miRNA的肿瘤辐射增敏及减弱辐射旁效应作用、实施方法及用途
阅读：813发布：2023-01-31
专利汇可以提供miRNA的肿瘤辐射增敏及减弱辐射旁效应作用、实施方法及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医学技术领域。具体涉及miR214的 辐射 增敏作用，miR495的辐射增敏和减弱辐射旁效应损伤的作用，两者在改善 肿瘤 放疗 治疗 效果治疗中的用途和应用方法。本发明的miRNA可用于作为提高肿瘤临床 放射治疗 效果的辅助药物，尤其miR495既可以提高肿瘤辐射敏感性，还可以减弱旁效应对肝脏的损伤，为制备临床肿瘤放疗辅助药物提供新思路。，下面是miRNA的肿瘤辐射增敏及减弱辐射旁效应作用、实施方法及用途专利的具体信息内容。
1.miR214或miR495在制备用于肿瘤放射治疗中辐射增敏提高放疗效果的药物的用途。
2.miR495在制备用于减弱肿瘤放射治疗中辐射旁效应的药物的用途。
3.权利要求2所述的用途，其中所述的辐射旁效应为肝损伤。
4.权利要求1至3任一项所述的用途，其中所述的miR214或miR495来自人。
5.权利要求1至4任一项所述的用途，其中所述的肿瘤选自肝癌、乳腺癌、宫颈癌或肺癌。
6.权利要求1至5任一项所述的应用，其中所述的miR214具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
7.权利要求1至6任一项所述的应用，其中所述的miR495具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
8.一种用于肿瘤放射治疗中辐射增敏提高放疗效果的药物组合物，所述组合物包含：
(a)有效量的miR214和/或miR495；以及(b)药物上可接受的载体。
9.一种用于减弱肿瘤放射治疗中辐射旁效应的药物组合物，所述组合物包含：(a)有效量的miR495；以及(b)药物上可接受的载体。
10.如权利要求7或8所述的组合物，其特征在于，所述组合物的形式适于直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA注射法、金包被RNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌或复制缺陷腺病毒携带质粒DNA法。
miRNA的肿瘤辐射增敏及减弱辐射旁效应作用、实施方法及
用途
技术领域
背景技术
[0002] 微小RNA(micoRNA，简称miRNA)是一类由内源基因编码的长度为18-24个核苷酸的非编码单链RNA，由一段具有发夹环结构的长度70-80个核苷酸的miRNA前体(pre-miRNA)通过Dicer酶(双链RNA专一的RNA内切酶)剪切后生成的。它们在动植物中参与转录后基因表达调控，可通过与靶mRNA的3'-UTR区近乎完全互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成。关于miRNA最早的报道是1993年Lee、Wightman等在秀丽线虫(C.Elegans)体内发现了可调节线虫生长发育的miRNA—即lin-4【LeeR.C等，The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementary to lin-14.Cell.1993,75:843-854.】。此后，5000多个来自58个不同物种的miRNA被逐渐发现出来【Meltzer PS.Cancer genomics:small RNAs with big impacts.Nature,2005,435(7043):745-46..】，而且每个miRNA都具有相应的基因靶点，从而调控着大约30％蛋白质编码基因的表达，miRNA广泛存在于生物中，在肿瘤、感染性疾病、心血管疾病、免疫、代谢等领域发挥着重要的生物调节作用。
[0003] 肿瘤放射治疗是临床上治疗肿瘤的一种经典方法。近60％的肿瘤患者需要接受放射治疗。电离辐射效应会造成肿瘤细胞DNA损伤，进而诱导细胞凋亡，达到治疗肿瘤的效果。但是由于肿瘤细胞存在一定的辐射抗性，很大程度上影响了肿瘤放射治疗的效果【Josson S,Sung SY,Lao K,et al.Radiation modulation of microRNA in prostate cancer cell lines[J].Prostate,2008,68(15):1599-606.】。肿瘤的放射治疗在临床上应用的另一缺陷是，电离辐射对细胞和组织的损伤是非特异性的，放射医学在肿瘤传统治疗方法中，不仅对肿瘤细胞造成损伤，电离辐射也会使肿瘤附近的正常细胞甚至远端组织细胞发生损伤。这种损伤来源于受照射细胞的组织释放细胞因子(Organization releasing factor,ORF)、肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-a(TNF-α)【Muthusamy V,Piva TJ..UVB-stimulated TNFαrelease from human melanocyte and melanoma cells is mediated by p38 MAPK.Int J Mol Sci..2013,14(8):17029-17054】、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)【Paquette B,Therriault H,Wagner JR.Role of interleukin-1βin radiation-enhancement of MDA-MB-231 breast cancer cell invasion.Radiat Res.2013,180(3):
292-298.】、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、转化生长因子(transforming growth factorβ1，TGF-β1)【Shen L,Li X,Shan B,Zhang L,Gong Y,Dong Z et al.Therapeutic effect of compound of White Peony Root Oral Liquids on radiation-induced esophageal toxicity via the expression of EGF and TGF-β
1.Biomed Rep.2013,1(2):308-314】、活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)【Matsumoto H等.Nitric oxide is a key molecule serving as a bridge between radiation-induced bystander and adaptive responses.Curr Mol Pharmacol.2011，4(2):126-134.】，通过这些信息分子能够传递辐射损伤信号至未直接受到辐射的细胞、组织中，继而诱发的损伤效应。这种现象称为辐射旁效应现象。比如，在肝癌的放射治疗中，肝损伤就是辐射旁效应的一个严重并发症，很多患者在进行放射治疗后都伴有辐射肝损伤，为肿瘤的放射治疗带来了极大的副作用【Maor,Y,al.Liver Injury Induced by Anticancer Chemotherapy and Radiation Therapy.Int J Hepatol.2013:
815105.】。因此，临床肿瘤的放射治疗中，如何提高肿瘤细胞的辐射敏感度，同时降低对非照射正常组织的损伤成为肿瘤放射治疗的关键。
292-298.】、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、转化生长因子(transforming growth factorβ1，TGF-β1)【Shen L,Li X,Shan B,Zhang L,Gong Y,Dong Z et al.Therapeutic effect of compound of White Peony Root Oral Liquids on radiation-induced esophageal toxicity via the expression of EGF and TGF-β
1.Biomed Rep.2013,1(2):308-314】、活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)【Matsumoto H等.Nitric oxide is a key molecule serving as a bridge between radiation-induced bystander and adaptive responses.Curr Mol Pharmacol.2011，4(2):126-134.】，通过这些信息分子能够传递辐射损伤信号至未直接受到辐射的细胞、组织中，继而诱发的损伤效应。这种现象称为辐射旁效应现象。比如，在肝癌的放射治疗中，肝损伤就是辐射旁效应的一个严重并发症，很多患者在进行放射治疗后都伴有辐射肝损伤，为肿瘤的放射治疗带来了极大的副作用【Maor,Y,al.Liver Injury Induced by Anticancer Chemotherapy and Radiation Therapy.Int J Hepatol.2013:
815105.】。因此，临床肿瘤的放射治疗中，如何提高肿瘤细胞的辐射敏感度，同时降低对非照射正常组织的损伤成为肿瘤放射治疗的关键。
[0004] miRNA与肿瘤的关系一直是研究的热点，研究表明miRNA在多种癌症中，如淋巴癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胶质母细胞癌和胃癌等【CalinGA,CroceCM.MicroRNA signatures in human cancers[J].Nat Rev Cancer,2006,6(11):857-66.】异常并参与调控。最近，miRNA在肿瘤辐射敏感性方面的调节作用开始受到关注。细胞的辐射敏感性反映了DNA修复的效率，同时，NHEJ和HRR通路中核心元件的缺失导致了细胞辐射敏感性的细胞表型【Jeggo P，Cellular radiosensitivity：how much better do we understand it？Int J RadiatBiol 2009,85(12)：1061-1081.】，miRNA除参与辐射后DNA损伤应答通路的关键基因进行辐射敏感性调控外，还可以调节肿瘤微环境等外在因素影响辐射敏感性，达到使细胞辐射敏感或辐射抵抗的目的。如神经细胞瘤中，由N-myc介导调控ATM的miR-421异常表达会导致S期细胞周期检查点的变化和增强细胞对辐射的敏感性【Hailiang Hu,a,Liutao Du,a Gindy Nagabayashi,a Robert Cet al.ATM is down-regulated by N-Myc–regulated microRNA-421[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010；107(4):1506–1511.】。miR-101通过靶向DNA双链损伤中重要基因ATM和DNA-PKcs使其表达下调，从而增加肿瘤细胞的辐射敏感性【Chen S,Wang H,Ng WL,et.al.Radiosensitizing effects of ectopic miR-101 on non-small-cell lung cancer dells depend on the endogenous miR-
101level[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys.2011:81(5):1524-9.】。miR-22以ATM依赖方式上调，并抑制PTEN的表达，使得辐射敏感性增加【Tan G,Shi Y,Wu ZH.microRNA-22 promotes cell survival upon UV radiation by repressing PTEN[J].Biochem Biophys Res Commun,2012；417(1):546-51.】。这些提高肿瘤细胞辐射敏感性的miRNA有可能成为提高患者放疗疗效的新靶点。相反，有些miRNA也可以保护细胞，减少辐射所致DNA损伤。如在照射移植有肝癌细胞的裸鼠肿瘤实验中，miR210的下调可以降低细胞对辐射的耐受性【Yang W,Wei J,Sun T,Liu F.Effects of knockdown of miR-210 in combination with ionizing radiation in human endothelial cells[J].Radiat Oncol.2013；8:
102.】。
101level[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys.2011:81(5):1524-9.】。miR-22以ATM依赖方式上调，并抑制PTEN的表达，使得辐射敏感性增加【Tan G,Shi Y,Wu ZH.microRNA-22 promotes cell survival upon UV radiation by repressing PTEN[J].Biochem Biophys Res Commun,2012；417(1):546-51.】。这些提高肿瘤细胞辐射敏感性的miRNA有可能成为提高患者放疗疗效的新靶点。相反，有些miRNA也可以保护细胞，减少辐射所致DNA损伤。如在照射移植有肝癌细胞的裸鼠肿瘤实验中，miR210的下调可以降低细胞对辐射的耐受性【Yang W,Wei J,Sun T,Liu F.Effects of knockdown of miR-210 in combination with ionizing radiation in human endothelial cells[J].Radiat Oncol.2013；8:
102.】。
[0005] 目前，对miR214调节各种肿瘤生物学活性功能的研究比较多，如骨肉瘤【Xu Z,Wang T..miR-214 promotes the proliferation and invasion of osteosarcoma cells through direct suppression of LZTS1.Biochem Biophys Res Commun.2014:449(2):190-5.】、结肠癌肝转移【Chen DL,Wang ZQ,Zeng ZL.et.al.Identification of MicroRNA-214 as a negative regulator of colorectal cancer liver metastasis by way of regulation of fibroblast growth factor receptor
1expression..Hepatology.2014.doi:10.1002/hep.27118.】、鼻咽癌【Zhang ZC,Li YY,Wang HY.Knockdown of miR-214 promotes apoptosis and inhibits cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma[J].PLoS One.2014:9(1):e86149.】、胃癌【Yang TS,Yang XH,Wang XD,et.al.MiR-214 regulate gastric cancer cell proliferation,migration and invasion by targeting PTEN.Cancer Cell Int.2013:
13(1):68.】等。miR495与肿瘤关系也有几篇报道。miR495与多种癌症，如非小细胞肺癌【Chu H1,Chen X,Wang H,et.al.MiR-495 regulates proliferation and migration in NSCLC by targeting MTA3[J].Tumour Biol.2014:35(4):3487-94.】、转移性前列腺癌【Formosa A,Markert EK,Lena AM,et.al.MicroRNAs,miR-154,miR-299-5p,miR-376a,miR-376c,miR-377,miR-381,miR-487b,miR-485-3p,miR-495 and miR-654-3p,mapped to the
14q32.31 locus,regulate proliferation,apoptosis,migration and invasion in metastatic prostatecancer cells[J].Oncogene.doi:10.1038/onc.2013.451.】、多形性成胶质细胞瘤【Chen SM,Chen HC,Chen SJ,et.al.MicroRNA-495 inhibits proliferation of glioblastoma multiforme cells by downregulating cyclin-dependent kinase 6[J].World J Surg Oncol.2013,11:87.】、急性髓性淋巴瘤【Li Z1,Cao Y,Jie Z,et.al.MiR-495is a tumor-suppressor microRNA down-regulated in MLL-rearranged leukemia[J].Proc Natl Acad Sci U S A.2012:109(47):19397-402.】、胃癌【Li Z,Cao Y,Jie Z,et.al.miR-495 and miR-551a inhibit the migration and invasion of human gastriccancer cells by directly interacting with PRL-3[J].Cancer Lett.2012:323(1):41-7.】.的生长调节相关。此外，多药耐药是肿瘤化疗的常见情况，与P糖蛋白的过表达有关。因此抑制P糖蛋白的表达可能与克服多药耐药有关。Xu等【Xu Y,Ohms SJ,Li Z,et.al.Changes in the expression of miR-381 and miR-495 are inversely associated with the expression of the MDR1 gene and development of multi-drug resistance[J].PLoS One.2013:8(11):e82062.】比较野生型细胞K562和耐药细胞K562/ADM的miRNA表达谱发现，在后者中miR495表达显著下调，研究表明miR495可以靶向调节多药耐药基因(Multidrug resistance 1，MDR1)基因的3'-UTR。将miR495回复表达，可以降低P糖蛋白的表达，增加细胞对药物的摄取率。因此miR495与P蛋白相关的化疗耐药相关。
1expression..Hepatology.2014.doi:10.1002/hep.27118.】、鼻咽癌【Zhang ZC,Li YY,Wang HY.Knockdown of miR-214 promotes apoptosis and inhibits cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma[J].PLoS One.2014:9(1):e86149.】、胃癌【Yang TS,Yang XH,Wang XD,et.al.MiR-214 regulate gastric cancer cell proliferation,migration and invasion by targeting PTEN.Cancer Cell Int.2013:
13(1):68.】等。miR495与肿瘤关系也有几篇报道。miR495与多种癌症，如非小细胞肺癌【Chu H1,Chen X,Wang H,et.al.MiR-495 regulates proliferation and migration in NSCLC by targeting MTA3[J].Tumour Biol.2014:35(4):3487-94.】、转移性前列腺癌【Formosa A,Markert EK,Lena AM,et.al.MicroRNAs,miR-154,miR-299-5p,miR-376a,miR-376c,miR-377,miR-381,miR-487b,miR-485-3p,miR-495 and miR-654-3p,mapped to the
14q32.31 locus,regulate proliferation,apoptosis,migration and invasion in metastatic prostatecancer cells[J].Oncogene.doi:10.1038/onc.2013.451.】、多形性成胶质细胞瘤【Chen SM,Chen HC,Chen SJ,et.al.MicroRNA-495 inhibits proliferation of glioblastoma multiforme cells by downregulating cyclin-dependent kinase 6[J].World J Surg Oncol.2013,11:87.】、急性髓性淋巴瘤【Li Z1,Cao Y,Jie Z,et.al.MiR-495is a tumor-suppressor microRNA down-regulated in MLL-rearranged leukemia[J].Proc Natl Acad Sci U S A.2012:109(47):19397-402.】、胃癌【Li Z,Cao Y,Jie Z,et.al.miR-495 and miR-551a inhibit the migration and invasion of human gastriccancer cells by directly interacting with PRL-3[J].Cancer Lett.2012:323(1):41-7.】.的生长调节相关。此外，多药耐药是肿瘤化疗的常见情况，与P糖蛋白的过表达有关。因此抑制P糖蛋白的表达可能与克服多药耐药有关。Xu等【Xu Y,Ohms SJ,Li Z,et.al.Changes in the expression of miR-381 and miR-495 are inversely associated with the expression of the MDR1 gene and development of multi-drug resistance[J].PLoS One.2013:8(11):e82062.】比较野生型细胞K562和耐药细胞K562/ADM的miRNA表达谱发现，在后者中miR495表达显著下调，研究表明miR495可以靶向调节多药耐药基因(Multidrug resistance 1，MDR1)基因的3'-UTR。将miR495回复表达，可以降低P糖蛋白的表达，增加细胞对药物的摄取率。因此miR495与P蛋白相关的化疗耐药相关。
[0006] 在miR214与辐射相关的研究中，仅一篇围绕辐射诱导皮肤损伤机制研究。皮肤损伤是局部放疗的并发症之一，Zhang等【Protein and miRNA profiling of radiation-induced skin injury in rats:the protective role of peroxiredoxin-6 against ionizing radiation】在大鼠模型中用45Gy电子束照射皮肤，研究照射部位和邻近正常皮肤组织的蛋白和miRNA表达谱变化，确定miR214在辐射后诱导表达，并可能抑制PRDX-6表达，过表达PRDX-6可以减轻皮肤的损伤程度。通过miRNA表达谱芯片对临床上的放射治疗敏感和耐受的肺癌病人进行检测，发现与放疗不敏感组相比，放疗敏感组中有5个miRNA(miR126，let7a，miR 495，miR451，m iR12sb)表达显著上调[崔爽爽.MicroRNA表达与非小细胞肺癌放疗敏感性关系的研究]。除上述研究外，目前尚无miR214和miR495在肿瘤放疗增敏和减弱辐射旁效应损伤作用中的研究报道。
[0007] 综上，尽管miRNA参与肿瘤辐射敏感性调节的机制仍处于初级研究阶段，但是随着miRNA功能的不断深入研究，miRNA对肿瘤辐射敏感性调节的影响是毋庸置疑的，miRNA成为肿瘤细胞敏感性调节新靶点。在该研究领域中，迫切需要开发出可有效增强肿瘤细胞自身辐射敏感性、同时减弱辐射旁效应的miRNA药物以提高放疗效果的同时降低放疗对非照射组织的损伤作用。
[0008] 本发明人在前期对miRNA参与辐射敏感性方面的工作中，发现miR495和miR214均可以提高肿瘤细胞的辐射敏感性，此外miR-495还可以在体内外实验中明显减轻辐射旁效应对肝脏的损伤作用。
发明内容
[0009] 本发明前期工作确定了与增强辐射敏感性、减弱辐射旁效应相关的miRNA—miR214和miR495，由此本发明提供了miR214和miR495提高肿瘤放疗效果、减弱正常组织损伤的新用途。
[0010] 一方面，本发明提供了微小RNA miR214在制备用于肿瘤放射治疗中辐射增敏提高放疗效果的药物的用途。
[0011] 另一方面，本发明提供了微小RNA miR495在制备用于肿瘤放射治疗中辐射增敏提高放疗效果的药物的用途。
[0012] 另一方面，本发明提供了用于肿瘤放射治疗中辐射增敏提高放疗效果的药物组合物，其中包含：(a)有效量的微小RNA miR214；以及(b)药物上可接受的载体。
[0013] 另一方面，本发明提供了用于肿瘤放射治疗中辐射增敏提高放疗效果的药物组合物，其中包含：(a)有效量的微小RNAmiR495；以及(b)药物上可接受的载体。
[0014] 另一方面，本发明提供了用于肿瘤放射治疗中辐射增敏提高放疗效果的药物组合物，其中包含：(a)有效量的微小RNA miR214和微小RNAmiR495；以及(b)药物上可接受的载体。
[0015] 另一方面，本发明提供了微小RNA miR495在制备用于减弱肿瘤放射治疗中辐射旁效应的药物的用途。
[0016] 本发明中所述的肿瘤放射治疗中辐射旁效应包括但不限于肝损伤。
[0017] 另一方面，本发明提供了用于减弱肿瘤放射治疗中辐射旁效应的药物组合物，所述组合物包含：(a)有效量的微小RNAmiR495；以及(b)药物上可接受的载体[0018] 本发明所述的肿瘤可以为但不限于肝癌、乳腺癌、宫颈癌或肺癌。
[0019] 在本发明的一个实施方式中，微小RNA miR214和微小RNAmiR495来自人。
[0020] 在本发明的一个实施方式中，所述微小RNA miR214具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0021] 在本发明的一个实施方式中，所述微小RNA miR495具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0022] 在本发明中，所述组合物的形式适于(但不局限于)：直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、金包被RNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌或复制缺陷腺病毒携带质粒DNA法。
[0023] 本发明人经过大量实验发现：向肿瘤细胞或肿瘤组织中导入miR214或miR495均可有效提高辐射敏感性，从而改善放疗效果；此外，miR495同时可以通过下调Sp1，继而下调eNOS的表达，减低NO生成量，降低TGF-β的含量，而NO和TGF-β是介导辐射旁效应的重要介质，因此miR495作为肿瘤放疗的辅助药物，不仅可以提高肿瘤自身对于放疗的敏感性，同时减弱辐射旁效应带来的肝脏等损伤问题，由此，发明人发现了miR214和miR495在肿瘤放疗增敏和miR495减弱辐射旁效应损伤的新用途，从而在此基础上完成了本发明。
[0024] 另一方面，本发明还提供了本发明提供了微小RNA miR495在制备用于下调放疗肿瘤患者体内eNOS表达的药物中的用途。
[0025] 另一方面，本发明还提供了本发明提供了微小RNA miR495在降低TGF-β的含量中的用途。
[0026] 另一方面，本发明还提供了微小RNA miR495在制备用于防治放疗肿瘤患者未照射细胞DNA损伤的药物中的用途。
[0027] 如本文所用，术语“miR214”是指包含SEQ ID NO.1所示miR214-5p/3p序列或其同源序列，“miR495”是指包含SEQ ID NO.3所示miR495-5p/3p序列或其同源序列，此外还包括上述天然存在的miR214或miR495序列中经过生物学化学修饰，且仍具有辐射增敏性的衍生RNA。
[0028] 本领域中已知miR214和miR495编码基因的初始转录产物经过一系列的加工成熟之后，形成成熟的miR214和miR495。miR214前体和miR495前体只有在加工成成熟的miRNA才具有相应的生物学活性。因此，本领域的技术人员可合理利用miR214或miR495的成熟序列及能够产生或加工成为miR214或miR495的各种其他形式的核酸物质(如本发明中所述的miR214和miR495的前体)均可获得本发明所需获得的效果，即起到辐射增敏作用，或既能辐射增敏又能减弱辐射旁效应，从而用于改善放疗效果的药物。
[0029] 表达载体和组合物
[0030] 本发明还一种载体，它含有miR214或miR495的核苷酸序列。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明物所需的构建物或表达载体。这些方法包括但不限于：基因重组技术、体外合成技术等。组合物应含有有效量的本发明的miR214或miR495以及药学上可接受的载体。
[0031] 所述“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过渡不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
[0032] 给药途径可采用例如(但不限于)：(1)直接裸RNA注射法；(2)脂质体包裹RNA直接注射法；(3)金包被RNA基因枪轰击法；(4)繁殖缺陷细菌或复制缺陷腺病毒携带质粒DNA法；(5)电穿孔法，等等。
附图说明：
附图说明：
[0033] 图1验证miR214和miR495对肿瘤细胞辐射增敏作用的克隆形成实验结果(体外实验)。利用miR214和miR495前体多核苷酸序列克隆构建慢病毒表达载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro)，再分别感染HepG2细胞系构建miR214和miR495稳定过表达细胞系；空载体为对照组(control)。通过测定辐射后miR214组和miR495组的克隆形成验证两种miRNA的体外辐射增敏作用，照射剂量6Gy 60Co-γ。(结果显示为平均值±标准差(n＝3)；*P<0.05(miR214v.s.control)；**P<0.01(miR214v.s.control)；#P<0.05(miR495v.s.control)；##P<0.01(miR495v.s.control)。
[0034] 图2图示的是miR214和miR495对体内肿瘤辐射增敏作用的实验结果(体内实验)。利用图1描述中制备的miR214和miR495稳定过表达细胞系和对照细胞(control)，分别接种于裸鼠中制备肿瘤。肿瘤局部辐射后通过测量这三组的肿瘤体积来验证miR214和miR495的辐射增敏作用，辐射剂量为4Gy 60Co-γ，共局部辐射三次(时间点分别为接种肿瘤细胞的第
12天、第15天、第18天)。(结果显示为平均值±标准差(n＝8)；**P<0.01
##
(miR214v.s.control)；***P<0.001(miR214v.s.control)； P<0.01
(miR495v.s.control)；###P<0.001(miR495v.s.control))
12天、第15天、第18天)。(结果显示为平均值±标准差(n＝8)；**P<0.01
##
(miR214v.s.control)；***P<0.001(miR214v.s.control)； P<0.01
(miR495v.s.control)；###P<0.001(miR495v.s.control))
[0035] 图3图示的是miR495过表达对辐射旁效应信号分子—eNOS及其产物NO生成的影响。图3A为miR495和control组裸鼠体内外周血mRNA水平上eNOS的相对表达情况(结果显示为平均值±标准差(n＝3)；**P<0.01(miR495v.s.control))；图3B为体外细胞实验，miR495和control组经过6Gy辐射后15分钟经流式细胞术测定NO的产量，结果显示miR495可有效降低旁效应信号分子-NO的产量，从而减弱辐射旁效应。
[0036] 图4图示的是miR495过表达对辐射旁效应信号分子—TGF-β含量的影响。图为辐射60
(辐射剂量6Gy Co-γ)后miR495组和control组在不同时间点取细胞培养液上清，通过ELISA法测定TGF-β的相对表达含量(结果显示为平均值±标准差(n＝3)；*P<0.05(miR495v.s.control))。
(辐射剂量6Gy Co-γ)后miR495组和control组在不同时间点取细胞培养液上清，通过ELISA法测定TGF-β的相对表达含量(结果显示为平均值±标准差(n＝3)；*P<0.05(miR495v.s.control))。
[0037] 图5图示的是miR495过表达对减弱辐射旁效应的体外实验。miR495过表达和control细胞在辐射(辐射剂量6Gy 60Co-γ)后，利用培养基转移实验考察对正常肝细胞LO2微核形成数量的影响，验证miR495减弱辐射旁效应的作用。图示的为荧光显微镜下计数所测得的微核形成结果( 结果显示为平均值±标准差( n＝3 )；*P<0 .05(miR495v.s.control))。IR+：辐射；IR-：未辐射。
[0038] 本发明的优点
[0039] 本发明的优点主要在于：
[0040] (a)本发明揭示了miR214和miR495在增强肿瘤放疗敏感性和减弱放疗旁效应损伤中的新用途，为miRNA的研究和开发利用提供了新的思路和途径；
[0041] (b)本发明的miR214和miR495或其前体可有效用于肿瘤放射治疗，为肿瘤放疗领域的肿瘤增敏和减轻放疗副作用对正常组织的损伤提供了一种新颖的治疗剂。实施例
[0042] 为了能够更清楚的理解本发明的技术内容，特举以下实例结合附图详细说明，同时这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0043] 实施例1构建及鉴定过表达miR214和miR495的HepG2稳定细胞系
[0044] 利用慢病毒包装系统(购自美国的SBI公司)构建分别过表达miR214和miR495稳定细胞系。用MegaTran1.0转染试剂将包装病毒各组份转染293T细胞，制备含miR214或miR495前体序列(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)的病毒上清，然后以病毒上清感染HepG2细胞从而获得整合入miR214或miR495前体序列的稳定细胞系。这些稳定细胞系可利用宿主细胞转录成RNA前体，并剪切为成熟miR214或miR495，因此可以持续过表达miR214或miR495。同时，包装空载体(control)作为细胞系对照。稳定细胞系采用TRIzol(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，经RT-QPCR(Exiqon公司)后使用SYBR QPCR试剂(Exiqon公司)进行鉴定，在Chromo4Opticon2实时定量PCR仪(BioRad公司)上完成鉴定，鉴定结果表明已经成功制备获得了过表达miR214的HepG2稳定细胞系和过表达miR495的HepG2稳定细胞系。然后用制备获得的稳定细胞系进行体内和体外功能实验。
[0045] 实施例2体内和体外验证miR214和miR495的辐射增敏作用
[0046] 2.1 miR214和miR495的体外辐射增敏实验
[0047] 利用过表达miRNA214、miR495和control组的HepG2稳定细胞进行克隆形成实验，三种细胞分别以相同数量接种于六孔板中，每组复孔，细胞完全贴壁后，60Co-γ射线单次照射细胞(剂量6Gy，剂量率130cGy/min)，然后将平皿放回培养箱孵育，每两天更换培养基。待皿中细胞长出细胞群落后，取出平板进行固定和染色，最后拍照计数。通过克隆形成实验结果显示：过表达miR214组和miR495组克隆形成数在相同的辐射剂量下明显低于对照组(参见图1)。实验结果表明miR214和miR495体外均可提高肿瘤细胞的辐射敏感性。
[0048] 2.2 miR214和miR495的体内辐射增敏实验。
[0049] 利用过表达miRNA214、miR495和control组的HepG2稳定细胞在4周龄裸鼠的两侧7 60
大腿外侧分别皮下接种注射10细胞，局部辐射条件( Co-γ-ray，剂量4Gy，剂量率85cGy/min)，辐射时间为接种后第12天、15天和18天，共3次。不同时间点测量三组肿瘤体积变化情况。结果显示：在辐射的情况下，过表达miR214、miR495组的肿瘤体积显著低于对照组肿瘤(参见图2)。实验表明miRNA495和miRNA214体内均能显著提高辐射敏感性。
大腿外侧分别皮下接种注射10细胞，局部辐射条件( Co-γ-ray，剂量4Gy，剂量率85cGy/min)，辐射时间为接种后第12天、15天和18天，共3次。不同时间点测量三组肿瘤体积变化情况。结果显示：在辐射的情况下，过表达miR214、miR495组的肿瘤体积显著低于对照组肿瘤(参见图2)。实验表明miRNA495和miRNA214体内均能显著提高辐射敏感性。
[0050] 实施例3 miR495减弱辐射旁效应的体内实验
[0051] 在miR495体内辐射增敏实验结束时，miR495组动物行动活跃，状态良好，而对照组动物削瘦，活动迟缓，状态不佳。对两组小鼠进行解剖，观察脏器形态变化结合HE染色，结果表明：对照组组肝脏肉眼观测出现多个坏死灶，且HE染色支持该现象，而miR495组的肝脏从肉眼外观到HE染色均接近正常肝脏。体内实验表明，过表达miR495可有效减弱辐射旁效应对肝脏的损伤。
[0052] 实施例4 miR495减弱辐射旁效应的分子机制
[0053] 过表达miR495可通过下调Sp1转录因子，间接下调eNOS基因，从而降低辐射旁效应的信号分子—NO和TGF-β的生成量，最终减弱辐射旁效应。
[0054] 4.1 miR495对eNOS及其产物NO的影响
[0055] 4.1.1通过RT-QPCR测定辐射后miR495对外周血eNOS的mRNA表达水平的影响[0056] 取实施例3中对照组和miR495组小鼠的外周血淋巴细胞，TRI Reagent BD试剂(Molecular Research Center公司)提取其总RNA，再反转录(Fermentas公司)得到cDNA进行SYBR Green I实时定量PCR(Fermentas公司)来测定其eNOS的mRNA表达水平。eNOS定量PCR引物为：5’AGGCAATCTTCGTTCA3’(eNOS上游，SEQ ID：5)和5’CCGCATAGCGTATCA3’(eNOS下游，SEQ ID：6)。内参基因为GAPDH，定量PCR引物为：5’AAGGCTGTGGGCAAGG 3’(GAPDH上游，SEQ ID：7)和5’GGTGGAAGAGTGGGAGTT3’(GAPDH下游，SEQ ID：8)。结果见图3A。从图3A可以看出，miR495组eNOS表达水平明显低于对照组。
[0057] 4.1.2通过流式细胞术测定NO生成量验证辐射后过表达miR495对NO表达水平的影响
[0058] miR495过表达组和对照组的HepG2稳定细胞系在相同数量下装载DAF-FM探针(购自碧云天生物技术研究所，具体操作依照说明书所述)，6Gy的60Co-γ照射(剂量率为130cGy/min)后15分钟立即进行流式细胞术检测NO生成量，结果见图3B。从图3B可知，经辐射后miR495组的NO含量较对照组显著降低。
[0059] 图3A和图3B的两个实验结果均表明过表达miR495可显著降低eNOS及其产物NO的含量，后者作为辐射旁效应的信号分子之一，其生成量降低最终减弱辐射旁效应。
[0060] 4.2 miR495对辐射旁效应信号分子—TGF-β的含量影响。
[0061] 将相同数量的miR495组和对照组的HepG2细胞分别接种至6孔板，完全贴壁后进行6Gy的60Co-γ照射(剂量率为130cGy/min)，照射前换新鲜培养基，照射完37℃、5％CO2继续培养，分别取辐射后培养0h、24h、48h的细胞上清进行酶联免疫吸附试验(ELISA)测定TGF-β((Sino Biological公司)的含量。结果见图4，从图4可知，辐照后TGF-β的产量随时间的延长而上升，其中miR495组较control组水平均低，尤其在48h具有统计学差异，说明过表达miR495可降低TGF-β的产量，而TGF-β作为一个辐射旁效应的长效信号分子，其含量降低则旁效应信号减弱，继而减弱辐射旁效应。
[0062] 实施例5 miR495减弱辐射旁效应肝损伤的体外实验
[0063] 为研究不同处理组(miR495组和对照组)照射后细胞上清对正常肝细胞的辐射旁效应损伤机制，将正常肝细胞LO2接种于6孔板中，待完全贴壁后取辐射后培养24h的miR495组和对照组细胞上清分别孵育LO2细胞，同时用1μg/mL的细胞松弛素B(Sigma公司)处理LO2，孵育24h后弃去上清，用PBS清洗1次，再对其原位固定细胞，最后用100μg/mL吖啶橙(Sigma公司)染色，运用激光共聚焦技术观察微核微观结构，同时在荧光显微镜下观察计算其微核形成率。结果见图5，从图5可以看出，辐射后过表达miR495组的微核形成率明显低于对照组，具有显著差异。该培养基转移和微核试验说明miR495可保护未照射细胞的DNA损伤作用。
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