海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用
专利汇可以提供海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于海洋放线菌资源开发与利用领域，具体涉及海洋放线菌B11在制备抗 肿瘤 活性物质中的应用。所述的海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，所述培养基的pH为7.0，所述培养基的组成为麦芽浸粉10g， 葡萄糖 4g， 酵母 浸粉4g，天然 海 水 1L。所述海洋放线菌B11 发酵 液萃取后所获得的抗肿瘤活性物质对Hela和A549均具有较强的抗肿瘤活性，且具有良好的酸 碱 稳定性 及 热稳定性 ，并经细胞周期检测主要将肿瘤细胞阻遏在G2/M期。，下面是海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用专利的具体信息内容。
1.海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，其特征在于，所述放线菌B11为于
2017年12月26日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.
15129。
2.根据权利要求1所述的海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，其特征在于，所述海洋放线菌B11制备抗肿瘤活性物质的制备方法采用以下步骤：
（1）将海洋放线菌 B11接种到装有50mL培养基的200mL三角瓶中，30℃下180 rpm/min摇床培养2d，作为种子液；
（2）在含有400mL培养基的1000mL三角瓶按5%的接种量接种步骤（1）制备的种子液培养，30℃下180 rpm/min摇床培养8d，然后将发酵液4000 rpm/min下离心10min，收集上清液进行萃取实验；
（3）将步骤（2）制备的上清液经滤纸过滤后，将滤液用10%的NaOH将pH调节至10左右，边加边搅拌，萃取，静置分层，上层有机相用同样的方法再反复萃取两次，萃取最后获得的有机相经50℃减压浓缩发至干燥，即得抗肿瘤活性物质。
3.根据权利要求2所述的海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，其特征在于，所述培养基的pH 为7.0，所述培养基的组成为麦芽浸粉 10 g，葡萄糖4 g，酵母浸粉4 g，天然海水 1L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤活性物质在制备抗人宫颈癌细胞Hela药物或抗人肺癌细胞A549药物的应用。
海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用
技术领域
背景技术
发明内容
（2）在含有400mL培养基的1000mL三角瓶按5%的接种量接种步骤（1）制备的种子液培养，30℃下180 rpm/min摇床培养8d，然后将发酵液4000 rpm/min下离心10min，收集上清液进行萃取实验；
（3）将步骤（2）制备的上清液经滤纸过滤后，将滤液用10%的NaOH将pH调节至10左右，边加边搅拌，萃取，静置分层，上层有机相用同样的方法再反复萃取两次，萃取最后获得的有机相经50℃减压浓缩发至干燥，即得抗肿瘤活性物质。
图2为药物稀释1.6×10倍的细胞周期图；
图3为药物稀释3.2×104倍的细胞周期图；
图4为药物稀释6.4×104倍的细胞周期图。
具体实施方式
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC No. 15129，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：
100101，
分类命名：Streptomyces rubiginosohelvolus。
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’下游5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR总反应体系50uL：模板2uL，2×Taq Mix 25uL，引物1：2uL，引物2：2uL，ddH2O：19uL。PCR反应条件：预变性 95℃
5min ，95℃变性40 s，55℃ 退火45 s，72℃延伸75 s，共30个循环，72℃终延伸10min，反应结束。测序产物经琼脂糖凝胶电泳分离检验，紫外下观察，切胶回收纯化，送往上海生工测序。菌株序列在NCBI上进行核苷酸序列BLAST比对后，发现与绣赤蜡黄链霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus）相似性达到99%。
抑制率（IR）% = ×100%
然后利用Calcusyn软件计算抑制率为50%时样品的稀释倍数，即ID50，作为样品抗肿瘤活性的评价指标。其定义为抑制率为50%时样品稀释倍数，其ID50越大表明液体样品的抗肿瘤活性越高。
取0.1 g上述获得的抗肿瘤活性物质分别稀释至40、80、160、320、640、1280倍，抗肿瘤活性物质稀释样品作为对照，检测对人宫颈癌细胞Hela和人肺癌细胞A549的抑制率，计算ID50。各个浓度抗肿瘤活性物质稀释样品分别取3份(每份2mL)调pH至2，7，10置于水浴中加热1h，再将pH再调至7，以抗肿瘤活性物质稀释样品作为对照，检测对Hela和A549细胞的抑制率，计算ID50。
表3 pH7加热1h抗肿瘤活性物质不同稀释倍数的癌细胞存活率结果
表4 pH10加热1h抗肿瘤活性物质不同稀释倍数的癌细胞存活率结果
表5 各样品对KB细胞的ID50值
细胞周期实验
将处于对数生长期的A549细胞，按5×105 /ml 密度接种于6孔板中，稳定培养后加入不同浓度的药物（各稀释1000倍），37 ℃作用24h后，去除培养液，胰酶消化细胞五分钟，
1000 g离心收集细胞，用冰PBS洗细胞一次。加入300 μl PBS 将细胞均匀分散，然后缓慢加入4 ℃预冷的100%无水乙醇700 μl，4℃固定过夜。次日1000 g 离心5 min，弃上清，细胞沉淀中加入500 μl 含20 μg/ml RNase A 的PBS，混匀后，37 ℃水浴15 min，之后加入终浓度为10 μg/ml 的碘化丙啶（propidium iodide，PI），室温避光染色30 min。流式细胞仪FACSCalibur TM 检测样品细胞中DNA含量，每组样品至少分析1×104个细胞。
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