用白介素-4拮抗剂进行疫苗接种
阅读：257发布：2020-11-09
专利汇可以提供用白介素-4拮抗剂进行疫苗接种专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于诱导 抗原 特异性免疫应答的方法、用于增大免疫细胞对抗原的亲合 力 的方法、用于增大对抗原具有特异性的免疫细胞的数目的方法、 预防 或 治疗 感染的方法和 疫苗 接种的方法，所述方法包括联合抗原、尤其选自gag、pol或env的HIV-1抗原施用白介素-4受体(LL-4R)拮抗剂。，下面是用白介素-4拮抗剂进行疫苗接种专利的具体信息内容。
1.一种用于诱导受试者中抗原特异性免疫应答的方法，所述方法包括联合白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂向所述受试者施用所述抗原。
2.一种用于增大受试者中免疫细胞对抗原的亲合力的方法，所述方法包括联合白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂向所述受试者施用所述抗原。
3.一种用于增大受试者中对抗原具有特异性的免疫细胞的数目的方法，所述方法包括联合白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂向所述受试者施用所述抗原。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述免疫细胞为T淋巴细胞。
+
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞为CD8 T淋巴细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗原为病毒抗原。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述抗原为人免疫缺陷病毒抗原。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抗原为选自以下的人免疫缺陷病毒抗原：gag、pol或env基因产物，或其任何组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述抗原和白介素-4受体拮抗剂依次向所述受试者施用。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述抗原和白介素-4受体拮抗剂同时向所述受试者施用。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述抗原和白介素-4受体拮抗剂作为初免剂量向所述受试者施用。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，所述施用包括施用编码所述抗原的多核苷酸、编码所述白介素-4受体拮抗剂的多核苷酸，或两者。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多核苷酸中的任何一种或多种为重组病毒的组分。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述IL-4R拮抗剂为能够与IL-4Rα结合并且防止IL-4R信号传导的白介素-4受体α链(IL-4Rα)拮抗剂。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述IL-4R拮抗剂为缺乏信号肽并且包括选自以下的一种或多种突变的人白介素-4分子：在残基121上的突变、在残基
124上的突变、在位置123之后一个或多个残基的缺失、白介素-4基因的外显子2编码的片段的缺失，或其任何组合。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用加强剂量，其中所述加强剂量包括所述抗原和IL-4R拮抗剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述加强剂量的所述抗原和IL-4R拮抗剂同时施用。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述加强剂量的所述抗原和IL-4R拮抗剂依次施用。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中施用所述加强剂量包括施用编码所述抗原的多核苷酸、编码所述IL-4R拮抗剂的多核苷酸，或两者。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸中的任何一种或多种为重组病毒的组分。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述IL-4R拮抗剂为能够与IL-4Rα结合并且防止IL-4R信号传导的白介素-4受体α链(IL-4Rα)拮抗剂。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，其中所述加强剂量的所述IL-4R拮抗剂为缺乏信号肽并且包括选自以下的一种或多种突变的人白介素-4分子：在残基121上的突变、在残基124上的突变、在位置123之后一个或多个残基的缺失、白介素-4基因的外显子2编码的片段的缺失，或其任何组合。
23.根据权利要求15或权利要求22所述的方法，其中所述突变选自：R121D、Y124D、白介素-4基因的外显子2编码的片段的缺失，或其任何组合。
24.一种组合物，其包含：
(i)抗原和/或编码所述抗原的多核苷酸；以及
(ii)白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂和/或编码所述IL-4R拮抗剂的多核苷酸。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述多核苷酸中的任何一种或多种为重组病毒的组分。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的组合物，其中所述抗原为病毒抗原。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的组合物，其中所述抗原为选自以下的人免疫缺陷病毒抗原：gag、pol或env基因产物，或其任何组合。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的组合物，其中所述IL-4R拮抗剂为能够与IL-4Rα结合并且防止IL-4R信号传导的白介素-4受体α链(IL-4Rα)拮抗剂。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的组合物，其中所述IL-4R拮抗剂为缺乏信号肽并且包括选自以下的一种或多种突变的人白介素-4分子：在残基121上的突变、在残基124上的突变、在位置123之后一个或多个残基的缺失、白介素-4基因的外显子2编码的片段的缺失，或其任何组合。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述突变选自：R121D、Y124D、白介素-4基因的外显子2编码的片段的缺失，或其任何组合。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸中的任何一种或多种为重组病毒的组分。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述重组病毒选自由以下组成的组：痘病毒、牛痘病毒、减毒牛痘病毒(例如NYVAC)、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒和修饰的牛痘安卡拉(MVA)病毒。
33.一种用于预防或治疗受试者中感染的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求24至32中任一项所述的组合物。
34.一种针对感染向受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求24至30中任一项所述组合物的初次剂量和加强剂量。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述感染为人免疫缺陷病毒感染并且所述组合物包含选自以下的人免疫缺陷病毒抗原：gag、pol或env基因产物，或其任何组合。
36.根据权利要求13或权利要求20所述的方法，其中所述重组病毒选自由以下组成的组：痘病毒、牛痘病毒、减毒牛痘病毒(例如NYVAC)、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒和修饰的牛痘安卡拉(MVA)病毒。
37.根据权利要求13、20或36所述的方法，其中所述重组病毒瞬时表达所述受试者中所述白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂。
用白介素-4拮抗剂进行疫苗接种
[0001] 以交叉引用方式并入
技术领域
[0004] 背景
[0005] 普遍认为有效抗病毒粘膜CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应为病毒疫苗诱导的免疫应答的主要组分。具体地说，在粘膜表面处局部抗病毒免疫应答的重要性日益明显。还日益明显的是，不仅抗病毒T细胞应答的强度，而且抗病毒T细胞应答的‘质量’或亲合力在保护免受病毒感染中可为重要的，尤其那些证明对现有免疫接种策略具有抗性的病毒感染。T细胞应答的质量可以在T细胞对靶细胞上MHC-肽复合物的功能性亲合力中中反映出。高亲合力CTL可识别低浓度抗原，然而低亲合力CTL在低浓度抗原下在效应子功能方面无效。已经确立的是，高亲合力CTL相较于低亲合力T细胞具有增大的清除感染的功能性能力。但是，已发现高亲合力CTL和低亲合力CTL的相对比率随着感染的时程而改变。尽管如此，公认的是高亲合力CTL具有比低亲合力T细胞更大的清除感染的能力。
[0006] 例如，就人免疫缺陷病毒(HIV)而言，通常首先遭遇HIV的生殖组织和直肠组织中的局部抗病毒免疫应答是极其重要的。胃肠道中的局部免疫应答也是重要的，因为胃肠道是HIV复制的主要部位。最初HIV暴露的部位(粘膜)处高亲合力抗病毒T细胞的存在提+供减少粘膜CD4T细胞消耗和局部控制HIV感染的可能。鉴于疫苗策略识别表达极低水平病毒抗原的靶细胞的实际能力(例如在细胞的感染之后早期)，以及它们在低浓度靶抗原下更快速地引发靶细胞溶解，引发高亲合力CTL的疫苗策略潜在地可能提供更大保护免受感染。
[0007] 存现对能够引发高亲合力CTL的抗病毒疫苗的需要。具体地说，需要能够在作为许多病毒感染的起始点的粘膜表面引发高亲合力CTL的抗病毒疫苗。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明已发现，抗病毒疫苗诱导的抗原特异性T淋巴细胞的强度和亲合力可通过短暂地减小白介素-4(IL-4)的可用性和/或短暂地抑制IL-4功能得以增大。
[0010] 在第一个方面中，本发明提供一种用于诱导受试者中抗原特异性免疫应答的方法，所述方法包括联合白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂向受试者施用抗原。
[0011] 在第二个方面中，本发明提供一种用于增大受试者中免疫细胞对抗原的亲合力的方法，所述方法包括联合白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂向受试者施用抗原。
[0012] 在第三个方面中，本发明提供一种用于增大受试者中对抗原具有特异性的免疫细胞的数目的方法，所述方法包括联合白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂向受试者施用抗原。
[0013] 在上述方面的一个实施方案中，本发明包括向受试者施用初免剂量和加强剂量，每种所述剂量包括联合白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂向受试者施用抗原。
[0014] 在上述方面的一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用初免剂量，其中初免剂量包括抗原和IL-4R拮抗剂。
[0015] 在上述方面的一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用加强剂量，其中加强剂量包括抗原和IL-4R拮抗剂。
[0016] 在上述方面的一个实施方案中，加强剂量的抗原和IL-4R拮抗剂可依次施用或同时施用。
[0017] 在上述方面的一个实施方案中，施用初次剂量包括施用编码抗原的多核苷酸，编码IL-4R拮抗剂的多核苷酸，或两者。
[0018] 在上述方面的一个实施方案中，施用加强剂量包括施用编码抗原的多核苷酸，编码IL-4R拮抗剂的多核苷酸，或两者。
[0019] 在上述方面的一个实施方案中，初次剂量中多核苷酸中的任何一种或多种可为重组病毒的组分。
[0020] 在上述方面的一个实施方案中，加强剂量中多核苷酸中的任何一种或多种可为重组病毒的组分。
[0021] 在上述方面的一个实施方案中，初次剂量的重组病毒为痘病毒。
[0022] 在上述方面的一个实施方案中，加强剂量的重组病毒为痘病毒。
[0023] 在上述方面的一个实施方案中，初次剂量的重组病毒为选自由以下组成的组的痘病毒：牛痘病毒、减毒牛痘病毒(例如NYVAC)、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒和修饰的牛痘安卡拉(MVA)病毒。
[0024] 在上述方面的一个实施方案中，加强剂量的重组病毒为选自由以下组成的组的痘病毒：牛痘病毒、减毒牛痘病毒(例如NYVAC)、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒和修饰的牛痘安卡拉(MVA)病毒。
[0026] 在上述方面的一个实施方案中，加强剂量的IL-4R拮抗剂为能够与IL-4Rα结合并且防止IL-4R信号传导的白介素-4受体α链(IL-4Rα)拮抗剂。
[0027] 在上述方面的一个实施方案中，初次剂量的IL-4R拮抗剂为缺乏信号肽并且包括选自以下的一种或多种突变的人白介素-4分子：在残基121上的突变、在残基124上的突变、在位置123之后一个或多个残基缺失、白介素-4基因的外显子2编码的片段缺失，或其任何组合。
[0028] 在上述方面的一个实施方案中，加强剂量的IL-4R拮抗剂为缺乏信号肽并且包括选自以下的一种或多种突变的人白介素-4分子：在残基121上的突变、在残基124上的突变、在位置123之后一个或多个残基缺失、白介素-4基因的外显子2编码的片段缺失，或其任何组合。
[0029] 在上述方面的一个实施方案中，初次剂量的IL-4R拮抗剂为包括选自以下突变的人白介素-4分子：R121D、Y124D、白介素-4基因的外显子2编码的片段缺失，或其任何组合。
[0030] 在上述方面的一个实施方案中，加强剂量的IL-4R拮抗剂为包括选自以下突变的人白介素-4分子：R121D、Y124D、白介素-4基因的外显子2编码的片段缺失，或其任何组合。
[0031] 在上述方面的一个实施方案中，施用包括施用编码抗原的多核苷酸、编码白介素-4受体拮抗剂的多核苷酸，或两者。
[0032] 在上述方面的一个实施方案中，所述多核苷酸中的任何一种或多种为重组病毒的组分。
[0033] 在上述方面的一个实施方案中，重组病毒为痘病毒。
[0034] 在上述方面的一个实施方案中，重组病毒为选自由以下组成的组的痘病毒：牛痘病毒、减毒牛痘病毒(例如NYVAC)、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒和修饰的牛痘安卡拉病毒。
[0035] 在上述方面的一个实施方案中，重组病毒瞬时表达受试者中白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂。
[0036] 在上述方面的一个实施方案中，联合白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂向受试者施用抗原减少受试者中CD103+、b220+、CD8α+细胞的数目和/或增加受试者中CD11b+、CD103-、b220-、CD8α-细胞。CD103+、b220+、CD8α+细胞和/或CD11b+、CD103-、b220-、CD8α-细胞可对抗原抗原具有特异性。抗原可为HIV抗原(例如HIV gag、p ol和/或env抗原)。
[0037] 在第四个方面中，本发明提供抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂在制备用于诱导受试者中对抗抗原的特异性免疫应答的药物中的用途。
[0038] 在第五个方面中，本发明提供抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂在制备用于提高受试者中对抗原具有特异性的免疫细胞的亲合力的药物中的用途。
[0039] 在第六个方面中，本发明提供抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂在制备用于提高受试者中对抗原具有特异性的免疫细胞的数目的药物中的用途。
[0040] 在第七个方面中，本发明提供抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂，其用于诱导受试者中对抗原具有特异性的免疫应答。
[0041] 在第八个方面中，本发明提供抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂，其用于提高受试者中对抗原具有特异性的免疫细胞的亲合力。
[0042] 在第九个方面中，本发明提供抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂，其用于提高受试者中对抗原具有特异性的免疫细胞的数目。
[0043] 在第四个、第五个、第六个、第七个、第八个和第九个方面的一个实施方案中，抗原以编码抗原的多核苷酸提供。
[0044] 在第四个、第五个、第六个、第七个、第八个和第九个方面的一个实施方案中，白介素-4受体拮抗剂以编码白介素-4受体拮抗剂的多核苷酸提供。
[0045] 在第四个、第五个、第六个、第七个、第八个和第九个方面的一个实施方案中，所述多核苷酸中的任何一种或多种为重组病毒的组分。
[0046] 在第四个、第五个、第六个、第七个、第八个和第九个方面的一个实施方案中，重组病毒为痘病毒。
[0047] 在第四个、第五个、第六个、第七个、第八个和第九个方面的一个实施方案中，重组病毒为选自由以下组成的组的痘病毒：牛痘病毒、减毒牛痘病毒(例如NYVAC)、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒和修饰的牛痘安卡拉病毒。
[0048] 在第四个、第五个、第六个、第七个、第八个和第九个方面的一个实施方案中，重组病毒瞬时表达受试者中白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂。
[0049] 在第四个、第五个和第六个方面的一个实施方案中，药物为疫苗。
[0050] 在第四个、第五个和第六个方面的一个实施方案中，药物为包含第一组分和第二组分的疫苗，其中第一组分包含白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂并且第二组分包含抗原，并且其中第一组分和第二组分用于或配制用于同时或依次向受试者施用。
[0051] 在第七个、第八个和第九个方面的一个实施方案中，抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂为疫苗的组分。
[0052] 在第四个、第五个、第六个、第七个、第八个和第九个方面的一个实施方案中，疫苗作为初次剂量、加强剂量或两者用于向受试者施用或配制用于向受试者施用。
[0053] 在第四个、第五个、第六个、第七个、第八个和第九个方面的一个实施方案中，疫苗在向受试者施用之后能够减少受试者中CD103+、b220+、CD8α+细胞的数目和/或增加受试者中CD11b+、CD103-、b220-、CD8α-细胞。CD103+、b220+、CD8α+细胞和/或CD11b+、CD103-、b220-、CD8α-细胞可对抗原抗原具有特异性。抗原可为HIV抗原(例如HIV gag、pol和/或env抗原)。
[0054] 在第一个、第二个、第三个、第五个、第六个、第八个和第九个方面的一个实施方案中，免疫细胞为T淋巴细胞。
[0055] 在第一个、第二个、第三个、第五个、第六个、第八个和第九个方面的一个实施方案+中，免疫细胞为CD8T淋巴细胞。
[0056] 在第一个、第二个、第三个、第五个、第六个、第八个和第九个方面的一个实施方案+中，免疫细胞为细胞毒性CD8T淋巴细胞。
[0057] 在上述方面的一个实施方案中，抗原为病毒抗原。
[0058] 在上述方面的一个实施方案中，抗原为人免疫缺陷病毒抗原。
[0059] 在上述方面的一个实施方案中，抗原为选自以下的人免疫缺陷病毒抗原：gp120env、gp140env、gp160env、p18、gag、pol、vif、vpr、vpu、tat、rev和nef基因产物，和其组合。
[0060] 在上述方面的一个实施方案中，抗原为选自以下的人免疫缺陷病毒抗原：gag、pol或env基因产物，或其任何组合。
[0061] 在上述方面的一个实施方案中，抗原为选自组合的gag/pol，或组合的gag/pol/env基因产物的人免疫缺陷病毒抗原。
[0062] 在上述方面的一个实施方案中，抗原和白介素-4受体拮抗剂依次向受试者施用。
[0063] 在上述方面的一个实施方案中，抗原和白介素-4受体拮抗剂同时向受试者施用。
[0064] 在上述方面的一个实施方案中，抗原和白介素-4受体拮抗剂作为初免剂量向受试者施用。
[0065] 在上述方面的一个实施方案中，IL-4R拮抗剂为能够与IL-4Rα结合并且防止IL-4R信号传导的白介素-4受体α链(IL-4Rα)拮抗剂。
[0066] 在上述方面的一个实施方案中，IL-4R拮抗剂为缺乏信号肽并且包括选自以下的一种或多种突变的人白介素-4分子：在残基121上的突变、在残基124上的突变、在位置123之后一个或多个残基的缺失、白介素-4基因的外显子2编码的片段的缺失，或其任何组合。
[0067] 在第十个方面中，本发明提供一种组合物，其包含：
[0068] (i)抗原和/或编码抗原的多核苷酸；以及
[0069] (ii)白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂和/或编码IL-4R拮抗剂的多核苷酸。
[0070] 在第十一个方面中，本发明提供抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂在制备用于预防或治疗受试者感染的药物中的用途。
[0071] 在第十二个方面中，本发明提供抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂在制备用于针对感染向受试者进行疫苗接种的药物中的用途。
[0072] 在第十三个方面中，本发明提供抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂，其用于预防或治疗受试者感染。
[0073] 在第十四个方面中，本发明提供抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂，其用于针对感染向受试者进行疫苗接种。
[0074] 在第十一个方面的一个实施方案中，药物为疫苗。
[0075] 在第十三个方面的一个实施方案中，抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂为疫苗的组分。
[0076] 在第十一个和第十三个方面的一个实施方案中，疫苗包含第一组分和第二组分，其中第一组分包含白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂并且第二组分包含抗原，并且其中第一组分和第二组分用于，或配制用于同时或依次向受试者施用。
[0077] 在第十一个和第十三个方面的一个实施方案中，疫苗用于作为初次剂量、加强剂量或两者向受试者施用或配制用于向受试者施用。
[0078] 在第十二个方面的一个实施方案中，药物用于作为初次剂量、加强剂量或两者向受试者施用或配制用于向受试者施用。
[0079] 在第十四个方面的一个实施方案中，抗原和白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂用于作为初次剂量、加强剂量或两者向受试者施用，或配制用于向受试者施用。
[0080] 在第十一个和第十三个方面的一个实施方案中，疫苗在向受试者施用之后能够减少受试者中CD103+、b220+、CD8α+细胞的数目和/或增加受试者中CD11b+、CD103-、b220-、CD8α-细胞。CD103+、b220+、CD8α+细胞和/或CD11b+、CD103-、b220-、CD8α-细胞可对抗原抗原具有特异性。抗原可为HIV抗原(例如HIV gag、pol和/或env抗原)。
[0081] 在第十二个和第十四个方面的一个实施方案中，所述接种能够减少受试者中CD103+、b220+、CD8α+细胞的数目和/或增加受试者中CD11b+、CD103-、b220-、CD8α-细胞。CD103+、b220+、CD8α+细胞和/或CD11b+、CD103-、b220-、CD8α-细胞可对抗原抗原具有特异性。抗原可为HIV抗原(例如HIV gag、pol和/或env抗原)。
[0082] 在第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，抗原提供为编码抗原的多核苷酸。
[0083] 在第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，白介素-4受体提供为编码白介素-4受体抗原的多核苷酸。
[0084] 在第十个、第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，所述多核苷酸中的任何一种或多种为重组病毒的组分。
[0085] 在第十个、第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，重组病毒为痘病毒。
[0086] 在第十个、第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，重组病毒为选自由以下组成的组的痘病毒：牛痘病毒、减毒牛痘病毒(例如NYVAC)、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒和修饰的牛痘安卡拉病毒。
[0087] 在第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，重组病毒瞬时表达受试者中白介素-4受体(IL-4R)拮抗剂。
[0088] 在第十个、第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，抗原为病毒抗原。
[0089] 在第十个、第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，抗原为选自以下的人免疫缺陷病毒抗原：gp120env、gp140env、gp160env、p18、gag、pol、vif、vpr、vpu、tat、rev和nef基因产物，和其组合。
[0090] 在第十个、第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，抗原为选自以下的人免疫缺陷病毒抗原：gag、pol或env基因产物，或其任何组合。
[0091] 在第十个、第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，抗原为选自组合的gag/pol，或组合的gag/pol/env基因产物的人免疫缺陷病毒抗原。
[0092] 在第十个、第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，IL-4R拮抗剂为能够与IL-Rα结合并且防止IL-4R信号传导的白介素-4受体α链(IL-4Rα)拮抗剂。
[0093] 在第十个、第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，IL-4R拮抗剂为缺乏信号肽并且包括选自以下的一种或多种突变的人白介素-4分子：在残基121上的突变、在残基124上的突变、在位置123之后一个或多个残基的缺失、白介素-4基因的外显子2编码的片段的缺失，或其任何组合。
[0094] 在第十个、第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，突变选自：R121D、Y124D、白介素-4基因的外显子2编码的片段的缺失，或其任何组合。
[0095] 在第十五个方面中，本发明提供一种用于预防或治疗受试者感染的方法，所述方法包括向受试者施用根据第十个方面的组合物。
[0096] 在第十六个方面中，本发明提供一种用于针对感染向受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括施用根据第十个方面的初次剂量和加强剂量。
[0097] 在第十五个和第十六个方面的一个实施方案中，感染为人免疫缺陷病毒感染并且组合物包含选自以下的人免疫缺陷病毒抗原：gag、pol或env基因产物，或其任何组合。
[0098] 在第十一个、第十二个、第十三个和第十四个方面的一个实施方案中，感染为人免疫缺陷病毒感染并且抗原为选自以下的人免疫缺陷病毒抗原：gag、pol或env基因产物，或其任何组合。
[0100] 现将参考附图，仅通过举例的方式描述本发明的优选实施方案，其中：
[0101] 图1示出包括在MVA164与MVA165之间产生的基因间插入位点的MVA del-III合成载体序列，其包括FseI至HindIII位点的序列，并且并入鸡痘病毒早期/晚期启动子。
[0102] 图2示出MVA“HindIII F”插入位点，其中含有FseI至HindIII的多克隆位点(包括上游T5NT早期转录终止信号)已插入在ORF F8L与F7L之间。
[0103] 图3示出对于在猕猴中表达优化的合成SIV mac239gag/pol序列。序列含有在基因上游的合成痘病毒早期/晚期启动子和侧接于限制性核酸内切酶位点以促进克隆的早期转录终止子序列(T5NT)。在重叠区中的翻译期间，基因由于读框移位而表达为融合蛋白。
[0104] 图4为时程图，其示出在与IL-4受体(IL-4R)拮抗剂(IL-4C118)联合疫苗接种+之后HIV KdGag特异性CD8T细胞亲合力。FPV HIVIL-4C118/VV HIV IL-4C118＝用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组牛痘病毒进行加强接种。FPV HIV/VV HIV＝用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组鸡痘病毒进行初次接种，接着用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组牛痘病毒进行加强接种。
[0105] 图5为柱状图，其示出在与IL-4受体拮抗剂联合疫苗接种之后HIV KdGag特异+ +性CD8T细胞亲合力和HIV KdGag特异性CD8T-细胞应答的强度。FPV HIV/VV HIV＝用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组牛痘病毒进行加强接种；FPV HIV IL-4C118/VV HIV＝用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的牛痘病毒进行加强接种；FPV HIV/VV HIV IL-4C118＝用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组牛痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的鸡痘病毒进行加强接种；FPV HIV IL-4C118/VV HIV IL-4C118＝用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组牛痘病毒进行加强接种。
[0106] 图6为柱状图，其示出在与IL-4受体拮抗剂联合疫苗接种之后HIVKdGag特异性+全身(脾)CD8T细胞免疫。灰色柱＝使用编码IL-4受体拮抗剂(IL-4C118)和HIV gag/pol抗原的重组病毒疫苗的引发和进行加强接种。黑色柱-仅使用编码HIV gag/pol抗原(无IL-4受体拮抗剂)的重组病毒疫苗的引发和进行加强接种。
[0107] 图7为柱状图，其示出在IL-4受体拮抗剂(IL-4C118)初次-加强接种之后的HIV +KdGag特异性粘膜(生殖-直肠结节)CD8T细胞免疫。FPV HIV IL-4C118/VV HIV IL-4C118＝用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组牛痘病毒进行加强接种；FPV HIV/VV HIV＝用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组牛痘病毒进行加强接种；
[0108] 图8提供两个图，其表明在IL-4受体拮抗剂或白介素13(IL-13)的存在或不存在+下粘膜流感KdGag攻毒之后保护性免疫的水平，如通过重力损失和CD8T细胞应答所分析。
FPV HIV IL-4C118/VV HIV IL-4C118＝用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组牛痘病毒进行加强接种；FPV HIV/VV HIV＝用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组牛痘病毒加强接种；FPV HIVΔ10/VV HIVΔ10＝用编码HIV gag/pol抗原和IL-13Ra2可溶受体的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol抗原和IL-13Ra2可溶受体的重组牛痘病毒进行加强接种；FPV HIV/VV HIV(IL 13-/-)＝用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码IL-13敲除小鼠中HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组牛痘病毒进行加强接种；(n＝6-14每组；误差棒＝SEM)。
FPV HIV IL-4C118/VV HIV IL-4C118＝用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组牛痘病毒进行加强接种；FPV HIV/VV HIV＝用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组牛痘病毒加强接种；FPV HIVΔ10/VV HIVΔ10＝用编码HIV gag/pol抗原和IL-13Ra2可溶受体的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol抗原和IL-13Ra2可溶受体的重组牛痘病毒进行加强接种；FPV HIV/VV HIV(IL 13-/-)＝用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码IL-13敲除小鼠中HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组牛痘病毒进行加强接种；(n＝6-14每组；误差棒＝SEM)。
[0109] 图9提供两个图，其示出通过ELISpot在加强免疫接种后8个星期测量的记忆全身和粘膜HIV特异性T细胞应答。FPV HIV/VV HIV＝用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol(无IL-4受体拮抗剂)的重组牛痘病毒进行加强接种；FPV HIV IL-4C118/VV HIV IL-4C118＝用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组鸡痘病毒进行初免接种，接着用编码HIV gag/pol抗原和突变体IL-4C118的重组牛痘病毒进行加强接种。
[0110] 图10提供一系列点图，其说明用于评估进行初免接种后24小时肺粘膜中APC亚群的抗原呈递细胞(APC)亚群设门策略。R1＝总APC亚群；R2＝正向散射(FSC)双粘体辨别；R3＝侧向散射(SSC)双粘体辨别；R5＝对MHC II+CD11c+＝APC亚群设门的细胞；APCd＝抗原呈递细胞；DC＝树突细胞；CD11c＝DC标记；1A＝MHC II细胞标记。
[0111] 图11提供一系列点图，其评估初免接种后24h肺粘膜中CD103缔合抗原呈递细胞亚群。FPV-HIV＝表达HIV gag/pol基因的鸡痘病毒或表达HIV gag/pol/env基因的鸡痘病毒；VV-HIV＝表达HIV gag/pol基因的牛痘病毒；MVA-HIV＝表达HIV gag/pol基因的修饰牛痘安卡拉病毒；FPV-HIV IL-13KO＝给予对照疫苗FPV-HIV的IL-13敲除动物；FPV-HIV IL-13Rα2＝鸡痘病毒共表达HIV gag/pol基因和可溶IL-13Ra2的鸡痘病毒或共表达HIVgag/pol/env基因和可溶IL-13Ra2的鸡痘病毒；FPV-HIV C118＝共表达HIV gag/pol基因和IL-4拮抗剂的鸡痘病毒或表达HIV gag/pol/env基因和IL-4拮抗剂的鸡痘病毒；CD11b＝树突细胞标记；CD103＝肺/皮肤特异性T细胞标记；IL-13KO＝IL-13-/-基因敲除小鼠。
[0112] 图12提供一系列点图，其评估初免接种后24h肺粘膜中B220缔合抗原呈递细胞亚群。FPV-HIV＝表达HIV gag/pol基因的鸡痘病毒或表达HIV gag/pol/env基因的鸡痘病毒；VV-HIV＝表达HIV gag/pol基因的牛痘病毒；MVA-HIV＝表达HIV gag/pol基因的修饰牛痘安卡拉病毒；FPV-HIV IL-13KO＝给予对照疫苗接种FPV-HIV的IL-13敲除动物；FPV-HIV IL-13Rα2＝鸡痘病毒共表达HIV gag/pol基因和可溶IL-13Ra2的鸡痘病毒或共表达HIVgag/pol/env基因和可溶IL-13Ra2的鸡痘病毒；FPV-HIV C118＝共表达HIV gag/pol基因和IL-4拮抗剂的鸡痘病毒或表达HIV gag/pol/env基因和IL-4拮抗剂的鸡痘病毒；VV-IL13KO＝给予对照疫苗VV-HIV的IL-13敲除动物；VV-HIV IL-13Rα2＝共表达HIV gag/pol基因和可溶IL-13Ra2的牛痘病毒；CD11b＝树突细胞标记；B220＝B细胞标记；C118＝IL-4拮抗剂。
[0113] 图13提供一系列点图，其评估初免接种后24h肺粘膜中CD8缔合抗原呈递细胞亚群。FPV-HIV＝表达HIV gag/pol基因的鸡痘病毒或表达HIV gag/pol/env基因的鸡痘病毒；VV-HIV＝表达HIV gag/pol基因的牛痘病毒；MVA-HIV＝表达HIV gag/pol基因的修饰牛痘安卡拉病毒；FPV-HIV IL-13KO＝给予对照疫苗接种FPV-HIV的IL-13敲除动物；FPV-HIV IL-13Rα2＝鸡痘病毒共表达HIV gag/pol基因和可溶IL-13Ra2的鸡痘病毒或共表达HIVgag/pol/env基因和可溶IL-13Ra2的鸡痘病毒；FPV-HIV C118＝共表达HIV gag/pol基因和IL-4拮抗剂的鸡痘病毒或表达HIV gag/pol/env基因和IL-4拮抗剂的鸡痘病毒。CD11b＝树突细胞标记；CD8α＝树突细胞标记。
[0114] 图14为柱状图，其说明对p24Gag的血清IgG1应答在HIV-IL-4R拮抗剂辅助疫苗接种之后增强。
[0115] 定义
[0116] 除非上下文另外明确指明，否则本申请所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个参照物。例如，短语“病毒”还包括多种病毒。
[0117] 如本文所用，术语“包含”意味“包括”。词语“包含”的变化形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”具有相应的变化的含义。因此，例如，“包含”重组病毒的疫苗可仅由那个重组病毒组成或可包括一中或多种其它组分(例如其它类型的重组病毒)。
[0118] 如本文所用，“治疗有效量”的含义是指本发明中所用的药剂或组合物的量没有毒性但足以得到所需的治疗效果。所需的精确量将随受试者而变化，取决于如治疗的物种、受试者的年龄和一般条件、治疗病状的严重性、施用的具体药剂、施用方式等因素。因此，不可能指明可应用于所有实施方案的精确“有效量”。但是，对于任何给定情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验方法确定。
[0120] 如本文所用，术语“IL-4拮抗剂”涵盖能够预防或抑制IL-4的产生和/或生物功能的任何药剂，例如，IL-4受体(IL-4R)和IL-4受体α链(IL-4Rα)拮抗剂。
[0121] 如本文所用，术语“IL-4R的拮抗剂”、“IL-4R拮抗剂”和“白介素-4受体拮抗剂”可互换使用并且具有相同含义。术语涵盖能够防止或抑制IL-4Rα或包括IL-4Rα的受体复合物起始(即直接经由它们开始)的细胞信号传导通路的活化和/或延长的任何药剂。在一些实施方案中，IL-4R拮抗剂可为以下药剂，这种药剂与IL-4Rα结合而不引发IL-4Rα介导的细胞信号传导，并且从而防止或改变IL-4Rα与一种或多种配体(例如IL-4和/或IL-13)之间的结合相互作用，从而可另外能够在拮抗剂不存在的情况下活化IL-4R受体复合物。在其它实施方案中，IL-4R拮抗剂可为以下药剂，这种药剂与IL-4Rα结合的一种或多种配体(例如IL-4和/或IL-13)，从而阻断或改变配体与IL-4Rα之间的结合相互作用。在其它实施方案中，IL-4R拮抗剂可为以下药剂，这种药剂能够抑制或阻断已由IL-4Rα或包括IL-4Rα的受体复合物引发(即经由它们开始)的细胞信号传导通路。例如，药剂可与由IL-4Rα或包括IL-4Rα的受体复合物引发(即经由它们开始)的信号传导通路中的下游蛋白质或分子相互作用或修改它们的活性。
[0122] 如本文所用，免疫细胞/免疫细胞种群和给定抗原在上下文中的术语“亲和力”意味引起免疫细胞/免疫细胞种群中抗原特异性应答所需的抗原的量或浓度。
[0123] 如本文所用，术语“抗体”包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM和IgY，全抗体，包括单链全抗体，和其抗原结合片段。抗原结合抗体片段包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包括VL或VH域的片段。抗体可来自于任何动物来源。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可包括单独或与以下中的全部或部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1域、CH2域和CH3域。还包括一个或多个可变区与铰链区、CH1域、CH2域和CH3域的任何组合。抗体可为特异性结合生物分子的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、人源化抗体和人单克隆和多克隆抗体。
[0126] 如本文所用，术语“核苷酸序列”应理解为涵盖DNA序列、RNA序列和互补(cDNA)序列。
[0127] 如本文所用，术语“亲代病毒”应理解为是指可修改以并入外源性遗传物质以形成本发明重组病毒的病毒。
[0128] 如本文所用，术语“重组病毒”应理解为是指包括至少一个外源性核苷酸序列的“亲代病毒”。
[0129] 如本文所用，重组病毒当用于上下文时的术语“外源性核苷酸序列”应理解为涵盖插入到亲代病毒的基因组中以形成重组病毒的任何核苷酸序列。
[0130] 如本文所用，例如像核苷酸序列、多肽、外源性核苷酸序列、外源性多肽、抗原或表位的给定组分当用于上下文时的术语“免疫原性”意味，药剂能够单独或与一种或多种其它药剂组合起作用诱导免疫应答，增强现有免疫应答，或改变现有免疫应答。
[0131] 应理解，如本文考虑的“诱导”免疫应答包括激发免疫应答并且增强先前存在的免疫应答。
[0132] 如本文所用，术语“试剂盒”是指递送材料的任何递送系统。这类递送系统包括允许从一个地方到另一地方地储存、运输或递送反应试剂(例如在适当容器中的标签、参考样品、支持材料等)和/或支持材料(例如缓冲液、进行测定的说明书等)的系统。例如，试剂盒可包括如盒子的一个或多个套罩，其含有相关反应试剂和/或支持材料。术语“试剂盒”包括分段试剂盒和组合试剂盒。
[0133] 如本文所用，术语“分段试剂盒”是指包括两个或更多个单独容器的递送系统，每一容器含有总试剂盒组分的子部分。这些容器可共同或单独输送至预定接受者。包括两个或更多个各自含有总试剂盒的子部分的单独容器的递送系统包括在术语“分段试剂盒”的含义内。
[0134] 如本文所用，“组合试剂盒”是指单个容器中含有反应测定的所有组分(例如单个盒子中容纳每一种所需组分)的递送系统。
[0135] 应理解，本文中参考所述数值使用术语“约”包括所述数值和在所述值的加或减百分之十内的数值。
[0136] 应理解，本文中当指代数值的范围时使用术语“之间”涵盖在范围的每一端点处的数值，例如，长度在10个残基与20个残基之间的多肽包括长度在10个残基的多肽和长度在20个残基的多肽。
[0137] 本文对在先前领域文件的任何描述或来源于那些文件或基于那些文件的说明并非认可这些文件或来源于它们的说明是相关领域的普通一般知识的一部分。
[0138] 出于描述的目的，除非另外说明，否则本文提到的所有文件以全文引用的方式并入本文。
[0139] 详述
[0140] 以下详述足够详细地传达本发明的示例性实施方案使得本领域普通技术人员能够实践本发明。所述的各种实施方案的特征和限制不必要地限制本发明其它实施方案或本发明整体。因此，以下详述不限制本发明的范围，本发明范围仅由权利要求限定。
[0141] 能够对抗病毒抗原引起高亲合力T淋巴细胞应答和/或T淋巴细胞应答的颇大强度的疫苗为本领域中所积极追求的。鉴于粘膜表面为病毒的第一进入入口，在这些位点能够引起应答的疫苗也是合乎需要的。本发明人已鉴别出，抗原特异性T淋巴细胞应答的亲合力和/或强度可通过抑制IL-4显著，即通过减小IL-4的可用性和/或抑制IL-4功能来增强。这可以短暂地进行，以使得正常IL-4水平和功能可在长时期内恢复。
[0142] 因此，本发明的一些方面设计能够增强免疫细胞应答的强度和/或增强免疫细胞对靶标感染性药剂的亲合力的组合物、疫苗和药物。组合物可包含连同能够抑制IL-4的产生和/或活性的组分一起的能够针对感染性药剂诱导免疫的免疫原性组分。或者，免疫原性组分和能够抑制IL-4的产生和/或活性的组分可提供在单独组合物中用于同时施用或依次施用。本发明组合物可提供在试剂盒中。
[0143] 本发明的其它方面涉及用于诱导受试者中抗原特异性免疫应答的方法。所述方法包括施用一种或多种本发明组合物，并且可有效增大受试者中免疫细胞对抗原的亲合力和/或提高对抗原具有特异性的免疫细胞的数目。
[0144] 本发明的又其它方面涉及用于通过施用本文所提供的组合物、疫苗和药物预防和/或治疗感染的方法。所述方法可涉及施用预防性和/或治疗性疫苗。
[0145] 白介素-4(IL-4)拮抗剂
[0146] 如本领域技术人员所已知，IL-4为能够结合两个单独受体复合物的免疫调节细胞因子。I型受体复合物包括白介素-4受体α(IL-4Rα)和普通γ链(γc)。II型受体复合物包括IL-4Rα链但γc由IL-13蛋白质受体α1(IL-13Rα1)链或IL-13蛋白质受体2(IL-13Rα2)链取代。就两种情况而言，仅IL-4Rα链能够结合IL-4，并且IL-4Rα链与γc、IL-13Rα1或IL-13Rα2的异二聚体也是引发细胞信号传导(就IL-4Rα/γc和就IL-4Rα/IL-13Rα1而言经由JAK/STAT通路)所需的。
[0147] 本发明组合物和方法采用IL-4产生和/或功能的拮抗剂。如本说明书的实施例中所说明，已发现IL-4拮抗剂显著提高/增强免疫细胞对共施用的抗原的应答的强度和/或亲合力。在不受理论束缚的情况下，假设抑制免疫应答的局部环境中IL-4产生和/或功能降低对抗原特异性CTL产生和/或功能的抑制效应。因此，当共施用具体抗原时，IL-4+拮抗剂提供抗原特异性细胞(例如抗原特异性CD8T淋巴细胞)的增大的强度和/或亲合力。
[0148] 如本文所考虑的IL-4拮抗剂涵盖能够防止或抑制IL-4的产生和/或生物功能的任何药剂。鉴于IL-4的许多生物功能通过与IL-4R的结合相互作用介导，IL-4产生和/或功能的许多拮抗剂还为IL-4R的拮抗剂(并且反之亦然)。
[0149] IL-4拮抗剂可由于与IL-4的结合相互作用抑制IL-4的产生和/或生物功能。拮抗剂与IL-4之间的结合相互作用可防止IL-4与一种或多种其它分子(例如IL-4Rα)结合或以其它方式与它们相互作用，并且从而抑制IL-4功能和/或产生。就此而言，IL-4与拮抗剂之间的结合相互作用的亲合力可高于IL-4与IL-4以其它方式结合的一种或多种其它分子之间的结合相互作用的亲合力。仅通过非限制实施例，IL-4受体的可溶形式可用作IL-4拮抗剂。这些可突变以便以高亲合力与IL-4结合(例如仅由IL-4Rα链的胞外区组成的可溶IL-4R)。抗体也可用作IL-4拮抗剂。抗体可具有对IL-4R(例如IL-4Rα)或IL-4Rα的配体(例如IL-4)的结合特异性。
[0150] 另外地或替代地，IL-4拮抗剂可通过防止或抑制由IL-4R引发(即经由它开始)的信号传导通路中任何一种或多种下游蛋白质或分子的表达和/或功能来抑制IL-4的产生和/或生物功能。例如，药剂可与由IL-4R或包括IL-4Rα的受体复合物引发(即经由它们开始)的信号传导通路中的下游蛋白质或分子相互作用或修改它们的活性。
[0151] 另外地或替代地，IL-4拮抗剂可由于与IL-4R或其组分(例如IL-4Rα)的结合相互作用抑制IL-4的产生和/或生物功能。就此而言，结合相互作用将一般不引发通过IL-4R介导的细胞信号传导，但是结合亲合力将一般足够防止其它配体与IL-4R或其组分(例如IL-4Rα)结合，或以能够经由IL-4R引发细胞信号传导的方式结合的能力。
[0152] 通过非限制性实施例，IL-4拮抗剂可为与IL-4R或其组分(例如IL-4Rα结合的拮抗剂。这些IL-4拮抗剂还因此为IL-4R拮抗剂和IL-4Rα拮抗剂。结合相互作用一般不经由IL-4R诱导显著水平的细胞信号传导，或诱导任何细胞传导，但相互作用的亲合力足够强大以防止IL-4R的其它配体(例如IL-4和/或IL-13)与IL-4R结合(例如与IL-4Rα结合)，或以能够经由IL-4R引发细胞信号传导的方式结合的能力。
[0153] 在某些实施方案中，IL-4拮抗剂与IL-4Rα结合(并且因此也为IL-4Rα的拮抗剂)。与IL-4Rα结合而基本上不使细胞信号传导发生，同时防止IL-4Rα(或包括IL-4Rα的IL-4R)与其配体之间的相互作用的任何IL-4拮抗剂可用于本发明组合物和方法中。这类拮抗剂为本领域技术人员所熟知的，并且包括例如IL-4Rα的修饰配体(例如突变体IL-4分子)，所述配体能够与IL-4Rα结合而不引发细胞信号传导，因此阻断IL-4R功能。修饰IL-4Rα配体的特定和非限制性实例包括具有以下的IL-4：C-末端突变，如一个或多个C末端残基的缺失(例如本文所述的如IL-4C118的鼠IL-4的分泌形式中酪氨酸残基
119的缺失或取代)和其它哺乳动物IL-4同系物中的等效突变；人或猕猴IL-4的分泌形式(例如本文所述的IL-4C123)中在124位处的酪氨酸的缺失或取代和其它哺乳动物IL-4同系物中的等效突变；剪接变体，如具有IL-4基因的外显子2编码的一个或多个残基的缺失的变体(例如人中的IL-4δ2和其它哺乳动物IL-4同系物中的等效突变)；和人IL-4蛋白质的成熟分泌形式中121位和/或124位和其它哺乳动物IL-4同系物中等效位处的突变(例如人IL-4Y124D突变体或R121D/Y124D IL-4突变体；小鼠Q116D/Y119D IL-4突变体或Y119D突变体)。还考虑到，IL-4Rα特异性抗体还可设计成与IL-4Rα结合而基本上不使细胞信号传导发生。
119的缺失或取代)和其它哺乳动物IL-4同系物中的等效突变；人或猕猴IL-4的分泌形式(例如本文所述的IL-4C123)中在124位处的酪氨酸的缺失或取代和其它哺乳动物IL-4同系物中的等效突变；剪接变体，如具有IL-4基因的外显子2编码的一个或多个残基的缺失的变体(例如人中的IL-4δ2和其它哺乳动物IL-4同系物中的等效突变)；和人IL-4蛋白质的成熟分泌形式中121位和/或124位和其它哺乳动物IL-4同系物中等效位处的突变(例如人IL-4Y124D突变体或R121D/Y124D IL-4突变体；小鼠Q116D/Y119D IL-4突变体或Y119D突变体)。还考虑到，IL-4Rα特异性抗体还可设计成与IL-4Rα结合而基本上不使细胞信号传导发生。
[0154] 许多方法可用于测定IL-4R结合相互作用和/或IL-4R介导的细胞信号传导，并且为本领域技术人员所熟知的。非限制性实例包括表面等离子共振、荧光共振能量转移(TR-FRET)、化学免疫共沉淀、生物发光共振能量转移(BRET)、由电泳迁移率变动测定(EMSA)测量的IL-4依赖性STAT6活化等。
[0155] 抗原
[0156] 本发明组合物和方法采用刺激免疫应答的抗原。包括的抗原特异性免疫应答通过IL-4拮抗剂(例如IL-4Rα拮抗剂)的存在而增强。
[0157] 抗原可为能够刺激受试者中免疫应答的任何分子(例如蛋白质、肽、多糖等)，包括内源性(自体)抗原和外源性(外来)抗原。可使用抗原的组合。
[0158] 在某些实施方案中，抗原为肽抗原。肽抗原可为适于刺激对关注的靶抗原的免疫应答的大小。所用的肽的大小可对于T细胞和/或B细胞表位处理要求来优化。本领域技术人员将认识到，主要组织相容性复合物I类限制的T细胞表位的长度一般在8个氨基酸残基与10个氨基酸残基之间，然而II类限制的T细胞表位的长度一般在12个氨基酸残基与25个氨基酸残基之间。侧翼残基可包括在任一种情况下用于最佳蛋白水解处理(例如2-3个天然侧翼氨基酸残基用于I类限制的T细胞表位)。II类限制的表位可含有特异性结合II类MHC分子的中心9-10氨基酸残基核心，其中核心的任一侧的侧翼残基用于使结合稳定。
[0159] 线性B细胞表位可为至少：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30个氨基酸残基。B细胞表位的大小可为长度小于约500、200、100、80、60、50或40个氨基酸残基。
[0160] 本发明组合物或方法中所用的肽的大小可适于通过抗原呈递细胞将含于肽内的表位呈递到T淋巴细胞和/或B淋巴细胞。
[0161] 鉴别和选择有效抗原肽(例如能够引发免疫应答的最小肽序列)的技术为本领域技术人员所熟知的。仅通过非限制性实例，参考Rappuoli和Bagnoli编,(2011),“Vaccine Design:Innovative Approaches and Novel Strategies”,Caister Academic Press,UK；和 Agudelo 和 Patarroyo,(2010),“Quantum chemical analysis of MHC-peptide interactions for vaccine design”,Mini Rev Med Chem；10(8):746-58，其全部内容以引用方式并入本文。
[0162] 在一些实施方案中，抗原可为病毒抗原。抗原所来源的示例性病毒组分包括被膜、外壳、囊、衣壳、毒素、RNA、DNA和其组合。不存在关于抗原所来源的病毒的具体类型的具体限制。非限制性实例包括疱疹病毒(例如人疱疹病毒(HHV)1-8型)如单纯疱疹病毒I型和II型、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、埃巴氏病毒(epstein barr virus)；肝炎病毒(例如肝炎A、B、C)；正粘病毒(例如流感病毒A型、B型、C型和其重组形式)；黄病毒(例如登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒(例如SARS病毒)；副粘病毒(例如亨德拉病毒、麻疹病毒、仙台病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒)；肠道病毒(例如柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)；披盖病毒(例如风疹病毒)；腺病毒(例如4型和7型)；乳头状瘤病毒(例如人乳头状瘤病毒)；纤丝病毒(例如埃博拉病毒)；布尼亚病毒(例如汉坦病毒、白蛉热病毒)；弹状病毒(例如水泡性口炎病毒；如狂犬病毒的狂犬病病毒)；和逆转录病毒(例如慢病毒如HIV-1、HIV-2、SIV和绵羊髓鞘脱落病毒)。
[0163] 可使用给定病毒的任何合适抗原。单纯疱疹病毒抗原的非限制性实例包括即早蛋白、糖蛋白B、糖蛋白D和VZV抗原9PI和gpII。肝炎病毒的抗原的非限制性实例包括S、M和L包膜蛋白和pre-S表面抗原。合适流感病毒抗原的非限制性实例包括血凝素、神经氨酸酶和其它流感病毒包膜蛋白。日本脑炎病毒抗原的非限制性实例包括蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS 1和NS 1-NS2A。麻疹病毒抗原的非限制性实例包括麻疹病毒融合蛋白。风疹病毒的示例性抗原包括但不限于蛋白E1和E2。示例性轮状病毒抗原包括VP7sc。呼吸道合胞病毒抗原的非限制性实例包括RSV融合蛋白和M2蛋白。示例性狂犬病毒抗原包括但不限于狂犬病毒糖蛋白和狂犬病毒核蛋白。乳头状瘤病毒抗原的非限制性实例包括L1和L2衣壳蛋白和与子宫颈癌相关联的E6/E7抗原。
[0164] 在某些实施方案中，病毒抗原来自逆转录病毒。逆转录病毒可为人免疫缺陷病毒(例如HIV-1或HIV-2)。HIV的合适抗原的非限制性实例包括以下基因产物的抗原：gp120env、gp140env、gp160env、p18、gag、pol、vif、vpr、vpu、tat、rev和nef基因，以及其组合。例如，抗原可为HIV-1gag、pol、env、gag/pol或gag/pol/env基因产物。
[0165] 组合物
[0166] 本发明组合物可包含连同能够抑制IL-4的产生和/或活性的组分一起的能够针对靶标药剂诱导免疫的免疫原性组分(例如抗原)。
[0167] 或者，免疫原性组分(例如抗原)和能够抑制IL-4的产生和/或活性的组分可提供在配制用于同时施用或依次施用的单独组合物中。
[0168] -多肽和蛋白质
[0169] 本发明组合物可包含IL-4拮抗剂(例如IL-4Rα拮抗剂)和/或能够针对靶标药剂诱导免疫的免疫原性组分(例如抗原)。
[0170] 组合物可配制用于注射、吸附或局部施用，促进宿主细胞和组织对拮抗剂和/或免疫原性组分的直接暴露。在某些实施方案中，拮抗剂和/或免疫原性组分可呈纳米粒子的形式提供(参见例如美国专利号7,611,690、7,858,596和8,048,404中所述的方法)。另外地或替代地，组合物可呈适于通过粒子轰击递送的干燥粉末形式配制(参见例如依赖于气体驱动粒子加速的方法，如美国专利号5,584,807、5,865,796和6,010,478中所述的方法；和依赖于气体驱动无针注射的方法，如美国专利号5,299,163、5,383,851和5,993,412中所述的方法)。
[0171] -核酸构建体
[0172] 本发明组合物可包含能够表达编码IL-4拮抗剂和/或能够针对靶标药剂诱导免疫的免疫原性组分(例如抗原)的一或多种多核苷酸的核酸构建体。编码IL-4拮抗剂的多核苷酸可在与编码免疫原性组分的多核苷酸相同或不同的构建体中。核酸构建体可为例如表达载体、质粒载体、病毒载体、phosmid、黏粒、重组病毒或适于插入外来序列、引入细胞中并且随后表达引入序列的任何其它载体构建体。
[0173] 构建体可为以复制子粒子为基础的疫苗载体。非限制性实例包括来源于辛德毕斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)的以α病毒复制子粒子为基础的疫苗载体。
[0174] 编码IL-4拮抗剂和/或免疫原性组分(例如抗原)的多核苷酸可以可操作地连接到调控多核苷酸序列(例如转录和/或翻译控制序列，如启动子序列、5’端非翻译区、3’端非翻译区、c/s-调控区、核糖体结合序列、转录和翻译起始位点等)。启动子可为组成型或诱导型。调控多核苷酸序列可为相容的用于在旨在施用构建体的细胞或组织类型中的表达。
[0175] 应将启动子理解为意味细胞的转录机构识别以引发下游多核苷酸序列的转录的DNA序列。合适启动子的非限制性实例包括：组成型启动子，如一些真核生物病毒中所见的启动子，如腺病毒、多瘤病毒、CMV(例如巨细胞病毒即早基因启动子)、SV40、劳斯肉瘤病毒(例如长末端重复启动子)、禽类肉瘤病毒、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、B型肝炎病毒逆转录LTR区；存在于真核生物基因中的启动子，如：EF-1α启动子、金属硫蛋白基因启动子、肌动蛋白启动子和免疫球蛋白启动子；需要添加用于表达的物质或外源信号的诱导型启动子，如四环素启动子、NFKappaB/UV光、Cre/lox、热休克启动子、可调控RNA聚合酶II启动子(参见PCT公开号WO/2006/135436)；组织特异性启动子，如PCT公开号WO/2006/012221中所述的PSA启动子；和组成型RNA聚合酶III启动子，如5S ARN、ARN 7SLARNt、ARNsn、H1和U6基因的RNA pol III启动子。其它非限制性实例包括人延长因子1α启动子和人泛素c启动子。
[0176] 核酸构建体可使用本领域已知的任何合适方法配制用于递送到靶细胞和组织。
[0177] 在某些实施方案中，构建体可配制用于以裸DNA的形式递送(参见例如美国专利号6,265,387、6,972,013和7,922,709中所述的技术)。
[0178] -重组病毒
[0179] 在一些实施例中，包括在本发明组合物中的核酸构建体可呈重组病毒的形式。一般可将病毒修饰以表达编码一种或多种外源性蛋白质或外源性蛋白质组分的多核苷酸。例如，可改造重组病毒以便表达编码IL-4拮抗剂(例如IL-4Rα拮抗剂)和/或包括一种或多种抗原的免疫原性组分的多核苷酸。
[0181] 关于用以产生本发明重组病毒的特定类型的亲代病毒不存在具体限制。合适亲代病毒的非限制性实例包括逆转录病毒(例如慢病毒，如HIV、HIV-1、HIV-2、FIV、BIV、EIAV、MW、CAEV和SIV)、腺病毒和腺相关病毒、α病毒(例如VEE)、黄病毒和痘病毒(例如牛痘病毒、鸟痘病毒(如鸡痘病毒)和禽痘病毒)。
[0182] 重组病毒可为活重组病毒或活减毒重组病毒。一般来说，重组病毒是具有复制能力的病毒，这意味着它们能够在它们感染的宿主细胞中繁殖。
[0183] 本发明重组病毒包括至少一个外源性核苷酸序列。应理解，在本发明上下文中，核苷酸序列涵盖DNA、RNA和互补(cDNA)序列。
[0184] 如本文所用的外源性核苷酸序列涵盖插入到亲代病毒的基因组中以形成重组病毒的任何核苷酸序列。在某些实施方案中，外源性核苷酸序列编码IL-4拮抗剂(例如IL-4Rα拮抗剂)和/或不同微生物(例如不同病毒)的免疫原性分子(例如抗原)。
[0185] 在不对核苷酸序列的长度施加任何特定限制的情况下，在一些实施方案中序列的长度可在约10个核苷酸至15个核苷酸之间、15个核苷酸至25个核苷酸之间、20个核苷酸至30个核苷酸之间、25个核苷酸至35个核苷酸之间、30个核苷酸至40个核苷酸之间、35个核苷酸至45个核苷酸之间、40个核苷酸至50个核苷酸之间、50个核苷酸至75个核苷酸之间、75个核苷酸至100个核苷酸之间、100个核苷酸至150个核苷酸之间、150个核苷酸至200个核苷酸之间、200个核苷酸至275个核苷酸之间、275个核苷酸至350个核苷酸之间、350个核苷酸至500个核苷酸之间、500个核苷酸至750个核苷酸之间、750个核苷酸至1000个核苷酸之间、1000个核苷酸至1250个核苷酸之间、1250个核苷酸至1500个核苷酸之间、1500个核苷酸至1750个核苷酸之间、1750个核苷酸至2000个核苷酸之间、2000个核苷酸至2500个核苷酸之间、2500个核苷酸至3000个核苷酸之间或大于3000个核苷酸。
[0186] 本发明重组病毒可包括多外源性多核苷酸序列，包括同一外源性序列的一个或多个副本和/或不同外源性序列的组合(例如编码IL-4拮抗剂(例如IL-4Rα拮抗剂)的多核苷酸和编码包括一种或多种抗原的免疫原性组分的多核苷酸)。
[0187] 关于一个或多个外源性多核苷酸序列插入到病毒基因组中的位置不存在具体限制，这将主要依赖于具体多核苷酸和亲代病毒。但是，优选的是，外源性序列插入在病毒基因组中使对翻译病毒多肽的病毒功能、复制和/或蛋白水解处理的不良作用最小的位置处。
[0188] 外源性多核苷酸可插入到病毒的开放阅读框架(ORF)中。例如，多核苷酸可插入在两个病毒基因之间的交叉点处。或者，多核苷酸可插入到不在ORF中的区中的病毒基因组中。例如，多核苷酸可插入到两个不同ORF之间的非编码序列中，5’端到ORF(例如在5’-非翻译区(5’-UTR)中)或3’端到ORF(例如在3’-非翻译区(3’-UTR)中)。
[0189] 插入到亲代病毒中的外源性多核苷酸可包括编码蛋白水解切割位点的至少一个核苷酸序列。若作为单个多肽的组分翻译，蛋白水解切割位点可在促进从其它病毒编码的多肽切割和释放编码多肽方面为有利的。编码蛋白水解切割位点的合适序列和它们并入到其它序列中的方法为此项技术中熟知的并且描述于标准文本中。
[0190] 本发明重组病毒可包括用于从亲代病毒和/或从不同外来病毒引发外源性序列(例如5’端帽、内部核糖体进入位点等)的翻译的至少一个内源性或外源性核苷酸序列。
[0191] 插入到亲代病毒中的外源性多核苷酸可包括用于引导编码IL-4拮抗剂和/或免疫原性组分(例如抗体)在感染细胞(例如内质网)内和/或离开感染细胞的运输的信号肽。
[0192] 根据本发明的重组病毒可使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术和重组核酸技术产生。所利用的具体方法将依赖于所用的亲代病毒和待插入的具体外源性多核苷酸。将外源性核苷酸序列插入到亲代病毒中可使用标准的分子生物学技术完成。合适的技术描述于例如标准文本中，包括Sambrook等,(1989),“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York；和Ausubel等编,(2000-2010),“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons公司。本说明书的实施例也提供对将外源性核苷酸序列插入到亲代病毒中的方法的特定指导。使用这些原理，各种外源性核苷酸序列中的任一个可插入到亲代病毒基因组中。
[0193] 仅通过非限制性实施例，遗传重组可用以通过同源或异源重组事件将外源性多核苷酸性载体转移到亲代病毒。外源性多核苷酸可提供在侧翼有亲代病毒序列的载体中。外源性多核苷酸或侧翼序列可包括可选择的标记。在由载体和亲代病毒感染宿主细胞之后，重组事件可用于用载体的外源性序列置换亲代病毒的外源性序列。这样产生的重组病毒可使用可选择的标记选择。
[0194] 另外地或替代地，可产生重组病毒互补DNA(cDNA)构建体，包括具有在基因组中靶标位置处插入的一个或多个外源性cDNA序列的亲代基因组的cDNA拷贝。这可例如通过经由聚合酶链式反应(PCR)产生病毒基因组的cDNA片段和/或克隆包括片段的质粒来实现。各种遗传片段可使用例如切割遗传cDNA片段的适当限制性位点结合在一起以产生例如可连接到其它片段末端的悬垂端(overhanging end)。以这种方式，病毒基因组的cDNA拷贝可用在所需位置处插入的外源性cDNA序列与针对RNA聚合酶适当定位的启动子序列一起构建。重组cDNA构建体的RNA拷贝可然后使用适当RNA聚合酶产生。病毒RNA转录物可然后使用适当技术(例如电穿孔)转染成适当细胞系(例如BHK-21细胞或维洛细胞)，其中重组病毒的产生可然后发生。
[0195] 从亲株制备重组病毒的合适方法的其它非限制性实例包括：逆转录病毒系统，如美国专利号5,219,740、5,219,740、7,250,299和7,608,273中所公开的系统；α病毒系统，如美国专利号6,465,634和7,811,812中所述的系统；黄病毒系统，如美国专利号5,744,140和8,124,398中所述的系统；腺相关病毒系统，如美国专利号5,173,414、7,022,519和7,125,705中所述的系统；以腺病毒为基础的系统，如美国专利号6,905,862、
7,989,425和6,468,771中所述的系统；痘病毒系统，如美国专利号7,015,024和
7,338,662中所述的系统；和禽痘病毒系统，如美国专利号5,871,742和6,340,462中所述的系统。
7,989,425和6,468,771中所述的系统；痘病毒系统，如美国专利号7,015,024和
7,338,662中所述的系统；和禽痘病毒系统，如美国专利号5,871,742和6,340,462中所述的系统。
[0196] -示例性重组病毒
[0197] 本发明某些实施方案涉及包括重组痘病毒(即痘病毒科)的组合物，并且具体地说痘病毒的脊椎动物痘病毒亚科的组合物。使用这类病毒的有利之处可在于它们的基因组可适应大的外来DNA序列的并入。这继而使得能够改造这些病毒来表达编码全蛋白(例如包括IL-4Rα受体拮抗剂的IL-4拮抗剂和/或包括抗原的免疫原性肽)的异源基因序列。使用这些病毒还可由于包括人的动物中的良好的安全性特征为有利的。
[0198] 仅通过非限制性实施例，如修饰的牛痘病毒安卡拉(MVA)的减毒牛痘病毒和NYVAC可用作亲株以产生重组痘病毒。亲代病毒可具有在它们产生期间移除或失活的一个或多个致病基因。
[0199] 另外地或替代地，如基于金丝雀痘病毒(ALVAC)或鸡痘病毒(TROVAC)的禽痘病毒载体的宿主受限菌株可用作亲株以产生重组痘病毒。
[0200] 重组痘病毒可用于本发明组合物中，以便提供以短暂方式，例如在免疫接种的局部位点处表达IL-4拮抗剂(例如IL-4Rα受体拮抗剂)。当共施用如抗原(例如在同一或单独痘病毒中表达)的免疫原性组合物时，IL-4拮抗剂可增强抗原特异性免疫细胞(例如+CD8T淋巴细胞)以高亲合力的感应。形成的抗重组痘病毒的免疫应答将最终清除病毒，因此意味IL-4拮抗剂瞬时表达而非永久地表达，从而提高安全性特征。
[0201] 在示例性实施方案中，本发明组合物可包括一种或一系列重组牛痘病毒和/或鸡痘病毒。一种或多种重组病毒可包括编码IL-4拮抗剂(例如IL-4Rα受体拮抗剂)、来自感染性微生物(例如致病病毒)的至少一种抗原或两者的一个或多个外源性多核苷酸序列。抗原可为病毒抗原(例如逆转录病毒抗原)。抗原可为HIV-1和/或HIV-2的抗原。抗原可由以下中的一个或多个编码：gp120env、gp140env、gp160env、p18、gag、pol、vif、vpr、vpu、tat、rev和nef基因，或其组合。IL-4拮抗剂可为IL-4的突变体形式，包括使IL-4拮抗剂能够与IL-4Rα结合而不引发细胞信号传递的突变。例如，突变可在残基121和/或124(例如IL-4的成熟分泌人形式的R121D和/或Y124D)处或另一物种的IL-4同系物中的相应位置处。突变可为IL-4基因的外显子2编码的一些或所有残基的缺失。
[0202] -制剂、药物和疫苗
[0203] 本发明组合物和药物可使用本领域普通技术人员已知的方法制备。合适方法的非限制性实例描述于Gennaro等编,(1990),“Remington's Pharmaceutical Sciences”,Mack Publishing公司,Easton,Pennsylvania,USA中。
[0204] 本发明组合物和药物可包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。如本文所考虑的“药学上可接受的”载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂为当向如人或非人动物的具体接受者施用时一般不产生显著不良反应的物质。药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和佐剂一般也与组合物或药物的其它成分相容。合适赋形剂、稀释剂和载体的非限制性实例可见于“Handbook of Pharmaceutical Excipients”第4版,(2003)Rowe等编,The Pharmaceutical Press,London,American Pharmaceutical Association,Washington中。
[0205] 本发明组合物和药物可配制成疫苗。本发明疫苗包括预防性疫苗(即，出于预防感染的目的施用的疫苗)和治疗性疫苗(出于治疗感染的目的施用的疫苗)。本发明疫苗可因此出于预防、改善、缓解或治疗目的向接受者施用。
[0206] 本发明组合物和药物可呈适于注射施用的形式，呈适于口服摄取的制剂(例如像胶囊、片剂、囊片、酏剂)，呈适于局部施用的软膏、霜剂或洗剂的形式，呈适于作为滴眼剂递送的形式，呈适于吸入施用(如通过鼻内吸入或经口吸入)的气雾剂形式，或呈适于胃肠外施用的形式，即皮下、肌内或静脉内注射。
[0207] 如佐剂或生物应答调节剂的补充活性成分还可并入到本发明组合物和药物中。尽管佐剂可包括在本发明药物组合物中，但是它们不必要包括佐剂。就这些而言，可避免使用佐剂所产生的反应原性问题。
[0208] 一般来说，在本发明组合物或药物方面的佐剂活性包括但不限于增强组合物或药物(例如抗原)中免疫原性组分所诱导的免疫应答(定量地或定性的)的能力。这可减小产生免疫应答所需的免疫原性组分的剂量或水平和/或减小产生所需免疫应答所需的免疫接种的数目或频率。
[0209] 任何合适佐剂可包括在本发明组合物或药物内。例如，可利用以铝为基础的佐剂。合适的以铝为基础的佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝和其组合。可利用的以铝为基础的佐剂的其它特定实例描述于欧洲专利号1216053和美国专利号6,372,223中。其它合适佐剂包括弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)；默克佐剂
65(Merck and Company，Rahway，N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，Pa.)；
如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝的铝盐；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不可溶悬浮液；
酰化糖；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；生物可降解微球；单磷酰基脂质A和quil A；水包油乳状液，包括描述于欧洲专利号0399843、美国专利号7,029,678和PCT公开号WO
2007/006939中的乳状液；和/或其它细胞因子，如GM-CSF或白介素-2、白介素-7或白介素-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单磷酰基脂质A(MPL)、霍乱毒素(CT)或它的组成亚单位、热不稳定肠毒素(LT)或它的组成亚单位、toll样受体配体佐剂，如脂多糖(LPS)和其衍生物(例如单磷酰基脂质A和3脱酰单磷酰基脂质A)、胞壁酰二肽(MDP)和呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白。
65(Merck and Company，Rahway，N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，Pa.)；
如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝的铝盐；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不可溶悬浮液；
酰化糖；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；生物可降解微球；单磷酰基脂质A和quil A；水包油乳状液，包括描述于欧洲专利号0399843、美国专利号7,029,678和PCT公开号WO
2007/006939中的乳状液；和/或其它细胞因子，如GM-CSF或白介素-2、白介素-7或白介素-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单磷酰基脂质A(MPL)、霍乱毒素(CT)或它的组成亚单位、热不稳定肠毒素(LT)或它的组成亚单位、toll样受体配体佐剂，如脂多糖(LPS)和其衍生物(例如单磷酰基脂质A和3脱酰单磷酰基脂质A)、胞壁酰二肽(MDP)和呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白。
[0210] 方法
[0211] 本发明提供用于诱导受试者中抗原特异性免疫应答的方法。所述方法可有效增大受试者中免疫细胞对施用抗原的亲合力和/或提高特异于施用抗原的免疫细胞的数目。所述方法可出于预防、改善、缓解和/或治疗目的进行。例如，所述方法可用于预防受试者中的感染(即疫苗接种)和/或治疗受试者中的感染(例如病毒感染、逆转录病毒感染、HIV-1和/或HIV-2感染)。
[0212] 所述方法需要施用本发明的一种或多种组合物、药物或疫苗。因此，所述方法需要施用IL-4拮抗剂，例如像上文标题为“白介素-4(IL-4)拮抗剂”的节中所述的拮抗剂中的任何一种或多种。例如，所述方法可包括施用与IL-4结合的拮抗剂或如与IL-4Rα结合的拮抗剂的IL-4R拮抗剂。所述方法还需要施用免疫原性组分，如包括一种或多种抗原的组分。合适抗原的非限制性实例包括上文标题为“抗原”的节中所述抗原中的任何一种或多种。抗原可来自于如病毒的病原微生物。例如，所述方法可包括施用HIV-1和/或HIV-2的抗原，包括由以下中的任何一种或多种编码的抗原：gp120env、gp140env、gp160env、p18、gag、pol、vif、vpr、vpu、tat、rev和nef基因和其组合(例如gag/pol、gag/pol/env)。
[0213] 所述方法可涉及同时施用IL-4拮抗剂和免疫原性组分，或涉及依次施用IL-4拮抗剂，接着施用免疫原性组分(或反之亦然)。当同时施用时，IL-4拮抗剂和免疫原性组分可提供在同一组合物中，或提供在单独组合物中。组合物可包含一种或多种核酸构建体或包括编码IL-4拮抗剂和/或免疫原性组分的多核苷酸序列的重组病毒(例如一种或多种重组痘病毒，如重组牛痘病毒、重组鸡痘病毒和/或重组MVA病毒)。合适核酸构建体和重组病毒的非限制性实例阐述于上文标题为“核酸构建体”、“重组病毒”和“示例性重组病毒”的亚节中。
[0214] 发明人已鉴别出，抗原特异性免疫细胞应答的强度和/或免疫细胞对抗原的亲合力可通过对抗原的免疫应答的局部环境中IL-4/IL-4R信号传导的短暂拮抗来进一步提+高。例如，高亲合力抗原特异性免疫细胞(例如记忆CD8T细胞)的产生可通过在初始施用抗原之后IL-4拮抗剂(例如IL-4Rα拮抗剂)的短暂表达(例如持续小于1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天或21天的时间)得以提高。
[0215] 用于施用的示例性制剂描述于上文标题为“制剂和疫苗”的亚节中。示例性施用剂量和途径描述于下文标题为“施用剂量和途径”的节中。
[0216] 一般来说，组合物、药物和疫苗以治疗有效量向受试者施用。“治疗有效量”的含义是指本发明中所用的活性组分的量没有毒性但足以得到所需的治疗效果。所需的精确量将随受试者而变化，取决于如治疗的物种、受试者的年龄和一般条件、治疗病状的严重性、所预防的感染的性质、施用的具体药剂、施用方式等因素。因此，不可能指明精确的“治疗有效量”。但是，对于任何给定情况，适当的“治疗有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验方法确定。
[0217] 如本文所考虑的“受试者”包括社会、经济或研究重要性的任何物种的哺乳动物(例如人)和个体，包括但不限于羊、牛、马、猪、猫、犬、鸟、灵长类和啮齿动物物种。
[0218] 本发明方法可用于诱导受试者中对抗与IL-4拮抗剂共施用的抗原的抗原特异性+免疫应答。抗原特异性免疫应答可包括T淋巴细胞(例如CD8T淋巴细胞)。应理解，如本文所考虑的“诱导”抗原特异性免疫应答包括激发免疫应答以及调节先前存在的免疫应答(例如增强或现存的免疫应答)。将抗原与IL-4拮抗剂共施用可增强对抗原具有特异性的免疫应答，这些免疫应答优于通过施用抗原而不施用IL-4拮抗剂实现的免疫应答。
[0219] 另外地或替代地，本发明方法可用于提高免疫细胞对向受试者与IL-4拮抗剂共+施用的抗原的亲合力。免疫细胞可为T淋巴细胞(例如CD8T淋巴细胞)。通过提高免疫细胞对抗原的亲合力，引起免疫细胞/免疫细胞种群中应答所需的抗原的量或浓度减小。将抗原与IL-4拮抗剂共施用可增强免疫细胞对抗原的亲合力，所述亲合力优于通过施用抗原而不施用IL-4拮抗剂实现的亲合力。
[0220] 另外地或替代地，本发明方法可用于提高特异于受试者中抗原的免疫细胞的数+目。免疫细胞可为T淋巴细胞(例如CD8T淋巴细胞)。将抗原与IL-4拮抗剂共施用可提高对抗原具有特异性的免疫细胞的数目，所述数目大于通过施用抗原而不施用IL-4拮抗剂实现的数目。
[0221] 抗原特异性免疫应答的感应和抗原特异性免疫细胞的数目和亲合力可使用本领域技术人员已知的标准方法测定。示例性方法包括但不限于：固相异质测定(例如酶联免疫吸附测定)、溶液相测定(例如电化学发光测定)、扩增发光邻近均质测定、流失细胞测量术、胞内细胞因子染色、功能性T细胞测定、功能性B细胞测定、功能性单核细胞-巨噬细胞测定、四聚体结合和解离测定、五聚体结合和解离测定、树状和网状内皮细胞测定、NK细胞应答的测量、氧化暴发测定、细胞毒素特异性细胞溶解测定和吞噬和凋亡评估。
[0222] 所述方法可包括施用抗原和白介素-4受体拮抗剂的初免剂量，并且随后施用抗原和白介素-4受体拮抗剂的稍后加强剂量。例如，加强剂量可在初免剂量之后至少7天、14天、21天或28天，至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月，或至少1年、2年、
3年、4年或5年施用。引发疫苗剂量的抗原和IL-4拮抗剂可单独地或依次地施用。加强剂量的抗原和IL-4拮抗剂可单独地或依次地施用。初免剂量和加强剂量可通过相同或不同途径施用。例如，初免剂量和加强剂量可粘膜(例如鼻内)、肌内、静脉内或皮下施用。此外，初免剂量可粘膜(例如鼻内)施用来诱导粘膜抗原特异性免疫细胞，并且加强剂量可肌内、皮下或静脉内施用来诱导全身抗原特异性免疫细胞。
3年、4年或5年施用。引发疫苗剂量的抗原和IL-4拮抗剂可单独地或依次地施用。加强剂量的抗原和IL-4拮抗剂可单独地或依次地施用。初免剂量和加强剂量可通过相同或不同途径施用。例如，初免剂量和加强剂量可粘膜(例如鼻内)、肌内、静脉内或皮下施用。此外，初免剂量可粘膜(例如鼻内)施用来诱导粘膜抗原特异性免疫细胞，并且加强剂量可肌内、皮下或静脉内施用来诱导全身抗原特异性免疫细胞。
[0223] 施用剂量和途径
[0224] 本发明组合物、药物和疫苗可通过标准途径向接受者施用，包括但不限于胃肠外(例如静脉内、脊柱内、皮下或肌内)、经口、局部或粘膜(例如鼻内)途径。
[0225] 组合物、药物和疫苗可以隔离方式或以与其它附加治疗药剂组合方式向接受者施用。在将组合物、药物和疫苗与治疗药剂一起施用的实施方案中，施用可为同时的或依次的(即施用组合物/药物/疫苗，接着施用药剂，或反之亦然)。
[0226] 一般来说，组合物、药物和疫苗可以以与施用途径和接受者的身体特征(包括健康状况)相容的方式并且以引起所需效应(即治疗有效性、免疫原性和/或保护性)的这种方式配制。例如，本发明组合物、药物和疫苗的适当剂量可取决于各种因素，包括但不限于：受试者的身体特征(例如年龄、体重、性别)；组合物、药物或疫苗是作为单一药剂还是辅助治疗使用；患者的MHC限制类型；病毒感染的进展(即病理状态)；和本领域技术人员可认识到的其它因素。当测定适当剂量时可考虑到的各种总体考虑描述于例如Gennaro等编,(1990),“Remington's Pharmaceutical Sciences”,Mack Publishing公司,Easton,Pennsylvania,USA；和Gilman等编,(1990),“Goodman And Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics”,Pergamon Press中。
[0227] 本领域技术人员通过常规实验将能够测定有效无毒的量的本文所述抗原和/或IL-4拮抗剂以包括在本发明组合物、药物或疫苗中用于所需治疗结果。一般来说，本发明组合物、药物或疫苗可以以约50微克至约5mg的活性组分的量向患者施用。剂量可以以约50微克至约500微克的活性组分的量。一般来说，有效剂量预期在每24小时每千克体重约0.0001mg至约1000mg活性组分范围内；通常，为约每24小时每千克体重约0.001mg至约750mg；每24小时每千克体重约0.01mg至约500mg；每24小时每千克体重约0.1mg至约500mg；每24小时每千克体重约0.1mg至约250mg；或每24小时每千克体重约1.0mg至约250mg。更通常，有效剂量范围预期为在以下范围内：每24小时每千克体重约1.0mg至约200mg；每24小时每千克体重约1.0mg至约100mg；每24小时每千克体重约1.0mg至约
50mg；每24小时每千克体重约1.0mg至约25mg；每24小时每千克体重约5.0mg至约50mg；
每24小时每千克体重约5.0mg至约20mg；或每24小时每千克体重约5.0mg至约15mg。
50mg；每24小时每千克体重约1.0mg至约25mg；每24小时每千克体重约5.0mg至约50mg；
每24小时每千克体重约5.0mg至约20mg；或每24小时每千克体重约5.0mg至约15mg。
[0228] 通常，在治疗应用中，治疗可用于疾病状态或病状的持续时间。此外，本领域普通技术人员应明白，个体剂量的最佳量和间隔将通过治疗的疾病状态或病状的性质和程度，施用的形式、途径和部位，和治疗的具体个体的性质来决定。最佳条件可使用常规技术得以测定。
[0229] 在许多情况下(例如预防性应用)，具有本发明组合物、药物或疫苗的数次或多次施用可为合乎需要的。例如，组合物、药物或疫苗可施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。施用可为约一周至约十二周间隔，并且在某些实施方案中为约一周至约四周间隔。定期再次施用可就反复暴露于靶标的具体抗原而言为合乎需要的。
[0230] 本领域普通技术人员还应明白，施用的最佳时程可使用治疗测定试验的常规时程确定。
[0231] 在向受试者“协同地”施用两个或更多个实体时，它们可在单一组合物在同一时间施用，或在单独组合物中在同一时间施用，或在单独组合物中在单独时间施用。
[0232] 本发明的某些实施方案涉及以多单独剂量施用组合物、药物或疫苗。因此，本文所述预防(即疫苗接种)和治疗感染的方法涵盖例如在限定时间段内向受试者施用多个单独剂量。因此，本文公开的预防(即疫苗接种)和治疗感染的方法包括施用初免剂量。初免剂量可在加强剂量之前。加强剂量可用于再次疫苗接种的目的。在各种实施方案中，组合物、药物或疫苗施用至少一次、两次、三次或更多次。
[0233] 试剂盒
[0234] 包括组合物、药物和疫苗的适于进行本发明方法的药剂可作为试剂盒中的组分提供。
[0235] 本发明试剂盒可包含有助于进行本发明方法的组分，例如像施用装置、缓冲液和/或稀释剂。试剂盒可包括用于容纳各种组分的容器和用于以本发明方法使用试剂盒组分的说明书。
[0236] 试剂盒可为如本文所定义的分段试剂盒或组合试剂盒。分段试剂盒包含容纳于单独容器中的试剂，并且可包括小玻璃容器、塑料容器等。这类容器可允许试剂在避免试剂的交叉污染同时从一个隔室向另一隔室的有效转移，和以定量方式从一个隔室向另一隔室添加每一容器的药剂或溶液。通常，本发明试剂盒还将包括使用试剂盒组分的说明书从而进行适当方法。
[0237] 例如，试剂盒可包含第一容器和第二容器。第一容器可包含IL-4拮抗剂(例如像与IL-4Rα结合的拮抗剂)。第二容器可包含带有或编码免疫原性药剂(例如一种或多种病毒抗原)的组分。试剂盒可还包含一个或多个其它容器，容器含有例如有助于如所需向受试者施用试剂盒的组分的一个或多个装置以进行本发明方法。
[0238] 本领域普通技术人员将了解，在不脱离广义上描述的本发明的精神或范围的情况下，可对所述特定实施方案中所公开的本发明作出众多的变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被视为是说明性的而不是限制性的。实施例
[0239] 现将参考以下特定实施例描述本发明，所述实施例不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
[0240] 实施例1：疫苗的制备
[0241] -鼠IL-4突变序列的设计和制备
[0242] 将小鼠IL-4C118cDNA使用基因特异性引物和一步RT-PCR试剂盒(QIAGEN)从脾的总RNA扩增。
[0243] 正向引物5’GGATCCACCATGGGTCTCAACCCCCAGCTA 3’(SEQ ID NO:1)含有促进克隆的BamHI(GGATCC)限制性位点和重叠甲硫氨酸起始密码子的共有Kozak翻译起始序列(CCACCATGG)。
[0244] 反向引物5’GAATTCTAATCCATTTGCATGATGCTC 3’(SEQ ID NO:2)含有框内STOP密码子(TAG)的插入以提前终止在成熟分泌蛋白上118位之后的氨基酸序列，从而缺乏完整基因序列编码的20氨基酸信号肽。成熟分泌蛋白的氨基酸118因此对应于完整基因序列的密码子138位(其包括氨基末端可切割信号肽)。终止密码子的插入产生两个末端氨基酸119和120的缺失，从而移除细胞信号传导所需的119位处的必需的酪氨酸。反向引物还含有EcoRI限制性位点以促进DNA亚克隆。
[0245] 将431bp PCR片段(SEQ ID NO:3)直接连接到U尾载体pDrive中并且转化到QIAGEN EZ感受态细胞中(QIAGEN)。将PCR片段在pBluescriptSK+的BamHI与EcoRI位点之间亚克隆，以添加下游HindIII位点，然后以BamHI-HindIII片段的形式亚克隆到pAF09中(参见参考文献7)，与含于载体中的鸡痘病毒早期/晚期启动子ATG密码子在框内。还将小鼠IL-4C118BamHI-HindIII片段亚克隆到pTK7.5A中(参见参考文献9)，在牛痘病毒P7.5早期/晚期启动子下游。
[0246] -共表达IL-4C118的FPV-HIV和VV-HIV疫苗的构建
[0247] 共表达HIV gag/pol(mut)抗原和小鼠IL-4C118的重组病毒使用亲代病毒FPV-HIV 086和VV-HIV 336构建(参见参考文献1)。重组FPV通过用FPV-HIV 086(MOI0.05)感染鸡胚皮肤(CES)细胞培养基，接着使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,USA)用pAF09-IL-4C118转染得以构建。将rFPV通过在含有MX-HAT(2.5mg/ml霉酚酸、250mg/ml黄嘌呤、100mg/ml次黄嘌呤、0.4mg/ml氨基蝶呤(aminopterine)和30mg/ml胸苷)的最低必须培养基(MEM)中CES细胞上病毒的继代来选择，以选择表达gpt(黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶)基因的病毒。含有重组病毒的蚀斑使用含有X-gal(200mg/ml)的琼脂覆盖物(MEM中1％琼脂)鉴别以检测lacZ基因的共表达。将染成蓝色的蚀斑挑出，并且在选择培养基下进行3轮至4轮蚀斑纯化。重组病毒通过PCR确认IL-4C118基因的存在和野生型病毒的缺少。
[0248] 类 似 地，将rVV 通 过 用VV-336(MOI 0.05)感 染H143B TK细 胞 并 且 用pTK7.5A-IL-4C118转染来构建。重组病毒使用含有HAT补充液的MEM来选择，以选择表达含于载体中的单纯疱疹病毒TK基因的病毒。将病毒在选择下蚀斑纯化并且类似于rFPV进行纯度确定。
[0249] 共表达小鼠IL-4C118的重组FPV-092(HIV gagpol和env)和VV337(HIV env)(参见参考文献1)使用上述方法类似地构建。
[0250] 产生的IL-4C118重组病毒的简要描述提供如下。如上文所述，每一重组病毒的构建描述于参考文献1中，并且每一重组病毒可商购自CSIRO生物试剂目录(参见：http://asnet1-mi.act.csiro.au/index.aspx)。
[0251] (i)FPV086为在PE/L(fpv早期/晚期)的控制下表达HIV-1亚型B gagpol(具有特异性突变)的重组鸡痘病毒，并且使用pKG10a插入于FPV-M3的F6,7,9基因座中；
[0252] (ii)VV336为在PE/L(fpv早期/晚期)的控制下表达HIV亚型A/E gagpol(具有特异性突变)的TK阴性重组牛痘病毒，并且使用pJmcs插入于VV-WR-L929的TK基因座中；
[0253] (iii)FPV092为在PE/L(fpv早期/晚期)的控制下表达HIV-1亚型AE gagpol(具有特异性突变)的重组鸡痘病毒，并且使用pKG10a插入于FPV-090(AE env)的F6,7,9基因座中；
[0254] (iv)VV337为在PE/L(fpv早期/晚期)的控制下表达HIV亚型A/E env(具有特异性突变)的TK阴性重组牛痘病毒，并且使用pJmcs插入于VV-WR-L929的TK基因座中。
[0255] -猕猴IL4C123疫苗
[0256] 自然猕猴IL-4cDNA序列获自GenBank数据库(参见GenBank/NCBI参考序列：NM_001032904下的条目–SEQ ID NO:8-9)。设计合成DNA序列(SEQ ID NO:4)，以使得终止密码子紧接着成熟分泌蛋白上的氨基酸123引入，从重组突变蛋白删除羧基末端序列。
通过类推小鼠和人IL4蛋白，删除细胞信号传导所需的124位处的必需酪氨酸。
通过类推小鼠和人IL4蛋白，删除细胞信号传导所需的124位处的必需酪氨酸。
[0257] 将DNA序列如下修饰。将含有BamHI位点和Kozak序列的唯一上游序列包括在内以促进亚克隆并且分别确保蛋白质的有效翻译。还将HindIII位点包括在3’端处以促进克隆到表达载体中。合成DNA序列以通过Genscript USA公司排序。将合成DNA如上文所述在pAF09的BamHI与HindIII位点之间亚克隆，并且使用编码SIV gagpol基因的FPV089分离重组鸡痘病毒。FPV089为在PE/L(fpv早期/晚期)的控制下表达SIV gagpol的重组鸡痘病毒，并且使用pKG10a插入于FPV-M3的F6,7,9基因座中。FPV089的构建描述于参考文献1中，并且FPV089可商购自CSIRO生物试剂目录(参见：http://asnet1-mi.act.csiro.au/index.aspx)。
[0258] 为了将猕猴IL-4C123和SIV gag/pol基因插入并且表达到修饰牛痘安卡拉病毒中，基于MVA“del-III”(图1–SEQ ID NO:10)和牛痘“HindIII-F区”(图2–SEQ ID NO:11)使用GFP-灭瘟素S脱氨基酶(BSD)融合基因作为可选择的标记基因(参见参考文献8)利用基因间插入位点(参见图1和2)发展一系列新载体。使用合成SIV mac239gag/pol序列，将所述序列优化用于猕猴中的表达(图3-SEQ ID NO:12)。序列含有在基因上游的合成痘病毒早期/晚期启动子和在下游侧接限制性核酸内切酶位点以促进克隆的早期转录终止子序列(T5NT)。在重叠区中的翻译期间，基因由于读框移位而表达为融合蛋白。
[0259] 可以设想并且预测，相较于例如包括SIVgagpol基因而无产生的突变体IL-4序列的类似或相同的疫苗，上文产生的猕猴IL4C123疫苗将诱导施用疫苗的猕猴中对抗SIV的免疫应答提高。更确切地说，可以设想并且预测，疫苗将诱导抗原特异性T细胞亲合力提高和/或对抗SIV gagpol基因产物的抗原特异性T细胞应答的强度提高。
[0260] -人IL-4突变序列的设计
[0261] 考虑到猕猴和人中IL-4基因与蛋白质之间的高水平的序列同源性，人IL-4序列也以残基123下的突变设计。
[0262] 人IL-4mRNA序列的非限制性实例提供在GenBank/NCBI参考序列：NM_000589.2中。SEQ ID NO:13提供人IL-4的成熟分泌形式的mRNA和氨基酸序列。
[0263] SEQ ID NO:5提供编码突变体IL-4蛋白(IL-4C123)的人IL-4DNA序列。人IL-4C123通过在密码子148位并入终止密码子(TGA)来设计，以使得蛋白质将在成熟分泌蛋白上的氨基酸123位之后终止，接着删除24氨基酸信号肽。成熟分泌蛋白上氨基酸一位对应于mRNA上密码子25位。这将导致产生缺乏细胞信号传导所需的124位上的必需酪氨酸的突变体IL-4。可以设想并且预期，它的蛋白质将与I型和II型IL-4R结合而无信号传导，从而防止通过外源性IL-4和IL-13活化。
[0264] 上文序列已优化用于当用于疫苗方面时增强人细胞的表达(SEQ ID NO:6)。密码子优化导致罕见FseI限制性位点的产生(GGCCGGCC)。这个限制性位点在向鸡痘和MVA载体中的亚克隆过程期间使用，所以从提出的优化人IL4C123序列移除，而不改变氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
[0265] 可设想并且预测，这些序列编码的人IL-4蛋白突变体将为能够与IL-4受体结合而不在任何显著程度上引发IL-4受体介导的细胞信号传导的IL-4受体拮抗剂。
[0266] 此外，可设想并且预测，相较于例如施用包括抗原/抗原编码而不包括人IL-4蛋白突变体的类似或相同疫苗的人，包括与抗原/抗原编码序列组合的任何一个或多个人IL-4蛋白序列的人疫苗将诱导施用疫苗的人中对抗抗原的免疫应答提高。更确切地说，可以设想并且预测，这种人疫苗将诱导抗原特异性T细胞亲合力提高和/或施用的人中抗原特异性T细胞应答的强度提高。
[0267] 实施例2：IL-4拮抗剂疫苗接种诱导高亲合力CD8+T细胞
[0268] (i)材料和方法
[0269] -小鼠的免疫接种：无病原6-7周龄磁性BALB/c(H-2d)小鼠获自约翰科廷医学研究学院(JCSMR)的动物育种机构。所有动物根据澳大利亚国立大学动物实验伦理准则进行保持并且使用。将小鼠如表1中所述在温和甲氧氟烷麻醉下间隔两个星期使用i.n./7 7
i.m.联合粘膜全身疫苗接种途径用1x 10pfu rFPV接着1x 10pfu rVV进行初期-加强免疫接种，从而表达HIV-1抗原或/和IL-4R拮抗剂。为评估进行加强接种后6个星期的保护性免疫，将小鼠用75蚀斑形成单位(PFU)的流感病毒PR8(A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))进行鼻内攻毒，从而如Ranasinghe等2011(参见参考文献2)中所述表达神经氨酸酶茎中d
的HIV的KGag197-205表位。这使用反向遗传技术(参见参考文献3和4)构建。攻毒之后检测体重10天。
i.m.联合粘膜全身疫苗接种途径用1x 10pfu rFPV接着1x 10pfu rVV进行初期-加强免疫接种，从而表达HIV-1抗原或/和IL-4R拮抗剂。为评估进行加强接种后6个星期的保护性免疫，将小鼠用75蚀斑形成单位(PFU)的流感病毒PR8(A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))进行鼻内攻毒，从而如Ranasinghe等2011(参见参考文献2)中所述表达神经氨酸酶茎中d
的HIV的KGag197-205表位。这使用反向遗传技术(参见参考文献3和4)构建。攻毒之后检测体重10天。
[0270] 表1.本研究中所用的初次加强接种策略。
[0271]初次 加强
1 i.n.FPV-HIV i.m.VV-HIV
2 i.n.FPV-HIV IL-4C118 i.m.VV-HIV
3 i.n.FPV-HIV i.m.VV-HIV IL-4C118
4 i.n.FPV-HIVIL-IL-4C118 i.m.VV-HIV IL-4C118
1 i.n.FPV-HIV i.m.VV-HIV
2 i.n.FPV-HIV IL-4C118 i.m.VV-HIV
3 i.n.FPV-HIV i.m.VV-HIV IL-4C118
4 i.n.FPV-HIVIL-IL-4C118 i.m.VV-HIV IL-4C118
[0272] 所有rFPV和rVV构建体编码HIV-1 gag/pol抗原。表1中所述的所有病毒使用FPV-086和VV-336构建，从而如参考文献1中所述表达HIV gag/pol(mut)蛋白。
[0273] i.n.＝鼻内，i.m.＝肌内。
[0274] -四聚体染色和解离测定：将别藻蓝蛋白缀合的KdGag197-205四聚体在约翰科廷医学研究学院的生物分子资源实验室(Bio-Molecular Resource Facility)合成。将2-5x106脾细胞或粘膜淋巴细胞用抗CD8a-FITC抗体(BD PharMigen，San Diego，CA)和APC缀合的KdGag197-205四聚体在室温下染色并且如先前所述分析(参见参考文献2和5)。
[0275] 类似地，在KdGag197-205四聚体染色之后，如先前所述进行解离测定(参见参考文献2)。设置板以评估每个样品五个时间点(0-60min)。将50μg/ml抗H-2Kd竞争性结合抗体(BD PharMigen，San Diego，USA)添加到每一孔中以防止解离的四聚体重新结合，并且将板以37℃，5％CO2孵育。在每一时间点，将细胞转移到冰冷FACS缓冲液中以停止反应，洗涤并且重悬浮于含有0.5％多聚甲醛的100μl FACS缓冲液中。在FACs Calibur流式细胞仪(Becton-Dickinson，San Diego，USA)上获得100,000个事件，并且使用Cell Quest Pro软件分析。
[0276] -IFN-γ和IL-2 ELISpot测定：将IFN-γ或IL-2HIV特异性T细胞应答如先前所述通过IFN-γ或IL-2捕获ELISpot测定进行测量(参见参考文献2和6)。简单地说，将2x105个脾细胞或GN细胞添加到涂布有5μg/ml小鼠抗IFN-γ或IL-2捕获抗体(BD PharMigen，San Diego，CA)的96孔Millipore PVDF板(Millipore，MA，Ireland)，并且在H-2Kd免疫优势的CD8+T细胞表位，Gag197-205-AMQMLKETI(SEQ ID NO:14)(在JCSMR的生物分子资源实验室合成)的存在下针对IL-2或IFN-γELISpot分别刺激12h或22h。ConA刺激的细胞(Sigma，USA)用作阳性对照，并且未刺激的细胞用作阴性对照。对于两个ELISpot测定，所有步骤准确地如先前所述进行(参见参考文献2和5)。绘制的数据表示为SFU每106个T细胞并且表示平均值±SD。在绘制数据之前从每一刺激的值扣除未刺激的细胞计数。在所有情况下，背景SFU计数是极低的。
[0277] -细胞内细胞因子分析(ICS)：产生HIV特异性CD8T细胞的IFN-γ和INF-α如Ranasinghe等中所述进行分析(参见参考文献2和5)。简单地说，2x 106个淋巴细胞用AMQMLKETI(SEQ ID NO:14)肽以37℃刺激16h，并且用Brefeldin A(eBioscience，CA，USA)进一步孵育4h。将细胞用CD8-APC(BD PharMigen，San Diego，CA)表面染色，然后固定并且透化，之后用IFN-γ-FITC和TNF-α-PE(BD PharMigen，San Diego，CA)进行细胞内染色。每个样品总计100,000个设门事件使用FACS Calibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Diego，CA)收集，并且结果使用Cell Quest Pro软件分析。在绘制图形之前，将未刺激的背景值从数据中扣除。
[0278] -数据的统计学分析：计算SD或SEM，并且使用双尾两样品等变异或不等变异斯氏T检验测定p值。小于0.05的p值被认为是显著的。除非另外说明，否则将实验重复最少三次。
[0279] (ii)结果
[0280] -共表达IL-4可溶拮抗剂的HIV-1疫苗可诱导全身和粘膜HIV特异性CD8+T细胞的高亲合力和高强度：将i.n./i.m.初期-加强免疫接种策略选择用于这些研究，因为HIV是一种粘膜疾病，并且持续的粘膜和全身免疫都是合乎需要的。数据表明，用共表达IL-4R拮抗剂(IL-4C118)(FPV-HIV-IL-4C118/VV-HIV-IL-4C118)的HIV疫苗初期-加强诱导长d久的高亲合力KGag197-205特异性CTL(图4)。接种有FPVHIVgag/pol和VVHIVgag/ppol的小IL-4-/-鼠可在14天内产生高亲合力CD8T细胞，但在8个星期内无法产生高亲合力记忆CD8T细胞。据推测，IL-4因此在正常免疫功能的细胞环境中是必须的，然而以IL-4C118的IL-4R短暂抑制能够诱导长久的高亲合力CTL，伴以更好的保护(图9)。数据还表面，初期中包括IL-4C118在产生高亲合力HIV特异性CD8T细胞亚群方面是有利的(图4)。相反，如果受体仅包括在加强免疫接种(i.n.FPV-HIV/VV-HIV-IL-4C118)中，那么T细胞亲合力更类似于对照i.n.FPV-HIV/i.m.VV-HIV疫苗接种，即使观察到HIV特异性CD8T细胞的强度提高(图5)。
[0281] i.n.FPV-HIV-IL-4C118/i.m.VV-HIV-IL-4C118疫苗策略还诱导产生全身(图6)d和粘膜(图7)KGag197-205特异性CTL的IFN-γ提高。更有趣的是，产生增强的IL-2和IFN-γ(图7)的生殖-直肠(粘膜)CTL为HIV疫苗的令人兴奋的前景，因为用这种性质的疫苗有待IL-2可为一项困难的任务(通常多功能、特异性IL-2产生被认为是保护性免疫的标志)。IL-4拮抗剂疫苗策略能够不仅诱导HIV特异性效应T细胞免疫提高，还诱导全身和粘膜区室中的记忆CD8T细胞(图9)。
[0282] -HIV-1 IL-4拮抗剂疫苗策略可产生稳健的保护性免疫：在加强免疫接种之d后8个星期，将小鼠用表达KGag197-205免疫显性表位的75pfu流感病毒攻毒，并且每天监测体重持续10天。保持体重并且未受到流感病毒感染的小鼠被认为是保护性免疫的量度(参见参考文献2)。接受对照i.n FPV-HIV/i.m.VV-HIV免疫接种的攻毒后IL-13-/-小鼠与接受相同疫苗的野生型BALB/c小鼠相比体重未显著损失(图8B)。有趣的是，接受i.n.FPV-HIV-IL-4C118/i.m.VV-HIV-IL-4C118疫苗的小鼠表现得极类似于接受对照疫苗的IL-13-/-小鼠或用可溶IL-13抑制剂疫苗(i.n.FPV-HIV-IL-13RΔ10/i.m.VV-HIV-IL-13RΔ10)测试的小鼠(图8A和8B)。从攻毒后五天，相较于接受对照接种p<0.05的野生型BALB/c小鼠，上文三个疫苗接种组的恢复率显著更高。上文保护性数据与给以i.n.FPV-HIV/i.m.VV-HIV疫苗的IL-13-/-小鼠或接受i.n.FPV-HIV-IL-13RΔ10/+
i.m.VV-HIV-IL-13RΔ10的BALB/c小鼠的CD8T脾细胞的解离速率良好地相关(图4)，并且还和观察到的效应子/记忆粘膜和全身免疫应答(通过IFN-γ和IL-2产生测量)良好地相关(图6、7和9)。未免疫接种的小鼠展示在第七天内高达20-24％的体重损失，并且展示在攻毒后第十天的恢复体征(图8B)。在十天，IL-4拮抗剂疫苗展示相较于对照疫苗接种策略显著更高的IFN-γ应答。数据清楚地表明，IL-4拮抗剂疫苗策略可产生优异的保护性免疫。
i.m.VV-HIV-IL-13RΔ10的BALB/c小鼠的CD8T脾细胞的解离速率良好地相关(图4)，并且还和观察到的效应子/记忆粘膜和全身免疫应答(通过IFN-γ和IL-2产生测量)良好地相关(图6、7和9)。未免疫接种的小鼠展示在第七天内高达20-24％的体重损失，并且展示在攻毒后第十天的恢复体征(图8B)。在十天，IL-4拮抗剂疫苗展示相较于对照疫苗接种策略显著更高的IFN-γ应答。数据清楚地表明，IL-4拮抗剂疫苗策略可产生优异的保护性免疫。
[0283] -小鼠中引发和/或加强IL-4拮抗剂疫苗诱导的T细胞应答的强度和亲合力：进+行实验以测定IL-4拮抗剂施用对CD8T细胞亲合力和强度在初次和/或加强疫苗阶段的影响。
[0284] T细胞应答用四聚体染色测量。如图5中所示，以共表达IL-4拮抗剂IL-4C118[(i)FPV-HIV-IL-4C118/(ii)VV-HIV；或(i)FPV-HIV-IL-4C118/(ii)VV-HIV-IL-4C118]的HIV疫苗的加强诱导高亲合力CTL。以共表达IL-4拮抗剂IL-4C118[(i)FPV-HIV-IL-4C118/+(ii)VV-HIV-IL-4C118]的HIV疫苗的引发和加强高亲合力和高强度CD8T细胞应答。但+
是，仅以加强剂量[(i)FPV HIV/(ii)VV HIVIL-4C118]递送IL-4拮抗剂仅诱导CD8T细胞应答的高强度，但不诱导高亲合力。
是，仅以加强剂量[(i)FPV HIV/(ii)VV HIVIL-4C118]递送IL-4拮抗剂仅诱导CD8T细胞应答的高强度，但不诱导高亲合力。
[0285] -由小鼠中引发和加强IL-4拮抗剂疫苗诱导的全身T细胞应答：进行实验以测定+通过以IL-4拮抗剂引发和加强诱导的全身CD8T细胞免疫的水平。如图6中所示，细胞内细胞因子染色表明，以初期和进行加强接种递送的IL-4拮抗剂(IL-4C118)(灰色条纹)可+ +
增强全身HIV特异性CD8IFNγT细胞的感应。
增强全身HIV特异性CD8IFNγT细胞的感应。
[0286] -由小鼠中引发和加强IL-4拮抗剂疫苗诱导的粘膜T细胞应答：进行ELISPOT测+定以测定通过以IL-4拮抗剂引发和加强诱导的粘膜CD8T细胞免疫的水平。如图7中所示，ELISPOT数据表明，以初期和进行加强接种递送的IL-4拮抗剂(IL-4C118)可增强可表+ +
达IFNγ和白介素2(IL-2)的HIV特异性粘膜CD8 T细胞的感应。
达IFNγ和白介素2(IL-2)的HIV特异性粘膜CD8 T细胞的感应。
[0287] 实施例3：FPV HIV IL-4拮抗剂疫苗的评估
[0288] (i)材料和方法
[0289] -针对肺抗原呈递研究的小鼠的免疫接种：无病原6-7周龄磁性BALB/c(H-2d)小鼠获自约翰科廷医学研究学院(JCSMR)的动物育种机构。所有动物根据澳大利亚国立大学(ANU)动物实验伦理准则进行保持并且使用。将小鼠(n＝3-5)在温和甲氧氟烷麻醉下鼻7
内免疫接种1x 10pfu不同重组FPV、VV或MVA HIV疫苗构建体(参考上文实施例1和2)。
紧接在递送之前，将病毒稀释于磷酸缓冲盐水(PBS)中，最终体积为25微升/小鼠，并且超声处理20-30s以获得均匀的病毒悬浮液。
内免疫接种1x 10pfu不同重组FPV、VV或MVA HIV疫苗构建体(参考上文实施例1和2)。
紧接在递送之前，将病毒稀释于磷酸缓冲盐水(PBS)中，最终体积为25微升/小鼠，并且超声处理20-30s以获得均匀的病毒悬浮液。
[0290] 将FPV早期/晚期启动子和HIV gagpol使用引物和PCR从FPV092扩增。
[0291] FseIFPVel GGGCCGGCCCATTTAGTATCCTAAAATTGAATTG
[0292] SalIKG10a CCTTTTTAACAACCATGGGTCGAC
[0293] 将产物与GFP-BSD盒一起连接到MVA载体中，选择用以构建图2中所述的pMVA“F位点”。重组MVA-HIV gagpol通过对鸡皮肤细胞的Blasicidine抗性选择，并且通过针对gag的GFP表达和PCR确认。
[0294] -肺细胞样品的制备：将肺样品首先切割成小片，并且在含有2mg/mL胶原酶(Sigma，USA)、2.4mg/mL分散酶(GIBCO，USA)和5个单位/毫升DNAse(Calbiochem，USA)的2mL完全RPMI缓冲液中以37℃在轻微涡旋下消化1h。然后将样品过滤穿过细胞过滤器，用完全RPMI冲洗，红细胞溶解并且过滤穿过无菌纱布以移除碎片，如先前所述(参见参考文献2、10和11)。将单细胞悬浮液然后保持在4℃持续最少4-6h用于恢复，之后进行测定，因为我们已观察到，消化科降低一些表面标记的调节表达。
[0295] -使用FACS评估抗原呈递细胞：将BALB/c和IL-13KO小鼠用对照FPV-HIV免疫，并且另一组BALB/c小鼠用不同疫苗免疫。疫苗接种后24小时，将小鼠实施安乐死并且收6
集肺，并且如上文所述制备单细胞悬浮液。从每一样品等分4x 10个细胞，并且首先将细胞用Fc阻断抗体(抗小鼠CD16/CD32Fc Block，BD Biosciences，USA)以40℃孵育20min，并d
且将细胞用荧光标记的抗MHCII I-A、CD11c、CD11b、B220、CD8a、CD103(Biolegend，USA或e-Biosciences，USA)抗体以40℃表面染色30min。固定细胞，并且每个样品总计500,000个设门事件使用Fortessa流式细胞仪(Becton Dickinson，San Diego，CA)收集，并且结构使用Cell Quest Pro软件分析。
集肺，并且如上文所述制备单细胞悬浮液。从每一样品等分4x 10个细胞，并且首先将细胞用Fc阻断抗体(抗小鼠CD16/CD32Fc Block，BD Biosciences，USA)以40℃孵育20min，并d
且将细胞用荧光标记的抗MHCII I-A、CD11c、CD11b、B220、CD8a、CD103(Biolegend，USA或e-Biosciences，USA)抗体以40℃表面染色30min。固定细胞，并且每个样品总计500,000个设门事件使用Fortessa流式细胞仪(Becton Dickinson，San Diego，CA)收集，并且结构使用Cell Quest Pro软件分析。
[0296] -针对抗体研究的小鼠的免疫接种：无病原6-7周龄磁性BALB/c(H-2d)小鼠获自约翰科廷医学研究学院(JCSMR)的动物育种机构。所有动物根据澳大利亚国立大学(ANU)动物实验伦理准则进行保持并且使用。将小鼠(n＝5)在温和甲氧氟烷麻醉下间隔两个星7 7
期使用i.n./i.m.联合粘膜全身疫苗接种途径用1x 10pfu rFPV接着1x 10pfu rVV初次-加强免疫接种，从而表达HIV-1抗原或/和IL-4拮抗剂。紧接在递送之前，将rFPV和rVV稀释于磷酸缓冲盐水(PBS)中，并且超声处理20-30s以获得均匀的病毒悬浮液，给定鼻内rFPV最终体积为20-25μl，并且递送i.m.rFPV或rVV，每个四头肌50μl。
期使用i.n./i.m.联合粘膜全身疫苗接种途径用1x 10pfu rFPV接着1x 10pfu rVV初次-加强免疫接种，从而表达HIV-1抗原或/和IL-4拮抗剂。紧接在递送之前，将rFPV和rVV稀释于磷酸缓冲盐水(PBS)中，并且超声处理20-30s以获得均匀的病毒悬浮液，给定鼻内rFPV最终体积为20-25μl，并且递送i.m.rFPV或rVV，每个四头肌50μl。
[0297] -血清收集：将血清从免疫前小鼠收集，并且还在加强免疫接种后2-8个星期收集。将血通过尾部静脉穿刺收集，并且血清通过离心分离并且储存在-20℃直到测定。
[0298] HIV-1 p24Gag特异性血清酶联免疫吸附测定(ELISA)：ELISA用以测定HIV-1 p24Gag特异性IgG1和IgG2a血清抗体滴度。将Falcon Microtest III板(Becton Dickinson，Oxnard，CA)用HIV-1 p24Gag(由NIH AIDS研究和参考试剂计划友好提供)的硼酸盐缓冲液(Pierce)涂布，以4℃过夜。将板用0.05％Tween20的PBS(PBST)洗涤5次，并且将非特异性结合位点通过添加5％脱脂牛奶/PBST，以200微升/孔在37℃阻断2小时。将板然后如之前洗涤，并且将稀释于5％脱脂牛奶/PBST的血清样品以50μl的体积添加到每一孔中。将血清样品双重稀释从1/50至1/400。将板以37℃孵育1.5h并且用PBST如所指出洗涤。将于1％牛血清白蛋白/PBST(Sigma)(BSA/PBST)中稀释至1:500的第二抗体，生物素缀合的抗小鼠IgG1或抗小鼠IgG2a(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)以50μl体积添加到相应孔中，并且以4℃孵育过夜。将板用PBST洗涤5次，并且将1％BSA/PBST于中稀释1:1000的50μl辣根过氧化物酶缀合的抗生蛋白链菌素(HRP-SA，Amersham Life Science)添加到每一孔中。将板以37℃孵育1.5h，用PBS洗涤5次，并且将抗体使用溶解于二甲亚砜(Sigma)中并且稀释于TMB柠檬酸盐/磷酸盐底物缓冲液(Sigma)中的0.01mg/ml四甲基联苯胺(TMB)(Sigma)底物检测。在405nm处以15min和30min读取每一孔中的光密度(OD)。
[0299] (ii)结果
[0300] 为评估鼻内IL-4拮抗剂初期如何在i.n.递送之后诱导高亲合力CD8T细胞，评估肺粘膜中的APC亚群。将BALB/c和IL-13-/-小鼠(n＝3)如上文所述用不同疫苗鼻内免疫接种。疫苗接种后24小时收集肺并且将细胞如上文所述染色。
[0301] 图10提供一系列点图，其说明用于评估肺粘膜中APC亚群的抗原呈递细胞(APC)亚群设门策略。FACS曲线示出对活细胞预设门，接着基于正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)d双粘体辨别，并且对MHCII I-A+和CD11c+种群设门的细胞，顶部图块(R5门)。然后使用d
这个MHCII I-A+CD11c+门，分析表达各种水平CD11b、B220、CD103、CD8的肺APC亚群。
这个MHCII I-A+CD11c+门，分析表达各种水平CD11b、B220、CD103、CD8的肺APC亚群。
[0302] 初免接种后24小时评估CD103缔合小鼠肺粘膜的抗原呈递细胞亚群。如图11中所示，相较于接受对照疫苗的野生型BALB/c小鼠或IL-13-/-(敲除)小鼠，鼻d内(i.n.)FPV-HIV-C118递送诱导肺粘膜中IA+CD11c+CD11b+CD103-APC亚群提高和d d
IA+CD11c+CD11b-CD103+种群减小。数据表明，IA+CD11c+CD11b+CD103-种群在诱导高亲合力CTL中起重要作用。一般来说，相较于rVV或rMVA载体，i.n.FPV初期诱导表达肺粘膜中提高的CD11b和较低CD103的APC亚群(上部图块)。
IA+CD11c+CD11b-CD103+种群减小。数据表明，IA+CD11c+CD11b+CD103-种群在诱导高亲合力CTL中起重要作用。一般来说，相较于rVV或rMVA载体，i.n.FPV初期诱导表达肺粘膜中提高的CD11b和较低CD103的APC亚群(上部图块)。
[0303] 初免接种后24小时在肺粘膜中评估B220缔合抗原呈递细胞亚群(图12)。鼻d内FPV-HIV-C118递送诱导肺粘膜中IA+CD11c+CD11b+B220-(参见中间行的最右图块中左上种群)抗原呈递细胞亚群，相较于给予FPV-HIV对照疫苗的野生型BALB/c(左上方图块)或IL-13-/-小鼠(中间行，从左边第二个图块)。类似地，FPV-HIV-C118递d
送诱导作为IA+CD11c+CD11b-CD8-的提高的APC亚群。鼻内重组FPV载体诱导较低的d
IA+CD11c+CD11b-B220+，相较于VV-HIV或MVA-HIV(参见中间行的最右图块中右下种群)。
送诱导作为IA+CD11c+CD11b-CD8-的提高的APC亚群。鼻内重组FPV载体诱导较低的d
IA+CD11c+CD11b-B220+，相较于VV-HIV或MVA-HIV(参见中间行的最右图块中右下种群)。
[0304] 图12中顶部右边行(a)突出显示相较于VV或MVA引发的鼻内FPV引发的重要性。图12中的中间右边行(b)示出，鼻内递送含IL-4R拮抗剂作为佐剂的FPV-HIV疫苗诱导肺粘膜中优异的CD11+B220-树突细胞，并且FPV-HIV-C118初期诱导最高dIA+CD11c+CD11b+B200-树突细胞百分比。图12(c)中底部右边行示出，鼻内递送VV增强肺粘膜中CD11b-B200+DC亚群。这清楚地表明，鼻内FPV引发有益于感应在初免接种而非加强接种期间诱导的高亲合力CD8T细胞。
[0305] 初免接种后24小时评估肺粘膜中CD8缔合抗原呈递细胞亚群(图13)。鼻内FPV-HIV-C118递送诱导较低百分比的树突细胞，这些细胞为肺粘膜中的
d
IA+CD11c+CD11b-CD8+(底部右边图块-行中右下种群表明CD11b-CD8+细胞)，相较于给予对照疫苗的野生型BALB/c(顶部左边图块)或IL-13-/-小鼠(底部左边图块)。类似d
地，FPV-HIV-C118递送诱导APC亚群，所述APC亚群为IA+CD11c+CD11b+CD8-(底部右边图块-左上种群)。鼻内重组FPV-HIV、VV-HIV或MVA-HIV疫苗接种诱导类似百分比的DC，所d
述DC为IA+CD11c+CD11b-CD8+，表明所用载体不影响DC亚群。
d
IA+CD11c+CD11b-CD8+(底部右边图块-行中右下种群表明CD11b-CD8+细胞)，相较于给予对照疫苗的野生型BALB/c(顶部左边图块)或IL-13-/-小鼠(底部左边图块)。类似d
地，FPV-HIV-C118递送诱导APC亚群，所述APC亚群为IA+CD11c+CD11b+CD8-(底部右边图块-左上种群)。鼻内重组FPV-HIV、VV-HIV或MVA-HIV疫苗接种诱导类似百分比的DC，所d
述DC为IA+CD11c+CD11b-CD8+，表明所用载体不影响DC亚群。
[0306] 图14说明在HIV IL-4R拮抗剂辅助疫苗接种之后(加强接种后2个星期)血清IgG1对p24Gag的应答增强。预期这些应答随时间增大，因为观察到最佳抗体应答为疫苗接种后4-8个星期。观察到的应答比给予对照疫苗的IL-13 KO小鼠或接受IL-13Ra2辅助疫苗的组大得多(参考11)。
[0307] (iii)讨论
[0308] 这些结果和其它观察突出显示至少以下点：
[0309] A.当鼻内(i.n.)递送时，新颖的FPV HIV IL-4拮抗剂疫苗可在疫苗接种后12-24h将唯一抗原呈递细胞(APC)募集到肺粘膜，从而最可能引起高亲合
力CTL的感应。数据表明，在FPV-HIV-IL-4拮抗剂疫苗之后所诱导的APC亚群
+ + + - - -
IAdCD11cCD11bCD103B220CD8在调节T细胞亲合力中起关键作用(图10-13)。这些疫苗表现得极类似于给予对照FPV-HIV疫苗的IL-13-/-小鼠(图11-13)。目前APC数据清楚得表明，IL-4和IL-13消耗的细胞环境可将唯一APC亚群趋化到肺粘膜中，提高高亲合力CD8T细胞的感应；
力CTL的感应。数据表明，在FPV-HIV-IL-4拮抗剂疫苗之后所诱导的APC亚群
+ + + - - -
IAdCD11cCD11bCD103B220CD8在调节T细胞亲合力中起关键作用(图10-13)。这些疫苗表现得极类似于给予对照FPV-HIV疫苗的IL-13-/-小鼠(图11-13)。目前APC数据清楚得表明，IL-4和IL-13消耗的细胞环境可将唯一APC亚群趋化到肺粘膜中，提高高亲合力CD8T细胞的感应；
[0310] B.鼻内rPFV初期可相较于重组牛痘或修饰牛痘安卡拉(MVA)将不同APC亚群募集到肺粘膜，从而表明引发载体也在调节亲合力中起重要作用(图1-3)。确切地说，在VV+ + -和MVA之后诱导的IAdCD11cCD11bCD103+种群似乎对亲合力具有负面涵义；
[0311] C.rFPV为极其安全的递送载体，并且它不穿过小鼠中的血脑屏障(数据未示出)。
[0312] D.鼻内FPV HIV IL-4拮抗剂(C118)初期/i.m.VV HIV C118加强疫苗免疫策略即使在加强免疫接种后2个星期还可诱导提高的p24gag IgG1抗体应答。这些应答将通常在加强免疫接种后再增强4-8个星期。
[0313] 实施例1、2和3的参考文献
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