一种上转换纳米材料的合成和修饰方法
阅读：674发布：2023-01-08
专利汇可以提供一种上转换纳米材料的合成和修饰方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种上转换 纳米材料 的合成与修饰方法。采用 热分解 法制备粒径均匀的上转换纳米材料；其次，将纳米颗粒外包裹介孔 二 氧 化 硅 进行表面修饰，形成核壳纳米颗粒，构造亲 水 性结构；最后，在多孔纳米颗粒上搭载 光敏剂 和叶酸，使其具有光动 力 杀伤和体外靶向 肿瘤 细胞的功能。本发明使用穿透能力强的 近红外 光激发 ，使得癌细胞产生大量 活性氧 起到抑制癌症的作用，实现光动力学 治疗 杀灭肿瘤细胞，并减少细胞和 生物 组织 的损伤。，下面是一种上转换纳米材料的合成和修饰方法专利的具体信息内容。
1.一种上转换纳米材料的合成和修饰方法，其特征是：包括如下步骤：
(1)采用热分解法制备NaYF4:Yb,Er,Gd上转换纳米材料，纳米材料的粒径在25～50nm之间；
(2)将步骤(1)中获得的上转换纳米材料外包裹无定形二氧化硅，并在无定形二氧化硅表面修饰介孔二氧化硅，形成核壳纳米颗粒，构造亲水性结构；
(3)将步骤(2)中获得的核壳纳米颗粒上搭载光敏剂。
(4)将步骤(3)中得到的纳米颗粒使用叶酸功能化。
2.根据权利要求1所述的一种上转换纳米材料的合成和修饰方法，其特征是：所述的纳米颗粒用于靶向定位并杀灭宫颈癌细胞且不伤害正常组织与细胞。
3.根据权利要求1所述的一种上转换纳米材料的合成和修饰方法，其特征是：所述步骤(1)中上转换纳米材料中掺杂稀土元素Yb,Er,Gd摩尔百分比分别为25～30mol％、0.3～
1mol％、30～35mol％。
4.根据权利要求1所述的一种上转换纳米材料的合成和修饰方法，其特征是：所述步骤(2)中包裹无定形二氧化硅的方法如下：向步骤(1)获得的反应液中加入正硅酸乙酯(TEOS)搅拌36～48小时，TEOS与步骤(1)中获得的上转换纳米材料溶液的体积比为1：20～1：25。
5.根据权利要求4所述的一种上转换纳米材料的合成和修饰方法，其特征是：所述步骤(2)中在无定形二氧化硅表面修饰介孔二氧化硅的方法如下：继续加入TEOS和C18TMS，分别用于二氧化硅层制备和造孔剂，通过控制TEOS的量可自行控制二氧化硅层的厚度。
6.根据权利要求1所述的一种上转换纳米材料的合成和修饰方法，其特征是：所述步骤(3)中使用MC540光敏剂或者ZnPc光敏剂。
一种上转换纳米材料的合成和修饰方法
技术领域
背景技术
[0002] 光动力学治疗(PDT)是现代医学治疗癌症和肿瘤的一种有效手段，其具有靶向性高、无毒性以及微创性等优点。同时，可以通过修改参数，如波长、强度和曝光时间，达到增加或改变控制程度的目的，由此可有效解决治疗中的安全性和特异性问题。PDT对肿瘤的杀伤机制较为复杂，光敏剂的种类、组织生物学特性以及光敏剂与肿瘤相结合的状态等因素都会对其杀伤效果造成影响。由于肿瘤组织高吸收和低代谢的特性，光敏性物质进入人体后，会优先在肿瘤组织处吸收并聚积。光敏剂受到相应波长(例如可见光、紫外光或近红外光)光照射，激活后由基态变成激发态，该过程可以产生大量单线态氧和自由基。活性氧与多种生物大分子相互作用后产生细胞毒性，破坏甚至杀灭肿瘤细胞破坏，达到治疗目的。
[0003] 但是传统的光动力学疗法存在着以下问题，限制了其在医学上的应用。1)卟啉衍生物是现阶段常用的光敏剂，其缺乏对肿瘤组织的靶向性，难以在肿瘤处达到一定浓度，治疗效果不明显。2)光敏剂分子多为疏水性分子，在体内易团聚，难以传输到肿瘤处。
发明内容
[0004] 针对传统制备技术中存在的不足，加以改进，本发明提供了一种上转换纳米材料的合成与修饰方法。合成的纳米颗粒形状均匀，发光效率高。本发明以介孔二氧化硅包裹的上转换纳米颗粒为载体，表面修饰叶酸和光敏剂，主要用于靶向肿瘤并杀灭肿瘤细胞，基本不会损伤正常组织细胞，是一种理想的肿瘤治疗方案。
[0005] 本发明所采用的技术方案如下：一种上转换纳米材料的合成与修饰方法，该方法包括如下步骤：
[0007] (2)将步骤(1)中获得的上转换纳米材料外包裹无定形二氧化硅，并在无定形硅表面修饰介孔二氧化硅，形成核壳纳米颗粒，构造亲水性结构；
[0008] (3)将步骤(2)中获得的核壳纳米颗粒上搭载光敏剂，使其具备光动力学杀灭肿瘤细胞的能力；
[0009] (4)将步骤(3)中得到的纳米颗粒使用叶酸功能化，使其能与肿瘤细胞表面的叶酸受体结合，具备靶向肿瘤细胞的能力。
[0010] 所述上转换纳米材料的微观结构表现为核壳状结构且最外层为多孔状结构，构造亲水性结构，可加载光敏剂等小分子。
[0012] 作为优选，所述步骤(1)中上转换纳米材料中掺杂稀土元素Yb,Er,Gd摩尔百分比分别为25～30mol％,0.3～1mol％,30～35mol％。
[0013] 作为优选，所述步骤(2)中包裹无定形二氧化硅的方法如下：向步骤(1)获得的反应液中加入正硅酸乙酯(TEOS)搅拌36～48小时，TEOS与反应液的体积比为1：20～1：25。
[0014] 作为优选，所述步骤(2)中在无定形二氧化硅表面修饰介孔二氧化硅的方法如下：继续加入TEOS和C18TMS，分别用于二氧化硅层制备和造孔剂，通过控制TEOS的量可自行控制二氧化硅层的厚度。
[0015] 作为优选，所述步骤(3)中使用MC540光敏剂，在980nm近红外光激发作用下吸收上转换纳米颗粒转换的绿光；或使用ZnPc光敏剂，在980nm近红外光激发作用下吸收上转换纳米颗粒转换的红光。
[0016] 所述步骤(4)中使用叶酸功能化上转换纳米颗粒，可以靶向定位宫颈癌细胞表面的叶酸受体。
[0018] 所述上转换纳米材料通过表面修饰在纳米颗粒外包裹硅层，将其疏水基团转化为亲水基团，硅烷试剂所带配体的化学基团与生物分子共价偶联。采用SiO2包裹法进行表面修饰。
[0019] 所述的上转换纳米材料最外层的介孔结构，具有很大的比表面积，通过加载叶酸，可以靶向识别大部分肿瘤细胞，并内化聚集在肿瘤处。
[0020] 本发明的上转换纳米材料具有较好的分散性和亲水性，用纳米颗粒孵育肿瘤细胞进行体外实验效果良好。
[0021] 本发明的上转换纳米材料具有较强的转换效率，将980nm近红外转换为明亮的绿光，肉眼可见光的颜色受颗粒颜色影响。
[0022] 本发明的上转换纳米材料具有一定的医疗价值，可以广泛靶向识别大部分肿瘤细胞，具有较强的发光转换效率，可用于体内杀灭肿瘤细胞，还可以应用于如：生物检测，药物治疗，CT、MRI等标记，具有广泛的应用前景。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：
[0024] (1)发光转换效率高；热分解法制备上转换纳米材料，在现有技术的基础上，进行一系列实验方案的优化。制备出发光强度较高的上转换纳米材料，保证了后续光敏剂作用下光动力学杀灭肿瘤细胞。
[0025] (2)靶向定位能力强；由于该材料上修饰了亲水性强的硅层，且最外层为介孔二氧化硅结构，因此可以在表面通过成键连接叶酸，并且搭载光敏剂，使材料功能化，靶向肿瘤并杀灭肿瘤细胞。
[0026] (3)具有良好的分散性；良好的分散性保证了在表面修饰的过程中每一个纳米颗粒都分别被硅层包裹及功能化，便于被肿瘤细胞内化吸收，具有更大的比表面积。
[0027] (4)成本较低廉，环保无污染；使用到的材料都为可商业化、大规模生产的原料，未使用到其它有毒有害的化学试剂。
[0028] (5)细胞毒性弱：上转换纳米材料对细胞的毒性很小，几乎不会影响正常细胞的活性。
[0030] 图1(a)为UCNPs的TEM图像；
[0031] 图1(b)为UCNPs@无定形SiO2的TEM图像；
[0032] 图1(c)为UCNPS@介孔SiO2的TEM图像。
[0034] 图3(a)和图3(b)为宫颈癌细胞对照组的暗场明场对比图；
[0035] 图3(c)和图3(d)为UCNPs@SiO2孵育的宫颈癌细胞的暗场明场对比图；
[0036] 图3(e)和图3(f)为UCNPs@SiO2@FA孵育的宫颈癌细胞的暗场明场对比图；
[0037] 图3(g)和图3(h)为UCNPs@SiO2@MC540孵育的宫颈癌细胞的暗场明场对比图；
[0038] 图3(i)和图3(j)为UCNPs@SiO2@FA@MC540孵育的宫颈癌细胞的暗场明场对比图；
[0039] 图4(a)为UCNPs@SiO2@FA@MC540孵育宫颈癌细胞活细胞染色图；
[0040] 图4(b)为UCNPs@SiO2@FA@MC540孵育宫颈癌细胞死细胞染色图；
[0041] 图4(c)为UCNPs@SiO2@FA@MC540孵育宫颈癌细胞死活细胞染色合成图；
[0042] 图5(a)为宫颈癌细胞活细胞染色图；
[0043] 图5(b)为UCNPs@SiO2孵育的宫颈癌细胞活细胞染色图；
[0044] 图5(c)为UCNPs@SiO2@FA孵育的宫颈癌细胞活细胞染色图；
[0045] 图5(d)为UCNPs@SiO2@MC540孵育的宫颈癌细胞活细胞染色图。
具体实施方式
[0046] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
[0047] 实施例1：
[0048] (1)在圆底烧瓶里加入3mL油酸和15mL1-十八烯，搅拌。在氮气环境中将混合物加热到70℃。混合397μL YCl3，300μL YbCl3，30μL ErCl3，300μL GdCl3制备NaYF4:Yb/Er/Gd(30,0.3,30mol％)溶液。将该溶液加入到反应液中，并加热到150℃，保温30min后，得到澄澈均匀的溶液。
[0049] (2)将步骤(1)中的反应液冷却到65℃，逐滴加入10mL含有0.1g NaOH和0.148g NH4F的甲醇溶液。将反应液升温到110℃保温20min。连接冷凝管和活塞，将三口瓶密封，抽真空10min。反复三次交叉抽真空和充满氮气，每次持续一分钟。
[0052] (5)用20ml环己烷将沉淀物涡旋溶解，在室温下以1000g的离心力离心5min。将有上转换纳米颗粒的上清液(UCNPs溶液)保存在5mL玻璃瓶里。
[0053] 由步骤(1)至步骤(5)可得到粒径分布在25～50nm的上转换纳米颗粒，如图1(a)所示。该上转换纳米材料在980nm近红外光激发下可发出明亮的绿光。
[0054] (6)将21mL环己烷、1.5mL IGEPAL CO-520、2mLUCNPs溶液加入到50ml单口瓶中，逐滴加入211μL质量分数25％的氨水，搅拌30min后逐滴加入80μL的TEOS，搅拌48小时，实验反应过程中搅拌速度保持在750r/min。
[0055] (7)将步骤(6)中的反应液分别装到两个离心管里。用20mL无水乙醇冲洗三口瓶，分别转移到两离心管里。涡旋和离心1min后，各加入10mL丙酮，涡旋30s。在室温下以5200g的离心力离心20min，之后去掉上清液。每个离心管中加入10mL乙醇，涡旋并超声10min。将两个离心管中的溶液倒入一只离心管中，加入15mL丙酮。在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液，用15mL乙醇和15mL去离子水再分散沉淀，涡旋并超声10min。
[0056] (8)在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液，用20mL去离子水再分散沉淀，涡旋并超声20min，将均匀的溶液储存在20mL玻璃瓶里。
[0057] 由步骤(6)到步骤(8)可得到无定形二氧化硅层包裹的上转换纳米颗粒，其平均粒径约为70nm，如图1(b)所示。
[0058] (9)取8mL步骤(8)制备的材料加入50mL离心管里，在室温下以8000g的离心力离心20min。之后，倒掉上清液。用20mL乙醇再分散沉淀，涡旋并超声10min，得到分散均匀性好的溶液。
[0059] (10)将步骤(9)中溶液转移到50mL单口圆底烧瓶中，向烧瓶中加入1.716mL的质量分数25％的氨水以及6.5mL乙醇、130μL TEOS和52μL C18TMS的混合溶液。实验反应过程中搅拌速度保持在750r/min。在室温下搅拌6小时。
[0060] (11)将步骤(10)中反应液分别转移到两个离心管中，在室温下以4000g的离心力离心20min。之后倒掉上清液，用10mL乙醇再分散每只离心管中的纳米颗粒沉淀。在室温下以5200g的离心力离心20min。之后倒掉上清液。
[0063] 由步骤(9)到步骤(13)可得到介孔二氧化硅层包裹的上转换纳米颗粒，颗粒孔隙度和分散性均良好，平均粒径为100nm，如图1(c)所示。本实施例在包裹介孔二氧化硅层前先进行无定形二氧化硅层，为的是使每一个纳米颗粒都分别被硅层包裹，使纳米颗粒具有亲水性，便于被肿瘤细胞内化吸收，具有更大的比表面积。
[0064] (14)将步骤(13)制备得到的纳米颗粒加入12mL乙醇溶液中，涡旋超声30min。在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液，将纳米颗粒再次均匀分散在3mL DMSO中，超声3min,得到混合均匀的溶液。
[0065] (15)取1mg叶酸和3mL DMSO加入20mL玻璃瓶中。以750r/min的速度搅拌。搅拌过程中加入5μL的APTES，1.1mg的NHS和1.6mg的EDC。在室温下搅拌两个小时。将含有纳米颗粒的溶液缓慢加入步骤(14)中混合均匀的溶液，在室温下持续搅拌反应并过夜。
[0066] (16)将反应混合物倒入50ml的离心管中，在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液。将纳米颗粒再分散到12ml的DMSO溶液中，涡旋超声10min。在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液。重复上述操作，将DMSO溶液换为乙醇溶液。由于叶酸作用使得整体颗粒颜色为黄色，目测激光下的颜色将会由绿色转换为黄绿色或者黄色。
[0067] 由步骤(14)到步骤(16)可得到叶酸修饰后的纳米颗粒，叶酸对肿瘤细胞具有广谱靶向性，可靶向识别肿瘤细胞。
[0068] (17)在20mg介孔二氧化硅包裹的上转换纳米颗粒内加入4mL吡啶，超声分散纳米颗粒，得到均匀溶液。将纳米微粒悬浮液均匀地转移到4个具有圆形底座的2-mL微离心管中。在室温下，以5200g的离心力将纳米颗粒离心。
[0069] (18)在步骤(17)中得到的每个微离心管中，加入222μL的吡啶、422μL的MC540。将纳米颗粒分散在超声波水浴中30分钟，以增加其单分散性，同时去除在多孔硅壳内的气泡。在室温下，将反应液放置在阴凉处24h。
[0070] (19)将步骤(18)中反应液以5200g的离心力离心20分钟分离纳米颗粒。从每根离心管中小心取出900μL上清液。在剩余光敏剂溶液中，通过旋涡分散开纳米颗粒。将纳米颗粒放入70℃烘箱中烘干，并过夜。在室温下将干燥的纳米颗粒储存在阴暗处。
[0071] (20)在环境照明和980-nm激光激励下，光敏剂加载UCNPs的颜色分别出现预期结果。
[0072] 由步骤(17)到步骤(20)可得到光敏剂MC540修饰的纳米颗粒，在980nm近红外光激发下可以吸收大量的绿光，产生大量活性氧。(21)取同一批次宫颈癌细胞(Hela细胞)分别进行对照组和实验组实验。实验组分为四组，分别是1)未经叶酸和光敏剂修饰的纳米颗粒(白色粉末状)；2)叶酸功能化后的纳米颗粒；3)光敏剂修饰后的纳米颗粒；4)叶酸+光敏剂修饰后的纳米颗粒。
[0073] 四种不同的纳米颗粒的荧光光谱图如图2所示。加载光敏剂MC540后，纳米颗粒在绿光区域的荧光强度大幅度降低，其红光区域的荧光强度也受到影响。
[0074] 用25μL上述纳米颗粒孵育宫颈癌细胞。对照组细胞中添加等量培养基孵育。在明暗场下分别观察其细胞状态，结果如图3(a)-图3(j)所示，同时加载了叶酸和光敏剂MC540的纳米颗粒具有良好的靶向性。用加载了叶酸和光敏剂MC540孵育宫颈癌细胞，用980nm近红外光分别照射1min，进行活死细胞染色实验，实验结果如图4(a)-图4(c)所示，在980nm近红外光激发下宫颈癌细胞大量死亡，其死亡率高于90％。其他纳米颗粒孵育的宫颈癌细胞，其细胞存活率较高，如图5(a)-图5(d)所示。上述细胞实验证实了修饰了叶酸和光敏剂MC540的上转换纳米材料具有良好的肿瘤细胞靶向及杀灭能力。
[0075] 实施例2：
[0076] 步骤(1)到步骤(5)同实施例1。
[0077] (6)将21mL环己烷、1.5mL IGEPAL CO-520、2mL UCNPs溶液加入到50ml单口瓶中，逐滴加入211μL质量分数25％的氨水，搅拌30min后逐滴加入100μL的TEOS，搅拌36小时，实验反应过程中搅拌速度保持在750r/min。
[0078] (7)将步骤(6)中的反应液分别装到两个离心管里。用20mL无水乙醇冲洗三口瓶，分别转移到两离心管里。涡旋和离心1min后，各加入10mL丙酮，涡旋30s。在室温下以5200g的离心力离心20min，之后去掉上清液。每个离心管中加入10mL乙醇，涡旋并超声10min。将两个离心管中的溶液倒入一只离心管中，加入15mL丙酮。在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液，用15mL乙醇和15mL去离子水再分散沉淀，涡旋并超声10min。
[0079] (8)在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液，用20mL去离子水再分散沉淀，涡旋并超声20min，将均匀的溶液储存在20mL玻璃瓶里。
[0080] 步骤(9)到(21)同实施例1。
[0081] 实施例3：
[0082] (1)在圆底烧瓶里加入3mL油酸和15mL1-十八烯，搅拌。在氮气环境中将混合物加热到70℃。混合390μL YCl3，250μL YbCl3，100μL ErCl3，350μL GdCl3制备NaYF4:Yb/Er/Gd(25,1,35mol％)溶液。将该溶液加入到反应液中，并加热混合物到150℃，保温30min后，得到澄澈均匀的溶液。
[0083] (2)将步骤(1)中的反应液冷却到65℃，逐滴加入10mL含有0.1g NaOH和0.148g NH4F的甲醇溶液。将反应液升温到110℃保温20min。连接冷凝管和活塞，将三口瓶密封，抽真空10min。反复三次交叉抽真空和充满氮气，每次持续一分钟。
[0084] (3)使氮气充满密闭空间，以10℃/min的速度升温到300℃，并保持这个温度1.5h。反应结束后在空气中逐渐冷却到室温20～35℃。
[0085] (4)将步骤(3)中的反应液转移到两个50mL离心管中。用丙酮定容液体至40mL。在室温下以6660g的离心力离心10min。
[0086] (5)用20ml环己烷将沉淀物涡旋溶解，在室温下以1000g的离心力离心5min。将有上转换纳米颗粒的上清液保存在5mL玻璃瓶里。
[0087] 步骤(6)到步骤(21)同实施例1。
[0088] 实施例4：
[0089] 步骤(1)到步骤(5)同实施例1。本实施例通过步骤(1)到步骤(5)制备的纳米颗粒未包裹无定形硅层，虽然不影响后续的材料表面修饰，但是会提高介孔二氧化硅层包裹的上转换纳米颗粒的难度。
[0090] (6)将(5)中得到的环己烷溶液分别转移到两离心管里，各加入10mL丙酮，涡旋30s。在室温下以5200g的离心力离心20min，之后去掉上清液。每个离心管中加入10mL乙醇，涡旋并超声10min。将两个离心管中的溶液倒入一只离心管中，加入15mL丙酮。在室温下以
5200g的离心力离心20min。倒掉上清液，用15mL乙醇和15mL去离子水再分散沉淀，涡旋并超声10min。
5200g的离心力离心20min。倒掉上清液，用15mL乙醇和15mL去离子水再分散沉淀，涡旋并超声10min。
[0091] (7)在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液，用20mL去离子水再分散沉淀，涡旋并超声20min，将均匀的溶液储存在20mL玻璃瓶里。
[0092] (8)取8mL制备的材料加入50mL离心管里，在室温下以8000g的离心力离心20min。之后，倒掉上清液。用20mL乙醇再分散沉淀，涡旋并超声10min，得到分散均匀性好的溶液。
[0093] (9)将(8)中溶液转移到50mL单口圆底烧瓶中，向烧瓶中加入1.716mL的质量分数25％的氨水以及6.5mL乙醇、130μL TEOS和52μL C18TMS的混合溶液。实验反应过程中搅拌速度保持在750r/min。在室温下搅拌6小时。
[0094] (10)将(9)中反应液分别转移到两个离心管中，在室温下以4000g的离心力离心20min。之后倒掉上清液，用10mL乙醇再分散每只离心管中的纳米颗粒沉淀。在室温下以
5200g的离心力离心20min。之后倒掉上清液。
5200g的离心力离心20min。之后倒掉上清液。
[0095] (11)将(10)中的沉淀用2mL的乙醇再分散，将纳米颗粒转移到坩埚里，再用1mL的乙醇冲洗离心管并将溶液转移到坩埚里。将坩埚盖子微微打开，放置坩埚在70℃下过夜。
[0096] (12)将(11)中干燥的纳米颗粒放到马弗炉里，温度500℃下放置6h，去除掉多余的C18TMS。关掉马弗炉，空冷到室温，用玛瑙研磨棒研磨纳米颗粒。最后大约得到8mg的纳米颗粒。
[0097] (13)将上述纳米材料加入12mL乙醇溶液中，涡旋超声30min。在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液，将纳米颗粒再次均匀分散在3mL DMSO中，超声3min,得到混合均匀的溶液。
[0098] (14)取1mg叶酸和3mL DMSO加入20mL玻璃瓶中。以750r/min的速度搅拌。搅拌过程中加入5μL的APTES，1.1mg的NHS和1.6mg的EDC。在室温下搅拌两个小时。将含有纳米颗粒的溶液缓慢加入(14)中混合均匀的溶液，在室温下持续搅拌反应并过夜。
[0099] (15)将反应混合物倒入50ml的离心管中，在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液。将纳米颗粒再分散到12ml的DMSO溶液中，涡旋超声10min。在室温下以5200g的离心力离心20min。倒掉上清液。重复上述操作，将DMSO溶液换为乙醇溶液。由于叶酸作用使得整体颗粒颜色为黄色，目测激光下的颜色将会由绿色转换为黄绿色或者黄色。
[0100] (16)在20mg介孔二氧化硅包裹的上转换纳米颗粒内加入4mL吡啶，超声分散纳米颗粒，得到均匀溶液。将纳米微粒悬浮液均匀地转移到4个具有圆形底座的2-mL微离心管中。在室温下，以5200g的离心力将纳米颗粒离心。
[0101] (17)在(16)中得到的每个微离心管中，加入222μL的吡啶、422μL的MC540。将纳米颗粒分散在超声波水浴中30分钟，以增加其单分散性，同时去除在多孔硅壳内的气泡。在室温下，将反应液放置在阴凉处24h。
[0102] (18)将(17)中反应液以5200g的离心力离心20分钟分离纳米颗粒。从每根离心管中小心取出900μL上清液。在剩余光敏剂溶液中，通过旋涡分散开纳米颗粒。将纳米颗粒放入70℃烘箱中烘干，并过夜。在室温下将干燥的纳米颗粒储存在阴暗处。
[0103] (19)在环境照明和980-nm激光激励下，光敏剂加载UCNPs的颜色分别出现预期结果。
[0104] (20)取同一批次宫颈癌细胞(Hela细胞)分别进行对照组和实验组实验。实验组分为四组，分别是(1)未经叶酸和光敏剂修饰的纳米颗粒(白色粉末状)；(2)叶酸功能化后的纳米颗粒；(3)光敏剂修饰后的纳米颗粒；(4)叶酸+光敏剂修饰后的纳米颗粒。用25μL上述纳米颗粒进行孵育。对照组细胞中添加等量培养基孵育。用980nm近红外光分别照射1min，观察其细胞状态。
[0105] 实施例5：
[0106] 步骤(1)到步骤(16)同实施例1。
[0107] (17)在20mg介孔二氧化硅包裹的上转换纳米颗粒内加入4mL吡啶，超声分散纳米颗粒，得到均匀溶液。将纳米微粒悬浮液均匀地转移到4个具有圆形底座的2-mL微离心管中。在室温下，以5200g的离心力将纳米颗粒离心。
[0108] (18)在(17)中得到的每个微离心管中，加入222μL的吡啶、422μL的ZnPc。将纳米颗粒分散在超声波水浴中30分钟，以增加其单分散性，同时去除在多孔硅壳内的气泡。在室温下，将反应液放置在阴凉处24h。
[0109] (19)将(18)中反应液以5200g的离心力离心20分钟分离纳米颗粒。从每根离心管中小心取出900μL上清液。在剩余光敏剂溶液中，通过旋涡分散开纳米颗粒。将纳米颗粒放入70℃烘箱中烘干，并过夜。在室温下将干燥的纳米颗粒储存在阴暗处。
[0110] (20)在环境照明和980-nm激光激励下，光敏剂加载UCNPs的颜色分别出现预期结果。
[0111] (21)取同一批次宫颈癌细胞(Hela细胞)分别进行对照组和实验组实验。实验组分为四组，分别是1)未经叶酸和光敏剂修饰的纳米颗粒(白色粉末状)；2)叶酸功能化后的纳米颗粒；3)光敏剂修饰后的纳米颗粒；4)叶酸+光敏剂修饰后的纳米颗粒。用25μL上述纳米颗粒进行孵育。对照组细胞中添加等量培养基孵育。用980nm近红外光分别照射1min，观察其细胞状态。
[0112] 由此，本发明工艺简单，热分解法制备上转换纳米材料，在现有技术的基础上，进行一系列实验方案的优化。制备出发光强度较高的上转换纳米材料，保证了后续光敏剂作用下光动力学杀灭肿瘤细胞。该材料上修饰了亲水性强的硅层，且最外层为介孔二氧化硅结构，因此可以在表面连接叶酸并且搭载光敏剂，使材料功能化。上转换纳米材料对细胞的毒性很小，几乎不会影响正常细胞的活性。除了用于体内杀灭肿瘤细胞，还可以应用于如：生物检测，药物治疗，CT、MRI等标记。
[0113] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
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