抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA及其编码序列与应用
专利汇可以提供抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA及其编码序列与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA及其编码序列与应用，其目的是提供抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA及其编码序列与其在基因功能研究及制备 肿瘤 治疗 性药物和抗癌药物筛选中的应用。该小干扰RNA，是下述双链RNA序列之一：1)正义链为 序列表 中的SEQ ID №：1，反义链为序列表中的SEQ ID №：2的双链RNA序列；2)正义链为序列表中的SEQ ID №：3，反义链为序列表中的SEQ ID №：4的双链RNA序列。本发明可用于SMAD4及TGF-β 信号 通路的功能研究，以及胰腺癌等 恶性肿瘤 的发生、发展机理研究，并将在抗肿瘤药物的制备及抗癌药物的筛选中具有较大的实际用途。，下面是抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA及其编码序列与应用专利的具体信息内容。
1、抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA，是下述双链RNA序列之一：
1)正义链为序列表中的SEQ ID №：1，反义链为序列表中的SEQ ID №：2的双 链RNA序列；
2)正义链为序列表中的SEQ ID №：3，反义链为序列表中的SEQ ID №：4的双 链RNA序列。
2、权利要求1所述的抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA的编码序列。
3、根据权利要求2所述的编码序列，其特征在于：所述抑制SMAD4基因表达的 小干扰RNA的编码序列是下述双链核苷酸序列之一：
1)正义链为SEQ ID №：5所示的核苷酸序列；反义链为SEQ ID №：6所示的 核苷酸序列；
2)正义链为SEQ ID №：7所示的核苷酸序列；反义链为SEQ ID №：8所示的 核苷酸序列。
4、权利要求1所述的抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA在制备肿瘤治疗性药物 及抗癌药物筛选中的应用。
5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为胰腺肿瘤。
技术领域
本发明涉及小干扰RNA及其编码序列与应用，特别是涉及抑制SMAD4基因表达的 小干扰RNA及其编码序列在基因功能研究与其在制备肿瘤治疗性药物及抗癌药物筛选 中的应用。
背景技术
RNA干扰技术(RNA interference，简称RNAi)是通过小分子双链RNA(ds RNA) 特异性互补靶向基因转录本，从而诱导转录后基因沉默的一种方式。将双链RNA降解 成长度为21-23nt的小干扰RNA片段(siRNA，small interfering RNA)，这些小片 段会进一步介导与其同源的单链RNA降解，其结构稳定，无须像反义核苷酸那样进行 广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶 基因降低至极低水平甚至完全“敲除”，从而产生缺失突变表型。siRNA的干预效应 关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高 度序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因静寂具有重要的药理作 用。已证实，RNA干扰技术可单独或与其它现有的治疗手段一同用于突变所致的疾病， 如病毒感染，还可以用于治疗肿瘤。
发明内容
本发明所提供的抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA，是下述双链RNA序列之一：
1)正义链为序列表中的SEQID №：1，反义链为序列表中的SEQ ID №：2的双 链RNA序列；
2)正义链为序列表中的SEQ ID №：3，反义链为序列表中的SEQ ID №：4的双 链RNA序列。
将上述双链RNA序列分别命名为SMAD4 siRNA-1和SMAD4 siRNA-2。其中，SMAD4 siRNA-1的反义链与SMAD4 mRNA的385-405位置序列互补，序列表中SEQ ID №：1 由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №：2由 21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；SMAD4 siRNA-2的反义链与 SMAD4 mRNA的558-578位置序列互补，序列表中SEQ ID №：3由21个碱基组成， 序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №：4由21个碱基组成，序 列的方向从左至右为5′端→3′端。
编码上述抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA的DNA序列也属于本发明的保护范围。 它具有下述双链核苷酸序列之一：
1)SMAD4 siRNA-1编码序列的正义链(不做模板的DNA链)具有序列表SEQ ID №： 5的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：5限定的DNA序列杂交的 核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中SEQ ID №：6的核苷酸序列 或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
2)SMAD4 siRNA-2编码序列的正义链具有序列表SEQ ID №：7的核苷酸序列或在 高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义 链具有序列表中SEQ ID №：8的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №： 8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件 下杂交并洗膜。
序列表中SEQ ID №：5由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端， 序列表中SEQ ID №：6由21个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端；序 列表中SEQ ID №：7由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列 表中SEQ ID №：8由21个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。
含有上述抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA编码序列的表达载体、转基因细胞系 和宿主菌以及扩增上述抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA编码序列中任一片段的引物 也属于本发明的保护范围。
本发明提供了抑制SMAD4基因表达的siRNA双链序列，实验证明所提供的siRNA 可以有效抑制SMAD4基因的表达。本发明可用于SMAD4及TGF-β信号通路的功能研 究，以及胰腺癌等恶性肿瘤的发生、发展机理的研究，并将在抗肿瘤药物的制备及抗 癌药物的筛选中具有较大的实际用途。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
说明书附图
图1为转染SMAD4 siRNA后细胞内SMAD4基因表达情况的Western Blot检测结 果
图2为MTT法检测瞬时表达SMAD4 siRNA对BEP2D细胞增殖影响的结果
图3为MTT法检测TGF-β1对瞬时表达SMAD4 siRNA的BEP2D细胞的生长抑制效 应的结果
具体实施方式
实施例1、抑制SMAD4基因表达的siRNA的设计及合成。
根据人SMAD4基因(GenBank号为：BT009739.1)的mRNA序列，借助Ambion公 司在网上提供的siRNA工具软件设计其siRNA序列，得到两条双链RNA序列，分别命 名为SMAD4 siRNA-1、SMAD4 siRNA-2，序列如下： SMAD4 siRNA-1：
正义链：5’-aauccauaucacuacguucga-3’(序列表中SEQ ID №：1)
反义链：5’-ucgaacguagugauauggauu-3’(序列表中SEQ ID №：2)；
SMAD4 siRNA-2：
正义链：5’-aaguaaucgugcaucgacaga-3’(序列表中SEQ ID №：3)
反义链：5’-ucugucgaugcacgauuacuu-3’(序列表中SEQ ID №：4)。
实施例2、检测SMAD4 siRNA-1、SMAD4 siRNA-2对SMAD4基因的抑制作用及对 TGF-β1刺激的反应性变化。
用美国Invitrogen公司的LipofectamineTM 2000试剂盒并参照试剂盒操作指南 将化学合成的SMAD4 siRNA-1和SMAD4 siRNA-2分别转染永生化人支气管上皮细胞 BEP2D细胞中，用下述方法检测转染细胞中SMAD4基因的表达情况：
一、Western blot检测
提取上述转染细胞的总蛋白，以转染GFP siRNA的BEP2D细胞为阴性对照，用 Western blot法检测转染细胞中SMAD4基因的表达情况，所用抗体为鼠抗SMAD4单克 隆抗体，购自Santa Cruz公司，并以同一张膜上重复杂交鼠抗ACTIN单克隆抗体(购 自Santa Cruz公司)作为对照，检测结果如图1所示(泳道1为转染GFP siRNA的阴 性对照组，泳道2为SMAD4 siRNA-1转染组，泳道3为SMAD4 siRNA-2转染组)，同 对照相比，转染SMAD4 siRNA-1和SMAD4 siRNA-2的细胞内SMAD4蛋白的表达水平均 降低至检测水平以下，表明SMAD4 siRNA-1和SMAD4 siRNA-2可有效抑制SMAD4基因 的表达。
二、MTT检测SMAD4沉默后细胞生长增殖能力变化及对TGF-β1刺激的反应性变 化情况
用MTT检测步骤获得SMAD4沉默细胞的生长增殖能力变化及对TGF-β1刺激的反 应性变化情况，具体方法为：将指数生长期的BEP2D细胞分别按每孔5×104接种于96 孔板中，细胞分6组：对照组(转染GFP siRNA)、转染Smad4 siRNA-1组、转染Smad4 siRNA-2组、2ng/mL TGF-β1作用的对照组、2ng/mL TGF-β1作用的Smad4 siRNA-1 转染组及2ng/mL TGF-β1作用的Smad4 siRNA-2转染组。接种的细胞在18-24h后用 脂质体转染法分别转染GFPsiRNA，Smad4 siRNA-1和Smad4 siRNA-2(转染试剂 Lipofectamine 2000，Invitrogen)，转染后24h在后3组加入2ng/mL 的TGF-β1，作用48h后换液加入MTT进行检测，瞬时表达SMAD4 siRNA对BEP2D细 胞增殖影响的检测结果如图2所示，表明SMAD4基因沉默后，细胞增殖能力增强。 TGF-β1对瞬时表达SMAD4 siRNA的BEP2D细胞的生长抑制效应的检测结果如图3所 示，表明SMAD4基因沉默细胞可以拮抗TGF-β1对细胞的生长抑制效应。
序列表
<160>8
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
aauccauauc acuacguucg a 21
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
ucguuc guagu gauauggau u 21
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
aaguaaucgu gcaucgacag a 21
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
ucugucgaugc acgauuacu u 21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
aatccatatc actacgaacg a 21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
ttaggtatag tgatgcttgc t 21
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
aagtaatcgt gcatcgacag a 21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
ttcattagca cgtagctgtc t 21
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