技术领域
[0001] 本
发明涉及成纤维细胞生长因子抑制多肽及其应用，具体涉及具有抑制成纤维细胞生长因子，
治疗恶性肿瘤的多肽。
背景技术
[0002] 血管生成是恶性实体肿瘤突破上皮基底膜后进一步生长所必须的。肿瘤中新形成的血管具有其自身独特的结构特点，表现为管壁不完整，无平滑肌成分，仅由有孔的内皮细胞和片状的基膜构成。多数学者认为，新生血管的结构特点使恶性肿瘤组织发生远处转移成为可能。因此，恶性实体肿瘤中新生血管的定量被认为是一种重要的独立的
预后标志。
[0003] 成纤维细胞生长因子，对肿瘤细胞有明显的趋向活性，刺激成纤维细胞，血管内皮细胞等向病灶部位移动。当细胞迁移至病灶部位时，开始进入增殖和修复期，其中最关键的步骤之一是肉芽组织的形成，肉芽组织的本质是大量的毛细血管和丰富的成纤维细胞，是成纤维细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的高效促生长剂，能够强烈促进新生毛细血管的形成，显著增加肉芽组织毛细血管数量和血液流量，为肿瘤组织提供所需要的
氧及丰富的营养物质，促进肿瘤的生长。抑制成纤维细胞生长因子，可以有效抑制肿瘤组织中血管的新生，断绝肿瘤组织生长需要的氧及营养物质，将肿瘤细胞“饿死”。从而，达到治疗肿瘤的效果。
[0004] 目前，没有成熟开发的成纤维细胞生长因子抑制多肽问世，用于治疗恶性肿瘤。
[0005] 本
专利中的成纤维细胞生长因子抑制多肽已证明在结肠癌病中有效，具有在其他肿瘤模型中开发的前景。
发明内容
[0006] 发明目的
[0007] 本发明提供全新的序列，该序列为成纤维细胞生长因子拮抗剂，对恶性肿瘤具有很好的疗效。
[0008] 技术方案
[0009] 成纤维细胞生长因子抑制多肽，其特征在于其序列为PSHNPEEQLSWGDSGEDSEPLP。
[0010] 所述的成纤维细胞生长因子抑制多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0011] 所述的成纤维细胞生长因子抑制多肽在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0012] 一种检测肿瘤的
试剂盒，其含有
权利要求1所述的成纤维细胞生长因子抑制多肽。
[0013] 所述的试剂盒，其特征在于还有
[0014] (1)包被液：pH9.6的0.05mol/L
碳酸盐缓冲液；
[0015] (2)PBS缓冲液：pH7.4的0.02mol/L
磷酸盐缓冲液；
[0016] (3)
抗体稀释液：pH7.4的0.02mol/LPBS和0.2％BSA；
[0017] (4)封闭液：pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液和2.0％BSA
[0018] (5)洗涤液：0.02mol/LPBS(pH7.4)和0.05％Tween-20；
[0019] (6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液；
[0020] (7)终止液：2mol/L
硫酸溶液；
[0021] (8)成纤维细胞生长因子抗体；
[0022] (9)山羊抗小鼠IgG。
[0023] 有益效果
[0024] 利用固相合成法化学合成成纤维细胞生长因子抑制多肽，该多肽具有全新的序列，该多肽可体外抑制成纤维细胞生长因子，治疗恶性肿瘤，如结肠癌。我们发现的成纤维细胞生长因子抑制多肽可以同时抑制结肠癌
细胞增殖活
力，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。
具体实施方式
[0025] 成纤维细胞生长因子抑制多肽由上海生工合成。
[0027] 成纤维细胞生长因子抑制多肽对体外培养人结肠癌细胞的生长和存活IC50。
[0028] 采用MTT比色法。将对数生长的人结肠癌细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物成纤维细胞生长因子抑制多肽(上海生工合成)和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的
溶剂。每孔设五个复孔，培养48h，分别在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式人结肠癌细胞生长抑制率＝(1-实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。计算出实验药物的IC50为14.45μM，阳性对照药的IC50为4.2μM。
[0029] 实施例2
[0030] 成纤维细胞生长因子抑制多肽对体外培养人肝癌细胞的生长和存活IC50。
[0031] 采用MTT比色法。将对数生长的人肝癌HepG2细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物成纤维细胞生长因子抑制多肽和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h，分别在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育
30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式人HepG2细胞生长抑制率＝(1-实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。计算出实验药物的IC50为24.75μM，阳性对照药的IC50为4.9μM。
[0032] 实施例3
[0033] 用肿瘤模型检测成纤维细胞生长因子抑制多肽的体内活力。
[0034] 建立结肠癌肿瘤模型，阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽(上海生工合成)设3个剂量：1、2、4mg/Kg。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，成纤维细胞生长因子抑制多肽可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，0.75、1.5、3mg/Kg生存率达到92.12％，82.23％，72.4％，对应的紫杉醇42.2％。
[0035] 实施例4含有成纤维细胞生长因子抑制多肽的ELISA试剂盒检测：
[0036] 酶连
免疫吸附实验(ELISA)试剂盒包括如下试剂：
[0037] (1)包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)。称取0.75g碳酸钠，1.46g
碳酸氢钠，加去离子
水定容至500ml；
[0038] (2)PBS缓冲液：0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)。称取0.2g磷酸二氢
钾，2.90g磷酸氢二钠，8g
氯化钠，加去离子水定容到1000ml；
[0039] (3)抗体稀释液：0.02mol/LPBS(pH7.4)和0.2％BSA。称取0.2gBSA加入配好的0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100ml；
[0040] (4)封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)和2.0％BSA。2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml；
[0041] (5)洗涤液：0.02mol/LPBS(pH7.4)和0.05％Tween-20。将50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，震荡混匀；
[0042] (6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液；
[0043] (7)终止液：2mol/L硫
酸溶液。10ml98％浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml，室温保存；
[0044] (8)成纤维细胞生长因子抑制多肽
[0045] (9)成纤维细胞生长因子抗体购自上海一研
生物科技有限公司
[0046] (10)二抗(山羊抗小鼠IgG)购自
艾美捷科技有限公司
[0047] 使用方法：1、血清样本制备：取3只荷瘤裸鼠，进行眼眶取血，每只200μL，迅速离心12000rpm 3min，取上清，按体积比1：2加PBS，80℃水浴30min，12000rpm 3min取上清，-20℃冻存备用。2、成纤维细胞生长因子抗体为包被抗体，将成纤维细胞生长因子抗体溶于包被稀释液中，浓度为100μg/mL。96孔酶标板每孔加入100μL，4℃包被过夜。弃去包被液，加入封闭液200μL，37℃封闭1h。弃去封闭液，分别加入样品稀释液稀释的血清样本100μL(稀释比1：50)和成纤维细胞生长因子抑制多肽100μL(10μg/ml)及上述血清样本50μL和成纤维细胞生长因子抑制多肽50μL的混合物，分成3组，37℃孵育1h。弃去血清，PBST和
自来水间隔洗涤三次。洗涤后，每孔加入样品稀释液稀释酶标二抗100μL(稀释比1：10000)，37℃孵育1h。弃去二抗，洗涤。洗涤后，每孔加入100μL底物液(50μL底物A，50μL底物B)，37℃反应30min后，加入50μL 2M H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm
波长测定每孔的光
密度值OD450nm。
[0048] 结果：成纤维细胞生长因子抑制多肽可以和成纤维细胞生长因子抗体结合，并可以竞争血清中成纤维细胞生长因子，故说明成纤维细胞生长因子抑制多肽用竞争法检测成纤维细胞生长因子，实现肿瘤预测；
[0049]
