假马齿苋总皂苷在制备抗脑缺血药物中的应用
阅读：561发布：2020-05-12
专利汇可以提供假马齿苋总皂苷在制备抗脑缺血药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了 假 马 齿苋 总皂苷在制备防治脑缺血药物中的应用。本发明所述假马齿苋总皂苷主要含有下列达玛烷型三萜皂苷化合物Bacopaside I，Bacoside A3，Bacopaside II，Bacopasaponin Cisomer及Bacopasaponin C。本发明还提供了Bacopaside I在制备防治脑缺血药物中的应用。本发明实验研究证明，假马齿苋总皂苷和Bacopaside I均可明显改善大鼠脑缺血 再灌注 损伤引起的行为症状、缩小脑梗塞体积、降低脑缺血大鼠脑 水 肿。因此，可用于制备防治脑缺血药物。本发明所述防治脑缺血药物为由假马齿苋总皂苷或Bacopaside I作为活性成分与药用辅料按照常规方法制成的药物组合物。本发明进一步拓展了Bacopaside I及假马齿苋总皂苷的用途，为防治脑缺血提供了一种新的药物，有较大的临床应用价值。，下面是假马齿苋总皂苷在制备抗脑缺血药物中的应用专利的具体信息内容。
1.假马齿苋总皂苷在制备防治脑缺血药物中的应用，其特征在于，所述假马齿苋总皂苷含有下列达玛烷型三萜皂苷化合物：
Bacopaside I，Bacoside A3，Bacopaside II，Bacopasaponin C isomer 及Bacopasaponin C：
上述5个皂苷化合物的总量在假马齿苋总皂苷中的含量为50%-55%重量%。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述假马齿苋总皂苷通过下列制备方法得到，包括以下步骤：
（1）取假马齿苋药材重量12倍量的40-70%乙醇浸泡60min，煎煮120min，重复三次，合并提取液，过滤去沉淀；
（2）上清液通过HP-20大孔树脂，以10倍柱体积量去离子水洗去水溶性杂质，再先后以
5倍柱体积量40%乙醇、5倍柱体积量75%乙醇洗脱，收集75%乙醇洗脱液备用； （3）取75%乙醇洗脱液，低温蒸去乙醇至无醇味，浓缩至干，80℃减压干燥24h至恒重，得假马齿苋总皂苷固体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治脑缺血药物为由假马齿苋总皂苷作为活性成分与药用辅料按照常规方法制成的药物组合物。
4.Bacopaside I在制备防治脑缺血药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Bacopaside I通过下列制备方法得到，包括以下步骤：
（1）药材处理：假马齿苋粉碎成粉末，以甲醇-水体积比9:1溶解，过滤，滤液通过上
90%甲醇平衡的三菱化学手性柱，再经90%甲醇洗脱，蒸干得浸膏；
（2）提取：脱色后浸膏与硅胶等比拌样后进行中压制备，中压条件为：压力25bar、流速
6ml/min、水相70%-10%、甲醇30%-90%、 总时间6.5h，其中0.5h为平衡柱子时间；收集到的提取物通过板层析，展开剂为乙酸乙酯：甲醇：水=20:3.4:2.7，与Bacopaside I标准品对照找到所需的点，收集所需提取物蒸干；
（3）纯化：氯仿与甲醇等体积混合溶剂溶解(2)得到的提取物，通过LH-20凝胶柱，以氯仿与甲醇等体积混合溶剂冲洗，得到纯化的Bacopaside I。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述防治脑缺血药物为由Bacopaside I作为活性成分与药用辅料按照常规方法制成的药物组合物。
假马齿苋总皂苷在制备抗脑缺血药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及中药提取物，具体涉及中药提取物的应用，尤其涉及从假马齿苋（Bacopa Monnieri（L.）Wettst）中提取分离得到的假马齿苋总皂苷在制备防治抗脑缺血药物中的应用。
背景技术
[0002] 假马齿苋系玄参科植物假马齿苋(Bacopa Monnieri(L.)Wettst)的全草，中医理论描述了假马齿苋具有清热凉血，解毒消肿的功效，用于治疗痢疾、目赤肿痛、丹毒、痔疮肿痛、象皮肿等症状。
[0003] 印度阿育吠陀医药体系（Ayurvedic system of medicine）认为假马齿苋能增强智力和改善记忆，具有延缓衰老、预防痴呆，镇静、催眠，抗老年痴呆之功效。假马齿苋提取物制成的制剂已在印度上市，作为治疗记忆损伤和抗老年痴呆的辅助药物。但至今，假马齿苋中尚未开发出任何形式的药物。本发明人前期通过神经保护活性指导下的化学成分系统分离方法对假马齿苋药材进行了系统的活性成分研究，从假马齿苋提取物中纯化得到一个神经保护活性非常强的三萜类化合物Bacopaside I，如下结构式表示：
[0004]
[0005] 药理研究结果表明，Bacopaside I对过氧化氢（H2O2）和谷氨酸（L-Glutamate）诱导的大鼠皮层神经元和嗜铬细胞瘤细胞（PC 12cells）损伤具有显著的保护作用，且保护作用呈现剂量依赖关系，具有潜在的抗老年痴呆活性，可以开发新药。经本发明人的进一步研究，证实了假马齿苋提取物具有防治脑缺血的作用，可以研究开发防治抗脑缺血药物。经查询，在本发明前尚未有该相关药物的报道。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于研究开发假马齿苋提取物作为制备防治抗脑缺血药物。
[0007] 本发明提供了假马齿苋总皂苷在制备防治脑缺血药物中的应用。 [0008] 本发明所述假马齿苋总皂苷主要含有下列达玛烷型三萜皂苷化合物： [0009] Bacopaside I，Bacoside A3，Bacopaside II，BacopasaponinC isomer 及Bacopasaponin C：
[0010]
[0011] 通过检测，上述5个皂苷化合物的总量在假马齿苋总皂苷中的含量为50%-55%（重量%）。
[0012] 本发明所述假马齿苋总皂苷制备方法包括以下步骤：
[0013] (1)取假马齿苋药材重量12倍量的40-70%乙醇浸泡60min，煎煮120min，重复三次，合并提取液，过滤去沉淀；
[0014] (2)上清液通过HP-20大孔树脂，以10倍柱体积量去离子水洗去水溶性杂质，再先后以5倍柱体积量40%乙醇、5倍柱体积量75%乙醇洗脱，收集75%乙醇洗脱液备用； [0015] (3)取75%乙醇洗脱液，低温蒸去乙醇至无醇味，浓缩至干，80℃减压干燥24h至恒重，得假马齿苋总皂苷固体。
[0016] BacopasideI、Bacoside A3、BacopasideII、BacopasaponinC isomer 及Bacopasaponin C五种单体标准品制备采用液相制备得到：色谱条件为：35%乙腈/65%水，以1.8ml/min流速等度洗脱，检测波长为205nm。分别接取无杂峰干扰的五个化合物，蒸干即得。
[0017] 本发明的另一目的提供了Bacopaside I在制备防治脑缺血药物中的应用。 [0018] 本发明所述Bacopaside I制备方法包括以下步骤：
[0020] (2)提取：脱色后浸膏与硅胶等比拌样后进行中压制备，中压条件为：压力25bar、流速6ml/min、水相70%-10%、甲醇30%-90%、总时间6.5h，其中0.5h为平衡柱子时间；收集到的提取物通过板层析(展开剂为乙酸乙酯：甲醇：水=20:3.4:2.7)，与Bacopaside I标准品对照找到所需的点，收集所需提取物蒸干；
[0021] （3）纯化：氯仿与甲醇等体积混合溶剂溶解(2)得到的提取物，通过LH-20凝胶柱，以氯仿与甲醇等体积混合溶剂冲洗，得到纯化的Bacopaside I，经C谱、H谱、DEPT谱以及质谱鉴定确认与标准品一致。
[0022] 本发明人将上述假马齿苋总皂苷和BacopasideI通过药理实验，采用动物模型对大鼠中脑动脉阻断（MCAO）致局灶性脑缺血再灌注模型的防治作用，结果证实了假马齿苋总皂苷和BacopasideI均可用于防治脑缺血。
[0023] 因此，本发明所述假马齿苋总皂苷和BacopasideI可用于制备防治脑缺血药物。 [0024] 本发明所述防治脑缺血药物为由假马齿苋总皂苷作为活性成分与药用辅料按照常规方法制成的药物组合物。
[0025] 本发明所述防治脑缺血药物为由BacopasideI作为活性成分与药用辅料按照常规方法制成的药物组合物。
[0027] 图1BacopasideI对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响。纵坐标表示大鼠神经学评分，各组分别为1：空白对照组；2：模型组；3:Bacopaside I 3mg/kg；4:Bacopaside I 10mg/kg；5:Bacopaside I 30mg/kg。**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。 [0028] 图2Bacopaside I对脑缺血再灌注损伤大鼠脑水肿程度的影响。纵坐标表示脑缺血再灌注损伤大鼠脑水肿程度，各组分别为1：空白对照组；2：模型组；3:Bacopaside I3mg/kg；4:BacopasideI 10mg/kg；5:Bacopaside I 30mg/kg。**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
[0029] 图3Bacopaside I对脑缺血再灌注损伤大鼠脑缺血体积的影响。纵坐标表示脑缺血再灌注损伤大鼠脑缺血体积比，各组分别为1：空白对照组；2：模型组；3:Bacopaside I3mg/kg；4:BacopasideI 10mg/kg；5:Bacopaside I 30mg/kg。**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
[0030] 图4假马齿苋总皂苷对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响。纵坐标表示神经大鼠神经学评分，各组分别为1：空白对照组；2：模型组；3:假马齿苋总皂苷15mg/kg；4:假马齿苋总皂苷50mg/kg；5:假马齿苋总皂苷150mg/kg。**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。 [0031] 图5假马齿苋总皂苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑水肿程度的影响。纵坐标表示脑缺血再灌注损伤大鼠脑水肿程度，各组分别为1：空白对照组；2：模型组；3:假马齿苋总皂苷15mg/kg；4:假马齿苋总皂苷50mg/kg；5:假马齿苋总皂苷150mg/kg。**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
[0032] 图6假马齿苋总皂苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑缺血体积的影响。纵坐标表示脑缺血再灌注损伤大鼠脑缺血体积比，各组分别为1：空白对照组；2：模型组；3:假马齿苋总皂苷15mg/kg；4:假马齿 苋总皂苷50mg/kg；5:假马齿苋总皂苷150mg/kg。**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
具体实施方式
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 [0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径市售得到。 [0035] 实施例1、假马齿苋总皂苷的制备
[0036] 取假马齿苋药材10kg加1200kg的40-70%乙醇浸泡60min，煎煮120min，重复三次，合并提取液，过滤去沉淀；上清液通过HP-20大孔树脂，以10倍柱体积量去离子水洗去水溶性杂质。先后用5倍柱体积量40%乙醇、5倍柱体积量75%乙醇洗脱，收集75%乙醇洗脱液；取75%乙醇洗脱液，低温蒸去乙醇至无醇味，浓缩至干，80℃减压干燥24h至恒重，得假马齿苋总皂苷固体70g。
[0037] Bacopaside I、Bacoside A3、Bacopaside II、BacopasaponinC isomer 及Bacopasaponin C五种单体标准品制备采用液相制备得到：
[0038] 取上述假马齿苋总皂苷适量，加色谱纯甲醇溶解成浓度为20mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，经液相制备五种化合物单体。色谱条件为：35%乙腈/65%水，以1.8ml/min流速等度洗脱，检测波长为205nm。分别按上述次序依次接收无杂峰干扰的五个化合物，蒸干即得。
[0039] 假马齿苋总皂苷含量采用HPLC检测，5个皂苷化合物由HPLC-UV定量 [0040] 5个皂苷化合物由HPLC-UV定量方法:
[0041] （1）仪器和试药Agilent 1100 HPLC系统，BacopasideI、Bacoside A3、Bacopaside II、Bacopasaponin C isomer及Bacopasaponin C均为上述制得，乙腈为色谱纯，水为三蒸水，其它试剂为分析纯。
[0042] （2）色谱条件和系统适用性Agielnt ZORBAX SB－C18柱，以乙腈∶0.2％磷酸（NaOH调节pH至3）为流动相，等度洗脱，柱温为30℃，流速1.0ml/min，检测波长205nm，总时间45min。
[0043] (3)溶液的配制对照品溶液的制备精密称取对照品各10.0mg，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容。然后稀释成一系列浓度，储存于4℃冰箱中，作为储备液。各对照品浓度范围为：BacopasideI（40-280μg/ml）、Bacoside A3（40-160μg/ml）、Bacopaside II（40-280μg/ml）、Bacopasaponin C isomer（40-160μg/ml） 及 Bacopasaponin C（40-160μg/ml）。假马齿苋总皂苷精密配制成1mg/ml的溶液。
[0044] （4）标准曲线取各对照品溶液，加溶剂甲醇稀释成不同浓度，在上述色谱条件下进样测定。紫外检测条件下，以峰面积为纵坐标，对照品进样浓度（μg/ml）为横坐标作图，得各化合物标准曲线。
[0045]
[0046] 由此测得假马齿苋总皂苷含量为52.13%。
[0047] 实施例2、假马齿苋总皂苷在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用
[0048] 本发明采用了线栓法大脑中动脉阻断模型造成大鼠急性脑缺血再灌注损伤模型，并采用给药第三天造模连续给药六天的防治给药方式，从脑梗塞面积、脑水肿程度及动物行为评分三方面证明假马齿苋总皂苷对急性脑缺血再灌注损伤的治疗作用。 [0049] 1、实验材料和方法
[0050] 1）动物与分组：
[0051] SD雄性大鼠，体重260-280g，由第二军医大学实验动物中心提供。动物随机分为5组:(1)假手术组；（2）模型组;(3)假马齿苋总皂苷组（实施例1制得）（15mg/kg）；(4)假马齿苋总皂苷组（实施例1制得）（50mg/kg）；(5)假马齿苋总皂苷组（实施例1制得）（150mg/kg）。
[0052] 2）给药方式：
[0053] 实验大鼠采用灌胃给药，连续给药六天，假手术组和模型组给予 等量的生理盐水。假马齿苋总皂苷分别用生理盐水配制成1.5、5、15mg/ml，按大鼠体重各组给药2ml/200g,每天给药一次。
[0054] 3）脑缺血再灌注模型的制备：
[0055] 采用改良的Nagasawa等的线栓法复制大鼠局灶性闹缺血再灌注损伤模型。实验前腹腔注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉，保留自主呼吸，仰卧位固定于鼠板，颈部正中去毛，用75%的酒精消毒，取大鼠腹侧颈部正中手术切口，分离暴露左侧颈总动脉（CCA）与颈内（ICA）、颈外动脉（ECA），夹闭CCA，于ECA外端0.7cm处结扎并切口，将以多聚赖氨酸处理过的尼龙线栓线轻轻插入，向颈内入颅方向缓慢推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进约18mm后结扎，阻断MCA血流，同时开放夹闭的CCA进行缺血。缺血2h后，轻轻拔出线栓实现再灌注。缝合动物伤口，整个实验过程中维持动物体温在37℃。假手术组除不插入拴线以外，其余操作同模型组。
[0056] 4）神经行为评分：
[0057] 参考Longa的5级4分法，在动物麻醉清醒后24h进行评分，其标准为：0分：未观察到神经症状；1分：提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直；2分：向瘫痪侧转圈；3分：向病灶对侧跌倒；4分：不能自发行走，意识丧失。
[0058] 5）脑梗塞体积和脑水肿检测方法如下：
[0059] 动物进行完行为检测后，断头处死，迅速取出完整大脑，以4℃的生理盐水洗去血迹，称重，将大脑均匀切成6片冠状切片。脑切片进入2%TTC溶液，37℃避光孵育20min，取出后4%多聚甲醛固定24h， 取出拍照。利用图像分析软件Image J测定脑梗死面积和脑梗死体积。脑切片再在110℃中干燥24h并称重。
[0060] 水肿程度（%）=（湿重-干重）*100%/湿重
[0061] 脑梗死体积（%）=（未损伤侧大脑面积-损伤侧非白色区面积）*100%/(2*未损伤侧大脑面积)
[0062] 6）结果见图4-图6
[0063] 图4为假马齿苋总皂苷对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响。手术后模型组大鼠神经功能损伤比较严重，大鼠表现出明显的运动功能障碍，提鼠尾可见其左前肢内收，行走时偏向左侧，神经功能评分明显升高；与模型组比较给药组大鼠行为障碍均得到不同程度的改善。图5为假马齿苋总皂苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑水肿程度的影响。各给药组缺血再灌注损伤大鼠水肿程度也有不同程度的降低。
[0064] 图6为假马齿苋总皂苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑缺血体积的影响。模型组缺血程度比较严重，缺血面积明显比各给药组大。
[0065] 结论：
[0066] 通过神经功能评价、脑缺血体积的计算以及脑水肿程度测定，结果显示假马齿苋总皂苷对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有一定地保护作用，且50mg/kg剂量最有效。 [0067] 实施例3、Bacopaside I的制备
[0068] 将假马齿苋除去杂质后粉碎成粉末10kg，以甲醇-水体积比9:1溶解，过滤，滤液上90%甲醇平衡的三菱化学手性MCI柱，再经90%甲醇洗脱，蒸干得样品。脱色后样品与硅胶等比拌样后进行中压制备， 中压条件为：压力25bar、流速6ml/min、水相70%-10%、甲醇30%-90%、总时间6.5h，其中0.5h为平衡柱子时间。中亚得到的样品通过点板(展开剂为乙酸乙酯：甲醇：水=20:3.4:2.7)与标准品对照找到所需的点，收集蒸干。氯仿与甲醇等体积溶解上述得到的提取物，过凝胶柱。得到纯化的Bacopaside I 11g,经由C谱、H谱、DEPT谱以及质谱鉴定确证是Bacopaside I。
[0069] 实施例4、Bacopaside I在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用
[0070] 本发明采用了线栓法大脑中动脉阻断模型造成大鼠急性脑缺血再灌注损伤模型，并采用给药第三天造模连续给药六天的防治给药方式，从脑梗塞面积、脑水肿程度及动物行为评分三方面证明Bacopaside I对急性脑缺血再灌注损伤的治疗作用。 [0071] 2、实验材料和方法
[0072] 1）动物与分组：
[0073] SD雄性大鼠，体重260-280g，由第二军医大学实验动物中心提供。动物随机分为5组:(1)假手术组；（2）模型组;(3)BacopasideI组（3mg/kg）；(4)BacopasideI组（实施例3制得）（10mg/kg）；(5)BacopasideI组（30mg/kg）。
[0074] 2）给药方式：
[0075] 实验大鼠采用灌胃给药，连续给药六天，药物组、假手术组和模型组给予等量的生理盐水。BacopasideI分别用生理盐水配制成0.3、1、3mg/ml，按大鼠体重各组给药2ml/200g,每天给药一次。
[0076] 3）脑缺血再灌注模型的制备：
[0077] 采用改良的Nagasawa等的线栓法复制大鼠局灶性闹缺血再灌注损伤模型。实验前腹腔注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉，保留自主呼吸，仰卧位固定于鼠板，颈部正中去毛，用75%的酒精消毒，取大鼠腹侧颈部正中手术切口，分离暴露左侧颈总动脉（CCA）与颈内（ICA）、颈外动脉（ECA），夹闭CCA，于ECA外端0.7cm处结扎并切口，将以多聚赖氨酸处理过的尼龙线栓线轻轻插入，向颈内入颅方向缓慢推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进约18mm后结扎，阻断MCA血流，同时开放夹闭的CCA进行缺血。缺血2h后，轻轻拔出线栓实现再灌注。缝合动物伤口，整个实验过程中维持动物体温在37℃。假手术组除不插入拴线以外，其余操作同模型组。
[0078] 4）神经行为评分：
[0079] 参考Longa的5级4分法，在动物麻醉清醒后24h进行评分，其标准为：0分：未观察到神经症状；1分：提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直；2分：向瘫痪侧转圈；3分：向病灶对侧跌倒；4分：不能自发行走，意识丧失。
[0080] 5）脑梗塞体积和脑水肿检测方法如下：
[0081] 动物进行完行为检测后，断头处死，迅速取出完整大脑，以4℃的生理盐水洗去血迹，称重，将大脑均匀切成6片冠状切片。脑切片进入2%TTC溶液，37℃避光孵育20min，取出后4%多聚甲醛固定24h，取出拍照。利用图像分析软件Image J测定脑梗死面积和脑梗死体积。脑切片再在110℃中干燥24h并称重。
[0082] 水肿程度（%）=（湿重-干重）*100%/湿重
[0083] 脑梗死体积（%）=（未损伤侧大脑面积-损伤侧非白色区面积）*100%/(2*未损伤侧大脑面积)
[0084] 6）结果见图1-图3
[0085] 图1为BacopasideI对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响。手术后模型组大鼠神经功能损伤比较严重，大鼠表现出明显的运动功能障碍，提鼠尾可见其左前肢内收，行走时偏向左侧，神经功能评分明显升高；与模型组比较给药组大鼠行为障碍均得到不同程度的改善。图2为BacopasideI对脑缺血再灌注损伤大鼠脑水肿程度的影响。各给药组缺血再灌注损伤大鼠水肿程度也有不同程度的降低。图3为BacopasideI对脑缺血再灌注损伤大鼠脑缺血体积的影响。模型组缺血程度比较严重，缺血面积明显比各给药组大。 [0086] 结论：
[0087] 通过神经功能评价、脑缺血体积的计算以及脑水肿程度测定，结果显示BacopasideI对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有一定的保护作用，且10mg/kg剂量最有效。
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