一种复合植物肽粉及其制备方法和用途
阅读：0发布：2021-03-23
专利汇可以提供一种复合植物肽粉及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提出了一种谷 氨 酰胺活性肽组合物，包括如下任意一种或多种的三肽：Asn-Gln-Thr、Asn-Gln-Gly、Ger-Gln-Leu、Gla-Gln-Asn、Gly-Gln-Ger。一种复合 植物 肽粉，包括以下重量份的组分：谷氨酰胺活性肽组合物10-20份、玉米低聚肽30-50份、 胶原蛋白 12-17份、 牛 磺酸5-10份和 食品添加剂 0.1-1份。本发明制备的谷氨酰胺活性肽组合物，具有高效补充营养、改善病人Gln的代谢、促进蛋白合成的效果，与玉米低聚肽、胶原蛋白等复配，能够显著改善 恶性 肿瘤 患者 放化疗 期间的营养状态，具有双通道、转运快、耗能低、不易饱和、吸收快的特点，值得在临床推广应用。，下面是一种复合植物肽粉及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.一种谷氨酰胺活性肽组合物，其特征在于，包括如下任意一种或多种的三肽：Asn-Gln-Thr、Asn-Gln-Gly、Ger-Gln-Leu、Gla-Gln-Asn、Gly-Gln-Ger。
2.一种权利要求1所述的谷氨酰胺活性肽组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.清洗:将玉米黄粉用去离子水清洗后，使用胶体磨将玉米黄粉打成浆状；
S2.酶解:将玉米黄粉浆装入反应釜中，加入Na2CO3将pH值调至8.0，温度调至38℃，加入胰蛋白酶和碱性蛋白酶，搅拌酶解；
S3.固液采用反向高效液相色谱法分离，凝胶渗透色谱提纯:将酶解产物过滤，收集滤液，将滤液进行离心，收集上清液；
S4.喷雾干燥:将上清液进行-40℃冷冻干燥过夜，采用反向高效液相色谱法分离，凝胶渗透色谱提纯，得到谷氨酰胺活性肽组合物。
3.根据权利要求2所述谷氨酰胺活性肽组合物的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的活力为250U/mg，所述碱性蛋白酶的活力为100U/mg，所述玉米黄粉、胰蛋白酶、碱性蛋白酶的质量比为100:(1-3)：(2-10)。
4.根据权利要求2所述谷氨酰胺活性肽组合物的制备方法，其特征在于，所述搅拌速率控制在200-500r/min，酶解时间为2-3h，所述离心速率为10000-15000r/min，所述离心时间为5-10min。
5.一种如权利要求1所述谷氨酰胺活性肽组合物在制备对恶性肿瘤患者放化疗期间免疫功能改善的药物或保健品中的用途。
6.一种复合植物肽粉，其特征在于，包括以下重量份的组分：权利要求1所述的谷氨酰胺活性肽组合物10-20份、玉米低聚肽30-50份、胶原蛋白12-17份、牛磺酸5-10份和食品添加剂0.1-1份。
7.根据权利要求6所述一种复合植物肽粉，其特征在于，所述食品添加剂包括甜味剂、食用香精和抗氧剂。
8.根据权利要求7所述一种复合植物肽粉，其特征在于，所述抗氧剂选自维生素C、维生素E、茶多酚、儿茶酚或白藜芦醇中的一种或几种混合。
9.一种如权利要求6-8任一项权利要求所述复合植物肽粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按配比称取谷氨酰胺活性肽组合物、玉米低聚肽、胶原蛋白、牛磺酸和食品添加剂，混合均匀，制得复合植物肽粉。
10.一种如权利要求5-7任一项权利要求所述复合植物肽粉在制备对恶性肿瘤患者放化疗期间免疫功能改善的药物或保健品中的用途。
一种复合植物肽粉及其制备方法和用途
技术领域
背景技术
[0002] 恶性肿瘤放化疗期间的消化道反应一直是临床探讨的课题。剧烈的消化道反应会导致患者营养吸收减少，而放化疗过程中又需要充足的营养补充以应对治疗过程中带来的消耗，因此如何对放化疗期间的患者进行营养支持就成为与降低药物副作用同样重要的课题。
[0003] 肿瘤病人发生营养不良及体重下降的原因是多方面的，主要原因包括：进食减少、代谢异常、急性炎性反应增加等。由于手术、化疗、放疗等抗肿瘤治疗均可以引起肿瘤病人的进食减少，肿瘤本身引起的消化道梗阻等也常是进食减少的原因之一。随着对肿瘤恶液质发病机理的不断认识，人们发现肿瘤病人的营养不良通过普通的营养支持手段及方法往往很难纠正，而必须强调营养支持的同时针对肿瘤病人的异常代谢进行调节。
[0004] 营养支持方法主要分为肠内及肠外营养支持两项技术。营养支持的使用原则是，当胃肠功能良好并且可以安全使用时，首选肠内营养支持途径，因为肠内营养符合生理、价格便宜、操作简便，并且比较适合于家庭内营养支持的开展。肠内营养的使用一般可通过口服、鼻饲、胃造口及空肠造口等多种途径。肿瘤病人的家庭内营养支持的实施及发展，近年来也受到了人们的重视。对于进一步地改善肿瘤病人的生活质量，降低治疗的费用，家庭内营养支持技术具有重要作用。
[0005] 令人鼓舞的是近年来的一些研究证明，使用免疫营养物质，不但不促进肿瘤细胞的生长，反而抑制了肿瘤细胞的生长，取得了一定的抗肿瘤治疗的效果。另外，此类营养物在发挥抗肿瘤治疗作用时，不会产生化疗药物通常会引起的严重毒副作用，这也是激发人们越来越多地关注营养支持在肿瘤治疗中的应用的重要原因之一。
发明内容
[0006] 本发明提供一种复合植物肽粉及其制备方法和用途，其目的在于，提供一种复合植物肽粉，通过本发明制备的谷氨酰胺活性肽组合物，来源于玉米，具有高效补充营养、改善病人Gln的代谢、促进蛋白合成的效果，且制备方法简单，活性成分多且成本较低等特点，与玉米低聚肽、胶原蛋白等复配，能够显著改善恶性肿瘤患者放化疗期间的营养状态，具有双通道、转运快、耗能低、不易饱和、吸收快的特点，值得在临床推广应用。
[0007] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0008] 本发明提供一种谷氨酰胺活性肽组合物，包括如下任意一种或多种的三肽：Asn-Gln-Thr、Asn-Gln-Gly、Ger-Gln-Leu、Gla-Gln-Asn、Gly-Gln-Ger。本发明中所述氨基酸序列：C末端-Asn-Gln-Thr-N末端、C末端-Asn-Gln-Gly-N末端、C末端-Ger-Gln-Leu-N末端、C末端-Gla-Gln-Asn-N末端、C末端-Gly-Gln-Ger-N末端。
[0009] 本发明进一步保护一种谷氨酰胺活性肽组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0010] S1.清洗:将玉米黄粉用去离子水清洗后，使用胶体磨将玉米黄粉打成浆状；
[0012] S3.固液采用反向高效液相色谱法分离，凝胶渗透色谱提纯:将酶解产物过滤，收集滤液，将滤液进行离心，收集上清液；
[0014] 作为本发明进一步的改进，所述胰蛋白酶的活力为250U/mg，所述碱性蛋白酶的活力为100U/mg，所述玉米黄粉、胰蛋白酶、碱性蛋白酶的质量比为100:(1-3)：(2-10)。
[0015] 作为本发明进一步的改进，所述搅拌速率控制在200-500r/min，酶解时间为2-3h，所述离心速率为10000-15000r/min，所述离心时间为5-10min。
[0016] 本发明进一步保护一种上述谷氨酰胺活性肽组合物在制备对恶性肿瘤患者放化疗期间免疫功能改善的药物或保健品中的用途。
[0019] 作为本发明进一步的改进，所述抗氧剂选自维生素C、维生素E、茶多酚、儿茶酚或白藜芦醇中的一种或几种混合。
[0020] 本发明进一步保护一种上述复合植物肽粉的制备方法，包括以下步骤：按配比称取谷氨酰胺活性肽组合物、玉米低聚肽、胶原蛋白、牛磺酸和食品添加剂，混合均匀，制得复合植物肽粉。
[0021] 本发明进一步保护一种上述复合植物肽粉在制备对恶性肿瘤患者放化疗期间免疫功能改善的药物或保健品中的用途。
[0022] 本发明具有如下有益效果：手术、创伤、严重感染等应激状态下会导致患者营养不良，提高Gln在血液中的浓度，可促进蛋白质的合成、降低其分解，改善患者营养状况。研究表明，在人类肿瘤(如三阴性乳腺癌、肺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤等)中，Gln的代谢途径处于异常激活状态，其机体需要量大大超过了机体自身合成Gln的能力。本发明制备的谷氨酰胺活性肽组合物，来源于玉米，具有高效补充营养、改善病人Gln的代谢、促进蛋白合成的效果，且制备方法简单，活性成分多且成本较低等特点，与玉米低聚肽、胶原蛋白等复配，能够显著改善恶性肿瘤患者放化疗期间的营养状态，具有双通道、转运快、耗能低、不易饱和、吸收快的特点，值得在临床推广应用。附图说明
[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024] 图1为本发明实施例1中谷氨酰胺活性肽组合物的液相色谱图。
具体实施方式
[0025] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026] 实施例1
[0027] 一种谷氨酰胺活性肽组合物，包括Asn-Gln-Thr、Asn-Gln-Gly、Ger-Gln-Leu、Gla-Gln-Asn、Gly-Gln-Ger。
[0028] 制备方法，包括以下步骤：
[0029] S1.清洗:将玉米黄粉用去离子水清洗后，使用胶体磨将玉米黄粉打成浆状；
[0030] S2.酶解:将100g玉米黄粉浆装入反应釜中，加入Na2CO3将pH值调至8.0，温度调至38℃，加入1g胰蛋白酶(活力为250U/mg)和2g碱性蛋白酶(活力为100U/mg)，搅拌酶解，搅拌速率控制在200r/min，酶解时间为2h；
[0031] S3.固液采用反向高效液相色谱法分离，凝胶渗透色谱提纯:将酶解产物过滤，收集滤液，将滤液进行离心，离心速率为10000r/min，离心时间为5min，收集上清液；
[0032] S4.喷雾干燥:将上清液进行-40℃冷冻干燥过夜，采用反向高效液相色谱法分离，凝胶渗透色谱提纯，选取得到五种三肽组成的谷氨酰胺活性肽组合物。经过氨基酸测序，所述谷氨酰胺活性肽组合物包括Asn-Gln-Thr、Asn-Gln-Gly、Ger-Gln-Leu、Gla-Gln-Asn、Gly-Gln-Ger。
[0033] 其液相色谱图(洗脱液：乙腈：水(v:v)＝7:1)如图1所示，从图谱中可知，其中Asn-Gln-Thr的出峰位置12min左右、Asn-Gln-Gly的出峰位置15min左右、Ger-Gln-Leu的出峰位置17min左右、Gla-Gln-Asn的出峰位置21min左右、Gly-Gln-Ger的出峰位置28min左右。
[0034] 组合物中，Asn-Gln-Thr、Asn-Gln-Gly、Ger-Gln-Leu、Ger-Gln-Leu和Ger-Gln-Leu的质量比为10：18：10：12：9。
[0035] 实施例2
[0036] 一种谷氨酰胺活性肽组合物，包括如下两种多肽：Asn-Gln-Thr、Asn-Gln-Gly。
[0037] 制备方法，包括以下步骤：
[0038] S1.清洗:将玉米黄粉用去离子水清洗后，使用胶体磨将玉米黄粉打成浆状；
[0039] S2.酶解:将100g玉米黄粉浆装入反应釜中，加入Na2CO3将pH值调至8.0，温度调至38℃，加入3g胰蛋白酶(活力为250U/mg)和10g碱性蛋白酶(活力为100U/mg)，搅拌酶解，搅拌速率控制在500r/min，酶解时间为3h；
[0040] S3.固液采用反向高效液相色谱法分离，凝胶渗透色谱提纯:将酶解产物过滤，收集滤液，将滤液进行离心，离心速率为10000-15000r/min，离心时间为5-10min，收集上清液；
[0041] S4.喷雾干燥:将上清液进行-40℃冷冻干燥过夜，采用反向高效液相色谱法分离，凝胶渗透色谱提纯，分别得到实施例1和图1中的五种三肽，选取其中两种混合得到谷氨酰胺活性肽组合物：Asn-Gln-Thr、Asn-Gln-Gly(质量比：2:1)。
[0042] 实施例3
[0043] 一种谷氨酰胺活性肽，具有如下三肽：Ger-Gln-Leu。
[0044] 制备方法，包括以下步骤：
[0045] S1.清洗:将玉米黄粉用去离子水清洗后，使用胶体磨将玉米黄粉打成浆状；
[0046] S2.酶解:将100g玉米黄粉浆装入反应釜中，加入Na2CO3将pH值调至8.0，温度调至38℃，加入2g胰蛋白酶(活力为250U/mg)和5g碱性蛋白酶(活力为100U/mg)，搅拌酶解，搅拌速率控制在340r/min，酶解时间为2.5h；
[0047] S3.固液采用反向高效液相色谱法分离，凝胶渗透色谱提纯:将酶解产物过滤，收集滤液，将滤液进行离心，离心速率为12500r/min，离心时间为7min，收集上清液；
[0048] S4.喷雾干燥:将上清液进行-40℃冷冻干燥过夜，采用反向高效液相色谱法分离，凝胶渗透色谱提纯，从得到的几种多肽中选取得到谷氨酰胺活性肽Ger-Gln-Leu。
[0049] 实施例4
[0050] 原料组成(重量份)：实施例1制备的谷氨酰胺活性肽组合物10份、玉米低聚肽30份、胶原蛋白12份、牛磺酸5份和食品添加剂1份。
[0051] 所述食品添加剂包括(重量份)：甜味剂甜菊糖苷10份、食用香精草莓粉2份和抗氧剂3份。所述抗氧剂为维生素C和茶多酚按1:1混合。
[0052] 制备方法：
[0053] 包括以下步骤：按配比称取谷氨酰胺活性肽组合物、玉米低聚肽、胶原蛋白、牛磺酸和食品添加剂，混合均匀，制得复合植物肽粉。
[0054] 实施例5
[0055] 原料组成(重量份)：实施例1制备的谷氨酰胺活性肽组合物20份、玉米低聚肽50份、胶原蛋白17份、牛磺酸10份和食品添加剂5份。
[0056] 所述食品添加剂包括(重量份)：甜味剂三氯蔗糖10份、食用香精草莓粉2份和抗氧剂3份。所述抗氧剂为白藜芦醇。
[0057] 制备方法：
[0058] 包括以下步骤：按配比称取谷氨酰胺活性肽组合物、玉米低聚肽、胶原蛋白、牛磺酸和食品添加剂，混合均匀，制得复合植物肽粉。
[0059] 对比例1
[0060] 原料组成(重量份)：实施例1制备的谷氨酰胺活性肽组合物70份、胶原蛋白17份、牛磺酸10份和食品添加剂5份。
[0061] 所述食品添加剂包括(重量份)：甜味剂三氯蔗糖10份、食用香精草莓粉2份和抗氧剂3份。所述抗氧剂为白藜芦醇。
[0062] 制备方法：
[0063] 包括以下步骤：按配比称取谷氨酰胺活性肽组合物、胶原蛋白、牛磺酸和食品添加剂，混合均匀，制得复合植物肽粉。
[0064] 对比例2
[0065] 原料组成(重量份)：玉米低聚肽70份、胶原蛋白17份、牛磺酸10份和食品添加剂5份。
[0066] 所述食品添加剂(重量份)：包括甜味剂三氯蔗糖10份、食用香精草莓粉2份和抗氧剂3份。所述抗氧剂为白藜芦醇。
[0067] 制备方法：
[0068] 包括以下步骤：按配比称取玉米低聚肽、胶原蛋白、牛磺酸和食品添加剂，混合均匀，制得复合植物肽粉。
[0069] 测试例1
[0070] (1)移植性肝癌小鼠模型的制备
[0071] SPF级健康昆明小鼠60只，雌雄各半，6周龄，重l8g-20g。取体外培养的对数生长期H22(S型)肝癌细胞，调整瘤细胞浓度为1×107/mL。在无菌条件下，将瘤细胞接种于小鼠右腋部皮下，接种量为0.2mL/只(细胞数为2×106/只)。整个接种过程须在无菌罩内以无菌操3
作进行，1h内完成接种。待皮下移植瘤体积达60mm左右时(约lOd)，模型制造成功。
作进行，1h内完成接种。待皮下移植瘤体积达60mm左右时(约lOd)，模型制造成功。
[0072] (2)分组与给药
[0073] 试验1组受试物：称取本发明实施例1制备的谷氨酰胺活性肽组合物。
[0074] 试验2组受试物：称取本发明实施例5制备的复合植物肽粉。
[0075] 试验3组受试物：称取本发明对比例1制备的复合植物肽粉。
[0076] 试验4组受试物：称取本发明对比例2制备的复合植物肽粉。
[0077] 按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则分为如下6组，每组12只：
[0078] 模型对照组：灌胃等量的生理盐水1次/日，共给药40日；
[0079] 环磷酰胺组：尾静脉注射25mg/kg wt.环磷酰胺，隔日给药1次，共计10次；
[0080] 试验1组：尾静脉注射25mg/kg wt.环磷酰胺，隔日给药1次，共计10次；同时灌胃给予上述配制的受试物，剂量为5g/kg，1次/日，共给药40日；
[0081] 试验2组：尾静脉注射25mg/kg wt.环磷酰胺，隔日给药1次，共计10次；同时灌胃给予上述配制的受试物，剂量为5g/kg，1次/日，共给药40日；
[0082] 试验3组：尾静脉注射25mg/kg wt.环磷酰胺，隔日给药1次，共计10次；同时灌胃给予上述配制的受试物，剂量为5g/kg，1次/日，共给药40日；
[0083] 试验4组：尾静脉注射25mg/kg wt.环磷酰胺，隔日给药1次，共计10次；同时灌胃给予上述配制的受试物，剂量为5g/kg，1次/日，共给药40日；
[0084] 末次给药48h后脱臼处死小鼠，切除移植瘤，称取瘤重。瘤重抑制率(％)IR＝(1-给药组瘤重均值/模型对照组瘤重均值)×100％。通过瘤重的比较来体现药物对肝癌小鼠模型治疗作用。数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS15.0软件进行方差分析。
[0085] (3)结果与分析
[0086] 试验结果表明(参见表1)：与模型对照组相比，各治疗组对小鼠肝癌模型的治疗作用均具有极显著性差异(P＜0.01)，这说明环磷酰胺在治疗肝癌方面具有极其显著的疗效。
[0087] 试验1组(实施例1制备谷氨酰胺活性肽组合物)、试验2组(实施例5制备的复合植物肽粉)与模型对照组相比在抑瘤率方面具有显著性差异，且环磷酰胺组化疗组的小鼠死亡5只，这说明本发明谷氨酰胺活性肽组合物可以配合化疗药物达到显著的协同抗癌治疗效果，并且可以降低肿瘤小鼠的死亡率。
[0088] 试验2组(实施例5制备的复合植物肽粉)与试验3组(对比例1制备的复合植物肽粉)、试验4组(对比例2制备的复合植物肽粉)相比在抑瘤率方面具有显著性差异，且试验3组的小鼠死亡2只，试验4组小鼠死亡3只，这说明本发明实施例5制备复合植物肽粉中采用玉米低聚肽与谷氨酰胺活性肽组合物进行复配，其效果显著优于单独使用玉米低聚肽或者谷氨酰胺活性肽组合物的组别，具有协同增效的作用。由此可见，本发明的营养品在维持肿瘤小鼠氮平衡的同时，还可以达到非常显著的抑癌或抗癌治疗效果，获得了预料不到的技术效果。
[0089] 表1本发明对肝癌小鼠模型的治疗作用
[0090]组别 样本量(开始/结束) 瘤重(g) 平均抑瘤率(％)
**
试验1组 10/9 1.37±0.25 52.6
试验2组 10/10 0.95±0.29**## 67.1
试验3组 10/8 1.56±0.42** 46.0
试验4组 10/7 1.62±0.17## 43.9
对照组 10/10 2.89±0.12 /
环磷酰胺组 10/5 1.75±0.31** 39.4
**
试验1组 10/9 1.37±0.25 52.6
试验2组 10/10 0.95±0.29**## 67.1
试验3组 10/8 1.56±0.42** 46.0
试验4组 10/7 1.62±0.17## 43.9
对照组 10/10 2.89±0.12 /
环磷酰胺组 10/5 1.75±0.31** 39.4
[0091] 与模型对照组比较，**P＜0.01；与环磷酰胺组比较，##P＜0.01。
[0092] 测试例2
[0093] 1.动物分组及给药方法
[0094] BW小鼠的重量为18-20g，将BW小鼠分为A、B、C大组，每大组60只小鼠。每大组60只小鼠随机平均分为空白对照组、实施例1谷氨酰胺活性肽组合物组、实施例5复合植物肽粉组、对比例1复合植物肽粉组、对比例2复合植物肽粉组和灵芝孢子粉组。每只小鼠灌胃20mg/kg wt.,连续灌胃一周。A大组进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验，B大组测定迟发型变态反应DTH，C大组进行抗体生成细胞检测和血清溶血素测定。
[0095] 2、细胞免疫功能测定
[0096] ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
[0097] 小鼠末次灌胃1h后，将脾细胞悬浮于完全培养液中，调整细胞浓度为3×106个/mL。将细胞悬液分别加入24孔培养板的2孔中，每孔1mL，试验孔孔加75μL ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，超人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以
570nm波长测定光密度值。
570nm波长测定光密度值。
[0098] 3、迟发型变态反应实验
[0099] 每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm、用DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏。5天后，用DNFB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。
[0100] 4、体液免疫功能测定
[0101] 4.1免疫动物压积SRBC以生理盐水制成2％(v/v)的细胞悬液(约1×108个SRBC)，每只鼠腹腔注射0.2mL。
[0102] 4.2血清溶血素测定
[0103] 4.2.1血清收集
[0104] 小鼠用SRBC免疫5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。
[0105] 4.2.2凝集反应
[0106] 用生理盐水将血清100倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL，再加入100μL 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。
[0107] 4.2.3抗体生成细胞检测
[0108] 4.2.3.1脾细胞悬液制备将SRBC免疫5天后的小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾脏，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液，200目筛网6
过滤，1000rpm/min，10min，去上清，Hank's液洗2遍，以完全培养基RPMI 1640制备成5×10～1×107个细胞/mL的脾细胞悬液。
过滤，1000rpm/min，10min，去上清，Hank's液洗2遍，以完全培养基RPMI 1640制备成5×10～1×107个细胞/mL的脾细胞悬液。
[0109] 4.2.3.2空斑的测定
[0110] 底层培养基制备0.5g琼脂糖加入100mL灭菌生理盐水中，加热溶解，待温度于50℃左右时，以1mL/孔的量加至六孔培养板中，琼脂凝固后备用。
[0111] 顶层培养基制备0.5g琼脂糖加入100mL Hank's液中(PH7.2-7.4),加热溶解，以0.5mL/试管的量加至46-50℃恒温的试管中。
[0112] 铺板：50μL 20％SRBC(生理盐水配制，v/v)、200μL脾细胞悬液先后加入含有0.5mL顶层的试管中，迅速混匀，倒入六孔板中并铺平顶层混合液，每个样本做两个平行孔。
[0113] 空斑测定：已制备好培养板放入37℃、5％CO2培养箱中孵育1h，然后每孔加入500μL以完全培养基稀释的补体(v/v，1：10)，继续孵育2h，自动图象分析仪读取溶血空斑图象分析软件计数溶血空斑数。取平行孔空斑数的平均值为样本的溶血空斑数值，以空斑数/106脾细胞表示。
[0114] 5.实验结果
[0115] 5.1各组小鼠脾淋巴细胞转化能力比较
[0116] 由表2可得，谷氨酰胺活性肽组合物可提高ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化指数，本发明方法(实施例1)的谷氨酰胺活性肽组合物与空白对照组比较，小鼠淋巴细胞转化指数有显著提高(P＜0.01)，与灵芝孢子粉组相当，对比例1和对比例2在小鼠淋巴细胞转化指数比空白对照有显著提高，而实施例5制备的复合植物肽粉则显著高于实施例1制备的谷氨酰胺活性肽组合物、对比例1和对比例2，并显著高于灵芝孢子粉组(P＜0.05)在小鼠淋巴细胞转化指数上的效果。
[0117] 表2 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验结果(x±s)
[0118]组别 OD值
实施例1 0.121±0.007**
实施例5 0.135±0.012*
对比例1 0.098±0.012*
*
对比例2 0.095±0.010
空白对照组 0.075±0.005
灵芝孢子粉组 0.118±0.010**
实施例1 0.121±0.007**
实施例5 0.135±0.012*
对比例1 0.098±0.012*
*
对比例2 0.095±0.010
空白对照组 0.075±0.005
灵芝孢子粉组 0.118±0.010**
[0119] 与空白对照组比较：*p<0.05**p<0.01。
[0120] 5.2迟发性变态试验
[0121] 由表3可得出，实施例1提取的谷氨酰胺活性肽组合物灌胃的小鼠、实施例5制备的复合植物肽粉灌胃的小鼠左右耳肿胀度差均高于空白对照组(P＜0.01)，实施例5制备的复合植物肽粉明显优于对比例1、对比例2和灵芝孢子粉组，而对比例1、对比例2小鼠左右耳肿胀效果不如本发明组的效果明显。
[0122] 表3受试物迟发性变态反应实验DTH测定结果(x±s)
[0123]
[0124]
[0125] 与空白对照组比较：*p<0.05**p<0.01。
[0126] 5.3血清溶血素测定
[0127] 溶血素水平反映体液免疫能力，体液免疫是由B细胞介导的特异性免疫应答，通过抗体发挥效应，其目标主要是清除细胞外的病原菌及其产生的毒素等抗原异物。由表4得出，谷氨酰胺活性肽组合物可提高SRBC致敏小鼠的血清溶血素含量，本发明给药组(实施例5)效果较空白对照组均有明显差异(P＜0.01)，对比例1、对比例2和灵芝孢子粉组较空白组均具有差异性，但本发明给药组的效果最好，明显优于其他各组。
[0128] 表4受试物体液免疫功能实验血清血溶素实验结果(x±s)
[0129]组别 血清溶血素HC50
实施例1 165.72±17.56**
**
实施例5 173.23±10.28
对比例1 138.27±22.23*
对比例2 141.24±20.72*
空白对照组 120.87±15.37
灵芝孢子粉组 163.72±21.93**
实施例1 165.72±17.56**
**
实施例5 173.23±10.28
对比例1 138.27±22.23*
对比例2 141.24±20.72*
空白对照组 120.87±15.37
灵芝孢子粉组 163.72±21.93**
[0130] 与空白对照组比较：*p<0.05**p<0.01。
[0131] 5.4抗体生成细胞检测
[0132] 由表5得出，本发明方法实施例1提取的谷氨酰胺活性肽组合物、实施例5制备的复合植物肽粉与空白对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，对比例1和对比例2的抗体生成细胞检测结果较空白组有差异性(p＜0.05)，没有本发明组效果好，可见本发明制备的复合植物肽粉明显优于灵芝孢子粉、以及单独使用玉米低聚肽或谷氨酰胺活性肽组合物的组别。
[0133] 表5受试物体液免疫实验抗体生成细胞检测实验结果(x±s)
[0134]
[0135]
[0136] 与空白对照组比较：*p<0.05**p<0.01。
[0137] 与现有技术相比，手术、创伤、严重感染等应激状态下会导致患者营养不良，提高Gln在血液中的浓度，可促进蛋白质的合成、降低其分解，改善患者营养状况。研究表明，在人类肿瘤(如三阴性乳腺癌、肺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤等)中，Gln的代谢途径处于异常激活状态，其机体需要量大大超过了机体自身合成Gln的能力。本发明制备的谷氨酰胺活性肽组合物，来源于玉米，具有高效补充营养、改善病人Gln的代谢、促进蛋白合成的效果，且制备方法简单，活性成分多且成本较低等特点，与玉米低聚肽、胶原蛋白等复配，能够显著改善恶性肿瘤患者放化疗期间的营养状态，具有双通道、转运快、耗能低、不易饱和、吸收快的特点，值得在临床推广应用。
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