定义
术语“关节内半衰期”、“存留半衰期”和它们的同源词指如下时 间,其为适于将给定的粘弹性补充剂注射入关节内区域的任何时间中 较大(的时间):(a)清除50%注射的HA凝胶组分需要的时间;(b)清 除50%注射的HA液体组分需要的时间;和(c)清除50%HA需要的 时间,无论其是否为液体、凝胶或另一种形式。用于计算存留半衰期 的目的,除非另有说明,注射被认为是给药进入成年人的
膝关节的关 节内区域。用于测定存留半衰期的方法是本领域已知的,说明性的方 法为在
实施例中描述的。
术语“HA液体”、“HA液体相”、“HA液体组分”、“可溶性HA” 和它们的同源词指具有小于20MDa的平均MW的非交联的或微交联 的(lightly crosslinked)
水溶性HA。
术语“HA凝胶”、“HA凝胶相”、“HA凝胶组分”和它们的同源 词指HA凝胶,其为不包含可溶性HA或包含小于10%(w/w)可溶性 HA的基于HA的组合物的水不溶性部分。典型地,给定基于HA的组 合物中凝胶的含量可以通过从HA液体中分离HA凝胶来测定,所述组 合物包含HA凝胶和HA液体的混合。分离可通过例如45μ
过滤器过 滤组合物来实现,所述过滤器使可溶性HA穿过,而保留不溶相。为 了使更粘性组合物中的可溶性HA从HA凝胶中的释放达到最大,需要 在过滤前用几体积有或没有使其达到平衡的
溶剂稀释组合物。而且, 通常,基于它们的
流变学性质,纯凝胶可与纯液体区分,所述流变学 性质例如储能(弹性的)模量(storage(elastic)modulus(G′)和损耗 (粘性的)模量(loss(viscous)modulus)(G″),其分别表示随着变 形速率(测试
频率)的改变,物质可以回收(弹性应答(elastic response))或流动(粘性应答(viscous response))的相对程度。这 两个模量都为频率的线性函数。它们已被证明是
聚合物溶液和凝胶结 构的灵敏的探针。G′和G″随着频率的增加而增加,但是一个比另一 个增加的更快。在其中G′=G″时,该频率被称为交叉频率(fc)。交叉频 率随着聚合物分子量或浓度的增加而降低。对于在低频率的聚合物溶 液,弹性
应力松弛和粘应应力占主导,因此,在频率低于fc时,G″大 于G′。相反,对于凝胶,不会存在G′和G″交叉,在频带中G′大于 G″。除非另有说明,测试频率为0.04-7Hz。对于粘弹性材料的物理性 能和测定这些性质的方法的综述,参见,例如“Polymers as Rheology Modifiers”,由Schulz和Glass编辑,ACS Symposium Series 462, 1991;“An Introduction to Rheology,”H.A.Bames,J.F.Hutton和K. Walters,Elsevier,1989;和Bohlin Rheometer Application Notes MRK544-01,MRK556-01和MRK573-01。
术语“HA”、“透明质酸盐”、“透明质烷”可交换使用,除非另有 说明,指任意HA,而不考虑来源(细菌
发酵的或动物衍生的)、分子量、 其物理形式(例如凝胶或液体),或存在或不存在化学改性(例如交联的 或其它衍生化的)或制备方法。
方案
本发明提供粘弹性补充方法和相关的方法。根据本发明,粘弹性 补充方法包括在3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26周内单次关节内注 射给药粘弹性补充剂,给药量足以在注射后提供达4、5或6个月的治 疗效果。在某些实施方案中,大体积单次注射的治疗效果基本上与在 治疗过程内三次注射给药(每次为大体积的1/3)获得的相同。在某些实 施方案中,单次注射方案提供在注射后关节痛减少直至4、5或6个月。
治疗效果可以通过任意适宜的方法(参见,例如,Altman等(1996) Osteoarth.Cart.,4:217-243)评价。例如,治疗效果可通过测定关节痛 的减少来评价。关节痛的程度可以根据五点Likert分类(例如没有、轻 度、中度、严重、非常严重),或者按如在实施例中描述的100mm直 观类比尺(scale)(VAS)分类。其它适宜的疼痛指数包括
健康状态评 估调查表(HAQ)(Fries等(1980)Arthritis Rheumatol.,23:137-145)和 关节炎影响检测尺(Arthritis Impact Measurement Scale)(AIMS) (Meenan等(1980)Arthritis Rheumatol.,23:146-154。
治疗效果也可通过测定功能缺损程度的改善来评价。功能缺损可 使用分离有效的多维指数(segregated validated multidimensional index)(SMI),例如用于髋部和膝OA的Western Ontario和McMaster ′s大学(WOMAC TM)OA指数(Bellamy等人(1988)J.Rheumatol. 34:1833-1840;也参见实施例);或聚集的多维指数(aggregated multidimensional index)(AMI),例如用于髋部或膝的痛-函数指数 (Algo-Functional Index)(AFI)(Lequesne等人(1987)Scand.J. Rheumatol.Suppl.,65:85-89)。
治疗效果也可由患者或医师通过总体状况评估来评价。总体状况 可利用Likert或VAS尺来评价,例如在实施例中描述的。
治疗效果的其它标记可包括关节检查(参见,例如Theiler等人 (1994)Osteoarth.Cart.,2:1-24),基于性能测定(performance based measures)(参见,例如Rejeski等人(1995)Osteoarth.Cart., 3:157-168)等。
在某些实施方案中,给药进入膝关节的粘弹性补充剂的量为6±2 ml或更高,例如4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、 6.5、6.75、7、7.25、7.5、7.75、8ml或更高。
粘弹性补充剂
在本发明的方法中使用的基于HA的粘弹性补充剂具有下述任一 项、任两项或所有的特征:
(i)粘弹性补充剂具有小于3周的存留半衰期。
(ii)粘弹性补充剂包含小于20mg/ml HA;
(iii)在粘弹性补充剂中5%(w/w)或更高的HA为凝胶形式。
在一个说明性的实施方案中,在本发明中使用的粘弹性补充剂为 Synvisc。Synvisc包含两种形式的8±2mg/ml HA:可溶性形式, hylan A(平均MW 6,000kDa)和在生理学可接受的溶液中的水合凝胶 形式,hylan B。按HA的重量计,在Synvisc中的hylan A/hylan B 比例为9∶1。Hylan A为通过用少量醛共价交联来化学改性的水溶性透 明质烷,所述醛典型地为甲醛,而hylan B为用二乙烯砜进一步交联的 hylan A。Hylan液体为水合的hylan A,用少量交联进行的改性形式的 透明质烷,所述交联增加了其平均分子量和增加了其粘弹性性质。 Hylan凝胶为hylan B的水合形式,其为使用二乙烯砜作为双功能的交 联剂通过将hylan A交联成连续聚合的网状结构制备的。
通常,在本发明提供的方案中使用的粘弹性补充剂包括具有关节 内存留半衰期短于22天例如21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4和3天的基于HA的粘弹性补充剂。 在某些实施方案中,粘弹性补充剂的存留半衰期大于2、3、4、5、6 或7天。
在本发明中使用的粘弹性补充剂可进一步表征为:其中它们包含 小于20mg/ml HA,例如在1-15、1-10、1-5、5-15、5-10、10-15、 6-10和7-9mg/ml的范围。在给定组合物中的HA的含量可通过任意 适宜的方法测定,如例如在实施例中描述的方法。
在本发明中使用的粘弹性补充剂组合物可进一步表征为:其中在 粘弹性补充剂中至少10%重量的HA为凝胶形式。例如,在某些实施 方案中,粘弹性补充剂包含至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、99%或更高的HA凝胶。在某些实施方案中,粘弹性补 充剂包含10-90%、10-75%、10-50%、10-40%、10-25%HA凝胶。 在某些实施方案中,在粘弹性补充剂中HA凝胶/HA液体的比例包含 1∶50-10∶1(w/w),例如1∶50、1∶25、1∶15、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、 1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1 和10∶1。
在本发明的方法中使用的粘弹性补充剂可进一步在液体相中包含 水溶性的HA,其具有HA的MW为500-20,000kDa,例如500-1,000; 500-1,500、500-3,000;500-5,000;500-7,000;500-10,000; 500-15,000;1,000-1,500;1,000-3,000;1,000-5,000;1,000-7,000; 1,000-10,000;1,000-15,000;5,000-10,000;和10,000-15,000kDa。
HA可以是动物源的,例如来源于公鸡冠或脐带或非动物源,例如 细菌发酵的。细菌发酵的HA可以如在例如Cooney等人(1999) Biotechnol.Prog.,15:898-910中描述的。细菌发酵的HA也可以为市 售的(例如Shiseido,Japan;Sigma-Aldrich,USA)。
HA可以是衍生的(例如交联的或另外改性的或稳定的)或非衍生 的。交联剂的实例包括醛、环氧化物、polyaziril、缩水甘油醚(例如1,4- 丁二醇二缩水甘油醚)和二乙烯砜。
在本发明的方法中使用的粘弹性补充剂的特定实例包括AdantTM、 ArthreaseTM、ArthrumTM、FermathronTM、GoonTM、 HyalartTM/HyalganTM、Hy-GAGTM、Hya-jectTM、HyalubrixTM、 NeoViscTM、SupartzTM/ArtzTM、Synvisc、OrthoviscTM、OstenilTM、 SinovialTM、SuplasynTM和SynochromTM、ViscornealTM(参见,例如 Physicians′Desk ReferenceTM,2004)。其它适宜在本发明的方法中使 用的产物包括在美国
专利Nos.5,143,724;4,713,448;5,099,013; 5,399,351;6,521,223;5,827,937;美国专利
申请 No.60/533,429 中描述的粘弹性补充剂。
包括hylan A和hylan B的hylans和粘弹性补充剂的制备为在例 如美国专利Nos.5,143,724;4,713,448;5,099,013和5,399,351中描 述的。
在某些实施方案中,粘弹性补充剂不包括DurolaneTM和/或其它的 具有存留半衰期比21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49或50天长的粘弹性补充剂。
粘弹性补充剂也可包含另外的活性或无活性化合物,包括例如非 甾体抗炎药(NSAIDs),例如IbuprofenTM、DiclofenacTM和PiroxicamTM; 麻醉剂例如,LidocaineTM和BupivacaineTM;麻醉性
镇痛剂,例如, 可待因和吗啡;皮质类固醇,例如,地塞米松和泼尼松;
抗肿瘤剂例 如MethotrexateTM,5-氟尿嘧啶和PaclitaxelTM和抗病毒剂,例如, AcyclovirTM和VidarabineTM。粘弹性补充剂也可包含组分例如细胞(例 如软骨细胞或间充质干细胞)、
蛋白质、DNA、维生素或其它想要的生 物学活性物质。
用途和给药
本发明提供用于治疗患有关节病症的患者和用于减少与这种病症 有关的疼痛和不适的方法和组合物。这种病症的实例包括骨关节炎(原 发性(自发性)或继发性)、类风湿性关节炎、关节损伤(例如重复性的运 动损伤)、软骨组织病症(软骨
软化)和关节炎前状况。本发明进一步提 供减少与这种病症有关的疼痛的方法。该方法可在需要用于关节病症 治疗的人类中或在非人类患者中实施。
给药部位的实例包括膝的、
肩膀的、颞下颌的和腕掌的关节、肘、 髋部、腕、踝和在脊柱中腰椎关节突(小平面)的关节。注射到任一个这 些关节中的体积将至少为用于那些关节的目前推荐剂量的双倍。
本发明进一步提供粘弹性补充装置,包括前灌注的、单次使用的
注射器,其包含6±2ml的单次单元剂量的Synvisc,例如4、4.25、 4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、6.5、6.75、7、7.25、7.5、 7.75、8、8.25、8.5、8.75、9、9.25、9.5、9.75、10ml或更多。尽 管其优选地提供使用本文中提供的单次注射器的单次给药剂量,但是 需要的剂量可以由两个或多个注射器提供。例如,单次给药6ml可以 使用每个包含2ml的3个注射器完成。
下述实施例提供说明性的实施方案。所述实施例不以任何方式限 制本发明。本领域普通技术人员将认识到在本发明的范围内可进行多 种修饰和改变。因此,这样的修饰和改变包括在本发明内。
实施例
实施例1:在患有OA的患者中Synvisc的关节内注射
进行预期的、开放标记的研究用于评价在患有有症状的胫腿节 OA(在研究的膝中的总体OA疼痛,在100mm VAS尺上为50-80)的 非卧床病人中进行关节内注射4ml或6ml Synvisc的安全和功效(包 括作用的持续时间),所述关节内注射4ml或6ml Synvisc与目前三 次关节内注射2ml Synvisc的配药方案相反。包含的其它条件为:年 龄在40岁以上;最近的3个月内通过
X射线测定的Kellgren-Lawrence 等级为II-III;没有压力渗出液(tense effusion)、机能损耗(mechanical deficit)或最近(<2年)的创伤。将100名患者(从59到66岁,平均年 龄61年,55%女性)随机分为五组:
第1组:一次注射6ml;
第2组:一次注射4ml;
第3组:隔两周注射4ml两次;
第4组:隔一周注射4ml三次;和
第5组:标准方案:隔一周注射2ml三次
然后,随访患者6个月(在第2、3、8、16和24周)。使用的第一 和第二评价点为如下所述的:
A.OA疼痛的患者自我评价
该研究的基本功效点用于评价在患有膝OA的患者中用Synvisc 粘弹性补充对研究膝OA疼痛缓解的功效。这点可在过去的48小时内 患者自我评价的100mm VAS上测定,没有疼痛的点(0mm)至极度疼 痛(100mm);在第一次注射后的24周进行。
B.患者总体自我评价
患者在100-mm VAS上估计它们的靶标膝的整体状况,100-mm VAS其从很好(0mm)至很差(100mm),考虑48小时内所有相关的体 征和症状。呈给患者的准确说明为下述的:“请利用下面的垂直线指出 你的(研究)膝在这次探访时的整体一般状况左侧或‘0’分表示‘非 常好’,而‘100’分表示‘非常差’”。
C.WOMACTM
患者完成了WOMACTM的VAS模型(version),如在Bellamy等 的(1988)J.Rheumatol.,15(12):1833-40中描述的。该尺为三维的、 疾病特异性、自己管理的、健康状态测定方法。其探查疼痛区域内、 四肢强直和躯体功能总共24个问题的临床重要的患者相关的症状。将 WOMACTM以当地语言提供给患者,通常在小于5分钟内完成。
WOMACTM的分部为下述的。
WOMACTM部分A包括有关活动期间疼痛水平的询问,用没有疼 痛(0mm)至极疼痛(100mm)的VAS对回答评分(由患者)。疼痛的评价 采用下述方案:
1.在平面上行走?[走]
2.上楼或下楼?[爬
楼梯]
3.在晚上在躺床上时?[夜间的]
4.坐着或躺着?[静止]
5.站直?[负重]
WOMAC部分A的平均得分是基于每人对部分A问题的回答。
WOMACTM部分B(四肢强直评分)包括有关活动期间强直严重 性的询问,用没有四肢强直(0mm)至极端四肢强直(100mm)的VAS 对回答评分(由患者)。四肢强直的评价采用下述方案:
1.在早晨苏醒后?[早晨四肢强直]
2.在白天剩余的后来时间(duing rest later in the day)?[在白天 晚些存在的四肢强直]
部分B的平均得分是基于每人对部分B问题的回答。
WOMCCTM部分C包括有关活动期间功能缺损的询问,用没有困 难(0mm)至极困难(100mm)的VAS对回答评分(由患者)。功能缺损的 评价采用下述方案:
1.下楼梯?[早晨四肢强直]
2.上楼梯?[在白天晚些存在的四肢强直]
3.从坐着站立?[起立]
4.站?[站]
5.弯向地板?[弯曲]
6.在平面上行走?[平走]
7.上下车?[
汽车]
8.上街?[购物]
9.穿短袜/长袜[脱短袜/长袜]
10.卧床[卧床]
11.进入/出浴池[进/出浴池]
12.坐[坐]
13.上/下洗手间[上/下洗手间]
14.重的家庭工作[重的家务]
15.轻的家庭工作[轻的家务]
部分C的平均得分是基于每人对部分C问题的回答。
从总WOMACTM得分基线上的改变来自分析在第一次注射后作为 第二端点的所有时间点的3个WOMACTM部分(A、B和C)。
D.医师OA总体评价
在患者完成总体评价和WOMACTM后,研究者用从很好(0mm)至 很差(100mm)的100-mm VAS评价探访时患者膝的整体状况。这一评 价是基于患者的病征、功能能力和身体检查。医师被要求指出在这次 探访时患者膝的整体一般状况,利用具有如下特征呈现的线(line): 线的左侧(“0”)端指“很好”,右端(“100”)指“非常差”。
E.结果
在第一次注射后24周,与基线相比表现出疼痛减少的结果(在过 去48小时内的VAS;0相当于没有疼痛,100相当于极疼)显示在表1 中。与在3×2ml组中的36.7mm相比,在1×6ml组中疼痛按34.9mm 减少,其得分是最好的。在用1×4或2×4ml治疗组中,这一减少相当 少(仅24mm减少)。
表1.OA疼痛的患者自我评价(自基线的变化)
组 1 1×6ml 2 1×4ml 3 2×4ml 4 3×4ml 5 3×2ml 平均值 -34.9 -24.3 -24.0 -32.6 -36.7
标准偏差 16.4 28.3 22.9 25.3 26.9 95%Cl -42.5, -27.2 -37.2, -11.5 -35.0, -13.0 -44.4, -20.8 -42.9, -24.1
包括疼痛、四肢强直和功能缺损改善的第二功效点,如通过 Western Ontario和McMaster Universities Osteoarthritis指数 (WOMACTM)(表2为WOMACTM A)、患者(表3)和医师(表4)总体膝OA 评价测定的,显示出相同的趋势。按照功效和结果排序的处理组显示 在表5中。在第1组中观察的效果的延长持续时间是令人惊奇的。依 据安全性,在每个组(1×6ml和3×2ml)中10%的患者报告了最少强度 或中等强度的相关局部膝
副作用(adverse events)(疼痛、肿胀或渗 出)。
表2.WOMACTM A疼痛得分(自基线的变化)
组 1 1×6ml 2 1×4ml 3 2×4ml 4 3×4ml 5 3×2ml 平均值 -25.8 -14.7 -16.6 -27.7 -25.6 标准偏差 22.5 24.2 24.8 27.2 24.6 95%Cl -36.3, -15.3 -25.7, -3.7 -28.5, -4.6 -40.5, -14.9 -37.1, -14.1
表3.患者总体评价(自基线的变化)
组 1 1×6ml 2 1×4ml 3 2×4ml 4 3×4ml 5 3×2ml 平均值 -31.3 -14.3 -19.8 -35.9 -24.4 标准偏 差 26 31 24 32.9 32.3 95%Cl -43.3,-19.1 -28.4,-0.2 -31.2,-8.2 -41.3,-10.5 -39.5,-9.3
表4.医师总体评价(自基线的变化)
组 1 1×6ml 2 1×4ml 3 2×4ml 4 3×4ml 5 3×2ml 平均值 -30.7 -16.8 -22.9 -25.9 -27.7 标准偏 差 18.3 24.8 26.9 25.0 29.6 95%Cl -39.5,-21.9 -28.1,-5.5 -35.8,-10.0 -37.5,-14.2 -41.6,-13.8
表5:处理组排列
组 1 1×6ml 2 1×4ml 3 2×4ml 4 3×4ml 5 3×2ml Pt.疼痛 2 4 5 3 1 Pt.总体 1 5 4 2 3 Phy.总体 1 5 4 3 2 WOMACTM A 2 5 4 1 3 WOMACTM B 4 5 3 2 1 WOMACTM C 2 4 5 1 3
关于安全性,在处理组之间没有观察到大的差异,一般而言,仅 仅第1组(1×6ml)具有最小副作用。这些结果也建议比2ml大的 Synvisc体积可安全地给药,以减少患有膝骨关节炎的患者的疼痛。
实施例2:Synvisc存留半衰期的测定
A.将14C-乙酸酯加入到公鸡冠的器官培养物的透明质烷中
用颈脱位法处死幼公鸡(3-6个月龄)。用(80%)
乙醇彻底地清洗鸡 冠,然后,利用解剖刀在基部
切除。将过量的血从鸡冠中挤出,将其 放置在无菌盐溶液中,转移到
层流净化罩中,用另外体积的无菌盐溶 液清洗三次。然后,沿着血管中线解剖鸡冠,切除长方形的粉红色皮 组织部分。用解剖刀将鸡冠组织部分切成切片,放置在Ventrex培养 基HL-1(Ventrex Labs)中:5mg/ml丙酸睾丸
酮(Belmar Laboratories, Inwood,NY)、20μ Ci/ml的14C-
醋酸(ICN Radiochemicals,Irvine,CA 1mCi/ml)、0.1mg/ml青霉素、0.1mg/ml
链霉素和0.1mg/ml两性霉 素B(Hazelton,Lenexa,KS)。将单独培养物置入60mm塑料陪替培养 皿中,其包含约1.5g的鸡冠组织和15ml的培养基。在5%CO2环境 中培养培养物72小时,之后,通过在10,000g离心10分钟将组织从 培养基中分离。将组织片冷冻在30mm陪替培养皿中。典型地,在继 续制备hylan的过程前,将冷冻的鸡冠组织保存在
冰箱中1-72小时。
B.放射标记的hylan液体的制备
Hylan A
纤维为如下制备的。将冷冻的放射标记的鸡冠组织的切片 以0.75 g组织每1g反应培养基的比例放置在反应培养基中,所述反 应培养基包含丙酮、福尔
马林(37%甲醛溶液)、氯仿和醋酸钠。允许反 应进行18-20小时,之后采集
组织切片,在丙酮中洗涤三次,然后在 层流净化罩中干燥。然后,将四体积的蒸馏水加入到干的组织切片中, 以便提取放射标记的hylan。该水溶液提取在4-6℃下进行,之后,除 去水提物,加入同样体积的水,进行第二次提取。将固体醋酸钠溶解 在含水提取物中至浓度为1%,通过缓慢加入四体积的95%乙醇沉淀 hylan纤维。在丙酮中洗涤放射标记的hylan纤维两次,将其储存在冷 的丙酮下。
集中放射标记的hylan A纤维(40.3mg),通过在4℃缓慢的翻滚式 混合(end-over-end mixing)3天,将其溶解在3.0ml无菌、无热 原的
磷酸盐缓冲盐水溶液(Biotrics Inc.,Ridgefield, NJ,Iot 122-1)中。 在完成溶解后,用未标记的hylan液体稀释
放射性hylan液体五倍。将 混合物在4℃以翻滚式混合保存另外5天。
C.放射标记的凝胶的制备
将氚化水(New England Nuclear,100mCi/ml)混入用于将hylan 液体(hylan A)交联成hylan凝胶(hylan B)的反应混合物中。按如下进行 交联反应。将Hylan A纤维在氚化水中膨胀约三小时。加入浓缩氢氧 化钠,强力搅拌混合物直到溶液为均相的(约15分钟)。在水中,将二 乙烯砜稀释至50%的浓度,在强力搅拌下,将其加入反应混合物中。 将反应混合物保存在在室温下(22℃)另外55分钟,期间,通过二乙烯 砜将多糖链交联成连续聚合的凝胶(hylan凝胶)。通过在氚化水中进行 该反应,氚共价附着在二乙烯基磺酰基交联内的
碳上。通过加入十体 积的无菌无热原的盐溶液以降低pH低于12来终止该反应。生理盐水 洗涤也引起hylan凝胶肿胀至其饱和水合(equilibrium hydration)。用生 理盐水洗涤hylan凝胶以除去未反应的二乙烯砜、未反应的氚及其它 反应产物,并使pH降至7。通过过滤从凝胶中分离过量的生理盐水, 之后,使凝胶穿过25g针5次,使固体凝胶分裂成易于可注射的形式。 在这种形式中,用无菌无热原的生理盐水彻底地渗析氚化的凝胶以除 去任意非共价结合的氚。
D.hylan凝胶-hylan液体混合物的制备
将氚化的hylan凝胶(3.04g)直接加入到11.63g的14C-hylan液体 中,将混合物置于Glen
粉碎混合机中48小时。然后,使混合物连续 穿过18g、21g和25g针10次,以确保均匀性和易于注射。
E.HA浓度和放射性标记量的测定
混合物的凝胶和液体组分中hylan多糖的浓度为通过用于试验其 重复葡糖醛酸
单体(3)的自动化卡唑法来测定,并乘以(2.07)以计算多糖 链的其余部分的浓度。在葡糖醛酸测定之前,通过在紧密密封的顶部 有罗纹的管中(tightly capped screw top tubes)将称重的0.1g凝胶 样品加入到0.2ml 1N H2SO4中
水解hylan凝胶,在100℃进行酸性 水解2小时。在通过用卡唑法分析HA之前,用0.2ml的1N NaOH 中和在该过程中完全地溶解的样品。
卡唑法包括测定样品中己糖醛酸(葡糖醛酸)的含量。Dische等人 (1947),在J.Biol.Chem.,167:189-198中报道了通过比色法测定己糖 醛酸浓度的方法。该方法是基于用
硫酸和卡唑对己糖醛酸进行显色反 应。Balazs等人在(1965)Anal.Biochem.,12:547-558中报道了用于 测定己糖醛酸的最新的自动化方法。在硫酸/
硼酸酯介质中加热样品, 并与卡唑反应。卡唑与己糖醛酸反应形成具有在530nm有最大吸光率 的粉红色复合物。对于自动化方法,通过使用
蠕动泵抽吸样品和标准 品穿过连续流量分析器。将
试剂(酸和卡唑)加入反应室并加热,通过连 续流量比色计在530nm读取吸光率。
试验产品的放射性含量可在ISOCAP 300液体闪烁计数器 (Nuclear Chicago)中使用Scintiverse Bio HP(Fisher Scientific)作为闪 烁剂通过闪烁计数来测定。使用ISOCAP 300的外标比例程序将原始 CPM数据转
化成DPM,所述程序相对于氚液体闪烁淬灭标准(Tritium Liquid Scintillation Quench Standards)或碳-14液体闪烁淬灭标准 (Carbon-14 Liquid Scintillation Quench Standards)(Amergham, Arlington Heights,II)进行标准化。
F.Synvisc存留半衰期的测定
在称重为2.5至3.5kg的新西兰白兔中测定来自膝关节的 Synvisc和其凝胶和液体组分的清除。将兔子分别在24小时、3、7 和28天处死。给药基本上如上所述制备的放射性物质,如关节内注射 0.3ml(0.086ml/kg体重)。该剂量水平预期相当于单次6ml给药 Synvisc至70kg的人。同样地,在其它动物中给药的相应量与动物 的重量成正比。
DPMs为如上述的每个组织中获得的,当适宜时,直接计算DPM /mg。分别对每种动物计算每个关节组织回收的总DPMs以及和DPMs 和DPM/mg。然后,在每个时间点,平均这些值,表示为平均值±平 均标准误差。计算的平均数以至少二位有效数字来报道,即使在其中 值很小并且动物与动物差别很大的情况下。通过均分独立的动物总数 计算在每个时间点关节恢复的总的平均DPM。
通过将每次的平均数拟合成指数函数(Y=Aekx)进行半衰期的确 定。估计的标准误差是从曲线拟合获得的,除以A以获得预期的误差 百分数。其可乘以半衰期获得半衰期的预计误差。
G.结果
Synvisc的凝胶组分(hylan B)为具有较长半衰期的部分。根据放 射性物质的清除率,测定凝胶组分的存留半衰期为7.7-8.8天。这样, 在30天,超过95%的凝胶将被清除。根据实验测定的凝胶的半衰期, 进行理论计算以估计预期在单次6ml注射后人类关节中的凝胶含量。 假设将约6mg的凝胶注入人类患者的膝中,在注射后第21天,剩余 凝胶的含量将为约0.9mg。
Synvisc的液体组分(hylan A)比凝胶组分清除的更快。液体组分 的半衰期确定为1.2-1.5天。在第7天,99%注射的物质从兔子的膝关 节中清除。
也进行兔子肌肉
植入物研究。在植入后第7和30天的
显微镜检查 没有检测出任意剩余试验材料,其与关节内清除率的研究一致。
根据在
说明书内引用的参考的教导,说明书可被最彻底地理解。 在说明书内的实施方案提供了本发明实施方案的说明,其将不会被解 释为限制本发明的范围。本领域技术人员易于认识到许多其它的实施 方案包括在本发明内。在该公开的内容中引用的所有出版物和专利以 其全部引入作为参考。至此,通过参考被人本申请的材料与本说明书 矛盾或不一致时,以本说明书内容为准。在本文中任意参考的引证都 是允许的,这样的参考都是本发明的
现有技术。
除非另有说明,在包括
权利要求的说明中使用的所有的表示成分 量、细胞培养和处理条件等的数字应当理解为在所有条件下可通过术 语“约”来
修改。因此,除非另有相反说明,数字参数为近似值,可 根据寻求通过本发明获得想要的性质进行改变。除非另有说明,在一 组成分前的术语“至少”应当理解为指组中的每个成分。本领域技术 人员将认识到或能仅仅使用常规实验来确定,许多本文中描述的本发 明特定实施方案的同等方案。这样的同等方案指下述权利要求书包括 的。