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抑制肿瘤血管生成的含VEGF深度阻断剂的癌症 治疗组合物及其制备方法

阅读：796发布：2020-05-15

专利汇可以提供抑制肿瘤血管生成的含VEGF深度阻断剂的癌症治疗组合物及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种用于抑制血管生成的癌症治疗组合物，及其制备方法。根据本发明的血管生成抑制剂是一种含融合蛋白的癌症治疗组合物，所述融合蛋白包含血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的血管内皮生长因子结合结构域和神经纤毛蛋白1(NRP1)的b1结构域。所述新型融合蛋白是用于阻断VEGF与细胞膜上其受体的结合的血管生成抑制剂，并具有抑制癌症细胞增殖以及癌症的生长和转移的效果。另外，所述融合蛋白可以用作抗癌剂，并在相比于传统血管生成抑制剂的更低的剂量下展示出有效的抗癌效果。，下面是抑制肿瘤血管生成的含VEGF深度阻断剂的癌症治疗组合物及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的Ig2结构域和神经纤毛蛋白1(NRP1)的b1结构域。
2.权利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
3.权利要求3所述的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包含SEQ ID NO:4。
4.权利要求3所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:5。
5.用于癌症治疗的组合物，所述组合物包含权利要求1至4任一项所述的融合蛋白。
6.DNA片段，所述DNA片段编码权利要求1至4任一项所述的融合蛋白。
7.重组载体，所述重组载体包含权利要求6所述的DNA片段。
8.细胞，所述细胞用权利要求7所述的重组载体转化。
9.权利要求6所述的细胞，其中，所述细胞是HEK293E。
10.制备用于癌症治疗的蛋白质的方法，其特征在于：
(a)培养权利要求8所述的经转化的细胞；以及
(b)从所述细胞的所述培养溶液中分离融合蛋白。

说明书全文

抑制肿瘤血管生成的含VEGF深度阻断剂的癌症 治疗组合物及

其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及抑制癌症生长和转移的新型血管生成抑制融合蛋白及其制备方法。

背景技术

[0002] 血管生成是器官正常生长和修复的必要过程，也是一个高度精细调节的过程。这些过程的调节失衡导致炎症、心血管疾病、免疫疾病或恶性疾病。血管内皮生长因子A(VEGFA)是血管生成的主要诱导物，并且已知其参与癌症生长和进展。VEGFA基因包含8个外显子并产生至少6种主要的VEGFA同型，VEGFA-121、VEGFA-145、VEGFA-165、VEGFA-183、VEGFA-189和VEGFA-206。其中，三种主要的同源蛋白质VEGFA-121、VEGFA-165和VEGFA-189在细胞中分泌，而它们的特征、生物利用度和分布彼此不同。然而，认为它们的血管生成功能通常受VEGF165调节。

[0003] VEGFA与两种酪氨酸激酶受体(VEGF受体(VEGFR)1和VEGFR2)结合，不仅参与新血管形成的发展，而且还可以防止细胞凋亡从而实现血管的维持。血管生成信号传导由VEGFA与VEGFR2(KDR)和共同受体(神经纤毛蛋白-1(NRP1))的结合介导。虽然VEGFR2是参与血管生成(angiogenesis)和血管形成(vasculogenesis)的主要受体，但VEGFR1对VEGFA的结合亲和力比VEGFR2高得多。

[0004] VEGFA表达水平通过诸如伤口愈合和缺氧条件的生理必需条件而增加，并且在诸如增殖性视网膜病、关节炎、牛皮癣和癌症的病理状态中也增加。此外，VEGFA是肿瘤血管发生的重要介导物，因为它从外周血管诱导新血管生长，使癌细胞可以获得氧气和营养，并促进癌症转移。

[0005] 已经开发了许多抗VEGF药物(诸如抗体制剂、适体和酪氨酸磷酸化抑制剂)。最近，(VEGF-trap)一种对VEGFA具有高亲和力的融合蛋白的阿柏西普，已被强调为下一代药物。该药物由对VEGFR1和VEGFR2的结合位点组成。

[0006] 作为相关的现有技术，题为“用于抑制血管生成和肿瘤细胞增殖的融合蛋白及包含其的组合物”的韩国专利公开No.1397088公开了包含血管生成抑制剂和癌症特异性抗体的融合蛋白，其对胃癌或乳腺癌具有治疗效果。

[0007] 在相关文献中，再生元公司和拜耳医疗保健公司报告了VEGF Trap-Eye(阿柏西普；商品名， )用于黄斑变性的III期临床试验结果，该结果表明与兰尼单抗相比，它可以通过较低剂量达到治疗效果。

[0008] Finely et al.开发了一种用于研究癌症特征(包括癌症生长速率和VEGF分泌)的移植有人癌细胞的小鼠模型，以使用VEGF-trap来预测VEGF分泌率，这表明它可以在临床前阶段用作活体癌症模型。

[0009] 本发明人制备了血管生成抑制剂(VEGF深度阻断剂(VEGF Deep)：VEEP)融合蛋白，其是包含VEGFR1的Ig2结构域和NRP1的b1结构域的诱饵受体，以便以比VEGF-trap更高的亲和力结合VEGFA并阻断VEGFA信号转导，以完成本发明。

发明内容

[0010] 技术问题

[0011] 本发明的一个目的是提供抑制癌症生长和转移的新型血管生成抑制融合蛋白及其制备方法。

[0012] 本发明的一个目的是提供一种重组DNA，其编码抑制癌症生长和转移的新型血管生成抑制融合蛋白。

[0013] 技术方案

[0014] 为此，本发明的一个方面提供融合蛋白，其特征在于包含血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的Ig2结构域和神经纤毛蛋白1(NRP1)的b1结构域。含有所述蛋白质的组合物能够抑制癌症生长和转移，并且可以用于治疗癌症。

[0015] 发明效果

[0016] 根据本发明的新型融合蛋白是血管生成抑制剂，其阻断血管内皮生长因子与细胞膜上其受体的结合，并具有抑制癌细胞增殖、生长和转移的效果。含有融合蛋白的组合物可以有效地用作抗癌剂。此外，与常规血管生成抑制剂相比，该组合物展现出较低的剂量具有较高的抗癌效果。附图说明

[0017] 图1是显示VEGFR1-NRP1-Fc融合蛋白的示意图。

[0018] 图2显示了VEEP融合蛋白的表达。

[0019] 图3显示通过比较LLC小鼠模型中VEEP与对照VEGF-trap的抗癌效果而获得的结果。

[0020] 图4显示了VEEP治疗后第30天LLC小鼠模型的终点分析结果。

具体实施方式

[0021] 本发明的模式

[0022] 在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明性目的，并且本发明不旨在这些实施例的限制。

[0023] 本发明的第一个实施方案提供融合蛋白，其特征在于包含血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的Ig2结构域和神经纤毛蛋白1(NRP1)的b1结构域。更具体地，血管内皮生长因子受体1可以但不限于由SEQ ID NO:1表示。Ig2结构域和神经纤毛蛋白1(NRP1)的b1结构域可以是各种形式，并且优选地，Ig2结构域和神经纤毛蛋白1(NRP1)的b1结构域可以由SEQ ID NO:2表示。融合蛋白可以进一步包含免疫球蛋白的Fc结构域，并且可以使用各种Fc结构域。
优选地，Fc结构域可以由SEQ ID NO:3表示。融合蛋白可以进一步包含用于表达的前导序列，并且可以使用各种前导序列。优选地，前导序列可以由SEQ ID NO:4表示。更优选地，融合蛋白可以具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

[0024] 本发明的第二个实施方案提供用于癌症治疗的组合物，该组合物包含上述融合蛋白。本领域技术人员可以向组合物中加入各种形式的药物递送材料、赋形剂、稳定剂等，这些各方面制剂也属于本发明的范围。

[0025] 本发明的第三个实施方案提供了编码该蛋白质的DNA片段。本发明所属领域的技术人员可根据遗传密码的简并性产生编码本发明融合蛋白的各种DNA序列。最后，编码本发明蛋白质的任何类型的DNA序列都在本发明的范围内。

[0026] 本发明的第四个实施方案提供了使用上述重组载体通过转化/转染获得的转化体。对于转化体，可以使用各种细胞；优选人源细胞，最优选HEK293E细胞。

[0027] 本发明的第五个实施方案提供了一种制备蛋白质的方法，包括培养根据本发明的经转化细胞；并将融合蛋白与细胞培养基分离。

[0028] 方法

[0029] 1、VEGFR1-NRP1-Fc融合蛋白的制备

[0030] 通过合成DNA(Ezbio；EZbio)的PCR获得编码VEGFR1的Ig2结构域的DNA片段，并且从韩国生物科学和生物技术研究所的人类基因库获得编码NRP1的b1结构域的DNA片段。将包含两个片段的DNA片段与人Fc DNA连接以产生融合蛋白。将克隆的DNA转染到HEK293E细胞中，并使用蛋白A树脂纯化培养基。通过测量A280吸光度计算纯化的蛋白质的浓度。

[0031] 2、体外亲和力试验(ELISA)

[0032] 将VEEP和VEGF-trap加入到包被有VEGF的96孔板中。洗涤数次后，加入HRP-偶联的抗人Fc，并向其中加入稳定的TMB，然后在450nm下测量吸光度。

[0033] 3、VEEP动物试验

[0034] 靶标疾病和实体肿瘤动物模型

[0035] 作为验证药物的抗癌效果的动物模型，从Koatech(韩国平泽市)购买6周龄雄性C57BL/6小鼠。根据动物实验伦理规则对动物进行一周的适应期。LLC(Lewis肺癌)细胞系购自ATCC，用于诱导小鼠中的实体瘤。

[0036] 体内测定VEEP的抗癌效果和终点

[0037] 将1x106LLC细胞皮下注射到6周龄C57BL/6小鼠的右胁腹区域。从LLC注射后第9天开始，每3天分别皮下注射25mg/kg VEEP和25mg/kg VEGF-trap，并且总共施用8次。每3-4天测量实体肿瘤的增殖，持续30天，并观察实体瘤的存活。使用电子数字卡尺测量实体瘤的大小以测量正交的长度(长轴)和宽度(短轴)。通过Π/6×(长度)2×宽度计算实体瘤的体积。在第30天，处死小鼠并提取实体瘤并使用微量天平称重。

[0038] <实施例1>融合蛋白

[0039] 纯化的VEGFR1-NRP1-Fc融合蛋白在还原条件和非还原条件下进行SDS-PAGE分析，观察到单体和二聚体的条带显示在与预测大小相对应的位置(图2)。

[0040] <实施例2>亲和力分析

[0041] 为了确定融合蛋白VEEP对VEGFA的亲和力，通过ELISA分析分析VEGF对受体或阻断剂的结合亲和力。对于亲和力试验，从VEGFA同源蛋白中选择VEGF165。对于对照，使用在细胞中天然表达的VEGFA受体(诸如VEGFR1、VEGFR2、NRP1和NRP2)和市售阻断剂(诸如VEGF-trap、贝伐单抗和兰尼单抗)进行比较和分析。分析结果显示，VEGF-trap对VEGF165的结合亲和力在对照组中最高。相反，与所有对照相比，本发明的融合蛋白VEEP显示出对VEGF165的最高结合亲和力，并且显示出比VEGF-trap高10倍的结合亲和力(表1)。

[0042] [表1]结合亲和力

[0043]

[0044]

[0045] <实施例3>抗癌效果试验

[0046] 为了测量根据本发明制备和纯化的VEEP融合蛋白的抗癌效果，使用LLC小鼠模型进行实体瘤生长的测量和存活的观察。作为LLC小鼠中实体瘤生长的测量结果，没有阻断剂治疗的对照组中平均肿瘤大小为13105mm3。在VEGF-trap治疗组中，平均肿瘤大小减小至9479mm3，但各个小鼠模型之间的减少效果表现出较大差异。相反，测量VEEP治疗的小鼠的实体瘤的平均大小为5872mm3，与没有阻断剂的对照相比，其显示抗癌效果的显著增加(图
3)。此外，VEEP的抗癌效果优于VEGF-trap。VEEP融合蛋白治疗小鼠的存活率为80％，优于VEGF-trap治疗对照(80％)或未阻断剂治疗对照(0％)。因此，认为本发明中制备的VEEP融合蛋白可以有效地应用于不能用VEGF-trap治疗的患者。

[0047] <实施例4>终点分析

[0048] 在用VEEP治疗LLC小鼠后第30天测量肿瘤大小和重量。与VEGF-trap治疗的小鼠的实体瘤重量(7.49g)相比，VEEP融合蛋白治疗的LLC小鼠的实体瘤重量(5.15g)显著降低(图3)。VEGF-trap治疗的小鼠表现出肿瘤大小的巨大差异。在VEEP治疗的小鼠中，平均肿瘤大小小于VEGF-trap治疗的小鼠，并且VEEP治疗的小鼠的肿瘤大小减小程度彼此相似(图4)。
因此，如在上述抗癌效果分析的结果中，认为本发明的VEEP阻断剂有效地应用于对VEGF-trap没有治疗效果的患者。

[0049] 参考文献

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[0064] 序列表1：VEGFR1部分的序列

[0065] VSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNT(VEGFR1)

[0066] 序列表2：Nrp1部分的序列

[0067] SaiakegfSanysvLQSsvsedfkcmealgmesgeihsdqitassqystnwsaersrlnypengwtpgedsyrewiqvdlgllrfvtavgtqgaisketkkkyyvktykidvssngedwitikegnkpvlfqgntnptdvvvavfpkplitrfvrikpatwetgismrfevygckit

[0068] 序列表3：免疫球蛋白Fc结构域

[0069] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0070] 序列表4：前导序列

[0071] MYLGLNYVFIVFLLNGVQS

[0072] 序列表5：全长序列

[0073] MYLGLNYVFIVFLLNGVQSVSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTSaiakegfSanysvLQSsvsedfkcmealgmesgeihsdqitassqystnwsaersrlnypengwtpgedsyrewiqvdlgllrfvtavgtqgaisketkkkyyvktykidvssngedwitikegnkpvlfqgntnptdvvvavfpkplitrfvrikpatwetgismrfevygckitDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

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