技术领域
[0001] 本
发明属于
生物和医药技术领域,涉及冬凌草甲素的新用途。本发明提供了冬凌草甲素在制备治疗肿瘤药物中的应用,具体的说,本发明公开了冬凌草甲素抑制肿瘤细胞迁移的新用途。
背景技术
[0002] 冬凌草,小灌木,系唇形科香茶菜属
植物碎米桠变种,因其植株
凝结薄如蝉翼、形态各异的蝶状
冰凌片而得名。
[0003] 冬凌草是一种具有综合开发利用价值的植物。冬凌草适应性强,对
土壤要求不严,选择在干燥、不易积
水的沙性或轻粘质土种植。种植时间在春秋为宜,亩种4000株左右。冬凌草主要管理是中耕除草,防积水。自然分布于太行山南部。
[0004] 冬凌草的药用部位是全株,因此,它的产量较高,一般亩产干草500公斤以上。作药用,在开花前采收,因为此时的冬凌草药理作用最强;作冬凌草保健茶,在整个生长期均可,鲜叶直接泡茶或与菊花、金
银花等配合饮用,也可晒干或烘干备用。
[0005] 冬凌草性味苦、甘、微寒。冬凌草有良好清热毒、活血止痛、抑菌、抗肿瘤作用,主治咽喉肿痛、扁桃体炎、感冒头痛、气管炎、慢性
肝炎、关节
风湿痛、蛇虫咬伤。全株对食管癌、
乳腺癌、直肠癌等有缓解作用。冬凌草的煎剂和醇剂可有效地抑制甲型、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等,从而提高肌体抵抗
力,迅速降低因
炎症引起的白血球增高。冬凌草可与化疗、其它抗癌药物配合治疗癌症有明显地增效作用,
[0006] 冬凌草甲素是冬凌草中的重要活性成分,生物利用度高、性质稳定,具有临床使用价值。随着人们对此类化合物的化学和生物学研究的深入,其分子作用机制将逐步明确,这将进一步推动此类化合物的化学结构修饰和构效关系研究,并有助于提高此类化合物的药用价值。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供冬凌草甲素在制备抗肿瘤药物中的新的药用用途。
[0008] 本发明提供了冬凌草甲素在制备抗肿瘤药物中的用途,所述的冬凌草甲素抑制或者延缓肿瘤细胞迁移。
[0009] 所述的抗肿瘤药物可以制成针剂或者片剂。
[0010] 本发明所述的冬凌草甲素,又名Oridonin,结构式如下:
[0011]
[0012] 其相关性质如下:
[0014] 【英文名】Oridonin
[0015] 【分子式】C20H28O6
[0016] 【分子量】364.44
[0017] 【CAS号】28957-04-2
[0018] 【检测方式】高效液相色谱法HPLC≥98%
[0019] 【性状】本品为淡黄色针状结晶
[0020] 【提取来源】为唇形科香茶菜属植物碎米亚桠(Rabdosia rubescens)的全草。
[0021] 【药理性质】熔点248℃-250℃,微溶于水,溶于甲醇、乙酸乙酯、丙
酮等。
[0022] 本发明的冬凌草甲素购自上海源叶生物科技有限公司,货号:90063(http://www.biomart.cn/infosupply/4768868.htm)。
[0023] 本发明所述的肿瘤类型包括肝癌、
肺癌、肾癌、胃癌、胰腺癌、
宫颈癌或者肠癌。优选治疗或者
辅助治疗肝癌的药物。
[0024] 所述的肿瘤类源于smmc-7721、A549、HCG、PANC-1、HELA、SW620、MCF-7或者FOCUS细胞。
[0025] 所述的抗肿瘤药物可以是冬凌草甲素和其他治疗肝癌药物的组合物。
[0026] 所述的其他治疗肝癌药物可以是目前临床上常用的抗肿瘤药物,例如,是索拉菲尼。
[0027] 另一方面,本发明还提供了一种在体外抑制肿瘤细胞迁移的方法,即将冬凌草甲素加入体外培养的肿瘤细胞的培养液中,抑制该肿瘤细胞的迁移和生长。
[0028] 其中,冬凌草甲素的药物浓度大于0且小于50μmol/L。冬凌草甲素的药物浓度 可 以 是 1μmol/L,2μmol/L,5μmol/L,7μmol/L,10μmol/L,15μmol/L,20μmol/L,30μmol/L。通常,整体效果较好时,冬凌草甲素的药物浓度小于10μmol/L。
[0029] 本发明及其
抑制剂、拮抗剂等,在治疗上进行施用(
给药)时,可提供不同的效果。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
[0030] 以本发明的冬凌草甲素为例,可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有
治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、
葡萄糖、水、甘油、
乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的冬凌草甲素可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物,可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的冬凌草甲素还可与其他治疗剂一起使用。
[0031] 当本发明的冬凌草甲素被用作药物时,可将治疗有效剂量的冬凌草甲素施用于
哺乳动物,其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0032] 本发明提供了冬凌草甲素在制备治疗肿瘤药物中的应用,具体的说,本发明公开了冬凌草甲素抑制肿瘤细胞迁移的新用途。在肿瘤细胞的培养液中加入冬凌草甲素,能够明显减缓肿瘤细胞的划痕愈合,明显减缓肿瘤细胞的迁移速度。冬凌草甲素是天然产物,分子量较小,结果比较简单,药效明显。本发明为抑制和减缓肿瘤生长提供了一种新的候选化合物。
具体实施方式
[0033] 实验材料:
[0034] 肝癌细胞株FOCUS:
[0035] 物种: 人类
[0036] 提供者: Harvard Medical School MGH
[0037] 组织来源: 肝癌组织
[0038] 肝癌细胞株Hep3B:
[0039] 物种: 人类
[0040] 提供者: ATCC
[0041] 组织来源: 肝癌组织
[0042] 肝癌细胞株SK-Hep-1:
[0043] 物种: 人类
[0044] 提供者: ATCC
[0045] 组织来源: 肝癌组织
[0046] 肝癌细胞株SMMC7721:
[0047] 物种: 人类
[0048] 提供者: 中国科学院细胞库
[0049] 组织来源: 肝癌组织
[0050] 结肠癌细胞株SW620:
[0051] 物种: 人类
[0052] 提供者: ATCC
[0053] 组织来源: 结肠癌组织
[0054] 乳腺癌细胞株MCF-7:
[0055] 物种: 人类
[0056] 提供者: ATCC
[0057] 组织来源: 乳腺癌组织
[0059] 物种: 人类
[0060] 提供者: ATCC
[0061] 组织来源: 宫颈癌组织
[0062] 胰腺癌细胞株PANC-1:
[0063] 物种: 人类
[0064] 提供者: ATCC
[0065] 组织来源: 胰腺癌组织
[0066] 胃癌细胞株HGC:
[0067] 物种: 人类
[0068] 提供者: ATCC
[0069] 组织来源: 胃癌组织
[0070] 药物来源:
[0071] 冬凌草甲素购自上海源叶生物科技有限公司,每份药物准确称量后溶于DMSO(二甲基亚砜,Sigma),配制成100mM或50mM的母液备用。
[0073] (1)1×PBS
[0074]
[0075]
[0076] 0.1NNaOH调节pH至7.4
[0077] 加ddH2O定容至1L
[0079] (2)EDTA试剂:
[0080] 0.2gEDTA溶解于1×PBS中。
[0081] (3)细胞冻存液:
[0082] 完全培养基中加入加7%的DMSO和10%相应血清。
[0083] (4)5×胰酶:
[0084]
[0085] 过滤灭菌,-20℃储存。
[0086] 使用时用1×PBS试剂稀释。
[0087] 细胞培养基本实验操作方法:
[0088] 1.细胞复苏
[0089] 1)从液氮罐中取出冻存管,直接投入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
[0090] 2)从37℃水浴中取出冻存管,用吸管吸出细胞悬液,注入离心管并加入10倍以上培养液,混合后低速离心,弃上清,再重复用培养液洗一次。
[0091] 3)用培养液适当稀释后,接种培养瓶,放在37℃
培养箱静置培养,次日更换培养液,继续培养。培养至一定浓度时进行传代。PANC-1细胞培养在含10%Gibico胎
牛血清的DMEM高糖培养基中,SK-HEP1和QGY细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中,培养基中含100U/ml青霉素和100μg/ml
链霉素。
[0092] 2.细胞传代培养
[0093] 每天观察细胞生长的情况,当细胞在培养瓶中长至约90%汇合时传代,约每隔2 2
2-4天传代一次。一瓶传代成三瓶,或一个25cm 传代于一个75cm 的培养瓶中。方法:
[0095] 2)加入2-3ml胰酶消化液消化,置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶,使细胞分离。
[0096] 3)用含10-15%的Gibico胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中,继续培养。
[0097] 3.细胞冻存
[0098] 1)取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化,收集于离心管中并计数,离心。
[0099] 2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液,加入配置好的冻存培养液(含10%DMSO,40%7
DMEM和50%Gibico胎牛血清),冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×10/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀,然后分装入无菌冻存管中,每管加1-1.5ml。
[0100] 3)将冻存管放入冻存盒置-80℃速冻,5小时后移入液氮罐中保存。
[0101]
实施例1Cck-8法初筛药物对肿瘤细胞的生长抑制作用
[0102] 将贴壁肿瘤细胞3×10P3P/孔接种至96孔板,培养24小时使之贴壁后加入药物,设3个浓度梯度(药物浓度分别为50.00、5.00、0.50μM),每个浓度设3个复孔。另用0.2%的DMSO代替药物,作为阴性对照。细胞在37℃,5%COR2R条件下培养48小时后,去掉培养液,用Cck-8
试剂盒(同仁化学研究所)测定细胞存活率。培养细胞用的新生
小牛血清和胎牛血清、DMEM高糖和1640细胞完全培养基均购自Gibco公司。
[0103] 测试方法为:将细胞用无血清培养基洗一遍,按照100μl/well的量加入预先配制好的Cck-8试剂(10ml无血清培养基中加入1ml的cck-8溶液1,充分混匀)。将3个没有细胞的孔设为本底孔,用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养2小时,然后用酶标仪读取光吸收值(测定
波长450nm,以650nm为对照波长),计算细胞存活率,以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率,计算药物对肿瘤细胞的IC50值。
[0104] 使用的肿瘤细胞有肺腺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞HeLa、胃癌细胞HGC、胰腺癌细胞PANC-1和肝癌细胞Focus、QGY、Hep3B、SMMC-7721、Sk-hep1等。
[0105] IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为肿瘤细胞数量为对照的一半时药物的浓度。IC50的计算使用6个剂量效应,再通过曲线拟合得到函数计算而得。
[0106] 结果显示,冬凌草甲素对大部分肿瘤有抑制效果。