一种免疫缺陷裸鼠模型的制备方法及应用
阅读：280发布：2021-12-18
专利汇可以提供一种免疫缺陷裸鼠模型的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于基因敲除技术建立的裸(nude)鼠模型的方法，具体涉及将小鼠的Foxn1基因敲除，得到Foxn1基因缺失、不表达功能性FOXN1蛋白的裸鼠，再将获得的裸鼠的“nude”基因导入NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠或与NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠交配，从而得到表现出裸鼠症状的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude小鼠。本发明还公开了敲除Foxn1基因而表现裸鼠症状的非人动物或其子代，及其在蛋白或基因领域的应用。，下面是一种免疫缺陷裸鼠模型的制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种构建裸鼠或其子代的方法，其特征在于，所述鼠基因组中的Foxn1基因，经遗传修饰后，使得鼠体内FOXN1蛋白不表达或表达的FOXN1蛋白不具有功能。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括敲除小鼠体内Foxn1基因的全部或部分序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行裸鼠或其子代的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行裸鼠或其子代的构建。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的方法包括使用靶向Foxn1基因的sgRNA序列敲除小鼠体内Foxn1基因的全部或部分序列；优选的，敲除Foxn1基因的第4号外显子至3’UTR的全部或部分序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)利用靶向Foxn1基因的sgRNA序列，制备获得sgRNA载体；
2)将步骤1)获得的sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
3)将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Foxn1基因敲除成功，获得阳性裸鼠；
4)将步骤3)筛选出的阳性小鼠通过杂交和/或自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的裸鼠；
优选的，所述步骤3)中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示；
优选的，所述的sgRNA序列靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述裸鼠用作动物模型；优选的，所述动物模型为荷瘤动物模型。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的裸鼠为免疫缺陷裸鼠或人源化裸鼠。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进一步包含在免疫缺陷裸鼠或其子代体内进行人免疫系统重建；优选的，所述人免疫系统重建使用人外周血细胞移入，或使用人造血干细胞移入。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法构建的裸鼠或其子代。
10.一种经遗传修饰的细胞株，其特征在于，所述细胞株基因组中的Foxn1基因，经遗传修饰后，使得所述细胞株中不表达FOXN1蛋白或表达的FOXN1蛋白不具有功能。
11.根据权利要求10所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株中缺失Foxn1基因的全部或部分序列；优选的，使用靶向Foxn1基因的sgRNA序列敲除细胞株基因组中Foxn1基因的第
4号外显子至3’UTR的全部或部分序列。
12.根据权利要求10或11所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株来源于非人动物或其子代；优选的，所述动物为啮齿类动物；更优选的，所述啮齿类动物为小鼠，所述的小鼠为免疫缺陷小鼠。
13.一种制备多基因改造非人动物或其子代的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)利用权利要求1-8任一所述的方法制备的裸鼠或其子代，或者，权利要求9所述的裸鼠或其子代；
b)将步骤a)获得的裸鼠或其子代与其他基因改造动物交配或体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因改造非人动物或其子代。
14.根据权利要求13所述的方法产生的多基因改造非人动物或其子代。
15.一种靶向动物Foxn1基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列在待改变的Foxn1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则。
16.根据权利要求15所述的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列在小鼠Foxn1基因的靶位点位于小鼠Foxn1基因的第4号外显子和/或3’UTR上；
所述sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，所述sgRNA序列靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示；优选的，所述sgRNA序列靶向的
5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1所示，所述sgRNA序列靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8所示。
17.一种包含权利要求15或16所述的sgRNA序列的构建体。
18.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含一种或多种权利要求15-16任一所述的sgRNA序列和/或一种或多种权利要求17所述的构建体。
19.根据权利要求15-16任一所述的sgRNA序列、权利要求17所述的构建体或权利要求
18所述的细胞在构建免疫缺陷裸鼠或Foxn1基因敲除/敲入动物或Foxn1基因人源化动物中的应用。
20.一种荷瘤动物模型，其特征在于，所述荷瘤动物来源于权利要求1-8任一所述的方法构建的裸鼠或其子代，或者，权利要求9所述的裸鼠或其子代，或者，权利要求14所述的多基因改造非人动物或其子代。
21.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求1-8任一所述的方法构建的裸鼠或其子代，或者，权利要求9所述的裸鼠或其子代，或者，权利要求14所述的多基因改造非人动物或其子代。
22.一种组织或器官，其特征在于，所述组织或器官来源于权利要求1-8任一所述的方法构建的裸鼠或其子代，或者，权利要求9所述的裸鼠或其子代，或者，权利要求14所述的多基因改造非人动物或其子代。
23.一种权利要求1-8任一所述的方法构建的裸鼠或其子代、权利要求9所述的裸鼠或其子代、权利要求10-12任一所述的细胞株、权利要求14所述的多基因改造非人动物或其子代、权利要求20所述的荷瘤动物模型、权利要求21所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物或权利要求22所述的组织或器官在Foxn1基因或FOXN1蛋白相关领域或者免疫相关领域的应用。
24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述的应用包括需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在生产和利用动物疾病模型，用于人源细胞移植、免疫系统重建、病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或筛选、验证、评价或研究药物、药效研究，相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途；优选的，所述应用包括使用人PBMC进行人免疫系统重建后，对抗人单抗、双抗或联合用药的药效评价、药物筛选，或人CAR-T体内评估或筛选。
25.一种人用药物筛选或评价的方法，其特征在于，包括将人肿瘤细胞移入已用人PMBC重建的动物体内，向移入人肿瘤细胞的动物给予候选药物，对给予药物的动物进行药效检测和比较，其中，所述的动物为权利要求1-8任一所述方法构建的裸鼠或其子代、权利要求9所述的裸鼠或其子代、权利要求14所述的多基因改造非人动物或其子代或者权利要求20所述的荷瘤动物模型。
26.一种CAR-T体内验证的方法，其特征在于，包括向动物体内植入人肿瘤细胞，向植入人肿瘤细胞的动物注射人CAR-T，对注射人CAR-T后的动物进行肿瘤抑制效果检测和评价，所述动物为权利要求1-8所述方法构建的裸鼠或其子代、权利要求9所述的裸鼠或其子代、权利要求14所述的多基因改造非人动物或其子代或者权利要求20所述的荷瘤动物模型，或者，通过移植人PMBC重建人免疫系统的权利要求1-8所述方法构建的裸鼠或其子代、权利要求9所述的裸鼠或其子代、权利要求14所述的多基因改造非人动物或其子代或者权利要求
20所述的荷瘤动物模型。
一种免疫缺陷裸鼠模型的制备方法及应用
技术领域
背景技术
[0002] 免疫缺陷动物(immunodeficient animal)是指由于先天性遗传突变或用人工的方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。近几年来，随着技术的迅猛发展，一些新的免疫缺陷动物尤其是多种联合免疫缺陷动物品种的培育成功，在医学领域的研究中发挥了重要作用。其中，NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠作为目前国际上公认的免疫缺陷程度最高的小鼠，在人源化动物研究、肿瘤药物及其他疾病的治疗机理方面已经得到广泛应用。
[0003] NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠，其中NOD是自发性I型糖尿病小鼠，其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱；补体系统和树突状细胞等先天免疫系统功能较低；Prkdcscid的含义是Prkdc(Protein kinase DNA-activated catalytic)基因突变，小鼠的T细胞和B细胞缺失，null表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷(SCID)；IL-2rg 的含义是白细胞介素2受体的gamma链(IL-2Rγc)缺失，该链是具有重要免疫功能的细胞因子IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL21等多种细胞因子受体共有的功能组成单元，缺失后小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。现有研究表明该小鼠对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，少量细胞即可成瘤(依赖于细胞系或细胞类型)，同时也没有B淋巴细胞泄漏，是最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，并已广泛用于新的人源化动物模型研发。
[0004] 在动物实验中，为了便于手术经常需要给动物备皮，一般有两种方法。一种是物理方法，即通过使用剃刀或剪刀或镊子等工具去除动物身上的毛。但该过程不仅繁琐、费时，还很容易损伤动物皮肤，尤其是对皮肤特别薄的动物，如小鼠，剃毛过程可能出现剃伤或者剃不干净的现象，可能会直接影响试验结果。另一种方式是使用药物，如脱毛剂。但药物容易粘在操作人员的皮肤粘膜上，可能造成不必要的损伤，另外方法掌握不好的话，动物表皮容易受到腐蚀。而且，有些试验要求毛刮到很干净，而以上两种方法可能都达不到。
[0005] 无胸腺裸鼠(Nude mouse，以下简称裸鼠)是由于第11号染色体上“裸体”(nude)位点的等位基因发生突变从而形成的一种免疫缺陷动物，主要表现为全身无毛以及缺乏正常胸腺。裸鼠作为最早发现的免疫缺陷动物，已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。已有研究发现，可将“nude”基因通过传统的交配方式，导入不同近交系动物，得到其它遗传背景明确、表型类似的“裸体”动物模型。但裸鼠作为单一T细胞免疫功能缺陷动物，仍然具有正常的B细胞和NK细胞，免疫缺陷程度不深，且研究表明随着鼠龄增加，NK细胞从中优先选择2个(分别是sgRNA1和sgRNA8)进行后续实验。在其5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，其互补链加上AAAC得到反向寡核苷酸(见表2)，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-sgRNA1、pT7-sgRNA8，其中PCR反应体系见表3。
[0006] 表1 UCA检测结果
[0007]
[0008] 表2 sgRNA1和sgRNA8序列列表
[0009]
[0010] 表3 PCR连接反应体系(10μL)
[0011]sgRNA退火产物 1μL(0.5μM)
[0012] Foxn1基因，经遗传修饰后，使得所述动物的细胞、组织或器官中不表达FOXN1蛋白或表达的FOXN1蛋白不具有功能。优选的，所述不表达FOXN1蛋白或表达的FOXN1蛋白不具有功能的非人动物或其子代表现出无毛鼠或裸鼠的症状。
[0013] 优选的，所述的非人动物或其子代基因组中缺失Foxn1基因的全部或部分序列。
[0014] 进一步优选的，所述的非人动物或其子代动物基因组中缺失Foxn1基因的第4号外显子至3’UTR的全部或部分。
[0015] 在本发明的一个具体实施例中，敲除动物基因组中Foxn1基因的第4号外显子至3’UTR的约10192bp(SEQ ID NO：29)的碱基片段，并伴有7个碱基的随机插入，所述敲除Foxn1基因后基因片段长度约19893bp(SEQ ID NO：30)。其中，随机插入片段为AGTGCAT。
[0016] 在本发明的一个具体实施方式中，敲除动物基因组中Foxn1基因的第4号外显子至3’UTR的约10182bp(SEQ ID NO：31)的碱基片段，所述敲除Foxn1基因后基因片段长度约
19896bp(SEQ ID NO：32)。
19896bp(SEQ ID NO：32)。
[0017] 在本发明的一个具体实施方式中，敲除动物基因组中Foxn1基因的第4号外显子至3’UTR的约9095kb(SEQ ID NO：33)和/或31bp(SEQ ID NO：34)的碱基片段，所述敲除Foxn1基因后基因片段长度约20952bp(SEQ ID NO：35)。
[0018] 优选的，所述非人动物或其子代为免疫缺陷动物或人源化动物。
[0019] 优选的，所述非人动物或其子代为啮齿类动物；进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
[0020] 在本发明的一个具体实施例中，所述小鼠为NOD/scid或NOD-Prkdcscid IL-2rgnullscid null小鼠背景。优选的，所述NOD-Prkdc IL-2rg 小鼠为B-NDG小鼠。
[0021] 在本发明的一个具体实施例中，所述的小鼠为基因PD-1、PD-L1、IL3、IL6、IL15、CSF1、CSF2、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、TIGIT、TIM-3、GITR、CD137或OX40人源化小鼠。
[0022] 优选的，所述非人动物或其子代进一步包含在非人动物或其子代体内进行人免疫系统重建。
[0023] 进一步优选的，所述人免疫系统重建使用人外周血细胞移入，或使用人造血干细胞移入。
[0024] 本发明的第二方面，涉及一种经遗传修饰的细胞株，所述细胞株基因组中的Foxn1基因，经遗传修饰后，使得所述细胞株中不表达FOXN1蛋白或表达的FOXN1蛋白不具有功能。
[0025] 优选的，所述细胞株中缺失Foxn1基因的全部或部分序列。进一步优选的，使用靶向Foxn1基因的sgRNA序列敲除细胞株基因组中Foxn1基因的全部或部分序列。
[0026] 在本发明的一个具体实施方式中，使用靶向Foxn1基因的sgRNA序列敲除细胞株基因组中Foxn1基因的第4号外显子至3’UTR的全部或部分序列。
[0027] 优选的，所述细胞株来源于非人动物或其子代。
[0028] 优选的，所述动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠；更进一步优选的，所述的小鼠为免疫缺陷小鼠。
[0029] 优选的，所述细胞株为免疫缺陷小鼠细胞株；进一步优选的，所述免疫缺陷小鼠的scid null遗传背景为NOD-Prkdc IL-2rg 。
[0030] 本发明的第三方面，涉及一种构建裸鼠或其子代的方法，所述鼠基因组中的Foxn1基因，经遗传修饰后，使得鼠体内FOXN1蛋白不表达或表达的FOXN1蛋白不具有功能。
[0031] 优选的，所述的方法包括敲除小鼠体内Foxn1基因的全部或部分序列。
[0032] 优选的，使用基因编辑技术进行裸鼠或其子代的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行裸鼠或其子代的构建。
[0033] 优选的，所述的方法包括使用靶向Foxn1基因的sgRNA序列敲除小鼠体内Foxn1基因全部或部分序列。进一步优选的，敲除Foxn1基因的的第4号外显子至3’UTR的全部或部分序列。
[0034] 优选的，所述的方法，包括如下步骤：
[0035] 1)提供一种包含一种或多种靶向Foxn1基因的sgRNA序列和/或一种或多种含有靶向Foxn1基因的sgRNA序列的构建体和/或一种或多种所述构建体的体外转录产物的细胞；
[0036] 2)将步骤1)所述的细胞在培养液中进行培养；
[0037] 3)将步骤2)培养后的细胞移植至受体雌性小鼠的输卵管内，允许所述细胞在所述小鼠的子宫中发育；
[0038] 4)鉴定步骤3)的怀孕雌性子代基因敲除小鼠的种系传递。
[0039] 进一步优选的，所述的方法，包括如下步骤：
[0040] 1)利用靶向Foxn1基因的sgRNA序列，制备获得sgRNA载体；
[0041] 2)将步骤1)获得的sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
[0042] 3)将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Foxn1基因敲除成功，获得阳性裸鼠；
[0043] 4)将步骤3)筛选出的阳性小鼠通过杂交和/或自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的裸鼠。
[0044] 优选的，所述步骤3)中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示。
[0045] 优选的，所述的sgRNA序列靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。
[0046] 优选的，所述的裸鼠为免疫缺陷裸鼠或人源化裸鼠。
[0047] 更优选的，所述免疫缺陷裸鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠。更优选的，所述的人源化裸鼠中人源化的基因选自PD-1、PD-L1、IL3、IL6、IL15、CSF1、CSF2、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、TIGIT、TIM-3、GITR、CD137或OX40。
[0048] 优选的，所述小鼠的受精卵细胞遗传背景为NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠。
[0049] 优选的，所述裸鼠用作动物模型。更优选的，所述动物模型为荷瘤动物模型。
[0050] 优选的，所述的方法进一步包含在免疫缺陷裸鼠或其子代体内进行人免疫系统重建；更优选的，所述人免疫系统重建使用人外周血细胞移入，或使用人造血干细胞移入。
[0051] 本发明的第四方面，涉及根据上述的方法构建的裸鼠或其子代。
[0052] 优选的，所述的裸鼠为免疫缺陷裸鼠或人源化裸鼠。
[0053] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的裸鼠或其子代为免疫缺陷裸鼠或其子代。
[0054] 本发明的第五方面，涉及一种构建NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠的方法，将上述的非人动物或其子代或上述的裸鼠的“nude”基因导入NOD-Prkdcscid IL-2rgnull鼠，或将上述的非人动物或其子代或上述的裸鼠与NOD-Prkdcscid IL-2rgnull鼠交配；并进行筛选，得到NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠。
[0055] 本发明的第六方面，涉及根据上述的方法构建的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠。
[0056] 本发明的第七方面，涉及一种制备多基因改造非人动物或其子代的方法，包括如下步骤：
[0057] a)利用上述的方法构建的裸鼠或其子代，或者，上述的裸鼠或其子代，或者，上述构建的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠；
[0058] b)将步骤a)获得的裸鼠或其子代，或NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠与其他基因改造动物交配或体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因改造非人动物或其子代。优选的，所述的裸鼠为免疫缺陷裸鼠或人源化裸鼠。
[0059] 优选的，所述多基因改造非人动物或其子代可以是双基因改造动物、三基因改造动物、四基因改造动物、五基因改造动物、六基因改造动物、七基因改造动物、八基因改造动物或九基因改造动物。
[0060] 本发明的第八方面，涉及上述的方法产生的多基因改造非人动物或其子代；优选的，所述非人动物为啮齿类动物；更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
[0061] 本发明的第九方面，涉及一种靶向动物Foxn1基因的sgRNA序列，所述sgRNA序列在待改变的Foxn1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则。
[0062] 优选的，所述动物为啮齿类动物；更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
[0063] 优选的，所述sgRNA序列在小鼠Foxn1基因的靶位点位于小鼠Foxn1基因的第4号外显子和/或3’UTR上。
[0064] 优选的，所述sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，所述sgRNA序列靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。
[0065] 进一步优选的，所述sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1所示，所述sgRNA序列靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8所示。
[0066] 优选的，所述的sgRNA序列，编码sgRNA的DNA分子双链序列为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
[0067] 本发明的第十方面，涉及一种包含上述的sgRNA序列的构建体。
[0068] 本发明的第十一方面，涉及一种制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：
[0069] (1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Foxn1基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Foxn1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
[0070] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
[0071] (3)将步骤(1)设计的制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
[0072] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA的正、反向寡核苷酸序列分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
[0073] 优选的，所述动物为啮齿类动物；更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
[0074] 优选的，所述的方法，包括如下步骤：
[0075] (1)将序列如SEQ ID NO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：8-14所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
[0076] 优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示，其中SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16为A组，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18为B组；
[0077] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：19所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
[0078] (3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，将合成的sgRNA的正、反向寡核苷酸序列变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
[0079] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA的正、反向寡核苷酸序列分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
[0080] 本发明的第十二方面，涉及一种细胞，所述细胞包含一种或多种上述的sgRNA序列和/或一种或多种上述的构建体和/或上述方法获得sgRNA载体。
[0081] 本发明的第十三方面，涉及根据上述的sgRNA序列、上述的构建体或上述的细胞在构建免疫缺陷裸鼠或Foxn1基因敲除/敲入动物或Foxn1基因人源化动物中的应用。
[0082] 本发明的第十四方面，涉及一种荷瘤动物模型，所述荷瘤动物来源于上述的非人动物或其子代，或者，上述的方法构建的裸鼠或其子代，或者，上述的裸鼠或其子代，或者上述的多基因改造非人动物或其子代，或者，上述的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠。
[0083] 本发明的第十五方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物或其子代，或者，上述的方法构建的裸鼠或其子代，或者，上述的裸鼠或其子代，或者上述的多基因改造非人动物或其子代，或者，上述的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠。
[0084] 本发明的第十六方面，涉及一种组织或器官，所述组织或器官来源于上述的非人动物或其子代，或者，上述的方法构建的裸鼠或其子代，或者，上述的裸鼠或其子代，或者上述的多基因改造非人动物或其子代，或者，上述的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠。优选的，所述的动物为啮齿类动物；更优选的，所述的啮齿类动物为小鼠。最优选的，所述的小鼠为B-NDG背景。
[0085] 优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。
[0086] 优选的，上述细胞或细胞系或原代细胞培养物，组织或器官不是动物品种。
[0087] 本发明的第十七方面，涉及一种上述的非人动物或其子代、上述的细胞株、上述方法构建的裸鼠或其子代、上述的裸鼠或其子代、上述的多基因改造非人动物或其子代、上述的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物在制备动物模型中的用途。
[0088] 本发明的第十八方面，涉及一种上述的非人动物或其子代、上述的细胞株、上述的方法构建的裸鼠或其子代、上述的裸鼠或其子代、上述的多基因改造非人动物或其子代、上述的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠、上述的荷瘤动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物或上述的组织或器官在Foxn1基因或FOXN1蛋白相关领域或者免疫相关领域的应用。
[0089] 优选的，所述的应用包括需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在生产和利用动物疾病模型，用于人源细胞移植、免疫系统重建、病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或筛选、验证、评价或研究药物、药效研究，相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
[0090] 进一步优选的，所述应用包括使用人PBMC进行免疫系统重建后，对抗人单抗、双抗或联合用药的药效评价、药物筛选，或人CAR-T体内评估或筛选。
[0091] 本发明的第十九方面，涉及一种人用药物筛选或评价的方法，包括将人肿瘤细胞移入已有人PMBC重建的动物体内，向移入人肿瘤细胞的动物给予候选药物，对给予药物的动物进行药效检测和比较，其中，所述的动物为上述的非人动物或其子代、上述方法构建的裸鼠或其子代、上述的裸鼠或其子代、上述的多基因改造非人动物或其子代、上述的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠或者上述的荷瘤动物模型。
[0092] 优选的，所述药物筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
[0093] 优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
[0094] 优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
[0095] 本发明的第二十方面，涉及一种CAR-T体内验证的方法，包括向动物体内植入人肿瘤细胞，向植入人肿瘤细胞的动物注射人CAR-T，对注射人CAR-T后的动物进行肿瘤抑制效果检测和评价，所述动物为上述非人动物或其子代、上述方法构建的裸鼠或其子代、上述的裸鼠或其子代、上述的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠或上述的多基因改造非人动物或其子代，或已通过移植人PMBC重建人免疫系统的上述非人动物或其子代、上述方法构建的裸鼠或其子代、上述的裸鼠或其子代、上述的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude鼠或上述的多基因改造非人动物或其子代。
[0096] 优选的，所述CAR-T体内验证的方法不是治疗方法。该方法对CAR-T的效果进行检测和评价，以确定该方法是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
[0097] 本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
[0098] 在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
[0099] 在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
[0100] 除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，
1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；
Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，
1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；
Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
[0101] 以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
[0102] 本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
附图说明
[0103] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
[0104] 图1：A：sgRNA1-sgRNA7活性检测结果，其中nc为阴性对照，pc为阳性对照，blank为空白对照；B：sgRNA8-sgRNA14活性检测结果，其中nc为阴性对照，pc为阳性对照，blank为空白对照；
[0105] 图2：pT7-sgRNA质粒图谱示意图；
[0106] 图3：鼠尾PCR鉴定结果(F0)，其中，WT为野生型，H2O为水对照，1-44为小鼠编号；
[0107] 图4：NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude小鼠表型为无毛；
[0108] 图5：在B-NDG nude、B-NDG小鼠单侧乳垫接种人乳腺癌MDA-mB-231细胞，其中，A：B-NDG nude鼠成瘤照片；B：B-NDG鼠成瘤照片。
具体实施方式
[0109] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0110] 在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
[0111] NOD/scid小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，
[0112] NOD-Prkdcscid IL-2rgnull(B-NDG)小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号B-CM-002或B-CM-001，
[0114] EcoRI，BamHI、BbsI酶购自NEB，货号分别为；R3101M，R3136M，R0539L；
[0115] Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；
[0116] Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
[0117] 大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；
[0118] 卡那霉素购自Amresco，货号为0408。
[0119] 实施例1pT7-sgRNA1、pT7-sgRNA8的构建
[0120] 根据“nude”基因的特点，本发明拟通过将NOD/scid小鼠体内Foxn1基因(小鼠Foxn1基因序列见SEQ ID NO：26，mRNA序列见SEQ ID NO：27，蛋白序列见SEQ ID NO：28)的第4号外显子至3’UTR的约10kb的碱基敲除，以使小鼠的Foxn1基因的功能失活，不表达功能性的FOXN1蛋白，从而表现出裸鼠症状；再将获得的NOD/scid裸鼠与免疫缺陷程度更高的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠交配，得到无毛的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude小鼠。
[0121] 设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)、3’端靶位点(sgRNA8-sgRNA14)的sgRNA序列。其中5’端靶位点位于4号外显子，3’端靶位点位于3’UTR，各sgRNA靶向“nude”基因靶位点序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：14所示。所述的“nude”基因为Foxn1基因。
[0122] sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：1)：5’-GGCTGGTAGCAGTACATCCCAGG-3’[0123] sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：2)：5’-CAGTACATATGTTGCAAGGGAGG-3’[0124] sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：3)：5’-AGACTTACCTGATGGAAGGCAGG-3’[0125] sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：4)：5’-ACATATGTTGCAAGGGAGGCTGG-3’[0126] sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：5)：5’-CCTCAGACTTACCTGATGGAAGG-3’[0127] sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：6)：5’-CAAGGTCAAGCCCCAAGCTCTGG-3’[0128] sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：7)：5’-GGACCACTGTCCAGAGCTTGGGG-3’[0129] sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：8)：5’-GTGTGAGATGCGGGTCCACCAGG-3’[0130] sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO：9)：5’-CCTTTAAGGTGAGCCCAATATGG-3’[0131] sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：10)：5’-CAAAGGCCGCAGCTGATGTTGGG-3’[0132] sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-CCACCAGGTAGCATCCTAGATGG-3’[0133] sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-GGGGGCCCCGTGTGAGATGCGGG-3’[0134] sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-AGATGGATGCCCCCAACTTCTGG-3’[0135] sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-CTTCTGGCTAACAAATAAGTTGG-3’[0136] 利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，具体活性数值见表1，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图1。其中sgRNA-4、sgRNA-9、sgRNA-10及sgRNA-11活性相对较低，sgRNA-1活性最高，这可能由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实验，sgRNA-4、sgRNA-9、sgRNA-10及sgRNA-11的数值仍显著高于对照组nc数值，仍可判断sgRNA-4、sgRNA-9、sgRNA-10及sgRNA-11是具有活性的，活性满足基因打靶实验要求。从中优先选择2个(分别是sgRNA1和sgRNA8)进行后续实验。在其5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，其互补链加上AAAC得到反向寡核苷酸(见表2)，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-sgRNA1、pT7-sgRNA8，其中PCR反应体系见表3。
[0137] 表1 UCA检测结果
[0138]
[0139] 表2 sgRNA1和sgRNA8序列列表
[0140]
[0141] 表3 PCR连接反应体系(10μL)
[0142]
[0143]
[0144] 反应条件：
[0145] 室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5mL)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。
[0146] pT7-sgRNA质粒来源：
[0147] pT7-sgRNA载体图谱，参见图2。该质粒骨架来源Takara，货号3299。由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
[0148] 含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO:19)：
[0149] gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc
[0150] 实施例2显微注射及胚胎移植
[0151] 取NOD/scid小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-sgRNA1、pT7-sgRNA8质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因敲除小鼠(即为F0代)。
[0152] 实施例3敲除小鼠的鉴定
[0153] 对得到的F0代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，反应体系及反应条件分别见表4、5，引物PCR-1位置位于5’端靶位点左侧，引物PCR-2位置位于3’端靶位点右侧，引物序列如下：
[0154] 上游引物：PCR-1(SEQ ID NO：20)：5’-AGCCCCTCTACTGACTTGCTGATTT-3’；
[0155] 下游引物：PCR-2(SEQ ID NO：21)：5’-TAAGGGGTTCACAGGTCATACGGGA-3’[0156] 被成功敲除的小鼠PCR条带应为约776bp，否则应无条带。
[0157] 表4 PCR反应体系(20μL)
[0158]10×缓冲液 2μL
dNTP(2mM) 2μL
MgSO4(25mM) 0.8μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
dNTP(2mM) 2μL
MgSO4(25mM) 0.8μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
[0159] 表5 PCR扩增反应条件
[0160]
[0161] 44只F0代小鼠的PCR鉴定结果见图3。其中编号为2、16和37的小鼠为阳性小鼠。将2、37号小鼠进行进一步的测序验证(由测序公司进行)，确认2号小鼠缺失10182bp(SEQ ID NO：31)，37号小鼠缺失10192bp(SEQ ID NO：29)，但存在7个碱基的随机插入(AGTGCAT)。后续测序验证表明16号小鼠存在9126bp的基因缺失，其中第一段缺失9095bp(SEQ ID NO：
33)，第二段缺失31bp(SEQ ID NO：34)。
33)，第二段缺失31bp(SEQ ID NO：34)。
[0162] 实施例4具有“nude”表型的NOD-PrkdcscidIL-2rgnull小鼠(B-NDGnude小鼠)的获得[0163] 将F0鉴定为阳性的小鼠与NOD/scid小鼠交配得到F1代小鼠，经PCR分析确认后，将F1代杂合子小鼠互交获得F2代纯合子小鼠，该小鼠即可表现出“nude”表型。将F2代纯合子小鼠与NOD-Prkdcscid IL-2rgnull(B-NDG)小鼠杂交后互交，即可从后代中获得具有无毛表型的NOD-Prkdcscid IL-2rgnull nude小鼠，结果如图4所示。
[0164] 实施例5显微注射及胚胎移植直接获得B-NDG nude小鼠
[0165] 取NOD-Prkdcscid IL-2rgnull(B-NDG)小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-sgRNA1、pT7-sgRNA8质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，直接得到Foxn1基因敲除的B-NDG小鼠。将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，即可建立稳定的B-NDG nude小鼠品系。
[0166] 实施例6 B-NDG nude小鼠的鉴定及验证
[0167] 取同龄C57BL/6、B-NDG、NOD/scid小鼠各5只，B-NDG nude小鼠4只，分别取全血(EDTA抗凝)，加入裂红液后，流式检测mCD3、mCD19及NKp46的表达量。流式结果显示，在C57BL/6和NOD/scid小鼠中分离的全血白细胞中有明显的的T、B细胞分群和NK细胞分群，但在B-NDG nude和B-NDG小鼠中未检测到T、B细胞和NK细胞，说明B-NDG裸鼠和B-NDG小鼠在血液中的T、B、NK是缺失的，B-NDG裸鼠具有高度免疫缺陷。
[0168] 在多只B-NDG nude、B-NDG小鼠单侧乳垫接种人乳腺癌MDA-mB-231细胞(1×107)，3
观察肿瘤生长情况。在接种后40天左右肿瘤体积达到400-600mm时拍照记录成瘤情况，对比照片见图5(A)和5(B)，B-NDG nude鼠成瘤后明显比B-NDG小鼠更易观察和测量其生长情况。
观察肿瘤生长情况。在接种后40天左右肿瘤体积达到400-600mm时拍照记录成瘤情况，对比照片见图5(A)和5(B)，B-NDG nude鼠成瘤后明显比B-NDG小鼠更易观察和测量其生长情况。
[0169] 实施例7 B-NDG nude小鼠的人免疫系统重建
[0170] 使用本发明方法获得的B-NDG nude小鼠，在移植人外周血细胞(hPBMC)或人造血干细胞后，可以在小鼠体内构建人免疫系统重建的人源化小鼠模型。
[0171] 以hPBMC重建为例，选取5只使用本方法制备的B-NDG nude小鼠，通过尾静脉注射1×107人外周血细胞(hPBMC)，2周后取血进行流式细胞检测。流式数据显示，通过注射人外周血细胞(hPBMC)，可以在5只B-NDG nude小鼠体内检测到表达人白细胞表面分子标记(CD45+)的细胞。本实验结果表明通过移植人外周血细胞，可以初步在小鼠体内重建人免疫系统。且进一步的分析表明，外周血细胞的重建以T细胞为主。
[0172] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。
[0173] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0174] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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