一种全人源抗TNF-α单克隆抗体及其应用
阅读：844发布：2023-01-22
专利汇可以提供一种全人源抗TNF-α单克隆抗体及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，具体的涉及一种全人源抗TNF?α单克隆 抗体 ，重链可变区具有SEQ ID NO：1所示 氨 基酸序列或与其具有至少98％的同源性的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列或与其具有至少98％的同源性的氨基酸序列。另外本发明也公开了一种上述新型全人源抗TNF?α单克隆抗体的DNA序列，重链可变区核苷酸编码为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，轻链可变区核苷酸编码为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。本发明公开了人源抗TNF?α单克隆抗体在制备 治疗 自身免疫性 疾病 药物中的应用前景。，下面是一种全人源抗TNF-α单克隆抗体及其应用专利的具体信息内容。
1.一种全人源抗TNF-α单克隆抗体，其特征在于，重链可变区具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或与其具有至少98％的同源性的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列或与其具有至少98％的同源性的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的新型全人源抗TNF-α单克隆抗体，其特征在于，重链为SEQ ID NO：5所示氨基酸序列，轻链为SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。
3.编码权利要求1所述的新型全人源抗TNF-α单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，重链可变区核苷酸编码为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，轻链可变区核苷酸编码为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
4.编码权利要求2所述的新型全人源抗TNF-α单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，重链核苷酸编码为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，轻链核苷酸编码为SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列。
5.含有权利要求3或4所述的DNA序列的表达载体，其为原核或真核表达载体。
6.含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞，其为真核细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，所述的宿主细胞为中国仓鼠的卵巢细胞CHO、幼仓鼠的肾脏细胞BHK、猴的肾脏细胞COS细胞、人的胚肾细胞HEK-293、人的子宫颈癌细胞HELA。
8.权利要求1所述人源抗TNF-α单克隆抗体在制备治疗自身免疫性疾病药物中的用途，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病。
一种全人源抗TNF-α单克隆抗体及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)是一类具有广泛生物学活性的细胞因子，主要由单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、B细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞等免疫细胞产生。体内TNF-α蛋白有跨膜型TNF-α和分泌型TNF-α。跨膜TNF-α全长233个氨基酸，其中1-76位氨基酸是信号肽(包括跨膜氨基酸)，77-233氨基酸是胞外段。第77-233个氨基酸也是分泌型TNF-α的氨基酸序列，其大小为17KD(Smith，et al.，J.Biol.Chem.262：6951-6954，1987)，以三聚体形式与细胞表面的TNF受体(TNFR)结合，介导多种生物学效应。TNF-α作用于瘤细胞表面的受体，通过对细胞的识别、结合、内吞进入溶酶体，致溶酶体和蛋白酶类高度活化导致细胞死亡，它在免疫反应、炎症和损伤反应中起重要作用，主要影响细胞增殖和细胞凋亡的调节，不仅对肿瘤细胞有细胞毒性、细胞溶解、诱导细胞凋亡、抑制增殖等作用，还能够促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化，提高中性粒细胞的吞噬能力。
[0003] 鼠源单抗作为治疗药物存在很多缺陷，由于人体具有强烈的免疫原性，体内消除快，半衰期短，导致临床疗效有限，副作用大。为克服在人体使用鼠抗体产生的问题，对鼠抗体进行遗传工程改造人源化，例如人鼠嵌合抗TNF-α单抗(Infliximab)是利用基因工程制备获得的，其可变区仍取自鼠源TNF-α单抗，保留了与肿瘤坏死因子可溶性片段和跨膜区结合的特异性和亲和力，恒定区被人IgG1的恒定区所取代，体内半衰期大大延长。然而这些嵌合抗体和人源化抗体仍然可能引起不想要的免疫反应，特别是当长期给药时。2002年12月Abbott公司的Humira成为第一个获准用于减轻成人中到重度活动期类风湿性关节炎(RA)的病征和症状及抑制关节结构损伤进展的全人单克隆抗体。由于是全人抗体，避免了会产生免疫反应的缺点。
[0004] 自身免疫性疾病是继癌症和心血管疾病的第三大类疾病。RA是最常见的自身免疫病之一，我国类风湿关节炎患病率约为0.32-0.36％，在60岁以上人群发病率高达30％～40％。面对每人每年昂贵进口药物治疗费用，患者往往只能长期忍受痛苦的化学治疗。进口抗体药物虽已进入中国市场，但其昂贵的价格使患者难以接受，因此，迫切需要国产抗体药物的开发上市。
[0005] 为试图克服使用非人源抗体及人源化抗体造成的相关问题，通过构建的全人抗体来降低人抗鼠抗体(HAMA)引发的机体免疫原性，已成为较为有效的治疗策略。当前形势下，在国内，本领域迫切需要建立既能够保持或提高抗体特异性，又能够降低或消除抗体免疫原性的抗TNF-α单抗，从而可以用于临床治疗RA和获得性免疫缺乏综合症(AIDS)等。因此，本发明提供了一种安全可靠的，在人体内半衰期更长、功能显著的人源抗体。
发明内容
[0006] 本发明公开了一种全人源抗TNF-α单克隆抗体，包括重链可变区与轻链可变区，其重链可变区(VH)具有SEQ ID NO：1氨基酸序列，其轻链可变区(VL)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列。
[0007] 本发明公开了一种全人源抗TNF-α单克隆抗体，包括重链与轻链，其重链(H)为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，其轻链(L)为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
[0008] 本发明还公开了一种核苷酸序列，编码上述的全人源抗TNF-α单克隆抗体。
[0009] 本发明公开了上述核苷酸序列，包括重链可变区与轻链可变区，其中编码全人源抗TNF-α单克隆抗体重链可变区的为SEQ ID NO：3核苷酸序列，编码全人源抗TNF-α单克隆抗体轻链可变区的为SEQ ID NO：4核苷酸序列。
[0010] 本发明公开了上述核苷酸序列，其中编码全人源抗TNF-α抗体重链的为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，编码全人源抗TNF-α抗体轻链的为SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
[0011] 本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括免疫活性的抗体片段，如：Fab(antigen-binding fragment),片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的ScFv(single chain Fv)分子。
[0012] 本发明公开了一种遗传工程化的宿主细胞，它被含有编码所述抗人TNF-α单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸的载体所转化或转导。所述宿主细胞为真核细胞，具体可以是：中国仓鼠的卵巢细胞CHO、猴的肾脏细胞COS细胞、人的胚肾细胞HEK-293、人的子宫颈癌细胞HELA等。
[0014] 图1是一曲线图，描述与阿达木单抗相比，由全人源抗TNF-α抗体HE03(本发明中所制备的抗体)抑制TNF-α与U-937细胞表面受体的结合实验。
[0015] 图2是一柱状图表，描述与阿达木单抗相比，通过给与人抗TNF-α抗体HE03保护D-半乳糖胺致敏小鼠免受TNF-a诱导的致死性。
具体实施方式
[0016] 下面结合具体实施例，进一步阐述本说明。以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0017] 实施例方案中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。实施方案中所使用的阿达木抗体即adalimumab单抗，购自Abbott公司；放线菌素D购买于华美生物工程有限公司；cDNA反转录试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；Trizol试剂购于Invitrogen公司；大肠杆菌TG1购自Amersham公司；Sfi I和NOT I双酶切购买于大连宝生物工程有限公司；ScFv基因文库和噬菌粒载体pCANTAB-5E购自瑞典Amersham pharmacia公司；重组人TNF-α(rhTNF-α)抗原购自深圳晶美公司；淋巴细胞分离液为天津血液研究所生产。
[0018] 一、人源性单链抗体库的构建：
[0019] (1)cDNA的制备
[0020] 收集100名健康人外周血各10ml，混合，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞。用Trizol试剂从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA，用cDNA反转录试剂盒反转录出cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。
[0021] (2)抗体文库的构建
[0022] 引物设计，参考文献(Immunotechnology，1998，3：271-278)设计并合成克隆人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的VHBack，VHFor，VLBack和VLFor引物。VHBack，VHFor，VLBack和VLFor的序列见Immunotechnology，1998，3：271-278。其中在VHBack引物的5’端加上含有Sfi I位点的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在VHFor引物的5’端加上序列gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc，在VLBack引物的5’端加上序列tccggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct，在VLFor引物的5’端加上含有Not I位点的序列atg cgg ccg c(引物均由英潍捷基公司进行合成)。
[0023] 参照上述引物，从cDNA第一链中扩增重链可变区和轻链可变区基因；制备ScFv接头DNA；用ScFv接头PCR装配VH和VL进行ScFv基因文库的构建；再扩增ScFv基因文库以添加限制性位点进行克隆；对ScFv基因文库和噬菌粒载体pCANTAB-5E同时进行Sfi I和NOT I双酶切；ScFv和载体DNA的连接；连接物电转化大肠杆菌TG1。然后将细胞培养于SOB-AG(含有100mg/l氨苄青霉素和2％葡萄糖的SOB培养基)琼脂板上，培养温度30℃。通过反复100次电转化，使所获抗体库的容量达到1x1010。
[0024] (3)制备用于抗原上选择的噬菌体抗体
[0025] 取部分噬菌体文库菌液用2×YT(含100μg/mL氨苄和2％葡萄糖)稀释，37℃震荡培养2小时；按照辅助噬菌体与细菌之比为10:1的比例加入辅助噬菌体M13KO7进行感染1小时；然后以3000r/分钟离心细菌培养液，弃上清。将细菌沉淀用2×YT(含100μg/mL氨苄和50μg/L卡那霉素)培养基重悬后，37℃震荡过夜；将过夜菌离心30分钟后取上清，加入0.2倍体积预冷的PEG/NaCl(20％PEG 8000/2.5M NaCl)溶液沉淀噬菌体，冰浴1小时；离心15分钟，弃上清，以无菌的PBS重悬沉淀，再次加入0.2体积的PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，冰浴1小时后；离心15分钟，以适量无菌的1/10体积的PBS溶解沉淀，4℃储存备用。二、抗体库的淘选及阳性克隆鉴定：
[0026] 对于实施例1得到的噬菌体展示文库中的抗体，通过淘选技术选择高亲和力抗体。
[0027] (1)噬菌体抗体库的富集筛选
[0028] 用rhTNF-α抗原包被培养板在4℃下过夜；取出包被板，用PBS洗涤3次，用含10％脱脂奶粉的PBS封闭液室温封闭2小时；倒掉液体，PBS洗涤3次，加噬菌体抗体库，37℃培养2小时；倒空，用PBS(含0.05％Tween 20)洗涤5次，用PBS洗5次(第2轮各洗涤10次，第3轮各洗涤20次，并洗涤时间也增加)；倒空，加入100mM三乙胺(pH＝12)，在室温洗脱噬菌体颗粒10分钟后加入1M Tris(pH＝7.4)混匀中和，转移到15mL管中；用正处于对数生长期的E.coli TG1(OD600＝0.4)和洗脱的噬菌体混合，37℃水浴中静置30分钟。取200μL感染了噬菌体的细菌进行单位体积中的细菌群落总数(cfu)的测定，其余的细菌离心沉淀，用2×YT(含100μg/mL氨苄和2％葡萄糖)重悬，涂布于平板上，放37℃培养过夜，制备噬菌体用于下一轮筛洗，共进行3轮筛选。
[0029] (2)ELISA法鉴定阳性克隆
[0030] 将分离较好的菌落接种，培养过夜。用rhTNF-α抗原包被96孔酶联板4℃过夜；次日取20μl的过夜培养物接种至96孔酶联板中，培养至OD600＝0.5左右，离心沉淀，弃上清，各孔加200μL 2×YT(含终浓度1mM的异丙基硫代半乳糖苷，37℃，250rpm诱导3小时；将诱导产物离心15分钟，收集上清备用；将包被好的酶联板用PBS洗三遍，每孔各加300μL封闭液，室温封闭2小时；将封闭好的酶联板用PBS洗三遍，每孔各加100μL封闭缓冲液，再往各孔各加100μL诱导上清液(含分泌的ScFv)混匀，37℃水浴下结合水浴结合1小时；配Anti-E-Tag抗体(以1:1000的比例稀释于封闭缓冲液中)，用PBS洗三遍后，加100μL稀释好的Anti-E-Tag抗体在37℃水浴结合1小时，PBS洗三遍，加稀释好的辣根过氧化物酶标记的抗体100μL，37℃水浴1小时；PBS洗3遍，加(OPD)显色液，闭光显色30分钟。加入2M H2SO4终止反应，酶标仪测其OD490值。
[0031] (3)阳性克隆的DNA序列测定分析
[0032] 挑选ELISA检测的阳性克隆ELISA值较高的独立克隆送往上海生工生物工程有限公司进行测序分析。
[0033] 经3次淘选抗体库后获得了一株抗人TNF-α单链抗体ScFv，测序后获得其基因序列。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：1分别显示了ScFv重链可变区VH的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：2分别显示了ScFv轻链可变区VL的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0034] 三、抗人TNF-α重链真核表达载体和抗人TNF-α轻链真核表达载体的构建：
[0035] (1)全基因合成
[0036] 根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(NucleicAcids Research，1982，10：4071-4079)报道的序列，SEQ ID NO：9显示了重链恒定区(CH)的氨基酸序列。SEQ ID NO：10显示了轻链恒定区(CL)的氨基酸序列；抗体库筛选得到的人源抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列和轻链可变区(VL)氨基酸序列，通过VH+CH组合成完整的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：5)，VL+CL组合成完整的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，全人源抗体完整重链、完整轻链基因，各在5′端添加KOZAK序列(GCCGCCACC)、起始密码子、信号肽基因序列，在3′端含有2个翻译终止密码子。信号肽氨基酸序列为SEQ ID NO：11：MEFGLSWLFLVAILKGVQC(参考阿达木专利，WO_2007_014162_A2)，跟据上述的组合氨基酸序列，进行碱基密码子优化后，全基因合成上述两条基因片段(由上海英潍捷基公司合成)。优化后的重链组合片段的核苷酸碱基序列为SEQ ID NO：7；优化后的轻链组合片段的核苷酸碱基序列为SEQ ID NO：8；
[0037] (2)表达载体的构建
[0038] 将上述两条基因片段按说明书步骤通过 TA Cloning Kit(Invitrogen，Catalog no.K8300-01)和 TA Vector Kit(Invitrogen，
Catalog no.12744-017)分别进行TA克隆，重链组合片段TA克隆到
vector，轻链组合片段TA克隆到 Vector，成功构建重链表达载体和轻链
表达载体。
Catalog no.12744-017)分别进行TA克隆，重链组合片段TA克隆到
vector，轻链组合片段TA克隆到 Vector，成功构建重链表达载体和轻链
表达载体。
[0039] 四、抗人TNF-α完整抗体的表达：
[0040] 将上述已构建的重组表达载体质粒共转染转入哺乳动物宿主细胞系，以表达抗hTNF-α全人源抗体。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(参见，例如Chasin，L.等人的美国专利4818679号)。优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其他方法，包括磷酸钙共沉降，脂转染和原生质融合等。在电穿孔中，用设为300V电场和900μFd电容的电穿孔仪Gene Pulser(Bio-Rad Laboratories)，
[0041] 在比色杯内加入1.5×107个细胞悬浮在0.8mL的PBS中，并含有40μg用PvuI(购于TakaRa)线性化的表达载体质粒DNA。转染48小时后，对噬菌体库细胞进行遗传霉素(G418)以及氨甲喋呤(methotrexate或MTX)加压筛选，通过多轮不同浓度MTX(100nm，200nm，500nm，1000nm，2000nm，5000nm)加压筛选后，用极限稀释亚克隆转染子，选出高水平表达人源抗体的细胞株，高表达细胞株进行进一步的放大发酵培养，通过纯化得到一定数量的高纯度人源抗TNF-α抗体，命名为HE03，以用于后续抗体特异性及活性的评估等。
[0042] 五、抗人TNF-α单克隆抗体与抗原结合的亲和力：
[0043] 应用Biacore X100测定，Biacore X100动力学/亲和力软件分析，采用间接捕获的方法，通过胺偶联试剂盒把(Amine Coupling Kit)羊抗人IgG Fc抗体偶联在CM5芯片表面作为捕获分子，通过计算分别把HE03和对照阿达木单抗稀释到一定浓度作为配体，把rhTNF-α作为分析物。分析物稀释5个浓度，每个浓度作为一个循环，先用HBS-EP(0.01M HEPES,pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05％(v:v)表面活性剂P20)缓冲液运行3个循环，设计一个分析物浓度为0浓度运行2个循环，最后设计一个重复的分析物浓度运行1个循环。整个过程运行11个循环，每个循环都可绘制一条曲线，通过Biacore X100动力学/亲和力分析软件分析得到所测本发明抗体HE03和对照组阿达木单抗的动力学/亲和力数据，实验重复3次。
[0044] 表1亲和力实验结果
[0045]
[0046]
[0047] 注：Kd(M)为亲和力常数；ka(M-1S-1)为结合常数；Kd(S-1)为解离常数。
[0048] 结果如表1所示，显示所获得的全人源抗体HE03的Kd值显著低于对照组全人源抗体阿达木单抗，说明全人源抗体HE03对TNF-α的亲和力高于对照组阿达木单抗。
[0049] 六、抗体中和TNF-α对L929细胞的杀伤作用研究：
[0050] 人重组TNF-α(rhTNF-α)引起对鼠L929细胞的细胞毒性，如下述通过共温育抗体与rhTNF-α在L929检测中评价本发明抗体HE03中和活性。
[0051] L929细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液(GIBCO)中。对数生长期细胞消化计数后，取200g离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用前述培养液重悬，调整细胞密度至2×105/ml，将细胞加至96孔培养板中，100μl/孔，置37℃，5％CO2培养箱培养过夜。将含有100μl抗体HE03、阳性对照阿达木抗体的96孔板用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基进行2倍梯度连续稀释。加入50μl rhTNF-α使每一个样品孔的最终浓度为500pg/ml。然后将上述板于室温温育30分钟，加入含有1.0μg/ml放线菌素D的50μl培养过夜的L929细胞，调整细胞终浓度为每孔5x104个，设置复孔。在CO2浓度为5％、温度为37℃的培养箱中培养过夜。新鲜配制的非同位素细胞增殖检测试(Promega)，按20μl/孔加入96孔培养板中，并放置于培养箱内继续培养3小时，酶标仪检测490nm处的光吸收，参比波长为630nm。以样品浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，测得IC50值，结果见表2。
[0052] 表2：抗体中和TNF-α对L929细胞的杀伤作用
[0053]
[0054] 实验结果显示，本发明全人源抗TNF-α单克隆抗体HE03拮抗TNF-α介导的L929细胞杀伤作用的IC50相比于对照组阿达木单抗的IC50略低，说明HE03中和TNF-α的能力更强于对照组阿达木单抗。
[0055] 七、抗TNF-α抗体HE03抑制TNF-α与U-937细胞表面受体的结合实验：
[0056] 用表达hTNF-α受体的人组织细胞系U-937细胞系(ATCC NO.CRL1593)检测人抗TNF-α抗体抑制hTNF-α与细胞表面hTNF-α受体结合的能力。取状态良好的U937细胞，细胞活力计数仪计数后以10％胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度至5×105写上单位，将细胞按100μl/管分至流式细胞术检测管中。用PBS将异硫氰酸荧光素(FITC，Amresco)标记的rhTNF-α(为R&D公司产品210-TA-050，使用透析法标记获得)稀释至100ng/ml，用该稀释液分别将全人源抗TNF-α单克隆抗体HE03、阿达木单抗稀释至100μg/ml，并连续2倍梯度稀释，将稀释好的样品及对照品按100μl/管加入流式管中，在4℃避光反应1小时；再用含1％胎牛血清的PBS洗涤细胞2次，每次200g离心5分钟，弃上清，细胞沉淀重悬于300μl含1％胎牛血清的PBS中，流式细胞仪检测每管的荧光强度。以样品浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，测得IC50值，结果见表3和图1。
[0057] 表3：HE03抑制U-937细胞上TNF-α受体结合
[0058]
[0059] 实验结果显示，本发明全人源抗TNF-α单克隆抗体HE03阻断TNF-α与U937细胞表面受体的结合的IC50相比于对照组阿达木单抗阻断TNF-α与U937细胞表面受体的结合的IC50值略低，因此说明本发明单抗HE03中和TNF-α的能力强于对照组阿达木单抗。
[0060] 八、抗TNF-α抗体HE03拮抗TNF-α诱导小鼠的死亡实验：
[0061] 给D-半乳糖胺致敏的小鼠注射rhTNF-α导致在24小时内的致死性，以表明TNF-α中和剂可以在此模式中防止致死性。1μg rhTNF-α及20mg D-半乳糖胺(Amresco)腹腔注射，可诱导80-90％C57BL/6小鼠死亡。为检测人抗TNF-α抗体HE03在此模型中体内中和TNF-α的能力，在本实验例中，对照组同样选用阿达木单抗，先给予一定量的各种抗体进行腹腔注射，30分钟后，再给予1μg rhTNF-α及20mg D-半乳糖胺进行腹腔注射，24小时后观察各种抗体的保护效果。各组注射剂量及结果见下表4和图2。
[0062] 表4：各组小鼠存活率
[0063]
[0064] 以上实验结果显示，本发明中的全人源抗TNF-α单克隆抗体HE03拮抗TNF-α诱导小鼠死亡的效果好于对照组阿达木单抗，因此该抗体在小鼠体内中和TNF-α的能力比阿达木单抗强。
[0065] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
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