乳腺癌诊断学
阅读：729发布：2020-05-11
专利汇可以提供乳腺癌诊断学专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及检测癌或预测发展癌的患者或测定患癌患者中癌的进展速度的方法和手段，包括测定所述患者样品中RANKL活性和/或OPG的量。，下面是乳腺癌诊断学专利的具体信息内容。
1.RANKL的检测剂和OPG的检测剂用于制备检测癌或预测发展癌的患者的试剂盒的用途，其中所述癌是乳腺癌，其中检测和预测通过测定所述患者样品中RANKL活性和OPG的量来实行。
2.权利要求1的用途，其特征在于RANKL活性通过测定样品中RANKL和/或RANK的量来测定。
3.权利要求1的用途，其特征在于RANKL活性通过测定下列之任何一种的信号传导来测定：RANK，IKK-α，IkB-α，P-NF-κ-B，CyclinD1。
4.权利要求1的用途，其特征在于样品包含患者的乳腺细胞。
5.权利要求4的用途，其特征在于细胞包含激素受体，所述激素受体选自：黄体酮受体及雌激素受体。
6.权利要求5的用途，其特征在于激素受体选自ESR1，ESR2或其异源二聚体受体。
7.权利要求1的用途，其特征在于RANKL在所述患者的血清样品中测定。
8.权利要求1～7之任一项的用途，其特征在于患者由激素治疗。
9.权利要求8的用途，其中患者接收激素替代治疗。
10.权利要求9的用途，其中患者接收用黄体酮或孕酮，或用激素避孕药的激素替代治疗。
11.权利要求1～5之任一项的用途，其中检测和预测通过进一步测定患者样品中月经周期的激素或孕酮或RANKL配体的血清浓度来实行。
12.权利要求11的用途，其中RANKL配体包含被RANKL浓度体内调控的RANKL配体或RANKL调控蛋白。
13.权利要求11的用途，其中检测和预测通过进一步测定样品中的黄体酮和/或孕酮水平来实行。
14.权利要求13的用途，其特征在于由RANKL活性和黄体酮和/或孕酮水平的至少两个值、以及进一步OPG的量来估计发展乳腺癌的风险。
15.权利要求11的用途，其中新-发作乳腺癌通过测定骨保护素与RANKL的比来诊断或预测。
16.试剂盒，其包含RANKL的检测剂和OPG的检测剂，及黄体酮或孕酮的检测剂。
乳腺癌诊断学
【技术领域】
[0001] 本发明涉及乳腺癌诊断学领域。【背景技术】
[0002] 乳腺癌是人中最常见的癌之一，且会在US和欧洲通常影响达8分之一的在她们的生命时间的女性。Women's Health Initiative（WHI）和Million Women Study显示了激素替代治疗（HRT）相关于增加的偶发和致死的乳腺癌的风险。尤其是，百万女性在HRT和避孕药中使用的合成黄体酮衍生物（孕酮）诸如乙酸甲羟孕酮（MPA）显著地增加发展乳腺癌的风险。
[0003] NF-κB配体的受体活化物（RANKL,也被称为ODF,TRANCE,OPGL,TNFSF11）和其受体RANK（TRANCE-R,TNFRSF11A）对于破骨细胞的发育和活化必要。RANKL抑制在为潜在地百万患者预防骨损失的批准的边缘。已克隆及表征RANK和RANKL（US6,017,729,EP0873998,EP0911342,US5,843,678,WO98/46751,WO98/54201）。已在人中的原发性乳腺癌和乳腺癌细胞系中观察到RANKL和RANK二者表达，且已建议，RANKL/RANK系统可无对增殖或死亡感
14
受性的效应地调控上皮肿瘤的骨转移 。
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受性的效应地调控上皮肿瘤的骨转移 。
[0004] Terpos et al.,Blood102(3)(2003):1064-1069描述了用于多发性骨髓瘤，导致骨损伤及干扰骨髓中血细胞产生的癌的发展的预后的标记物。
[0005] Hashimoto et al.,Cancer&Chemotherapy7(31)(2004):1027-1033（摘要）提及，反映破骨细胞和成骨细胞活性的骨代谢标记物（包括可溶性RANKL和OPG）提供骨疾病的严重性和预后的信息。
[0007] WO00/43553A1公开了通过测定雌激素-相关的标记物水平来就乳腺癌筛选女性的方法。在此方法中测定的标记物是自乳腺导管流体获得的芳香酶，芳香酶活性，雌激素合成的副产物和在雌激素合成的上游作用的蛋白效应子。
[0008] Beleut et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America107(7)(2010):2989-2994提供了导致乳腺增殖的机理的调查。主要是，黄体酮驱动乳腺上皮细胞的增殖。
[0009] Leibbrandt et al.,European Journal of Clinical Investigation 39(10)(2009):842-850是成骨细胞和破骨细胞上RANK，RANKL和OPG的功能的综述。
[0010] Reid et al.,Molecular Cancer8(49)(2009):1-10公开了OPG产生由内皮细胞刺激。
[0011] Bo-Ying et al.,Annals of Surgical Oncology17(6)(2010):1675-1681描述了涉及增加的前列腺癌的骨转移的TNFRSF11B基因中特定多态性的鉴定。【发明内容】
[0012] 本申请的目标在于提供鉴定癌的诊断方法和手段。
[0013] 本发明涉及癌中RANKL的特定作用，其为诊断及预测癌和癌发展的使用。
[0014] 根据第1方面，本发明提供检测癌或预测发展癌的患者或测定患癌患者中癌的进展速度的方法，包括测定所述患者样品中的RANKL活性和/或OPG浓度。
[0015] 根据本发明发现，RANK/RANKL通路相关于癌发展，和可用于检测癌及预测癌发作。发现RANKL负责保护细胞免于致癌突变，由于其在由DNA损伤诱导的该突变之后预防细胞死亡。尽管转化突变，细胞存活是癌细胞的一种关键性质。此活性中RANKL的新发现的作用允许RANKL活性和/或OPG浓度与癌发展关联。由此，可估计患者具有或发展癌的似然性。本发明也涉及通过测定受试者样品中的RANKL活性或OPG浓度来鉴定或预测受试者发展癌细胞的风险的方法。
[0016] 根据本发明“预测”应不以绝对意义，即以可以100%确定度预测患者会明确地发展癌的含义解释，但本发明涉及估计患者发展癌的风险。类似地，“检测乳腺癌”也不要求可通过测定RANKL活性鉴定全部癌患者，但患者可具有高的具有癌的变化。因此，测定RANKL活性可首先导致鉴定癌，可能之后是更侵袭性测试。
[0017] 本发明基于结果，RANKL活性-以及其天然的配体OPG的浓度-可与癌发生和发展相关，由此，在优选的实施方式中，可根据发明的方法包括该关联。其例如可能关联阴性对照的数据（例如发展或不发展癌的患者的数据）和/或阳性对照（发展癌的患者的数据）数据，及将该阴性或阳性对照数据与患者样品的RANKL活性比较。此外，为了改善诊断力，监测RANKL活性，即例如以至少或至多例如1周，2周，3周，4周，5周，6周，7周，8周，1个月，2个月，3个月，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月或12个月或更多的特定间隔测量不同时间点的患者样品中的RANKL活性是可能的。在2个或更多时间点的RANKL活性的变化可指示癌发展。在特定实施方式中，其优选在月经周期中相同的时间监测RANKL活性值，由于RANKL活性可被雌性性激素影响。例如，优选的是，在排卵之后固定的量的天测量样品的RANKL活性。
[0018] 在优选的实施方式中，癌是依赖于生长用激素的癌。该激素可为性激素，诸如雌性性激素如黄体酮或雌激素。癌细胞可具有激素受体，尤其黄体酮受体或雌激素受体。雌激素受体的例是ESR1（包含ERα链），ESR2（包含ER-β链）或，诸如混合的ER-α和ER-β链的杂聚体受体。该受体的存在可指示细胞中激素信号传导的需求。尤其是，此信号传导可为RANKL-介导的。RANKL由激素的活化保护癌或癌前细胞免于DNA损伤诱导的细胞死亡。由此这些激素可经增加的RANKL活性支持癌，其可因此用于诊断或预测本发明的癌。
[0019] 根据本发明诊断的优选的类型的癌是在发展，尤其乳腺癌或前列腺癌期间具有性激素依赖性的癌。其他类型的癌包括霍奇金氏淋巴瘤；非-霍奇金氏淋巴瘤；B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤；T-细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤；外周T-细胞白血病，成年T-细胞白血病/T-细胞淋巴瘤；NK细胞肿瘤；大粒状淋巴细胞白血病；郎格尔汉斯细胞组织细胞增多症；骨髓样瘤形成；急性髓性白血病；急性前髓细胞性白血病；急性髓单核细胞性白血病；急性单核细胞性白血病；骨髓增生异常综合征；及慢性骨髓增生病症。在尤其优选的实施方式中，癌是选自肺癌，乳腺癌，乳腺癌，黑色素瘤，肉瘤，前列腺癌，头颈癌，未知的原发性来源的癌，淋巴瘤，白血病，肾癌，及胃肠癌。
[0020] 根据本发明癌可为原发性癌。如在本文显示，甚至达临床癌表现之前2年，可诊断癌性发展，由此癌可通过测定RANKL活性来预测。因此，原发性癌可诊断或预测。此外，诊断或预测复发癌的发展也是可能的。
[0021] 根据本发明，发现RANKL水平在达发展癌之前2年特殊地不同于阴性对照。例如发现血清中的RANKL水平在可例如由常规活组织检查诊断的临床显现癌发作之前12～24个月显著地增加。意外地，RANKL血清水平在显现癌之前5～12个月降低。由与在特定时间发展癌的患者之前取的样品的阳性对照数据比较，关联样品数据及预测未来癌发展是可能的，且甚至直到癌的临床症状的时间可由常规手段，诸如由活组织检查检测。
[0022] RANKL是调控树突细胞及破骨细胞的功能的细胞表面受体RANK的知道的配体。根据本发明，已发现癌发展中的进一步机理。RANKL驱动激素影响的癌发展。该激素可在任何个体中具有正常激素背景或可已人工施用（诸如在激素替代治疗中,在绝经期治疗中或作为避孕药）。此外，已研究及表征癌中此配体的细胞机理和活性。RANKL效应，“RANKL活性”，包括RANKL与RANK结合和其得到到活化。RANK顾名思义还活化IKKα，IκBα，P-NFκB和cyclinD1或活化Id2-p21，MAPK Erk和p38通路。此通路由于RANKL的任何上调可用作发明的诊断方法的指示。同样修饰任何这些因子的活性可用于在本文进一步所述的治疗性方法。因此，此通路的任何成员的任何上调或活化可用来估计“RANKL活性”。多数这些蛋白是细胞内的，且通过使用细胞样品评价它们的浓度是可能的。替代性地或除了估计蛋白浓度之外，例如通过测定细胞，尤其是乳腺组织细胞中的mRNA浓度来测定这些蛋白的表达是可能的。因此本发明包括通过测定RANK，IKK-α，IkB-α，P-NF-κ-B，CyclinD1（Id2-p21,MAPK Erk或p38）中的任何一种的信号传导来测定RANKL活性。任何这些因子的信号传导和活化可例如通过检测和/或定量活化的RANK，IKK-α，IkB-α，P-NF-κ-B和/或CyclinD1或Id2-p21，MAPK Erk和/或p38的量来测量。活化的形式的这些蛋白可例如通过测定这些蛋白的磷酸化的形式或通过测定蛋白聚集物来测定。阴性或阳性对照的比较总是可辅助鉴定一种或更多这些蛋白的增加的活化。但是，就可接近性原因，优选测定患者的血或血清样品中的RANKL浓度。
[0023] RANK不是RANKL的唯一受体。骨保护素（OPG）是可减少RANKL活性（RANKL与RANK结合和其经IKKα,IκBα,P-NFκB和cyclinD1的信号传导通路）的分泌的诱饵受体。此外，RANKL上调OPG表达和可导致增加的OPG浓度，尤其是在血或血清样品中。OPG可通过与其结合减少游离的RANKL的浓度。在本发明的一些实施方式中，RANKL浓度可以其游离的，可溶性形式测定。在其他实施方式中，总RANKL浓度（除了OPG结合的RANKL之外的游离的RANKL）可为癌的指示。尽管，RANKL活性是乳腺癌发展的成因，RANKL浓度的上调进而也可上调其可发挥诊断或预测癌的诊断标记物的作用的调控配体OPG。因此，为诊断目的，术语“测定RANKL活性”包括确定RANKL信号传导通路中或任何RANKL浓度中的任何上调。无论在哪提及RANKL活性，代之以或之外使用OPG浓度也任选地是可能的。在尤其优选的实施方式中，将OPG和RANKL的组合用作发明的预测或诊断的标记物，尤其可使用样品中RANKL随OPG量之间的比。导致降低的游离的可溶性RANKL的增加的OPG浓度最可能是可已在癌发展中起始了第1步骤的增加的RANKL浓度的之前期的结果（无增加的OPG缓冲效应）。因此，与在癌发作的不同阶段期间不同RANKL浓度的发现一致，导致临床癌的发展，OPG是癌发展的类似倒转标记物。因此本发明涉及OPG作为癌的诊断或预后的诊断标记物的用途。
[0024] 在优选的实施方式中，增加的RANKL活性或RANKL血清浓度用于估计癌会在12～24个月之内发展（最可能）。降低的血清RANKL浓度可用于预测癌在5～12个月之内发作，优选与阴性对照比较检测增加和减小二者。优选将RANKL的减小及OPG的增加用作发明的诊断或预测/预后的指示。在优选的实施方式中，比较性阳性对照用于估计直到癌会最可能发展的时间。阴性和阳性对照值可用于关联分析，优选之后是测定统计学意义的统计学分析，例如使用Student氏T-检验比较组。
[0025] RANKL活性优选通过测定样品中RANKL和/或RANK的量来测定。尽管，可分析RANKL/RANK级联之内的任何信号传导因子，以预测乳腺癌发展的发作，优选测定RANKL和/或RANK本身的量。通常RANKL或RANK的量指称样品体积中的浓度或替代性地作为样品中量/细胞。尤其在RANKL的情况中，优选测定尤其血或血清样品中的溶质RANKL浓度。
[0026] 细胞样品优选包含可诊断或指示进一步癌发展的组织的患者的细胞。优选细胞包括乳腺细胞。可由本领域知道的方法，尤其是通过结合配体及检测该结合事件来估计RANKL，RANK或RANKL信号传导通路的任何其他成员的浓度量。优选的配体是针对RANKL或RANK或信号传导通路的任何细胞蛋白的抗体。抗-RANKL-抗体是可商购的，例如地舒单抗，及公开于US2008/107597。为了测定细胞内蛋白，破坏细胞-膜或均质化细胞样品或使用细胞内标记物是通常必需的。优选结合事件通过使用标记物，尤其荧光标记物检测。
[0027] 在进一步实施方式中，通过优选RANKL单独或一种或更多这些因子的组合测定RANKL mRNA水平或RANKL信号传导通路中的任何因子，包括RANK，IKKα，IκBα，P-NFκB和cyclinD1的mRNA水平的浓度来估计RANKL活性是可能的。任何这些因子和尤其是RANKL的增加的表达是作为发展癌的成因的增加的RANKL活性的直接指示，由此可用于诊断或预测癌。
[0028] 此外，RANKL活性可与癌，尤其激素-驱动的癌如乳腺或前列腺癌的进展和扩展相关。癌可具有上皮来源。优选该关联相比发展以特定速度进展的癌的患者的阳性对照样品制造。
[0030] 黄体酮和尤其是其合成衍生物（孕酮）用于绝经后女性中组合的激素替代治疗（HRT），起初为降低发展雌激素-驱动的子宫内膜癌的风险，及为改善绝经症状。乙酸甲羟孕酮（MPA）是在激素避孕药中最常和最久使用的孕酮及通常用于HRT。
[0031] 根据本发明发现，癌发展中的RANKL活性受性激素，包括雌性性激素如雌激素或黄体酮，尤其是由黄体酮或其衍生物（孕酮）影响。因此，在优选的实施方式中，患者由激素治疗，优选接收激素替代治疗，优选用黄体酮或孕酮，或用激素避孕药接收激素替代治疗。孕酮的例是甲羟孕酮（或其乙酸盐,例如17-乙酸盐），炔诺酮，炔孕酮，异炔诺酮，乙酸炔诺酮，二乙酸炔诺醇，左炔诺孕酮，炔诺孕酮，去氧孕烯，孕二烯酮，诺孕酯，屈螺酮，地诺孕素，nesteron，乙酸诺美孕酮，曲美孕酮，他那罗吉，乙酸甲地孕酮，妊娠素，依托孕烯。激素或衍生物优选具有孕酮性效应。
[0032] 天然的激素水平可足以在细胞中诱导癌性突变的癌性RANKL保护。激素也可在受试者中人工增加。在激素替代治疗中或通过使用激素避孕药，一般是性激素的激素水平上调，导致增加的黄体酮水平，其可根据本发明与经RANKL通路的癌的发展相关联。因此，接收激素或激素避孕药或已由激素或激素避孕药治疗的患者处于增加的发展癌的风险。对于这些患者，测定上述RANKL活性特别是癌，癌发展或癌进展的预测。
[0033] 尤其是发现，通过包括测定月经周期的激素或雌性性激素或其功能衍生物（诸如孕酮）和优选将此数据包括进与RANKL活性值在一起的关联中，尤其是相比阴性和/或阳性对照，可改善发明的癌的诊断，预测或癌的进展的预测的预测值。此外，或作为替代，测定样品中RANKL配体的浓度也是可能的。此通过包括与配体可能结合的RANKL的信息来允许游离的血清RANKL浓度的测定的修正。优选的RANKL的配体是RANKL的血清配体，诸如OPG。因此，在还优选的实施方式中，本发明的方法包括确定患者样品中月经周期的激素或其功能衍生物或RANKL配体的血清浓度。RANKL配体可为被RANKL浓度体内调控的RANKL调控蛋白，诸如OPG。
[0034] 该激素的一例是黄体酮和黄体酮衍生物的例是孕酮，诸如乙酸甲羟孕酮（MPA）。尤其是高孕酮或黄体酮水平（例如血清浓度>0.3ng/ml）和RANKL活性可与癌发展相关。因此，在优选的实施方式中，本发明提供通过估计RANKL活性和黄体酮的值（和/或孕酮水平）二者，尤其其血清浓度来测定发展乳腺癌的风险。
[0035] 或者，或此外，本发明也包括确定所述患者样品中，优选血清样品中骨保护素（OPG）的量。骨保护素是可减少游离的血清RANKL浓度的分泌的天然的RANKL配体。此外，OPG可响应血清中增加的RANKL浓度而上调，由此OPG是癌，或发展癌的风险的替代性的或另外的指示物。
[0036] 尤其是，为发明的癌的诊断或预测，优选测定RANKL活性和OPG的浓度，及相比阴性和/或阳性对照关联样品的浓度和活性。为该关联，可使用任何添加，减少或骨保护素和RANKL之间的比。在优选的实施方式中（新-发作）癌通过测定骨保护素与RANKL的比来诊断或预测。意外地，通过使用骨保护素的血清浓度和游离的可溶性RANKL的血清浓度，该比在血清数据中达到非常高的统计学意义。游离的可溶性RANKL是根据本发明测定的RANKL的优选的物质。
[0037] 检测RANKL的手段包括结合配体，尤其抗-RANKL抗体，其特异于RANKL。适合的抗体公开于US2008/107597及可商购，例如抗体地舒单抗。"抗-RANKL-抗体"包括任何功能相当体和其衍生物，包括抗体片段诸如Fab，F(ab)2，Fv或单链抗体（scAb）。特异性结合RANKL活性关联的蛋白和因子，尤其RANKL和RANK和RANKL信号传导通路中的任何蛋白的抗体也包括在本发明中。抗体可通过用全长蛋白，蛋白的可溶性形式，或其片段免疫来产生。本发明的抗体可为多克隆或单克隆，或可为重组抗体，诸如嵌合抗体，其中轻和重链上的鼠恒定区被人序列取代，或CDR-移植的抗体，其中仅互补测定区具有鼠来源。本发明的抗体也可为，例如，由能产生人抗体的转基因动物的免疫制备的人抗体（WO93/12227）。抗体对于检测生物学样品中的RANKL有用，由此允许产生蛋白的细胞或组织的鉴定。
[0039] 试剂盒可包含添加剂，检测剂，洗涤溶液和/或具有各种pH值和离子强度的缓冲剂（Tris,乙酸盐或磷酸盐缓冲剂），增溶剂诸如吐温或聚山梨酯，载体诸如人血清白蛋白或明胶，防腐剂诸如硫柳汞或苄基醇，及抗氧化剂诸如抗坏血酸或偏亚硫酸氢钠。特定试剂盒组成的选择会依赖于许多因素，包括使用的样品。
[0040] 试剂盒可包含RANKL的检测剂，及生理学RANKL配体和/或孕酮的检测剂。优选的组合具有RANKL和生理学RANKL配体的检测剂；或RANKL和雌性性激素的检测剂。"检测剂"是指检测和/或定量样品中的特定分析物的剂。
[0041] 生理学RANKL配体可为OPG。激素可为孕酮，尤其黄体酮。
[0042] RANKL检测剂可为RANKL结合配体，包括合成配体和小分子。优选RANKL结合配体是抗-RANKL-抗体。RANKL结合配体可，诸如由荧光或放射性同位素标记。
[0043] 此试剂盒可用于以上详细描述的测定，预测或预后癌，癌发展或鉴定癌细胞的本发明的方法。
[0044] 在优选的实施方式中，本发明定义如下：
[0045] 1．检测乳腺癌或预测发展乳腺癌的患者或测定患乳腺癌的患者中乳腺癌的进展速度的方法，包括测定所述患者样品中的RANKL活性。
[0046] 2．根据定义1的方法，其特征在于RANKL活性通过测定样品中RANKL和/或RANK的量来测定。
[0047] 3．根据定义1或2的方法，其特征在于RANKL活性通过测定下列之任何一种的信号传导来测定：RANK，IKK-α，IkB-α，P-NF-κ-B，CyclinD1。
[0048] 4．定义1，2或3的方法，其特征在于样品包括患者细胞。
[0049] 5．定义3的方法，其中细胞包括乳腺细胞。
[0050] 6．根据定义4或5的方法，其特征在于细胞包括激素受体，所述激素受体选自：黄体酮受体，雌激素受体，优选选自ESR1，ESR2或异源二聚体受体。
[0051] 7．定义1或2的方法，其特征在于RANKL在所述患者的血清样品中测定。
[0052] 8．定义1～7之任一项的方法，其特征在于癌是乳腺癌。
[0053] 9．定义1～7之任一项的方法，其特征在于癌是前列腺癌。
[0054] 10．定义1～9之任一项的方法，其特征在于患者由激素治疗。
[0055] 11．定义10的方法，其中患者由激素治疗替代治疗或用激素避孕药治疗。
[0056] 12．定义10或11的方法，其中激素是黄体酮或孕酮。
[0057] 13．定义1～12之任一项的方法，还包括确定患者样品中月经周期的激素或其功能衍生物或RANKL配体的血清浓度。
[0058] 14．定义13的方法，其中RANKL配体是被RANKL浓度体内调控的RANKL配体或RANKL调控蛋白。
[0059] 15．定义13的方法，包括测定样品中的黄体酮和/或孕酮水平。
[0060] 16．定义13～15的方法，其中发展乳腺癌或诊断癌的风险由至少RANKL活性值和黄体酮和/或孕酮水平二者估计。
[0061] 17．定义13或16的方法，包括测定所述患者样品中骨保护素的量。
[0062] 18．定义13～17的方法，其中样品是血清样品。
[0063] 19．定义12～18的方法，其特征在于新-发作乳腺癌通过测定骨保护素与RANKL的比来诊断或预测。
[0064] 20．试剂盒，其包含RANKL的检测剂，及生理学RANKL配体和/或孕酮的检测剂。
[0065] 21．根据定义20的试剂盒，包含RANKL和雌性性激素的检测剂。
[0066] 22．根据定义20或21的试剂盒，其中RANKL配体是OPG。
[0067] 23．根据定义20的试剂盒，包含RANKL和雌性性激素的检测剂。
[0068] 24．根据定义23的试剂盒，其中激素是黄体酮。
[0069] 25．根据定义20～24之任一项的试剂盒，其中RANKL检测剂是RANKL结合配体。
[0070] 26．根据定义25的试剂盒，其中RANKL结合配体是抗-RANKL-抗体。
[0071] 27．根据定义25或26的试剂盒，其中RANKL结合配体被标记。
[0073] 图1．黄体酮-衍生MPA经RANK引发体内RANKL表达和乳腺上皮细胞增殖。
[0074] a，在安慰剂处理和MPA移植之后3天对照同窝仔和RANKΔmam雌性的乳腺中的上皮增殖。增殖通过原位Ki67免疫染色测定。b,c，对照中MPA-处理的乳腺中干细胞-富集+ high Δmam的CD24CD49 群（MaSC）的显著的增加，但RANK 乳腺中则不是。b，显示来自MPA-或- -
假-处理的8周龄处女雌性的乳腺MaSC的系阴性（CD31（内皮细胞）CD45（造血细胞）-
TER199（红细胞系细胞））的CD24和CD49表达的代表性的FACS谱。c，自MPA-或假-处Δmam + high
理的处女RANK 和同窝对照雌性的乳腺的MaSC-富集的CD24CD49 群的定量。对于全部MaSC实验，小鼠用MPA处理3天.n=4/组+/-sem。*P<0.05；***P<0.001（Student氏t检验）。
假-处理的8周龄处女雌性的乳腺MaSC的系阴性（CD31（内皮细胞）CD45（造血细胞）-
TER199（红细胞系细胞））的CD24和CD49表达的代表性的FACS谱。c，自MPA-或假-处Δmam + high
理的处女RANK 和同窝对照雌性的乳腺的MaSC-富集的CD24CD49 群的定量。对于全部MaSC实验，小鼠用MPA处理3天.n=4/组+/-sem。*P<0.05；***P<0.001（Student氏t检验）。
[0075] 图2．RANK控制孕酮-驱动的乳腺癌的发生率和发作。
[0076] a，MPA/DMBA致癌方案。给未生育过的，6周龄雌性小鼠皮下移植MPA粒及如指示用floxed/Δ ΔmamDMBA经口治疗8周。b，用MPA粒和DMBA处理的MMTV-Crerank 雌性（RANK ）（n=14）和龄-匹配的同窝对照雌性（n=19）中可触及的乳腺肿瘤的发作，如显示于图2a。数据显示为在最后DMBA攻击之后无肿瘤的小鼠的百分率。对照的中位肿瘤发作在最后DMBA治疗Δmam
之后是11天和对于RANK 雌性是30天。c，在最后DMBA治疗之后22天自对照同窝仔和Δmam
RANK 雌性分离的乳腺肿瘤的代表性的组织切片。显示细胞角蛋白5染色。放大×20。
Δmam
d,e，在最终DMBA治疗之后第7天（d）及第22天（e）对照和RANK 雌性中癌原位和侵袭性乳腺癌的数。数据显示为平均值/小鼠+/-sem。n=3小鼠/基因型。对于各小鼠分析全部10个乳腺。*P<0.05（Student氏t检验）。下图显示在对照雌性中典型侵袭性腺癌的代Δmam
表性的组织切片。对于RANK 雌性，显示正常腺泡形态（第7天）和癌原位（第22天）。显示H&E染色的切片及对于增殖标记物Ki67的免疫染色。放大×20。
之后是11天和对于RANK 雌性是30天。c，在最后DMBA治疗之后22天自对照同窝仔和Δmam
RANK 雌性分离的乳腺肿瘤的代表性的组织切片。显示细胞角蛋白5染色。放大×20。
Δmam
d,e，在最终DMBA治疗之后第7天（d）及第22天（e）对照和RANK 雌性中癌原位和侵袭性乳腺癌的数。数据显示为平均值/小鼠+/-sem。n=3小鼠/基因型。对于各小鼠分析全部10个乳腺。*P<0.05（Student氏t检验）。下图显示在对照雌性中典型侵袭性腺癌的代Δmam
表性的组织切片。对于RANK 雌性，显示正常腺泡形态（第7天）和癌原位（第22天）。显示H&E染色的切片及对于增殖标记物Ki67的免疫染色。放大×20。
[0078] a，响应RANKL刺激（1μg/ml）在分离的原发性小鼠乳腺上皮细胞（MEC）中磷酸化的（P）IKKα，总IKKα，磷酸化的（P）p65NFκB，总p65NFκB，磷酸化的（P）IκBα，及总Δmam ΔmamIκBα的蛋白印迹。β-肌动蛋白显示为装载对照。b，对在对照，RANK 和IKKα 雌性中发展的合并的晚期阶段乳腺癌（对于各泳道n=4）中IKKα，IKKβ，IKKγ，磷酸化的（P）p65NFκB，总p65NFκB，磷酸化的（P）IκBα，及总IκBα的蛋白印迹。β-肌动蛋白显示为Δmam Δmam
装载对照c，在对照，RANK 和IKKα 雌性中发展的晚期阶段乳腺癌中RANK，CyclinD1和p21mRNA的表达。表达通过qRT-PCR测定。数据是平均值+/-sem。n=4/组。d，测定软-琼脂集落形成。响应用RANKL（1μg/ml）或EGF（100ng/ml）刺激的软琼脂中人SKBR3乳腺癌细胞的生长。在含RANKL的培养中18天之后形成的不依赖于固着地，大集落，其由诱饵受体OPG（1μg/ml）防止。对照是未刺激的SKBR3细胞。e，用MPA粒和DMBA治疗的Δmam
IKKα （n=10）和龄匹配的同窝对照（n=11）雌性中可触及的乳腺肿瘤的发作。数据显示为在最后DMBA攻击之后无肿瘤的小鼠的百分率。对照的中位肿瘤发作是在最后DMBA治疗Δmam
之后10天，对于IKKα 雌性是在最后DMBA治疗之后24天。f,gγ-辐射（5Gray）在假Δmam
操作的或移植MPA粒的对照和RANK 雌性同窝仔中诱导乳腺上皮细胞凋亡。凋亡通过对有活性的胱天蛋白酶3的免疫染色来检测。f，对代表性的乳腺切片显示上皮细胞的凋亡性核（箭标）。放大×40。g，乳腺上皮凋亡的定量。对各小鼠计数最少5000个核。结果显示的是平均值+/-sem。n=3小鼠/组。*P<0.05；**P<0.02（Student氏t检验）。
装载对照c，在对照，RANK 和IKKα 雌性中发展的晚期阶段乳腺癌中RANK，CyclinD1和p21mRNA的表达。表达通过qRT-PCR测定。数据是平均值+/-sem。n=4/组。d，测定软-琼脂集落形成。响应用RANKL（1μg/ml）或EGF（100ng/ml）刺激的软琼脂中人SKBR3乳腺癌细胞的生长。在含RANKL的培养中18天之后形成的不依赖于固着地，大集落，其由诱饵受体OPG（1μg/ml）防止。对照是未刺激的SKBR3细胞。e，用MPA粒和DMBA治疗的Δmam
IKKα （n=10）和龄匹配的同窝对照（n=11）雌性中可触及的乳腺肿瘤的发作。数据显示为在最后DMBA攻击之后无肿瘤的小鼠的百分率。对照的中位肿瘤发作是在最后DMBA治疗Δmam
之后10天，对于IKKα 雌性是在最后DMBA治疗之后24天。f,gγ-辐射（5Gray）在假Δmam
操作的或移植MPA粒的对照和RANK 雌性同窝仔中诱导乳腺上皮细胞凋亡。凋亡通过对有活性的胱天蛋白酶3的免疫染色来检测。f，对代表性的乳腺切片显示上皮细胞的凋亡性核（箭标）。放大×40。g，乳腺上皮凋亡的定量。对各小鼠计数最少5000个核。结果显示的是平均值+/-sem。n=3小鼠/组。*P<0.05；**P<0.02（Student氏t检验）。
[0079] 图4．RANK控制癌干细胞自我更新及人乳腺癌患者中的RANKL/OPG血清水平。
[0080] a，自与在e中相同的同群的血清样品中sRANKL和黄体酮的分析。然而，血清黄体酮和RANKL之间无关联可见于对照组（p=0.43），在血清采样后12～24个月发展乳腺癌的女性中sRANKL和血清黄体酮水平之间有清楚的关联。p=0.047（Spearman排序测试）。在血清测试之后6～12个月之内发展乳腺癌的女性中血清黄体酮和RANKL水平无关联（p=0.76）。数据显示为血清黄体酮的函数（低<0.2ng/ml;中等0.2～0.3ng/mL;高>0.3ng/mL）。b，自在她们的随访期间未发展乳腺癌的182个健康绝经后女性和在她们的血清收集之后5～12个月发展ER阳性乳腺癌的41个健康龄-匹配的女性预期地收集的UKCTOCS血清样品中的OPG-sRANKL比的分析。在血清采样之后第1年之内发展乳腺癌的女性中框标绘图显示显著地更高的OPG-sRANKL比。p=0.022（Mann Whitney U测试）。c，自182个健康绝经后女性和在她们的血清收集之后12～24个月发展ER阳性乳腺癌的57个健康龄-匹配的女性的UKCTOCS血清样品中OPG-sRANKL比的分析。观察到无显著差异。
[0082] a，相比对照同窝仔的乳腺，与K5-Cre交配的未生育过的及泌乳（L1）RANKfl/Δ雌性的乳腺组织的全包埋分析。自小叶-肺泡结构的孕育野生型雌性（箭标）中的肺泡，然而fl/Δ flox/Δ此发育在K5-Cre RANK 雌性中的发育不全的肺泡芽（箭标）中被阻拦。b，源于RANKflox/Δ
和RANK ；K5-Cre+雌性的纯化的乳腺上皮细胞的DNA印迹。在将基因组DNA用PvuII和SphI消化之后指示野生型或夹于两个lox P位置之间RANK等位基因（fl/+;9.6kb）和删除的RANK等位基因（Δ;3.9kb）。c，在第1天的哺乳（L1）显示正常小叶-肺泡结构的自对照BALBc nude（nu/nu）雌性的乳腺，用野生型乳腺组织移植的“清除的”nu/nu小鼠中在fl/Δ
L1的正常小叶-肺泡结构，及在用RANK ；K5-Cre乳腺组织移植的“清除的”nu/nu小鼠中在L1的缺陷小叶-肺泡发育的全包埋分析。也显示在手术清除之后nu/nu小鼠的脂肪垫。全部放大率×5。
和RANK ；K5-Cre+雌性的纯化的乳腺上皮细胞的DNA印迹。在将基因组DNA用PvuII和SphI消化之后指示野生型或夹于两个lox P位置之间RANK等位基因（fl/+;9.6kb）和删除的RANK等位基因（Δ;3.9kb）。c，在第1天的哺乳（L1）显示正常小叶-肺泡结构的自对照BALBc nude（nu/nu）雌性的乳腺，用野生型乳腺组织移植的“清除的”nu/nu小鼠中在fl/Δ
L1的正常小叶-肺泡结构，及在用RANK ；K5-Cre乳腺组织移植的“清除的”nu/nu小鼠中在L1的缺陷小叶-肺泡发育的全包埋分析。也显示在手术清除之后nu/nu小鼠的脂肪垫。全部放大率×5。
[0083] 图6．怀孕的MMTV-Cre，RANKfl/Δ雌性中泌乳乳腺的正常形成。
[0084] a，未生育过的同窝对照和RANKfl/Δ；显示正常肺泡/管上皮结构的MMTV-Cre雌性的乳腺组织的H&E分析。放大×10（顶部）和X40（下图）。b，相比对照同窝仔的乳腺，与fl/ΔMMTV-Cre交配的未生育过的及泌乳（L1）RANK 雌性的乳腺组织的全包埋分析。MMTV-Creflox/Δ flox/Δ
介导的RANK缺失未影响泌乳乳腺的形成。c，源于RANK 和RANK ；MMTV-Cre雌性的纯化的乳腺上皮细胞的DNA印迹。在将基因组DNA用PvuII和SphI消化之后指示野生型或夹于两个loxP位置之间RANK等位基因（fl/+;9.6kb）和删除的RANK等位基因（Δ;3.9kb）。
flox/Δ Δmam
RANK ；MMTV-Cre动物此后表示为RANK 。
介导的RANK缺失未影响泌乳乳腺的形成。c，源于RANK 和RANK ；MMTV-Cre雌性的纯化的乳腺上皮细胞的DNA印迹。在将基因组DNA用PvuII和SphI消化之后指示野生型或夹于两个loxP位置之间RANK等位基因（fl/+;9.6kb）和删除的RANK等位基因（Δ;3.9kb）。
flox/Δ Δmam
RANK ；MMTV-Cre动物此后表示为RANK 。
[0085] 图7．MPA在乳腺中诱导RANKL表达和上皮增殖。
[0086] a-c，在安慰剂处理和MPA移植之后3天对照同窝仔和RANKΔmam雌性的乳腺中上皮+增殖的定量，如显示于图1d。a，数据显示为相比假-操作的相应基因型的雌性的总Ki67 上皮细胞的相对变化。计数至少1000个乳腺上皮细胞/小鼠。n=3小鼠/基因型。**P<0.005；
Δmam
***P<0.001（Student氏t检验）。b，在MPA皮下移植之后第3天自对照同窝仔和RANK雌性的乳腺的原位Ki67免疫染色的细胞/腺泡的定量。然而，在对照雌性中，～80%的腺Δmam
泡显示中到高增殖迹象，RANK 雌性中多于60%的腺泡呈现非常低的增殖速度。c，为控制Δmam
动情期-依赖性背景增殖水平，分析超排卵的及假操作的对照同窝仔和RANK 雌性。计数至少1000个细胞/乳腺。n=3/基因型。在b及c中，数据显示为具有低（<20%的上皮+ + +
细胞是Ki67），中（20～80%的上皮细胞是Ki67）和高（>80%的上皮细胞是Ki67）数的增殖细胞+/-sem的腺泡/管的百分率。***P<0.001；*P<0.03（Student氏t检验）。d，在腹Δmam
膜内注射PBS或RANKL（1μg）之后1天对照同窝仔和RANK 雌性的乳腺中的上皮增殖。
原位Ki67免疫染色测定增殖。放大×40。e，腹膜内注射PBS或RANKL（1μg）之后1天上皮增殖的定量。显示Ki67阳性细胞+/-sem的平均百分率。*P<0.03；n=5（Student氏t检验）。
Δmam
***P<0.001（Student氏t检验）。b，在MPA皮下移植之后第3天自对照同窝仔和RANK雌性的乳腺的原位Ki67免疫染色的细胞/腺泡的定量。然而，在对照雌性中，～80%的腺Δmam
泡显示中到高增殖迹象，RANK 雌性中多于60%的腺泡呈现非常低的增殖速度。c，为控制Δmam
动情期-依赖性背景增殖水平，分析超排卵的及假操作的对照同窝仔和RANK 雌性。计数至少1000个细胞/乳腺。n=3/基因型。在b及c中，数据显示为具有低（<20%的上皮+ + +
细胞是Ki67），中（20～80%的上皮细胞是Ki67）和高（>80%的上皮细胞是Ki67）数的增殖细胞+/-sem的腺泡/管的百分率。***P<0.001；*P<0.03（Student氏t检验）。d，在腹Δmam
膜内注射PBS或RANKL（1μg）之后1天对照同窝仔和RANK 雌性的乳腺中的上皮增殖。
原位Ki67免疫染色测定增殖。放大×40。e，腹膜内注射PBS或RANKL（1μg）之后1天上皮增殖的定量。显示Ki67阳性细胞+/-sem的平均百分率。*P<0.03；n=5（Student氏t检验）。
[0087] 图8．RANKΔmam小鼠中孕酮-驱动的乳腺癌的存活曲线。
[0088] a,b，MPA诱导乳腺上皮细胞中RANKL表达。将未生育过的野生型雌性用DMBA或油媒质的口腔强饲治疗，用慢-释放MPA粒皮下移植，或用假手术治疗。a，在移植/口腔强饲之后3天由qRT-PCR在纯化的乳腺上皮细胞中测定RANKL mRNA。数据显示为相比安慰剂处理+/-sem的倍数变化。n=3小鼠/组。b，在用油媒质，DMBA，MPA或假手术治疗之后3天由蛋白印迹在自纯化的乳腺上皮细胞的细胞裂解物上检定可溶性（s）RANKL蛋白（19kDa）的表达。β-肌动蛋白显示为装载对照。注意到，仅MPA但不DMBA或油媒质单独诱导RANKL ΔmammRNA和蛋白表达。c，在用MPA粒和DMBA治疗的RANK （n=14）和有MMTV-Cre（Cre+对照;n=13）或无MMTV-Cre（Cre-对照;n=9）的龄-匹配的同窝对照雌性中可触及的乳腺肿瘤的发作，如显示于图2a。数据显示为在最后DMBA攻击之后无肿瘤的小鼠的百分率。Cre++
和Cre-对照组之间发现无显著差异。在最后DMBA治疗之后，对于Cre 对照的中位肿瘤发作Δmam flox/+
是9天，对于Cre-对照是11天，及对于RANK 雌性是30天。d，源于RANK ；MMTV-Cre+flox/Δ Δmam
和RANK ；MMTV-Cre+（RANK ）雌性的MPA/DMBA-诱导的乳腺肿瘤的代表性的DNA印迹。在将基因组DNA用PvuII和SphI消化之后指示野生型或夹于两个lox P位置之间RANKΔmam
等位基因（fl/+;9.6kb）和删除的RANK等位基因（Δ;3.9kb）。源于RANK 雌性的全部肿Δmam
瘤显示几乎完全缺失。e，对在用MPA/DMBA治疗之后RANK （n=9）和龄-匹配的同窝对照雌性（n=9）的总体存活的Kaplan Mayer分析。在最后DMBA治疗之后，对于对照，中位存Δmam
活是48天；和对于RANK 雌性，中位存活是93天。
和Cre-对照组之间发现无显著差异。在最后DMBA治疗之后，对于Cre 对照的中位肿瘤发作Δmam flox/+
是9天，对于Cre-对照是11天，及对于RANK 雌性是30天。d，源于RANK ；MMTV-Cre+flox/Δ Δmam
和RANK ；MMTV-Cre+（RANK ）雌性的MPA/DMBA-诱导的乳腺肿瘤的代表性的DNA印迹。在将基因组DNA用PvuII和SphI消化之后指示野生型或夹于两个lox P位置之间RANKΔmam
等位基因（fl/+;9.6kb）和删除的RANK等位基因（Δ;3.9kb）。源于RANK 雌性的全部肿Δmam
瘤显示几乎完全缺失。e，对在用MPA/DMBA治疗之后RANK （n=9）和龄-匹配的同窝对照雌性（n=9）的总体存活的Kaplan Mayer分析。在最后DMBA治疗之后，对于对照，中位存Δmam
活是48天；和对于RANK 雌性，中位存活是93天。
[0089] 图9．RANKΔmam雌性中鳞状腺癌的发展。
[0090] a,b，在最后DMBA治疗之后7（a）及21（b）天自对照同窝仔和RANKΔmam雌性分离的Δmam乳腺肿瘤的代表性的组织切片。显示H&E和E-钙粘素染色，指示来自对照同窝仔和RANKΔmam
雌性的肿瘤的管腺癌的典型特征。细胞角蛋白14（K14）表达展示对照和RANK 雌性二Δmam
者中基底细胞来源。但是，RANK 雌性趋向于显示鳞状化生的特征。全部放大率×20。
雌性的肿瘤的管腺癌的典型特征。细胞角蛋白14（K14）表达展示对照和RANK 雌性二Δmam
者中基底细胞来源。但是，RANK 雌性趋向于显示鳞状化生的特征。全部放大率×20。
[0091] 图10．在Mx-CreRANKfloxed/Δ和NeuTRANKΔmam小鼠中的乳腺癌发作。
[0092] a，用MPA粒和DMBA治疗的Mx-Crerankfloxed/Δ（n=4）和龄匹配的Mx-Crerank+/Δ同窝对照雌性（n=6）中可触及的乳腺肿瘤的发作，如显示于图2a。Mx-驱动的Cre重组酶由8天的4聚I:C腹膜内注射（200ml PBS中的200μg）活化。数据显示为在最后DMBA攻击之floxed后无肿瘤的小鼠的百分率。未发现显著差异。b，非-删除的RANK 等位基因（fl/+）及floxed/Δ floxed/Δ
在在Mx-Crerank 小鼠中诱导缺失（Δ）之后的DNA印迹。c，在在Mx-Crerank
小鼠中诱导缺失（Δ）之后各种器官的DNA印迹。而各缺失程度（50～100%）可见于胸腺，floxed
心脏，肝和脾脏，在纯化的乳腺上皮细胞（MEC）中未诱导RANK 等位基因的缺失。
在在Mx-Crerank 小鼠中诱导缺失（Δ）之后的DNA印迹。c，在在Mx-Crerank
小鼠中诱导缺失（Δ）之后各种器官的DNA印迹。而各缺失程度（50～100%）可见于胸腺，floxed
心脏，肝和脾脏，在纯化的乳腺上皮细胞（MEC）中未诱导RANK 等位基因的缺失。
[0093] 图11．MEC中的RANKL/RANK下游信号传导。
[0094] a，遗传确认的控制在怀孕期间泌乳乳腺的RANKL-RANK介导的形成的信号传导通路的示意轮廓。b，对响应RANKL刺激（1μg/ml）的分离的原代小鼠乳腺上皮细胞中磷酸化的（P）AKT，总AKT，磷酸化的（P）ERK1/2，总ERK1/2，磷酸化的（P）p38-MAPK，及p38-MAPK的蛋白印迹。数据是4个实验的代表。
[0095] 图12．MPA经RANKL/RANK活化NFκB通路及引发CyclinD1表达。
[0096] a，由MPA的NFκB通路和CyclinD1表达的活化。给未生育过的RANKΔmam和同窝Δmam对照雌性皮下移植慢-释放MPA粒或用假手术处理。a，检测在MPA处理之后3天RANK和同窝对照雌性的乳腺上皮细胞中磷酸化的（P）IκBα的原位免疫染色。b，在MPA处理之Δmam
后3天来自RANK 和同窝对照雌性的分离的乳腺上皮细胞中CyclinD1和RANKL的蛋白印迹分析。为分子大小比较显示重组体，鼠sRANKL蛋白。β-肌动蛋白显示为装载对照。
后3天来自RANK 和同窝对照雌性的分离的乳腺上皮细胞中CyclinD1和RANKL的蛋白印迹分析。为分子大小比较显示重组体，鼠sRANKL蛋白。β-肌动蛋白显示为装载对照。
[0097] 图13．RANKL/RANK下游信号传导通路。
[0098] a，对响应RANKL刺激（1μg/ml）的人SKBR3乳腺癌细胞中磷酸化的（P）p65NFκB，总p65NFκB，磷酸化的（P）IκBα，总IκBα，磷酸化的（P）ERK1/2，总ERK1/2，磷酸化的（P）p38-MAPK，及p38-MAPK的蛋白印迹。数据是3个实验的代表。b，在正常生长培养基（对照,补充10%FCS的DMEM）中或在RANKL（1μg/ml）的存在下培养的SKBR3乳腺癌细胞的生长曲线。通过经3天计数活细胞（锥虫蓝-排除）测定细胞数。c，用MPA粒和DMBA治疗Δmam的NFATc1 （n=10）和龄匹配的同窝对照（n=16）雌性中可触及的乳腺肿瘤的发作。数据Δmam
显示为在最后DMBA攻击之后无肿瘤的小鼠的百分率。未发现显著差异。d，自NFATc1和同窝对照雌性的纯化的乳腺上皮细胞（MEC）和MPA-驱动的乳腺肿瘤中NFATc1mRNA表达的定量。mRNA通过qRT-PCR测定。数据显示为相比对照的倍数变化（+/-sem）。n=5/组。
*P<0.05（Student氏t检验）。
显示为在最后DMBA攻击之后无肿瘤的小鼠的百分率。未发现显著差异。d，自NFATc1和同窝对照雌性的纯化的乳腺上皮细胞（MEC）和MPA-驱动的乳腺肿瘤中NFATc1mRNA表达的定量。mRNA通过qRT-PCR测定。数据显示为相比对照的倍数变化（+/-sem）。n=5/组。
*P<0.05（Student氏t检验）。
[0099] 图14．RANKL保护原发性鼠乳腺上皮细胞和人SKBR3乳腺癌细胞免于响应γ-辐射凋亡。
[0100] a，对在RANKL刺激的存在（1μg/ml）或缺失下，响应γ-辐射（2Gray）的分离的原发性小鼠乳腺上皮细胞中γH2AX，磷酸化的（P）Chk1，总Chk1，p53和β-肌动蛋白的蛋白印迹分析。b,c，在RANKL的缺失或存在（1μg/ml）下γ-辐射（2Gray）之后，碘化丙锭（PI）染色的b，乳腺上皮细胞和c，SKBR3人乳腺癌细胞的FACS分析。数据是至少3个实验的代表。在亚-G1区呈现DNA含量<2n的凋亡细胞。在指示的时间点给出亚-G1（M1），G1-期（M2），S/G2/M-期（M3）中的细胞以及DNA含量>4n的多倍体细胞的百分率。
[0101] 图15．RANKL保护原发性鼠乳腺上皮细胞和人SKBR3乳腺癌细胞免于响应多柔比星的凋亡。
[0102] a,b，与遗传毒性剂多柔比星（Dox,1μM），在RANKL的存在（1μg/ml）或缺失下温育的a，乳腺上皮细胞和b，SKBR3人乳腺癌细胞的FACS分析。数据是至少3个实验的代表。在多柔比星治疗之后24和36小时给出亚-G1（M1），G1-期（M2），S/G2/M-期（M3）中的细胞以及DNA含量>4n的多倍体细胞的百分率。c，在RANKL刺激的存在（1μg/ml）或缺失下γ-辐射（2Gray）之后6小时促-凋亡性基因Bim，Puma和Noxa的mRNA表达。数据显示为相比对照的倍数变化（+/-sem）。n=3。*P<0.05；**P<0.005（Student氏t检验）。
[0103] 图16．IKKα介导免于辐射-诱导的上皮凋亡的MPA-诱导的保护。
[0104] a,b，在IKKαΔmam雌性中响应γ-辐射的乳腺上皮细胞凋亡的减少的诱导。对同Δmam窝对照和IKKα 雌性假操作或移植MPA粒和γ-照射（5Gray）。在γ-辐射之前3天移植MPA粒。在辐射之后24小时，通过有活性的胱天蛋白酶3的免疫染色检测凋亡。a，对于代表性的乳腺切片，显示上皮细胞的凋亡性核（箭标）。放大×40。b，乳腺上皮凋亡的定量。
对于各小鼠计数最少5000个核。结果显示的是平均值+/-sem。n=3小鼠/组。*P<0.05（Student氏t检验）。
对于各小鼠计数最少5000个核。结果显示的是平均值+/-sem。n=3小鼠/组。*P<0.05（Student氏t检验）。
[0105] 图17．在血清采样之后5～12个月之内，而非12～24个月之内发展乳腺癌的女性的RANKL/OPG比变化。
[0106] a，自在她们的随访期间未发展乳腺癌的182个健康绝经后女性和在她们的血清收集之后5～12个月发展ER阳性乳腺癌的41个健康龄-匹配的女性，自UKCTOCS（UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening）的预期地收集的血清样品中个体RANKL和OPG水平的分析。由活组织检查诊断乳腺癌的发展。这些女性中无人在样品收集时间处于激素替代治疗。显示OPG和sRANKL水平以及OPG-sRANKL比的框标绘图。相比未发展乳腺癌的女性，在血清测试之后第1年之内发展乳腺癌的女性具有显著地更高OPG水平（p=0.041;Mann Whitney U测试）以及显著地增加的OPG-sRANKL比（p=0.022;Mann Whitney U测试）。b，自UKCTOCS，自在她们的随访期间未发展乳腺癌的182个健康绝经后女性和在她们的血清收集之后12～24个月发展ER阳性乳腺癌的57个健康龄-匹配的女性的预期地收集的血清样品中个体RANKL和OPG水平的分析。显示OPG和sRANKL水平以及OPG-sRANKL比的框标绘图。无显著差异（Mann Whitney U测试）。框标绘图指示中位比水平和四分位数间范围。
[0107] 图18．蛋白印迹的定量。
[0108] 在至少3个独立蛋白印迹/实验实施光密度测定法。对于蛋白印迹，数据显示于图1b，图1c，图3a和图3b。将指示的蛋白的表达值对β-肌动蛋白装载对照标准化。对于磷酸化的定量，数据标准化到相应总蛋白条带。*P<0.05；**P<0.001（Student氏t检验）。
[0109] 【实施例】
[0110] 【实施例1：小鼠】已最近产生Rankfloxed小鼠1。简言之，为产生携带Rank的无效Δ floxed等位基因（rank 等位基因）的小鼠，将rank 小鼠与β-肌动蛋白-Cre普遍存在的删Δ/floxed floxed Δ
除者小鼠交配。在产生MMTV-Crerank 小鼠之前，将携带rank 或rank 等位基因
的小鼠以及MMTV-Cre小鼠与BALBc背景回交7次。MMTV-NeuT小鼠由Guido Forni，Milan友情提供。MMTV-Cre（stock#003553）和Mx-Cre小鼠（stock#003556）从Jackson实验室floxed floxed 2-4
得到。K5-Cre，IKKα 和NFATc1 小鼠已之前描述 。小鼠基因型通过PCR和DNA
印迹分析测定。在全部实验中，仅使用自相同的繁殖的同窝仔小鼠。全部小鼠根据学院指南饲养及维持。
除者小鼠交配。在产生MMTV-Crerank 小鼠之前，将携带rank 或rank 等位基因
的小鼠以及MMTV-Cre小鼠与BALBc背景回交7次。MMTV-NeuT小鼠由Guido Forni，Milan友情提供。MMTV-Cre（stock#003553）和Mx-Cre小鼠（stock#003556）从Jackson实验室floxed floxed 2-4
得到。K5-Cre，IKKα 和NFATc1 小鼠已之前描述 。小鼠基因型通过PCR和DNA
印迹分析测定。在全部实验中，仅使用自相同的繁殖的同窝仔小鼠。全部小鼠根据学院指南饲养及维持。
[0111] 肿瘤和Cre效应中RANK缺失。在RANKΔmam雌性中发展的肿瘤的DNA印迹显示RANK缺失，尽管观察到一些残留的野生型条带（图8c），其可解释为其他细胞类型和/或逃脱者细胞的存在。未观察到Cre-阴性对照雌性和表达MMTV-Cre转基因的同窝仔中肿瘤发作的差异，指示Cre表达本身不改变MPA/DMBA乳腺肿瘤模型中的肿瘤发生率（图8d）。
[0112] 【实施例2：MPA/DMBA-诱导的乳腺致癌】
[0113] 如描述实施MPA/DMBA治疗5,6。简言之，将6周龄雌性小鼠用氯胺酮-赛拉嗪麻醉，和在右侧皮下手术移植慢-释放MedroxyprogesteroneAcetat（MPA）粒（50mg,90天释放;Innovative Research of America）。由口腔强饲施用6次贯穿随后8周200μl DMBA（5mg/ml，棉籽油中稀释的），如显示于图2a。通过触诊测定乳腺肿瘤的发作。未观察到Cre-阴性对照雌性和表达MMTV-Cre转基因的同窝仔中肿瘤发作的差异，指示Cre表达本身不在MPA/DMBA乳腺肿瘤模型中改变肿瘤发生率。
[0114] 【实施例3：乳腺组织移植物】
[0115] 为移植研究，如所述从未生育过的3周龄供体分离乳腺上皮组织，及移植到3周龄7
宿主nu/nu小鼠的清除的乳腺脂肪垫（内源性上皮缺乏）。在手术之后3周，使宿主交配及分离乳腺组织用于分析。
宿主nu/nu小鼠的清除的乳腺脂肪垫（内源性上皮缺乏）。在手术之后3周，使宿主交配及分离乳腺组织用于分析。
[0116] 【实施例4：组织学，全包埋和免疫组织化学】为组织分析，切下5μm切片，及用苏8
木素和伊红（H&E）染色。如所述实施乳腺的全包埋染色 。为免疫过氧化物酶染色，将石蜡-嵌入的切片脱水，及通过使用10mM柠檬酸盐缓冲剂或微波照射暴露抗原性表位。将切片与针对细胞角蛋白5，细胞角蛋白14，E-钙粘素，抗-Ki67（Novocastra）和抗-有活性的胱天蛋白酶3（细胞信号传导）的抗体温育，及通过使用缀合了过氧化物酶的第二抗体可视化。将组织形态测定指标（增殖和凋亡）计算为阳性上皮细胞除以上皮细胞总数的数，对于Ki67染色，每切片计数的不少于1000个核；及对于有活性的胱天蛋白酶3染色，每切片计数的不少于5000个细胞。
木素和伊红（H&E）染色。如所述实施乳腺的全包埋染色 。为免疫过氧化物酶染色，将石蜡-嵌入的切片脱水，及通过使用10mM柠檬酸盐缓冲剂或微波照射暴露抗原性表位。将切片与针对细胞角蛋白5，细胞角蛋白14，E-钙粘素，抗-Ki67（Novocastra）和抗-有活性的胱天蛋白酶3（细胞信号传导）的抗体温育，及通过使用缀合了过氧化物酶的第二抗体可视化。将组织形态测定指标（增殖和凋亡）计算为阳性上皮细胞除以上皮细胞总数的数，对于Ki67染色，每切片计数的不少于1000个核；及对于有活性的胱天蛋白酶3染色，每切片计数的不少于5000个细胞。
[0117] 【实施例5：蛋白印迹】
[0118] 不处理人上皮乳腺肿瘤细胞系SKBR3和原发性非-转化的小鼠乳腺上皮细胞，或ref 9用重组鼠RANKL 刺激 。从对照和突变小鼠分离腺癌，和制备总蛋白裂解物。使用标准流程实施蛋白印迹。简言之，将印迹用在1xTBS0.1%吐温-20（TBST）中的5%BSA中阻断
1小时，及与第一抗体于4℃温育过夜（在TBST中根据生产流程稀释）。使用与小鼠RANKL（AF462;R&D），细胞周期蛋白D1（Santa Cruz#Sc-8396），β-肌动蛋白（Sigma），磷酸化的（P）NFκB（#3033），NF-κB（#4767），磷酸化的（P）IκBα（#2859），IκBα（#4814），磷酸化的（P）IKKα（#2681），IKKα（#2678），IKKβ（#2678），IKKγ（#2685），磷酸化的（P）Akt（#3787），Akt（#9272），磷酸化的（P）Erk1/2（#9101），Erk1/2（#9102）和p38-MAPK（#9212），p53（#2524），磷酸化的（P）Chk1（#2348），Chk1（#2345）（全部自细胞信号传导），p38-MAPK（AF869;R&D），及γH2Ax（Ser139#07-164Millipore）具有反应性的第一抗体。将印迹在TBST中洗涤30分钟3次，与缀合了HRP的第2抗体（1:2000,Promega）于室温温育
1小时，在TBST中洗涤30分钟3次，及通过使用ECL可视化。
1小时，及与第一抗体于4℃温育过夜（在TBST中根据生产流程稀释）。使用与小鼠RANKL（AF462;R&D），细胞周期蛋白D1（Santa Cruz#Sc-8396），β-肌动蛋白（Sigma），磷酸化的（P）NFκB（#3033），NF-κB（#4767），磷酸化的（P）IκBα（#2859），IκBα（#4814），磷酸化的（P）IKKα（#2681），IKKα（#2678），IKKβ（#2678），IKKγ（#2685），磷酸化的（P）Akt（#3787），Akt（#9272），磷酸化的（P）Erk1/2（#9101），Erk1/2（#9102）和p38-MAPK（#9212），p53（#2524），磷酸化的（P）Chk1（#2348），Chk1（#2345）（全部自细胞信号传导），p38-MAPK（AF869;R&D），及γH2Ax（Ser139#07-164Millipore）具有反应性的第一抗体。将印迹在TBST中洗涤30分钟3次，与缀合了HRP的第2抗体（1:2000,Promega）于室温温育
1小时，在TBST中洗涤30分钟3次，及通过使用ECL可视化。
[0119] 【实施例6：qRT-PCR】
[0120] 肿瘤的总RNA通过使用RNeasy Mini Kit（Qiagen），根据生产商的使用说明制备。使总RNA（2μg）经历定量(q)RT-PCR分析。使用以下引物：
[0121] β-肌动蛋白正向引物：5’-GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG-3’；
[0122] β-肌动蛋白反向引物：5’-CCTGAACCCTAAGGCCAACCG-3’。
[0123] RANKL正向引物：5’-CTGAGGCCCAGCCATTTG-3’
[0124] RANKL反向引物：5’-GTTGCTTAACGTCATGTTAGAGATCTTG-3’
[0125] RANK正向引物：5’-CTTGGACACCTGGAATGAAG-3’
[0126] RANK反向引物：5’-CAGCACTCGCAGTCTGAGTT-3’
[0127] CyclinD1正向引物：5’-CTGTGCGCCCTCCGTATCTTA-3’
[0128] CyclinD1反向引物：5’-GGCGGCCAGGTTCCACTTGAG-3’
[0129] p21（Cdkn1a）正向引物：5’-GTGGCCTTGTCGCTGTCTT-3’
[0130] p21（Cdkn1a）反向引物：5’-GCGCTTGGAGTGATAGAAATCTG-3’
[0131] tRANKL正向引物：5’-GCGCCGGGCCAGCCGAGACTAC-3’
[0132] RANKL1正向引物：5’-GTCCCACACGAGGGTCCGCTGC-3’
[0133] RANKL2正向引物：5’-TGCGCACTCCGGCGTCCCG-3’
[0134] RANKL3正向引物：5’-CCGAGACTACGGCGGATCCTAACAG-3’
[0135] RANKLcom．反向引物：5’-TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAGCCCC-3’
[0136] Puma正向引物：5’-CCGCCTGATGCCCTCCGCTGTAT-3’
[0137] Puma反向引物：5’-CGGGCCCACTCCTCCTCCTCCAC-3’
[0138] Noxa正向引物：5’-ACTTTGTCTCCAATCCTCCG-3’
[0139] Noxa反向引物：5’-GTGCACCGGACATAACTGTG-3’
[0140] Bim正向引物：5’-GTTGAACTCGTCTCCGATCC-3’
[0141] Bim反向引物5’-GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3’
[0142] 【实施例7：DNA损伤应答】
[0143] 为测量细胞周期停滞和凋亡，将原发性小鼠乳腺上皮细胞和SKBR3人乳腺癌细胞以100000个细胞/孔的细胞-密度接种到6-孔板，及允许生长24小时。然后将细胞用多柔比星（1μM）或γ-辐射（2Gray）在重组RANKL（1μg/ml）的缺失或存在下处理。细胞周期停滞和死细胞的数通过使用碘化丙锭染色测定。为了测定体内乳腺上皮细胞死亡，将对Δmam照和RANK 同窝仔雌性用5Gray（Gy）的总剂量进行γ-照射。6小时后，分离乳腺，及就指示凋亡的有活性的胱天蛋白酶3（细胞信号传导）免疫染色。
[0144] 【实施例8：预期人群研究】
[0145] 基于预期群的UKCTOCS研究的募集细节见ref10。受试者是United Kingdom Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening（UKCTOCS），对于卵巢癌的最大多-中心随机化的控制的试验中的参与者。试验在England，Wales和Northern爱尔兰设置为13NHS trust，及由在UCL的Gynecological Cancer Research Centre配位。年龄是50～74的女性由27参与Primary Care Trusts的龄/性别注册随机邀请。接受邀请的女性用关于试验的书面及口头信息提供。在2001和2005之间，随机分配总202638个年龄是50～74的绝经后女性，以就卵巢癌筛选或无筛选。全部女性在募集时提供血样品，及此外，50640个女性每年给系列血样品。此试验注册为ISRCTN22488978及用ClinicalTrials.gov编号NCT00058032。获得书面同意，其包括：到她们的医疗记录的访问，和在未来研究中使用她们的数据/样品。各女性在募集时提供样品，及填写关于医疗和家族历史的基本问卷调查。随访问卷调查在募集之后3.5年发送给参与女性，问在接合试验之后是否她们发展任何癌。who在随访问卷调查上自身-报道乳腺癌的女性或由Office of National Statistics（ONS）标记为发展了乳腺癌的女性还通过她们的治疗医师随访。选择用ER-阳性侵袭性乳腺癌诊断的女性，在募集时不具有HRT治疗及具有通过随机化到试验的诊断之前至少5～24个月给出的血清样品用于分析（98例）。乳腺癌病例是龄匹配的，及与无乳腺癌历史（182对照）及具有在相同的天和临床收集的她们的血清样品的女性匹配。将在中心收集的血样品以2,500rpm旋转5分钟，及在Grienger凝胶管中运行过夜，及次日在中心UKCTOCS实验室处理。血清以500μl等分，然后热密封，编条码，及在液氮箱中的特定容器中存储。仅在使用之前解冻样品。伦理批准由Joint UCL/UCLH Committees on the Ethics of Human Re-search提供（REC参考号：06/Q0505/102）。
[0146] 【实施例9：乳腺癌患者】
[0147] 使用的UKCTOCS（UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening）同10
群 包含来自在她们的随访期间未发展乳腺癌的182个健康绝经后女性和在她们的血清收集之后5～24个月发展雌激素受体（ER）阳性乳腺癌的98个健康龄-匹配的女性的预期地收集的血清样品。在这98个女性中，41个在第1年之内发展乳腺癌，和57个女性在血清样品收集之后12～24个月发展乳腺癌。这些女性中无人在样品收集时间处于激素替代治疗。
群 包含来自在她们的随访期间未发展乳腺癌的182个健康绝经后女性和在她们的血清收集之后5～24个月发展雌激素受体（ER）阳性乳腺癌的98个健康龄-匹配的女性的预期地收集的血清样品。在这98个女性中，41个在第1年之内发展乳腺癌，和57个女性在血清样品收集之后12～24个月发展乳腺癌。这些女性中无人在样品收集时间处于激素替代治疗。
[0148] 【实施例10：黄体酮测定】
[0149] ●第1温育：将30μL样品-在生物素化的单克隆黄体酮-特异性抗体和用钌复合物标记的黄体酮衍生物的存在下-与达那唑温育，以释放黄体酮。自样品的黄体酮与用于抗体结合位点的标记的黄体酮衍生物竞争。
[0150] ●第2温育：在添加链霉亲和素-包被的微粒之后，复合物便经生物素和链霉亲和素的相互作用与固相结合。结合到固相的标记的黄体酮衍生物的量与样品的黄体酮含量成反比例。
[0152] ●结果经校准曲线测定，其是由2-点校准和经试剂条码提供的主曲线仪器-特别产生。
[0153] 【试剂-工作溶液】
[0154] M链霉亲和素-包被的微粒（透明封头），1瓶，6.5mL：链霉亲和素-包被的微粒，0.72mg/mL；防腐剂。
[0155] R1抗-黄体酮-Ab-生物素（灰封头），1瓶，10mL：生物素化的单克隆抗-黄体酮抗体（小鼠）0.15mg/L，磷酸盐缓冲剂25mmol/L，pH7.0；防腐剂。
[0156] R2黄体酮-肽-Ru(bpy)2（+ 黑封头），1瓶，8mL：偶联于用钌络合物标记的合成肽的黄体酮（植物来源），10ng/mL；磷酸盐缓冲剂25mmol/L，pH7.0；防腐剂。
[0157] 【实施例11：统计学】全部值在本文作为平均值sem给出。由Student氏t检验进行组之间的比较。对于肿瘤发作的Kaplan-Meier分析，实施时间等级测试。P0.05被接受为统计学地显著。除了Log RANK测试之外，实施post-hoc power分析（PS Power and Sample Size Calculations,在biostat.mc.vanderbilt.edu/PowerSampleSize的网页中），以计算等同肿瘤发作时间给出的实验动物数的正确地拒绝无效假说的概率。对于涉及Δmam ΔmamRANK 动物的研究，无效假说可以0.933的概率（力）拒绝，及对于IKKα 动物为0.766的概率。与此无效假说的测试关联的I型误差概率是0.05。人数据通过使用配对的t检验，Mann Whitney U测试，或Spearman排序测试分析，如所示。
[0158] 【实施例12：RANKL/RANK损伤的小鼠】
[0159] 为了检查肿瘤发生中RANKL/RANK的潜在作用，在乳腺上皮细胞中使用诱导性flox/ΔRANK等位基因的K5-Cre和MMTV-Cre介导的切除删除RANK（K5-Cre rank 小鼠和
flox/Δ
MMTV-Crerank 小鼠）。两个小鼠系呈现健康及呈现正常骨结构和淋巴结形成。如所预flox/Δ
期，K5-Cre rank 小鼠在青春期呈现明显正常乳腺发育；但是，这些小鼠在怀孕期间未发育乳-分泌小叶肺泡结构（图5a,b）。使用移植实验，这些效应是细胞自主的（图5c）。在flox/Δ
MMTV-Crerank 小鼠中，未生育过的雌性中的乳腺发育和怀孕中乳-分泌小叶肺泡结构flox/Δ
的形成呈现正常（图6a～c）。为了排除K5-Cre rank 小鼠中可以正常生理影响特定flox/Δ
细胞群的发育效应的任何问题，因此使用MMTV-Crerank 小鼠用于全部进一步实验。这flox/Δ Δmam
些MMTV-Crerank 突变小鼠在下文称为RANK 。
flox/Δ
MMTV-Crerank 小鼠）。两个小鼠系呈现健康及呈现正常骨结构和淋巴结形成。如所预flox/Δ
期，K5-Cre rank 小鼠在青春期呈现明显正常乳腺发育；但是，这些小鼠在怀孕期间未发育乳-分泌小叶肺泡结构（图5a,b）。使用移植实验，这些效应是细胞自主的（图5c）。在flox/Δ
MMTV-Crerank 小鼠中，未生育过的雌性中的乳腺发育和怀孕中乳-分泌小叶肺泡结构flox/Δ
的形成呈现正常（图6a～c）。为了排除K5-Cre rank 小鼠中可以正常生理影响特定flox/Δ
细胞群的发育效应的任何问题，因此使用MMTV-Crerank 小鼠用于全部进一步实验。这flox/Δ Δmam
些MMTV-Crerank 突变小鼠在下文称为RANK 。
[0160] 【实施例13：孕酮施用后RANKL活化的机理】
[0161] 在野生型群中，MPA（孕酮）处理引发乳腺上皮细胞的大量增殖。乳腺上皮细胞Δmam的MPA-诱导的增殖在RANK 雌性中显著地减少（图1a;图7a～c）。因此，RANKL腹膜内注射到未生育过的雌性引发乳腺上皮细胞经RANK的增殖（图7d,e）。最近已报道，内
15 16 hi
源性黄体酮在怀孕 及发情周期 期间影响Lin-CD24+CD49f 干细胞的数。在两个研究中，基于体内全身Ab阻断研究和RT-PCR表达牵涉RANKL/RANK系统，但是，不知道是否此是乳腺上皮细胞中RANKL-RANK的直接效应而非次要效应。因此检定是否孕酮诸如MPA也hi hi
可扩展Lin-CD24+CD49f 细胞。MPA处理导致Lin-CD24+CD49f 细胞的2倍扩展。该扩Δmam
展未在MPA-处理的RANK 雌性中发生（图1b,c）。这些数据提供RANKL/RANK系统控制hi
Lin-CD24+CD49f 细胞的扩展的第1个遗传证明。
15 16 hi
源性黄体酮在怀孕 及发情周期 期间影响Lin-CD24+CD49f 干细胞的数。在两个研究中，基于体内全身Ab阻断研究和RT-PCR表达牵涉RANKL/RANK系统，但是，不知道是否此是乳腺上皮细胞中RANKL-RANK的直接效应而非次要效应。因此检定是否孕酮诸如MPA也hi hi
可扩展Lin-CD24+CD49f 细胞。MPA处理导致Lin-CD24+CD49f 细胞的2倍扩展。该扩Δmam
展未在MPA-处理的RANK 雌性中发生（图1b,c）。这些数据提供RANKL/RANK系统控制hi
Lin-CD24+CD49f 细胞的扩展的第1个遗传证明。
[0162] 【实施例14：孕酮对对照和RANK/RANKL缺陷小鼠中经RANK/RANKL的癌发展的影响】
[0163] 在The Women's Health Initiative（WHI）和Million Women Study中，孕酮的使用已流行病学地与乳腺癌的发作和发生率关联。孕酮-驱动的乳腺癌可在雌性小鼠中建模，其中在DNA损伤剂二甲基苯[a]蒽（DMBA）的存在下慢释放MPA粒的移植引发乳腺癌（图2a;图8a,b）。
[0164] 在对照雌性中，MPA/DMBA治疗诱导可触及的乳腺肿瘤的快速发作。有趣地，在ΔmamRANK 雌性小鼠中，观察到MPA/DMBA-诱导的乳腺癌的发作的显著延迟（图2b;图8c,d）。
Δmam Δmam
RANK 雌性上延迟的肿瘤发作也导致显著地增强的存活（图8e）。在RANK 雌性中发展Δmam
的肿瘤的DNA印迹确认RANK的有效缺失（图8c）。在对照和RANK 雌性中发展的全部肿瘤呈现表达E-钙粘素的细胞角蛋白（CK）5和CK14阳性基底细胞亚型的管腺癌的典型组织Δmam
病理学（图2c,图9a,b）。但是，RANK 雌性中出现的管腺癌常发展鳞状化生的扩展的区（图2c,图9a,b）。
Δmam Δmam
RANK 雌性上延迟的肿瘤发作也导致显著地增强的存活（图8e）。在RANK 雌性中发展Δmam
的肿瘤的DNA印迹确认RANK的有效缺失（图8c）。在对照和RANK 雌性中发展的全部肿瘤呈现表达E-钙粘素的细胞角蛋白（CK）5和CK14阳性基底细胞亚型的管腺癌的典型组织Δmam
病理学（图2c,图9a,b）。但是，RANK 雌性中出现的管腺癌常发展鳞状化生的扩展的区（图2c,图9a,b）。
[0165] 【实施例15：在依赖于RANKL介导的孕酮信号的DNA损伤之后的癌发作】
[0166] 由于RANKΔmam在乳腺癌中显示延迟的发作。接下来分析在DMBA攻击之后早期阶段的乳腺肿瘤的发生率。MPA再次用来模拟黄体酮背景，以引发RANKL/RANK信号传导。在最后DMBA治疗之后1周，全部表达RANK的对照雌性已呈现多原位癌和甚至侵袭性乳腺肿Δmam瘤。相反，在最后DMBA攻击之后1周RANK 动物中观察到非常少癌是原位和绝不任何侵Δmam
袭性乳腺癌（图2d）。在最后DMBA攻击之后3周，癌原位的发生率在对照和RANK 雌性之Δmam Δmam
中类似，但侵袭性癌在RANK 雌性中仍非常稀有（图2e）。而且，增殖一般在自RANK 雌性的肿瘤中减少（图2d,e）。多个其他组织，包括肝，心脏，肌肉和造血隔室，但不在乳腺上皮flox/flox
细胞中RANK的缺失，使用Mx-Crerank 小鼠未大大延迟MPA/DMBA-诱导的乳腺癌的发作（图10a～c），提示RANK/RANKL损伤的效应在乳腺上皮细胞中是显性的。
袭性乳腺癌（图2d）。在最后DMBA攻击之后3周，癌原位的发生率在对照和RANK 雌性之Δmam Δmam
中类似，但侵袭性癌在RANK 雌性中仍非常稀有（图2e）。而且，增殖一般在自RANK 雌性的肿瘤中减少（图2d,e）。多个其他组织，包括肝，心脏，肌肉和造血隔室，但不在乳腺上皮flox/flox
细胞中RANK的缺失，使用Mx-Crerank 小鼠未大大延迟MPA/DMBA-诱导的乳腺癌的发作（图10a～c），提示RANK/RANKL损伤的效应在乳腺上皮细胞中是显性的。
[0167] 【实施例16：RANKL信号传导】
[0168] 乳腺上皮细胞中经IKKα-NFκB-CyclinD1的RANKL-RANK信号传导示于图11a。RANKL刺激的确在原发性小鼠乳腺上皮细胞（MEC）中导致p65NFκB和IκBα磷酸化（图
3a）。此外，MEC的RANKL刺激引发p38-MAPK和ERK的磷酸化（图11b）。为了直接显示是否RANK介导孕酮下游NFκB-CyclinD1体内活化，将小鼠用MPA攻击。3天MPA治疗导致磷酸化的IκBα的核蓄积，指示有活性的NFκB通路，及乳腺上皮细胞中CyclinD1蛋白表达的Δmam Δmam
诱导，二者在RANK 雌性中严重减少（图12a,b）。而且，在自对照和RANK 雌性分离的MPA/DMBA-诱导的乳腺癌中，我们发现，NFκB通路的损伤的活化（图3b）及细胞周期蛋白D1的下调的mRNA表达（图3c）。在这些原发性肿瘤中，也观察到p21mRNA的上调（图3c），由Id2
17
通路转录抑制的基因 。Id2通路是乳腺上皮细胞中RANKL/RANK的第2个遗传上确认的下
17
游通路 。为了延伸这些发现到人，检定人SKBR3乳腺肿瘤细胞。RANKL刺激诱导了NFκB，p38-MAPK和ERK活化和SKBR3细胞中的增殖（图13a,b）。为了进一步测试RANKL刺激的效
18
应，评定这些细胞以不依赖于固着的方式生长的能力，其与体内致瘤性良好关联 。重要的是，类似于EGFR刺激，观察到RANKL诱导软琼脂中SKBR3细胞的生长（图3d），即。RANK信号传导不仅引发增殖，而且作为转化剂诱导不依赖于固着地生长。
3a）。此外，MEC的RANKL刺激引发p38-MAPK和ERK的磷酸化（图11b）。为了直接显示是否RANK介导孕酮下游NFκB-CyclinD1体内活化，将小鼠用MPA攻击。3天MPA治疗导致磷酸化的IκBα的核蓄积，指示有活性的NFκB通路，及乳腺上皮细胞中CyclinD1蛋白表达的Δmam Δmam
诱导，二者在RANK 雌性中严重减少（图12a,b）。而且，在自对照和RANK 雌性分离的MPA/DMBA-诱导的乳腺癌中，我们发现，NFκB通路的损伤的活化（图3b）及细胞周期蛋白D1的下调的mRNA表达（图3c）。在这些原发性肿瘤中，也观察到p21mRNA的上调（图3c），由Id2
17
通路转录抑制的基因 。Id2通路是乳腺上皮细胞中RANKL/RANK的第2个遗传上确认的下
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游通路 。为了延伸这些发现到人，检定人SKBR3乳腺肿瘤细胞。RANKL刺激诱导了NFκB，p38-MAPK和ERK活化和SKBR3细胞中的增殖（图13a,b）。为了进一步测试RANKL刺激的效
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应，评定这些细胞以不依赖于固着的方式生长的能力，其与体内致瘤性良好关联 。重要的是，类似于EGFR刺激，观察到RANKL诱导软琼脂中SKBR3细胞的生长（图3d），即。RANK信号传导不仅引发增殖，而且作为转化剂诱导不依赖于固着地生长。
[0169] 在破骨细胞中，除了NFκB通路之外，钙神经素-NFATc1信号传导通路已发现对于RANKL-RANK介导的骨诱裂发生必要。NFATc1也可在RANKL-介导的骨诱裂发生期间由Id2通路调控。为了评定是否这些关键RANKL-RANK活化通路是也在MPA/DMBA-诱导的乳腺癌中flox/Δ Δmam flox/flox Δmam运作，产生MMTV-Crenfatc1 (NFATc1 )和MMTV-CreIkkα （IKKα ）小鼠以
删除乳腺上皮细胞中的NFATc1和IKKα。两种突变小鼠株在检定的任何器官呈现健康及呈Δmam
现无明显的缺陷。当用MPA/DMBA攻击时，IKKα 小鼠呈现乳腺癌的延迟的发作（图3e）。
Δmam
在自IKKα 小鼠的肿瘤中，发现IKKβ和IKKγ的正常表达，但减少的NFκB活化，如由增加的IκB蛋白水平及降低的p65NFκB磷酸化（图3b）及NFκB靶基因细胞周期蛋白D1的下调的mRNA表达（图3c）测定，提示这些肿瘤中NFκB信号传导的确需要IKKα。如所Δmam Δmam
预期，Id2通路基因p21未影响自IKKα 小鼠的肿瘤（图3c）。观察到对照和NFATc1小鼠之间肿瘤发作中无显著差异（图13c,d），提示下游信号传导需求在破骨细胞祖先和乳腺上皮细胞中不同。由此，乳腺上皮细胞中IKKα，但不NFATc1的缺失影响乳腺癌的发作。
删除乳腺上皮细胞中的NFATc1和IKKα。两种突变小鼠株在检定的任何器官呈现健康及呈Δmam
现无明显的缺陷。当用MPA/DMBA攻击时，IKKα 小鼠呈现乳腺癌的延迟的发作（图3e）。
Δmam
在自IKKα 小鼠的肿瘤中，发现IKKβ和IKKγ的正常表达，但减少的NFκB活化，如由增加的IκB蛋白水平及降低的p65NFκB磷酸化（图3b）及NFκB靶基因细胞周期蛋白D1的下调的mRNA表达（图3c）测定，提示这些肿瘤中NFκB信号传导的确需要IKKα。如所Δmam Δmam
预期，Id2通路基因p21未影响自IKKα 小鼠的肿瘤（图3c）。观察到对照和NFATc1小鼠之间肿瘤发作中无显著差异（图13c,d），提示下游信号传导需求在破骨细胞祖先和乳腺上皮细胞中不同。由此，乳腺上皮细胞中IKKα，但不NFATc1的缺失影响乳腺癌的发作。
[0170] 【实施例17：由于DNA损伤的孕酮驱动的癌发展】
[0171] 为了分析对DNA损伤诸如细胞周期停滞和凋亡的细胞应答中RANKL的作用，将小鼠原发性乳腺上皮细胞（MEC）和RANKL-响应人乳腺癌细胞系SKBR3用DNA损伤剂多柔比星或γ-辐射处理。RANKL处理未改变γH2AX和p53的诱导或Chk1，功能DNA损伤应答的原型标记物的活化（图14a）。而且，在用γ-辐射（图14b,c）或多柔比星（图15a,b）进行DNA损伤之后，RANKL未改变早期细胞周期停滞。意外地，RANKL处理导致显著保护免于响应γ-辐射（图14b,c）和多柔比星-诱导的DNA损伤（图15a,b）的细胞死亡。机理上，在RANKL的存在下未发生促-凋亡性分子Bim，Puma和Noxa的γ-辐射-诱导的上调（图19
15c）。已在体内显示，雌性小鼠的γ-辐射导致乳腺上皮细胞凋亡的5倍诱导 。因此，此之前建立的系统用于评定黄体酮-RANKL/RANK轴对γ-辐射-诱导的细胞死亡的效应。MPA（孕酮）诱导的RANKL/RANK的确体内保护免于乳腺上皮细胞的γ-辐射-诱导的凋亡。乳腺上皮细胞上RANK表达的损失消除MPA对γ-辐射-诱导的细胞死亡的保护性效应（图
3f,g）。而且，IKKα通路涉及在γ-辐射之后乳腺上皮的MPA-诱导的保护（图16a,b）。由此，除了促进细胞周期进展之外，MPA可在DNA损伤之后经RANKL/RANK和IKKα信号传导保护免于细胞死亡。
15c）。已在体内显示，雌性小鼠的γ-辐射导致乳腺上皮细胞凋亡的5倍诱导 。因此，此之前建立的系统用于评定黄体酮-RANKL/RANK轴对γ-辐射-诱导的细胞死亡的效应。MPA（孕酮）诱导的RANKL/RANK的确体内保护免于乳腺上皮细胞的γ-辐射-诱导的凋亡。乳腺上皮细胞上RANK表达的损失消除MPA对γ-辐射-诱导的细胞死亡的保护性效应（图
3f,g）。而且，IKKα通路涉及在γ-辐射之后乳腺上皮的MPA-诱导的保护（图16a,b）。由此，除了促进细胞周期进展之外，MPA可在DNA损伤之后经RANKL/RANK和IKKα信号传导保护免于细胞死亡。
[0172] 【实施例18：作为乳腺癌患者中诊断标记物的RANKL】
[0173] 本文呈现的数据显示，孕酮可诱导RANKL/RANK，其然后驱动乳腺癌。为了确认人乳腺癌患者中的这些研究，分析参与预期UKCTOCS（UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening）研究的女性中的RANKL和黄体酮血清水平（实施例9）。此同群提供了在乳腺癌表现之前研究可溶性RANKL，黄体酮和OPG的血清水平中的变化的独特机会。惊人地，尽管在对照女性中，黄体酮水平和血清RANKL之间无关联，在血清收集后12～24个月发展乳腺癌的女性中有统计学地显著关联（p=0.047,Spearman排序测试）（图4a）。实际上，在高孕酮组之内的女性之中，血清RANKL在发展乳腺癌的组中显著地更高（p=0.01,单尾的Wilcoxon秩和检验）（图4a）。由此，RANKL的高血清水平和高血清黄体酮可用于预测乳腺癌的未来发作。
[0174] 在血清采样之后5～12个月之后发展乳腺癌的女性中的关联不同。与此相比，此组显示在sRANKL和OPG的血清水平中显著改变，其相关于发展乳腺癌的未来似然性（图4b;图17a）。用OPG无该改变见于绝不发展乳腺癌或在血清采样之后12～24个月之间发展乳腺癌的UKCTOCS参与者（图4c;图17b）。
[0175] RANKL/OPG中的这些血清改变呈现为反直观的。但是，此发现与之前数据一致。例如，已报道在骨关节炎患者中，在受影响的骨中的RANKL mRNA水平确实地与骨破坏关联，但11
与血清RANKL水平相反地关联 。而且，对于血清RANKL水平和骨质疏松症显示类似现象：
20
低血清RANKL水平相关于绝经后女性中的非-创伤性断裂的10倍更高风险 。而且，增加
21
的OPG相关于不处于激素取代治疗的绝经后女性中增加的骨损失 。乳腺癌中这些血清变化的机理可反映针对发展微型肿瘤和/或不同身体隔室之内RANKL/OPG的再分布/隔离的补偿性机理。为了避免诊断或预后中数据的错整合，优选比较样品数据与在阴性（不发展癌的患者）对照上的阳性（患者和/或发展的癌的患者）。
与血清RANKL水平相反地关联 。而且，对于血清RANKL水平和骨质疏松症显示类似现象：
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低血清RANKL水平相关于绝经后女性中的非-创伤性断裂的10倍更高风险 。而且，增加
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的OPG相关于不处于激素取代治疗的绝经后女性中增加的骨损失 。乳腺癌中这些血清变化的机理可反映针对发展微型肿瘤和/或不同身体隔室之内RANKL/OPG的再分布/隔离的补偿性机理。为了避免诊断或预后中数据的错整合，优选比较样品数据与在阴性（不发展癌的患者）对照上的阳性（患者和/或发展的癌的患者）。
[0176] 【实施例19：讨论】
[0177] 基于这些结果，以下分子情景如何孕酮诸如MPA驱动乳腺癌是明显的：黄体酮和孕酮（及可能内源性黄体酮系统的去调节诸如在绝经前期）在乳腺中最前引发RANKL的诱导。RANKL经乳腺上皮细胞上的RANK驱动这些细胞进入细胞周期及，重要地，保护小鼠以及人乳腺上皮细胞免于响应DNA损伤包括γ-辐射的凋亡。而且，RANKL-/RANK控制乳腺癌干细胞的自我更新和不依赖于固着地生长。由此，孕酮-诱导的RANKL/RANK给损伤的乳22
腺上皮提供生长和存活优势，起始乳腺癌的前提 。这些效应是，至少部分，经IKKα-NFκB信号传导通路介导。
腺上皮提供生长和存活优势，起始乳腺癌的前提 。这些效应是，至少部分，经IKKα-NFκB信号传导通路介导。
[0178] 这些数据具有一些引起兴趣的含义。例如，孕酮已相关于具有异常乳房x射线照23
片的增加的风险 。由于乳房x射线照片检测微-钙化，以及腺密度和RANKL/RANK在骨代
12,13
谢/矿化中具有关键作用 ，可推测RANKL/RANK贡献于该损伤的钙化和/或腺密度。这是有趣的，因为发现显现乳腺癌发作之前和之后（5～12个月）女性血清中改变的RANKL/OPG比，证明RANKL/OPG血清水平是对于癌的检测有用的生物标记。在本文数据也显示，增加的RANKL和黄体酮血清水平可在肿瘤诊断之前12～24个月预测未来乳腺癌。百万女性在避孕药中采用黄体酮-衍生物及用于激素替代治疗。该激素已与发展乳腺癌的增加的风险流行病学地关联。
片的增加的风险 。由于乳房x射线照片检测微-钙化，以及腺密度和RANKL/RANK在骨代
12,13
谢/矿化中具有关键作用 ，可推测RANKL/RANK贡献于该损伤的钙化和/或腺密度。这是有趣的，因为发现显现乳腺癌发作之前和之后（5～12个月）女性血清中改变的RANKL/OPG比，证明RANKL/OPG血清水平是对于癌的检测有用的生物标记。在本文数据也显示，增加的RANKL和黄体酮血清水平可在肿瘤诊断之前12～24个月预测未来乳腺癌。百万女性在避孕药中采用黄体酮-衍生物及用于激素替代治疗。该激素已与发展乳腺癌的增加的风险流行病学地关联。
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