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-缓冲液(10mM碳酸铵溶液，加氨水调节pH至9.8)为流动 相，采用梯度洗脱(0时乙腈比例为20％，10分钟时乙腈比例线性上升到30％，20分钟时乙 腈比例线性上升到32％，50分钟时乙腈比例线性上升到35％，75分钟时乙腈比例线性上升 到44％，80分钟时乙腈比例线性上升到80％)；检测波长为240nm。理论板数按乌头碱的色 谱峰计算应不低于2500，与杂质的分离度应大于1.5。精密吸取对照液与供试液各50μl，分 别注入液相色谱仪，测定，即得。供试品色谱中，乌头碱、中乌头碱及次乌头碱的峰面积总 和应小于对照品色谱图中乌头碱的峰面积，即每1.0g组合物(约等于两个胶囊内的量)中含有 的乌头生物碱(包括中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)的峰面积不应大于50μg乌头碱(基于中乌 头碱、次乌头碱和乌头碱具有相同的吸光度)的峰面积。色谱图见图9。图9A为不含制附子 的组合物的HPLC色谱图，而图9B和9C分别表示乌头碱、中乌头碱和次乌头碱对照品和组 合物内乌头碱、中乌头碱和次乌头碱的HPLC色谱图。
2.5.7 分析7：青藤碱、芍药苷、丹皮酚、姜黄素的定量
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-缓冲液(0.1％磷 酸-0.2％三乙胺，pH3.5)为流动相，采用梯度洗脱：0时乙腈比例为8％，25分钟时乙腈比例 线性上升到20％，30分钟时乙腈比例线性上升到40％，55分钟时乙腈比例线性上升到70％； 检测波长分别为240nm(芍药苷)，262nm(青藤碱)，270nm(丹皮酚)及420nm(姜黄素)。 理论板数按丹皮酚色谱峰计算应不低于2500。青藤碱，丹皮酚，芍药苷及姜黄素与杂质的分 离度应分别大于1.5。
对照品溶液的制备精密称取青藤碱、芍药苷、丹皮酚和姜黄素适量，加50％乙醇溶解， 制成每1ml含青藤碱约35μg，含芍药苷约160μg，含丹皮酚约110μg，含姜黄素约40μg的混 合对照溶液，即得。
供试品溶液的制备取装量差异项下内容物0.15g，精密称定，置25ml量瓶，加50％乙 醇20ml，超声处理(270W，25kHz)30分钟后，以50％乙醇定容至刻度，摇匀，静置，滤 过(0.45μm滤膜)，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5.0μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
每1.0g组合物(约等于两个胶囊内的量)中含有的青藤碱、芍药苷、丹皮酚、姜黄素的量 分别不应少于5.0μg，23.0μg，9.0μg和4.0μg。色谱图分别见图10-13。图10A表示不含青风藤 的组合物的HPLC色谱图，而图10B和10C分别表示青藤碱对照品和组合物内青藤碱的HPLC 色谱图。图11A表示不含白芍的组合物的HPLC色谱图，而图11B和11C分别表示芍药苷对 照品和组合物内芍药苷的HPLC色谱图。图12A表示不含牡丹皮的组合物的HPLC色谱图， 而图12B和12C分别表示丹皮酚对照品和组合物内丹皮酚的HPLC色谱图。图13A表示不含 姜黄的组合物的HPLC色谱图，而图13B和13C分别表示姜黄素对照品和组合物内姜黄素的 HPLC色谱图。
2.5.8 分析8：次乌头碱的定量
本测定使用分析6中的色谱法和制备的样品溶液。
对照品溶液精密称乌头碱适量，以0.01M的盐酸溶液溶解，稀释制成每1ml中约含 0.005mg的溶液作为对照品溶液。
每1.0g组合物(约等于两个胶囊内的量)中含有的次乌头碱的量不应少于7μg。色谱图见 图9。
从各色谱图结果可见，以上色谱分析技术适宜用于本发明制剂的质量控制。制剂的质量 通过对主要标志性或主要活性化学成分的鉴别和测定而确定。
如果配方不完整或者提取方法不正确，会导致上述分析方法的结果异常，出现需鉴别成 分的缺失或含量不合要求，这些情况下的制剂的质量均不合格，不可接受。
2.6 动物
啮齿动物(大鼠和小鼠)购自香港中文大学实验室动物服务中心和香港大学实验室动物服 务中心。动物放在不同的笼内(小鼠每笼15只动物和大鼠每笼5只)，并在实验之前适应至少 一周。自由摄取食物和饮水，但在每个具体实验之前特定的禁食期除外。动物实验室配备自 动温度(22±1℃)和照明控制(12小时光照/12小时黑暗)。
所有动物实验的步骤及动物饲养管理均得到香港浸会大学的人体及动物实验管理委员会 (HASC)和HKSAR卫生署的批准，并且遵照美国国家卫生研究院的《实验动物管理及使用 手册》的制度准则进行。
2.7 药物给药
给药前，所有草药提取物均制备成由10％花生油、10％吐温-80和80％的提取物组成的乳 剂，均采用口服给药。剂量均表示为草药重量(g)/体重(kg)。对照组动物给予由10％花生油、 10％吐温-80和80％水组成的空白乳剂。在进行药液稀释以及配制阳性对照药时，均使用空白 乳剂为溶媒。
2.8 急性炎症模型
采用角叉菜胶或者鸡蛋清诱导的急性炎症模型研究本发明以上提取物的抗炎作用。
大鼠在左后足接受跖底注射角叉菜胶(0.1ml，1％，0.85％盐水配制；SigmaChemical Co.，St Louis，MO，USA)或鸡蛋清(0.1ml，10％，0.85％盐水配制)。
动物在实验之前禁食24小时，在注射角叉菜胶1小时之前和24小时之后，或者注射鸡 蛋清3小时之前，各提取物分别灌胃给予动物，剂量见结果部分各表所示。药物以交错方式 给予动物以使每个动物之间间隔时间一致。阳性对照组动物给予消炎痛。
足肿胀实验的评估
采用足体积测量器(Plethysmometer 7150，Ugo Basile，意大利)测量每个动物足肿胀体积 (按ml)，精确度至小数点后两位。在角叉菜胶注射之前和之后2、4、6、24小时，或者鸡蛋 清注射之后1、2、3和4小时进行测量。爪的肿胀率是足体积百分比差异并由以下公式计算： 肿胀率(％)＝(A-B)×100/B，这里A表示注射后不同时间点的足体积，B表示注射之前的足体积。
结果表示为平均值+SD。数据分析采用方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD法(方差 相等)或Tamhane’s T2法(方差不等)，p<0.05为具有显著性意义。
2.9 镇痛实验
采用大鼠甩尾实验和小鼠扭体实验研究本发明以上提取物的镇痛作用。
2.9.1 甩尾实验
甩尾实验是急性疼痛的模型。此实验中，通过测定辐射热源直接作用于动物尾部产生刺 激作为开始，到动物弹开其尾巴以避开辐射热源作为结束间的时间测量潜伏期。正式实验， 需对动物进行筛选，对于体重为180g至220g的Spague-Dawley大鼠，如果反应潜伏期小于2 秒或超过6秒则应排除在实验之外。
实验之前动物禁食24小时，各提取物分别于实验前1小时灌胃给予动物，剂量见结果部 分各表所示。药物以交错方式给予动物以使每个动物之间间隔时间一致。
实验开始时，将每只大鼠轻轻放入仪器(IITC model 336甩尾痛觉测试计，IITC Inc.， Woodland Hills，California，U.S.A)的固定器内，再将动物的尾巴置于于尾槽内。启动光源以施 加辐射热至尾巴上由末梢起1/3长度处，引起甩尾反应。记录由启动光源至动物弹开其尾巴 以避开光源的时间，作为反应的潜伏期。实验同时设定截止时间，通常为12秒至15秒，如 果到达截止时间，动物仍未有反应，则以截止时间为潜伏期。截止时间的设定有助于防止动 物尾部长时间间暴露于辐射热下可能引起的组织损伤。
甩尾试验的评估
在药物给药后1、2和3小时测量甩尾反应。结果表示为平均值±SD。数据分析采用方差 分析(ANOVA)，两两比较采用LSD法(方差相等)或Tamhane’s T2法(方差不等)，p<0.05为具 有显著性意义。
2.9.2 扭体实验
扭体实验中，通过于小鼠的腹膜内腔内注射乙酸诱导急性炎症疼痛，其特征在于经后肢 牵张腹部肌肉系统的收缩波，这种活动称之为扭动反应。扭体发作的次数的多少可反映动物 对乙酸引起疼痛的反应强弱。扭体实验灵敏度较高，可用于评价非甾体抗炎药的止痛活性。
ICR小鼠雌雄各半，体重18g至25g，实验之前禁食24小时。
各提取物分别于乙酸注射前1或2小时灌胃给予动物，剂量见结果部分各表所示。药物 以交错方式给予动物以使每个动物之间间隔时间一致。随后动物被放入单独的10×15cm树脂 玻璃观察室10分钟以上以适应环境。实验时，于小腹腹腔注射用0.85％生理盐水配制的0.8％ 乙酸溶液0.1ml，注射完成后将各动物放回观察室。
2.9.3 扭体实验的评估
观察动物在注射乙酸后特定时间内(15或20分钟)扭体反应发作的次数。结果表示为平均 值±SD。数据分析采用方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD法(方差相等)或Tamhane’s T2 法(方差不等)，p<0.05为具有显著性意义。
2.10 实验性关节炎
佐剂性关节炎(AA)和II型胶原性关节炎(CIA)均是广泛使用的实验性关节炎模型，对于 研究风湿性关节炎的发病机理以及研究和开发抗关节炎药物有重要意义。
2.10.1 佐剂性关节炎
佐剂性关节炎是最经典的动物关节炎模型，它不仅广泛地用于炎症和自身免疫疾病的病 因、病理的研究，而且也大量地用于抗风湿药物的临床前研究。
结核杆菌悬浮液的制备和AA的诱导
热灭活的结核杆菌H37Ra购自Difco，Detroit，Michigan，U.S.A；矿物油购自Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，Montana，U.S.A。将热灭活的结核杆菌和矿物油在玻璃研钵里研磨，得到 0.625mg/ml的结核杆菌悬浮液。在体重为100g至130g的雄性Sprague-Dawley大鼠的尾基部 皮下注射0.10ml的悬浮液以诱导关节炎。大鼠(每组7～12只)在免疫之后开始每天口服各提取 物，以空白乳剂作阴性对照。
佐剂性关节炎的评估
从第9日开始，每天进行关节炎指数评估，每隔一天测定体重和双后足体积。关节炎指 数按照每足的红斑和关节软组组织肿胀程度评为0至4级，分别评0至4分，每只动物最大 关节炎指数为16分。后足体积采用足体积测量器(Plethysmometer 7150，Ugo Basile，意大利) 测量。结果表示为两只后足的平均体积。体重以0.1g精密度天平(Sartorius，Germany)测定。
结果表示为平均值+SD。数据分析采用SAS8.0软件的广义线性模型的重复测量，两两比 较采用SNK法(Student Newman-Keuls)，p<0.05为具有显著性意义。
2.10.2 II型胶原诱导的关节炎
II型胶原诱导的关节炎(CIA)是自身免疫性疾病的实验模型，它可通过以II型胶原免疫在 啮齿动物的易感种(大鼠和小鼠)中引起。这种模型和人类疾病有相似似处，包括疾病与组织 相容基因位点中基因的连锁，单核细胞浸润，血管翳形成，纤维蛋清沉积，软骨和骨破坏， 以及自身反应性T和B细胞。CIA模型已经成为评价关节炎治疗药物的工业标准。免疫之后， 这些动物产生自体免疫调节的多发性关节炎，它和人自身免疫性疾病风湿性关节炎共有几个 临床、组织学和免疫学特征。由于CIA和风湿性关节炎之间的重要相似，此实验模型已经是 用于研发抗炎药物的常规模型。
II型胶原(CII)的制备和关节炎的诱导
牛II型胶原的0.05M乙酸溶液(批号：082503)和弗氏不完全佐剂(批号：091003)均购自 Chondrex，LLC.Washington，U.S.A。将II型胶原与等体积的弗氏不完全佐剂(IFA)于匀浆机内 (IKA-WERKE Gmbh & Co.KG，德国)在冰浴中匀浆30秒，形成乳液。冰水浴可防止II型胶 原在匀浆期间的变性，变性的胶原不能诱导CIA的产生。
在体重为200g至380g的雌性Wistar大鼠尾基部的两个部位皮内注射0.10ml乳液(每个 部位0.05ml)。首次免疫的第7日进行同样的注射以加强免疫。从关节炎诱导当日(0日)直到 30日，动物每天口服给予提取物或消炎痛(阳性对照)(每组n＝5-6)。阴性对照组仅给予空白 乳乳液。
II型胶原诱导的关节炎的评估
从第9日开始，每天进行关节炎指数评估，每三天测定一次体重和双后足体积。关节炎 指数按照每足的红斑和关节软组组织肿胀程度评为0至4级，分别评0至4分，每只动物最 大关节炎指数为16分。后足体积采用足体积测量器(Plethysmometer7150，Ugo Basile，意大利) 测量。结果表示为两只后足的平均体积。体重以0.1g精密度天平(Sartorius，Germany)测定。
结果表示为平均值±SD。数据分析采用SAS8.0软件的广义线性模型的重复测量，两两比 较采用SNK法(Student Newman-Keuls)，p<0.05为具有显著性意义。
2.11 毒性
毒性研究包括两个内容：1)混合物D、Dp和胶囊的最大耐受剂量(MTD)；2)胶囊 的亚慢性毒性。
2.11.1 最大耐受剂量(MTD)
小鼠
ICR小鼠，雌雄各半，体重18g-26g，自由摄取食物和饮水，但在实验之前禁食16小时。 两组小鼠以交错方式给予混合物D和Dp。在0日至6日和13日观察小鼠的死亡率、毒性反 应和全身症状。
大鼠
SD大鼠，雌雄各半，体重110～140g，自由摄取食物和饮水，但在实验之前禁食16小时。 两组SD大鼠以交错方式给予胶囊和载体(0.3％羧甲基纤维素钠)。在0日至13日之间观察大 鼠的死亡率、毒性反应和全身症状。
2.11.2 亚慢性毒性
亚慢性毒性实验通常指持续给药1至2月以上观察毒性反应的研究，该时间接近实验大 鼠寿命的5％。进行亚慢性毒性实验可观察药物的毒性反应，并研究安全系数。并且设计这种 亚慢性研究以阐明异生物质，即中药制剂，对结构和功能实体的无数毒性作用的任何一种。
SD大鼠，雌雄各半，体重90～110g，自由摄取食物和饮水。三组SD大鼠(每组3只大鼠) 通过以交错方式给予51.0g/kg和76.5g/kg剂量的胶囊，或者载体(0.3％0.3％羧甲基纤维素钠)。 动物每周给药6日，每天一次。每天观察大鼠的死亡率、毒性反应。根据每周的体重计算给 药体积。
3 结果
3.1 最优提取方法的确定
通过测量其抗炎(鸡蛋清诱导的足肿胀)和镇育作用(表1-3)的实验，以及主要化学成分的 提取率(表4)，评估按照上述不同方法，即方法A-G的七种提取物的效果。
3.1.1足肿胀实验
表1 大鼠足肿胀实验中提取物抗炎作用的比较(N＝6)
注意*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组在同一时间点比较。#：P<0.05，##： P<0.01与混合物D组在同一时间点比较。
3.1.2甩尾实验
表2 大鼠甩尾实验中提取物镇痛作用的比较
注意*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组在同一时间点比较。#：P<0.05，##： P<0.01与混合物D组在同一时间点比较。
3.1.3扭体实验
表3 小鼠扭体实验中提取物镇痛作用的比较
注意*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组在同一时间点比较。#：P<0.05，##： P<0.01与混合物D组在同一时间点比较。
3.1.4各种方法的提取率
表4 各种提取方法中主要活性成分的提取率(％，N＝2)
实验结果显示，对于由注射鸡蛋清引起的大鼠急性炎症，混合物D具有最有效的抗炎作 用(表1)。对于由腹膜内乙酸注射诱导的小鼠急性疼痛反应，混合物D还显示较强的镇痛作用 (表3)。然而，对于由辐射刺激诱导的大鼠急性疼痛反应，混合物B产生最强的镇痛作用(表 2)。
与其它提取方法相比，目标活性成分，如青藤碱、芍药苷、芍药酚、姜黄素、去甲氧基 姜黄素和双去甲氧基姜黄素的提取在采用方法D时较高(表4)。因而，选择方法D得到的混 合物D用于纯化并进行随后的实验。虽然其它混合物不如混合物D一样有效，但本发明中涉 及的其它方法得到的混合物也同样显示了生物活性作用，因此也保留在本发明的范围之内。
3.2 混合物D和Dp之间的比较
混合物D和Dp的比较包括两者的收率、主要活性成分的回收率、抗炎镇痛活性及毒性 的。
3.2.1 混合物D和Dp收率的比较
测量得自方法D和Dp的提取物的重量，收率为所得提取物与原料的重量比。混合物D 和Dp的提取物1、3和5的收率分别是12.50％和5.25％(表5)。纯化率定义为混合物Dp收 率和混合物D收率之间的差相对于混合物D收率的比。纯化率显示Dp纯化方法所除去物质 的相对量。
表5 混合物D和混合物Dp的收率(N＝2)
3.2.2 活性成分回收率的比较
混合物D和Dp中青藤碱、芍药苷和姜黄素的含量采用高效液相色谱(HPLC)测定。经纯 化之后，混合物Dp保留了混合物D内85.11％的青藤碱，99.11％的芍药苷和74.22％的姜黄 素。
表6 选定的生活物性组分的回收率
3.2.3 混合物D和Dp对角叉菜胶引起的急性炎症作用的比较
阳性对照药消炎痛在给药7小时内均抑制足肿胀，但在角叉菜胶刺激后24小时未观察到 这种作用。混合物D(15.36g/kg)和Dp(0.96g/kg和15.36g/kg)在药物给药之后25小时内均产 生显著的抗炎作用。混合物D在0.96g/kg剂量条件下于给药后7小时和25小时产生显著的 抗炎作用。混合物D在15.36g/kg剂量条件下，混合物Dp在0.96g/kg和15.36g/kg剂量条件 下于给药后的3小时、5小时、7小时和25小时都显著的抗炎作用(表7)。其作用均有明显的 量效和时效关系。
表7 混合物D和Dp对由角叉菜胶引起的大鼠足肿胀的作用
注意：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，与对照组在同一时间点比较。
3.2.4 鸡蛋清诱导的大鼠足肿胀实验中混合物D和Dp抗炎作用比较
混合物D和Dp在药物给药后4小时都产生显著的抗炎作用，其作用均有明显的时效关 系。(表8)
表8 混合物D和Dp对鸡蛋清引起的足肿胀的作用
注意：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，与对照组在同一时间点比较；#，P<0.05，与混 合物Dp组在同一时间点比较。
3.2.5 辐射热刺激诱导的大鼠甩尾反应中混合物D和Dp镇痛作用的比较
给药之后1小时混合物D和Dp都显著延长了大鼠对辐射刺激的潜伏期。给药后2小时 混合物Dp仍然显著延长了潜伏期(表9)。其作用均有明显的时效关系。
表9 混合物D和Dp对大鼠关于辐射热刺激潜伏期的作用
注意：*，P<0.05，**，P<0.01与对照组在同一时间点比较。
3.2.6 由乙酸注射诱导的扭体实验
给药后两小时，混合物D和Dp对乙酸诱导的小鼠扭体活性都具有显著的抑制作用。(表 10)
表10 混合物D和Dp对小鼠扭体发作次数的作用
注意：*，P<0.05，**，P<0.01与对照组比较。
3.2.7 急性毒性
死亡率
以动物死亡数量/使用动物数量*100计算死亡率。给予混合物D和Dp的小鼠的死亡率分 别是65.2％和10.5％(表11)。在混合物D和Dp药物给药之后，第一例死亡分别发生在0.62 小时和0.46小时。
表11 ICR小鼠在接受混合物D或混合物Dp之后的死亡率
体重
单次给药后观察13日，给予混合物D和Dp且未死亡的ICR小鼠的体重在给药之后均保 持增加。在第13日，给予混合物D和Dp的动物的体重增加百分率分别是19.47％和32.30％(表 12)。
表12 ICR小鼠接受混合物D或混合物Dp之后体重增加
急性毒性：全身症状
死亡小鼠在死亡前均表现出昏迷并伴随阵挛性和强直性惊厥。此外，死亡之前还可看见 镇静、困难呼吸和鼻子肿大等现象。
存活的小鼠中，给予混合物D的小鼠分别只有13.0％和60.9％的动物出现粪便和毛发轻 度变差。给予混合物Dp的小鼠分别有38.9％和11.1％的动物出现粪便和毛发轻度变差，这些 情况保持1-2天。
3.3 混合物Dp的药理活性
3.3.1 混合物Dp对实验性关节炎的影响
胶原诱导的关节炎(CIA)
CII/IFA免疫之后，阴性对照组的所有动物在13日至16日间开始出现关节炎症状(图14)。 在18日时关节炎指数到达最高点，19日至23日稍有变化(图14A)，接着保持稳定至实验结 束，而后足体积至27日才达到坪值(图14B)。疾病动物的体重也显著减少(图14C)。与此相 反，每天口服给予23.08g草药/kg的混合物Dp则显著抑制了关节炎的发生与发展(图16A和 B)。与对照组相比，混合物Dp显著抑制II型胶原诱导的足体积增加(图14B)、逆转关节炎指 数发展的趋势(图14A)。混合物Dp还影响CIA大鼠的体重(图14C)。
3.3.2 混合物Dp对急性炎症模型的影响
混合物Dp对角叉菜胶引起的大鼠足肿胀模型的抑制作用
角叉菜胶跖底注射诱导的大鼠足肿胀持续至少24小时，峰值时间是注射后6小时。阳性 对照药物消炎痛在给药后7小时内抑制肿胀，在刺激24小时则观察不到这种作用。混合物 Dp在0.96g/kg和15.38g/kg剂量条件下给药之后25小时产生显著的抗炎作用。该作用有明显 的量效和时效关系。(表13)
表13 混合物Dp对角叉菜胶引起的大鼠足肿胀模型的作用
注意：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，与对照组在同一时间点比较
混合物Dp对鸡蛋清引起的大鼠足肿胀模型的抑制作用
鸡蛋清跖底注射诱导的大鼠足肿胀持续约4小时，峰值时间是注射后1小时。
混合物Dp以0.24g/kg、0.96g/kg和15.36g/kg剂量条件下给药后6小时产生显著抗炎作 用。但在3.85g/kg剂量条件下尽管观察到肿胀减小的趋势，但无显著的抗炎作用。该作用有 明显的量效和时效关系。(表14)
表14 混合物Dp对鸡蛋清引起的大鼠足肿胀模型的抑制作用
注意：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05，与对照组在同一时间点比较
3.3.3 混合物Dp的镇痛作用
甩尾实验
混合物Dp在7.69和30.77g/kg剂量条件下给药后1小时显著延长大鼠对辐射热刺激的潜 伏期。此外，30.77g/kg混合物Dp在药物给药后2和3小时还显著延长对辐射热的潜伏期。 但是在1.92g/kg尽管观察到增加潜伏期的趋势，但无显著的镇痛作用。该作用有明显的量效 和时效关系。(表15)
表15 混合物Dp对大鼠关于辐射热刺激潜伏期的作用
注意：*，P<0.05，**，P<0.01与对照组在同一时间点比较
扭体实验
混合物Dp以15.38g/kg和30.77g/kg给药后两小时，两个剂量都引起对乙酸诱导的小鼠 扭体反应的显著抑制。该作用有明显的量效关系。(表16)
表16 混合物Dp对小鼠扭体发作次数的作用
注意：*，P<0.05，**，P<0.01与对照组比较。
3.4 第二实例下生产的胶囊的药理活性
3.4.1 胶囊对实验性关节炎的影响
佐剂性关节炎
佐剂免疫之后，阴性对照组动物于12日至21日间开始出现关节炎症状(图15)。与对照 组相比，胶囊显著抑制佐剂关节炎诱导的足体积增加(图15B)并逆转关节炎指数发展趋势(图 15A)。胶囊对AA大鼠体重无显著影响(图15C)。
II型胶原诱导的关节炎(CIA)
CII/IFA免疫之后，阴性对照组动物于13至16日间开始出现关节炎症状(图16)，在18 日关节炎指数到达峰值，19日至23日稍有变化(图16A)，接着保持稳定至实验结束，而后足 体积至27日才达到坪值(图16B)。疾病动物体重显著减少(图16C)。与此相反，每天口服给 予34.0g草药/kg的胶囊显著抑制关节炎的发展(图16A、B和C)。与对照组相比，胶囊显著 抑制II型胶原诱导的足体积增加(图16B)和逆转关节炎指数发展趋势(图16A)。胶囊还影响 CIA大鼠的体重(图16C)。
3.4.2 胶囊的镇痛作用
扭体实验
阳性对照药延胡索乙素以0.09g/kg和青藤碱以0.0375g/kg，以及胶囊以6.375g/kg、 12.750g/kg和25.50g/kg给药后一小时，所有试验药物均对乙酸诱导的小鼠扭体反应产生抑制。 与对照组相比，延胡索乙素、青藤碱和12.7g/kg和25.50g/kg的胶囊的抑制有显著性意义。胶 囊的该作用有明显的量效关系。(表17)
表17 胶囊对小鼠扭体发作次数的作用
注意：*，P<0.05，**，P<0.01与对照组比较。
3.4.3 胶囊的毒性
急性毒性
胶囊以294g草药/kg剂量单一给药后14日未发现死亡率。与对照组相比，动物体重增加 在第4和第7日有轻微减少(表18)，动物摄食量在第2和第5日有轻微降低(表19)。药物给 药后一周，这些症状均逐渐恢复正常。
表18 SD大鼠接受胶囊后体重增加(N＝10)
表19 SD大鼠接受胶囊后的摄食量(N＝10)
亚慢性毒性
以动物死亡数量/使用动物数量*100％计算死亡率。在药物以51.0和76.5g草药/kg剂量给 药之后，直至97日未发现死亡率。
给药97日，每组动物体重保持增加。在97日，0.3％CMC-Na溶液、51.0g草药/kg和76.5g 草药/kg的胶囊给药之后大鼠体重增加的百分比分别是183.7％、151.9％和154.8％(图17)。 全身症状
全身症状观察主要包括皮肤、毛皮、眼黏膜、循环系统、自主和中枢神经系统、体马达 (somatomotor)活性、行为中的任何变化。记录任何药物毒性症状例如震颤、抽搐、流涎、腹 泻、嗜睡、瞌睡、病态、成束、瞳孔放大、瞳孔缩小、粪便、排出物或张力减退。
在给予0.3％CMC-Na溶液的大鼠中未发现异常观察。在以51.0g草药/kg胶囊给药的大 鼠中，从20日至97日发现立毛现象，从30日开始发现具有轻微的湿粪便。对于以76.5g草 药/kg的胶囊给药的大鼠，从9日至97日均发现立毛和具有轻微的湿粪便。
4.讨论
4.1 七种方法的比较
通过生物活性和化学成分提取量上的比较，对提取工艺路线进行了筛选和优化。结果显 示在生物活性方面，包括对角叉菜胶诱导的足肿胀的急性抗炎作用，辐射热刺激诱导的大鼠 甩尾反应和腹膜内乙酸刺激诱导的小鼠扭体反应中的止痛作用，青藤碱、芍药苷、丹皮酚和 姜黄素、去甲氧基姜黄素及双去甲氧基姜黄素的主要活性化学成分提取量等方面，由方法D 生产的混合物D最佳。
因而，选择方法D得到的混合物D进行纯化并用于接下来的实验。尽管如此，其它方法 得到的混合物也具有药理作用，故也保留在本发明范围之内。
4.2 混合物Dp的纯化
纯化方法目的是由提取物中除去非活性物质，因此增加活性物质的相对丰度。
聚合吸附树脂是从草药提取物除去非活性物质的一种理想材料。在中药纯化方法越来越 多地采用这些树脂，这主要是因为于它们通常对糖苷、生物碱、黄酮和萜类具有选择吸附性 能，而这些成分多具有生物活性，并多被认为是中药的药效成分。Amberlite XAD-7HP是一 种具有中等极性的较理想的聚合吸附树脂，它可选择性地吸附中等极性的化合物，例如青藤 碱、芍药苷和本发明中的一些其它物质。
结果(表5)表明纯化率大约是60％，这显示混合物D内接近60％的物质已经Amberlite XAD-7HP树脂除去(以上3.2.1节给出了术语“纯化率”的定义)。虽然本发明中使用Amberlite XAD-7HP树脂，但本发明中草药混合物的进一步纯化并不限于使用这一种树脂。
主要化学成分回收率的比较(表6)和原始提取物(混合物D)及纯化物(混合物Dp)的主要药 理学活性和急性毒性上的比较(表7-10)证明这两种提取物在药理学上基本等效、在化学组成 上基本相似，同时，混合物Dp的急性毒性较低(表11)。
回收率结果表明经Amberlite XAD-7HP树脂纯化后，85.11％的青藤碱，99.11％的芍药苷 和74.22％姜黄素被保留在纯化后的提取物中(混合物Dp)(表6)。按照中国国家食品药品监 督管理局(SFDA)建议的标准，每种制剂方法中的回收率应不少于70％。我们的结果表明本发 明的主要成分的回收率高于70％，因此符合SFDA的标准。这也提示该纯化方法可能在很大 程度上保留了大多数活性成分。这是维持制剂本身的药理活性和临床作用最重要的一点。
至于抗炎活性，结果表7和8均表明混合物D和Dp具有相似作用。某些情形下，混合 物Dp甚至优于混合物D。例如，在角叉菜胶诱导的足肿胀实验中，药物以0.96g/kg的较低 剂量给药后3和5小时(表7)，以及鸡蛋清诱导的足肿胀实验药物给药后7小时(表8)，就可 以观察到这一点。至于镇痛活性，结果证明混合物D和Dp在大鼠甩尾实验及在小鼠扭体实 验中的作用比较接近(表9和10)。因此，纯化混合物Dp在抗炎作用以及镇痛作用中具有和混 合物D基本相似的药效作用强度。
动物口报混合物D和Dp之后的死亡率分别是65.2％和10.5％(表11)，这提示XAD-7柱 处理除去了混合物D中潜在的毒性成分。灌药后未死小鼠的体重在该研究期间继续保持增加， 这提示混合物D和Dp对生长都不具有明显的抑制影响。粪便出现变差的情况提示混合物D 和Dp对动物胃肠道可能有一些刺激。这些结果表明在急性毒性实验中混合物Dp比混合物D 毒性小。
这些结果表明，纯化后样品(混合物Dp)和纯化前样品(混合物D)不但化学上而且药理学 上基本相似，同时纯化步骤还减少了混合物D的急性毒性。因此，Amberlite XAD-7HP树脂 用于本品的纯化不仅可除去非活性成分，保留药理活性，还可同时降低纯化产品的毒性，所 以纯化效果是理想的、可以接受的。
4.3 混合物Dp的生物活性
实验结果表明：本发明的混合物Dp对II型胶原诱导(图14)的关节炎具有显著的抗关节 炎作用，对由角叉菜胶或鸡蛋清(表13和14)引起的足肿胀均有具有明显的抗炎作用，对由辐 射热刺激引起的大鼠疼痛反应(表15)、或由乙酸刺激小鼠(表16)诱导的疼痛反应均具有明显 的镇痛作用。在足肿胀实验中，混合物Dp在0.96g/kg剂量时即产生显著的抗炎作用，说明 其有效剂量较低。
但镇痛活性中，混合物Dp在7.69g/kg(甩尾实验)或15.38g/kg(扭体实验)时才能抑制疼痛 反应，这表明混合物Dp的抗炎活性较其镇痛作用强，这点有利于对类风湿性关节炎治疗时 通过直接作用其的病因病机起作用。通过本研究，混合物Dp的抗关节炎作用得到了明确。
4.4 胶囊的生物活性
实验结果表明：本发明的胶囊对佐剂诱导的关节炎和II型胶原诱导的关节炎均具有显著 的抗关节炎作用(图15和16)，对由乙酸刺激小鼠诱导的疼痛反应也具有明显的镇痛作用(表 17)。
4.5 胶囊的毒性
实验结果表明：本发明的胶囊在急性毒性(表18和19)和亚慢性毒性(图17)中较低。一次 性经口给药294g/kg时，在SD大鼠中未出现动物死亡。其主要的中毒症状是在给药后的第一 周出现体重增加减少和食欲降低，但这些症状在第二周即得到恢复。对SD大鼠重复给予本 胶囊，每周6日，每日一次经口给药51.0或76.5g/kg时，共给药97日，观察到相似结果。
4.6 化学组成和比例
虽然本发明所涉及到的这些主要化学成分，包括青藤碱、芍药苷、芍药酚、姜黄素、去 甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素等，以及它们的作用都是已知的，但是像本发明所提供的 范例，即从本发明中的草药组合进行提取而对他们进行使用这一点而言，对于本领域的技术 人员却并不是显而易见的。本发明的提取物可能包括许多尚未被鉴定或量化的其它成分。然 而，迄今为止尚未有其它报导将已知主要活性成分青藤碱、芍药苷、芍药酚、姜黄素、去甲 氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素组合在一个制剂中进行使用。因此，任何一种口服组合物， 只要包括上述这些在本发明内得到鉴定的主要组分，不管他们是从上述名单的草药中纯化得 到的，还是通过人工合成得到的，均属于本发明所包括的范围。
在以上实例教导本发明如何实施的同时，有一点是很清楚的，就是各组分的比例比各组 分具体的重量单位更重要。因此，在实践本发明时，本领域的熟练人员能按比例增加或减少 各组分的重量，但保持各组分的比例不变，这些也均属于本发明所包括的范围。
这里就配方指定重量单位，本发明可理解成不受使用的重量单位的限制。
4.7 本发明可适于其它人用口服制剂
除了胶囊之外，提取物可用于制备片剂，水剂或油悬浮液剂，分散性粉剂或颗粒剂，乳 剂，硬或软胶囊，糖浆剂，酊剂或饮料。上述口服制剂可按照本领域现有的任何用于制备这 种药学上可接受的制剂的已知方法制备，该制剂包含一种或多种以下添加剂：增甜剂，矫臭 剂，着色剂和防腐剂。增甜剂和矫臭剂会增加制剂的可口性。提取物与无毒的药学上可接受 的片剂用赋形剂混合后制成片剂也是可接受的。药学上可接受意指在和制剂的其它组分相容 的意义上，这种试剂应当是可接受的(以及对病人是无害的)。这样的赋形剂包括惰性稀释剂， 例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘 合剂例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；还有润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是 未包衣的，或者采用已知技术进行包衣，以迟延其在胃肠道的崩解和吸收，从而在较长时间 内产生持续的作用。例如，单独或与蜡一起，或采用延时材料如单硬脂酸甘油酯和二硬脂酸 甘油酯。
口服使用制剂还可以是硬明胶胶囊剂，其中活性组分与惰性固体稀释剂混合，例如碳酸 钙、磷酸钙或高岭土，或者是软胶囊胶囊剂，其中活性组分与水或油介质混合，例如花生油、 液体石蜡或橄榄油。某些实施方案中，水悬浮液可包含和适于水悬浮液制备的赋形剂混合的 本发明的提取物。这样的赋形剂包括悬浮剂、分散或润湿剂、一种或多种防腐剂，一种或多 种着色剂，一种或多种矫臭剂和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。油悬浮液可通过在例 如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油植物油中，或者在如液体石蜡的矿物油中，悬浮活性组 分配制。油悬浮液包含增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂，例如以上阐 明的那些，和矫臭剂，以提供可口的口服制剂。这些制剂可通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸 保存。这些制剂还可以是分散性粉剂或粒剂提供和分散或润湿剂、悬浮剂及一种或多种防腐 剂混合的一种或多种提取物，这些制剂适于通过加入水制备成水悬浮液。这些制剂还可包括 额外的赋形剂，例如甜味、矫臭和着色剂。
糖浆剂和酏剂可以甜味剂配制，例如甘油、脱水山梨糖醇或蔗糖。这样的制剂还包含缓 和剂、防腐剂、矫味或着色剂。
非肠道给药用提取制剂可以是无菌的可注射制剂，例如无菌可注射的水或油悬浮液。这 种悬浮液可按照本领域公知的方法采用适当的分散或润湿剂和悬浮剂配制。这种无菌注射制 剂还可以是无菌可注射的无毒非肠道可接受的稀释剂或溶剂的溶液或悬浮液，例如1，3-丁二 醇溶液。适当的稀释剂包括，例如，水、林格氏溶液和等张氯化钠溶液。此外，按照惯例采 用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为了这种目的，可以采用任何温和的不挥发性油， 包括合成的单或二脂酸甘油酯。此外，例如油酸的脂肪酸同样也用于该注射制剂的制备。
药物制剂还可以是水包油乳剂。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，例如液体石 蜡的矿物油，或者它们的混合物。适当的乳化剂包括天然形成的树胶例如阿拉伯胶和西黄蓍 胶，天然形成的磷脂，例如大豆卵磷脂，源自脂肪酸和己糖醇酸酐的酯类或偏酯类，例如山 梨糖醇酐单油酸酯，和这些偏酯和环氧乙烷的缩合产品，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。 乳剂还可含有甜味剂和矫臭剂。
可以与载体物质混合以产生单一剂型的提取物的数量将取决于治疗的宿主和具体给药方 式变化。
虽然本发明可以是药品，它还可以作为保健品消费，换言之，为了任何特定的临床目的 设计成营养或健康补充剂。因而，作为营养或健康补充剂它适于一般消费。
本发明范围内的变化
按照中医实践和中华人民共和国药典的约束，为了使用方便，通常优选干燥植物原料。 因此，以上说明书所有涉及草药的重量是那些草药的干重。虽然传统使用和优选干燥原料， 必须认识到干燥的植物原料有利于它们的贮藏、运输和随后的加工。干燥并不是这些草药发 挥药效等优点所必需的。因而，采用新鲜植物原料也可实施本发明。当新鲜植物原料的使用 足以符合使用的提取物的必须的质量和比例时，皆属于本发明所包括的范围内。
药典个别植物条目下在一个植物属内给出了几个种，这是可以理解的。同一属的这些种 可由药典给出的同一属的其它成员自由代替，或者一起使用。
此外，人们认识到某一植物部位可含有更高浓度的感兴趣的活性成分，本发明在药典的 标准命名法下教导使用特定的植物部位。然而这些成分还可以位于同一植物的其它部位。因 而，在当前权利要求书的范围内感兴趣的成分可从同一植物的其它部位提取。本领域熟练人 员会理解，借助于植物细胞和组织培养技术，体外培养这些草药的细胞和组织并从这些细胞 作组织提取感兴趣的活性成分是可行的。
提取方法需要减小药材的尺寸。这里，可通过许多方式，包括，但不限于，切割、剁碎、 切碎、捣碎、粉碎、碾磨和研磨，完成尺寸的减小。虽然教导了一种方式，还可以使用完成 药材尺寸减小的其它方法和手段。
尽管本说明书已经透过了实施例详细地描述了前面的发明，所列举的实施例仅为优选的 实施方案。本领域的技术人员可在不背离本发明所描述和要求保护的精神和范围之内进行变 化和修正。利用以上说明，属于中草药的制备和使用领域的技术人员应能够容易地实施本发 明。
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