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核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法

阅读：26发布：2021-11-21

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权利要求

1.一种核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法，其特征在于：包括以下步骤，
S1、前列腺特异性抗原PSA启动子的克隆与鉴定；
S2、hTERT/PSA双调控增殖腺病毒载体RSOAds－hTERT/PSA的构建及鉴定；
S3、核素125I标记hTERT/PSA双调控增殖型溶瘤腺病毒构建125I－RSOAds－hTERT/PSA核素-溶瘤病毒标记物；
S4、125I－RSOAds－hTERT/PSA体外对激素非依赖性前列腺癌细胞的转染效率、肿瘤杀伤效应检测；
S5、125I－RSOAds－hTERT/PSA靶向治疗前列腺癌抑瘤效应、瘤微环境改变观察。
2.如权利要求1所述的核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法，其特征在于：步骤S1具体为，
S11、前列腺特异性启动子的基因PCR克隆与鉴定：根据美国NCBI Nucleotide获得的序列(U37672.1)，设计扩增PSA启动子引物，并分别引入NotI和SpeI酶切位点；从前列腺癌组织中提取基因组DNA，并以此为模板行PCR扩增出522bp大小PSA启动子片段；用EcoR V酶切pUC57质粒，将目的基因的PCR产物与pUC57载体酶切产物进行连接，筛选克隆，提取质粒并测序确认插入产物；将鉴定正确的质粒命名为pUC57-PSAp；
S12、PSA启动子和hTERT启动子生物活性测定：培养表达不同PSA及hTERT的前列腺癌细胞至对数生长期，转染含有PSA启动子和hTERT启动子的荧光素酶质粒PGL3-PSA及hTERT，双荧光素酶系统测定PSA启动子和hTERT启动子的生物活性。
3.如权利要求1所述的核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法，其特征在于：步骤S2具体为，
S21、hTERT/PSA双调控增殖腺病毒载体RSOAds－hTERT/PSA的构建：运用定点突变重叠聚合酶链反应技术使腺病毒质粒PQW1的E1A和E1B的启动子缺失，并产生合适的酶切位点，将带有相同酶切位点的hTERT启动子和PSA启动子连入PQW1载体中，得到双调控增殖腺病毒载体RSOAds－hTERT/PSA；
S22、每组病毒均进行扩增和滴度测定。
4.如权利要求1-3任一项所述的核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法，其特征在于：步骤S3具体为，
S31、125I标记采用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)作为氧化剂进行标记，分别设定不同浓度的溶瘤病毒和NBS进行作用，以便确定最佳的标记条件，分别考察125I的用量、反应时间、pH值、反应体积对125I－RSOAds－hTERT/PSA核素-溶瘤病毒标记物标记率的影响；
S32、标记完成后采用凝胶柱层析法分离纯化核素-溶瘤腺病毒标记物；采用纸层析法
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测定 I－RSOAds－hTERT/PSA标记物不同时间的放射性纯度，采用微孔滤膜过滤除菌，并将标记物放4℃冰箱保存待用；
S33、125I分别标记双调控溶瘤腺病毒完成预实验，对最佳标记方法、标记条件、标记率、外部条件包括温度、时间与pH值对标记成功的影响。
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5.如权利要求1-3任一项所述的核素 I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法，其特征在于：步骤S4具体为，
S41、RT-PCR和Western blot法分别测定2种前列腺癌细胞株包括人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3、小鼠雄激素非依赖性前列腺腺癌细胞株RM-1，和正常前列腺组织的的hTERT/PSA生物活性表达情况；
S42、培养hTERT/PSA表达量不同的各类型前列腺癌细胞，检测各组细胞中前列腺肿瘤干细胞抗原PSCN、CD44+、CD24+等表面分子的表达情况；
S43、体外实验分4组：病毒-核素复合物组(125I-RSOAds-hTERT-PSA)、未核素标记RSOAds-hTERT-PSA组、单纯核素125I组、生理盐水空白对照组，根据实验要求适时分别加入各实验组以上2种类型的体外培养的前列腺癌细胞，对比研究以上4组对hTERT和PSA表达不同的前列腺癌细胞的杀伤作用；
S44、各组进行如下检测，并至少重复3次，将收集的资料进行详细统计学分析，以便观察125I－RSOAds－hTERT/PSA的对前列腺癌细胞生长的杀伤作用：
①125I－RSOAds－hTERT/PSA中溶瘤腺病毒E1A/E1B基因表达检测；②125I－RSOAds－
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hTERT/PSA中溶瘤腺病毒复制能力检测；③ I－RSOAds－hTERT/PSA对前列腺癌细胞杀伤效应测定；④ELISA法检测各组培养液上清中细胞因子分泌情况，了解免疫指标变化情况；
⑤TUNNEL法和流式细胞术检测各组前列腺癌细胞凋亡情况，对一些特殊的凋亡诱导指标进行检测；⑥前列腺癌肿瘤细胞表面前列腺干细胞抗原PSCN、CD44+、CD24+的表达变化情况；
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S45、核素 I在前列腺癌肿瘤细胞中浓聚程度检测，同等杀伤效果下核素 I使用剂量检测，不同培养时段核素125I的稳定性检测。
6.如权利要求1-3任一项所述的核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法，其特征在于：步骤S5具体为，
S51、核素-病毒复合物在正常小鼠体内的分布：125I-RSOAds-hTERT-PSA自小鼠的尾静脉注入，在不同时段采用ECT或者PET-CT成像，测定不同器官核素的标准最大摄取值；
S52、参考国际国内文献建立种植性近交系C57BL/6小鼠前列腺癌动物模型：将体外培养处于对数期的小鼠雄激素非依赖性前列腺腺癌细胞株RM-1制成细胞悬液，并按10×106/鼠进行皮下注射于小鼠右前肢腋下或其他合适部位，采用微型超声和触摸法相结合观察成瘤情况，在成瘤约2g，进行实验，此时通过尾静脉抽血验PSA以及部分细胞因子；
S53、动物实验随机分4组(n＝20)：核素-病毒(125I-RSOAds-hTERT-PSA)标记物组、未标记核素RSOAds-hTERT-PSA组、单纯核素125I组、生理盐水空白对照组，分别采用前列腺癌组织内直接注射法和小鼠静脉给药法处理各实验组小鼠，对比研究125I-RSOAds-hTERT-PSA标记物、双调控溶瘤腺病毒RSOAds-hTERT-PSA、单纯应用核素125I的抗肿瘤作用效果；
S54、各实验组在不同的时间段分别进行如下观察和检测：
①荷瘤鼠皮下肿瘤生长曲线、生存期观察及移植瘤体积测定(采用微型超声检查)；②检测肿瘤组织转染腺病毒E1A/E1B蛋白含量，研究转染效率，观察125I-RSOAds-hTERT-PSA能否直接靶向感染前列腺癌细胞；③前列腺癌细胞凋亡检测(TUNNEL法和流式细胞术)；采用Western Blot检测Caspase-3等表达水平，探讨凋亡诱导的通路；④前列腺癌异位移植瘤以及重要脏器病理学检测(HE染色检查、免疫组化法)，检查瘤体中的CD4+、CD8+T细胞和巨噬细胞浸润情况；⑤ELISA方法检测小鼠血清中细胞因子的分泌包括IL-2、TNF、IL-10及IFN-γ；
⑥PSA变化情况。
S55、通过电镜检查了解种植前列腺肿瘤组织的微侵袭和微血管生成情况；检测各组肿瘤组织中VGEF、PSCN、CD44+、CD31+、C D24+的表达情况；检测病理标本中炎性细胞的浸润情况；探讨肿瘤微环境变化情况；
S56、采用ECT或者PET-CT成像方法，观察治疗后小鼠体内核素125I分布情况；观察荷瘤鼠应用125I－RSOAds－hTERT/PSA后是否有毒副作用，并得到应用剂量。

说明书全文

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核素 I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向

治疗的实验研究方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法。

背景技术

[0002] 前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。2004年WHO《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中前列腺癌病理类型上包括腺癌(腺泡腺癌)、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌。其中前列腺腺癌占95％以上，因此，通常所说的前列腺癌就是指前列腺腺癌。2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。

[0003] 前列腺癌的研究是目前研究的重要课题之一，目前尚缺乏核素125I标记 PSA/hTERT启动子双调控溶瘤腺病毒对前列腺癌靶向治疗及瘤微环境影响的准确研究。核素125I标记PSA/hTERT启动子双调控溶瘤腺病毒的方法，该方法国内外鲜有报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法解决现有技术中存在如何进行核素125I标记 PSA/hTERT启动子双调控溶瘤腺病毒对前列腺癌靶向治疗及瘤微环境影响的准确研究的问题。

[0005] 本发明的技术解决方案是：

[0006] 一种核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法，其特征在于：包括以下步骤，

[0007] S1、前列腺特异性抗原PSA启动子的克隆与鉴定；

[0008] S2、hTERT/PSA双调控增殖腺病毒载体RSOAds－hTERT/PSA的构建及鉴定；

[0009] S3、核素125I标记hTERT/PSA双调控增殖型溶瘤腺病毒构建125I－RSOAds －hTERT/PSA核素-溶瘤病毒标记物；

[0010] S4、125I－RSOAds－hTERT/PSA体外对激素非依赖性前列腺癌细胞的转染效率、肿瘤杀伤效应检测；

[0011] S5、125I－RSOAds－hTERT/PSA靶向治疗前列腺癌抑瘤效应、瘤微环境改变观察。

[0012] 进一步地，步骤S1具体为，

[0013] S11、前列腺特异性启动子的基因PCR克隆与鉴定：根据美国NCBI Nucleotide获得的序列(U37672.1)，设计扩增PSA启动子引物，并分别引入 NotI和SpeI酶切位点；从前列腺癌组织中提取基因组DNA，并以此为模板行 PCR扩增出522bp大小PSA启动子片段；用EcoR V酶切pUC57质粒，将目的基因的PCR产物与pUC57载体酶切产物进行连接，筛选克隆，提取质粒并测序确认插入产物；将鉴定正确的质粒命名为pUC57-PSAp；

[0014] S12、PSA启动子和hTERT启动子生物活性测定：培养表达不同PSA及 hTERT的前列腺癌细胞至对数生长期，转染含有PSA启动子和hTERT启动子的荧光素酶质粒PGL3-PSA及hTERT，双荧光素酶系统测定PSA启动子和 hTERT启动子的生物活性。

[0015] 进一步地，步骤S2具体为，

[0016] S21、hTERT/PSA双调控增殖腺病毒载体RSOAds－hTERT/PSA的构建：运用定点突变重叠聚合酶链反应技术使腺病毒质粒PQW1的E1A和E1B的启动子缺失，并产生合适的酶切位点，将带有相同酶切位点的hTERT启动子和 PSA启动子连入PQW1载体中，得到双调控增殖腺病毒载体RSOAds－ hTERT/PSA；

[0017] S22、每组病毒均进行扩增和滴度测定。

[0018] 进一步地，步骤S3具体为，

[0019] S31、125I标记采用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)作为氧化剂进行标记，分别设定不同浓度的溶瘤病毒和NBS进行作用，以便确定最佳的标记条件，分别考察125I的用量、反应时间、125
pH值、反应体积对 I－RSOAds－hTERT/PSA核素- 溶瘤病毒标记物标记率的影响；

[0020] S32、标记完成后采用凝胶柱层析法分离纯化核素-溶瘤腺病毒标记物；采用纸层析法测定125I－RSOAds－hTERT/PSA标记物不同时间的放射性纯度，采用微孔滤膜过滤除菌，并将标记物放4℃冰箱保存待用；

[0021] S33、125I分别标记双调控溶瘤腺病毒完成预实验，对最佳标记方法、标记条件、标记率、外部条件包括温度、时间与pH值对标记成功的影响。

[0022] 进一步地，步骤S4具体为，

[0023] S41、RT-PCR和Western blot法分别测定2种前列腺癌细胞株包括人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3、小鼠雄激素非依赖性前列腺腺癌细胞株RM-1，和正常前列腺组织的的hTERT/PSA生物活性表达情况；

[0024] S42、培养hTERT/PSA表达量不同的各类型前列腺癌细胞，检测各组细胞中前列腺肿瘤干细胞抗原PSCN、CD44+、CD24+等表面分子的表达情况；

[0025] S43、体外实验分4组：病毒-核素复合物组(125I-RSOAds-hTERT-PSA)、未核素标记RSOAds-hTERT-PSA组、单纯核素125I组、生理盐水空白对照组，根据实验要求适时分别加入各实验组以上2种类型的体外培养的前列腺癌细胞，对比研究以上4组对hTERT和PSA表达不同的前列腺癌细胞的杀伤作用；

[0026] S44、各组进行如下检测，并至少重复3次，将收集的资料进行详细统计学分析，以便观察125I－RSOAds－hTERT/PSA的对前列腺癌细胞生长的杀伤作用：

[0027] ①125I－RSOAds－hTERT/PSA中溶瘤腺病毒E1A/E1B基因表达检测；②125I－RSOAds－hTERT/PSA中溶瘤腺病毒复制能力检测；③125I－RSOAds－ hTERT/PSA对前列腺癌细胞杀伤效应测定；④ELISA法检测各组培养液上清中细胞因子分泌情况，了解免疫指标变化情况；⑤TUNNEL法和流式细胞术检测各组前列腺癌细胞凋亡情况，对一些特殊的凋亡诱导指标进行检测；⑥前列腺癌肿瘤细胞表面前列腺干细胞抗原PSCN、CD44+、CD24+的表达变化情况；

[0028] S45、核素125I在前列腺癌肿瘤细胞中浓聚程度检测，同等杀伤效果下核素125I使用125
剂量检测，不同培养时段核素 I的稳定性检测。

[0029] 进一步地，步骤S5具体为，

[0030] S51、核素-病毒复合物在正常小鼠体内的分布：125I-RSOAds-hTERT-PSA 自小鼠的尾静脉注入，在不同时段采用ECT或者PET-CT成像，测定不同器官核素的标准最大摄取值；

[0031] S52、参考国际国内文献建立种植性近交系C57BL/6小鼠前列腺癌动物模型：将体外培养处于对数期的小鼠雄激素非依赖性前列腺腺癌细胞株RM-1制成细胞悬液，并按10×106/鼠进行皮下注射于小鼠右前肢腋下或其他合适部位，采用微型超声和触摸法相结合观察成瘤情况，在成瘤约2g，进行实验，此时通过尾静脉抽血验PSA以及部分细胞因子；

[0032] S53、动物实验随机分4组(n＝20)：核素-病毒(125I-RSOAds-hTERT-PSA) 标记物组、未标记核素RSOAds-hTERT-PSA组、单纯核素125I组、生理盐水空白对照组，分别采用前列125
腺癌组织内直接注射法和小鼠静脉给药法处理各实验组小鼠，对比研究 I-RSOAds-hTERT-PSA标记物、双调控溶瘤腺病毒 RSOAds-hTERT-PSA、单纯应用核素125I的抗肿瘤作用效果；

[0033] S54、各实验组在不同的时间段分别进行如下观察和检测：

[0034] ①荷瘤鼠皮下肿瘤生长曲线、生存期观察及移植瘤体积测定(采用微型超声检查)；②检测肿瘤组织转染腺病毒E1A/E1B蛋白含量，研究转染效率，观察125I-RSOAds-hTERT-PSA能否直接靶向感染前列腺癌细胞；③前列腺癌细胞凋亡检测(TUNNEL法和流式细胞术)；采用Western Blot检测Caspase-3等表达水平，探讨凋亡诱导的通路；④前列腺癌异+ +位移植瘤以及重要脏器病理学检测(HE染色检查、免疫组化法)，检查瘤体中的CD4 、CD8T细胞和巨噬细胞浸润情况；⑤ELISA方法检测小鼠血清中细胞因子的分泌包括IL-2、TNF、 IL-
10及IFN-γ；⑥PSA变化情况。

[0035] S55、通过电镜检查了解种植前列腺肿瘤组织的微侵袭和微血管生成情况；检测各组肿瘤组织中VGEF、PSCN、CD44+、CD31+、C D24+的表达情况；检测病理标本中炎性细胞的浸润情况；探讨肿瘤微环境变化情况；

[0036] S56、采用ECT或者PET-CT成像方法，观察治疗后小鼠体内核素125I分布情况；观察荷瘤鼠应用125I－RSOAds－hTERT/PSA后是否有毒副作用，并得到应用剂量。

[0037] 本发明的有益效果是：该种核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法，能够实现准确的影响分析，通过较全面的实验方法，进而实现对核素125I标记PSA/hTERT启动子双调控溶瘤腺病毒对前列腺癌靶向治疗及瘤微环境影响的检测，保证了结果的准确性与可靠性。

具体实施方式

[0038] 实施例

[0039] 一种核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法，其特征在于：包括以下步骤，

[0040] S1、前列腺特异性抗原PSA启动子的克隆与鉴定；

[0041] 步骤S1具体为，

[0042] S11、前列腺特异性启动子的基因PCR克隆与鉴定：根据美国NCBI Nucleotide获得的序列(U37672.1)，设计扩增PSA启动子引物，并分别引入 NotI和SpeI酶切位点；从前列腺癌组织中提取基因组DNA，并以此为模板行 PCR扩增出522bp大小PSA启动子片段；用EcoR V酶切pUC57质粒，将目的基因的PCR产物与pUC57载体酶切产物进行连接，筛选克隆，提取质粒并测序确认插入产物；将鉴定正确的质粒命名为pUC57-PSAp；

[0043] S12、PSA启动子和hTERT启动子生物活性测定：培养表达不同PSA及 hTERT的前列腺癌细胞至对数生长期，转染含有PSA启动子和hTERT启动子的荧光素酶质粒PGL3-PSA及hTERT，双荧光素酶系统测定PSA启动子和 hTERT启动子的生物活性。

[0044] S2、hTERT/PSA双调控增殖腺病毒载体RSOAds－hTERT/PSA的构建及鉴定；

[0045] 步骤S2具体为，

[0046] S21、hTERT/PSA双调控增殖腺病毒载体RSOAds－hTERT/PSA的构建：运用定点突变重叠聚合酶链反应技术使腺病毒质粒PQW1的E1A和E1B的启动子缺失，并产生合适的酶切位点，将带有相同酶切位点的hTERT启动子和 PSA启动子连入PQW1载体中，得到双调控增殖腺病毒载体RSOAds－ hTERT/PSA；

[0047] S22、每组病毒均进行扩增和滴度测定。

[0048] S3、核素125I标记hTERT/PSA双调控增殖型溶瘤腺病毒构建125I－RSOAds －hTERT/PSA核素-溶瘤病毒标记物；

[0049] 步骤S3具体为，

[0050] S31、125I标记采用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)作为氧化剂进行标记，分别设定不同浓度的溶瘤病毒和NBS进行作用，以便确定最佳的标记条件，分别考察125I的用量、反应时间、125
pH值、反应体积对 I－RSOAds－hTERT/PSA核素- 溶瘤病毒标记物标记率的影响；

[0051] S32、标记完成后采用凝胶柱层析法分离纯化核素-溶瘤腺病毒标记物；采用纸层析法测定125I－RSOAds－hTERT/PSA标记物不同时间的放射性纯度，采用微孔滤膜过滤除菌，并将标记物放4℃冰箱保存待用；

[0052] S33、125I分别标记双调控溶瘤腺病毒完成预实验，对最佳标记方法、标记条件、标记率、外部条件包括温度、时间与pH值对标记成功的影响。

[0053] S4、125I－RSOAds－hTERT/PSA体外对激素非依赖性前列腺癌细胞的转染效率、肿瘤杀伤效应检测；

[0054] 步骤S4具体为，

[0055] S41、RT-PCR和Western blot法分别测定2种前列腺癌细胞株包括人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3、小鼠雄激素非依赖性前列腺腺癌细胞株RM-1，和正常前列腺组织的的hTERT/PSA生物活性表达情况；

[0056] S42、培养hTERT/PSA表达量不同的各类型前列腺癌细胞，检测各组细胞中前列腺肿瘤干细胞抗原PSCN、CD44+、CD24+等表面分子的表达情况；

[0057] S43、体外实验分4组：病毒-核素复合物组(125I-RSOAds-hTERT-PSA)、未核素标记RSOAds-hTERT-PSA组、单纯核素125I组、生理盐水空白对照组，根据实验要求适时分别加入各实验组以上2种类型的体外培养的前列腺癌细胞，对比研究以上4组对hTERT和PSA表达不同的前列腺癌细胞的杀伤作用；

[0058] S44、各组进行如下检测，并至少重复3次，将收集的资料进行详细统计学分析，以便观察125I－RSOAds－hTERT/PSA的对前列腺癌细胞生长的杀伤作用：

[0059] ①125I－RSOAds－hTERT/PSA中溶瘤腺病毒E1A/E1B基因表达检测；②125I－125
RSOAds－hTERT/PSA中溶瘤腺病毒复制能力检测；③ I－RSOAds－ hTERT/PSA对前列腺癌细胞杀伤效应测定；④ELISA法检测各组培养液上清中细胞因子分泌情况，了解免疫指标变化情况；⑤TUNNEL法和流式细胞术检测各组前列腺癌细胞凋亡情况，对一些特殊的凋亡诱导指标进行检测；⑥前列腺癌肿瘤细胞表面前列腺干细胞抗原PSCN、CD44+、CD24+的表达变化情况；

[0060] S45、核素125I在前列腺癌肿瘤细胞中浓聚程度检测，同等杀伤效果下核素125I使用剂量检测，不同培养时段核素125I的稳定性检测。

[0061] S5、125I－RSOAds－hTERT/PSA靶向治疗前列腺癌抑瘤效应、瘤微环境改变观察。

[0062] 步骤S5具体为，

[0063] S51、核素-病毒复合物在正常小鼠体内的分布：125I-RSOAds-hTERT-PSA 自小鼠的尾静脉注入，在不同时段采用ECT或者PET-CT成像，测定不同器官核素的标准最大摄取值；

[0064] S52、参考国际国内文献建立种植性近交系C57BL/6小鼠前列腺癌动物模型：将体外培养处于对数期的小鼠雄激素非依赖性前列腺腺癌细胞株RM-1制成细胞悬液，并按10×106/鼠进行皮下注射于小鼠右前肢腋下或其他合适部位，采用微型超声和触摸法相结合观察成瘤情况，在成瘤约2g，进行实验，此时通过尾静脉抽血验PSA以及部分细胞因子；

[0065] S53、动物实验随机分4组(n＝20)：核素-病毒(125I-RSOAds-hTERT-PSA) 标记物组、未标记核素RSOAds-hTERT-PSA组、单纯核素125I组、生理盐水空白对照组，分别采用前列腺癌组织内直接注射法和小鼠静脉给药法处理各实验组小鼠，对比研究125I-RSOAds-125
hTERT-PSA标记物、双调控溶瘤腺病毒 RSOAds-hTERT-PSA、单纯应用核素 I的抗肿瘤作用效果；

[0066] S54、各实验组在不同的时间段分别进行如下观察和检测：

[0067] ①荷瘤鼠皮下肿瘤生长曲线、生存期观察及移植瘤体积测定(采用微型超声检查)；②检测肿瘤组织转染腺病毒E1A/E1B蛋白含量，研究转染效率，观察125I-RSOAds-hTERT-PSA能否直接靶向感染前列腺癌细胞；③前列腺癌细胞凋亡检测(TUNNEL法和流式细胞术)；采用Western Blot检测Caspase-3等表达水平，探讨凋亡诱导的通路；④前列腺癌异位移植瘤以及重要脏器病理学检测(HE染色检查、免疫组化法)，检查瘤体中的CD4+、CD8+T细胞和巨噬细胞浸润情况；⑤ELISA方法检测小鼠血清中细胞因子的分泌包括IL-2、TNF、 IL-10及IFN-γ；⑥PSA变化情况。

[0068] S55、通过电镜检查了解种植前列腺肿瘤组织的微侵袭和微血管生成情况；检测各组肿瘤组织中VGEF、PSCN、CD44+、CD31+、C D24+的表达情况；检测病理标本中炎性细胞的浸润情况；探讨肿瘤微环境变化情况；

[0069] S56、采用ECT或者PET-CT成像方法，观察治疗后小鼠体内核素125I分布情况；观察荷瘤鼠应用125I－RSOAds－hTERT/PSA后是否有毒副作用，并得到应用剂量。

[0070] 该种核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法，能够实现准确的影响分析，通过较全面的实验方法，进而实现对核素125I标记PSA/hTERT启动子双调控溶瘤腺病毒对前列腺癌靶向治疗及瘤微环境影响的检测，保证了结果的准确性与可靠性。

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核素125I标记双调控溶瘤腺病毒的方法及其对前列腺癌靶向治疗的实验研究方法

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