乳腺癌的诊断和治疗
阅读：474发布：2020-05-13
专利汇可以提供乳腺癌的诊断和治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于癌症诊断、研究和 治疗 的组合物和方法，包括但不限于癌症标记物。具体地，本发明涉及用于受试者对 癌症治疗 的反应的预测的组合物和方法。，下面是乳腺癌的诊断和治疗专利的具体信息内容。
1.一种用于确定作用疗程的方法，其包括
a)检测来自患有乳腺癌的受试者的样品中的循环肿瘤细胞(CTC)水平;
b)基于所述样品中的所述CTC水平来确定作用疗程。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述作用疗程包括抗雌激素疗法。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗雌激素疗法包括他莫昔芬。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗雌激素疗法选自由来曲唑、阿那曲哇和依西美坦组成的组。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述作用疗程包括化疗。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括表征所述CTC上的一种或多种肿瘤标记物的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肿瘤标记物选自由雌激素受体、HER-2、bcl-2、凋亡标记物和ki67组成的组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中使用单克隆抗体M30检测所述凋亡标记物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中使用多重PCR方法检测所述肿瘤标记物中的一种或多种。
10.根据权利要求7所述的方法，其中使用免疫磁测定检测所述肿瘤标记物。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法进一步包括确定CTC-内分泌治疗指数(CTC-ETI)的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述CTC-ETI基于所述肿瘤标记物的所述表达和CTC总数目。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述乳腺癌是转移性的。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述乳腺癌呈雌激素受体阳性。
乳腺癌的诊断和治疗
[0001] 相关申请案
[0002] 本申请要求2010年7月7日提交的临时申请61/362，021和2011年3月31日提交的临时申请61/469，890的优先权，这两篇临时申请均以引用的方式完整地并入本文。
技术领域
[0004] 发明背景
[0005] 乳腺癌是美国妇女中第二个最常见形式的癌症，并且是妇女中癌症死亡的第二大原因。虽然20世纪80年代乳腺癌的新发病例数急剧上升，但现在这个数字似乎已稳定下来。乳腺癌死亡率的下降可能是因为越来越多的妇女接受乳房X光检查。在早期被检测到时，乳腺癌成功治疗的机会有很大的提高。
[0006] 手术、放疗、化疗和激素疗法对乳腺癌有很高的治疗性，这种病在早期阶段被检测到时很多时候是可治愈的。乳腺X线照相术是乳腺癌的早期检测的最重要的筛检方法。乳腺癌被分成多种子类型，但其中仅有少数几种影响预后或疗法选择。在初步怀疑患乳腺癌后的病人管理一般包括该诊断的确认、疾病阶段的评价，和疗法选择。诊断可以通过以下方式确认：抽吸细胞学检查、用立体定向或超声波技术对不可触及的病变进行针芯活检，或者切取活检或切除活检。在用手术切除肿瘤组织的时候，对它的一部分进行处理以测定ER和PR水平。
[0007] 预后和疗法选择受到以下因素影响：患者的年龄、疾病的阶段、包括肿瘤坏死的存在在内的原发肿瘤的病理特征、肿瘤组织中的雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)水平、HER2过表达状态和增殖能力的测量，以及绝经状况和一般健康状况。超重患者可能有较差的预后(Bastarrachea等人，Annals ofInternal Medicine，120：18[1994])。预后还可能因种族而不同，黑人与白人相比具有较差的预后，拉美裔人亦是如此，只是程度较轻(Elledge等人，Journal of the National Cancer Institute86：705[1994]；Edwards等人，Journal ofClinical Oncology16：2693[1998])。
[0008] 乳腺癌的三种主要治疗为手术、放射，和药物疗法。没有哪种治疗适合每一位患者，而且往往需要两种或两种以上的治疗方式。治疗的选择由许多因素决定，包括患者的年龄和她的绝经状况、癌症类型(例如，乳腺导管与小叶)、它的阶段、该肿瘤是否是激素感受性肿瘤，以及它的侵袭水平。
[0009] 乳腺癌治疗被定义为局部或全身性治疗。手术和放射被认为是局部疗法，因为它们直接治疗肿瘤、乳房、淋巴结，或其他特定区域。药物治疗称为全身性疗法，因为它的影响广泛传播。药物疗法包括典型的化疗药物、激素阻断治疗(例如，芳香酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂和雌激素受体下调剂)，以及单克隆抗体治疗(例如，对抗HER2)。它们可以单独使用，或者最经常以不同组合形式使用。
[0010] 需要另外的治疗，特别是针对患者的肿瘤定制的治疗。发明概要
[0011] 本发明涉及用于癌症诊断、研究和治疗的组合物和方法，包括但不限于癌症标记物。具体地，本发明涉及用于受试者对癌症治疗的反应的预测的组合物和方法。
[0012] 在一些实施方案中，本发明的组合物和方法可用于确定受试者(例如，被诊断为患有转移性乳腺癌的受试者)的生存预后或对治疗(例如，抗雌激素治疗)的反应。此类方法可用于研究和临床应用。
[0013] 例如，在一些实施方案中，本发明提供了用于确定作用疗程的方法，其包括检测来自诊断为患有转移性乳腺癌的受试者的样品中的循环肿瘤细胞(CTC)的水平；以及基于样品中的CTC水平来确定作用疗程。在一些实施方案中，作用疗程包括抗雌激素治疗(例如，他莫昔芬(tamoxifen)或芳香酶抑制剂如来曲唑(1etrozole)、阿那曲唑(anastrozole)或依西美坦(exemestane))。在其他实施方案中，作用疗程包括化疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括表征一种或多种与CTC相关的肿瘤标记物(例如，雌激素受体、HER-2、bcl-2、凋亡标记物、IGFR1、波形蛋白(vimentim)或ki67)的步骤。在一些实施方案中，使用单克隆抗体M30检测凋亡标记物。在一些实施方案中，转移性乳腺癌呈雌激素受体阳性。在一些实施方案中，使用多重技术(例如，多重PCR)或免疫磁测定法检测该肿瘤标记物中的一种或多种。在一些实施方案中，测定是自动执行的。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定CTC-内分泌治疗指数(CTC-ETI)的步骤。在一些实施方案中，通过为CTC和肿瘤标记物的水平分配点来计算CTC-ETI。在一些实施方案中，低CTC-ETI指示受试者可能对内分泌(例如，抗雌激素)疗法起反应。在一些实施方案中，高CTC-ETI得分指示受试者不大可能对内分泌疗法起反应并且最好用化疗治疗。
[0015] 图1示出癌细胞系中的雌激素受体的表达。
[0016] 图2示出癌细胞系中的a)Bcl-2、b)Ki-67和c)HER-2的表达。
[0017] 图3示出癌细胞系的CTC-ETI评分的计算。
[0018] 图4示出三位患者的CTC-ETI评分的计算。
[0019] 图5示出CTC-ETI评分的示例性临床研究和乳腺癌的临床结果的图解。
[0020] 图6示出CTC-ETI评分的示例性临床研究和乳腺癌的临床结果的图解。
[0021] 图7示出CTC-ETI评分的示例性临床研究和乳腺癌的临床结果的图解。
[0022] 图8示出CTC-ETI评分受监测的8位患者的临床研究的结果。
[0023] 定义
[0024] 为有助于理解本发明，下面定义许多术语和短语：
[0025] 如本文所使用的术语“检测”(detect，detect ing，detect ion)可以描述发现或辨别的一般行为或者对组合物的特定观察。
[0026] 如本文所使用的术语“核酸分子”是指任何含有核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。该术语包括含有DNA和RNA的任意已知碱基类似物的序列，所述碱基类似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖辫苷、5′-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。
[0027] 术语“基因”是指包含产生多肽、前体或RNA(例如，rRNA、tRNA)必需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可由全长编码序列或所述编码序列的任何部分编码，只要全长或片段的所需活性或功能特征(例如，酶活性、配体结合性、信号转导、免疫原性等)得以保留即可。该术语也包括结构基因的编码区和与编码区5′和3′两个末端相邻、距离任一端大约1kb或1kb以上的序列，使得所述基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5′端并存在于mRNA上的序列被称作5′非翻译序列。位于编码区的3′端或下游并存在于mRNA上的序列称作3′非翻译序列。术语“基因”包括cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含被称作“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列打断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可含有调控元件如增强子。内含子从核或初级转录物中被除去或“剪接去除”；因此内含子在信使RNA(mRNA)转录物中不存在。在翻译过程中mRNA起到的作用是确定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。
[0028] 如本文所使用的术语“异源基因”是指在其自然环境中不存在的基因。例如，异源基因包括导入到一个物种中的来自另一个物种的基因。异源基因也包括生物体所固有的但以一些方式(例如，经突变、加入多个拷贝、连接至非天然调控序列等)改变的基因。异源基因与内源基因的区别在于异源基因序列通常连接至这样的DNA序列，所述DNA序列没有天然地与染色体中的基因序列缔合，或者与在自然界中未发现的染色体的部分(例如，在基因非正常表达的基因座中被表达的基因)缔合。
[0029] 如本文所使用的术语“寡核苷酸”是指单链多核苷酸链的短长度。寡核苷酸的长度通常小于200个残基(例如，15至100个之间)，然而，如本文使用的该术语也意在包括更长的多核苷酸链。寡核苷酸经常用它们的长度来表示。例如，24残基寡核苷酸称作“24-mer”。通过自杂交或通过与其他多核苷酸杂交，寡核苷酸可以形成二级和三级结构。此类结构可以包括但不限于双链体、发夹、十字形、弯曲和三链体。
[0030] 如本文所使用的术语“互补的”或“互补”用来指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“5′-A-G-T-3′”和序列“3′-T-C-A-5′”互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基依据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交的效率和强度具有重大影响。这在扩增反应，以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。
[0031] 如本文所使用的术语“同源”是指互补程度。可存在部分同源或完全同源(即同一性)。部分互补的序列是至少部分地抑制完全互补的核酸分子与“基本上同源的”靶核酸杂交的核酸分子。对完全互补的序列与靶序列的杂交的抑制可使用杂交测定法(DNA印迹或RNA印迹、溶液杂交等)在低严格条件下进行检验。在低严格条件下，基本上同源的序列或探针将竞争并抑制完全同源的核酸分子与靶标的结合(即杂交)。这并不是说低严格条件是允许非特异性结合的条件；低严格条件要求两序列彼此之间的结合是特异性(即选择性)的相互作用。非特异性结合的不存在可通过使用基本上不互补(例如，低于约30％的同一性)的第二靶标进行测试；在非特异性结合不存在时，该探针将不会与第二非互补靶标杂交。
[0032] 当用于指双链核酸序列如cDNA或基因组克隆时，术语“基本上同源”是指在如上文所述的低严格条件下能与所述双链核酸序列的一条或两条链杂交的任何探针。
[0033] 基因可产生多个RNA物种，其是由初级RNA转录物的差异剪接而生成的。作为相同基因剪接变体的cDNA将含有具有序列同一性或完全同源性的区域(代表两种cDNA上存在相同外显子或相同外显子的一部分)，以及具有完全非同一性的区域(例如，代表cDNA1上存在外显子“A”，而其中cDNA2含有外显子“B”)。由于这两种cDNA含有具有序列同一性的区域，因此它们都将与衍生自完整基因或含有在两种cDNA上均存在的序列的基因部分的探针杂交；这两个剪接变体因此与此种探针以及彼此之间基本上同源。
[0034] 当用于指单链核酸序列时，术语“基本上同源”是指在如上文所述的低严格条件下能与单链核酸序列杂交的任何探针(即它是单链核酸序列的互补体)。
[0035] 如本文所使用的术语“杂交”用来指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即核酸之间的缔合强度)受到诸如核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格程度、所形成的杂合体的Tm，以及核酸内的G：C比等因素的影响。在其结构内包含互补核酸配对的单个分子被说成是“自杂交的”。
[0036] 如本文所使用的术语“严格”用来指进行核酸杂交的温度、离子强度，以及其他化合物如有机溶剂的存在的条件。在“低严格条件”下，所关注的核酸序列将与其精确互补物、具有单碱基错配的序列、密切相关的序列(如具有90％或更高同源性的序列)，以及仅有部分同源性的序列(如具有50-90％同源性的序列)杂交。在“中等严格条件”下，所关注的核酸序列将仅与其精确互补物、具有单碱基错配的序列，以及密切相关的序列(如具有90％或更高同源性的序列)杂交。在“高严格条件”下，所关注的核酸序列将仅与其精确互补物以及(取决于条件如温度)具有单碱基错配的序列杂交。换言之，在高严格条件下，可提高温度以排除与具有单碱基错配的序列的杂交。
[0037] “高严格条件”用于指核酸杂交时指的是包括等同于下述的条件：在42℃下在由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.5％SDS、5X Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后，当使用约500个核苷酸长度的探针时，在42℃下在包含0.1X SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤。
[0038] “中等严格条件”用于指核酸杂交时指的是包括等同于下述的条件：在42℃下在由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、
0.5％SDS、5X Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后，当使用约500个核苷酸长度的探针时，在42℃下在包含1.0X SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤。
0.5％SDS、5X Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后，当使用约500个核苷酸长度的探针时，在42℃下在包含1.0X SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤。
[0039] “低严格条件”包括等同于下述的条件：在42℃下在由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.1％SDS、5X Denhardt试剂[每500ml50X Denhardt试剂含有：5g Ficoll(型号400，Pharamcia)、5g BSA(FractionV；Sigma)]和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后，当使用约500个核苷酸长度的探针时，在42℃下在包含5X SSPE、0.1％SDS的溶液中洗涤。
[0040] 本领域熟知可采用许多等同条件构成低严格条件；考虑诸如以下的因素：探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶标(存在于溶液中或固定化的DNA、RNA、碱基组成等)的性质，以及盐和其他组分(如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在与否)的浓度，并且可改变杂交溶液以产生不同于但又等同于上文所列条件的低严格杂交条件。另外，本领域已知促进在高严格条件下杂交的条件(例如，提高杂交和/或洗涤步骤的温度、在杂交溶液中使用甲酰胺等)(见上文“严格”定义)。
[0041] 如本文所使用的术语“扩增寡核苷酸”是指与靶核酸或它的补体杂交且参与核酸扩增反应的寡核苷酸。扩增寡核苷酸的实例是在扩增过程中与模板核酸杂交且含有被聚合酶延伸的3′OH末端的“引物”。扩增寡核苷酸的另一个实例是不被聚合酶延伸(例如，因为它具有3′封闭端)、但是参与或促进扩增的寡核苷酸。扩增寡核苷酸可以任选地包括修饰的核苷酸或类似物或参与扩增反应、但是不与靶核酸互补或不包含在靶核酸内的另外的核苷酸。扩增寡核苷酸可以含有不与靶标或模板序列互补的序列。例如，引物的5′区域可以包括不与靶核酸互补的启动子序列(称作“启动子-引物”)。本领域技术人员会理解，起引物作用的扩增寡核苷酸可以被修饰成包括5′启动子序列，并因而起启动子-引物作用。类似地，启动子-引物可以通过去除启动子序列或被合成成不含启动子序列来进行修饰，并且仍然起引物的作用。3′封闭的扩增寡核苷酸可以提供启动子序列，并且用作聚合模板(称作“启动子-提供者”)。
[0042] 如本文所使用的术语“引物”是指寡核苷酸，无论是在纯化的限制酶切消化中天然产生的还是合成生产的，所述寡核苷酸在被置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下(即，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶存在下，并且在合适的温度和pH下)时能作为合成的起点。所述引物优选为单链以实现最大扩增效率，但是可替代地为双链。如果为双链，所述引物在用于制备延伸产物之前，先处理所述引物以分离它的链。优选地，所述引物是寡脱氧核糖核苷酸。所述引物必须足够长，以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。
[0043] 如本文所使用的术语“探针”是指寡核苷酸(即，核苷酸序列)，无论是在纯化的限制酶切消化中天然产生的还是通过重组或通过PCR扩增合成生产的，所述寡核苷酸能够与另一种所关注的寡核苷酸的至少一部分杂交。探针可以为单链或双链。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。预见到可以用任何“报告分子”标记在本发明中使用的任何探针，以便所述探针在任何检测系统中都可被检测到，所述检测系统包括但不限于酶(例如，ELISA以及基于酶的组织化学测定法)系统、荧光系统、放射性系统和发光系统。本发明无意限于任何特定检测系统或标记。
[0044] 当术语“分离的”针对核酸使用时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中，是指这样的核酸序列，其被鉴定并且从至少一种在其天然来源中通常与其相联系的组分或污染物中分离出来。分离的核酸以不同于其在自然界中被发现的形式或背景存在。相反地，未分离的核酸是诸如以其在自然界中存在的状态被发现的DNA和RNA的核酸。例如，给定的DNA序列(例如，基因)被发现在宿主细胞染色体上与相邻基因接近；RNA序列如编码特定蛋白的特定mRNA序列以与许多其他编码大量蛋白质的mRNA的混合物形式存在于细胞中。然而，编码给定蛋白的分离的核酸包括，例如，此种在细胞中通常表达给定蛋白质的核酸，其中所述核酸存在于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置上，或者所述核酸的侧翼存在不同于在自然界被发现的核酸序列的核酸序列。所述分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以单链或双链形式存在。当要利用分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸表达蛋白质时，所述寡核苷酸或多核苷酸将至少含有有义链或编码链(即，所述寡核苷酸或多核苷酸可以是单链)，但是可以既含有有义链又含有反义链(即，所述寡核苷酸或多核苷酸可以是双链)。
[0045] 如本文所使用的术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中除去组分(例如污染物)。例如，通过除去污染非免疫球蛋白类蛋白来纯化抗体；还通过除去不与靶分子结合的免疫球蛋白来纯化抗体。非免疫球蛋白类蛋白的去除和/或不与靶分子结合的免疫球蛋白的去除导致样品中靶-反应性免疫球蛋白的百分比增大。在另一个实例中，在细菌宿主细胞中表达重组多肽，并且通过除去宿主细胞蛋白来纯化所述多肽；由此提高样品中重组多肽的百分比。
[0046] 如本文所使用的术语“样品”以其最广泛的意义使用。在一种意义上，它意在包括从任何来源获得的样本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可以从动物(包括人)获取并且包括流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，如血浆、血清等。环境样品包括环境材料如表面物质、土壤、水、晶体和工业样品。但此类实例不应被解读为限制适用于本发明的样品类型。
具体实施方式
[0047] 本发明涉及用于癌症诊断、研究和治疗的组合物和方法，包括但不限于癌症标记物。具体地，本发明涉及用于受试者对癌症治疗的反应的预测的组合物和方法。
[0048] 在过去的30年里乳腺癌的死亡率在西方世界有所下降，这部分由于全身辅助治疗的广泛应用。然而，在2008年美国超过40,000名妇女将死于转移性乳腺癌。虽然偶有转移性乳腺癌患者似乎被治愈，但大多数患者注定最终死于这种疾病。但是，已为这种环境下的患者引入许多新疗法，使得生存有了适度延长且缓解有着实质性改善。
[0049] 因此，对于大多数转移性乳腺癌患者的治疗目标是选择反应可能性最高且毒性可能性最低的疗法，从而平衡癌症的症状与治疗的副作用。确实，现在有各种各样的策略和药剂可用于治疗这些患者。这些包括化疗(现在有10种以上批准用于治疗转移性乳腺癌的不同药剂)，以及抗HER2疗法(曲妥珠单抗、拉帕替尼)，而且虽然抗血管生成疗法没有被FDA批准，但它也显得相当有前途。然而，治疗转移性乳腺癌患者的主要支柱之一是抗雌激素疗法。
[0050] 乳腺癌可以用多种抗雌激素方法治疗，这些方法基本上可以分为附加激素疗法(Additive)和消除激素疗法(Ablative)。最常用的附加激素疗法是选择性雌激素受体调节剂(SERM)他莫昔芬(tamoxifen)，但是雄激素疗法如氟甲睾酮(fluoxymesterone)和促孕剂如醋酸甲地孕酮也是有效的。消除激素疗法在过去主要通过手术实现，但最近已在绝经前妇女中用促黄体激素释放激素激动剂和拮抗剂如戈舍瑞林(goserlin)或亮丙瑞林(leuprolide)实现消除激素疗法，并且已在绝经后妇女中用抑制芳香酶诱导的前体二氢表雄烯二酮(dihydroepiandrostenidione)(DHEA)和睾酮转化成雌二醇和雌酮的药剂实现消除激素疗法。在美国有三种可用的芳香酶抑制剂(AI)：来曲唑、阿那曲唑和依西美坦。
[0051] 对于转移性乳腺癌患者合适的治疗的选择基于两个因素：预后和预测。在这方面，抗雌激素疗法可以被认为是最早的“靶向性”疗法。随后的研究已证明他莫昔芬在ER阴性乳腺癌患者中是无效的。然而，抗雌激素治疗仅在30-50％的患有处于转移环境或早期环境的ER阳性(或“丰富的”)肿瘤的妇女中是有效的。预见到，ER阳性但内分泌难治性的转移性乳腺癌的患者最好用直接化疗进行治疗，尽管其有增大的毒副反应，而不要在数个月的无效但毒性较低的内分泌治疗尝试期间延迟化疗。
[0052] 在为转移性乳腺癌患者选择姑息治疗方案后，出于以下两个原因之一要终止它并让患者开始新的治疗方法：1)所选择的疗法毒性太强，以至于即使它起作用，它也不可能诱导缓解，或2)它不起作用并且肿瘤进展。确定这些现象，尤其是确定后者的当前方法包括病史、体格检查、血清学测试，和放射线照相术评价。由于主观性问题以及超过50％的患者仅在内部器官如骨、肝和肺中有转移病变的事实，病史和体格检查是众所周知地不可靠的。非特异性血清学检查，如来自骨(碱性磷酸酶)和肝(碱性磷酸酶、血清谷氨酸草酸转移酶等)的酶缺乏可用于确定进展的足够的敏感性和特异性。至少三个类别的肿瘤相关的肿瘤标记物已用于监测此类患者。这些包括针对MUC-1蛋白(CAl5-3、CA27.29)的测定、针对癌胚抗原(CEA)的测定，以及针对HER2的细胞外域的测定。美国临床肿瘤协会肿瘤标记物指导小组(The American Society of Clinical Oncology Tumor Marker Guideline Panel)已建议至少将CA15-3和CEA用于监测选定的转移性乳腺癌患者。然而，在所有这三种情况下，治疗反应或失败的早期决定被“肿瘤标记物尖峰(spike)”现象所扰乱，其中在最终觉得对治疗起反应的患者中的多达25％患者中，该标记物实际上增加了几个星期至几个月，然后它下降至或低于基线。因此，迄今为止，在新启动的治疗的前一至二个月期间，循环肿瘤标记物结果在确定进展方面根本没有任何价值。
[0053] 放射线照相成像一直是确定转移性乳腺癌患者的临床过程的最受推崇的方式。已经制定严格的标准来定义X射线平片、计算机断层照相和磁共振成像的反应性、稳定性和进展。然而，放射线照相成像有几个缺点。所有这些方式对进展的敏感性在前一个或两个治疗循环期间对于大多数患者都差，特别是后面二种方式不方便、昂贵并且伴随着对患者造成不适。因此，通常不执行这些测试，一直到在启动新疗法后患者已接受几个月的治疗才执行。也许更重要地，只有约50％的转移性乳腺癌患者将有“可测量的”疾病，而他们将在骨和/或胸膜中具有“不可测量的”病变或者在皮肤和肺中具有“军事(military)”病变，该病变太小以至于不能准确定量。监测“单独的骨”疾病患者的努力成果一直特别令人沮丧。用焦磷酸锝进行的骨闪烁照相术是最广泛使用的监测这些患者的成像方式，但是它受到对检测进展的相对差的敏感性以及受到所谓的“闪烁照相闪光”限制，其中发现对治疗，特别是内分泌治疗起反应的患者在已知病变中具有增加的放射性示踪物摄取，并且随着成骨愈合活性的增加甚至会出现新摄取区域。
[0054] 可选择快速进展容易通过临床、血清学和/或影像学手段确定的患者。然而，许多转移性乳腺癌患者在确定新启动的治疗是否有可能在随后的几个月内获得成功或者它是否是无效方案方面提出临床挑战。如果是这样的话，此类患者最好用潜在更有效、即使毒性较强的治疗方式如化疗来治疗。
[0055] 因此，在一些实施方案中，本发明提供了鉴定不大可能对抗雌激素疗法起反应的ER阳性转移性乳腺癌患者的方法。在此类患者中，传统的化疗可以立即启动或者在抗雌激素疗法的短暂尝试后启动。在一些实施方案中，本发明方法允许较早地监测当前治疗的有效性。在此类情形下，可以为对其当前治疗不起反应的受试者选择替代的治疗。
[0056] 在一些实施方案中，本发明提供了利用循环肿瘤细胞(CTC)分析的方法，例如，在一些实施方案中，本发明提供了通过定量CTC水平来确定抗雌激素疗法的有效性的方法。在一些实施方案中，CTC水平用来确定预后及指导作用疗程。
[0057] 在一些实施方案中，将CTC水平与未患癌症的受试者的水平或没有诊断出癌症的受试者的群体平均水平相比较。在一些实施方案中，将CTC与诊断为患有转移性胰腺癌的受试者(包括已对抗雌激素疗法起反应和不起反应的那些受试者)的群体平均水平相比较。在其他实施方案中，随时间监测诊断为患有转移性或非转移性乳腺癌的受试者中的CTC水平。
[0058] 在其他实施方案中，表征一种或多种与CTC关联的肿瘤标记物，以便辨别抗雌激素疗法对其有良好效果的妇女与似乎激素难以治疗的妇女，并从而确定预后或作用疗程。在一些实施方案中，该肿瘤标记物包括但不限于，ER、HER2、bcl-2、凋亡(用单克隆M30染色)、IGRFR1、波形蛋白和Ki67。另外的肿瘤标记物也可以使用并且是本领域技术人员已知的。本发明考虑了已知和未知(例如，尚未被发现)的肿瘤标记物。优选的肿瘤标记物是存在于CTC上并且指示(单独或组合)对抗雌激素疗法反应的那些标记。
[0059] 在一些实施方案中，将CTC上的肿瘤标记物的状态与这些相同标记物在从同一患者收集的原发和/或转移组织中的状态相关联。
[0060] I.循环肿瘤细胞
[0061] 肿瘤细胞于150多年前首次在尸检时在人体循环系统中被识别。最近的技术进步已允许开发利用免疫磁方法从全血中分离循环肿瘤细胞(CTC)的高度自动化的标准化系统。在一些实施方案中，本发明方法利用CellSearchTM系统(Immunicon Corporation，Huntingdon Valley，PA)定量CTC(Allard等人，Clin Cancer Res2004；10(20)：6897-904；Cristofanilli等人，N Engl J Med2004；351(8)：781-91；其中的每一篇均以引用的方式完整地并入本文)。CELL SEARCH系统鉴定这样的“事件”，该事件然后被用抗细胞角蛋白抗体进行的免疫荧光染色表征为上皮来源，并凭借DAPI染色被确定为细胞性的。利用用对抗CD45的单克隆抗体进行的免疫荧光染色鉴定污染白细胞，将结果以数字格式用图片显示。
[0062] 本发明不限于CELL SEARCH系统的使用。可以利用分离和/或定量CTC的任何方法。
[0063] II.肿瘤标记物
[0064] 在一些实施方案中，本发明提供了鉴定与CTC关联的肿瘤标记物的方法。下面更详细地描述了示例性肿瘤标记物。
[0065] 雌激素受体(ER)。其中，指示独立于雌激素疗法的所选择的标记物包括ER、HER2、bcl-2的相对水平，和凋亡测量。数项研究已揭示ER表达与来自内分泌疗法的益处之间的关联不是二分的，而是与ER蛋白的定量水平相关。因此，不同的截断值已用来为不同的ER测定二分为“阳性”与“阴性”。在一些实施方案中，使用可在CTC中测量的ER相对水平来辅助确定对内分泌疗法的反应的可能性。
[0066] HER2。多种临床前和临床调查已表明，在ER阳性乳腺癌中HER2过表达和/或扩增降低了对内分泌治疗的敏感性。本发明不局限于特定机制。事实上，对机制的理解并非实施本发明所必需的。虽然如此，但预见到患有呈ER阳性、但也呈HER2阳性的乳腺癌的患者不太可能受益于抗雌激素治疗。
[0067] BCL-2。BCL-2是保护细胞不进入程序性细胞死亡途径的抗凋亡蛋白。BCL-2在乳腺癌中普遍表达并且与较差的预后关联。与ER阴性乳腺癌相比，BCL-2表达更普遍地表达于ER阳性乳腺癌中。临床前研究和一些临床研究表明BCL-2表达似乎与对抗雌激素疗法的抗性关联。本发明不局限于特定机制。事实上，对机制的理解并非实施本发明所必需的。虽然如此，但预见到ER阳性、BCL-2阳性的乳腺癌更可能是内分泌治疗难以治疗的。
[0068] 凋亡。抗雌激素疗法的一种作用机制是经由伴有凋亡的程序性细胞死亡介导。因此，凋亡的连续监测提供了乳腺癌细胞死亡的证据。化疗和激素疗法的手术前研究已经证明早期的凋亡诱导与随后的临床反应关联。本发明不局限于特定机制。事实上，对机制的理解并非实施本发明所必需的。虽然如此，但预见到凋亡的连续评价提供了抗雌激素疗法的有效性的指示。
[0069] KI-67。Ki-67是反映细胞转换(turnover)的增殖抗原。初生组织中的Ki-67免疫组织化学染色与早期乳腺癌的预后关联。在新辅助疗法研究中，Ki67水平的降低已经与来自包括他莫昔芬和芳香酶抑制剂在内的抗雌激素疗法的明显益处相关。本发明不局限于特定机制。事实上，对机制的理解并非实施本发明所必需的。虽然如此，但预见到在内分泌治疗之前和期间与CTC关联的Ki67的连续评价提供了受益可能性的指示。
[0070] 在一些实施方案中，以多重格式或格点格式(panelformat)检测一种或多种上述标记物。例如，在一些实施方案中，利用基于多参数rt-PCR的测定如OncotypeDXTM(Genomic Health Inc，CA)。将ER、BCL-2、HER2和Ki67表达的相对值导入(drive)用于导出OncotypeDx“Recurrence Score(RS)”的算法中。高度有效的相关研究已经证明，具有低RS(反映出具有高ER、低HER2、低BCL-2和低Ki67)的结节阴性和结节阳性患者在用单独的他莫昔芬治疗时都有预后，而具有高复发评分(反映出具有低ER、高HER2、高BCL-2和高Ki67)的那些在用单独的他莫昔芬治疗时具有差得多的预后，但更可能受益于化疗(Paik等人，N Engl J Med2004；351：2817-26；Paik等人，J Clin Oncol2006；
24：3726-34)。
24：3726-34)。
[0071] III.检测方法
[0072] 下面提供了检测与CTC关联的标记物的示例性方法。然而，可以利用任何合适的检测肿瘤标记物核酸或蛋白质的方法。
[0073] A.DNA和RNA检测
[0074] 在一些实施方案中，使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术，将肿瘤标记物检测为mRNA，所述多种核酸技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增。
[0075] 1.测序
[0076] 核酸测序技术的说明性非限制性实例包括但不限于，链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域普通技术人员将会认识到，因为RNA在细胞中较不稳定并且在实验中较易受核酸酶攻击，因此通常在测序前将RNA反转录成DNA。
[0077] 链终止子测序使用序列-特异性的DNA合成反应终止，其中使用修饰的核苷酸底物。在模板DNA上的特异性位点开始延伸，这通过使用在该区域与模板互补的短放射性的或其他标记的寡核苷酸引物进行。使用DNA聚合酶、标准的4种脱氧核苷酸碱基和低浓度的单链终止核苷酸(最常见的是二脱氧核苷酸)延伸寡核苷酸引物。将这个反应在4个单独的管中重复进行，每种碱基轮流作为二脱氧核苷酸。DNA聚合酶对链终止核苷酸的有限掺入导致产生一系列相关的DNA片段，这些片段仅仅在使用特定二脱氧核苷酸的位置处终止。对于每个反应管，通过在平板聚丙烯酰胺凝胶或填充有粘稠聚合物的毛细管中电泳来按大小分离该片段。随着从凝胶顶部向底部的扫描，通过阅读哪个泳道产生来自标记的引物的可视标记来确定序列。
[0079] 2.杂交
[0080] 核酸杂交技术的说明性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列，以及DNA或RNA印迹。
[0081] 原位杂交(ISH)是一类杂交，其使用标记的互补DNA或RNA链作为探针来定位组织的一部分或切片中的特异性DNA或RNA序列(原位)，或者，如果所述组织足够小，则定位整个组织(全胚ISH)中的特异性DNA或RNA序列。DNA ISH可以用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位在组织切片或全胚内的mRNA和其他转录物。通常对样品细胞和组织加以处理以将目标转录物固定在适当的位置并增加探针接近的机会。使探针在高温下与靶序列杂交，然后洗掉多余的探针。分别使用自动射线照相术、荧光显微术或免疫组织化学，在组织中定位并定量用放射性-、荧光-或抗原-标记的碱基标记的探针。ISH也可以使用2种或更多种用放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测2种或更多种转录物。
[0082] 2.1FISH
[0083] 在一些实施方案中，使用荧光原位杂交(FISH)检测肿瘤标记物序列。本发明的优选FISH测定法使用细菌人工染色体(BAC)。这些细菌人工染色体已经广泛地用于人基因组测序项目(见Nature 409：953-958(2001))，并且含有特定BAC的克隆可以从经销商处得到，经销商可以通过许多来源，例如，NCBI找到。来自人基因组的每种BAC克隆已经给出了参考名称，该参考名称可以明确地对其进行识别。可以利用这些名称找到相应的GenBank序列和从经销商处订购克隆的拷贝。
[0084] 用于执行FISH的具体方案是本领域熟知的，并且可以容易地修改用于本发明。有关方法的指南可以从许多参考文献获得，包括：In situ Hybridization：Medical Applications( 编 者 G.R.Coulton 和 J.de Belleroche)，Kluwer Academic Publishers，Boston (1 992)；Insitu Hybridization：In Neurobiology；Advances in Methodology(编者J.H.Eberwine，K.L.Valentino，和J.D.Barchas)，Oxford University Press Inc.，England(1994)；Insitu Hybridization：A Practical Approach( 编 者D.G.Wilkinson)，Oxford University Press Inc.，England(1992))；Kuo，等人，Am.J.Hum.Genet.49：112-119(1991)；Klinger，等 人，Am.J.Hum.Genet.51 ∶55-65(1992)；以 及Ward，等人，Am.J.Hum.Genet.52：854-865(1993))。也可以商购获得试剂盒，它们提供了执行FISH测定的方案(可从例如Oncor，Inc.，Gaithersburg，MD得到)。提供有关方法的指南的专利包括U.S.5,225,326、5,545,524、6,121,489和6,573,043。所有这些参考文献都以引用的方式完整地并入本文，并且可以与本领域中类似的参考文献，以及与本文实施例部分中提供的信息一起使用来建立对于特定实施室方便的程序步骤。
[0085] 2.2微阵列
[0086] 不同类型的生物测定法被称作微阵列，包括但不限于：DNA微阵列(例如，cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列)、蛋白微阵列、组织微阵列、转染或细胞微阵列、化学化合物微阵列，和抗体微阵列。DNA微阵列通常称作基因芯片、DNA芯片或生物芯片，是附连至固体表面(例如玻璃、塑料或硅芯片)，形成阵列的微观DNA点的集合，所述形成的阵列的目的是描绘表达或同时监测数千个基因的表达水平。固定的DNA片段称作探针，在单个DNA微阵列中可以使用数千个探针。微阵列可以用于通过比较疾病和正常细胞中的基因表达来鉴定疾病基因。微阵列可以使用多种技术制造，包括但不限于：用细尖针印刷到载玻片上、使用预制遮罩的影印石版术、使用动态微镜装置的影印石版术、喷墨打印，或者在微电极阵列上的电化学。
[0087] DNA和RNA印迹分别用于检测特定DNA或RNA序列。使从样品提取的DNA或RNA破碎，在基质凝胶上对其进行电泳分离，并将其转移到膜滤器中。使滤器结合的DNA或RNA和与所关注的序列互补的标记的探针杂交。检测结合至滤器的杂交的探针。该操作的变体是反转RNA印迹，其中固定到膜上的底物核酸是分离的DNA片段的集合，并且该探针是从组织提取并标记的RNA。
[0088] 3.扩增
[0089] 可以在检测之前或与检测同时，扩增基因组DNA和mRNA。核酸扩增技术的说明性非限制性实例包括但不限于，聚合酶链式反应(PCR)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录-介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)，和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域普通技术人员将会认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增之前将RNA反转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。
[0090] 聚合酶链式反应(美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188，它们均以引用的方式完整地并入本文)通常称作PCR，它使用多个由变性、将引物对退火成相反链，和将引物延伸组成的循环来使靶核酸序列的拷贝数呈指数增加。在称作RT-PCR的变型中，使用反转录酶(RT)由mRNA制备互补DNA(cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA从而产生多个DNA拷贝。对于PCR的其他各种变换，参见例如，美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159；Mullis等人，Meth.Enzymol.155：335(1987)；以及Murakawa等人，DNA7：287(1988)，它们均以引用的方式完整地并入本文。
[0091] 转录介导的扩增(美国专利号5,480,784和5,399,491，它们均以引用的方式完整地并入本文)通常称作TMA，它在基本上恒定的温度、离子强度和pH条件下自催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自催化地产生其他拷贝。参见，例如，美国专利号5,399,491和5,824,518，它们均以引用的方式完整地并入本文。在美国公布号20060046265(以引用的方式完整地并入本文)中描述的变型中，TMA任选地包括使用封闭部分、终止部分和其他修饰部分来提高TMA过程灵敏度和准确度。
[0092] 连接酶链反应(Weiss，R.，Science254：1292(1991)，以引用的方式完整地并入本文)通常称作LCR，它使用2组与靶核酸的邻近区域杂交的互补DNA寡核苷酸。在重复的由热变性、杂交和连接组成的循环中，使DNA寡核苷酸通过DNA连接酶共价连接，从而产生可检测的双链连接的寡核苷酸产物。
[0093] 链置换扩增(Walker,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：392-396(1992)；美国专利号5,270,184和5,455,166，它们以引用的方式完整地并入本文)通常称作SDA，它使用由下列组成的循环：将引物序列对退火成靶序列的相反链；在dNTPαS存在下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的引物延伸产物；内切核酸酶-介导的半修饰的限制内切核酸酶识别位点的切割；以及聚合酶-介导的从切口的3′端的引物延伸以置换现有链和产生用于下一轮引物退火、切割和链置换的链，导致产物的几何扩增。嗜热SDA(tSDA)以基本上相同的方法在更高的温度下使用嗜热内切核酸酶和聚合酶(EP专利号0684315)。
[0094] 其他扩增方法包括，例如：基于核酸序列的扩增(美国专利号5,130,238，以引用的方式完整地并入本文)，通常称作NASBA；使用RNA复制酶扩增探针分子自身的扩增方法(Lizardi等人，BioTechnol.6：1197(1988)，以引用的方式完整地并入本文)，通常称作Qβ复制酶；基于转录的扩增方法(Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173(1989))；以及自持续的序列复制(Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874(1990)，其中的每一篇文献均以引用的方式完整地并入本文)。已知扩增方法的进一步讨论参见Persing，David H.，“In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques”，见Diagnostic Medical Microbiology：PrinciplesandApplications(Persing 等人 编 辑)，pp.51-87(American Society for Microbiology，Washington，DC(1993))。
[0095] 4.检测方法
[0096] 可以采用任何常规方式检测未扩增的或扩增的肿瘤标记物核酸。例如，在一些实施方案中，通过与可检测地标记的探针杂交并测量由此产生的杂合体来检测肿瘤标记物核酸。下面描述了检测方法的说明性非限制性实例。
[0097] 一种说明性的检测方法，杂交保护测定(HPA)涉及使化学发光的寡核苷酸探针(例如，吖啶酯-标记的(AE)探针)与靶序列杂交、选择性地水解未杂交的探针上存在的化学发光的标记，以及在光度计中测量从剩余探针产生的化学发光。参见，例如，美国专利号5,283,174和Norman C.Nelson等人，Nonisotopic Probing，Blotting，and Sequencing，ch.17(Larry J.Kricka ed.，2d ed.1995，其中的每一篇文献均以引用的方式完整地并入本文)。
[0098] 另一种说明性检测方法提供了扩增过程的实时定量评价。扩增过程的“实时”评价涉及在扩增反应过程中连续或定期测定反应混合物中扩增子的量，以及使用测得值计算样品中初始存在的靶序列的量。基于实时扩增测定样品中存在的初始靶序列的量的多种方法是本领域熟知的。这些方法包括在美国专利号6,303,305和6,541,205中公开的方法，这两篇专利均以引用的方式完整地并入本文。美国专利号5,710,029中公开了另一种测定样品中初始存在的靶序列的量、但不基于实时扩增的方法，该专利以引用的方式完整地并入本文。
[0099] 可以通过使用多种自杂交探针(其中的大部分具有茎-环结构)实时检测扩增产物。标记此类自杂交探针，使它们通过与靶序列的杂交而发射出不同的可检测的信号，这取决于该探针是在自杂交状态还是在改变的状态。作为非限制性实例，“分子火炬”是一类自杂交探针，其包括自互补的不同区域(称作“靶标结合域”和“靶标封闭域”)，所述自互补的不同区域通过连接区(例如，非核苷酸接头)相连，并且在预定杂交测定条件下彼此杂交。在优选的实施方案中，分子火炬含有1-约20个碱基长度的在靶标结合域中的单链碱基区，并且在链置换条件下易被扩增反应中存在的靶序列杂交。在链置换条件下，有利于分子火炬的2个互补区(它们可以是完全或部分互补的)的杂交，但存在靶序列的情况是个例外，所述靶序列会结合靶标结合域中存在的单链区，并置换靶标封闭域的全部或一部分。分子火炬的靶标结合域和靶标封闭域包括可检测标记或一对相互作用标记(例如，发光/淬灭剂)，所述标记被放置成在分子火炬自杂交时产生不同于在分子火炬与耙序列杂交时产生的信号，从而允许在未杂交的分子火炬存在下检测试验样品中的探针：靶标双链体。美国专利号6,534,274中公开了分子火炬和多种类型的相互作用标记对，该专利以引用的方式完整地并入本文。
[0100] 具有自互补性的检测探针的另一个实例是“分子信标”。分子信标包括具有下列的核酸分子：靶标互补序列、在不存在扩增反应中存在的靶序列的情况下将探针保持在封闭构象的亲和对(或核酸臂)，和当探针处于封闭构象时相互作用的标记对。靶序列和靶标互补序列的杂交分离亲和对的成员，从而将探针转换成开放构象。由于标记对的相互作用减弱，因此向开放构象的转换是可检测的，所述标记对可以是，例如，荧光团和淬灭剂(例如，DABCYL和EDANS)。分子信标公开于美国专利号5,925,517和6,150,097，其以引用的方式完整地并入本文。
[0101] 其他自杂交探针是本领域普通技术人员熟知的。作为非限制性实例，具有相互作用标记的探针结合对，如在美国专利号5,928,862(以引用的方式完整地并入本文)中公开的那些，可能适用于本发明。另外的检测系统包括如美国公布号20050042638中公开的“分子开关”，该美国公布以引用的方式完整地并入本文。其他探针，如包含嵌入染料和/或荧光染料的探针，也可以用于检测本发明中的扩增产物。参见，例如，美国专利号5,814,447(以引用的方式完整地并入本文)。
[0102] B.蛋白检测
[0103] 在一些实施方案中，本发明提供了检测肿瘤标记物蛋白和/或肿瘤标记物蛋白的水平的方法。使用本领域普通技术人员已知的多种蛋白技术检测蛋白，所述技术包括但不限于：蛋白测序；和免疫测定。
[0104] 1.测序
[0105] 蛋白测序技术的说明性非限制性实例包括但不限于质谱法和埃德曼(Edman)降解。
[0106] 质谱法原则上可以对任意尺寸的蛋白测序，但是随着蛋白尺寸的增大，质谱法在计算上变得较困难。用内切蛋白酶消化蛋白，并且使由此产生的溶液通过高压液相色谱柱。在该柱的末端，溶液从带高正电势的狭窄喷嘴喷射进质谱仪。液滴上的电荷使液滴破碎，直到仅保留单个离子。然后将肽破碎并测量片段的质荷比。通过电脑分析质谱，并经常将其与以前测序的蛋白的数据库相比较，以便确定片段的序列。然后用不同的消化酶重复该过程，并将序列中的重叠部分用于构建蛋白的序列。
[0107] 在埃德曼降解反应中，使待测序的肽吸附到固体表面(例如，用凝聚胺(polybrene)包被的玻璃纤维)上。将埃德曼试剂异硫氰酸苯酯(PTC)与12％三甲基胺的弱碱性缓冲溶液一起加入到吸附的肽中，并使其与N-末端氨基酸的胺基团反应。然后可以通过加入无水酸来选择性地脱附末端氨基酸衍生物。该衍生物异构化而形成可被洗掉并可通过色谱法鉴定的取代的乙内酰苯硫脲，并且可以重复该循环。每个步骤的效率为约98％，这允许可靠地测定约50种氨基酸。
[0108] 2.免疫测定
[0109] 免疫测定的说明性非限制性实例包括但不限于：免疫沉淀、蛋白印迹、ELISA、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术，和免疫-PCR。使用本领域普通技术人员已知的多种技术(例如，比色、荧光、化学发光或放射性技术)可检测地标记的多克隆或单克隆抗体适合用于免疫测定中。
[0110] 免疫沉淀是使用对抗原特异性的抗体从溶液中沉淀出该抗原的技术。该过程可以用于鉴定在细胞提取物中存在的蛋白复合物，该鉴定通过靶向被认为存在于复合物中的蛋白来进行。从细菌最初分离的不溶性抗体-结合蛋白(如蛋白A和蛋白G)将该复合物从溶液中提取出来。也可以使抗体偶联至琼脂糖珠子，所述珠子可以容易地从溶液中分离出来。洗涤后，可以使用质谱法、蛋白印迹或任何数量的鉴定复合物中的组分的其他方法来分析沉淀。
[0111] 蛋白印迹或免疫印迹是一种检测给定组织匀浆或提取物样品中的蛋白的方法。该方法使用凝胶电泳来根据质量分离变性的蛋白。然后将蛋白从凝胶中转移出来，并转移到膜(通常是聚二氟乙烯或硝酸纤维素)上，在这里使用对所关注的蛋白特异性的抗体探测该蛋白。结果，研究人员可以检查给定样品中蛋白的量，并将几个组之间的水平加以比较。
[0112] ELISA是酶联免疫吸附测定的缩写，是一种检测样品中抗体或抗原的存在的生化技术。它使用最少2种抗体，一种抗体对抗原有特异性，另一种抗体偶联至酶。第二种抗体会使发色的或发荧光的底物产生信号。ELISA的变型包括夹心ELISA、竞争ELISA和ELISPOT。因为可以进行ELISA来评价样品中抗原的存在或抗体的存在，所以它是测定血清抗体浓度和检测抗原的存在的有用工具。
[0113] 免疫组织化学和免疫细胞化学是指，通过组织或细胞中的抗原结合它们各自的抗体的原理来分别定位组织切片或细胞中的蛋白的过程。通过用产色标签或荧光标签标记抗体来实现可视化。颜色标签的典型实例包括但不限于辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。荧光团标签的典型实例包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)。
[0114] 流式细胞术是一种计数、检查和分选悬浮于流体流中的微观颗粒的技术。它允许同时多参数地分析流过光/电学检测装置的单个细胞的物理和/或化学特征。单一频率或颜色的光束(例如，激光)指向水动力学集中的流体流。许多检测器瞄向流体流穿过光束的点；一个与光束在一条线上(前向散射或FSC)，几个与光束垂直(侧向散射(SSC)和一个或多个荧光检测器)。穿过光束的每个悬浮颗粒会以某些方式散射光，颗粒中的荧光化合物可以受激发以比光源低的频率发光。通过检测器拾取散射光和荧光的组合，并通过分析在每个检测器(一个检测器对应一个荧光发射峰)处亮度的波动，可以推论出关于每个颗粒的物理和化学结构的各种事实。FSC与细胞体积相关，并且SSC与颗粒的密度或内部复杂性(例如，核的形状、细胞质颗粒的数量和类型，或膜粗糙度)相关。
[0115] 免疫-聚合酶链式反应(IPCR)利用核酸扩增技术来增加基于抗体的免疫测定中的信号的产生。因为不存在PCR的蛋白等价物，也就是说，不能以与在PCR过程中复制核酸相同的方式复制蛋白，提高检测灵敏度的唯一途径是通过信号扩增。靶蛋白结合到直接或间接缀合至寡核苷酸的抗体上。将未结合的抗体洗掉，并对剩余的结合的抗体的寡核苷酸进行扩增。通过使用标准的核酸检测方法(包括实时方法)检测扩增的寡核苷酸来进行蛋白检测。
[0116] 在一些实施方案中，利用免疫磁检测。在一些实施方案中，自动执行检测。示例性免疫磁检测方法包括但不限于从Veridex(Raritan，NJ)商购获得的方法。
[0117] C.数据分析
[0118] 在一些实施方案中，使用基于计算机的分析程序将由检测测定产生的原始数据(例如，肿瘤标记物表达的存在、不存在或量和/或CTC水平)翻译成给临床医生使用的预测值数据(例如，癌症疗法的选择)。临床医生可使用任何合适的方式获得预测数据。因此，在一些优选的实施方案中，本发明提供了进一步的益处，即不可能在遗传学或分子生物学受到训练的临床医生不需要理解原始数据。该数据以其最有用的形式被直接提供给临床医生。然后临床医生能够立即利用所述信息以便最优化受试者的护理。
[0119] 本发明考虑了任何能够接收、加工信息以及传递信息至进行所述测定的实验室、信息提供者、医疗人员和受试者并传递来自所述实验室、信息提供者、医疗人员和受试者的信息的方法。例如，在本发明的一些实施方案中，从受试者获取样品(例如，活检或血液或血清样品)并将其提交给位于世界各地(例如，在与受试者居住或最终使用所述信息的国家不同的国家)的分析(profiling)机构(例如，医疗机构的临床实验室、基因组分析企业等)以产生原始数据。其中所述样品包含组织或其他生物学样品，受试者可以去医疗中心获取样品并将其送到分析中心，或者受试者可自己收集样品(例如，尿样)并直接将其送至分析中心。当所述样品包含先前确定的生物学信息时，所述信息可由受试者直接发送至分析机构(例如，可通过计算机扫描包含所述信息的信息卡，并使用电子通信系统将数据传递给分析中心的计算机)。一旦分析机构收到样品，就对所述样品进行加工并产生特定于受试者所需要的诊断或预后信息的分析结果(例如，表达数据)。
[0120] 然后以适合治疗临床医生解释的格式准备分析数据。例如，而不是提供原始数据，所制备的格式可代表针对受试者的诊断或危险估计(例如，癌症治疗成功的可能性)以及对特定治疗选项的建议。可采用任何合适的方法将数据呈现给医生。例如，在一些实施方案中，分析机构产生可为临床医生(例如，在医疗点)打印的或在计算机显示器上为医生显示的报告。
[0121] 在一些实施方案中，首先在医疗点或在当地机构分析信息。然后将原始数据发送至中心处理机构以进一步分析和/或将原始数据转化成可供医生或患者使用的信息。中心处理机构提供了保密(所有数据都用统一的安全协议存储在中心机构)、快速和一致的数据分析的优势。然后中心处理机构可在受试者治疗后控制数据的命运。例如，使用电子通信系统，中心机构可将数据提供给临床医生、受试者或研究人员。
[0122] 在一些实施方案中，受试者使用电子通讯系统能够直接获取数据。受试者基于所述结果可选择进一步干预或咨询。在一些实施方案中，所述数据用于研究使用。例如，所述数据可用于进一步优化可用作疾病具体病状或阶断的指示器的标记物的包含或去除。
[0123] D.组合物和试剂盒
[0124] 用于本发明诊断方法中的组合物包括但不限于，探针、扩增寡核苷酸和抗体。特别优选的组合物检测CTC样品中的肿瘤标记物的表达水平的存在。
[0125] 可以以试剂盒形式提供这些组合物中的任一种，其是单独存在或者与本发明的其他组合物组合。例如，可以在用于扩增和检测肿瘤标记物的试剂盒中提供所述单个标记的探针和扩增寡核苷酸对。试剂盒可以进一步包含适当的对照和/或检测试剂。
[0126] 本发明的探针和抗体组合物也可以以阵列或格点测定形式提供。
[0127] IV.确定作用疗程
[0128] 在一些实施方案中，本发明提供了用于确定作用疗程的系统、试剂盒和方法。
[0129] 在一些实施方案中，确定CTC-内分泌治疗指数(CTC-ETI)。在一些实施方案中，通过为CTC和肿瘤标记物的水平分配点来计算CTC-ETI(参见，例如实施例1)。在一些实施方案中，低CTC-ETI指示受试者可能对内分泌(例如，抗雌激素)疗法起反应。在一些实施方案中，高CTC-ETI评分指示受试者不大可能对内分泌疗法起反应并且最好用化疗治疗。
[0130] 实验
[0131] 下列实施例的提供是为了证明和进一步说明本发明的某些实施方案，而不应当被解读为限制本发明的范围。
[0132] 实施例1
[0133] 制定CTC-内分泌治疗指数(CTC-ETI)
[0134] CTC可以使用可商购获得的自动化免疫磁系统(例如 系统；VeridexLLC)可再现且可靠地计数。高水平的CTC预示转移性乳腺癌(MBC)患者的病情进展迅速(Cristofanilli，等人NEJM2004)。雌激素受体(ER)阳性MBC患者中仅～50％患者受益于内分泌疗法(ET)。内分泌难治性MBC患者最好用化疗缓解。这个实施例描述了使用的多参数测定法，其鉴定不太可能受益于ET并且最好用化疗进行治疗的ER
阳性MBC患者。
阳性MBC患者。
[0135] 方法。 系统具有四个荧光通道。其中的三个通道用于区分CTC与WBC(DAPI，抗-细胞角蛋白，抗-CD45)。第4个“空”通道被用于用抗原特异性荧光标记的抗体测量ER、Bcl-2、HER2和Ki67表达。选择这四种标记物是因为它们与对ET的敏感性(ER，Bcl-2)或抗性(HER2，Ki-67)相关联。将培养的人乳腺癌细胞(MCF-7：ER+，BCL-2+，HER2-，Ki67+；MDA-MB-231：ER-，Bcl-2-，HER2-，Ki67+；BT-474：ER+，Bcl-2+，HER2+，Ki67+)添加到7.5ml来自正常供体的人全血中，并使用 试剂盒进行分离和表
征。
征。
[0136] 表1示出各种标记与对ET的反应的关联性。
[0137] 表1
[0138]
[0139] 表2示出抗体和实验参数。
[0140] 表2
[0141]
[0142] 结果。相对于合适的阴性对照，每种细胞系均对各自的标记物适当地染色，但是染色是异质的，甚至在单个细胞系内亦是如此(图1-3)。
[0143] 使用这些数据，制定CTC-ETI，其中为各个分类分配评分，所述分类由细胞计数外加每种标记物的细胞阳性的相对百分比和程度组成，其中较低的评分(低或无CTC，或具有高％和强度的ER和Bcl-2、低HER2和Ki-67的CTC)＝预测的有利的对ET的反应(表3和4)。
[0144] 表3
[0145]
[0146] 表4
[0147]
[0148] 使用上述方法确定3位转移性乳腺癌患者的CTC-ETI。结果在图4中示出。
[0149] 在进一步的研究中，研究了21位患者。研究设计和结果在图7-8中示出。1位患者不合格。20位患者中的5位具有低CTC计数(＜5CTC/7.5ml全血)，且预计具有相对有利的预后。在10位患者(50％)中确定CTC-ETI：2位患者具有低CTC-ETI，而3位患者具有中等的CTC-ETI；并且5位患者具有高CTC-ETI。技术上的困难使得无法在剩余4位患者中获得准确的CTC-ETI。注意，在单一患者中，在CTC之中的生物标记物的表达是异质的。
[0150] 考虑较低的CTC-ETI评分(低或无CTC，或者具有高CTC ER和BCL-2以及低CTC HER2和Ki-67的CTC)与对ET的有利反应关联。计算MBC患者的CTC-ETI以确定对于ET而言是否高CTC-ETI预示着抗性和迅速进展。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种预防乳腺癌的内衣 | 2020-05-12 | 376 |
| 一种治疗乳腺癌的中药 | 2020-05-13 | 408 |
| 一种抗乳腺癌新药丸剂 | 2020-05-13 | 304 |
| 一种抗乳腺癌草莓啤酒 | 2020-05-13 | 825 |
| 乳腺癌标志物 | 2020-05-11 | 98 |
| 预测乳腺癌复发 | 2020-05-12 | 131 |
| 乳腺癌诊断设备 | 2020-05-12 | 286 |
| 乳腺癌治疗方案 | 2020-05-11 | 65 |
| 用于乳腺癌的piRNA | 2020-05-11 | 575 |
| 乳腺癌标志物 | 2020-05-11 | 937 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈