人sDR5-Fc重组融合蛋白及其新应用
阅读：632发布：2023-03-11
专利汇可以提供人sDR5-Fc重组融合蛋白及其新应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及人sDR5‑Fc重组融合蛋白及其在制备防治药物性肝损伤的药物中的应用。本发明通过 发明人 长期的研究，重新选择蛋白基因序列，得到了一种新的本发明所述的人sDR5‑Fc重组融合蛋白。并经大量实验发现，人sDR5‑Fc重组融合蛋白在多种小鼠药物性肝损伤模型中可明显降低血清转 氨 酶 水 平，减少肝脏病理损伤，显著降低 肝细胞 凋亡率，提高小鼠存活率。人sDR5‑Fc融合蛋白作为防治药物性肝损伤的一种新型候选药物， 治疗 范围广、靶点明确，作用特异且迅速，疗效显著，安全性高，极具开发潜 力 。，下面是人sDR5-Fc重组融合蛋白及其新应用专利的具体信息内容。
1.SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的人sDR5-Fc重组融合蛋白。
2.权利要求1所述的人sDR5-Fc重组融合蛋白在制备防治药物性肝损伤的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物性肝损伤为解热镇痛药诱导的肝损伤。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述解热镇痛药为对乙酰氨基酚。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物性肝损伤为乙酰胆碱酯酶抑制剂诱导的肝损伤。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂为他克林。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物性肝损伤为抗结核药诱导的肝损伤。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗结核药为异烟肼和/或利福平。
9.一种防治药物性肝损伤的药物组合物，其特征在于，其活性成分包括权利要求1所述的人sDR5-Fc重组融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射剂。
人sDR5-Fc重组融合蛋白及其新应用
技术领域
[0001] 本发明涉及重组蛋白以及医药领域，特别是涉及一种人sDR5-Fc重组融合蛋白及其在制备防治药物性肝损伤的药物中的应用。
背景技术
[0002] 药物性肝损伤(Drug-induced liver injury，DILI)，是指由各类处方或非处方的化学药物、生物制剂、传统中药、天然药、保健品、膳食补充剂及其代谢产物乃至辅料等所诱发的肝损伤。以往有或无肝脏基础疾病的患者在使用药物后均有可能发生药物性肝损伤。DILI是最常见和最严重的药物不良反应之一，重者可致急性肝衰竭(acute liver failure,简称ALF)甚至死亡。药物性肝损伤是新药停止开发和退出市场的最常见的原因。
在我国，由于近年来药物不断增加，新药的推广、不断涌现的各类保健药物研发和临床应用，DILI的发病率也随之有明显增高。
在我国，由于近年来药物不断增加，新药的推广、不断涌现的各类保健药物研发和临床应用，DILI的发病率也随之有明显增高。
[0003] 已知全球有1100多种上市药物具有潜在肝毒性，常见的包括非甾体类抗炎药(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs，NSAIDs)、抗感染药物(含抗结核药物)、抗肿瘤药物、中枢神经系统用药、心血管系统用药、代谢性疾病用药、激素类药物、某些生物制剂等。在欧美人群中，导致DILI最常见的三类药物分别是：NSAIDs、抗生素、中枢神经系统药物(如治疗老年痴呆药物他克林tacrine)，其中对乙酰氨基酚(Acetaminophen，简称APAP)是导致DILI的最常见药物。另一研究报道，导致DILI的药物前三名分别为：APAP、高效抗逆转病毒药物，抗结核药物(如：异烟肼isoniazid、利福平rifampicin)，且APAP是导致急性肝衰竭的首要原因，英国因APAP导致的患者死亡率达到500例/年。美国疾病控制中心资料显示，美国每年发生急性肝衰竭1600例，APAP所致的DILI占4l％。在亚洲地区，药物性肝损害的致病原因与欧美国家的病因学研究结果不尽相同。我国是结核病高发区，近年来,抗结核药物引起的肝损伤已位居我国药物性肝损伤的首位。
[0004] 不同药物可导致相同类型肝损伤，同一种药物也可导致不同类型的肝损伤。临床DILI的发病机制主要有以下3类：①药物对肝脏的毒性损害：有些药物直接引起肝细胞凋亡、坏死、脂肪变性；②机体对药物的特异性反应：部分抗菌药及类固醇激素等许多药物或其代谢产物作为半抗原，能与肝脏特异性蛋白质结合成抗原经巨噬细胞加工后，被免疫细胞识别，而导致变态反应性肝损伤；③药物干扰肝脏的血流：有些药物通过干扰肝脏血流，导致供血不足性肝损害。
[0005] 近年来随着新药的不断研制和药物使用品种及剂量的增加，药物性肝损伤呈逐年增多的趋势。药物性肝损伤占急性肝功能衰竭病因的14％，在所有药物不良反应中占到9.5％，是全世界超紧急原位肝移植的最主要原因，绝大多数致命的药物不良反应均表现为药物性肝损伤。药物性肝损伤治疗费用大(平均住院费用为10897.13元)，疗程较长(平均住院20.57d)，给社会和患者带来很大的经济负担和心理压力。随着制药业的迅速发展，新药的面市，药物性肝损伤将日益成为一个世界性的大问题。
[0006] 药物性肝损伤患者主要给予保肝、降酶、退黄以及促进肝细胞生长的药物治疗，血清高胆红素患者辅以人工肝治疗。轻者在停药后或经一般保肝等对症处理后可很快好转，重者则需住院治疗，极少数肝功能衰竭死亡。DILI的基本治疗原则是：(1)及时停用可疑肝损伤药物，尽量避免再次使用可疑或同类药物；(2)根据DILI的临床类型选用适当的药物治疗；(3)对出现肝性脑病和严重凝血功能障碍的急性肝衰竭/亚急性肝衰竭，以及失代偿性肝硬化，可考虑肝移植。
[0007] 迄今DILI仍缺乏特效治疗手段，治疗药物主要包括以下几种：
[0008] (1)N-乙酰半胱氨酸
[0009] N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)由L-半胱氨酸加上乙酰基形成,是细胞内还原性谷胱甘肽的前体。NAC可清除多种自由基，调节NO合成，改善微循环，纠正组织缺氧。主要作用机制是：(1)NAC可提高机体内谷胱甘肽含量。NAC作为小分子物质,易于进入细胞,脱乙酰基后成为谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成的前体,促进GSH的合成,提高组织内GSH含量,增强组织的抗自由基及抗药物、毒物损伤的能力。(2)NAC在体内能作为NO分子载体并增加NO的生物利用度,发挥NO生理效应,促进收缩的微循环血管扩张,有效增加血液对组织氧输送和释放,纠正组织缺氧,防止细胞进一步坏死。(3)NAC分子中含有活性巯基(-SH),可对抗不同原因所致的组织氧化损伤，对体内氧自由基具有明显的拮抗作用。
[0010] 重型患者可选用NAC，临床越早应用效果越好。成人一般用法：50～150mg/(kg·d)，总疗程不低于3d。治疗过程中需严格控制给药速度，以防不良反应。目前，FDA批准NAC用来治疗APAP引起的DILI。在美国APAP是消耗量最大的非处方类镇痛药(每年大约有1亿人次服用)，有1000多个品种；在我国APAP也被广泛应用于成人和儿童的感冒发热、头痛以及其他疾病所致的发热和疼痛。美、英、日等国《药典》和《中国药典》均已收载此药,是全世界应用最广泛的药物之一。一般认为APAP所引起的原发性肝细胞毒性主要是因为在药物的生物转化过程中产生毒性较大的自由基代谢产物N-乙酰-对-苯醌亚胺(NAPQI)。如服用中毒剂量APAP，产生大量毒物NAPQI，肝中GSH缺乏，代谢物储积，引起细胞损害和肝坏死，表现为ALT和AST升高、凝血酶原时间延长。NAC是GSH的前体，可提高机体内GSH含量，清除自由基，改善微循环而发挥治疗作用。美国ALF研究小组8年24个中心173例非APAP所致ALF患者的前瞻性对照研究显示，NAC可提高早期无肝移植患者的生存率。2011年美国肝病学会(AASLD)ALF指南推荐NAC用于药物及毒蕈引起的ALF的治疗。2014年ACG的IDILI临床诊治指南推荐应用NAC治疗早期ALF患者。因在儿童非APAP引起的ALF随机对照治疗研究中结果不一致，故不建议NAC用于儿童非APAP所致药物性ALF的治疗，尤其是0～2岁的患儿。
[0011] 然而，目前已知全球有1100多种药物能引起DILI，APAP只是其中的一种药物，不同种类的药物其导致肝损伤的作用机理也不同，因此NAC药物的治疗范围是非常有限的。且NAC有一定的副作用：1)对呼吸道黏膜有刺激作用，有时引起呛咳或支气管痉挛。2)水溶液中有硫化氢的臭味，部分病人可引起恶心、呕吐、流涕、胃炎等。因此NAC在治疗DILI过程中需严格控制给药速度，以防不良反应。
[0012] (2)糖皮质激素
[0013] 糖皮质激素宜用于治疗免疫机制介导的DILI。伴有自身免疫特征的AIH样DILI多对糖皮质激素治疗应答良好，且在停用糖皮质激素后不易复发。
[0015] 我国CFDA批准异甘草酸镁可用于治疗ALT明显升高的急性肝细胞型或混合型DILI，从而降低DILI患者的ALT水平。
[0016] (4)有经验表明，轻-中度肝细胞损伤型和混合型DILI，炎症较重者可试用双环醇和甘草酸制剂(甘草酸二铵肠溶胶囊或复方甘草酸苷等)；炎症较轻者可试用水飞蓟素。胆汁淤积型DILI可选用熊去氧胆酸(UDCA)。有报道腺苷蛋氨酸(SAMe)治疗胆汁淤积型DILI有效。
[0017] 但是上述药物的确切疗效有待严格的前瞻性随机对照研究加以证实。且这些药物通常治疗范围窄，对轻者有一定疗效，但对重者疗效有限甚至两药连用可能加重病情。且作用靶点不明确，有一定副作用，因此药物性肝损伤依然缺乏作用特异的、安全性高的治疗措施。由此可见，目前治疗DILI的药物种类和疗效均有限，亟需开发新的治疗药物。
[0018] 肝损伤在其发生发展过程中，最核心的事件是肝细胞死亡。肝细胞死亡超过了肝脏的再生能力，药物性肝损伤即会发展成为肝衰竭。经典的肝细胞死亡模式分为两类，即坏死与凋亡。肝脏病理中我们观察到肝细胞的坏死和凋亡是并存的。
[0019] 肝细胞凋亡是肝细胞死亡的主要方式之一，其相关分子可成为治疗肝损伤的关键靶点。肝细胞凋亡包括两条途径：线粒体途径和死亡受体依赖途径。三类主要的死亡受体家族分子与肝脏中发生的生理病理凋亡过程密切相关，包括Fas、肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)受体。肝脏细胞，尤其是肝细胞和胆管上皮细胞，对于死亡受体介导的细胞凋亡非常敏感，因为在肝脏中死亡受体广泛表达。
[0020] TRAIL是一种Ⅱ型跨膜蛋白，N-末端位于细胞内，C-末端位于细胞外。TRAIL的胞外区可以被金属蛋白酶切下形成可溶性TRAIL。TRAIL在正常人体的各种组织内有广泛的表达，通过与靶细胞表面的受体特异性结合而发挥作用。目前，在人类中已发现5种TRAIL受体：①2个死亡受体DR4(death receptor 4)和DR5(death receptor 5)；②2个诱骗受体DcR1(decoy receptor l)和DcR2(decoy receptor 2)；③1个可溶性受体OPG(osteoprotegerin)。其中，DR4和DR5的胞内区拥有完整的死亡结构域，能够诱导细胞凋亡，而DcR1和DcR2均不能传递凋亡信号。
[0021] 研究表明，药物及其代谢产物可活化多种死亡信号通路，包括肝细胞线粒体受损、氧化应激、死亡配体和受体高表达等，从而促进细胞凋亡、坏死和自噬的发生。APAP能诱导产生促凋亡Bcl-2蛋白同系物Bim和死亡配体TRAIL，从而导致肝损伤的发生(Badmann A,Langsch S,Keogh A,Brunner T,Kaufmann T,Corazza N.TRAIL enhances paracetamol-induced liver sinusoidal endothelial cell death in a Bim-and Bid-dependent manner.Cell Death Dis.2012 Dec 20；3:e447.Badmann A,Keough A,Kaufmann T,Bouillet P,Brunner T,Corazza N.Role of TRAIL and the pro-apoptotic Bcl-2 homolog Bim in acetaminophen-induced liver damage.Cell Death Dis.2011 Jun 9；2:e171.)抗结核药可以引起免疫性肝损伤，肝细胞可直接被炎症反应中产生的氧化应激产物杀伤或通过死亡受体信号途径诱导凋亡。肝细胞死亡和肝内、外阻塞，使胆汁酸代谢异常，胆汁酸水平升高，会上调DR5，通过TRAIL诱导肝细胞凋亡增加。在肝脏遭受“缺血缺氧”时，研究发现，人肝细胞系在缺氧/恢复氧过程中，DR5上调，导致TRAIL诱导的细胞凋亡增加。因此，TRAIL-DR5诱导凋亡系统参与了肝损伤发生发展的多个阶段，是肝细胞快速大量调亡的关键因素之一。以TRAIL-DR5系统为靶点，抑制细胞凋亡可以有效的阻止肝损伤的发生发展。
[0022] DR5是肿瘤坏死因子受体家族的成员，在活化的外周血淋巴细胞、炎症组织、缺血组织中表达水平高。DR5与TRAIL相结合后引起一系列信号级联反应，激活Caspase-8，Caspase-8通过非线粒体依赖途径和线粒体依赖途径引发细胞凋亡。
[0023] 人DR5蛋白由411个氨基酸组成，N端位于胞外，C端位于胞内，只有一次跨膜。其中1～55位氨基酸是信号肽，84～179位氨基酸是含有2个富含半胱氨酸的重复功能区的链状结合区，184～206位氨基酸为跨膜区，胞内区含有死亡结构域。
[0024] 可溶性DR5(soluble DR5,sDR5)为DR5不含跨膜区域的可溶性形式，因缺乏跨膜区域不能在细胞膜上表达而被分泌至细胞外。sDR5虽然保持与TRAIL配体相结合的活性，但不能向细胞内传导凋亡信号，可阻断TRAIL-DR5介导的细胞凋亡反应。且sDR5是人体自身蛋白，具有毒性小、无免疫原性的优点，极具作为肝损伤疾病的重要治疗药物的潜质。有研究表明：sDR5可通过阻断TRAIL诱导的细胞凋亡来减轻乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的肝细胞损伤(Liu YG,Liu SX,Liang XH,Zhang Q,Gao LF,Han LH,Cao YL,Hou N,Du J,Sun WS.Blockade of TRAIL pathway ameliorates HBV-induced hepatocyte apoptosis in anacute hepatitis model.Biochemical and Biophysical Research Communications352(2007)329–334)。孙汶生；高立芬；刘玉刚；梁晓红。人sDR5蛋白作为乙型病毒性肝炎治疗药物的应用。专利号：200610044672.8。)目前，sDR5对于因药物性肝损伤是否存在治疗作用，国内外尚无报道。
发明内容
[0025] 基于此，本发明的目的之一在于提供一种人sDR5-Fc重组融合蛋白。
[0026] 具体技术方案如下：
[0027] SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的人sDR5-Fc重组融合蛋白，或氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不改变的人sDR5-Fc重组融合蛋白。
[0028] 本发明的另一目的在于提供一种上述人sDR5-Fc重组融合蛋白的新应用。
[0029] 具体技术方案如下：
[0030] 上述人sDR5-Fc重组融合蛋白在制备防治药物性肝损伤的药物中的应用。
[0032] 在其中一些实施例中，所述解热镇痛药为对乙酰氨基酚。
[0033] 在其中一些实施例中，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂为他克林。
[0034] 在其中一些实施例中，所述抗结核药为异烟肼和/或利福平。
[0035] 上述人sDR5-Fc重组融合蛋白在制备防治药物性肝损伤的药物中的应用，所述药物的给药途径包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔注射和透皮给药等任何能达到治疗效果的途径，给药剂量取决于疾病的严重程度、患者年龄、体重、给药方式和给药频率。
[0036] 本发明的另一目的在于提供一种防治药物性肝损伤的药物组合物。
[0037] 具体技术方案如下：
[0038] 一种防治药物性肝损伤的药物组合物，其活性成分包括上述人sDR5-Fc重组融合蛋白。
[0039] 在其中一些实施例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
[0040] 现有的治疗药物性肝损伤的药物，有的只能针对一种药物诱导的肝损伤，而已知全球有1100多种上市药物具有潜在肝毒性，现有的治疗药物非常有限，远不能满足病人的需求。另外，许多治疗药物性肝损伤的药物的确切疗效并未经严格的随机对照实验加以证实，疗效不明确，甚至两药连用可能加重病情。本发明的人sDR5-Fc重组融合蛋白能阻断肝细胞凋亡的核心信号通路，TRAIL-DR5凋亡信号通路广泛存在于多种因素导致的肝损伤中，因此人sDR5-Fc重组融合蛋白治疗药物性肝损伤的作用具有广泛性。同时，人sDR5-Fc重组融合蛋白来源于人体自身的蛋白，代谢产物为氨基酸，因此安全性较其它治疗药物更优，且能够安全的与其它治疗药物联用，增强疗效，促进康复。因此，人sDR5-Fc重组融合蛋白在药物性肝损伤疾病领域具有广阔的应用前景。
[0041] 因此，本发明的人sDR5-Fc重组融合蛋白及其在制备防治药物性肝损伤的药物中的应用具有以下有益效果：
[0042] (1)本发明通过发明人长期的研究，重新选择蛋白基因序列，得到了一种新的本发明所述的人sDR5-Fc重组融合蛋白。并经大量实验发现，本发明的人sDR5-Fc重组融合蛋白在多种小鼠药物性肝损伤模型中(尤其是APAP诱导的肝损伤、tacrine诱导的肝损伤或isoniazid和rifampicin诱导的肝损伤)可明显降低血清转氨酶水平，减少肝脏病理损伤，显著降低肝细胞凋亡率，提高小鼠存活率。
[0043] (2)本发明的人sDR5-Fc融合蛋白是通过与TRAIL分子结合，阻断TRAIL与肝细胞膜表面的DR5受体结合，从而阻断TRAIL-DR5通路诱导的肝细胞凋亡，TRAIL-DR5/DR4通路是肝脏最重要的细胞凋亡通路，参与多种因素导致的肝脏损伤过程，在药物诱导的肝损伤中，无论致病机制是什么，必然最终会涉及肝细胞的凋亡，因此本发明的人sDR5-Fc重组融合蛋白制备的治疗药物性肝损伤药物的适应症范围将比NAC等治疗药物性肝损伤的现有药物广。且本发明的人sDR5-Fc融合蛋白来源于人体自身的蛋白组分，将比NAC等治疗药物性肝损伤的现有药物更安全；且能够安全的与其它治疗药物联用，增强疗效，促进康复。
[0045] 图1为实施例1中人sDR5-Fc重组融合蛋白阻断TRAIL诱导的肝细胞凋亡结果图；其中：A为不同浓度TRAIL诱导HepG2细胞凋亡结果；B为不同浓度人sDR5-Fc重组融合蛋白阻断TRAIL诱导HepG2细胞凋亡结果；C为TRAIL诱导的凋亡的HepG2细胞形态图；D为人sDR5-Fc重组融合蛋白阻断TRAIL诱导凋亡的HepG2细胞形态图。
[0046] 图2为人sDR5-Fc重组融合蛋白治疗APAP诱导的小鼠肝损伤结果图；其中：A为APAP诱导的小鼠肝损伤模型中，不同剂量人sDR5-Fc降低血清转氨酶水平的情况；B为APAP诱导的小鼠肝损伤模型中，不同剂量人sDR5-Fc提高小鼠的存活率的情况；C为生理盐水组小鼠肝组织切片图；D为10mg/kg sDR5-Fc组小鼠肝组织切片图；E为生理盐水组小鼠肝组织切片的TRAIL免疫组化染色结果；F为10mg/kg sDR5-Fc组小鼠肝组织切片的TRAIL免疫组化染色结果；G为生理盐水组小鼠肝组织切片的TUNEL染色结果；H为10mg/kg sDR5-Fc组小鼠肝组织切片的TUNEL染色结果。
[0047] 图3为人sDR5-Fc重组融合蛋白与NAC协同治疗APAP诱导的肝损伤结果图。
[0048] 图4为人sDR5-Fc重组融合蛋白治疗tacrine诱导的小鼠肝损伤结果图。其中：A、B为在tacrine诱导的小鼠肝损伤模型中，10mg/kg sDR5-Fc重组融合蛋白降低血清转氨酶水平的情况；C为tacrine诱导的小鼠肝损伤模型中，10mg/kg sDR5-Fc重组融合蛋白提高小鼠的存活率的情况。
[0049] 图5为人sDR5-Fc重组融合蛋白治疗isoniazid和rifampicin诱导的小鼠肝损伤的结果图。
[0050] 图6为人sDR5-Fc重组融合蛋白最大耐受剂量实验的结果图；其中：小鼠经一次静脉注射2198.4mg/kg sDR5-Fc重组融合蛋白或相同体积溶剂后，A为注射药物1周后小鼠体重的变化图，B为注射药物1周后小鼠的肝、肾、脾、肺的重量比较图，C为注射药物1周后小鼠肝功能比较图，D和E为注射溶剂(D图)或sDR5-Fc(E图)1周后小鼠肝组织切片HE染色结果图。
具体实施方式
[0051] 以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0052] 以下实施例中所用人sDR5-Fc重组融合蛋白分为自制与商品化的两类。
[0053] 自制人sDR5-Fc重组融合蛋白的序列为SEQ ID NO：1、所示的氨基酸序列(信号肽-目的序列)：
[0054] MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.1)
[0055] 使用小鼠CHO细胞进行蛋白表达。
[0056] 商品化人sDR5-Fc重组融合蛋白：Recombinant Human TRAIL R2/TNFRSF10B Fc Chimera(R&D Systems,Catalog Number:631-T2),序列为TRAIL R2(Ala54～Glu182)-IEGRMD-Human IgG1(Pro100～Lys330)-6Histag，用小鼠NSO细胞进行蛋白表达。
[0057] 实施例1：人sDR5-Fc重组融合蛋白能阻断TRAIL诱导的肝细胞凋亡
[0058] 取对数生长期的HepG2细胞进行96孔板铺板，每孔加入相同浓度的放线菌素D抑制细胞分裂，每孔依次加入以2倍比稀释的TRAIL蛋白诱导细胞凋亡，在37℃5％CO2培养箱中孵育培养18～22小时后，加入新鲜配制的20:1混合的MTS/PMS显色溶液20ul/孔，在培养箱中继续培养3～4小时，用酶标仪检测其A490-A630值。从而计算出TRAIL杀伤活性EC90值。
[0059] 取对数生长期的HepG2细胞进行96孔板铺板，每孔加入相同浓度的放线菌素D抑制细胞分裂，每孔加入相同浓度的TRAIL蛋白诱导90％的细胞凋亡，每孔依次加入以2倍比稀释的人sDR5-Fc重组融合蛋白阻断细胞凋亡，在37℃5％CO2培养箱中孵育培养18～22小时后，加入新鲜配制的20:1混合的MTS/PMS显色溶液20ul/孔，在培养箱中继续培养3～4小时，用酶标仪检测其A490-A630值。从而计算出人sDR5-Fc重组融合蛋白抗TRAIL诱导凋亡的生物活性EC50值。
[0060] 实验发现(参见图1)，人sDR5-Fc重组融合蛋白能有效阻断TRAIL诱导肝细胞凋亡，且本公司自己生产的人sDR5-Fc重组融合蛋白(氨基酸序列为SEQ ID NO.1)的生物活性(EC50＝5.7ng/ml)是R&D公司生产的人sDR5-Fc蛋白的生物活性(EC50＝27.6ng/ml)的近5倍。
[0061] 实施例2：人sDR5-Fc抗体融合蛋白治疗APAP诱导的肝损伤
[0062] (1)40只C57BL/6雄性小鼠，平均分成4组(生理盐水组、0.1mg/kg sDR5-Fc组、1mg/kg sDR5-Fc组、10mg/kg sDR5-Fc组，sDR5-Fc的序列为SEQ ID NO.1)，每组10只小鼠，每只小鼠灌胃给予400mg/kg APAP，1小时后，每组小鼠分别腹腔注射给予生理盐水、0.1mg/kg sDR5-Fc、1mg/kg sDR5-Fc、10mg/kg sDR5-Fc，给药体积均为10ml/kg，在APAP给药后6h、24h、32h和48h每只小鼠分别颌下静脉采血，分离血清，检测血清转氨酶水平。在48h处死小鼠，取部分肝脏放入4％PFA中固定，石蜡包埋、切片、HE染色、TUNEL染色、TRAIL免疫组化染色。
[0063] 结果显示(参见图2)：10mg/kg sDR5-Fc重组融合蛋白能显著性的降低APAP诱导的肝损伤小鼠血清转氨酶水平(图A)；同时可以看到，生理盐水组小鼠表现出明显的肝脏病理损伤(图C，白色圈的区域为肝脏损伤区，大量肝细胞凋亡)，10mg/kg sDR5-Fc组小鼠肝组织切片基本正常(图D)；生现盐水组小鼠肝组织切片中有大量TRAIL阳性的淋巴细胞浸润(图E，白色圈的区域为大量TRAIL阳性细胞区)，10mg/kg sDR5-Fc组小鼠肝组织切片中基本没有TRAIL阳性的淋巴细胞浸润(图F，黑色箭头指向的为TRAIL阳性细胞)；生理盐水组小鼠肝组织切片中有大量经TUNEL染色后阳性的细胞(图G，白色圈的区域和白色箭头指向的均为TUNEL阳性细胞)，10mg/kg sDR5-Fc组小鼠肝组织切片中基本没有TUNEL染色阳性的细胞(图H，白色箭头指向的为TUNEL阳性细胞)。因此10mg/kg sDR5-Fc重组融合蛋白能减轻小鼠肝脏病理损伤，减少凋亡的肝细胞数量，同时TRAIL阳性的浸润淋巴细胞数量减少。
[0064] (2)40只C57BL/6雄性小鼠，平均分成4组(生理盐水组、0.1mg/kg sDR5-Fc组、1mg/kg sDR5-Fc组、10mg/kg sDR5-Fc组，sDR5-Fc的序列为SEQ ID NO.1)，每组10只小鼠，每只小鼠灌胃给予500mg/kg APAP，1小时后，每组小鼠分别腹腔注射给予生理盐水、0.1mg/kg sDR5-Fc、1mg/kg sDR5-Fc、10mg/kg sDR5-Fc，给药体积均为10ml/kg，在APAP给药后6h、24h、32h和48h观察小鼠的存活率。
[0065] 结果显示(参见图2中的图B)：10mg/kg sDR5-Fc重组融合蛋白能显著性的提高APAP诱导的肝损伤小鼠的存活率。
[0066] 实施例3：人sDR5-Fc重组融合蛋白与NAC协同治疗APAP诱导的肝损伤
[0067] 40只C57BL/6雄性小鼠，平均分成4组(生理盐水组、10mg/kg sDR5-Fc组、100mg/kgNAC组、10mg/kg sDR5-Fc和100mg/kg NAC联合给药组，sDR5-Fc的序列为SEQ ID NO.1)，每组10只小鼠，每只小鼠灌胃给予500mg/kg APAP，1小时后，每组小鼠分别腹腔注射给予生理盐水、10mg/kg sDR5-Fc、100mg/kg NAC、10mg/kg sDR5-Fc和100mg/kg NAC联合给药，给药体积均为10ml/kg，在APAP给药后24h每只小鼠分别颌下静脉采血，分离血清，检测血清转氨酶水平。
[0068] 结果显示(参见图3)：10mg/kg sDR5-Fc重组融合蛋白和100mg/kg NAC能协同作用，显著性的降低APAP诱导的肝损伤小鼠血清转氨酶水平。
[0069] 实施例4：人sDR5-Fc重组融合蛋白治疗tacrine诱导的肝损伤
[0070] (1)30只BALB/c雌性小鼠，平均分成3组(生理盐水组、10mg/kg sDR5-Fc组(sDR5-Fc的序列为SEQ ID NO.1)、10mg/kg水飞蓟素silymarin组)，每组10只小鼠，每只小鼠灌胃给予25mg/kg tacrine，1小时后，每组小鼠分别给予生理盐水(静脉注射)、10mg/kg sDR5-Fc(静脉注射)、10mg/kg silymarin(灌胃)，给药体积均为10ml/kg，在tacrine给药后6h每只小鼠分别颌下静脉采血，分离血清，检测血清转氨酶水平。
[0071] 结果显示(参见图4)：10mg/kg sDR5-Fc重组融合蛋白能显著性的降低tacrine诱导的肝损伤小鼠血清转氨酶水平。
[0072] (2)30只BALB/c雌性小鼠，平均分成3组(生理盐水组、10mg/kg sDR5-Fc组(sDR5-Fc的序列为SEQ ID NO.1)、10mg/kg silymarin组)，每组10只小鼠，每只小鼠灌胃给予30mg/kg tacrine，1小时后，每组小鼠分别给予生理盐水(静脉注射)、10mg/kg sDR5-Fc(静脉注射)、10mg/kg silymarin(灌胃)，给药体积均为10ml/kg，在tacrine给药后后6h、24h、
32h和48h观察小鼠的存活率。
32h和48h观察小鼠的存活率。
[0073] 结果显示(参见图4)：10mg/kg sDR5-Fc重组融合蛋白能显著性的提高tacrine诱导的肝损伤小鼠的存活率。
[0074] 实施例5：人sDR5-Fc重组融合蛋白治疗isoniazid和rifampicin诱导的肝损伤[0075] 30只BALB/c雌性小鼠，平均分成3组(生理盐水组、10mg/kg sDR5-Fc组(sDR5-Fc的序列为SEQ ID NO.1)、10mg/kg silymarin组)，每组10只小鼠，每只小鼠灌胃给予100mg/kg isoniazid和150mg/kg rifampicin，每天1次，连续给药造模2周。在每周第一天给药1小时后，每组小鼠分别给予生理盐水(静脉注射)、10mg/kg sDR5-Fc(静脉注射)、10mg/kg silymarin(灌胃)，给药体积均为10ml/kg，一周一次。在末次isoniazid和rifampicin给药后8h每只小鼠分别颌下静脉采血，分离血清，检测血清转氨酶水平。
[0076] 结果显示(参见图5)：10mg/kg sDR5-Fc能显著性的降低isoniazid和rifampicin诱导的肝损伤小鼠血清转氨酶水平。
[0077] 实施例6：人sDR5-Fc重组融合蛋白最大耐受剂量研究
[0078] 20只BALB/c雌性小鼠，平均分成2组(溶剂组、2198.4mg/kg sDR5-Fc组(sDR5-Fc的序列为SEQ ID NO.1))，每组10只小鼠，溶剂组每只小鼠一次静脉注射40ml/kg体积的溶剂、sDR5-Fc组每只小鼠一次静脉注射2198.4mg/kg的sDR5-Fc重组融合蛋白，观察7天，然后处死，心脏采血后分离血清，检测肝功能(包括ALT、AST、TP、ALB、Tbil水平)。对肝、脾、肾、肺进行观察、称重。取肝脏固定后进行石蜡包埋、切片、HE染色。
[0079] 结果显示(参见图6)：小鼠经一次静脉注射2198.4mg/kg sDR5-Fc重组融合蛋白，不会导致小鼠死亡，在给药7天后，溶剂组和sDR5-Fc组小鼠平均体重没有差异，肝、肾、脾、肺的平均重量也没有差异，未见毒性反应。血清肝功能检测发现两组小鼠肝功能基本正常，sDR5-Fc组相对于溶剂组，血清转氨酶水平更低点。两组小鼠肝组织切片也显示肝脏结构正常，肝细胞以中央静脉为中心，向周围呈放射状排列，形成单个细胞厚度的细胞板。因此，小鼠对sDR5-Fc的最大耐受剂量大于2198.4mg/kg。
[0080] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
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