短葶山麦冬Liriope muscari(Decne.)Baily作为《中国药典》1995版新增品种-山麦 冬的原
植物之一,已在长期的传统中医临床实践中显示出其特有的疗效。但是,短葶山 麦冬在临床的应用仍集中于饮片或是复方制剂,如生脉散、参麦注射液等,而迄今还未 见单独以其提取物或
单体化合物作为临床药物使用的,因此,对其进行深入研究和开发 具有重要意义。
在化学成分研究方面,主要集中在短葶山麦冬的皂苷类成分的分离和
鉴别,由于山 麦冬属植物须根中的总皂苷含量在相当长的生长期内远高于其
块根,因此将短葶山麦冬 的须根作为研究的对象,迄今已从短葶山麦冬中分离并鉴别了六个单体皂苷类成分,其 中一个为短葶山麦冬C(DT13)。
至今为止,世界上还没有一个理想的抗
肿瘤转移药物。肿瘤患者一旦出现转移, 即使进行手术、放、化疗,生存期限仍无法得到较好的延长。短葶山麦冬C在制备抗肿 瘤转移药方面的应用也未见报导。
本发明的目的是提供短葶山麦冬C在制备抗肿瘤转移药方面的应用。
本发明的技术方案是短葶山麦冬C在制备抗肿瘤转移药方面的应用,特别是在制 备与肿瘤新生血管生成抑制相关的抗肿瘤转移药中的应用。研究显示,短葶山麦冬C对
乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤转移有明显抑制作用。
本发明中短葶山麦冬C可以和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物,也可 以和其他与短葶山麦冬C不发生拮抗作用的抗肿瘤转移药组成复方制剂。这些制剂可以 是药学上允许的任意一种剂型,包括但不限于片剂、颗粒剂、丸剂、口服液、注射剂、 膜剂、胶囊剂、脂质体等。短葶山麦冬C的用量可根据用药途径、患者年龄、体重、体 表面积、所
治疗的
疾病类型和严重程度等变化,其日剂量可以是1mg/kg,可以一次或 多次施用。
本发明的有益效果:
本发明研究发现DT13能够明显抑制人乳腺癌细胞的生长、迁移、黏附能
力,体内 发现DT13能够抑制黑色素瘤B16的
肺转移。DT13作为一个具有明显抗转移活性的候 选药物,研究阐明DT13的抗转移作用及其与新生血管生成抑制作用的相互关系,可以 为从肿瘤新生血管生成
抑制剂入手发展DT13抗肿瘤转移药物提供借鉴,为制备抗肿瘤 转移药提供了新的选择。
附图说明
图1是DT-13对缺
氧状态人乳腺癌细胞MDA-MB-435迁移能力的影响。
图2是DT-13对缺氧状态人乳腺癌细胞MCF-7迁移能力的影响。
图3是DT-13对缺氧状态人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响。
图4是DT-13对血管生成的抑制实验照片。
图5是DT-13对血管生成的抑制实验照片。
以下通过
实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1 DT-13对细胞的毒性检测
(一)材料:
仪器:超净
工作台(苏州
艾可林
净化设备有限公司),恒温CO2
培养箱(德国Heraeus 公司),酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD公司),倒置
生物显微镜(日本OLYMPUS公 司),平板摇床(江苏省光明实验仪器厂)。
试剂:RPMI1640、F12培养基(GIBCO),胰蛋白酶(SIGMA),新生
牛血清 (HYCLONE),MTT(SIGMA),DMSO(SIGMA)。
细胞株:人乳腺癌细胞MDA-MB-435、MDA-MB-231、MCF-7。
(二)方法:
1、取处于指数生长期状态良好的细胞各一瓶,加入0.25%胰蛋白酶消化液,消化 使贴壁细胞脱落,计数2~4×104个/ml,制成细胞悬液。
2、取细胞悬液接种于96孔板上,180μl/孔,置恒温CO2培养箱中培养24小时。
3、换液,加入受试药物DT-13,20μl/孔,培养48小时。
4、将MTT加入96孔板中,20μl/孔,培养箱中反应4小时。
5、吸去上清液,加入DMSO,150μl/孔,平板摇床上振摇5分钟。
6、用酶联免疫检测仪在
波长为570nm处测定每孔的吸光值,并计算细胞抑制。
(三)结果
人乳腺癌细胞435
人乳腺癌细胞MCF-7
人乳腺癌细胞231
实施例2DT-13对缺氧状态细胞黏附能力的影响
目的:体外检测缺氧状态下,人乳腺癌细胞对基底膜粘附能力的变化
材料:六孔板,96孔板,PBS,1%明胶,2%BSA,无血清培养液,10%
小牛血清 培养液,消化液(0.25%胰蛋白酶),MTT试剂,DMSO
方法:
一、明胶板的制备:
1、称取一定量的明胶粉,按照1g/100ml量加入热的PBS溶解,趁热点入96孔板 中,30μl/孔,平放并晃动,使明胶平铺孔底,注意不要有气泡。
2、放置过夜,将明胶吸出,PBS洗一遍。
3、用2%BSA封闭1小时后吸去。
4、加入无血清培养基,20~30μl/孔,平衡1小时以上,后吸去。
二,细胞培养
1、生长旺盛的人乳腺癌细胞,培养于六孔板中,计数7×104~9×104,2ml/孔。
2、培养至细胞长至铺满孔底80%时,去掉培养基,PBS洗一遍,换成无血清培养 基,并且加入受试药物DT-13,常氧培养。
三,黏附能力测定
1、培养后的细胞去培养基,PBS洗一遍,消化,离心,制成无血清细胞悬液。
2、将无血清细胞悬液加入处理好的明胶板中,200μl/孔,每一个剂量设10个平行 孔。空白组仅加入无血清培养基。
3、培养1小时后,用
注射器将培养液吸去,PBS洗一遍,方法为加入PBS200μl/ 孔,枪头小心吹打10下,用注射器吸出。
4、加入MTT40μl/孔,孵育4小时。
5、弃去MTT,加入DMSO,150μl/孔,平板摇床上振摇5分钟。
6、用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值,并计算细胞黏附抑制 率:
结果:
MDA-MB-231 细胞黏附抑制率(%)
DT-13 10-8mol/l 20.98
DT-13 10-7mol/l 30.26
DT-13 10-6mol/l 50.12
DT-13 10-5mol/l 55.94
MDA-MB-435
DT13 10μM 58
DT13 1μM 63
DT13 0.01μM 43
MCF-7
DT13 1μM 28.6
DT13 0.1μM 37.1
DT13 10nM 59.1
DT13 1nM 81.6
实施例3 DT-13对缺氧状态细胞迁移能力的影响
用Boyden Chamber Transwell检测细胞迁移能力。该装置分内外两室。内室底部为 多聚
碳酸盐滤膜(孔径8μm),先用1%明胶包被,再用无血清的培养液平衡1h。人乳 腺癌细胞(1.5×104个细胞/100μl)悬于含2%FBS及不同浓度受试化合物的培养液种入 内室。外室则加入0.6ml含或不含VEGF(20ng/ml)的培养液。37℃孵育6h后,弃去 孔中培养液,用90%
乙醇固定细胞10min。用
棉签轻轻擦去内室上层未迁移的细胞,0.1% 结晶紫常温
染色10min,用PBS漂净多余染料,最后用10%乙酸100μl/孔抽提10min, 用可调波长式微孔板酶标仪(VERSAmaxTM,Molecular Device Corporation,Sunnyvale, CA,USA)在600nm下测定OD值。
结果见图1、2、3,说明DT13能够明显抑制三种乳腺癌细胞的迁移。
实施例4DT-13对血管生成的抑制实验
实验材料:6日龄鸡蛋购于南京浦口、经消毒的手术器械、粗针头、弯镊、孵箱、 经灭菌的
滤纸片(制药膜)、DT-13。
操作:
药膜的制备:DT-13药物浓度为1*10-3M加入到直径0.5cm灭菌滤纸膜上,分别加 30μl,10μl,1μl,以制备不同浓度的药膜。
1、将6日龄受精鸡蛋擦拭后大头朝上固定;
2、用粗针头刺破气室处蛋壳;
3、用弯镊开窗;
4、将表面膜小心剥除,选取血管最少的部位放置药膜;
5、宽
胶带封口,标记后放于孵箱,2日后拍照观察结果。
结果见图4,箭头处为放置药膜处。
第二次实验结果见图5。药物浓度为30nmol,20nmol,10nmol,1nmol,操作过程 同第一次实验步骤。
两次实验结果均发现,与空白对照相比,DT-13在10nmol就有明显的血管生成抑 制作用。
实施例5 DT-13对B16黑小鼠转移瘤的抑制作用
小鼠黑色素瘤细胞B16尾静脉注射C57小鼠,注射细胞量1*106个,同时
给药DT-13 二周后处死动物,数肺部转移灶个数进行统计。
组别 剂量 mg/kg 动物数 (开始) 动物数 (结束) 开始体重 (克) 结束体重 (克) 肺重/体重 肺转移灶 (个数)
溶剂 10 10 18.5±1.0 19.2±1.0 0.32±0.08 32.3±11.9 5-Fu 25 10 10 18.4±0.8 17.4±0.8 0.15±0.02** 11.0±1.1** DT13 10 10 10 18.5±0.9 19.3±0.8 0.16±0.02** 10.6±1.3** DT13 5 9 9 18.4±0.8 19.8±0.7 0.18±0.03* 16.3±1.8* DT13 2.5 10 10 18.0±0.8 19.6±0.6 0.21±0.05 27.9±2.8
*:P<0.05 **:P<0.01,与溶剂对照组相比。
DT-13高、中剂量组与溶剂对照组相比,肺重/体重的比值明显下降,且肺部转移灶 数量也明显降低。结果显示,DT-13对B16黑小鼠转移瘤有较好的抑制作用。